CN112166189A - 植物基因组编辑 - Google Patents

Abstract

提供了用于在植物中进行基因组编辑和定点整合的组合物，其包含用核酸酶蛋白、指导RNA或RNP包覆、处理或施加以用于递送至来自干种子的成熟的胚胎外植体的微弹粒子。还提供了使用所公开的组合物在植物的至少一个细胞中进行基因组编辑和定点整合的方法，以及通过所公开的方法产生的包含编辑的基因组或定点整合的植物、植物部分和种子。

Description

植物基因组编辑

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年5月24日提交的美国临时申请号62/676,161的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

序列表的并入

名称为“MONS423WO_ST25.txt”的文件中所含有的序列表以电子方式一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表的大小在Microsoft Windows操作系统中测量为3千字节并且创建于2019年5月22日。

技术领域

本公开涉及用于植物基因组编辑的组合物及其使用方法，所述组合物具有包覆有位点特异性核酸酶的微弹(microprojectile)粒子。

背景技术

精确的基因组编辑技术有望成为对基因表达和功能进行工程改造的有力工具，具有改善农业的潜力。本领域中持续需要开发可用于有效且高效地编辑植物基因组的新型组合物和方法。

发明内容

若干实施方案涉及一种编辑植物细胞的基因组的方法，其包括：将包覆或施加有位点特异性核酸酶的粒子递送至成熟的植物胚胎外植体；以及从成熟的植物胚胎外植体再生植物，其中在再生植物的至少一个细胞的基因组中，再生植物在位点特异性核酸酶的靶位点处或附近包含编辑或定点整合。在某些实施方案中，粒子为钨、铂或金粒子。在特定的实施方案中，粒子的大小在约0.5μm与约1.5μm之间。在其他实施方案中，粒子的大小为约0.6μm、约0.7μm或约1.3μm。在其他实施方案中，将多个包覆或施加有位点特异性核酸酶的粒子递送至外植体。在各种实施方案中，递送至外植体的粒子的量在约50μg与约5000μg之间、或在约50μg与约5000μg之间、或在约50μg与约2000μg之间、或在约50μg与约1000μg之间、或在约50μg与约500μg之间、或在约100μg与约500μg之间。

在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定出具有至少一个在位点特异性核酸酶的靶位点处或附近包含编辑或定点整合的细胞的再生植物。在某些实施方案中，鉴定步骤包括基于表型或性状鉴定出具有编辑或定点整合的再生植物。在其他实施方案中，鉴定步骤包括基于分子测定鉴定出具有编辑或定点整合的再生植物。

在某些实施方案中，位点特异性核酸酶为核糖核蛋白。在一些实施方案中，核糖核蛋白包括指导RNA。在其他实施方案中，核糖核蛋白的位点特异性核酸酶蛋白与指导RNA的比率为约1:8、或约1:6、或约1:4、或约1:2、或约1:1、或约2:1、或约4:1、或约6:1、或约8:1。在各种实施方案中，位点特异性核酸酶为Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Csn1、Csx12、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(也称为Cas12a)、CasX、CasY、CasZ或Argonaute蛋白、或其同源物或修饰形式。在特定的实施方案中，位点特异性核酸酶为Cas9蛋白。在其他实施方案中，Cas9蛋白来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。在其他实施方案中，位点特异性核酸酶为Cpf1蛋白。在其他实施方案中，位点特异性核酸酶不为核酸指导核酸酶。在其他实施方案中，位点特异性核酸酶为大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶、转座酶或转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease；TALEN)。

若干实施方案涉及一种编辑植物的基因组的方法，其包括：将包覆或施加有指导核酸或编码指导核酸的核酸的粒子递送至成熟的植物胚胎外植体；以及从成熟的植物胚胎外植体再生植物，其中成熟的植物胚胎外植体表达CRISPR相关蛋白，并且其中在再生植物的至少一个细胞的基因组中，再生植物在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Csn1、Csx12、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(也称为Cas12a)、CasX、CasY和CasZ。在一些实施方案中，粒子为钨、铂或金粒子。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定出具有至少一个在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合的细胞的再生植物。在一些实施方案中，所述方法包括将供体模板递送至成熟的植物胚胎。在一些实施方案中，供体模板包含插入序列和至少一个同源序列，以用于将插入序列在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近整合到植物的基因组中。在一些实施方案中，供体模板包含CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点。在一些实施方案中，所述方法包括将选择标记基因递送至成熟的植物胚胎。

若干实施方案涉及一种编辑植物的基因组的方法，其包括：将包覆或施加有CRISPR相关蛋白或编码CRISPR相关蛋白的核酸的粒子递送至成熟的植物胚胎外植体；以及从成熟的植物胚胎外植体再生植物，其中成熟的植物胚胎外植体表达指导核酸，并且其中在再生植物的至少一个细胞的基因组中，再生植物在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Csn1、Csx12、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(也称为Cas12a)、CasX、CasY和CasZ。在一些实施方案中，粒子为钨、铂或金粒子。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定出具有至少一个在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合的细胞的再生植物。在一些实施方案中，所述方法包括将供体模板递送至成熟的植物胚胎。在一些实施方案中，供体模板包含插入序列和至少一个同源序列，以用于将插入序列在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近整合到植物的基因组中。在一些实施方案中，供体模板包含CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点。在一些实施方案中，所述方法包括将选择标记基因递送至成熟的植物胚胎。

若干实施方案涉及一种编辑植物的基因组的方法，其方法包括：将包覆或施加有CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物或者一种或多种编码CRISPR相关蛋白的核酸和指导核酸的粒子递送至成熟的植物胚胎外植体；以及从成熟的植物胚胎外植体再生植物，其中在再生植物的至少一个细胞的基因组中，再生植物在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Csn1、Csx12、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(也称为Cas12a)、CasX、CasY和CasZ。在一些实施方案中，粒子为钨、铂或金粒子。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定出具有至少一个在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合的细胞的再生植物。在一些实施方案中，所述方法包括将供体模板递送至成熟的植物胚胎。在一些实施方案中，供体模板包含插入序列和至少一个同源序列，以用于将插入序列在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近整合到植物的基因组中。在一些实施方案中，供体模板包含CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点。在一些实施方案中，所述方法包括将选择标记基因递送至成熟的植物胚胎。

若干施方案涉及一种编辑植物的基因组的方法，其包括：将包覆或施加有基因组编辑试剂或一种或多种编码基因组编辑试剂的核酸的粒子递送至成熟的植物胚胎外植体；以及从成熟的植物胚胎外植体再生植物，其中在再生植物的至少一个细胞的基因组中，再生植物在基因组编辑试剂的靶位点处或附近包含编辑或定点整合。在一些实施方案中，基因组编辑试剂为CRISPR相关蛋白。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Csn1、Csx12、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(也称为Cas12a)、CasX、CasY和CasZ。在一些实施方案中，基因组编辑试剂为指导核酸。在一些实施方案中，基因组编辑试剂为包含CRISPR相关蛋白和指导RNA的核糖核蛋白(RNP)。在一些实施方案中，为大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶、转座酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，粒子为钨、铂或金粒子。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定出具有至少一个在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近包含编辑或定点整合的细胞的再生植物。在一些实施方案中，所述方法包括将供体模板递送至成熟的植物胚胎。在一些实施方案中，供体模板包含插入序列和至少一个同源序列，以用于将插入序列在CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点处或附近整合到植物的基因组中。在一些实施方案中，供体模板包含CRISPR相关蛋白/指导核酸复合物的靶位点。在一些实施方案中，所述方法包括将选择标记基因递送至成熟的植物胚胎。

在其他实施方案中，粒子进一步包覆或施加有多核苷酸分子。在一些实施方案中，多核苷酸分子为供体模板。在某些实施方案中，供体模板包含突变，以用于通过模板介导的修复将突变在位点特异性核酸酶的靶位点处或附近引入到植物的基因组中。在其他实施方案中，供体模板包含插入序列和至少一个同源序列，以用于将插入序列在位点特异性核酸酶的靶位点处或附近整合到植物的基因组中。

在一些实施方案中，插入序列包含转基因，所述转基因包含可操作地连接至植物可表达启动子的编码序列或可转录DNA序列。在某些实施方案中，转基因包含感兴趣的基因。在一些实施方案中，转基因包含蛋白编码序列。在其他实施方案中，转基因包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列。在其他实施方案中，转基因包含标记基因。在其他实施方案中，多核苷酸分子包含标记基因。在一些实施方案中，标记基因为选择标记基因。在各种实施方案中，选择标记基因包含腺苷酰转移酶(aadA)基因、新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶(hpt、hph或aph IV)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase；EPSPS)基因或双丙氨膦抗性(bar)或草丁膦N-乙酰基转移酶(phosphinothricin N-acetyltransferase)(pat)基因。在某些实施方案中，选择标记基因包含腺苷酰转移酶(aadA)基因。在替代实施方案中，标记基因为筛选标记基因。在各种实施方案中，筛选标记基因包含绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因。在一些实施方案中，多核苷酸分子包含供体模板区以及包含编码序列或可转录DNA序列的转基因，其中转基因位于供体模板区的外部。

在其他实施方案中，所述方法还包括选择具有标记基因的再生植物，其中标记基因与位点特异性核酸酶共递送。在一些实施方案中，标记基因为选择标记基因。在某些实施方案中，选择步骤包括用选择剂处理成熟的胚胎外植体或者从其再生的芽和/或根培养物或植物。在特定的实施方案中，选择标记基因为腺苷酰转移酶(aadA)基因。

在某些实施方案中，植物为双子叶植物。在一些实施方案中，植物为大豆植物。在其他实施方案中，植物为单子叶植物。在其他实施方案中，成熟的胚胎外植体在递送步骤之前包含以下中的一种或多种：(i)指导核酸，(ii)包含转基因或标记基因的多核苷酸，(iii)包含编码非编码RNA分子或指导核酸的转基因的多核苷酸，和/或(iv)供体模板。在一些实施方案中，成熟的胚胎外植体为干切除外植体。在其他实施方案中，成熟的胚胎外植体为湿胚胎外植体、干燥的湿胚胎外植体或湿切除胚胎外植体。在其他实施方案中，成熟的胚胎外植体的水分含量在约3％至约25％的范围内。在其他实施方案中，从水分含量在约3％至约25％的范围内的植物种子切除成熟的胚胎外植体。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本公开的某些方面。可通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文提出的具体实施方案的详细描述更好地理解本公开。

图1示出了在以不同量的包覆的金或钨粒子进行GUS蛋白递送之后的染色结果。

图2示出了在以不同大小的包覆的钨粒子进行GUS蛋白递送之后的染色结果。

图3示出了大豆中染色体11和18上的两个PDS基因基因座的对应序列部分，其中示出了sgRNA(标记crRNA)和FLA引物的靶标或结合位点。

具体实施方式

使用基因组编辑技术进行的基因功能分析和作物改良在改良农业方面具有良好前景。然而，基因组编辑工具和试剂通常以DNA的形式被递送至可培养植物细胞中。已用基因组编辑工具和试剂转化的植物细胞和组织的再生能力可能受到限制，并且许多植物种质可能不适合这些培养方法。实际上，许多作物植物和品种不能有效地形成愈伤组织、悬浮培养物或原生质体。因此，现有的基因组编辑方法可根据外植体的类型和培养要求而为物种和基因型依赖性的，并且在许多情况下限于商业性较弱的种质和农艺上重要作物的品种，它们需要用更多优良供体系进行更多轮回交以将基因组编辑或定点整合渗入到期望的遗传背景中。

本公开通过提供将以核酸酶蛋白和/或核糖核蛋白(RNP)形式的基因组编辑试剂递送至成熟或干切除胚胎外植体(DEE)中的方法克服了本领域中的不足，所述核糖核蛋白可被预组装和/或包覆在粒子上以用于向外植体的生物射弹递送(biolistic delivery)。“干切除外植体”为从成熟的干种子取得或切除的成熟的胚胎外植体。植物种子在其成熟期间自然干燥。如下文进一步所述，可根据处理方式，诸如在对干种子进行润湿、吸胀等之后，从成熟种子取得或切除其他类型的外植体，并且在从干种子切除之后可对外植体进行润湿、吸胀等。可通过将核酸酶和/或核糖核蛋白(RNP)递送至分生组织(诸如胚胎分生组织)的一个或多个细胞来产生编辑或定点整合，而无需任何先前的愈伤组织形成步骤。通过避免在根据本发明方法将基因组编辑试剂递送至靶向外植体的一个或多个细胞中之前对愈伤组织期的需要，可减少或消除基因型和物种与现有方法的依赖性，并且可实现基因组编辑试剂(诸如核酸酶、指导核酸和或RNP)有向那些靶向外植体中的有效递送。因此，目前公开的用于基因组编辑试剂递送的方法可直接在各种植物种质中进行，包括在农艺上重要的作物物种的优良种质系，从而可允许直接再生含有插入序列或转基因的靶向编辑或定点整合的期望种质的植物。

可根据本公开的基因组编辑方法产生具有序列或转基因的期望编辑或定点整合的干切除外植体，从而可允许仅用少量培养和/或再生步骤使其相当正常地发育成含有期望编辑或定点整合的成年R₀植株。此类R₀植株可从外植体发育或再生，而不需要胚性或愈伤组织培养物。通过本公开方法产生的R₀植株中的靶向编辑或定点整合可进一步在种系中传播，以产生基因组编辑R₁种子和植株以及具有期望编辑或定点整合的种子和植株的后代。

