ES2539327T3 - Reparto mediado de nanopartículas de nucleasas específicas de secuencias - Google Patents

Abstract

Un método de introducción de una nucleasa específica de secuencia (SSN) en una célula vegetal, método que comprende: el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular; poner en contacto la célula que tiene una pared celular y la nanopartícula recubierta entre sí; y permitir la absorción de la nanopartícula y la SSN en la célula vegetal que consta de una pared celular.

Description

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DESCRIPCIÓN

Reparto mediado de nanopartículas de nucleasas específicas de secuencias

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. 61/167,389 presentada el 7 de abril, 2009.

Antecedentes de la invención

Las propiedades únicas de las nanopartículas pueden ser explotadas para el reparto de ADN en las células. Entre las nanopartículas investigadas (por ejemplo, tungsteno, aluminio, níquel, etc.), las nanopartículas de oro (GNP) tienden a ser excelentes candidatos para el reparto de ADN. La baja citotoxicidad y la facilidad de funcionalización con diversos ligandos de importancia biológica hacen de las nanopartículas de oro una opción preferencial para la transformación. Las nanopartículas de oro pueden variar en tamaño de 1.2 nm-600 nm. La síntesis de uso común de GNP produce una superficie con carga negativa (por ejemplo, recubrimiento de citrato) para partículas de 20 -400 nm, mientras que las GNP de un rango más pequeño 1-10 nm, se cargan positivamente. El ADN del plásmido, que es suficientemente flexible para desenrollar parcialmente sus bases, puede ser expuesto a nanopartículas de oro. En el caso de las GNP funcionalizadas con citrato el ADN del plásmido se pueden desenrollar parcialmente. Las cargas negativas en el esqueleto del ADN son suficientemente distantes de modo que las fuerzas de van der Waals atractivas entre las bases y las nanopartículas de oro causan que el ADN del plásmido se una y recubra la superficie de la partícula de oro. Mientras que, en el caso de las GNP cargadas positivamente electrostáticas y las fuerzas de van der Waals pueden contribuir al recubrimiento o unión del ADN.

Además de las nanopartículas de metal, las nanopartículas de semiconductores (por ejemplo, puntos cuánticos) ("QD") dentro del rango de tamaños de 3-5 nm también se han utilizado como portadores para entregar moléculas en las células. El ADN y las proteínas se pueden recubrir o unir a la superficie de QD que es multifuncionalizada con un ligando (véase, por ejemplo, Patolsky, F.,et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)). Los QD multifuncionalizados con ácido carboxílico o amina pueden ser reticulados con moléculas que contienen un grupo tiol (véase, por ejemplo, Dubertret B, .et al., Science 298,1759 (2002); Akerman, M. E., W. C. W. Chan, P. Laakkonen, S. N. Bhatia, E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12617 (2002); Mitchell, G. P., C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121, 8122 (1999)) o un grupo Nhidroxisuccinimil (NHS) éster mediante el uso de protocolos estándar de bioconjugación (véase, por ejemplo, Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004); Bruchez, M.., M. Moronne, P. Gin, S. Weiss, A. P. Alivisatos, Science 281, 2013 (1998)). Una forma alternativa es multifuncionalizar los QD a través de la conjugación con estreptavidina. Los conjugados de estreptavidina con proteínas biotiniladas, oligos o anticuerpos (véase, por ejemplo, Dahan

M. et al., Science 302,442 (2003); Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004); Dahan

M. et al., Science 302, 442 (2003); Wu . X. Y., et al., Nature Biotechnol. 21, 41 (2003); Jaiswal, J. K., H. Mattoussi, J. M. Mauro, S. M. Simon, Nature Biotechnol. 21, 47 (2003); y Mansson, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 314, 52 9 (2004).

Las nanopartículas se han utilizado para el reparto de ADN del plásmido a una variedad de células animales. Se ha encontrado que cuando las nanopartículas recubiertas con ADN se incuban con células que no tienen una pared celular, las células toman las nanopartículas y comienzan a expresar cualquiera de los genes codificados en el ADN. Cuando las nanopartículas se suministran a las células que normalmente se desea que tengan una pared celular, la pared celular se despoja antes de la adición de las partículas a los protoplastos (véase, Torney, F. et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007). En las células vegetales, los actos de la pared celular como una barrera para el reparto de moléculas aplicadas exógenamente. Muchos métodos invasivos, como la pistola génica (biolística), microinyección, electroporación, y Agrobacterium, se han empleado para lograr el reparto de genes y moléculas pequeñas en estas células vegetales amuralladas. El reparto de moléculas pequeñas y proteínas a través de la pared celular y en la célula vegetal sería ventajoso para el desarrollo de tecnologías de apoyo para la manipulación in vitro e in vivo de células, tejidos y órganos de las plantas intactas.

Aunque bien establecida la introducción de ADN foráneo en bacterias, levaduras, células animales y musgo, además de genes -en una localización genómica predeterminada-sigue siendo un reto importante en las plantas superiores. La integración del transgén específica de sitio se produce a una frecuencia muy baja en las células vegetales, en comparación con la integración aleatoria, incluso cuando el ADN entrante contiene grandes tramos de la secuencia homóloga al ADN huésped (Halfter et al. 1992; Lee et al. 1990; Mia and Lam (1995). Por ejemplo, un sistema de transfección altamente eficiente basada en Agrobacterium y la selección de herbicida dan lugar a frecuencias de orientación de genes de hasta 5 x

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en arroz. Los intentos para mejorar la eficiencia de la orientación de genes en plantas han incluido el uso de marcadores de selección negativos, y el uso de plantas diseñadas genéticamente para exhibir mayores frecuencias de focalización. No obstante, estos esfuerzos la integración de ADN al azar a través de procesos no homólogos siguen siendo un obstáculo importante para la orientación de genes en las plantas. Dada la utilidad general prevista para la adición de gen

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diana en la modificación de los cultivos para la biotecnología agrícola e industrial, se necesita urgentemente una solución a este problema.

En este sentido, se han observado aumentos sustanciales en la frecuencia de la orientación de genes en un amplio rango de sistemas de modelos de plantas y animales después de la inducción de una ruptura de doble cadena en el ADN (DSB) a una localización genómica específica en las células huésped, que estimula un proceso celular nativo, reparación de DSB dirigida de homología. Las endonucleasas específicas de sitio de origen natural cuyos sitios de reconocimiento son raros en el genoma de la plantas se han utilizado de esta manera para conducir la integración del transgén en una secuencia diana transferida previamente en el genoma de la planta a través de la integración aleatoria. Estos estudios ponen de relieve el potencial de inducción de DSB dirigida, para estimular la orientación de genes en células vegetales, aunque el desafío de introducir una DSB en un locus nativo permanece.

En las células animales, la solución a la modulación/manipulación del genoma dirigido se consigue a través de una variedad de proteínas de enlace específico de secuencias de nucleótidos tales como proteínas con cremalleras de leucina, dedo de zinc, etc. Estas proteínas están implicadas con la regulación de genes como factores de transcripción y/o pueden ser utilizadas para inducir DSB en una localización genómica nativa. La DSB se puede proveer mediante varias clases diferentes de nucleasas específicas de secuencia, tales como meganucleasas, proteínas con cremalleras de leucina, dedo de zinc, etc., y más recientemente el desarrollo de nuevas versiones quiméricas de estas proteínas. Una de las mejores proteínas de enlace específicas de nucleótidos descritas son las proteínas dedo de zinc (ZFP). El dedo de zinc C2H2 fue descubierto en el factor de transcripción de anfibios TFIIIA, y desde entonces, se ha encontrado que es el motivo de reconocimiento de ADN más común en todas las especies de metazoos. La estructura cristalina de rayos X de la ZFP C2H2, Zif268, reveló un modo sorprendentemente silábico de reconocimiento de ADN-proteína, con cada dedo de zinc especificando un subsitio de 3 o 4 pb en el contexto de una disposición en tándem, y sugirió la posibilidad de utilizar este motivo peptídico como un andamio para los dominios de enlace de ADN con nuevas especificidades. Desde entonces, se han utilizado con éxito un gran número de ZFP diseñadas para unir nuevas secuencias, en muchos laboratorios diferentes en el contexto de factores de transcripción artificial y otras proteínas quiméricas funcionales. El dominio de la proteína dedo de zinc C2H2 se ha utilizado como un andamio para el ADN específico de secuencia de enlace (Pavelitch and Pabo 1991) y ZFN producidas por la fusión de dominios de la proteína con dedos de zinc con un dominio de nucleasa independiente de la secuencia derivada de la endonucleasa de restricción de tipo IIS FokI (Kim et al., 1996). Las ZFN diseñadas se han utilizado para conducir la orientación de alta eficacia a un locus genómico endógeno en células humanas transformadas (Moehle et al. 2007) y primarias (Lombardo et al. 2007).

Los primeros intentos de usar ZFN en plantas han sido prometedores (Lloyd et al. 2005; Wright et al. 2005; Maeder et al. 2008). Una construcción que lleva un gen de ZFN bajo el control de un promotor inducible junto con su secuencia de reconocimiento correspondiente se integró de forma estable en Arabidopsis y se demostró para introducir mutaciones dirigidas resultantes de recombinación no homóloga en el sitio de reconocimiento en las frecuencias que varían 7.9% entre las plántulas de la progenie inducidas (Lloyd et al., 2005). Del mismo modo, entre 66 plantas de tabaco regeneradas a partir de protoplastos transformados con una ZFN diseñada para escindir en el locus SuRA, tres deleciones de par de bases solas mostradas en el sitio diana resultante de la reparación de recombinación no homóloga (Maeder et al. 2008). Las células de tabaco, que contienen un gen indicador pre-integrado, no funcional faltante de 600 pb flanqueando directamente una secuencia de reconocimiento de dedo de zinc, cuando se co-transforman con construcciones que contienen un gen de ZFN correspondiente y un homólogo de ADN donante a la secuencia pre-integrada que comprende los faltantes de 600 pb, mostraron evidencia de reparación dirigida de homología del gen indicador (Wright et al. 2005). Más recientemente, se utilizó un ensayo basado en levaduras para identificar ZFN capaces de escindir un gen endoquitinasa vegetal (Cai et al., 2009). El Agrobacterium suministra un plásmido Ti que alberga tanto las ZFN como una construcción de ADN donante que comprende un casete del gen de resistencia del herbicida pat flanqueado por tramos cortos de homología con el locus endoquitinasa produce hasta 10% de la integración dirigida, del transgén dirigido de homología de forma precisa en el sitio de escisión de ZFN. Es importante tener en cuenta que otros diseños de dedos de zinc basados en un diseño C3H1 se han demostrado en plantas (Shukla et al., 2009, Cai et al 2009).

La presente invención se refiere a métodos que utilizan nanopartículas para suministrar de forma no invasiva nucleasas específicas de secuencia en células vegetales que tienen una pared celular.

Breve resumen de la invención

Las siguientes realizaciones se describen en conjunción con los sistemas, herramientas y métodos que están destinados a ser ejemplares e ilustrativos, y no limitantes en su alcance.

En un aspecto, la invención provee un método de introducción de una nucleasa específica de secuencia (SSN) en una célula vegetal, método que comprende: el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, en donde la nanopartícula es

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una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que es revestida con un péptido de penetración celular; poner en contacto la célula que tiene una pared celular y la nanopartícula recubierta entre sí; y permitir la absorción de la nanopartícula y la SSN en la célula vegetal que tiene una pared celular. En otro aspecto, la invención provee el uso de una nanopartícula recubierta con una SSN en la producción de una célula vegetal transgénica que tiene una pared celular, en donde la 5 nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular. En otro aspecto, la invención provee una composición que comprende una nanopartícula recubierta con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular. En otro aspecto, la invención provee una célula vegetal que tiene una pared celular y se transfecta con una nanopartícula recubierta con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula

10 que está recubierta con un péptido de penetración celular.