在引入基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸或核糖核蛋白(RNP))之前无需大量培养干切除外植体而产生基因组编辑R₀植株的能力允许更快速且有效地进行本公开方法，因此使其有潜力实施基因组编辑作物植物的大规模商业生产。可从种子取得干切除外植体，并且几乎直接用作基因组编辑或定点整合的靶标。根据一些实施方案，可从成熟干种子取得干切除外植体，并且用作可能仅用最少的润湿、水合或预培养步骤进行编辑的靶标。因此，来自可储存的干种子中的干切除外植体可方便地用作插入序列或转基因的基因组编辑或定点整合的靶标。作为干切除外植体的替代，可将“湿”或“干燥的湿”胚胎外植体(包括例如引发(primed)或发芽的胚胎外植体)用作基因组编辑的靶标。此类“湿”胚胎外植体为在接受编辑酶之前经历润湿、水合、吸胀或其他最少培养步骤的干切除外植体。类似地，也可将来自吸胀或水合种子的“湿切除”外植体用作靶标。“湿”胚胎外植体在从种子切除之后水合或吸胀，而“湿切除”胚胎外植体是从已经水合或吸胀的种子切除的。

I.转化方法

本公开的实施方案提供了编辑来自植物干种子的干切除外植体(DEE)基因组的方法，其包括引入基因组编辑试剂，诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP)，所述核糖核蛋白可被预组装或作为核酸指导核酸酶和单独的指导RNA来提供，以用于生物射弹粒子介导地递送至外植体的至少一个细胞中，以在外植体的至少一个细胞中产生基因组编辑或定点整合。本公开方法可通过在没有对外植体进行大量培养的情况下靶向收获种子的干切除胚胎外植体，之后递送基因组编辑试剂来进行。此类外植体可从可储存的干种子切除，或可为“湿”胚胎外植体、“干燥的湿”胚胎外植体或“湿切除”胚胎外植体。

根据一些实施方案，在将基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))递送至外植体之前，从植物种子切除的干外植体可任选地在水性培养基中预培养有限时间。此种预培养基可包含各种盐(例如，MS基础盐、B5盐等)和其他成分(诸如各种渗压剂、糖、抗微生物剂等)。预培养基可为固体或液体，并且还可包含一种或多种植物生长调节剂或植物激素，包括一种或多种生长素、细胞分裂素等。根据一些实施方案，可将多种外植体在同一培养基或容器中一起预培养。例如，可将2至100个外植体(诸如约25个外植体、约50个外植体、约75个外植体或约100个外植体)铺板在同一预培养基上或中，但是根据外植体的类型、容器、皿的大小等可将更大量的外植体在一起预培养。根据一些实施方案，预培养基可包含：生长素，诸如2,4-D、吲哚乙酸(IAA)、麦草畏、1-萘乙酸(NAA)等；以及细胞分裂素或类似的生长调节剂，诸如噻苯隆(thidiazuron；TDZ)、6-苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素或玉米素核苷等。此种预培养或预培养步骤可增强编辑和/或再生外植体的能力。可控制或预先确定预培养基中生长素和细胞分裂素(或类似的生长调节剂)的相对量，以使得改良编辑和/或再生成功，同时避免外植体形成愈伤组织(即使在较长时间内)。根据一些实施方案，预培养基可包含生长素(诸如2,4-D)和细胞分裂素(诸如TDZ)。例如，预培养基(如果存在的话)中细胞分裂素(诸如TDZ)的浓度的范围可为零(0)至约5ppm，诸如约0.3至约4百万分率(ppm)、约0.5至约3ppm、约1至约2或者在任何其他中间浓度范围内。在某些方面中，预培养基中细胞分裂素的浓度可为0、约0.1ppm、约0.2ppm、约0.3ppm、约0.4ppm、约0.5ppm、约0.6ppm、约0.7ppm、约0.8ppm、约0.9ppm、约1.0ppm、约1.25ppm、约1.5ppm、约1.75ppm、约2ppm、约2.5ppm、约3ppm、约3.5ppm、约4ppm、约4.5ppm或约5ppm。在TDZ的情况下，浓度可优选小于2ppm、或在约0.7至约1.3ppm或约0.5至约1ppm的范围内、或为约0.3ppm或约1.5ppm。在某些方面中，TDZ的浓度为约0.1ppm、约0.2ppm、约0.3ppm、约0.4ppm、约0.5ppm、约0.6ppm、约0.7ppm、约0.8ppm、约0.9ppm、约1.0ppm、约1.1ppm、约1.2ppm、约1.3ppm、约1.4ppm、约1.5ppm、约1.6ppm、约1.7ppm、约1.8ppm或约1.9ppm。生长素(诸如2,4-D)的浓度的范围可为零(0)至约2ppm、或约0.1ppm至约1ppm、或约0.1ppm至约0.5ppm或在任何其他中间浓度范围内。在某些方面中，生长素的浓度为约0.1ppm、约0.2ppm、约0.3ppm、约0.4ppm、约0.5ppm、约0.6ppm、约0.7ppm、约0.8ppm、约0.9ppm、约1.0ppm、约1.1ppm、约1.2ppm、约1.3ppm、约1.4ppm、约1.5ppm、约1.6ppm、约1.7ppm、约1.8ppm或约1.9ppm。

在一定程度上根据预培养基和/或外植体周围环境的温度，预培养步骤的时间可能有所不同。通常，也可将预培养步骤的时间控制并限制在约1或2小时至约5天的范围内，诸如约12小时至约60小时、或约12小时至约48小时或其中任何其他时间范围内。尽管存在植物生长调节剂，但是限制预培养步骤的时间的量也可避免愈伤组织形成。最佳的预培养时间还可改良植物再生频率。在预培养步骤期间，可将外植体保存在同一培养基上，或一次或多次转移到一种或多种新鲜培养基。还可控制任选预培养步骤的照明和/或温度条件。例如，外植体可在预培养步骤期间暴露于16/8小时光周期暴露，或可能暴露于各种其他光和暗循环或时间。替代地，可在暗或弱光条件下进行预培养步骤。外植体预培养基和周围环境的温度的变化也可为约18℃至约35℃、或约25℃至约30℃或约28℃，并且包括所有中间范围和值。

根据一些实施方案，并且无论是否进行预培养步骤，用于转化的干切除外植体均可任选地在预培养和/或暴露于基因组编辑试剂之前暴露于水合或吸胀培养基中持续有限时间。这种水合或水合步骤可使来自干种子或干燥的种子的外植体更适于编辑或定点整合。实际上，可在转化之前进行水合或吸胀步骤而无需单独的预培养步骤。水合培养基可仅由水组成，或还可包含一种或多种已知的渗压剂，诸如一种或多种糖(例如蔗糖等)、聚乙二醇(PEG)等。例如，水合培养基可包括约10％蔗糖和/或约20％PEG。不受任何理论的约束，渗压剂可调节或减缓外植体的水合速率。水合培养基中还可包括其他成分，诸如各种盐等。水合步骤的时间通常可较短，诸如约2分钟至约12小时、或约20分钟至约6小时、或约30分钟至约2小时、或约1小时。水合或吸胀步骤的时间可足够短，以使得不发生外植体的发芽或至少任何可观察到的发芽或发育变化。替代地，胚胎外植体可被引发以用于发芽，或甚至允许在递送基因组编辑试剂之前发芽。例如，胚胎外植体可通过将发芽阻滞的外植体润湿然后干燥(以产生“干燥的湿”胚胎外植体)来引发以用于发芽。此外，“湿切除”胚胎(从水合种子或湿种子切除的胚胎外植体)也可用作转化的靶标。在任何水合和/或预培养步骤之前、期间和/或之后，还可进行各种冲洗步骤。

根据一些实施方案，可包括一个或多个水合和/或预培养步骤以改良编辑，特别是对于干(或干燥的)外植体，诸如从成熟和/或干(或干燥的)种子取得的外植体，但是这些步骤中的一个或两个可根据用作编辑靶标的外植体的水分含量和/或类型而为任选的。然而，水合和/或预培养步骤可为任选的并且可不包括或不进行，特别是当将“湿”或“湿切除”胚胎外植体用作靶标时，因为这些外植体可能已具有足够的水合水平或水分含量。

无论是否进行一个或多个水合和/或预培养步骤，均可用基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))对外植体进行转化(所述RNP可被预组装和/或包覆在粒子上以用于生物射弹递送)以产生具有至少一个基因组编辑细胞的外植体。在递送基因组编辑试剂之后，然后可在选择外植体的一个或多个基因组编辑细胞的生长和发育的选择压力下，使外植体生长、发育再生等成植物。在某些实施方案中，包覆有基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))的粒子可与包含选择标记基因的DNA分子共转化或共递送，使得基因组编辑细胞的存活、生长和发育可在存在对应的选择剂的情况下是有利的。根据一些实施方案，核酸酶、RNP或编辑酶可与用于插入序列或转基因(例如，感兴趣的基因)向植物细胞基因组中定点整合的供体模板分子共转化或共递送。用于定点整合的供体模板分子还可包含可用作选择基础的选择标记基因。

根据本公开的某些实施方案，通过外植体的粒子介导轰击，将在其表面上具有或包覆有基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))的粒子引入到靶外植体的至少一个细胞中。此种粒子介导轰击可利用本领域中已知的任何合适的粒子枪装置，诸如氦粒子枪、电子粒子枪等。在轰击之前，粒子可装载或包覆有基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))的拷贝以及任选地标记基因和/或供体模板构建体或分子。粒子本身可包括本领域中已知的任何合适类型的粒子或珠粒，诸如金或钨珠粒等。粒子枪的爆破条件为本领域中众所周知的，并且可使用各种常规的屏、破裂盘(rupture disk)等，诸如对于氦粒子枪。电子枪可在减少转化所需的时间的量以及在过程中使用较少的消耗品方面提供一些优势。

对于粒子轰击，可将干胚胎外植体铺板到能够将外植体固定在适当位置的靶培养基或底物上，并适当定向以用于爆破。此种靶培养基或底物可含有例如凝胶剂诸如琼脂和羧甲基纤维素(CMC)以控制培养基或底物的粘度。将外植体铺板在液体诸如水合、预培养或冲洗培养基中，可促进外植体的铺展和定位。根据某些实施方案的粒子轰击所靶向的外植体可被定位成使得外植体的分生组织优先接收爆破粒子。例如，可将外植体放置在表面上，其中它们的分生组织面朝上，以在轰击期间优先接收包覆粒子。每个外植体也可以在不同的压力、力和/或一次或多次下用包覆粒子进行爆破。

根据本公开的选择标记基因与基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))共递送的实施方案，在轰击之后，可将靶向外植体培养在轰击后或培养后选择培养基(或一系列选择培养基)上(或中)，以允许含有选择标记基因的外植体的细胞和组织再生或发育成植物或植物部分(诸如根和/或芽)或选择出所述细胞和组织。选择标记基因可与基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))共递送，以选择出可能已接收基因组编辑试剂和选择标记基因的细胞。一般来讲，选择培养基将含有选择剂，以基于递送至外植体的至少一个细胞的选择标记基因的表达，偏向或有利于外植体细胞的存活、生长、增殖和/或发育(当在一个或多个受体细胞及其子代细胞中表达时，选择标记基因提供对选择剂的耐受性)。然而，根据一些实施方案，轰击外植体可不经受选择压力，并且最终可筛选已发育或再生植物在靶位点处是否存在编辑或突变。

然而，根据一些实施方案，可任选地在靶外植体轰击之后即刻将外植体培养在缺少选择剂的第一轰击后或培养后静息培养基上(或中)持续第一时间，以允许外植体恢复和/或开始表达选择标记基因。此种静息步骤的时间的范围可为约1小时至约24小时、或约6小时至约18小时、或约10小时至约15小时(例如，约12小时或过夜)。虽然编辑的植物的恢复可通过具有非选择性恢复期(例如，在静息培养基上培养)来改良，但是如果选择开始得太晚(例如，在轰炸之后多于18至24小时)，则编辑的植物恢复的频率可能下降。培养后培养基、选择培养基或静息培养基中的每一种均可包括标准植物组织培养基成分，诸如盐、糖、植物生长调节剂等，并且可在标准或不同温度(例如，28℃)和光照条件(例如，16/8小时光周期)下在这些培养基上进行培养。然而，根据编辑频率和选择方案，诸如所使用的特定选择标记基因和选择剂，在选择之前可包括或省略第一培养后或静息步骤。

在外植体在第一非选择性静息培养基上的任何初始恢复和培养之后，外植体可任选地经历增强步骤。根据这些实施方案，外植体可暴露于第二轰击后或增强培养基中或放置在其上(或中)，所述第二轰击后或增强培养基包含渗压剂(诸如聚乙二醇(PEG)等)和/或含钙盐化合物(诸如硝酸钙[Ca(NO₃)₂]等)。例如，硝酸钙的浓度可为约0.1M，并且PEG的浓度可为约20％，但是它们的浓度可能不同。这种增强培养基也可能缺少选择剂。将轰击外植体暴露于增强培养基中，可以起到进一步驱动包覆粒子和/或预组装的核酸酶和标记基因构建体(如果使用的话)进入外植体细胞中的作用。可将外植体放置在增强培养基中或上仅一小段时间，诸如约30分钟至约2小时的范围内，或约1小时，然后可在任何进一步培养或选择步骤之前进行一个或多个冲洗步骤。

如上所提及，轰击的外植体可与一种或多种含有选择剂的选择培养基接触，以偏向具有用于共轰击的选择标记基因构建体的表达的细胞的存活、生长、增殖和/或发育。选择标记基因通常将与用于选择的选择剂配对，使得选择标记基因赋予对以选择剂进行选择的耐受性。例如，选择标记基因可为腺苷酰转移酶基因(aadA)，其赋予对作为选择剂的大观霉素或链霉素的耐受性。

植物选择标记基因或转基因可包括赋予对对应选择剂的耐受性的任何基因，使得用植物选择标记转基因转化的植物细胞可耐受并承受通过选择剂所施加的选择压力。因此，接收选择标记基因的外植体细胞在选择下有利于生长、增殖、发育等。虽然植物选择标记基因通常用于赋予对选择剂的耐受性，但也可使用另外的一种或多种筛选标记或报告基因。此类筛选标记或报告基因可包括例如β-葡萄糖醛酸酶(GUS；例如，如例如美国专利号5,599,670中所述)或绿色荧光蛋白及其变体(GFP，例如美国专利号5,491,084和6,146,826中所述)。在植物、植物部分或植物细胞中可检测的多种筛选标记或报告基因为本领域中已知的，诸如荧光素酶、其他非GFP荧光蛋白以及在植物、植物部分或种子中赋予可检测表型的基因(例如，八氢番茄红素合成酶(phytonene synthase)等)。筛选标记的另外的实例可包括分泌标记，诸如冠瘿碱(opine)合成酶基因等，其表达造成一种或多种可作为用于鉴定转化细胞的手段而进行检测的分子的分泌。

植物选择标记基因可包含编码以下蛋白的基因，所述蛋白提供或赋予对除草剂诸如草甘膦和草铵膦的耐受性或抗性。有用的植物选择标记基因为本领域中已知的，并且可包括编码赋予对以下的抗性或耐受性的蛋白的植物选择标记基因：链霉素或大观霉素(例如，腺苷酰转移酶、aadA或spec/strep)、卡那霉素(例如，新霉素磷酸转移酶或nptII)、潮霉素B(例如，潮霉素磷酸转移酶、hpt、hph或aph IV)、庆大霉素(例如，aac3和aacC4)和氯霉素(例如，氯霉素乙酰转移酶或CAT)。编码赋予除草剂抗性或耐受性的蛋白的已知植物选择标记基因的另外的实例包括例如编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶(用于草甘膦耐受性的EPSP；例如，如美国专利号5,627,061、5,633,435、6,040,497和5,094,945中所述)的可转录DNA分子；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶(GOX；例如，如美国专利号5,463,175中所述；GAT；美国专利公布号2003/0083480中所述)的可转录DNA分子；编码八氢番茄红素去饱和酶的可转录DNA分子(crtI；例如，如Misawa等人,Plant Journal,4:833-840(1993)以及Misawa等人,Plant Journal,6:481-489(1994)中针对达草灭(norflurazon)耐受性所述)；以及双丙氨膦抗性(bar)或草丁膦N-乙酰基转移酶(pat)基因(例如，如DeBlock等人,EMBO Journal,6:2513-2519(1987)中针对草丁膦和双丙氨膦耐受性所述)。

为了进行一个或多个选择步骤，可将外植体与含有选择剂的一种或多种选择培养基接触或放置在其上(或中)。除了施加选择压力之外，选择培养基还可同时提供从轰击外植体再生或发育芽、根和/或整个植物。替代地，再生培养基可用于在不存在选择剂的情况下发育或再生一个或多个芽和/或根。再生和/或选择培养基可含有各种标准植物组织培养成分，诸如盐(例如，MS或B5盐)、一种或多种糖等。再生和/或选择培养基可任选地包括一种或多种植物生长调节剂，诸如生长素和/或细胞分裂素，其可促进或帮助芽和/或根(以及最终整个植物)的发育、伸长或再生。可在一系列标准或不同温度(例如28℃)和光照条件(例如16/8光周期)内进行一个或多个再生和/或选择步骤。这种在选择培养基上从轰击外植体发育基因组编辑R₀植株可能在很大程度上类似于正常的发芽和植物发育过程，但是分生组织的一些重新组织可响应于选择压力而发生，以形成成年植物的芽和/或根和其他植物部分。重要的是，不仅避免了轰击步骤之前的愈伤组织期，而且在轰击后，外植体可进一步发育或再生成基因组编辑R₀植株，而无需在转化之后从外植体形成胚性愈伤组织。

根据本公开的实施方案，可在第一选择培养基(或一系列选择培养基)中培养外植体，直到形成绿芽，然后可将其取出或切下并转移到新的选择培养基。可重复转移或继代培养过程一次或若干次(例如，2次、3次、4次或5次)，以提供多轮转移、继代培养和/或选择。据信，来自外植体的芽在选择压力下的多轮转移、继代培养和/或选择可扩大或增加整个稍后发育或再生的基因组编辑R₀植株的基因组编辑细胞的数量、比例和/或普遍性。

根据一些实施方案，再生培养基也可为选择培养基，诸如上述选择培养基中的一种或多种，也可用作生根培养基，以导致或允许从转移或继代培养的一个或多个芽形成和发育一个或多个根，所述生根培养基可包含一种或多种植物生长调节剂，诸如生长素和/或细胞分裂素。所述一种或多种生根培养基也可各自为选择培养基，并且除了一种或多种植物生长调节剂之外，还包含选择剂。从轰击的外植体发育或再生的生根的小植株(通过在选择压力下的系列转移或继代培养)可最终转移到PlantCon^TM或其他合适的容器和/或盆栽土壤，以用于基因组编辑R₀植株的继续发育，然后可从那些基因组编辑R₀植株收获基因组编辑R₁种子。仅数轮在选择压力下来源于最初轰击的外植体的绿芽的顺序继代培养(和最终生根)可足以形成基因组编辑R₀小植株，从而可进一步发育成产生基因组编辑R₁植株和种子的可育株。本公开通过提供在不同植物种质中以合理的频率产生基因组编辑植物来说明了本领域中的重大进步和改良。实际上，本公开方法避免了在制备用于轰击的干切除外植体，然后从轰击的外植体培养或再生基因组编辑R₀植株的整个过程中的任何阶段对愈伤组织期的需要。与本公开相比，现有的用于基因组编辑的方法通常限于适合更广泛的培养步骤的某些外植体类型以及植物种质和品种。

根据本公开的实施方案，一个或多个选择步骤可在单一选择培养基中进行，或可更优选地在一系列选择步骤或培养基中进行。选择培养基中选择剂的量或浓度可根据所使用的特定选择剂而变化。例如，用于选择标记基因aadA的大观霉素的量可在约50ppm至约250ppm的范围内或为约100ppm或约150ppm。根据一些实施方案，选择剂的量或浓度可在整个选择期保持恒定，或者选择剂的量或浓度可在选择期内逐步加大或增加。分步方法可允许一个或多个转化的外植体细胞恢复更长时间，直至其可实现选择标记基因的更稳健表达，以承受更强的选择压力。然而，在初始选择压力时，选择标记基因的表达可能是足够的，使得分步选择方法将是不必要的。无论哪种方法，均可将外植体周期性地转移或继代培养到新鲜的选择培养基，或者可周期性地用新的选择培养基更换并更新选择培养基。根据一些实施方案，在转移或继代培养到下一培养基之前，可将外植体保持在每种选择培养基中或上持续范围为约几天(例如，2天或3天)至几周(例如，3至4周)、或约1周至约3周的时间或持续约2周。根据涉及使用大观霉素作为选择剂的具体实施方案，大观霉素的浓度可以分步方式从约50ppm增加至约500ppm，或替代地，大观霉素的量浓度可保持相对恒定(例如，约100ppm、约150ppm或约200ppm)。

本公开方法允许在无需广泛培养的情况下从一个或多个轰击的外植体再生和/或发育候选基因组编辑植物，因此增加了鉴定和生长包含一个或多个基因组编辑细胞的芽和植物的效率并且降低了产生期望品种或种质的基因组编辑植物所必需的成本和劳动力。例如，在使用选择标记鉴定了假定的转化体之后，可在存在或不存在选择剂的情况下，将小植株放置在土壤中或土壤替代物上，诸如放置在生根培养基上。可使用分子技术分析从选择或再生的外植体伸长的芽在靶位点处是否存在基因组编辑。基因组编辑R₀植株可进一步产生基因组编辑R₁植株和种子，它们可产生也为基因组编辑的后续后代植株和种子。虽然可在几乎没有选择压力的情况下通过本公开方法产生基因组编辑R₀植株，但是可在一个或多个培养或再生步骤内维持用适当的选择剂维持选择。确定在期望靶位点处具有一个或多个基因组编辑的R1植株可与另一植株杂交，并且可在相对于后代(在不分离后代植物中的一个或多个编辑或突变，且在自交后代中稳定维持纯合性的情况下)中的一个或多个基因组编辑或突变的遗传而固定的一个或多个突变或编辑的下一代中选择纯合基因组编辑植物。如上所述，也可通过在外植体的一个或多个培养、继代培养、芽伸长和/或生根步骤期间用选择剂施加选择压力来选择性或优先地实现或促进R₀植株中基因组编辑细胞的生长、存活、发育等，以产生由于选择标记基因的共递送而具有较大比例的具有一个或多个基因组编辑或突变的细胞的R₀植株，但是可在最初培养之后和/或在R₀植株的剩余寿命期间交替继续(例如，周期性等)选择压力(例如，以局部喷施、土壤或种子应用等的形式)。

已知多种组织培养基，当适当补充时，它们支持植物组织生长和发育，包括从切除的植物组织形成成熟的植物。这些组织培养基可作为商业制剂购买，或由本领域技术人员定制制备和修改。此类培养基的实例包括但不限于由以下描述的培养基：Murashige和Skoog,Physiol.Plant 15:473-497,1962)；Chu等人,(Scientia Sinica 18:659-668,1975)；Linsmaier和Skoog,(Physiol.Plant 18:100-127,1965)；Uchimiya和Murashige,Plant Physiol.57:424-429,1976；Gamborg等人,Exp.Cell Res.50:151-158,1968；Duncan等人,Planta 165:322-332,1985；McCown和Lloyd,HortScience 16:453,1981；Nitsch和Nitsch Plant Physiol.44:1747-1748,1969；以及Schenk和Hildebrandt,Can.J.Bot.50:199-204,1972；或对应地补充的这些培养基的衍生物。本领域技术人员意识到，通常针对特定的感兴趣的靶作物或品种对用于粒子轰击、选择和再生的培养基和培养基补充物(诸如营养素和植物生长调节剂)进行优化。组织培养基可补充有碳水化合物，诸如但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、乳糖、半乳糖和/或葡萄糖，或各比率的碳水化合物。试剂是可商购获得的，并且可购自许多供应商(参见，例如Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO；和PhytoTechnology Laboratories,Shawnee Mission,KS)。这些组织培养基可用作静息培养基，或用作进一步添加了选择剂的选择培养基，并且/或者在补充有一种或多种植物生长调节剂时用作再生培养基。

本公开的实施方案还提供了通过本公开方法产生的基因组编辑植物、植物部分和种子，其在靶位点处或附近包含一个或多个编辑或突变。植物部分包括但不限于果实、种子、胚乳、胚珠、花粉、叶、茎和根。在本公开的某些实施方案中，植物或植物部分为种子。

II.可转化外植体

本公开方法还可包括一个或多个在粒子轰击之前通过任何合适的手动或自动方法从植物种子切除植物胚胎的至少一部分的步骤。根据本公开的实施方案，合适的胚胎外植体还包含胚胎的分生组织(meristem/meristematic tissue)、或分生组织的至少一部分、或胚胎外植体的至少一个分生细胞，因为据信靶向外植体的分生细胞以用于轰击和递送基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))为有效产生和发育或再生基因组编辑植物所必需的。胚胎外植体可缺少一个或多个胚性组织，诸如一个或多个子叶、一个或多个下胚轴、胚根等，只要其保留胚胎分生组织的至少一部分即可。根据本公开的许多实施方案，使用从干种子切除的成熟的胚胎外植体可为优选的，但是它们可能需要在粒子轰击之前进行一个或多个水合和/或预培养步骤。

用于从植物种子产生或切除胚胎外植体的任何合适的方法均可与本公开的实施方案结合使用。这些方法可自动化和/或手动进行，并且可涉及单一化(singulated)或成批(bulk)过程。根据许多实施方案，胚胎外植体可为从干成熟的植物种子取得或切除的成熟的胚胎外植体(或其部分)。对于任何给定的植物物种，成熟的种子或胚可关于大于或等于一定数目的授粉后天数(DAP)来定义，以区分同一植物物种的不成熟种子或胚胎，但是给定植物物种从不成熟到成熟胚胎的转变可为渐进的。一般来讲，如本领域所知，从不成熟到成熟胚胎的转变伴随着种子和胚胎的干燥或脱水的自然过程(除了其他发育变化之外)。

由于种子和胚胎的发育或成熟伴随着干燥，所以本公开方法中使用的成熟种子或胚胎外植体还可关于其水分含量来定义。此外，胚胎外植体可根据其被切除的种子的水分含量来定义。例如，根据本发明方法使用的种子或胚胎外植体的水分含量可最初为以下或在以下范围内：约3％至约25％、或约4％至约25％、或约3％或4％至约20％、或为在此类更广泛百分比范围内的任何百分比值或范围或在其内(取决于特定的植物物种)，诸如约5％至约20％、约5％至约15％、约8％至约15％和约8％至约13％。实际上，在用于本公开方法实施方案之前，可在切除胚胎外植体之前对植物种子进行人工干燥或脱水，只要种子和胚保持活力并能够用于粒子轰击和发育或再生即可。干燥种子可促进从种子切除胚胎外植体和/或储存来自种子的胚胎外植体。替代地或此外，种子可在外植体的切除之前水合或吸胀，以在切除步骤期间诸如促进胚胎、软化胚胎、减少对胚胎的损伤和/或维持胚胎的活力。然而，种子或外植体的水合可降低或消除种子或外植体的耐贮性，即使随后对种子或外植体进行干燥或脱水。