Además de los aspectos ejemplares y realizaciones descritas anteriormente, otros aspectos y realizaciones se harán evidentes a la vista de las siguientes descripciones.

15 Breve descripción de los dibujos

Las FIGS. 1 y 2 muestran la expresión de E. coli de ZFN-IL1 FokI etiquetada con histidina (1) y no etiquetada con histidina (2), respectivamente.

20 La FIG. 3 muestra la recombinación homóloga intra-cromosómica estimulada por proteína de fusión dedo de zinc FokI IL-1; con A representando el vector diana y B representando el recombinante con el gen de GFP reconstituido.

La FIG. 4 muestra una representación esquemática del plásmido pDAB1585.

25 La FIG. 5 muestra líneas celulares únicas de BY2-E que muestran la internalización de YFP mediada por GNP, 2 horas después de la incubación de las células; Panel A (FITC), B (rodamina), C (DIC), D (A+B), E (A+B+C), F (Reflectancia imagen invertida): internalización de YFP como se observa a través de microscopía de fluorescencia.

La Fig. 6 muestra la recombinación homóloga intra-cromosómica estimulada por la proteína de meganucleasa I-Scel; con A 30 representando el vector diana y B representando el recombinante con el gen GFP reconstituido.

La Fig. 7 muestra una representación esquemática del plásmido pDAB100375.

Descripción detallada de la invención

35 En la descripción y las tablas que siguen, se utilizan una serie de términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que debe darse a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones:

40 Retrocruzamiento. El retrocruzamiento puede ser un proceso en el cual un criador cruza repetidamente la progenie híbrida de nuevo con uno de los padres, por ejemplo, un híbrido de primera generación F1 con uno de los genotipos parentales del híbrido F1.

Embrión. El embrión puede ser la planta pequeña de contenido dentro de una semilla madura.

45 Nanopartícula. Una partícula microscópica con al menos una dimensión a escala nanométrica, por lo general menos de 100 nm. Las nanopartículas apropiadas para uso en la presente invención pueden tener un tamaño de 1 nm – 0.4 um. Un punto cuántico puede tener un diámetro medio de 1 nm -10 nm, preferiblemente de 2-4 nm. Las nanopartículas tal como se utiliza en la presente solicitud incluyen, pero no se limitan a, las nanopartículas de oro, nanopartículas de tungsteno,

50 nanopartículas recubiertas con oro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílice, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de gelatina, nanocubiertas, nanonúcleos, nanoesferas, nanopartículas magnéticas, nanovarillas, nanopartículas de semiconductores, puntos cuánticos, nanomatrices, nanomatrices dendriméricos y combinaciones de los mismos.

55 Punto cuántico. Un punto cuántico es una nanopartícula semiconductora que limita el movimiento de los electrones de la banda de conducción, los agujeros en la banda de valencia, o excitones (parejas unidas de electrones de la banda de conducción y huecos de la banda de valencia) en las tres direcciones del espacio. El confinamiento puede ser debido a los potenciales electrostáticos (generados por los electrodos externos, el dopaje, tensión, impurezas), la presencia de una interfaz entre diferentes materiales semiconductores (por ejemplo, en sistemas núcleo-cápsula de nanocristales), la

60 presencia de la superficie del semiconductor (por ejemplo, nanocristales semiconductores), o una combinación de éstos. Un

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punto cuántico puede tener un espectro de energía cuantizada discreta. Las funciones de onda correspondientes se localizan espacialmente dentro del punto cuántico, pero se extienden durante muchos períodos de la red del cristal. Un punto cuántico contiene un número finito pequeño (del orden de 1-100) de los electrones de la banda de conducción, agujeros en la banda de valencia, o excitones (es decir, un número finito de cargas eléctricas elementales).

Las nano-matrices incluyen, pero no se limitan a, los dendrímeros. Los dendrímeros son nanopartículas esferoides o globulares que se han diseñado para llevar a moléculas encapsuladas en sus espacios vacíos interiores o unidos a la superficie. Las moléculas son moléculas ramificadas repetidamente; la ramificación permite interacciones polivalentes entre las superficies y materiales a granel. Un ejemplo de un dendrímero son los polímeros en cascada de poliamidoamina catiónica esféricas (PAMAM). Estos polímeros se componen de aminas primarias sobre la superficie y las aminas terciarias en el interior. Este tipo de dendrímero se degrada parcialmente por el tratamiento térmico en solventes solvolíticos, lo que resulta en menos restricción estérica y una mayor flexibilidad. La carga altamente positiva del dendrímero facilita las interacciones electrostáticas con el ADN, y la estructura flexible permite que el dendrímero compacte cuando se une al ADN y se hinche cuando se libera del ADN. La eficiencia de la transfección o la transformación se incrementa como resultado de la carga positiva y la propiedad estructural flexible del dendrímero. Los dendrímeros pueden ser obtenidos a partir de Qiagen (Qiagen, Germantown, MD), los dendrímeros se comercializan al público como el Reactivo de Transfección Superfect ™ (Cat # 301305).

Multifuncionalizado. A menos que se especifique lo contrario, el término "multifuncionalizado" se utiliza para describir las nanopartículas ya sea mono o multi-funcionalizadas. Las partículas mono-funcionalizadas se referirán a nanopartículas o aglomeraciones de las nanopartículas funcionalizadas en las cuales los grupos funcionales de un solo tipo se han unido químicamente. Partículas multifuncionalizadas se referirán a nanopartículas o aglomeraciones de las nanopartículas en las cuales al menos dos, y quizás tres o más, diferentes tipos de grupos funcionales se han unido químicamente.

Resistencia a herbicidas. La resistencia a una dosificación de herbicida se refiere a la capacidad de una planta a sobrevivir (i.e., la planta no se puede matar) por que la dosificación de un ingrediente activo que inhibe el crecimiento y/o da lugar a la planta no resistente de supervivencia. En algunos casos, las plantas tolerantes pueden ponerse temporalmente amarillas o de otra manera mostrar alguna lesión inducida por los herbicidas (por ejemplo, macollamiento excesivo y/o la inhibición del crecimiento), pero recuperarse.

Estable. Estable se refiere a las características de una planta que se transmiten reproduciblemente de una generación a la siguiente generación de plantas puras de la misma variedad.

Absorción. La absorción se refiere a la translocación de una partícula o matrices, tales como una nanopartícula, por ejemplo oro, dendrímeros, o puntos cuánticos, a través de una pared celular o una membrana celular, en donde la translocación no se produce únicamente como un resultado del impulso impartido a la partículas por algo distinto de la célula en la que está siendo especialmente absorbido la partícula. Ejemplos no limitantes de dispositivos o métodos que causan la translocación de una partícula a través de una pared celular o una membrana celular únicamente como resultado de impulso impartido a la partícula son las tecnologías de biolística, pistola génica, microinyección, y/o impalefection.

Ácido nucleico. Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un desoxirribonucleótido, polímero ribonucleótido, u otro nucleótido o polímero de nucleósido, en conformación lineal o circular, y ya sea en forma mono-o bicatenaria. Para los fines de la presente divulgación, estos términos no deben ser interpretados como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como los nucleótidos que están modificados en la base, fracciones azúcar y/o fosfato (por ejemplo, esqueletos de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; i.e., un análogo de A será par de base con T.

Cromosoma. Un cromosoma, es un complejo de la cromatina que comprende la totalidad o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas. Un "episoma" es un ácido nucleico de replicación, complejo de nucleoproteína u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no es parte del cariotipo cromosómico de una célula. Ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas virales. Una "región accesible" es un sitio de la cromatina celular en la cual un sitio diana presente en el ácido nucleico puede estar unido por una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin desear estar ligado por ninguna teoría particular, se cree que una región accesible es una que no se empaqueta en una estructura nucleosomal. La estructura distinta de una región accesible a menudo se puede detectar por su sensibilidad a sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas. Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico al que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para el enlace. Por ejemplo, la secuencia 5 "-GAATTC-3' es un sitio diana para la endonucleasa de restricción Eco RI.

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Gen. Un gen, a los efectos de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico, así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, si o no tales secuencias reguladoras son adyacentes a las secuencias de codificación y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadoras, secuencias reguladoras traduccionales tales como sitios de enlace al ribosoma y sitios de entrada de ribosoma internos, potenciadores, silenciadores, aislantes, aislador de la cromatina, orígenes de replicación, sitios de enlace a la matriz y regiones de control de locus.

Expresión. Los términos expresión o expresión de genes se utilizan indistintamente, y se refieren a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen los ARN que se modifican, por procesos tales como taponado, poliadenilación, metilación, y edición, y proteínas modificadas, por ejemplo, por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación, y glicosilación. La "modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, la activación de genes y la represión de genes.

Proteína. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de aminoácidos de origen natural correspondientes.

Secuencia. El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN, puede ser lineal, circular o ramificada y puede ser monocatenaria o bicatenaria. El término "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede ser de cualquier longitud, por ejemplo entre 2 y 25,000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor de número entero entre estos o encima de estos), preferiblemente entre aproximadamente 100 y 5000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero entre estos), más preferiblemente entre aproximadamente 200 y 2500 nucleótidos de longitud.

Secuencia homóloga. La secuencia homóloga se refiere a una primera secuencia que comparte un grado de identidad de secuencia con una segunda secuencia, y cuya secuencia puede ser idéntica a la de la segunda secuencia. Una " secuencia no idéntica, homóloga" se refiere a una primera secuencia que comparte un grado de identidad de secuencia con una segunda secuencia, pero cuya secuencia no es idéntica a la de la segunda secuencia. Por ejemplo, un polinucleótido que comprende la secuencia de tipo salvaje de un gen mutante es homólogo y no idéntico a la secuencia del gen mutante. En ciertas realizaciones, el grado de homología entre las dos secuencias es suficiente para permitir la recombinación homóloga entre las mismas, utilizando los mecanismos celulares normales. Dos secuencias no idénticas homólogas pueden tener cualquier longitud y su grado de no homología pueden ser tan pequeño como un solo nucleótido (por ejemplo, para la corrección de una mutación de punto genómico, mediante recombinación homóloga dirigida) o tan grande como 10 o más kilobases (por ejemplo, para la inserción de un gen en un sitio predeterminado en un cromosoma). Dos polinucleótidos que comprenden las secuencias no idénticas homólogas no necesitan tener la misma longitud. Por ejemplo, se puede utilizar un polinucleótido exógeno (i.e., polinucleótido donante) de entre 20 y 10,000 nucleótidos o pares de nucleótidos.

Recombinación. La recombinación se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. A los efectos de esta divulgación, "recombinación homóloga (HR)". Se refiere a la forma especializada de ese intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de rupturas de la doble cadena en las células. Este proceso requiere de homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" para la reparación de la plantilla de una molécula "diana" (i.e., la que experimenta la ruptura de doble cadena), y es conocido indistintamente como "conversión de genes no cruzados" o "conversión de genes de tracto corto", porque conduce a la transferencia de información genética desde el donante hasta el objetivo. Sin desear estar ligado por ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de falta de coincidencia de ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o "hibridación de cadena dependiente de síntesis" (SDSA), en la cual el donante se utiliza para resintetizar información genética que pasará a formar parte de la diana, y/o los procesos relacionados. Tal HR especializado a menudo resulta en una alteración de la secuencia de la molécula diana de tal manera que parte o la totalidad de la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido diana.