对于胚胎外植体以及用于从可能事先进行水合、引发或发芽的干种子、干燥的种子和/或成熟的种子切除胚胎外植体的方法的进一步描述，参见例如美国专利号8,466,345、8,362,317和8,044,260以及美国专利公布号2016/0264983。不管所使用的种子类型和用于从种子机械切除胚胎外植体的精确方法如何，还可执行另外的步骤和过程，诸如灭菌、淘汰等，以制备和/或富集用于粒子轰击的外植体。还可在切除之后，但在粒子轰击步骤之前，对干或干燥的胚胎外植体进行水合、引发和/或发芽。

可在用于本发明方法之前不到一天从种子移除与本公开一起使用的胚胎外植体，诸如在使用之前约1至24小时，包括在使用之前约2、6、12、18或22小时。然而，根据其他实施方案，种子和/或外植体可在其使用之前储存较长时间，包括数天、数周、数月或甚至数年，这取决于用于维持种子和/或外植体活力的储存条件。使用干成熟种子作为生产或切除适于基因组编辑的胚胎外植体的来源的优点和益处在于，干成熟种子和/或外植体可在干燥条件下储存(在储存期间不发芽，并且保持活力且能够进行转化)。此类干燥储存条件可定义为储存于以下环境或周围环境中，所述环境或周围环境的水分含量或湿度足够低，使得所储存的种子和/或外植体在用于当前转化方法之前不发芽并保持活力且能够进行转化持续期望长的时间，诸如约1小时至约2年、或约24小时至约1年或持续那些更广泛的时间范围内的任何特定时间段或时间段范围。通过使用可储存种子或外植体，可在无需供体植物的情况下获得可靠的种子或外植体源材料的供应。储存成熟干种子的能力涉及干成熟种子和胚胎的自然特性。换句话讲，干成熟种子和/或胚胎外植体还可关于其静止、停滞或低代谢状态或活性来定义。因此，根据本公开方法使用的干种子或外植体可关于其低代谢状态和/或通过其代谢或发育静止或停滞状态来定义，直至种子或胚胎的稍后水合和发芽。

根据一些实施方案，可在从种子切除胚胎外植体之前或之后进行胚胎外植体或种子的水合或发芽。换句话讲，除任何预培养步骤之外，在切除胚胎外植体之前，可对种子进行吸胀或水合以允许种子开始发芽和/或发育，或替代地，可从种子切除干胚胎外植体，然后进行吸胀或水合以触发胚胎外植体的发芽和/或发育。然后，可在不预先使靶组织变绿的情况下对引发或发芽的种子进行粒子轰击，这可通过粒子轰击步骤之前的时间量和/或有限的光暴露量来控制。然而，如上所述，水合步骤替代地仅用于对干胚胎外植体进行水合，以使“润湿的”外植体更容易受到粒子轰击并递送基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))，而无需使胚胎发芽或进一步发育(例如，水合或吸胀步骤的时间可为有限的，以使得在轰击之前胚胎外植体不发生明显的发育变化和/或发芽)。

与本文所提供的方法实施方案一起使用的外植体可包括来自多种单子叶(monocotyledonous/monocot)植物和双子叶(dicotyledonous/dicot)植物的外植体，包括农业作物物种，诸如玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦、大麦、甘蔗、非洲油棕、柳枝稷植物、棉花、油菜、甜菜、苜蓿、大豆和其他豆科(Fabaceae或leguminous)植物。

III.基因组编辑

本公开的细胞、植物、植物部分和种子是通过使用位点特异性整合或基因组编辑进行的基因组修饰而产生的。通过基因组编辑来靶向修饰植物基因组可用于产生性状改良的作物植物。基因组编辑可用于在植物基因组中的期望靶位点处产生一个或多个编辑或突变，诸如以改变一个或多个基因的表达和/或活性，或在植物基因组中的期望位置处整合插入序列或转基因。如本文所用，“定点整合”是指使多核苷酸(例如，插入序列、调控元件或转基因)靶向整合或插入到植物基因组中的基因组编辑方法和技术。如本文所提供，可将基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))或编码一种或多种基因组编辑试剂的一种或多种核酸递送至外植体的受体细胞，诸如外植体的分生细胞。在不将一种或多种编码基因组编辑试剂的转基因转化、整合或并入到受体细胞中的情况下将基因组编辑试剂(诸如核酸酶蛋白、指导核酸和/或核糖核蛋白(RNP))递送至外植体的受体细胞的能力，通过经由粒子轰击将基因组编辑试剂递送至受体细胞，使得有可能改变非转基因受体细胞基因组(而无需用转基因转化受体细胞的基因组)。

可根据本文所提供的方法，可将任何合适的基因组编辑试剂(诸如锌指核酸酶(ZFN)、核酸指导核酸酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、大范围核酸酶、重组酶、转座酶或其任何组合)以蛋白或核糖核蛋白(RNP)的形式递送至外植体的细胞，以在外植体细胞和/或其子代细胞基因组内的靶位点处导致基因组编辑或定点整合。在指导核酸酶或核酸内切酶(诸如成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed ShortPalindromic Repeat；CRISPR)酶)的情况下，核酸酶可与指导RNA共递送以引导核酸酶到达靶位点，所述靶位点可与RNA指导核酸酶复合以形成核糖核蛋白(RNP)。位点特异性核酸酶还可包括任何已知位点特异性核酸酶的同源物或修饰形式，其共享保守氨基酸并且关于其各自的蛋白序列具有较高的同一性百分比(例如，在其蛋白序列中的比对长度内至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)。

根据一些实施方案，基因组编辑试剂可与供体模板分子共递送以用作模板，用于通过修复由基因组编辑试剂产生的双链断裂(DSB)或缺口，在期望的靶位点处进行向基因组中的期望的编辑、突变或插入。根据一些实施方案，基因组编辑试剂可与包含选择或筛选标记基因的DNA分子共递送。在每种情况下，任选地除供体模板分子和/或编码选择或筛选标记的DNA分子之外，可将基因组编辑试剂施加或包覆于用于向外植体的受体细胞的生物射弹或粒子递送的粒子上。根据一些实施方案，可将基因组编辑试剂施加或包覆于用于向外植体的一个或多个受体细胞的生物射弹或粒子递送的粒子上，其中外植体的所述一个或多个受体细胞在粒子轰击之前包含一种或多种DNA分子和/或转基因，其可稳定地转化成受体细胞的基因组，其中此类一种或多种DNA分子和/或转基因包含或编码以下中的一种或多种：(i)供体模板分子，以用作用于在期望靶位点处向基因组中进行期望的编辑、突变或插入的模板；(ii)选择或筛选标记基因；和/或(iii)指导核酸，以引导指导核酸酶到达期望的靶位点。

基因组编辑试剂可为指导核酸酶。根据一些实施方案，指导核酸酶可为选自由以下组成的组的CRISPR相关蛋白：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cpf1(也称为Cas12a)、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY、CasZ以及其同源物或修饰形式、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute(TtAgo)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)以及其同源物或修饰形式)。根据一些实施方案，指导核酸内切酶为Cas9或Cpf1酶。指导核酸酶可作为具有或不具有指导核酸的蛋白递送，并且指导核酸可与指导核酸酶复合并作为蛋白/指导核酸复合物递送。

对于指导核酸内切酶，还可提供指导核酸(诸如指导RNA(gRNA))分子，以经由碱基配对或杂交来将核酸内切酶引导至植物基因组中的靶位点，从而在靶位点处或附近产生DSB或切口。指导核酸可作为指导核酸分子，或作为包含可操作地连接至启动子或植物可表达启动子的编码指导RNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体来转化或引入到植物细胞或组织中。启动子可为组成型启动子、组织特异性或组织优选启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。

如本文所用，术语“指导核酸”是指包含以下的核酸：第一片段，其包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列；和第二片段，其与指导核酸酶蛋白相互作用。在一些实施方案中，包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列的指导的第一片段对应于CRISPR RNA(crRNA或crRNA重复序列)。在一些实施方案中，包含与指导核酸酶蛋白相互作用的核酸序列的指导的第二片段对应于反式作用CRISPR RNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，指导核酸包含两种单独的彼此杂交的核酸分子(与靶核酸中的序列互补的多核苷酸和与指导核酸酶蛋白相互作用的多核苷酸)，并且在本文中称为“双重指导(double-guide)”或“双分子指导(two-molecule guide)”。在一些实施方案中，双重指导可包含DNA、RNA或DNA和RNA的组合。在其他实施方案中，指导核酸为单个多核苷酸，并且在本文中称为“单分子指导”或“单指导”。在一些实施方案中，单指导可包含DNA、RNA或DNA和RNA的组合。术语“指导核酸”是包括性的，指双分子指导和单分子指导。

如本领域所知，前间隔序列邻近基序(protospacer-adjacent motif；PAM)可存在于紧邻基因组靶位点序列的5'端且在其上游的基因组中，所述基因组靶位点序列与指导核酸的靶向序列互补，所述靶向序列紧靠基因组靶位点(相对于指导RNA的靶向序列)的有义(+)链的下游(3')。参见，例如，Wu,X.等人,“Target specificity of the CRISPR-Cas9system,”Quant Biol.2(2):59-70(2014)。与靶位点(相对于指导RNA的靶向序列)相邻的有义(+)链上的基因组PAM序列可包含5’-NGG-3’。然而，指导核酸的对应序列(紧靠指导核酸的靶向序列的下游(3'))通常可能不与基因组PAM序列互补。

指导核酸通常可为不编码蛋白的非编码核酸分子。指导核酸的指导序列的长度可为至少10个核苷酸，诸如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、或17-25个核苷酸，或长度为约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸。指导序列可与基因组靶位点处的DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。

除了指导序列之外，指导核酸还可包含一个或多个其他结构或支架序列，所述一个或多个其他结构或支架序列可与指导核酸酶结合或相互作用。此类支架或结构序列还可与其他RNA分子(例如，tracrRNA)相互作用。用于设计使用指导核酸酶在植物基因组内的靶位点处进行基因组编辑和定点整合的靶向构建体和指导核酸的方法和技术是本领域已知的。

若干位点特异性核酸酶(诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN)不是核酸指导的，而是依靠它们的蛋白结构来确定它们用于造成DSB或切口的靶位点，或者它们融合、拴系或连接于DNA结合蛋白结构域或基序。位点特异性核酸酶(或融合/连接/拴系的DNA结合结构域)的蛋白结构可使位点特异性核酸酶靶向靶位点。根据许多这些实施方案，非核酸指导位点特异性核酸酶(诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN)可根据已知方法设计、工程改造和构建，以靶向并结合植物的内源基因的基因组基因座处或附近的靶位点，以在此类基因组基因座处产生DSB或切口，以便通过DSB或切口的修复敲除或敲减基因的表达，这可导致通过可由供体模板分子指导的细胞修复机制来在DSB或切口的位点处产生序列突变或插入。

在一些实施方案中，位点特异性核酸酶为重组酶。重组酶可为与DNA识别基序连接的丝氨酸重组酶、与DNA识别基序连接的酪氨酸重组酶或本领域已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可为与DNA结合结构域连接或融合的DNA转座酶或重组酶。重组酶的非限制性实例包括连接等至本文所提供的DNA识别基序的酪氨酸重组酶，其选自由Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶组成的组。在一个方面中，本文所提供的Cre重组酶或Gin重组酶与锌指DNA结合结构域、或TALE DNA结合结构域、或Cas9核酸酶拴系在一起。在另一方面中，连接至本文所提供的DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组。在另一方面中，连接至本文所提供的DNA结合结构域的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。

位点特异性核酸酶可为锌指核酸酶(ZFN)。ZFN为由与切割结构域(或切割半结构域)融合的工程改造的锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白，其可源自限制性核酸内切酶(例如，FokI)。DNA结合结构域可为典型的(C2H2)或非典型的(例如，C3H或C4)。根据靶位点，DNA结合结构域可包含一个或多个锌指(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个锌指)。DNA结合结构域中的多个锌指可通过一个或多个接头序列分开。ZFN可被设计成通过锌指DNA结合结构域的修饰来切割双链DNA的几乎任何链段。ZFN由包括与DNA结合结构域融合的非特异性DNA切割结构域(例如，源自FokI核酸酶)的单体形成二聚体，所述DNA结合结构域包括被工程改造以结合靶位点DNA序列的锌指阵列。ZFN的DNA结合结构域通常可由3至4个(或更多个)锌指组成。相对于促成与靶位点的位点特异性结合的锌指α-螺旋的起点而言的-1、+2、+3和+6位处的氨基酸可改变和定制以适应特定靶序列。其他氨基酸可形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。

用于设计靶向和结合特定靶序列的ZFN的方法和规则是本领域已知的。参见，例如，美国专利申请号2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062。FokI核酸酶结构域可能需要二聚化来切割DNA并且因此需要具有其C端区域的两个ZFN来结合切割位点的相反DNA链(分开5-7bp)。如果双ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可切割靶位点。如本文所用，ZFN是广义的并且包括单体ZFN，所述单体ZFN可在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA。术语ZFN还可用于指被工程改造成共同作用以在同一位点处切割DNA的一对ZFN的一个或两个成员。不受任何理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性可使用各种方法中的一种重新工程改造，因此定制的ZFN在理论上可被构建成靶向几乎任何靶序列(例如，在植物基因组中的基因处或附近的靶序列)。用于工程改造锌指结构域的公开可获得的方法包括背景依赖组装法(Context-dependent Assembly；CoDA)、寡聚体库工程法(OligomerizedPool Engineering；OPEN)和模块组装法。在一个方面中，本文所提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种ZFN。在另一方面中，本文所提供的ZFN能够产生靶向DSB或切口。

位点特异性核酸酶可为TALEN酶。TALEN为通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域(例如，FokI)融合而产生的人工限制性酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点处造成双链DNA断裂。除野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改良切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数均是实现高活性水平的参数。

TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面中，核酸酶选自由以下组成的组：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051和Pept071。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点处造成双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广义的并且包括单体TALEN，所述单体TALEN可在没有另一个TALEN帮助的情况下切割双链DNA。术语TALEN还指共同作用以在同一位点处切割DNA的一对TALEN的一个或两个成员。

转录激活因子样效应物(TALE)可被工程改造成实际上结合任何DNA序列，诸如在植物中的基因的基因组基因座处或附近的序列。TALE具有由13至28个具有33至34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除了12和13位的高变氨基酸残基之外，各单体的氨基酸都是高度保守的。两种可变氨基酸被称为重复序列可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复序列区段的组合来工程改造特定的DNA结合结构域。

除野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改良切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数均是实现高活性水平的参数。PvuII、MutH和TevI切割结构域是用于与TALE一起使用的FokI和FokI变体的可用替代物。当与TALE偶联时，PvuII作为高度特异性的切割结构域起作用(参见Yank等人2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在靶向位点处在DNA中引入双链断裂(参见Beurdeley等人,2013.Nature Communications.4:1762)。

氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白。诸如DNAWorks的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法为本领域技术人员已知的。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人,Nucleic Acids Research(2011)39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。在另一方面中，本文所提供的TALEN能够产生靶向DSB。

位点特异性核酸酶可为大范围核酸酶。通常在微生物中鉴定出的大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族，为具有高活性和导致靶DNA的位点特异性消化的长识别序列(＞14bp)的独特的酶。天然存在的大范围核酸酶的工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可包含选自由I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI组成的组的支架或碱基酶。大范围核酸酶的工程改造可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能交织在单个结构域中。已经使用专门的诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列并具有改良的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，大范围核酸酶可经选择或工程改造以结合植物中的基因组靶序列，诸如在基因的基因组基因座处或附近的靶序列。在另一方面中，本文所提供的大范围核酸酶能够产生靶向DSB。

根据一些实施方案，可将供体模板与位点特异性核酸酶共递送至外植体的受体细胞，以用作在通过位点特异性核酸酶修复受体细胞基因组的靶位点处修复双链断裂(DSB)或切口期间产生期望编辑的模板。替代地，供体模板可能已存在于外植体的受体细胞中。类似地，对于指导核酸酶，也可将可转录DNA序列或编码指导核酸的转基因与指导位点特异性核酸酶共递送至外植体的受体细胞，以用作引导指导核酸酶在受体细胞基因组中的期望基因座或靶位点处形成双链断裂(DSB)或切口的指导核酸。替代地，指导核酸和/或包含编码指导核酸的可转录DNA序列的DNA分子或转基因可能已存在和/或由外植体的受体细胞表达。

根据一些实施方案，(i)可将位点特异性核酸酶、指导核酸和供体模板施加或包覆于粒子上以用于向受体细胞的生物射弹递送；或(ii)可将位点特异性核酸酶和/或指导核酸施加或包覆于粒子上以用于向受体细胞的生物射弹递送，并且供体模板可任选地存在于受体细胞中或在受体细胞中表达；或(iii)可将位点特异性核酸酶和/或供体模板施加或包覆于粒子上以用于向受体细胞的生物射弹递送，并且指导核酸可任选地存在于受体细胞中或在受体细胞中表达；或(iv)可将指导核酸和/或供体模板施加或包覆于粒子上以用于向受体细胞的生物射弹递送，并且位点特异性核酸酶可任选地存在于受体细胞中或在受体细胞中表达；在每种情况下，进行(i)、(ii)、(iii)或(iv)通过位点特异性核酸酶在受体细胞基因组中的期望基因座或靶位点处形成双链断裂(DSB)或切口，从而在受体植物细胞基因组中的期望位置处产生模板化或非模板化编辑或突变。

可潜在地选择植物基因组内的任何位点或基因座，以用于进行转基因、构建体或可转录DNA序列的基因组编辑(或基因编辑)或定点整合。对于基因组编辑和定点整合，可首先在具有位点特异性核酸酶(诸如像，锌指核酸酶(ZFN)、工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶或指导核酸酶(例如，Cas9或Cpf1))的所选基因组基因座处形成双链断裂(DSB)或切口。可使用本领域已知用于定点整合的任何方法。在存在具有插入序列的供体模板分子的情况下，可通过供体模板的一个或多个同源臂与植物基因组之间的同源重组，或通过非同源末端连接(non-homologous end joining；NHEJ)修复DSB或切口，导致插入序列向植物基因组中的定点整合，以在DSB或切口位点处产生靶向插入事件。因此，如果转基因、可转录DNA序列、构建体或序列位于供体模板的插入序列中，则可实现转基因、可转录DNA序列、构建体或序列的位点特异性插入或整合。

DSB或切口的引入也可用于在植物基因组中引入靶向突变。根据此方法，可经由DSB或切口的不完全修复在靶位点处引入诸如缺失、插入、倒位(inversion)和/或取代的突变，以产生基因的敲除或敲减。即使在不使用供体模板分子的情况下，也可通过靶向基因座的不完美修复来产生此类突变。基因的“敲除”可通过在基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口来实现，这导致蛋白的不表达或非功能蛋白的表达；而基因的“敲减”可通过在基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口而以类似方式实现，所述DSB或切口在不影响基因的编码序列的位点处以将消除所编辑的蛋白的功能的方式不完全修复。例如，内源基因座内DSB或切口的位点可处于基因的上游或5'区(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。类似地，基因的此类靶向敲除或敲减突变可用供体模板分子产生，以经由DSB或切口的修复在靶位点处或附近引导特定或期望的突变。相对于DSB或切口位点处或附近的靶向基因组序列，供体模板分子可包含同源序列，所述同源序列具有或不具有插入序列且包含一个或多个突变，诸如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，基因的靶向敲除突变可通过使基因的至少一部分取代、插入、缺失或倒位，诸如通过将移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中来实现。基因的一部分的缺失还可通过在两个靶位点处产生DSB或切口并造成侧接靶位点的居间靶区域的缺失来引入。

如本文所用，可为重组多核苷酸、DNA或RNA供体模板或序列的“供体分子”，“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为以下核酸分子，所述核酸分子具有同源核酸模板或序列(例如，同源序列)和/或用于经由修复植物细胞基因组中的切口或双链DNA断裂而定点、靶向插入或重组到植物细胞基因组中的插入序列。供体模板可为包含一个或多个同源序列和/或用于靶向整合的插入序列的单独的DNA分子，或供体模板可为还包含一个或多个其他表达盒、基因/转基因和/或可转录DNA序列的DNA分子的序列部分(例如，供体模板区)。例如，“供体模板”可用于转基因或抑制构建体的定点整合，或用作将突变诸如插入、缺失、取代等引入植物基因组内的靶位点中的模板。本文所提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个供体分子或模板。“供体模板”可为单链或双链DNA或RNA分子或质粒。供体模板的“插入序列”为设计用于靶向插入植物细胞基因组的序列，其可具有任何合适的长度。例如，供体模板的插入序列的长度可为2与50000个之间、2与10000个之间、2与5000个之间、2与1000个之间、2与500个之间、2与250个之间、2与100个之间、2与50个之间、2与30个之间、15与50个之间、15与100个之间、15与500个之间、15与1000个之间、15与5000个之间、18与30个之间、18与26个之间、20与26个之间、20与50个之间、20与100个之间、20与250个之间、20与500个之间、20与1000个之间、20与5000个之间、20与10000个之间、50与250个之间、50与500个之间、50与1000个之间、50与5000个之间、50与10000个之间、100与250个之间、100与500个之间、100与1000个之间、100与5000个之间、100与10000个之间、250与500个之间、250与1000个之间、250与5000个之间、或250与10000个之间的核苷酸或碱基对。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，诸如两个同源臂，以经由同源重组将突变或插入序列整合到植物基因组内的靶位点中，其中同源序列或所述一个或多个同源臂与植物基因组内靶位点处或附近的序列相同或互补或具有一定的百分比同一性或百分比互补性。当供体模板包含一个或多个同源臂以及插入序列时，所述一个或多个同源臂将侧接供体模板的插入序列或在其周围。

根据一些实施方案，供体模板可包含重组多核苷酸分子或构建体的“供体模板区”，所述重组多核苷酸分子或构建体用作插入序列或模板介导的修复的位点特异性整合的供体模板，其中重组多核苷酸分子或构建体还包含供体模板区之外的可独立于供体模板的其他元件。例如，重组多核苷酸分子或构建体可包含“供体模板区”和一个或多个转基因，诸如选择标记和/或编码非编码RNA分子(诸如指导RNA或用于抑制靶基因的RNA分子)的可转录DNA序列。

供体模板的插入序列可包含一个或多个基因或序列，所述一个或多个基因或序列各自编码转录的非编码RNA或mRNA序列和/或翻译的蛋白序列。供体模板的转录序列或基因可编码蛋白或非编码RNA分子。非编码RNA分子可为例如指导RNA或靶向抑制基因的RNA分子(例如，微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA链、反向重复序列等)。供体模板的插入序列可包含有不包含功能基因或完整基因序列的多核苷酸序列(例如，供体模板可仅包含调控序列，诸如启动子序列，或仅包含基因或编码序列的一部分)，或可不含有任何可鉴定基因表达元件或任何活跃转录的基因序列。此外，供体模板可为线性或圆形的，并且可为单链或双链的。供体模板可以DNA分子或从转基因表达的RNA分子的形式递送至细胞。供体模板可以裸核酸分子的形式或以与一种或多种递送剂(例如，脂质体、蛋白、泊洛沙姆、用蛋白封装的T链等)的复合物的形式递送至细胞。本文所提供的供体模板的插入序列可包含可转录成RNA分子的可转录DNA序列，所述RNA分子可为非编码或蛋白编码的，并且可转录DNA序列可以可操作地连接至启动子和/或其他调控序列，诸如组成型、诱导型或组织特异性启动子。

根据一些实施方案，供体模板可不包含插入序列，而是包含一个或多个同源序列，所述一个或多个同源序列包括一个或多个突变，诸如相对于植物基因组内靶位点处(诸如植物基因组内的基因处或附近)的基因组序列的插入、缺失、取代等。替代地，供体模板可包含有不包含编码或可转录DNA序列的插入序列，其中插入序列用于将一种或多种突变引入植物基因组内的靶位点中，诸如植物基因组内的基因处或附近。

本文所提供的供体模板可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个基因或转基因和/或可转录DNA序列。替代地，供体模板可不包含基因、转基因或可转录DNA序列。在不受限制的情况下，供体模板的基因/转基因或可转录DNA序列可包括例如杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮素利用效率基因(nitrogen use efficiency gene)、水分利用效率基因(water useefficiency gene)、增产基因(yield enancing gene)、营养品质基因(nutritionalquality gene)、DNA结合基因、选择标记基因、RNAi或抑制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、CRISPR/Cas9系统的单指导RNA、基于双生病毒的表达盒或植物病毒表达载体系统。根据其他实施方案，供体模板的插入序列可包含蛋白编码序列或编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，所述非编码RNA分子可靶向用于抑制的内源基因。供体模板可包含可操作地连接至编码序列、基因或可转录DNA序列的启动子，诸如组成型启动子、组织特异性或组织优选启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。供体模板可包含前导、增强子、启动子、转录起始位点、5'-UTR、一个或多个外显子、一个或多个内含子、转录终止位点、区域或序列、3'-UTR、和/或聚腺苷酸化信号，其可各自可操作地连接编码非编码RNA、指导RNA、mRNA和/或蛋白的编码序列、基因(或转基因)或可转录DNA序列。

根据本发明实施方案，重组供体模板多核苷酸分子的一部分(例如，插入序列)可通过基因组编辑而插入或整合在植物基因组内的期望位点或基因座处。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如编码非编码RNA分子的蛋白编码转基因或可转录DNA序列，所述非编码RNA分子靶向用于抑制的内源基因。供体模板还可具有侧接插入序列的一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复促进靶向插入事件。每个同源臂可与植物基因组内的靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。根据一些实施方案，用于将插入序列定点或靶向整合和/或将一个或多个同源序列重组到植物基因组中的重组DNA供体模板分子可与位点特异性核酸酶蛋白或RNP共递送，所述插入序列可包含转基因或构建体，诸如编码非编码RNA分子的转基因或可转录DNA序列，所述非编码RNA分子靶向用于抑制的内源基因。重组DNA供体模板还可包含选择或筛选标记基因和/或编码指导核酸的转基因，其中标记基因和编码指导核酸的转基因可各自可操作地连接至植物可表达启动子和/或其他表达调控元件。

如本文所用，用于基因组编辑或定点整合的“靶位点”是指植物基因组内多核苷酸序列的位置，其被基因组修饰酶结合，以向植物基因组内多核苷酸序列和/或其互补DNA链的核酸骨架中引入修饰。靶位点可包含至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个或至少30个连续核苷酸。核酸指导核酸酶的“靶位点”可包含在靶位点处的双链核酸(DNA)分子或染色体的任一互补链的序列。位点特异性核酸酶可与靶位点结合，诸如通过非编码指导核酸(例如但不限于，如本文进一步描述的CRISPR RNA(crRNA)或单指导RNA(sgRNA))。本文所提供的非编码指导核酸可与靶位点互补(例如，与在靶位点处的双链核酸分子或染色体的任一链互补)。应当理解，非编码指导核酸与靶位点结合或杂交可能不需要完全的同一性或互补性。例如，可容许靶位点与指导核酸之间有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个错配(或更多)。“靶位点”还指植物基因组内多核苷酸序列的位置，其被可不通过指导核酸指导的任何其他位点特异性核酸酶(诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)等)结合和切割，以向多核苷酸序列和/或其互补DNA链中引入双链断裂(或单链切口)。