Escisión. La "escisión", "inducción de una rotura de doble cadena" y "corte" se utilizan indistintamente y se refieren a la rotura del esqueleto covalente de una molécula de ADN. La escisión se puede iniciar por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitando a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión de cadena sencilla y la escisión de doble cadena son posibles, y la escisión de doble cadena pueden ocurrir como resultado de dos diferentes eventos de escisión de cadena sencilla. La escisión de ADN puede dar lugar a la producción de cualquiera de extremos romos o extremos escalonados. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de fusión se utilizan para la escisión

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específica de ADN de doble cadena. Un "dominio de escisión" comprende una o más secuencias de polipéptido que posee actividad catalítica para la escisión del ADN. Un dominio de escisión puede estar contenido en una sola actividad de la cadena polipéptido o escisión puede dar lugar a la asociación de dos (o más) polipéptidos. Un "dominio de semi-escisión" es una secuencia de polipéptido que, en conjunción con un segundo polipéptido (ya sean idénticos o diferentes) forma un complejo que tiene la actividad de escisión (preferiblemente actividad de escisión de doble cadena). La rotura de doble cadena y la escisión de doble cadena se utilizan indistintamente.

Cromatina. La cromatina es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende el ácido nucleico, principalmente ADN, y proteínas, incluyendo las proteínas histonas y cromosómicas no histonas. La mayoría de la cromatina celular eucariota existe en la forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados con un octámero que comprende dos de cada uno de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y ADN enlazador (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre los núcleos de nucleosomas. Una molécula de histona HZ se asocia generalmente con el ADN enlazador. Para los fines de la presente divulgación, el término "cromatina" pretende abarcar todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariotas y eucariotas. La cromatina celular incluye cromatina tanto cromosómica como episomal.

Enlace. El enlace se refiere a una secuencia específica, una interacción no covalente entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de enlace tienen que ser específicos de secuencia (por ejemplo., los contactos con los residuos de fosfato en el esqueleto del ADN), siempre y cuando la interacción en su conjunto sea específica a la secuencia. Tales interacciones se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o inferior. "Afinidad" se refiere a la fuerza de enlace: el aumento de la afinidad de enlace se correlaciona con una Kd inferior.

Enlace Operativo. Los términos "enlace operativo" y "operativamente enlazado" (o "unido operativamente") se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en donde los componentes están dispuestos de manera que ambos componentes funcionen normalmente y permitir la posibilidad de que al menos uno de los componentes puedan mediar una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora de la transcripción, tal como un promotor, está unido operativamente a una secuencia codificadora si la secuencia reguladora de la transcripción controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción generalmente está ligada operativamente con una secuencia codificante, pero no tiene por qué ser directamente adyacente a la misma. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está unida operativamente a una secuencia codificante, a pesar de que no sean contiguas. Con respecto a los polipéptidos de fusión, el término "unido operativamente" puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en enlace con el otro componente como lo haría si no estuviera así vinculado. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de enlace de ADN de ZFP está fusionado a un dominio de escisión, el dominio de enlace de ADN de ZFP y el dominio de escisión están en enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de enlace de ADN de ZFP es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de enlace, mientras que el dominio de escisión es capaz de escindir el ADN en la vecindad del sitio diana.

La nucleasa específica de secuencia (SSN) -incluye varias clases de proteínas bifuncionales que son capaces de reconocer las secuencias de nucleótidos específicas y únicas (sitios de reconocimiento nativos o personalizados), tales como, pero no limitado a, proteínas de meganucleasas, cremalleras de leucina y dedo de zinc. Las meganucleasas representan una familia de enzimas que pueden escindir el ADN de doble cadena con alta especificidad en presencia de iones metálicos divalentes (Ca, Mn, Mg). Sin embargo, se diferencian de las endonucleasas de restricción en sus propiedades de reconocimiento y estructuras (Belfort, M. Roberts RJ. Homing endonucleases: keeping the house in order; Nucleic Acid Research 1997, 25: 3379-3388). En particular, cuando las enzimas de restricción reconocen las secuencias de ácidos nucleicos cortos (3-8 pb), las meganucleasas reconocen secuencias más largas (12-40 pb) -que proporciona una mejor especificidad de la focalización de DSB. (Mueller, JE, Bryk, M. Loizos, N. Belfort M. Homing endonucleases. In Nucleases 2nd Edition. Linn, SM, Lloyd, RS, Roberts, RJ (Eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1993 111-143.). Las cremalleras de leucina -son una clase de proteínas que están implicadas en las interacciones proteína-proteína en muchas proteínas reguladoras eucariotas que son importantes factores de transcripción asociados con la expresión génica. La cremallera de leucina se refiere a un motivo estructural común compartido en estos factores de transcripción a través de varios reinos incluyendo animales, plantas, levaduras, etc. La cremallera de leucina está formada por dos polipéptidos (homodímero o heterodímero) que se unen a secuencias de ADN específicas de una manera donde los residuos de leucina están espaciados de manera uniforme a través de una α-hélice, de tal manera que los residuos de leucina de los dos polipéptidos terminan en la misma cara de la hélice.

Proteína de enlace de ADN dedo de zinc. Una proteína de enlace de ADN dedo de zinc, ZFP, (o dominio de enlace) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica de secuencia a

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través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de secuencia de aminoácidos dentro del dominio de enlace cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion de zinc. El término proteína de enlace del ADN dedo de zinc a menudo abreviado como proteínas dedo de zinc o ZFP. Los dominios de enlace de los dedos de zinc pueden ser "diseñados" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada. Los ejemplos no limitativos de métodos para la ingeniería de proteínas dedos de zinc son diseño y selección. Una proteína dedo de zinc diseñada es una proteína que no ocurre en la naturaleza cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para el procesamiento de la información en una base de datos de almacenamiento de información de diseños de ZFP existentes y los datos de enlace. Véase, por ejemplo, Patentes de EE.UU. 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261; y 6,785,613; véase también el documento WO 98153058; WO 98153059; WO 98153060; WO 021016536 y WO 031016496; y Patentes de EE. UU. 6,746,838; 6,866,997; y 7,030,215.

Secuencia genómica. Las secuencias genómicas incluyen aquellas presentes en los cromosomas, episomas, los genomas organelar (por ejemplo, mitocondrias, cloroplastos), cromosomas artificiales y cualquier otro tipo de ácido nucleico presente en una célula tal como, por ejemplo, cromosomas minicromosomas de secuencias amplificadas y los genomas de bacterias endógenas o de infección y virus. Las secuencias genómicas pueden ser normales (i.e., de tipo salvaje) o mutantes; las secuencias mutantes pueden comprender, por ejemplo, inserciones, deleciones, translocaciones, 25 reordenamientos, y/o mutaciones puntuales. Una secuencia genómica puede comprender también uno de un número de diferentes alelos.

Células vegetales. Las células vegetales incluyen, pero no se limitan a, células vegetales monocotiledóneas (monocotiledóneas) o dicotiledóneas (dicots) o algas o musgos. Los ejemplos no limitantes de monocotiledóneas incluyen plantas de cereales tales como maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, maye de azúcar, piña, cebolla, plátano, coco y. Los ejemplos no limitantes de las dicotiledóneas incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, remolacha azucarera, patata, lechuga, melón, soja, mayola (colza), y alfalfa. Las células vegetales pueden ser de cualquier parte de la planta y/o de cualquier etapa de desarrollo de la planta

Región de interés. Una región de interés es cualquier región del polímero de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro o adyacente a un gen, en la que es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser a los efectos de la escisión de ADN específica y/o recombinación específica. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma de orgánulos (por ejemplo, mitocondrial, de cloroplastos), plásmido, un genoma viral que infecta, o cualquier otra secuencia de nucleótidos, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región de codificación de un gen, dentro de las regiones no codificantes transcritas tales como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias de remolque o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea en dirección 3´ o en dirección 5´ de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o hasta 25,000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor integral de pares de nucleótidos

De acuerdo con las realizaciones de la invención, se puede proporcionar un método para introducir una nucleasa específica de la secuencia en una célula vegetal que consta de una pared celular, método que comprende poner en contacto una nanopartícula cubierta con una nucleasa específica de secuencia, con la célula vegetal y permitir la absorción a través de la pared celular vegetal. En aspectos particulares de la invención, la nanopartícula puede ser cualquier nanopartícula y puede contener reversible o irreversiblemente, estar recubierta con, o de lo contrario estar unida a y/o llevar una nucleasa dedo de zinc, y/o una meganucleasa. En ciertas realizaciones, una nucleasa dedo de zinc se puede introducir a las nanopartículas antes del contacto con una célula vegetal que tiene una pared celular o simultáneamente con la introducción de la nanopartícula a una célula vegetal que tiene una pared celular. Ejemplos de nanopartículas que pueden ser utilizadas en las realizaciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, oro, puntos cuánticos, nanopartículas recubiertas con oro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílice, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de tungsteno, nanopartículas de gelatina, nanocubiertas, nanonúcleos, nanoesferas, nanovarillas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de semiconductores, puntos cuánticos, nanomatrices, dendrímeros y/o combinaciones de los mismos.

De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, una célula vegetal que tiene una pared celular puede ser cualquier célula vegetal que consta de una pared celular intacta y entera. Las realizaciones de la invención pueden incluir células que comprenden una pared celular de cualquier tejido o dondequiera que se encuentren, incluyendo pero no limitados a, en embriones, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, flores, semillas, vainas, tallos, los cultivos en suspensión, y el cultivo de tejidos.

En realizaciones particulares de la invención, una SSN puede ser cualquier ZFN que puede ser entregada a una célula vegetal de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las ZFN pueden comprender proteínas de fusión que comprenden un dominio de escisión (o un dominio de semi-escisión) y un dominio de enlace de dedo de zinc, los polinucleótidos que codifican estas proteínas y combinaciones de polipéptidos y polinucleótidos que codifican el polipéptido.

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Un dominio de enlace de dedo de zinc puede comprender uno o más dedos de zinc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más dedos de zinc), y puede ser diseñado para unirse a cualquier región de interés. Por lo tanto, mediante la identificación de una región diana de interés en la cual se desea la escisión o la recombinación, se puede, de acuerdo con los métodos descritos en este documento, construir una o más proteínas de fusión que comprenden un dominio de escisión (o dominio de semi-escisión) y un dominio de dedos de zinc diseñados para reconocer una secuencia diana en dicha región de interés. La presencia de dicha proteína de fusión (o proteínas) en una célula dará lugar al enlace de la(s) proteína(s) de fusión para su(sus) sitio(s) de enlace y la escisión dentro o cerca de dicha región de interés. Por otra parte, si un polinucleótido exógeno homólogo a la región de interés también está presente en dicha célula, la recombinación homóloga se produce a una alta velocidad entre la secuencia de nucleótidos de rotura de doble cadena y el polinucleótido exógeno.

En realizaciones particulares, proporcionar al menos una SSN a una célula puede comprender proporcionar directamente una o más copias de una proteína de SSN a la célula por medio de una nanopartícula. En otras realizaciones, proporcionar al menos una SSN a una célula puede comprender proporcionar la célula con una nanopartícula que incluye un ácido nucleico que codifica la SSN y permitir que la célula produzca la SSN a partir del ácido nucleico que lo codifica.