如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧接两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。在不受限制的情况下，在一些实施方案中，在两个靶位点处修复双链断裂或切口之后，靶区域可经受突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，当用于描述多核苷酸序列或分子的靶区域时，“侧接”是指靶区域周围的多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶位点，在靶区域的每一侧具有一个靶位点。

本文提供了用于经由将位点特异性核酸酶蛋白或RNP递送至成熟和/或干切除外植体的至少一个细胞中来制备转基因或基因组编辑的植物、植物部分和种子的方法，以及本文所述的发育或再生基因组编辑或转基因植物的各种培养和处理步骤。还提供了根据本发明方法制成的转基因或基因组编辑植物、植物部分和种子。根据本公开的一个方面，可基于通过编辑或突变，或通过在已发育或再生植物或其后代植物、植物部分或种子中定点整合插入序列、转基因等所产生的标记、性状或表型筛选或选择从用位点特异性核酸酶进行粒子轰击的外植体发育或再生植物或其后代植物。如果给定的突变、编辑、性状或表型是隐性的，则可能需要一次或多次从初始R0植株的世代或杂交(例如自交)，以产生编辑或突变纯合型的植物，以便可观察性状或表型。可使用允许区分杂合子、纯合子和野生型植物的任何已知的接合性测定(诸如通过使用SNP测定、DNA测序、热扩增或PCR、和/或Southern印迹)测试子代植物(诸如从R1种子或后代中生长的植物)的接合性。

在其他实施方案中，可基于检测编辑或突变的存在或者插入序列、转基因等的定点整合的分子测定筛选或选择从用位点特异性核酸酶进行粒子轰击的外植体发育或再生的植物、或其后代植物、或前述的植物部分或种子的一个或多个组织或细胞。可用于检测通过定点整合来引入的编辑或突变或转基因的存在的测定包括例如：分子生物学测定，诸如Southern和Northern印迹、PCR、FLA和DNA测序；生化测定，诸如例如通过免疫学手段(ELISA和western印迹)或通过酶功能或体外分析来检测蛋白产物的存在。替代地，可基于表型或性状筛选或选择从用位点特异性核酸酶进行粒子轰击的外植体发育或再生的植物、或其后代植物或种子，所述表型或性状可为期望或预测的表型或性状。

IV.定义

提供以下定义以参考如本文所用的本公开的相关实施方案来定义和阐明这些术语的含义，并指导本领域普通技术人员理解本公开。除非另外说明，否则术语应根据其在相关领域中，特别是在分子生物学和植物转化领域中的常规含义和用法来理解。

“胚胎”为植物种子的一部分，其由可发育成所有或部分成年植物的前体组织(例如，分生组织)组成。“胚胎”还可包括植物胚胎的一部分。

“分生组织”包含未分化的细胞或分生细胞，它们能够分化以产生一种或多种类型的植物部分、组织或结构，诸如芽、茎、根、叶、种子等的所有或部分。

术语“再生(regeneration和regenerating)”是指通过一个或多个培养步骤从一个或多个植物细胞生长或发育植物的过程。

关于多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白、构建体、载体等的术语“重组”是指多核苷酸或蛋白分子或序列，所述分子或序列是人造的且通常未发现于自然界中，和/或存在于其中自然界中通常未发现所述分子或序列的情况下，包括包含两种或更多种以相同方式而无人类干预将不能天然地一起存在的多核苷酸或蛋白序列的组合的多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白、构建体等，如包含至少两种可操作性连接但彼此异源的多核苷酸或蛋白序列的多核苷酸分子、蛋白、构建体等。例如，术语“重组”可指两个或更多个DNA或蛋白序列在相同分子(例如质粒、构建体、载体、染色体、蛋白等)中的任何组合，其中此类组合为人造的并且通常不存在于自然界中。如此定义中所用，短语“通常不存在于自然界中”意指在不人为引入的情况下不存在于自然界中。重组多核苷酸或蛋白分子、构建体等可包含(i)与自然界中彼此邻近存在的一个或多个其他多核苷酸或蛋白序列分离，和/或(ii)与非天然地彼此邻近的一个或多个其他多核苷酸或蛋白序列相邻(或邻接)的一个或多个多核苷酸或蛋白序列。此类重组多核苷酸分子、蛋白、构建体等还可指已经过基因工程改造和/或在细胞外构建的多核苷酸或蛋白分子或序列。例如，重组DNA分子可以包含任何工程改造的或人造质粒、载体等，并且可以包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有多种维持元件，包括原核生物复制起点和选择标记，以及除了植株选择标记基因以外可能存在的一种或多种转基因或表达盒等。

如本文所用，术语“基因组编辑试剂”是指可以序列特异性方式修饰核苷酸序列的任何酶。在一些实施方案中，基因组编辑试剂通过诱导单链断裂来修饰基因组。在一些实施方案中，基因组编辑试剂通过诱导双链断裂来修饰基因组。在一些实施方案中，基因组编辑试剂包含胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，基因组编辑试剂包含腺嘌呤脱氨酶。在本公开中，基因组编辑试剂包括核酸内切酶、重组酶、转座酶、脱氨酶、解旋酶及其任何组合。在一些实施方案中，基因组编辑试剂为序列特异性核酸酶。

在一个方面中，基因组编辑试剂为选自以下的核酸内切酶：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈热球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(NgAgo))、指导核酸酶诸如CRISPR相关核酸酶(CRISPR相关核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cpf1(也称为Cas12a)、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY、其同源物或其修饰形式)。

在一些实施方案中，基因组编辑试剂包含可操作地连接至脱氨酶的DNA结合结构域。在一些实施方案中，DNA结合结构域源自CRISPR相关蛋白。在一些实施方案中，基因组编辑试剂包含尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)。在一些实施方案中，脱氨酶为胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶为APOPEC脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶为激活诱导的胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase；AID)。在一些实施方案中，DNA结合结构域为锌指DNA结合结构域、TALE DNA结合结构域、Cas9核酸酶、Cpf1核酸酶、催化失活的Cas9核酸酶、催化失活的Cpf1核酸酶、Cas9切口酶或Cpf1切口酶。

在一些实施方案中，基因组编辑试剂为重组酶。重组酶的非限制性实例包括连接至本文所提供的DNA识别基序的酪氨酸重组酶，其选自由Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶组成的组。在一个方面中，本文所提供的Cre重组酶或Gin重组酶与锌指DNA结合结构域、或TALE DNA结合结构域、或Cas9核酸酶拴系在一起。在另一方面中，连接至本文所提供的DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组。在另一方面中，连接至本文所提供的DNA结合结构域的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。

术语“可操作地连接”是指启动子或其他调节元件与基因(或转基因)的相关可转录DNA序列或编码序列之间的功能性键联，使得启动子等操作或起作用以至少在某个或某些细胞、组织、发育阶段和/或条件中启动、协助、影响、引起和/或促进相关可转录DNA序列或编码序列的转录和表达。

如本领域通常理解的，术语“启动子”通常可指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并协助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可由已知或天然存在的启动子序列或其他启动子序列人工产生、变化或衍生。启动子还可包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本公开的启动子可包括与本文已知或提供的一个或多个其他启动子序列在组成上类似但不相同的启动子序列的变体。可根据与可操作地连接启动子的相关编码或可转录序列或基因(包括转基因)的表达模式有关的多种标准对启动子进行分类，诸如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。在植株的所有或大多数组织中驱动表达的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段期间驱动表达的启动子称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织而驱动植物的某些组织中的表达增强的启动子被称为“组织增强”或“组织优选”启动子。因此，“组织优选”启动子在植物的一个或多个特定组织中引起相对较高或优先的表达，但在植株的一个或多个其他组织中表达水平较低。在植物的一个或多个特定组织内表达而在其他植物组织中几乎不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。“诱导型”启动子为响应于环境刺激诸如冷、干旱或光照或其他刺激诸如伤口或化学施加而启动转录的启动子。启动子也可关于其来源进行分类为诸如异源、同源、嵌合、合成等。

如本文所用，“植物可表达的启动子”是指可在植物细胞或组织中启动、协助、影响、引起和/或促进其相关可转录DNA序列、编码序列或基因的转录和表达的启动子。

关于相关多核苷酸序列(例如，可转录DNA序列或编码序列或基因)的术语关于启动子或其他调控序列“异源”为启动子或调控序列在不进行人为引入的自然界中不可操作地连接至此类相关多核苷酸序列，例如启动子或调控序列相对于相关多核苷酸序列具有不同来源和/或启动子或调控序列不天然存在于要用启动子或调控序列转化的植物种类中。同样，与相关多核苷酸序列(诸如转基因、编码序列或可转录DNA序列)相关的“异源启动子”或“异源植物可表达的启动子”意指在不进行人为引入的自然界中不存在于相关多核苷酸附近和/或可操作地连接至相关多核苷酸的启动子或植物可表达的启动子。

在一些实施方案中，除非另外特别指示，否则在描述特定实施方案的上下文中(尤其是在某些以下权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种(a/an)”和“所述”以及类似指称对象可解释为涵盖单数和复数两者。在一些实施方案中，术语“或”在本文中用于意指"和/或"，除非明确指示仅指代替代方案或这些替代方案是相互排斥的。

术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”为开放式连系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有这一个或多个步骤并且还可涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或装置不限于仅具有那些一个或多个特征并且可涵盖其他未列出的特征。

如本文关于两个或更多个核苷酸或蛋白序列所用的术语“同一性百分比”、“同一性％”或“百分比相同”通过以下方式计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对序列，(ii)确定两条序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白)的位置的数目以得到匹配位置的数目，(iii)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且(iv)将此商乘以100％以得到同一性百分比。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，那么通过将比对区域上的匹配位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。例如，“比较窗口”可被定义为比对区域，在这种情况下，“同一性百分比”也称为“比对同一性百分比”。因此，如本文所用，当对两条序列(查询和目标)进行最佳比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于两条序列之间的相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)上位置的总数，然后乘以100％。

根据一些实施方案，粒子复合物或组合物的组合物和制剂可包含“有效量”或“有效浓度”的位点特异性核酸酶，可能连同其他组分，以编辑植物的基因组。粒子/核酸酶组合物或制剂的有效量或浓度可取决于许多因素，诸如像预组装的核酸酶组合物或制剂所应用的粒子的类型、大小和量；期望基因组编辑的效率；组合物或制剂中其他成分的同一性和量；特定的植物物种；所用植物材料的类型(例如，干切除外植体、湿切除胚等)；以及将组合物或制剂应用于植物材料的特定条件(例如，温度、培养条件等)。

一些实施方案中的组合物还可包含与粒子/核酸酶组合物组合的农业上可接受的载剂或材料。如本文所用，关于载剂或材料的术语“农业上可接受的”意谓载剂或材料视情况而定(i)至少出于使用粒子/核酸酶组合物的目的而与粒子/核酸酶组合物的其他成分相容；(ii)可包括在粒子/核酸酶组合物中，以有效且可行地将粒子/核酸酶组合物递送至植物材料(例如，干切除外植体)，以及(iii)对于将应用组合物的植物材料为无害的(至少在将其应用于植物材料或与植物材料相关联的方式和数量方面)。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。关于本文中的某些实施方案提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图说明本公开，并且除非另外要求，否则不对本公开的范围加以限制。

已经详细描述了本公开，将显而易见的是，在不脱离如所附权利要求中进一步定义的本公开的精神和范围的情况下，修改、变化和等效实施方案是可能的。此外，应理解，本公开中包括以下内容的所有实施例均作为非限制性实施例提供。

实施例

实施例1.用于轰击大豆外植体的珠粒和载体片(Carrier Sheet)的制备

以下为用于制备用于轰击外植体的珠粒和载体片的方案的实施例。根据以下方案，制备使用PDS1000氦粒子枪轰击来自大豆种子的干切除胚胎外植体的粒子或珠粒和载体片。将50mg金或钨粒子称重到干净的DNA酶/不含RNA酶的管中。在用1ml 100％乙醇超声洗涤之后，通过短暂离心将粒子成丸(pelleted)，并除去乙醇。将粒子重悬于1ml 100％乙醇中，并在-20℃下储存以备后用。在使用之前，通过超声将粒子重悬。将42μl金或钨粒子转移到新管中，并且通过离心成丸，并除去乙醇。加入500μl无菌水，并且通过超声将粒子重悬。通过离心将粒子成丸，并除去水。将25μl水加入到管中，并用移液器吸头洗涤粒子，之后通过超声重悬。

将蛋白、DNA和/或RNA加入到管中(例如，约2.6μg DNA)。在加入蛋白、DNA和/或RNA后不久加入冰冷的无菌水，以使混合物的最终体积达到245μl。将混合物定容之后不久加入250μl冰冷的2.5M CaCl₂溶液和50μl灭菌的0.1M亚精胺。然后通过低速涡旋将此溶液混合。将管在冰上孵育至少45分钟，以实现粒子的包覆。每5至10分钟混合溶液，以在一些实验中获得较好的结果。通过低速离心将粒子成丸，例如通过使用Eppendorf 5815微量离心机以800-1000rpm离心2分钟。用1ml乙醇洗涤小丸，并用移液器吸头洗涤粒子，并通过离心成丸。除去乙醇，并且加入36μl 100％乙醇以在低速涡旋的情况下重悬粒子。每次用氦粒子枪轰击均使用5μl此制备剂。对于电子枪(Accell)，可通过在闪烁瓶中合并十份36μl珠粒/粒子制备剂并加入100％EtOH以产生20ml最终体积来修改此制备剂。