En otras realizaciones, una o más SSN proporcionadas a la célula son capaces de escindir, individualmente, o en concierto con otras SSN, en o cerca de una o más regiones de interés. En realizaciones particulares, una o más regiones de interés pueden estar dentro de la secuencia codificante de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En algunas realizaciones, una o más regiones de interés pueden estar cerca de y/o dentro de un locus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos puede ser rotura de doble cadena en una sola región de interés. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos puede ser rotura de doble cadena en dos o más regiones de interés. En realizaciones particulares, una o más de las roturas de doble cadena pueden estar situadas en la secuencia codificante de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En otras realizaciones, una o más de las roturas de doble cadena pueden estar cerca de y/o dentro de un locus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada.

En una realización particular donde se hacen al menos dos roturas de doble cadena, la reparación de las roturas de doble cadena puede comprender retirar el material entre las roturas de doble cadena y volver a unir los extremos de la secuencia de nucleótidos con el fin de escindir las secuencias entre las roturas de doble cadena. En las realizaciones, las secuencias escindidas pueden, sin limitación, comprender secuencias que codifican la totalidad o una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En realizaciones adicionales las secuencias escindidas pueden, sin limitación, comprender secuencias reguladoras que efectúan la expresión de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En tales realizaciones, la expresión de la proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada es disminuida en relación con los niveles de expresión antes de la escisión.

En realizaciones alternativas donde se hacen al menos dos roturas de doble cadena, la reparación de las roturas de doble cadena puede comprender retirar el material entre las roturas de doble cadena, sustituyéndolas por una secuencia donante con el fin de sustituir las secuencias entre las roturas de doble cadena con la secuencia donante. En otras realizaciones, las secuencias eliminadas pueden, sin limitación, comprender secuencias que codifican la totalidad o una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En realizaciones adicionales las secuencias eliminadas pueden, sin limitación, comprender secuencias reguladoras que efectúan la expresión de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En tales realizaciones, la expresión de la proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada es disminuida en relación con los niveles de expresión antes de la escisión.

En realizaciones en las que se hace una rotura de doble cadena, la reparación de la rotura de doble cadena puede comprender la inserción de una secuencia donante en o a través de la rotura de cadena doble. En ciertas realizaciones, la secuencia donante se puede insertar en la secuencia codificante de una proteína altamente, más altamente, muy altamente,

o más altamente expresada. En las realizaciones, la inserción de tal secuencia puede interrumpir la transcripción de la secuencia codificante de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada a través de, a modo de ejemplo no limitativo, la presencia de un codón de terminación en el marco. En realizaciones adicionales el donante puede, sin limitación, interrumpir la función de secuencias reguladoras que efectúan la expresión de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada. En las realizaciones, la expresión de una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada se disminuye en relación con los niveles de expresión antes de la escisión.

En otras realizaciones, la secuencia donante puede codificar una proteína de interés. En realizaciones adicionales, la expresión de la proteína de interés a partir de la secuencia donante puede ser controlada, regulada por, o unida

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operativamente a secuencias reguladoras presentes en la secuencia donante y/o secuencias reguladoras presentes en la secuencia en la que se insertó la secuencia donante. En realizaciones adicionales, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de interés puede ser proporcionada a la célula por separado o en conjunción con la secuencia donante. En algunas realizaciones, la secuencia donante puede estar contenida dentro de la misma molécula de ácido nucleico como la secuencia que codifica una proteína de interés.

En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína altamente, más altamente, muy altamente, o más altamente expresada, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína altamente, más altamente, muy altamente,

o más altamente expresada se puede localizar en, a modo de ejemplo no limitativo, un genoma, un plásmido, un cósmido, cromosoma artificial, episoma, u otra estructura de nucleótidos en la célula.

La práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones reveladas en el presente documento emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, bioquímica, la estructura de la cromatina y el análisis, la química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados que están dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 y las periódicas actualizaciones; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Reparto del Ácido Nucleico a células vegetales

Como se señaló anteriormente, las construcciones de ADN se pueden introducir en (por ejemplo, en el genoma de) una planta huésped deseada, mediante una variedad de técnicas convencionales. Para revisiones de tales técnicas ver, por ejemplo, Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 42 1463; and Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9.

Por ejemplo, la construcción de ADN se puede introducir directamente en el ADN genómico de la célula vegetal utilizando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células vegetales, o las construcciones de ADN se pueden introducir directamente en el tejido vegetal utilizando métodos biolísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN (véase, por ejemplo, Klein et al (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, las construcciones de ADN se pueden combinar con regiones flanqueantes de ADN-T apropiadas y se introducen en un vector huésped convencional Agrobacterium tumefaciens. Las técnicas de transfección mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarme y el uso de vectores binarios, están bien descritos en la literatura científica. Véase, por ejemplo Horsch et al (1984) Science 233:496-498, y Fraley et al (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:4803.

Además, la transferencia de genes se puede conseguir usando bacterias no-Agrobacterium o virus tales como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, virus X de la patata, virus mosaico de la coliflor y virus del mosaico de la vena de yuca y/o virus del mosaico del tabaco, Véase, por ejemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 1 1(1): 1-4.

Además, los péptidos de penetración de células fusionadas a una nanopartícula o la nucleasa específica de secuencia, se pueden usar para entregar las secuencias de nucleótidos o de proteínas a una célula vegetal. El péptido de penetración celular se puede expresar, aislar, y funcionalizar con una nanopartícula, secuencia de nucleótidos, o proteína para el reparto dentro de las células vegetales. Los péptidos de penetración de células capaces de transportar moléculas funcionalmente en células vegetales son conocidos en la técnica y pueden incluir, pero no se limitan a: TAT (Chugh et al, (2008) FEBS 275: 2403-2414); R9 (Chang et al (2005) Plant Cell Physiol 46(3): 482-488 and Chen et al (2007) FEBS Lett 581(9): 1891-1897); MPG (Ziegler et al (2008) Adv Drug Deliver Rev 6: 580-597 and Morris et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2730-2736); PEP1 (Henriques et al (2005) Biochemistry-EE. UU. 44(3): 10189 -10198); y péptidos de penetración de una célula derivada de plantas.

Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula es infectada por las bacterias usando un vector binario de ADN T (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) o el procedimiento de cocultivo (Horsch et al (1985) Science 227:1229-1231). Generalmente, el sistema de transfección de Agrobacterium se utiliza para diseñar plantas dicotiledóneas Bevan et al (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-384; Rogers et al (1986) Methods Enzymol. 118: 627-641). El sistema de transfección de Agrobacterium también se puede usar para transformar, así como para transferir el ADN a plantas monocotiledóneas y células vegetales. Véase la Patente de EE.UU. No. 5,591,616; Hemalsteen et al (1984) EMBO J

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3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al (1984) Nature 311 : 763-764; Grimsley et al (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton et al (1989) Plant Mol. Biol. 12:3 1-40.; y Gould et al (1991) Plant Physiol. 95:426-434.

Los métodos de transfección y de transferencia de genes alternativos incluyen, pero no se limitan a, transfección de protoplastos a través de absorción mediada por calcio -polietilenglicol (PEG) -o electroporación-de ADN desnudo (véase Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; De et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; y Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276) y electroporation of plant tissues (D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505). Los métodos adicionales para la transfección de células vegetales incluyen microinyección, absorción de ADN mediada por carburo de silicio (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), y bombardeo de microproyectiles (véase Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; y Gordon-Kim et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618).

Los métodos y composiciones revelados se pueden usar para insertar secuencias exógenas en una localización predeterminada en un genoma de la célula vegetal. Esto es útil en tanto como que la expresión de un transgén introducido en un genoma de la planta depende críticamente de su sitio de integración. Por consiguiente, los genes codificantes, por ejemplo, nutrientes, antibióticos o moléculas terapéuticas se pueden insertar, por recombinación dirigida, en regiones de un genoma de la planta favorable a su expresión.

Las células vegetales transfectadas que son producidas por cualquiera de las técnicas de transfección anteriores pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posea el genotipo transfectado y por lo tanto el fenotipo deseado. Tales técnicas de regeneración de basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejidos, por lo general basándose en un marcador biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; y and Enlace, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, órganos, polen, embriones o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen en general en Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.

Los ácidos nucleicos introducidos en una célula vegetal se pueden utilizar para conferir rasgos deseados en esencialmente cualquier planta. Una amplia variedad de plantas y sistemas de células vegetales se puede diseñar para las características fisiológicas y agronómicas deseadas descritas en el presente documento usando las construcciones de ácidos nucleicos de la presente divulgación y los diversos métodos de transfección mencionados anteriormente. En realizaciones preferidas, las plantas diana y las células vegetales para el diseño incluyen, pero no se limitan a, aquellas plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como cultivos, incluyendo cultivos de cereales (por ejemplo, trigo, maíz, arroz, mijo, cebada), cultivos de frutas (por ejemplo, tomate, manzana, pera, fresa, naranja), cultivos forrajeros (por ejemplo, la alfalfa), cultivos de hortalizas de raíz (por ejemplo, la zanahoria, la patata, la remolacha azucarera, batata), cultivos de hortalizas de hoja verde (por ejemplo, la lechuga, la espinaca, la col); plantas con flores (por ejemplo, petunia, rosa, crisantemo), coníferas y árboles de pino (por ejemplo, el abeto de pino, abeto); plantas utilizadas en la fitorremediación (por ejemplo, plantas de acumulación de metales pesados); cultivos oleaginosos (por ejemplo, girasol, colza, soja, palma) y plantas utilizados con fines experimentales (por ejemplo, Arabidopsis). Por lo tanto, los métodos y composiciones reveladas tienen uso en un amplio rango de plantas, incluyendo, pero no limitado a, especies de los géneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna, y Zea.

Un experto en la técnica reconocerá que después de que el casete de expresión se incorpora de manera estable en plantas transgénicas y se confirma que es operable, este se puede introducir en otras plantas por cruzamiento sexual. Cualquiera de una serie de técnicas de reproducción estándar se puede utilizar, dependiendo de la especie que se va a cruzar.

Una célula vegetal, callo, tejido o planta transfectada se puede identificar y aislar mediante la selección o detección del material de la planta diseñada para los rasgos codificados, mediante los genes marcadores presentes en el ADN de transfección. Por ejemplo, la selección se puede realizar mediante el cultivo del material de la planta diseñada en medios que contienen una cantidad inhibidora del antibiótico o herbicida al que la construcción génica de transfección confiere resistencia. Además, las plantas y células vegetales transfectadas también pueden identificarse por la detección de las actividades de cualquiera de los genes marcadores visibles (por ejemplo, la β-glucuronidasa, luciferasa, B o genes C1) que puede estar presente en las construcciones de ácidos nucleicos recombinantes. Dichas metodologías de selección y detección son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los métodos físicos y bioquímicos también se pueden usar para identificar los transfectantes de la planta o célula vegetal que contienen construcciones de genes insertados. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a: 1) el análisis de Southern

o la amplificación por PCR para la detección y determinación de la estructura del inserto de ADN recombinante; 2)

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transferencia de Northern, amplificación por PCR inversa-transcriptasa o cebador-extensión, para la detección y el examen de las transcripciones de ARN de las construcciones génicas; 3) ensayos enzimáticos para la detección de actividad de enzimas o ribozimas, donde tales productos génicos son codificados por la construcción del gen; 4) electroforesis en gel de proteínas, las técnicas de Western blot, inmunoprecipitación, o inmunoensayos ligados a enzimas, en donde los productos de construcción génica son proteínas; 5) tecnologías de detección de polimorfismo de nucleótido único, ensayo invasor, pirosecuenciación, secuenciación Solexa. También se pueden usar técnicas adicionales, tales como hibridación in situ, tinción de enzimas, y la inmunotinción, para detectar la presencia o expresión de la construcción recombinante en órganos y tejidos específicos de la planta. Los métodos para hacer todos estos ensayos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los efectos de la manipulación de genes utilizando los métodos revelados en este documento pueden ser observados por, por ejemplo, transferencias Northern del ARN (por ejemplo, ARNm) aisladas a partir de los tejidos de interés. Por lo general, si la cantidad de ARNm se ha incrementado, se puede suponer que el gen endógeno correspondiente se está expresando a una velocidad mayor que antes. Se pueden utilizar otros métodos de medición de la actividad del gen. Pueden utilizarse diferentes tipos de ensayos enzimáticos, en función del sustrato utilizado y el método de detección del aumento o disminución de un producto de reacción o subproducto. Además, los niveles de proteína expresada se pueden medir inmunoquimicamente, i.e., ELISA, RIA, EIA y otros ensayos basados en anticuerpos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante ensayos de detección electroforética (ya sea con tinción o transferencia western). El transgén se puede expresar selectivamente en algunos tejidos de la planta o en algunas etapas de desarrollo, o el transgén se puede expresar en sustancialmente todos los tejidos de la planta, sustancialmente a lo largo de todo su ciclo de vida. Sin embargo, también es aplicable cualquier modo de expresión combinatoria.