上面的超声步骤可以45-55kHz进行1min；包覆珠粒之前的离心步骤可在IEC微量离心机上以5000rpm(2300g)进行10秒；并且DNA包覆珠粒之后的离心步骤可在IEC微量离心机上以1000rpm(100g)进行2分钟。

实施例2.预培养用于粒子轰击的大豆外植体

以下为用于预培养用于轰击的外植体的方案的实施例。在粒子轰击之前预培养干切除大豆胚胎外植体。如大体上例如美国专利号8,362,317中所述，从干大豆种子切除成熟的胚胎外植体。将外植体称重以用于爆破，在20％PEG4000(Lynx 3017；参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)或10％蔗糖培养基中再水合1小时，并充分冲洗。也可在此步骤中使用Lynx 1595(参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)培养基(或具有30ppmCleary的Lynx 1595)。在EJW 1培养基或EJW 2培养基上，每个平板预培养约50个外植体(参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)。EJW(LIMS 4859)培养基中还使用在约0.5ppm至2ppm范围内的TDZ水平。将外植体在28℃下在16/8光周期或黑暗中预培养1至2天。外植体也可预培养约3天。

实施例3.外植体的粒子轰击

以下方案可与PDS1000氦粒子枪一起使用。使用70％EtOH(或用于载体片的异丙醇)将枪组件(诸如终止屏(stop screen)、破裂盘和载体膜支架(macrocarrier holder))消毒约1min。将破裂盘(例如，在约650至2200psi的范围内使用的盘，包括例如1350psi盘)装载到破裂盘固定盖(rupture disk retaining cap)中并旋入气体加速室中。将终止屏放置在黄铜的可调巢(nest)上。对于每次轰击，将5μl上述氦枪制备剂分配到每个载体片上。将载体片空气干燥，之后将其翻转并放置在黄铜的巢上的终止屏或固定屏的顶部。组装载体膜发射组件(macrocarrier launch assembly)并将其放置在破裂盘正下方。破裂盘与载体膜发射组件之间的间隙距离为约1cm。

将预培养的大豆外植体放在靶平板培养基#42(TPM42)上并在其上进行爆破，其中分生组织面向中心向上。通过测量2升蒸馏水至4L烧杯中并加入16g洗涤过的琼脂，然后高压灭菌25分钟以使琼脂进入溶液中来制备TPM42培养基。TPM42可含有8％羧甲基纤维素(CMC)(对于低粘度)(或2％羧甲基纤维素(CMC)(对于高粘度))和0.4％洗涤过的琼脂。将溶液稍微冷却并倒入4L共混器中，然后加入320g CMC(低粘度)或80g CMC(高粘度)以及2L水。将混合物共混并转移至4L塑料烧杯中，然后高压灭菌30分钟，混合并且分到四个1L瓶中。然后将TPM42溶液再高压灭菌25分钟并冷却至约60℃，之后倒入平板中。每个60mm平板可倒入约12至15ml，以制成约300个靶平板，可将其储存在4℃或-20℃下。

以下为使用ACCELL电子粒子枪的方案的实施例。将珠粒制备剂升温至室温并涡旋。将0.5Mil 3.2cm²聚酯薄膜(mylar)片放置在小塑料皿上，任选地在除湿机单元中，并且将320μl珠粒制备剂放置在片上。将每个片空气干燥。将预培养的大豆外植体放在TPM42平板上，其中分生组织面向中心向上。由于第一次爆破的能量不一致，所以首先进行空白爆破。将靶标放置在固定屏上方，所述固定屏放置在载体片正上方。在部分氦真空(13.5inHg)下，通过在17.5至20kV下使电容器放电来将10μL水滴汽化。通过汽化液滴所产生的冲击波将片推动至固定屏中，从而阻止大部分聚酯薄膜但允许金珠粒进入大豆外植体分生组织。在爆破之间，将一滴矿物油悬浮于各点之间，然后将其去除以进行清理。与之前一样，将10μL水悬浮于各点之间。用PVC块覆盖电弧室，将聚脂薄膜片放置在方形开口上，并将屏罩(screen hood)放置在片和点上方。将屏在片上方对齐。将靶皿颠倒放置在固定屏上方，使得分生组织在其上方定向，并且将重物放置在皿上。用钟罩覆盖设备，并抽真空。15秒之后，真空读数为13.5in Hg，并且将枪卸下。

实施例4.粒子轰击之后外植体的培养

将轰击的外植体表面铺板至EJW 1培养基上过夜(也可使用其他预培养培养基)。在一个实施例中，将平板在28℃下以16/8光周期孵育。将外植体表面铺板或包埋在含有50至500ppm大观霉素的B5培养基(大观霉素水平修改的LIMS 3485；参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)上，并在整个再生过程中保持28℃和16/8光周期。在一个实施例中，使用在B5培养基中的250ppm大观霉素。aadA选择标记基因的存在提供了对作为选择剂的大观霉素的抗性或耐受性。24.5g B5定制培养基混合物包括3.21g Gamborg's B5培养基、20g蔗糖和1.29g葡萄糖酸钙。监测培养物的芽/变绿，并根据需要进行继代培养。

实施例5.金/钨粒子大小和每次发射的量对蛋白递送的影响

对于以下研究，对实施例1的珠粒制备方案进行如下修改。以2500rpm离心约10秒之后，用500μl无菌水洗涤金或钨粒子3次，并且将粒子重悬于最终体积为50μl的无菌水中。表1示出了此研究的处理组。

表1.GUS递送的不同粒子量和大小的处理组。

将约26μg具有2个融合的核定位信号(NLS)拷贝的GUS蛋白(β-葡萄糖醛酸酶)(10μl GUS 2x NLS)与2μl TransIT-2020一起加入至每个50μl具有重悬粒子的小瓶中，并且GUS2x NLS的最终浓度为每次射击约8.7μg。将小瓶充分混合并在冰上孵育10至20min。然后将小瓶在8000x g下离心30秒，重悬于90μl无菌水中，超声处理2秒，然后将30μl加载到每个载体膜上。轰击之后，将外植体浸入5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡萄糖醛酸溶液中(Jefferson等人,1987EMBO J 6:3901-3907)，并在37℃下孵育过夜。然后评估外植体的GUS表达。

在图1中提供了用不同量的金或钨粒子针对GUS蛋白递送进行染色后的结果，示出在所有测试量下，约350μg 0.6um金粒子具有比任何钨粒子强的GUS表达。图2中提供了用不同大小的钨粒子(0.7或1.3μm)和每次发射不同量的GUS蛋白(500至4000μg)针对GUS蛋白表达进行染色之后的结果。这些结果表明，随着每次发射钨的量从500μg增加到4000μg，当使用0.7μm和1.3μm的钨粒子大小时，GUS表达对应地降低。

实施例6.钨粒子的量对稳定再生的影响

在与包含腺苷酸转移酶(aadA)基因的DNA共轰击或不共轰击的情况下，确定了通过将Cas9加指导RNA(gRNA)核糖核蛋白(RNP)钨介导递送至大豆干切除外植体中，钨粒子的量对编辑的外植体细胞的稳定再生的影响。

表2示出了这项研究的处理组。

表2.在具有或不具有aadA选择标记DNA的情况下，CRISPR/Cas9递送的不同量的钨粒子的处理组。

为了产生指导RNA-Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物，将20.6μg Cas9蛋白(126pmol)和8.6μg(253pmol)sgRNA(具有双tracrRNA::crRNA异源双链T58805的单指导RNA，如SEQ IDNO:1中所示)以1:2摩尔比(Cas9蛋白与指导RNA的比率)在含有1μl RNA酶抑制剂(RiboLock；Thermo Fisher Scientific)的1x NEB缓冲液3(100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，在25℃下pH 7.9)中混合至总体积30μl，并在室温下孵育至少1.5分钟。对于共递送，将指示浓度的aadA PCR产物加入至预混合物中。在大豆中，有两种PDS基因，GmPDS11(Glyma.11G253000，SEQ ID NO:2)和GmPDS18(Glyma.18G003900，SEQ ID NO:3)，其分别位于染色体(chr11)和染色体(chr18)上。gRNA T58805被设计成指导Cas9在GmPDS(Chr11)和GmPDS(Chr18)中的保守区中图3所示的位点(标记为crRNA位点)处切割。FLA引物的互补位点也在图3中示出。

对于粒子轰击和植物再生，用无菌水洗涤3次之后，将指示量的钨粒子(Bio-RadLaboratories)重悬于50μl无菌水中。然后将2μl

2020(Mirus Bio LLC)和30μl如上提供所制备的RNP复合物加入至粒子中，并在冰上轻轻混合至少10分钟。然后将包覆的钨粒子在微量离心机中在8000x g下成丸30秒，并除去上清液部分。通过短暂的超声处理将小丸重悬于180μl无菌水中。超声处理之后不久，将包覆的粒子加载到6x载体膜(每个30μl)上，并允许空气干燥约2至3小时。如上所述进行粒子轰击。

将轰击的外植体表面铺板于LIMS 4859(无选择)上过夜，然后直接铺板于LIMS3485(有选择)或LIMS 3485(参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)上，并在28℃和16/8光周期下培养直至芽再生。从选择培养基中收获芽，然后进行分子表征。替代地，将芽切下并使其在LIMS 4055培养基中生根(参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)，然后移到LIMS 4790培养基中以用于伸长。

LIMS 4790的组分和制备剂包括24.5克B5定制培养基混合物、0.03克Clearys3336WP，搅拌直至完全混合，加入水至1000ml，将pH调节至5.6，加入4克琼脂凝胶，高压灭菌，并且加入0.8ml羧苄西林(Carbencillin)(250mg/ml)、1ml特美汀(Timentin)(100mg/ml)和2ml先锋噻肟(Cefotamine)(100mg/ml)。

表3中提供了表2中每种处理的递送效率结果(转化频率或TF)。表3中的结果表明，用较少量的钨粒子获得了较高的aadA递送或转化效率。每个处理组中轰炸了共计128个外植体。虽然表3中提供了从这些外植体取样的芽的总数，但基于aadA基因阳性的芽的转化频率(TF)与轰击的外植体的总数相关(TF＝处理的aadA阳性芽/128个外植体)。提供了为检测aadA标记基因并在PDS基因座处进行编辑而取样的芽的数目，但是没有针对aadA的存在对不包括aadA的处理进行取样。通过实时定量PCR确定样品中aadA的存在，并且通过FLA来检测并通过测序来确认样品中编辑的存在。每个芽仅取得一个样品，并且如果发生再生，则每个外植体仅取样一个芽。

表3.基于aadA的存在的每种处理的转化频率(TF)。

基于靶向PDS基因基因座的指导RNA-Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物的共递送，进一步测试了每种处理的aadA阳性植物子集中是否存在编辑事件。轰击后2周之后，从再生小植物的叶样品提取出基因组DNA，并且通过片段长度分析(FLA)检测一个或两个PDS基因座处是否存在编辑。FLA为基于PCR的分子分析，其将PCR片段长度的变化与野生型参考的扩增子进行比较，以鉴定相对于野生型参考具有一个或多个突变的样品。根据制造商的说明，使用5'FAM标记引物、标准引物和Phusion^TM聚合酶(Thermo Fisher Scientific)进行PCR反应，以生成200至500bp PCR片段。如SEQ ID No:4和5中所示的GmPDS基因的FLA引物产生针对GmPDS11(Chr11上的PDS基因)的428bp PCR片段和针对GmPDS18(Chr18上的PDS基因)的384bp PCR片段。与这些预期大小不同的PCR片段被视为或检测为突变或编辑等位基因。将1ul PCR产物与0.5ul标记和8.5ul甲酰胺合并，在ABI测序仪(Life Technologies，NY)上运行，并随后分析片段长度变化，以鉴定出在靶位点处具有突变的植物，这通过TOPO克隆和测序进行确认。表4示出了如通过FLA检测的具有编辑的植物样品的数目。对于TOPO克隆和确认测序，通过PCR扩增了侧接PDS靶位点的基因组DNA，并将其克隆到pCR^TMBlunt

载体(ThermoFisher)中，通过热冲击转化为大肠杆菌菌株TOPO10，并且在37℃下在含有50ug/ml卡那霉素的LB琼脂平板上进行选择过夜。使用标准M13F和M13R引物挑选菌落以用于PCR扩增。将PCR产物提交Sanger测序以确认PDS基因编辑。

表4.aadA阳性样品中的编辑频率。

基于FLA鉴定了两种假定含有编辑的样品(RNP1009-6-4和RNP1009-7-3)。通过TOPO克隆和Sanger测序确认了编辑。如上所述，对通过FLA鉴定为具有突变或编辑的阳性样品的基因组DNA进行用PDS基因靶位点的引物的PCR扩增，并将扩增子亚克隆到TOPO载体中，并且挑选菌落并测序。RNP1009-6-4和RNP 1009-7-3样品的扩增子在靶向基因座处包括多个编辑，其中最常见的编辑为3个碱基对(bp)缺失和1bp插入，以及指导RNA的基因组靶位点内及附近偶尔的碱基变化。不受理论的束缚，除样品或R0植株内可能的嵌合体之外，此实验中还由于两个PDS基因座(各自具有两个PDS基因拷贝)可从单个样品或R0植株获得多个编辑。在此项研究中，所有aadA阳性样品的样品编辑频率为1.5％，其中用一种处理(RNP1009-7)获得的样品编辑频率为3.2％。然而，重要的是应注意，如果处理和/或测试了更多外植体或样品，则可用其他处理获得编辑。