La presente divulgación también abarca semillas de las plantas transgénicas descritas anteriormente en donde la semilla tiene la construcción del gen o el transgén. La presente divulgación abarca además la progenie, clones, líneas celulares o células de las plantas transgénicas descritas anteriormente en la que dicha progenie, clon, línea celular o célula tiene la construcción del gen o el transgén.

Aplicaciones

Los métodos y composiciones revelados para la escisión dirigida se pueden usar para inducir mutaciones en una secuencia genómica. La escisión dirigida también puede ser utilizada para crear inactivación génica o modificación génica (por ejemplo, la genómica funcional o la validación de dianas) y para facilitar la inserción dirigida de una secuencia en un genoma (i.e., introducción de secuencia génica). La inserción puede ser por medio de la sustitución de secuencias cromosómicas a través de, a modo de ejemplo no limitativo, la recombinación homóloga o por integración dirigida, en la que se inserta una nueva secuencia (i.e., una secuencia no está presente en la región de interés) en un sitio diana predeterminado. En ciertos ejemplos, dichas nuevas secuencias pueden ser flanqueadas por secuencias homólogas a la región de interés en el cromosoma, Los mismos métodos también se pueden usar para reemplazar una secuencia de tipo salvaje con una secuencia mutante o para convertir un alelo a un alelo diferente.

La escisión dirigida de patógenos de las plantas integradas o infectadas se puede usar para tratar infecciones patógenas en un huésped de planta, por ejemplo, mediante la escisión del genoma del patógeno tal que su patogenicidad se reduce o elimina. Adicionalmente, la escisión dirigida de genes que codifican receptores para los virus de plantas se puede utilizar para bloquear la expresión de tales receptores, evitando de este modo la infección viral y/o la propagación viral en la planta.

Los patógenos de plantas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, virus de plantas tales como Alfarnoviruses, Alphacryptoviruses, Badnaviruses, Betaciyptoviruses, Bigeminiviruses, Bromoviruses, Bymoviruses, Capilloviruses, Carlaviruses, Carmoviruses, Caulimoviruses, Closteroviruses, Comoviruses, Cucurnoviruses, Cytorhabdoviruses, Dianthoviruses, Enamoviruses, Fabaviruses, Fijiviruses, Furoviruses, Hordeiviruses, Hybrigeminiviruses, Idaeoviruses, Ilawiruses, Ipomoviruses, Luteoviruses, Machlomoviruses, Macluraviruses, Marafiviruses, Monogeminiviruses, Nanaviruses, Necroviruses, Nepoviruses, Nucleorhabdoviruses, Oryzaviruses, Ourmiaviruses, Phytoreoviruses, Potexviruses, Potyviruses, Rymoviruses, satellite WAS, satelliviruses, Sequiviruses, Sobemoviruses, Tenuiviruses, Tobamoviruses, Tobraviruses, Tornbusviruses, Tospoviruses, Trichoviruses, Tymoviruses, Umbraviruses, Varicosaviruses y Waikaviruses; patógenos hongos tales como carbonos (por ejemplo, Ustilaginales), rusts (Uredinales), ergots (Clavicepts pupurea) y el moho; mohos (Oomycetes) tales como Phytophthora infestam (tizón de la papa); patógenos bacterianos tales como Erwinia (por ejemplo,

E. herbicola), Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa, P. syringne, P.fluorescens y P. putida), Ralstonia (por ejemplo, R. solanacearum), Agrobacterium y Xanthomonas; ascárides (Nematoda); y phytomyxea (Polymyxa y Plasmodiophora).

Los métodos revelados para la producción de recombinación dirigida de una proteína de interés se pueden usar para reemplazar cualquier secuencia genómica con una secuencia no idéntica. Por ejemplo, una secuencia genómica mutante se puede reemplazar por su homólogo de tipo salvaje, proporcionando así métodos para el tratamiento de enfermedades de las

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plantas; proporcionar resistencia a patógenos de las plantas; aumentar los rendimientos de los cultivos, etc. De manera similar, un alelo de un gen puede ser sustituido por un alelo diferente, utilizando los métodos de recombinación dirigida revelados en este documento.

En muchos de estos casos, una región de interés comprende una mutación, y el polinucleótido donante comprende la secuencia de tipo salvaje correspondiente. Del mismo modo, una secuencia genómica de tipo salvaje se puede sustituir por una secuencia mutante, si tal es deseable. Por ejemplo, la sobreexpresión de un oncogén puede ser invertida, ya sea por mutación del gen o mediante la sustitución de sus secuencias de control con secuencias que soportan un nivel no patológico más bajo, de expresión. De hecho, cualquier patología dependiente de una secuencia genómica particular, de cualquier manera, se puede corregir o aliviar utilizando los métodos y composiciones revelados en este documento.

La separación, inserción, escisión, y/o recombinación dirigida también se pueden usar para alterar las secuencias no codificantes (por ejemplo, secuencias reguladoras tales como promotores, potenciadores, iniciadores, terminadores, sitios de empalme) para alterar los niveles de expresión de un producto génico. Tales métodos pueden ser utilizados, por ejemplo, con fines terapéuticos, la genómica funcional y/o estudios de validación diana.

La modificación dirigida de la estructura de la cromatina se puede utilizar para facilitar el enlace de proteínas de fusión a la cromatina celular. En realizaciones adicionales, se pueden usar una o más fusiones entre un dominio de enlace de dedo de zinc y una recombinasa (o fragmento funcional del mismo), además de o en lugar de las fusiones de dominio de escisión de dedos de zinc revelados en este documento, para facilitar la recombinación dirigida. Véase, por ejemplo, co-propiedad de la patente EE. UU. No. 6,534,261 y Akopian et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691. En realizaciones adicionales, los métodos y composiciones revelados que se utilizan para proporcionar fusiones de dominios de enlace de ZFP con dominios de activación o represión transcripcional que requieren dimerización (ya sea homodimerización o heterodimerización) para su actividad. En estos casos, un polipéptido de fusión comprende un dominio de enlace de dedo de zinc y un monómero dominio funcional (por ejemplo, un monómero de un dominio de represión o activación transcripcional dimérica). El enlace de dos de tales polipéptidos de fusión situados adecuadamente en sitios diana permite la dimerización con el fin de reconstituir un dominio de activación o represión de la transcripción funcional.

Además, como se revela anteriormente, los métodos y composiciones establecidos en este documento se pueden utilizar para la integración dirigida de secuencias exógenas en una región de interés en el genoma de una célula, por ejemplo en donde la escisión mejora la inserción a través de mecanismos de homología-dependiente ( por ejemplo, la inserción de una secuencia donante que comprende una secuencia exógena junto con una o más secuencias que son idénticas, u homólogas pero no idénticas, con una secuencia genómica predeterminada (i.e., un sitio diana).

La secuencia donante puede contener suficiente homología en las regiones que flanquean la secuencia exógena para apoyar la reparación de homología dirigida de una rotura de doble cadena en una secuencia genómica, la inserción de este modo la secuencia exógena en el sitio diana genómico. Por lo tanto, el ácido nucleico donante puede ser de cualquier tamaño suficiente para apoyar la integración de la secuencia exógena por los mecanismos de reparación dependiente de la homología (por ejemplo, recombinación homóloga). Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, se cree que las regiones de homología que flanquean la secuencia exógena proporcionan los extremos de cromosoma roto con una plantilla para la re-síntesis de la información genética en el sitio de la ruptura de doble cadena. En ciertas realizaciones, están presentes dos de las secuencias idénticas o dos de las secuencias homólogas pero no idénticas (o una de cada una), flanqueando la secuencia exógena. Una secuencia exógena (o ácido nucleico exógeno o polinucleótido exógeno) es uno que contiene una secuencia de nucleótidos que normalmente no está presente en la región de interés.

Las secuencias exógenas ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ADNc, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, etiquetas de epítopo, genes marcadores, los sitios de reconocimiento de enzimas de escisión y diversos tipos de construcciones de expresión. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 6,833,252. Ejemplos adicionales de endonucleasas de dirección incluyen ICeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, IPpoI, I-SceIII, ICreI, I-TevI, I-TevII e I-TaiIII. Sus secuencias de reconocimiento se conocen. Véase también la patente de EE.UU. No. 5,420,032; Belfort et al. (1997) Nuclei Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1 125-1 127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998)

J. Mol. Biol. 280:345-353 y the New England Biolabs catalogue.

Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a, secuencias que codifican proteínas que median la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a la neomicina, resistencia a G418, resistencia a la puromicina), las secuencias que codifican las proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde mejorada, proteína fluorescente roja, luciferasa), y proteínas que median un mayor crecimiento celular y/o amplificación de genes (por ejemplo, reductasa dihidrofolato). Por lo tanto los genes marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, β-glucuronidasa (GUS), fosfinotricina N-acetil transferasa (PAT, BAR),

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neomicina fosfotransferasa, p-lactamasa, catecol dioxigenasa, a-amilasa, tirosinasa, P-galactosidasa, luciferasa, aequorina, EPSP sintasa, nitrilasa, acetolactato sintasa (ALS), reductasa dihidrofolato (DHFR), dalapon deshalogenasa y antranilato sintasa. En ciertas realizaciones, la integración dirigida se utiliza para insertar una construcción de expresión de ARN, por ejemplo, las secuencias responsables de la expresión regulada de micro ARN o ARNsi. También se pueden incorporar promotores, potenciadores y secuencias reguladoras de transcripción adicional, como se describe anteriormente, en una construcción de expresión de ARN.

La transformación convencional utiliza la integración aleatoria de ADN foráneo para producir una planta de cultivo transgénica modificada con el rasgo de elección que está sometido a fuertes restricciones en algunos mercados extranjeros. Además, los resultados no deseados también surgen a partir del método de introducción de ADN o de la inserción aleatoria del transgén en las zonas sensibles del genoma, a menudo muchas veces por genoma. En particular, los efectos de la inserción imprecisa no pueden manifestarse en las primeras generaciones desde diferentes mecanismos de comprobación de errores de ADN se activan durante el crecimiento, la reproducción, la embriogénesis y el desarrollo. Estos resultados impactan en los tiempos y costos en dólares de cualquier programa de transgénicos en la biotecnología agrícola. Sin embargo, en una nueva invención Dow AgroSciences (WO / 2008/021207), un método para la inserción de precisión de transgenes se describe a través de recombinación homóloga mediada por Nucleasa Dedo de Zinc (ZFN). Por el contrario, cuando la proteína ZFN se puede expresar y purificar fuera del organismo diana y luego entregar a las células vegetales diana, la mutación específica quirúrgicamente/noqueado génico se puede inducir a través de recombinación no homóloga (NHEJ). Así, la presente invención puede producir una planta modificada genéticamente no transgénica que evitaría las restricciones en los cultivos transgénicos y proceso de terapia génica dirigido será posible sin necesidad de un enfoque transgénico.

Los métodos para la expresión heteróloga de proteínas nucleasas específicas de secuencia, como las proteínas ZFN, son conocidos en la técnica. Los sistemas de expresión aplicables incluyen, pero no se limitan a: el uso de un sistema in vitro tal como el sistema libre de células de germen de trigo (Véase la Patente de EE.UU. No. 7,235,382, incorporada en este documento como referencia); el sistema de expresión de Pseudomonas fluorescens (Madduri et al, (2007) Protein Expres Purif, 55(2): 352-360); y el sistema de expresión de la proteína Pichia (véase la Patente de EE.UU. Nº 4,683,293; 4,808,537; 4,812,405; 4,818,700; 4,837,148; 4,855,231;4,857,467; 4,879,231; 4,882,279; 4,885,242; 4,895,800; 4,929,555; 5,002,876; 5,004,688; 5,032,516; 5,122,465; 5,135,868; 5,166,329, incorporadas en este documento como referencia).

Las realizaciones particulares de la presente invención incluyen una ZFN funcional expresada exogenamente conjugada con nanopartículas (NP) y entregadas a través de NP mediada método de entrega inteligente y furtiva en las células vegetales intactas para inducir la ruptura de cadena doble y la restauración de la funcionalidad del gen afectado por NHEJ. En otras realizaciones, la ZFN funcional conjugada con NP se entrega con un fragmento donante de ADN a través de método de entrega inteligente y furtiva mediado por NP. En donde la ZFN escinde una secuencia específica en el genoma y el ADN donante se integra en este lugar a través de recombinación homóloga. Las estrategias para unir una proteína a la NP han tomado cuatro enfoques principales (1) adsorción electrostática, (2) conjugación con el ligando en la superficie de NP, (3) la conjugación con una pequeña molécula cofactor que la proteína puede reconocer y se unen, y (4) conjugación directa a la superficie NP (Aubin-Tam and Hamad-Schifferli, 2008). Otras estrategias se describen en la revisión de Medintz et al. Cuestiones involucradas en estas estrategias de etiquetado incluyen esterismo, o si la proteína puede “pasar” el ligando a la superficie de NP o el grupo de enlace correspondiente. Una elección de productos químicos que den lugar a un enlace específico (i.e., no causen una reticulación extensa) y sean estables para el propósito deseado, también es una consideración necesaria. El péptido de ZFN necesita ser funcionalizado bajo alta concentración de DDT y en presencia de iones de zinc. Con el fin de mantener la estabilidad de los conjugados, la funcionalización se hará de acuerdo con el procedimiento de conjugación descrito en Oh et. al., 2010.

La invención se describe adicionalmente con la ayuda de los siguientes ejemplos ilustrativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Producción de nucleasas de Secuencia Específica (SSN) mediante la traducción in vitro o expresión bacteriana.

Las SSN (IL1-LO / Fok1, IL1-43 / Fok1, IL1-8 / Fok1 y I-Scel) están diseñadas y amplificadas por PCR a partir de plásmidos que contienen las SSN, adheridas a sitios de enzimas de restricción y etiquetas de histidina 6x. El producto de PCR se inserta en un vector TOPO pCR2.1, para la clonación y secuenciación. Los fragmentos de genes que contienen la secuencia codificante de SSN se eliminan a partir del plásmido mediante la digestión de restricción y se ligaron en los sitios de restricción compatibles del vector de expresión pET15b. Estas muestras se transforman en células de E. coli competentes de expresión BL21 junto con pDAB4883. Para la expresión eficaz, el daño de proteína SSN se reduce en el ADN de E. coli BL21 mediante la transformación de BL21 con el plásmido pDAB4883 que consiste de plásmido de expresión pCOT4 que contiene un gen ligasa en dirección 3´ de un promotor que también es inducido por IPTG (isopropil beta-D

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tiogalactopiranósido). Esto ayuda a reparar cualquier daño causado por las SSN en el genoma de las células BL21 durante la sobre expresión.

La construcción del gen-ligasa pCOT4 y las construcciones SSN-pET15b se co-transforman en las mismas células de expresión BL21. Los cultivos de BL21 transgénicos se cultivan en 50 mL de medio LB con cloranfenicol, carbenicilina, y ZnCl2 y se incubaron a 37 °C hasta que el OD 600nm alcanza 0.5. La expresión se induce con diversas concentraciones de IPTG (0.1-0.7 mM), la incubación se hace a diversas temperaturas (16-28 °C) y el análisis es a través de SDS-PAGE y Western Blot para la detección de la presencia de la proteína de SSN. Por lo tanto, IL1-LO/Fok1, IL1-43/Fok1, IL1-8/Fok1 y I-SceI se expresan en células de E. coli y se purificaron con Ni-NTA. Después de la purificación, la función SSN se demuestra en base a la capacidad de liberar un fragmento específico de un plásmido de expresión.

Por otra parte, las nucleasas específicas de secuencia se expresan a través de la traducción in vitro. Un kit comercial, TNT®, de Promega provee un proceso eficiente y conveniente para expresar la proteína. Los plásmidos circulares que contienen los genes de nucleasa específica de secuencia clonados en dirección 3´, ya sea los promotores de la polimerasa de ARN T7 o SP6 se expresan in vitro por las enzimas de expresión de proteínas suministradas con el kit. Las proteínas sintetizadas se producen en una reacción de 50 µL dentro de unos 60 -90 minutos siguiendo el protocolo del fabricante. Los kits comerciales adicionales están disponibles para la traducción in vitro de proteínas, kits adicionales que se pueden usar incluyen: ActivePro™ de Ambion, PROTEINscript II ™ de Ambion, PURExpress™ de New England Biolabs, además de otros kits disponibles comercialmente.

Las figuras 1 y 2 muestran la expresión en E. coli de SSN etiquetada con histidina (1) y etiquetada con no-histidina (2), ZFN-IL1Fok1. ZFN-IL1Fok1 expresado in vitro libera un fragmento flanqueado en el sitio de enlace de ZFN bien definido a partir del plásmido. De esta manera, SSN expresada tanto in vitro como E. coli, son útiles para la digestión eficiente y específica de las moléculas de ADN diana, y se utilizan alternativamente a lo largo de esta investigación.

Se muestra que las proteínas expresadas a partir de genes clonados SSN son funcionales (i.e., en la escisión del ADN donante). Por ejemplo, el plásmido pDAB1585 (mostrado en la Fig. 4) se trata con la ZFN-IL1Fok1. Se linealiza el ADN del plásmido digerido. A continuación, el fragmento linealizado del plásmido digerido de ZFNIL1Fok1 se purifica a partir del gel y se auto-ligó utilizando un procedimiento de ligadura in vitro, durante la noche. El producto de ligación se transfiere en células de E. coli DH5α químicamente competentes. Se recuperaron varias colonias recombinantes y se analizaron tanto por análisis de patrón de restricción como por secuenciación del ADN, demostrando que pDAB1585 se digiere como se esperaba.

Ejemplo 2 -Producción de Cultivos de Células Diana con Sitios de Enlace de SSN Flanqueados por Fragmentos del Gen Indicador de GFP.

Las secuencias diana consisten en dos fragmentos de genes de la Proteína Verde Fluorescente (GFP) (Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Russia) que flanquean un casete de expresión β-glucuronidasa (uidA). En una construcción diana, un sitio de enlace de ZFN con secuencias de reconocimiento que consiste en repeticiones invertidas a las que las proteínas de fusión de dedo de zinc-FokI se puede unir como homodímeros (Fig. 3) se integra en la construcción diana. El sitio de enlace contiene cuatro repeticiones en tándem de la secuencia de reconocimiento de proteína de fusión IL1-FokI de manera que cada sitio de enlace tiene ∼200 pb de tamaño para asegurar que las secuencias de reconocimiento son accesibles a la proteína de fusión de dedo de zinc Fok1 en el entorno complejo de la cromatina. En una segunda construcción, un sitio de enlace I-SceI se integra en la construcción diana (Fig. 6). En cada construcción diana, los sitios de enlace se fusionan con la secuencia codificante de uidA en el N-terminal. Los fragmentos de genes gfp 5' y 3' se superponen por 540 pb. Estas secuencias superpuestas proporcionan homología dentro de las secuencias diana y un codón de terminación se inserta en el extremo 3' del fragmento gfp 5' para asegurar que la transcripción de gfp no funcional a partir de la secuencia diana.

Las secuencias diana están integradas de manera estable en cultivos en suspensión de células de tabaco BY2 utilizando la transformación de Agrobacterium. Los cultivo de BY2 (obtenidos a partir de Jun Ueki of Japan Tobacco, Iwata, Shizuoka, Japan) se mantuvieron en medios que contienen sales basales LS (Phyto-Technology Labs, Shawnee Mission, KS, #L689), 170 mg/L de KH2PO4, 30 g/L de sacarosa, 0.2 mg/L de 2,4-D y 0.6 mg/L de tiamina-HCl a un pH de 6.0. Las células de BY2 se subcultivan cada 7 días, mediante la adición de 0.25 mL de PCV a 50 mL de medio basado en LS mantenidos en matraces de 250 mL en un agitador rotatorio a 25 °C y 125 RPM. Con el fin de generar cultivos celulares de BY2 transgénicos con secuencias diana integradas, un matraz de una suspensión de post sub-cultivo de cuatro días se divide en cuatro alícuotas de 10-12 mL, que se co-cultivaron en placas de Petri 100x25 mm con 100 µL de cepa de Agrobacterium LBA4404 que alberga cualquiera pZFN-META pDAB 1585 (Fig. 4) o PI-SCE-META pDAB100375 (Fig. 7) cultivados durante la noche para una OD600 -1.5. Las placas se envuelven con Nescofilm® (Azwell Inc., Osaka, Japón) y se incuban a 25 °C sin agitación, durante 3 días después de lo cual se elimina el exceso de líquido y se sustituye con 11 mL de medio LS que contiene 500 mg/L de carbenicilina. Después de la resuspensión de las células de tabaco, 1 mL de suspensión se dispensa

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en placas de 100x25 mm de medio LS que contiene 500 mg/L de carbenicilina y 200 mg/L de higromicina solidificado con 8 g/L de agar TC (PhytoTechnology, Shawnee Mission, KS). Las placas se incuban sin envolver a 28 °C, en la oscuridad. Esto da lugar a 120 -144 placas de selección para un único tratamiento. Los aislados resistentes a higromicina individuales aparecen a los 10-14 días después de la siembra y se transfieren a placas de 60x20 mm individuales (un aislado por placa) en las que se mantienen en virtud de la selección como un callo en un horario de subcultivo de 14 días, hasta que se necesite para su análisis y posteriores experimentos de re-transformación.

Los cultivos de células transgénicas, resistentes a la higromicina, que contienen una copia integrada de longitud completa, única de la secuencia diana, se seleccionan y se utilizan para volver a iniciar los cultivos en suspensión mediante la colocación de ∼250 a 500 mg del tejido de callo en 40-50 mL de medio basal de LS que contiene 100 mg/L de higromicina y el sub-cultivo cada 7 días, como se describe anteriormente.