实施例7.粒子大小对稳定再生和编辑频率的影响

确定了在与包含腺苷酸转移酶(aadA)基因的DNA共轰击或不共轰击的情况下，钨粒子大小对稳定再生和编辑频率的影响。如上文在实施例6中所述，进行RNP复合物形成和珠粒制备。对于外植体制备、生物射弹递送和编辑事件的再生，使用实施例1至5中提供的方案。将一定量的干大豆外植体(例如，约20g)在20％PEG4000(LIMS 3017再水合培养基)中再水合1小时，并充分冲洗。在28℃与16/8光周期下，在LIMS 4859预培养培养基(参见例如美国专利公布号2016/0264983)上预培养每个平板约50个外植体持续1天。用氦粒子枪对外植体进行粒子轰击。打开时将氦罐设置为1700psi，并且外植体经受的真空压力为约27in Hg直到爆破完成。

将表面铺板的轰击外植体放置在LIMS 4859(无选择)上过夜，然后直接铺板于LIMS 3485(有选择)或LIMS 3485(美国专利申请公布号2016/0264983)上，并在28℃和16/8光周期下培养直至芽再生。从选择培养基中收获芽，并且进一步取样以用于分子表征。替代地，可将芽切下并使其在LIMS 4055培养基中生根(参见例如美国专利申请公布号2016/0264983)，并且移到LIMS 4790培养基中以用于伸长。

表5示出了在具有或不具有腺苷酸转移酶(aadA)基因的情况下，此项研究的以不同粒子大小和每次发射的钨粒子量的不同处理组。

表5.在具有或不具有aadA选择标记DNA的情况下，CRISPR/Cas9递送的不同大小和/或量的钨粒子的处理组。

递送效率结果(转化频率或TF)在表6中示出。

表6.基于aadA的存在的每种处理的转化频率(TF)。

此项实验再次表明，用较少量的钨粒子获得了较高的递送效率，但是用其他处理也获得了粒子的转化和递送。同样，每个处理组中轰炸了共计128个外植体。虽然表6中提供了从这些外植体取样的芽的总数，但转化频率(TF)与轰击的外植体的总数相关(TF＝每个处理的aadA阳性芽/128个外植体)。与实施例6类似，通过FLA确定了aadA阳性植物中的编辑频率，这也通过TOPO克隆和测序来证实。这些结果在表7中示出。

表7.aadA阳性样品中的编辑频率。

基于FLA鉴定了三种假定编辑样品(RNP1008-6-3、RNP1008-7-18和RNP1008-8-6)。通过TOPO克隆和Sanger测序证实了这些阳性样品中编辑的存在以及在靶向基因座内和附近偶然的碱基变化，其中在挑选的菌落中克隆的扩增子中最常见的编辑为2bp、3bp或7bp缺失。在此项研究中，所有aadA阳性样品的样品编辑频率为2.5％，其中用两种处理(RNP1008-6和RNP1008-7)获得的样品编辑频率为3.3％。然而，同样，如果处理和/或测试了更多外植体或样品，也可用其他处理获得编辑。

实施例8.aadA选择标记的量对稳定再生和编辑频率的影响

实施例7中描述了用于外植体制备、生物射弹递送和编辑事件的再生的程序。在此实验中，每次发射使用约250ug 0.7um钨粒子和量在0.04pmol至0.16pmol范围内的aadA。如表8所示，随着共轰击的aadA浓度从0.04pmol/发射增加至0.16pmol/发射，转化频率(TF)增加，并且具有单一aadA转基因拷贝的样品的百分比(如通过PCR检测)降低。在此实验中，每个处理组中轰炸了共计160个外植体。虽然表8中提供了从这些外植体取样的芽的总数，但转化频率(TF)与轰击的外植体的总数相关(TF＝每个处理的aadA阳性芽/160个外植体)。

如实施例7中所述，使用FLA进行进一步分子表征。通过下一代测序进一步证实通过FLA鉴定为具有编辑PDS等位基因的植物，并且编辑结果在表9中示出。INS_#指示插入#核苷酸的等位基因，并且DEL_#指示缺失#核苷酸的等位基因。也如上所述计算样品编辑频率。在此项研究中，所有aadA阳性样品的样品编辑频率为3.0％，其中用三种处理(RNP1011-3、RNP1011-4和RNP1011-6)的样品编辑频率在3.8％至11.1％的范围内。然而，同样，如果处理和/或测试了更多外植体或样品，也可用其他处理获得编辑。

表8.在不同量的aadA选择标记DNA的情况下，用钨粒子的CRISPR/Cas9递送的转化频率(TF)。

表9.在chr11和chr18 PDS基因座处的aadA阳性样品之间的编辑频率。

实施例9.Cas9与gRNA的相对比率对稳定再生和编辑频率的影响

如实施例7中所述进行用于外植体制备、生物射弹递送和编辑外植体的再生的程序。在此实验中，每次发射使用约125ug 0.7um钨粒子和0.8pmol aadA发射。在处理RNP1014-1至RNP1014-6中，将轰击的外植体直接表面铺板于LIMS 3485上，而在处理RNP1014-7至RNP1014-12中，将轰击的外植体表面铺板于LIMS 4859(无选择)上过夜，然后转移至LIMS 3485(有选择)。这些实验(RNP1013、RNP1014和RNP1017)中Cas9蛋白和gRNA的相对量以及这些处理的转化和编辑频率提供于表10和表11中。转化和样品编辑频率的计算如上所述。对于RNP1013和RNP1014实验，每个处理使用共计96个外植体，并且对于RNP1017实验，每个处理使用共计192个外植体。表12还提供了如通过测序所确定的aadA阳性样品中的样品编辑频率和编辑特征。

表10.钨粒子递送不同比率和量的Cas9/gRNA并且共递送aadA选择标记DNA的转化频率(TF)。

表11.钨粒子递送不同比率和量的Cas9/gRNA并且共递送aadA选择标记DNA的转化频率(TF)。

表12.在chr11和chr18 PDS基因座处的aadA阳性样品之间的编辑频率。

实施例10.将Cpf1、gRNA和ssDNA递送至成熟种子外植体中

LbCpf1示出了对TTTV PAM序列的偏爱，因此，基于每个靶序列上游适当PAM序列的出现来选择靶位点GmTS1。crRNA被设计成指导LbCpf1蛋白到达靶位点。组装包含纯化的LbCpf1蛋白或LbCpf1和同源crRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物。

此外，设计了5'TEG修饰的70bp长的ssDNA(单链DNA)模板。TEG修饰的ssDNA模板订购自Integrated DNA Technologies(IDT，产品Product 1184，Mod Code:/5Sp9/)。此模板具有10bp特征序列，其含有分别侧接30bp 5'同源臂和30bp 3'同源臂的BamHI识别序列，所述同源臂被设计成与侧接GmTS1位点的DNA序列相同。在GnTS1位点处的对应野生型序列在5'与3'同源臂之间具有8bp内源序列。将此单链DNA模板(ssDNA模板)加入至RNP复合物中。具体地，使用TransIT-2020作为包覆试剂将80pmol ssDNA模板、104pmol lbCpf1蛋白、312pmol gRNA和0.08pmol aadA DNA包覆在0.6um金粒子(Bio-Rad；约66ug/发射)上。将混合物在冰上保持＞＝15min，其中每5min轻轻混合。然后将包覆的金粒子(每次发射10至15ul)加载到微载体盘上并干燥1小时。

将干切除大豆胚胎外植体在LIMS 3990(含有1克/L KNO3、0.03克/L Clearys3336WP、3.9克/L MES、30克/L，pH 5.6的B5定制培养基)中再水合1小时，用无菌H2O充分冲洗，并且在28℃和16/8光周期下在培养基LIMS 4859中培养1天。根据实施例3对这些预培养的成熟大豆胚胎外植体进行轰击。轰击之后，将胚胎外植体转移到培养基LIMS 4859中，并在28℃、黑暗中培养两天。

然后将轰击的外植体在28℃和16/8光周期下转移到LIMS3485(选择)上约4周，然后在28℃和16/8光周期下转移到LIMS 4790(生根)，直到芽再生(约4周)。从芽组织中提取出DNA以用于测序分析。在鉴定为aadA标记基因阳性的235个样品中，75个样品在设计的Cpf1切割位点中具有小插入或缺失。鉴定出两个样品，其在接近设计的Cpf1bp切割位点7bp至43bp范围内具有一个或多个插入，推测是由于除编辑BamH1识别序列之外，非同源末端也连接到Cpf1切割位点中。

实施例11.递送Cpf1、gRNA和ssDNA以用于模板编辑

根据实施例10中所述的程序，使用8pmol或80pmol ssDNA模板进行了一项实验。如表13所示，通过8pmol ssDNA模板，鉴定出aadA选择标记基因阳性的27个样品，其在Cpf1切割位点处具有突变(小的插入或缺失)，并且鉴定出一个样品为完美模板编辑的结果，如通过具有含有侧接由同源臂所定义的5’和3’接合点的BamHI识别序列的10bp特征序列所证明。

表13.使用不同量的ssDNA模板的模板编辑

虽然已参考某些实施方案公开了本发明，但是将显而易见的是，在不脱离如本文所公开以及如所附权利要求所提供的本发明的精神和范围的情况下，修改和变化是可能的。此外，应当理解，虽然示出了本发明的实施方案，但是本公开中的所有实施例都作为非限制性实施例来提供，并且因此，不应将其视为对如此示出的各个方面的限制。本公开中提到的全部参考文献以引用的方式整体并入本文。本发明旨在具有由本公开、以下权利要求的语言及其任何等同形式所定义的全部范围。因此，附图和详细描述应视为说明性且非限制性的。

Claims (45)

1.一种编辑植物的基因组的方法，其包括：

a)将包覆或施加有位点特异性核酸酶或编码所述位点特异性核酸酶的核酸的粒子递送至成熟的植物胚胎外植体；以及

b)从所述成熟的植物胚胎外植体再生植物，其中在所述再生植物的至少一个细胞的所述基因组中，所述再生植物在所述位点特异性核酸酶的靶位点处或附近包含编辑或定点整合。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述粒子为钨、铂或金粒子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述粒子的大小在约0.5μm与约1.5μm之间。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述粒子的大小为约0.6μm、约0.7μm或约1.3μm。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将多个包覆或施加有所述位点特异性核酸酶的粒子递送至所述外植体。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中递送至所述外植体的粒子的量在约50μg与约5000μg之间、或在约50μg与约5000μg之间、或在约50μg与约2000μg之间、或在约50μg与约1000μg之间、或在约50μg与约500μg之间、或在约100μg与约500μg之间。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括：

c)鉴定出在所述位点特异性核酸酶的靶位点处或附近具有至少一个包含所述编辑或定点整合的细胞的再生植物。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述鉴定步骤包括基于表型或性状鉴定出具有所述编辑或定点整合的再生植物。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述鉴定步骤包括基于分子测定鉴定出具有所述编辑或定点整合的再生植物。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶为核糖核蛋白。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述核糖核蛋白包含指导RNA。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述核糖核蛋白的位点特异性核酸酶蛋白与指导RNA的比率为约1:8、或约1:6、或约1:4、或约1:2、或约1:1、或约2:1、或约4:1、或约6:1、或约8:1。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶为Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Csn1、Csx12、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、CasZ或Argonaute蛋白、或其同源物或修饰形式。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶为Cas9蛋白。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述Cas9蛋白来自酿脓链球菌。

16.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶为Cpf1蛋白。

17.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶不为RNA指导核酸酶。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶为大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶、转座酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述粒子进一步包覆或施加有多核苷酸分子。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸分子为供体模板。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述供体模板包含突变，以用于通过模板介导的修复将所述突变在所述位点特异性核酸酶的靶位点处或附近引入到所述植物的所述基因组中。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述供体模板包含插入序列和至少一个同源序列，以用于将所述插入序列在所述位点特异性核酸酶的靶位点处或附近整合到所述植物的所述基因组中。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述插入序列包含转基因，所述转基因包含可操作地连接至植物可表达启动子的编码序列或可转录DNA序列。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述转基因包含感兴趣的基因。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述转基因包含蛋白编码序列。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述转基因包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列。

27.如权利要求23所述的方法，其中所述转基因包含标记基因。

28.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸分子包含标记基因。

29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述标记基因为选择标记基因。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述选择标记基因包含腺苷酰转移酶(aadA)基因、新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶(hpt、hph或aph IV)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因或双丙氨膦抗性(bar)或草丁膦N-乙酰基转移酶(pat)基因。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述选择标记基因包含腺苷酰转移酶(aadA)基因。

32.如权利要求27或28所述的方法，其中所述标记基因为筛选标记基因。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述筛选标记基因包含绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因。

34.如权利要求19或28至33中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸分子包含供体模板区以及包含编码序列或可转录DNA序列的转基因，其中所述转基因位于所述供体模板区的外部。

35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其还包括：

d)选择具有标记基因的再生植物，其中所述标记基因与所述位点特异性核酸酶或编码所述位点特异性核酸酶的所述核酸共递送。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述标记基因为选择标记基因。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述选择步骤包括用选择剂处理所述成熟的胚胎外植体或者从其再生的芽和/或根培养物或植物。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述选择标记基因为腺苷酰转移酶(aadA)基因。

39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述植物为大豆植物。

41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述成熟的胚胎外植体在所述递送步骤之前包含以下中的一种或多种：(i)指导RNA(gRNA)，(ii)包含转基因或标记基因的多核苷酸，(iii)包含编码非编码RNA分子或指导RNA的转基因的多核苷酸，和/或(iv)供体模板。

42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述成熟的胚胎外植体为干切除外植体。

43.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述成熟的胚胎外植体为湿胚胎外植体、干燥的湿胚胎外植体或湿切除胚胎外植体。

44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述成熟的胚胎外植体的水分含量在约3％至约25％的范围内。

45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中从水分含量在约3％至约25％的范围内的植物种子切除所述成熟的胚胎外植体。

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