Ambos los grupos de células y las células individuales (producidos como se describe en the DAS single cell patent application, WO/2008/083233) se utilizan en los experimentos. Tres a cuatro días antes de los experimentos, un cultivo en suspensión de una semana de edad, se sub-cultiva en un medio fresco por transferencia de 2 mL de agregados en suspensión de BY2 en 40 mL de medio de LSBY2 que contiene la concentración de stock de éster etílico del ácido 4-cloro1,5-difenil-1H-pirazol-3-iloxi) de acético (como se describe en la patente WO/2008/083233) 1-3% de glicerol, y 0.05-0.1% (v/v) de DMSO en un matraz de 250 mL. Las células individuales se recogen ya sea en 3.5 días o 7 días después del tratamiento para inducir a las células individuales. Las células individuales de BY2 se procesan a través de un citómetro de flujo para determinar la viabilidad de las células y también evaluar, a través de microscopía confocal, la estabilidad de las células. La estabilidad se detecta mediante la observación del nivel de fluorescencia de fondo, si la hubiere. Un pequeño porcentaje de células muestran fluorescencia de fondo que coincide con las células muertas, lo que indica que la fluorescencia de fondo es de las células que se sometieron a necrosis. Tanto las células individuales como los agregados de suspensión regulares se utilizan en los experimentos después de las pruebas para la fluorescencia de fondo.

Ejemplo 3-Recubrimiento de nanopartículas (NP) con SSn para el Reparto en Células Vegetales.

Los coloides de oro de 150 nm de diámetro de tamaño (BBI International, GC150), 5 -((2-(y-3) -S (acetilmercapto) succinoil) amino) fluoresceína (SAMSA-fluoresceína: Invitrogen, A-685), Las nanopartículas de 80 y 90 nm de tamaño de coloides de oro multifuncionalizado con ácido carboxílico (Ted-Pella, 32019), sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida), EDC (1-etil-3-[3dimetilaminopropil] carbodiimida clorhidrato), (Pierce Bitoechnology, 24510, 22980,), MES (ácido 2-[N-morfolino] etanosulfónico) (Fisher Scientific, AC32776-1000), paquetes de solución reguladora salina regulada con fosfato (Sigma, P5368-10PAK), GFP etiquetada con histidina (Evrogen, Excitación max -482 nm, Emisión max -502 nm, FP611), turbo YFP (Evrogen, Excitación max -525 nm, Emisión max -538 nm, FP611), yoduro de propidio (Sigma-P4864), diacetato de fluoresceína (Sigma, F7378) son tipos de NP multifuncionalizadas que están recubiertos con SSN y se utiliza para el reparto en los cultivos de células diana.

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Preparación de conjugados de nanopartículas

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Síntesis del conjugado de oro-fluoresceína sin SSN para tratamientos de control: el conjugado de oro-fluoresceína se prepara mediante un método descrito previamente (Cannone et. al. 2006) para el reparto y el seguimiento de las partículas en células individuales o grupo de BY2 sin SSN. Un (1) mg de SAMSA-fluoresceína se disuelve en 100 µL de NaOH 0.1 M y se agitó durante 15 minutos para eliminar el grupo protector acetilo, el tiol. La SAMSA activada se mezcla a continuación con 100 µL de coloides de oro de 150 nm (~109 partículas/mL). A continuación, esta solución se incuba durante 1 hora para asegurar la finalización de la reacción. A continuación, se adicionan 50 µL de HCl 1 M para neutralizar la solución. La solución se centrifugó a 3000 RPM durante 30 minutos y se retira el sobrenadante. El pellet de color amarillo obtenido se resuspende en 200 µL de PBS 0.1 M, resultando en una solución de color naranja. Esta etapa de purificación se repite dos veces para asegurar la eliminación de la SAMSA-fluoresceína libre. El modo de unión de SAMSA con el oro es principalmente a través del enlace tiol. Debido a la repulsión electrostática significativa (SAMSA es dianiónica a pH > 7), se cree que SAMSA está perpendicular a la superficie de oro coloidal (Cannone et. al. 2006). Dichas NP se utilizan para rastrear la entrada del número de tales partículas fluorescentes que entran en las células como una medida de la indicación de susceptibilidad celular en las condiciones dadas.

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Síntesis de nanopartículas de oro (GNP), recubiertas con SSN: los conjugados GNP-SSN se sintetizan usando un protocolo ligeramente modificado descrito por Grabarek and Gergely, 1990. 0.25 mL de una solución coloidal de oro multifuncionalizado con ácido carboxilo 20-150 nm (~109 partículas/mL) se centrifugaron a 3000 RPM durante 10 minutos. Después de descartar el sobrenadante, el pellet de color rojo se suspende en 1 mL de solución reguladora de activación (MES 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 6.0). Después de esto, se adicionan 0.4 mg de EDC y 1.1 mg de sulfo-NHS a esta solución y se agitaron en vórtex durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se adicionan 9 µL de ZFN-IL1Fok1 y la solución resultante se incuba durante un máximo de 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente para que la proteína y

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el oro reaccionen por completo. La relación de coloides de oro y de proteína utilizados en esta reacción se determina mediante la búsqueda del número de ácidos carboxílicos presentes en los coloides de oro. En primer lugar, el número de grupos carboxílicos presentes en un coloide de oro se calcula dividiendo el área de superficie de una partícula de oro (se supone esfera) por la superficie ocupada por un grupo carboxílico (0.20 nm2 (Kimura, et. al. 2002)). Entonces, este resultado se multiplica por el número total de coloides de oro presentes, para obtener el número total de grupos carboxílicos presentes en toda la solución coloidal de oro. Esto se equipara con el número de grupos amino presentes en la cantidad dada de proteína. Los coloides de oro se unen a la proteína a través de la formación de un enlace amida entre el ácido carboxílico presente en el coloide de oro y el grupo amino presente en la proteína (Grabarek and Gergely, 1990). Existen aproximadamente 127,285 moléculas de proteína atadas a una nanopartícula de oro.

(ii) Tratamiento de la célula:

Evolución de la absorción de oro y la viabilidad celular: Las siguientes muestras se preparan en placas estériles de 24 pozos: (i) 500 µL de clúster de suspensión diana o células individuales (control); (ii) 500 µL de células individuales o clúster de suspensión de BY2 + 20 µL de GNP + 25 µL de fluoresceína diacetato (FDA) + 25 µL de yoduro de propidio; y (iii) Otros tratamientos incluyen 40, 60, 80 µL de GNP sola y en combinación de ZFN-IL1Fok1 con las células y las manchas de viabilidad celular. Las muestras tratadas se examinan con el microscopio de fluorescencia a 5, 20, 120 min y, finalmente, después de 24-48 horas para confirmar la viabilidad de las células.

b) tratamientos Oro-SAMSA-fluoresceína: Las siguientes muestras se preparan en placas de 24 pozos estériles antes de los experimentos: (i) 500 µl de clúster de suspensión diana o células individuales (control); (ii) 500 µl de clúster de suspensión diana o células individuales + 20 µl de SAMSA-fluoresceína (control); y (iii) el clúster de suspensión diana o células individuales + 20 µl de GNP-SAMSA-fluoresceína se tratan y las suspensiones se incuban durante 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente para confirmar la entrada de partículas.

c) tratamientos de ZFN-IL1Fok1 recubierto con GNP (por ejemplo, etiquetada) -Las siguientes muestras se preparan en placas de 24 pozos estériles antes de los tratamientos de células o de clúster de suspensión: (i) 500 µL de clúster de suspensión diana o células individuales (control); (ii) 500 µL de clúster de suspensión de destino o células individuales + 920 µL de ZFN (control); y iii) 500 µL de células individuales + 10-40 µL de GNP recubierta (por ejemplo, etiquetada) ZFNIL1Fok1. Las células y los clúster tratados se incuban durante un máximo de 2 horas en oscuridad a temperatura ambiente antes de los experimentos.

Los tratamientos de control utilizando GFP/YFP atado a GNP se incluyen en todos los experimentos para asegurar la penetración no invasiva y el momento de entrada óptimo que se utiliza como guía en los experimentos (Véase, la Figura 5). Además, los péptidos de penetración celular de fusión (CPPs) se fusionan (por ejemplo, multifuncionalizados) con NP para realizar un seguimiento de la entrada en tiempo real de las partículas en los racimos de suspensión diana y células individuales.

Ejemplo 4: Síntesis de conjugados Punto Cuántico (QD)-SSN etiquetada.

Los QD de nanocristales semiconductores luminiscentes proporcionan un ejemplo poderoso prototípico con muchas aplicaciones biológicas demostradas (Thermes V, et al. 2002; Windbichler et.al, 2007; Fajardo-Sanchez et. al, 2008; Arnould S, et al., 2006). Su utilidad se deriva de la combinación de características fotofísicas únicas y de los tamaños comparables a los de una proteína grande. El radio hidrodinámico de QD CdSe-ZnS hidrófilos varía de ~ 5 nm (para nanocristales cap intercambiados con ligandos moleculares) a ∼ 20 nm (para nanocristales encapsulados dentro de copolímeros de bloque) (Smith J, et al., 2006). Un QD único se conjuga con varias biomoléculas (tales como anticuerpos, péptidos, ADN) para proporcionar bioconjugados QD recubiertos con mayor avidez.

El uso de ZFN-IL1Fok1 conjugado (por ejemplo, recubierto) con QD hidrofílicos como una estrategia alternativa para facilitar su absorción intracelular y el reparto en el sitio de ADN diana apropiado se describe en este ejemplo. El método generalmente sigue el procedimiento para la internalización de cargas de proteínas-QD en células vivas como se describe en la solicitud de patente DAS 65.502.

(i) síntesis de QD: Los QD de núcleo-cubierta CdSe-ZnS con máximos de emisión centrada a 510 y 540 nm se sintetizan utilizando reacciones escalonadas de precursores organometálicos en mezclas de solventes de coordinación calientes siguiendo los procedimientos descritos (Lu et. al., 2007; Doyon et.al. 2006; Collins et. a., 2003; Lanio et. al, 2000). Los nanocristales son multifuncionalizados y se hacen hidrófilos mediante el intercambio de la cubierta tapada nativa, compuesta principalmente de fosfina de trioctilo y óxido de fosfina de trioctilo (TOP/TOPO), con ligandos bifuncionales como se ha descrito previamente Lie et al., 2002; Mani et. al., 2005; Desjarlais and Berg, 1993). Se utilizan dos conjuntos de QD

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hidrofílicos: (1) nanocristales tapados con solamente ácido dihidrolipoico; y (2) nanocristales cubiertos con una mezcla de poli (etilenglicol)-ácido dihidrolipoico anexado (PEG Mw ≈ 600, DHLA-PEG) y biotina-terminada-DHLA poli (etilenglicol) (PEG Mw. ≈ 400, DHLA-PEG-biotina) con una relación molar 9:1 de los ligandos. Estos se conocen como DHLA-QD y DHLA-PEG-biotina-QD, respectivamente.

(ii) auto-ensamblaje de Bioconjugados del Punto Cuántico: Para auto-ensamblar los conjugados QD-ZFN-IL1Fok1 en la valencia deseada, His-ZFN en las relaciones molares apropiadas se adicionan a 0.3 µM de QD cubiertos con DHLA 510 nm de emisión en solución reguladora Tris-Cl 10 mM, pH 8 y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Del mismo modo, se adicionan b-PEStreptavidin a 0.3 µM de 540-nm de emisión de QD (cubierto con DHLA-PEG: DHLA-PEGbiotina relación 9: 1) en solución reguladora salina de fosfato (NaCl 137 mM, fosfato 10 mM, KCl 2.7 mM, pH 7.4, PBS) y se incubaron a 4 °C durante la noche; la formación del conjugado en este caso se impulsa por las interacciones de estreptavidina-biotina. Los conjugados se caracterizan utilizando electroforesis en gel, donde se controlan los cambios en la movilidad electroforética de los QD ensamblados ya sea con His-ZFN anexado o b-PE marcada con estreptavidina. Las muestras se diluyeron en solución reguladora 1 X TBE (Tris 0.09 M, Na2-EDTA 0.002 M, ácido bórico 0.09 M pH 8.3) y se realizan en geles de agarosa al 1% o 2% para los conjugados QD-b-PE y YFP, respectivamente. En particular, los efectos de variar el número de moléculas de ZFN-IL1Fok1 por bioconjugado QD se controlan si se fusionan con proteínas fluorescentes para el seguimiento. Se recogen imágenes del gel por la excitación del QD y/o proteínas y la captura de imágenes de fluorescencia de las bandas separadas dentro de los geles. La formación del conjugado se confirmó mediante el control de los cambios en la transferencia de energía entre los QD y las proteínas fluorescentes en el auto-ensamblaje. Los espectros fluorescentes se recogieron en un lector de placas Tecan Safire Dual Monochromator Multifunction Microtiter (Tecan, Research Triangle Park, NC), utilizando 325 nm de excitación. Para el reparto intracelular de experimentos de imágenes, los QD son auto-ensamblados con una mezcla de ZFN-IL1Fok1 a una relación molar de ZFN:QD nominal.

(iii) Absorción intracelular de conjugados Punto Cuántico -Proteína Fluorescente: se llevan a cabo experimentos de internalización celular en condiciones estériles, como se describe anteriormente. Los bioconjugados QD se diluyen en medio de cultivo completo, se adicionan al cultivo celular, y se incuban a 37 °C durante 1 hora a 40-150 µg/mL. Los conjugados cubiertos con QD de superficie mixta que consisten de ya sea 1:5 o 1:10 QD/ZFN y QD/b-PE con valencia de ensamblaje de

1:1 a 1: 2.5, junto con CPP a 50 CPP por QD, se incuban con los cultivos celulares a diferentes concentraciones del conjugado de QD. El exceso de conjugados de QD no unidos se elimina, mediante el lavado del cultivo al menos tres veces con PBS o medio de cultivo celular. A continuación, las células se fijaron en 3.7% de paraformaldehído, durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS, y se montaron en medio de montaje ProLong Antifade que contiene tinte DAPI (Invitrogen) para la tinción nuclear. La colección de imágenes de epifluorescencia se lleva a cabo usando un microscopio Leica. La imágenes de Split fluorescencia una al lado de la otra se recogen y cuantifican utilizando un sistema DualView equipado con un filtro dicroico de 565 nm. Para las imágenes celulares de 510 nm QD-YFP/ZFN, las muestras se excitaron a 488 nm y las emisiones se recolectan/separan con el dicroico 565 nm y la deconvolución. La fluorescencia de QD que se aplica a una λ < 565 nm y la cola fluorescente de YFP se recolecta a una λ > 565 nm. La pérdida de YFP en la ventana de QD se resta como parte de la deconvolución. Los QD de 540 nm y b-PE se excitaron a 488 nm y sus respectivas emisiones se separan con el filtro dicroico de 565 nm y la deconvolución. La fluorescencia de DAPI se excita mediante una lámpara de Xe y la emisión se recolecta utilizando un cubo de DAPI (D350/50x para la excitación, 400DCLP dicroica, D460/50m para la detección). AF647-TF se excita usando la lámpara de Xe y fluorescencia se detecta usando un cubo Cy5 (excitación HQ620/60x, Q660LP dicroica, emisión HQ700/75m). Ambos cubos de excitación/detección son proporcionados por Chroma Technology. Las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) se recogen usando una fuente de luz brillante.

(iv)

confirmación de los QD cubiertos con ZFN-IL1Fok1: las interacciones His se producen directamente con la superficie inorgánica rica en Zn de los nanocristales. La ZFN-IL1Fok1 diseñada con un N-terminal que lleva a dos secuencias (His)6 separadas por un pequeño espaciador y CPP que tiene un secuencia (His)8 N-terminal permite la formación de complejos apretados de QD -proteína/péptido. El enlace biotina-avidina es una estrategia de bioconjugación ubicua conocida en la técnica por su fuerte interacción (KD ~ 10-15 M). Usando los QD de superficie cubierta con una mezcla de PEG terminada hidroxilo y biotina (DHLAPEG-biotina-QD) permite la fácil conjugación (por ejemplo, recubrimiento) con b-PE-estreptavidina disponible comercialmente.

(v)

Reparto intracelular de conjugados QD-ZFN-IL1Fok1: Para verificar que la absorción de QD multifuncionalizados (por ejemplo, funcionalizados en la superficie) recubiertos con carga de YFP/ZFN-IL1Fok1 está mediada por la presencia de CPP en la superficie de nanocristales, las líneas celulares de BY2 diana se incuban por separado con tres tipos de conjugado: conjugados QD-CPP (10-100 CPP por QD), QD-ZFN-IL1Fok1/CPP, y QD ensamblados con una mezcla de ZFN-IL1Fok1 y CPP (QD-ZFN-IL1Fok1-CPP con -10 ZFN-IL1Fok1 y ~ 50 CPP por conjugado). Las células se incuban con soluciones de conjugados QD que emiten a 510 nm (a una concentración de ∼ 75 nM), enjuagados para eliminar cualquier material no unido, y, posteriormente procesado con imágenes, utilizando microscopía de epifluorescencia. Las células también son contra-teñidas con DAPI para permitir la visualización de los núcleos y los endosomas, respectivamente. Cuando la CPP

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adicional está presente en la superficie de QD (conjugados QD-ZFN-IL1Fok1-CPP de superficie mixta), una absorción intracelular sustancial de conjugados se lleva a cabo como se indica por la intensidad de fluorescencia medida pronunciada para ambos conjuntos de células. Adicionalmente, las imágenes recogidas para ambos cultivos muestran que existe un solapamiento casi completo entre los patrones de fluorescencia del QD y ZFN-IL1Fok1/YFP. La evaluación de los patrones

5 de tinción y del patrón de co-localización indica una distribución perinuclear, y están confinados predominantemente dentro de los compartimentos endosomales. La internalización eficiente de los conjugados QD por las líneas celulares en presencia de CPP demuestra que CPP facilita la absorción intracelular de los QD multifuncionalizados (por ejemplo, superficie funcionalizada) con cargas de ZFN-IL1Fok1-proteína de fusión fluorescente.

10 Las células individuales y clústers agregados son tratados de forma similar a los tratamientos de NP descritos en la sección de nanopartículas y se siembran en placas sin selección y se controlan para las colonias de expresión de GFP, 2-4 semanas después de los experimentos.

15 Ejemplo 5 -Reparación Dirigida de Homología-Seguida por el Reparto de SSN en células de tabaco a través de GNP y QD

Las líneas celulares diana con sitios de enlace I-SceI o ZFN integrado, tratadas con el ZFN-IL1Fok1 o I-SceI atados a las partículas, como se describe anteriormente, se sembraron en placas Petri en medio. Las células se sembraron en placas en medio de no-selección después de los tratamientos. Los focos fluorescentes verdes son visibles después de 7 días. Para 20 confirmar que los resultados de fluorescencia observados a partir de la reconstitución de un gen gfp funcional, una mezcla de segmentos de tejido fluorescentes son aislados y enriquecido manualmente a través de varios pasajes de sub-cultivo selectivo. El ADN genómico se aisló a partir de estos tejidos fluorescentes y se evaluó mediante PCR con sondas ancladas en cualquier fragmento del gen gfp. Las muestras enriquecidas a partir de tejidos fluorescentes tratados con SSN, cuando se amplifican, producen el producto de PCR predicho de 0.6 kb, indicando que la recombinación anticipada ha reconstituido

25 un gen de gfp funcional en estos tejidos. También, se observa un producto de PCR adicional de 4.1 kb en las muestras enriquecidas, indicando la presencia de la secuencia indicadora no-recombinada en la población celular. Esto no es inesperado dado el método de selección visual de los tejidos fluorescentes utilizados para lograr el enriquecimiento de células positivas para gfp.

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Claims (18)

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   Reivindicaciones

   1. Un método de introducción de una nucleasa específica de secuencia (SSN) en una célula vegetal, método que comprende:

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   el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular;

   poner en contacto la célula que tiene una pared celular y la nanopartícula recubierta entre sí; y

   10

   permitir la absorción de la nanopartícula y la SSN en la célula vegetal que consta de una pared celular.

2. 2.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además en primer lugar proveer la célula vegetal que tiene una pared celular.

3. 3.

   El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, comprende inmovilizar la SSN a través de absorción no covalente en la superficie de la nanopartícula.

4. 4.

   El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la absorción de la SSN en la nanopartícula.

5. 5.

   El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además permitir la absorción de la nanopartícula en un compartimento de la célula vegetal que consta de una pared celular.

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6. 6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además el recubrimiento de la 25 nanopartícula con una proteína dirigida al compartimento subcelular.
7. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compartimento se selecciona del grupo que consiste en citosol, núcleo, tonoplasto, plástido, etioplasto, cromoplasto, leucoplasto, oleoplasto, proteinoplasto, amiloplasto, cloroplasto, y el lumen de la doble membrana.

   30
8. 8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula vegetal que consta de una pared celular es de una planta seleccionada del grupo que consiste de las células de tabaco, zanahoria, maíz, canola, colza, algodón, cacahuete, soja, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp., y de la caña de azúcar.

   35 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula vegetal es de un tejido seleccionado del grupo que consiste de embriones, meristemático, callo, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de las raíces, flores, semillas, vainas y tallos .
9. 10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartícula se selecciona del

   40 grupo que consiste de nanopartículas de oro, nanopartículas recubiertas con oro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílice, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de tungsteno, nanopartículas de gelatina, nanocubiertas, nanonúcleos, nanoesferas, nanovarillas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de semiconductores, puntos cuánticos, nanomatrices, nanomatrices dendrímeros y sus combinaciones.

   45 11. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la derivatización de la superficie de la nanopartícula.
10. 12. El método de la reivindicación 2, en donde la SSN es una nucleasa dedos de zinc formada por una proteína con dedos

    de zinc con un dominio de nucleasa independiente de la secuencia preferiblemente derivada de la endonucleasa de 50 restricción de tipo IIS FokI.
11. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además la selección de células que han integrado de forma estable el ZFN.

    55 14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las células seleccionadas son células regenerables.

12. 15.

    El método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además la regeneración de una planta a partir de las células regenerables.

13. 16.

    El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartícula es una nanopartícula mutifuncionalizada

14. 17.

    Uso de una nanopartícula recubierta con una SSN en la producción de una célula vegetal transgénica que tiene una

    20

    imagen2

    5 pared celular, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular.

15. 18.

    Una composición que comprende una nanopartícula recubierta con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular.

16. 19.

    Una célula vegetal que tiene una pared celular y se transfecta con una nanopartícula recubierta con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular.

    10

    15 20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica de poliamidoamina (PAMAM).
17. 21. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica de poliamidoamina (PAMAM).

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18. 22. La composición de la reivindicación 18, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica de poliamidoamina (PAMAM).

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