JP7416384B2 - ゲノム編集方法 - Google Patents

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Description

本発明は、タンパク質を金粒子に効率よく結合させる技術に関する。より詳しくは、遺伝子銃に使用する金粒子にタンパク質を効率よく結合させる技術に関する。
近年、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集技術が開発され、種々の生物に応用されるようになりつつある（特許文献１）
しかしながら、形質転換系の開発されていない生物、または、形質転換効率の低い生物については、ゲノム編集技術の適用が困難であった。
そこで、形質転換の困難な生物に対するゲノム編集技術の開発が求められていた。
米国特許公開公報第２０１４／００６８７９７号
タンパク質を金粒子に効率よく被覆する方法を提供する。
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
本発明によれば、タンパク質を効率よく金粒子に結合できる。
図１は、遺伝子銃を用いてゲノム編集個体を取得する工程を示す概略図である。 図２は、両親媒性分子非存在下において、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｈ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を示すグラフである。 図３は、両親媒性分子として１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を使用し、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｉ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を示すグラフである。 図４は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの終濃度を１．０ｍＭ、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン/ヒストンＨ１タンパク質存在下で、塩濃度がタンパク質の金粒子への結合量に及ぼす影響を示すグラフである。
本発明の最終目的は、図１に記載のように、遺伝子銃を用いてゲノム編集個体を作成することである。そのためには、図１のように４つのステップ、１）金粒子の調製、２）マイクロキャリアへの塗布、３）茎頂への撃ち込み、４）ゲノム編集個体の取得が必要となる。本発明においては、これらの工程のうち、特に、１）金粒子の調製、２）親水性フィルムへの塗布の工程、および３）撃ち込み（マクロキャリアからの放出）の工程を改善するものである。
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ニューブリーディングテクニック（ＮＢＴ）といわれる技術の一部で、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳなどを用いて、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して変異を導入することで遺伝子を破壊すること、もしくは、部位特異的にＤＮＡ断片を挿入または置換すること、または、ＣＲＩＳＰＲシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体を構築し、細胞中で発現させることで、狙った点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変することも含まれるがこれらに限られず、ゲノムを編集できる技術であればよい。ゲノム編集技術を用いることで、狙った遺伝子を高い効率で破壊できる。遺伝子破壊の場合、遺伝子組換えの痕跡を残さずに狙った遺伝子のみを破壊できることから組換え植物と取り扱わない国もある。また、ゲノム編集によれば、切断配列の両側の配列に相同な断片を、その部位に導入したいＤＮＡ断片の両側に連結しておくことで、効率よく部位特異的なＤＮＡ断片の挿入または置換が可能である。また、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳなどを通常用いる濃度から下げることで、ＤＮＡ切断後に起きる置換変異の割合を増加させることも可能である。
上記意味で、ゲノム編集は、外来遺伝子がほぼランダムに組み込まれる従来型の植物の形質転換法、例えば、直接導入法やアグロバクテリウム法などとは異なる技術とも言える。ゲノム編集技術では、切断部位をターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを切断する工程を含むことが特徴で、かかるターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いない従来型の形質転換法とは区別できる。ここで、「ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いて」という意味は、ヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入してもよく、ヌクレアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを細胞に導入してヌクレアーゼタンパク質を発現させてもよいという意味である。また、ガイドＲＮＡについてもＲＮＡを細胞に導入してもよく、ガイドＲＮＡを発現し得るＤＮＡを導入してガイドＲＮＡを発現させてもよい趣旨である。
本明細書において、ＲＮＰとは、ＲＮＡを含む核タンパク質、即ち、リボ核酸とタンパク質の複合体を意味する。ＲＮＰの例としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ、リボソーム、スプライスソーム、テロメラーゼ、ヴォールト、リボヌクレアーゼＰ、ｈｎＲＮＰ、およびｓｎＲＮＰ等が挙げられるがこれらに限られない。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを含む、ゲノム編集能力のあるＲＮＰである。
上述のように、ゲノム編集においては、ヌクレアーゼなどのタンパク質をターゲットとなる生物の細胞中、特に生殖系列の細胞中に導入することが必要であるが、タンパク質を効率よく遺伝子銃で細胞中に導入することは生物、特に植物の特定の種においては困難な場合があった。そこで、発明者らは、遺伝子銃を用いたゲノム編集技術に用いることができる、タンパク質による金粒子の被覆方法、マクロキャリアにスポットした金粒子の撃ち込み後の残存量を減らす方法を開発し、本発明を完成した。
（金粒子を被覆する方法）
本発明の金粒子を被覆する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
前記両親媒性分子（化合物）は、親水性（水溶性）部分と、疎水性（不溶性）部分とを有している。親水性基は、その化学残基が水を好む性質を有している。親水性基としては、例えば、炭水化物、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基を含む基が含まれるが、これらに限られない。両親媒性分子（化合物）としては、脂質分子、リポソーム、リポポリプレックス（ｌｉｐｏ ｐｏｌｙｐｌｅｘ）などを含むがこれらに限られない。リポポリプレックスは、例えば、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンを含んでいてもよい。
前記疎水性基は、その化学残基は水を排除する性質を有している。かかる化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない。炭化水素は、疎水性基である。
本発明の金粒子のタンパク質被覆方法においては、両親媒性化合物を用いることにより、金粒子へのタンパク質の結合量（結合率）を増加させることができ、さらに、マクロキャリアからの放出率も向上させる（マクロキャリアへの金粒子の残存量を減少させる）ことができる。
前記両親媒性化合物は陽イオン性を有していることが好ましい。この陽イオン性両親媒性化合物は、天然由来ではないポリアミンであってもよく、これら１つ以上のアミンは、少なくとも１つの疎水性残基に結合されており、この疎水性残基は、Ｃ６－Ｃ２４アルカン、Ｃ６－Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモンを有していてもよい。ここでＣＸのＸの数字は炭素数を表す。両親媒性化合物は、リポソームを形成していても形成していなくてもよい。また、両親媒性化合物は、以下の構造を有していてもよい。
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ６－Ｃ２４アルカン、Ｃ６－Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。Ｒ１及びＲ２は、同一であっても異なっていてもよい。
前記両親媒性化合物は、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンまたはＢｉｓ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ＯＤＡＰ （Ｂｉｓ ｉｍＯＤＡＰ， ＯＤＡＰはＯｘａｌｙｌｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）であってもよい。
前記両親媒性分子（化合物）の、前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度が１０μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１００μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
本発明においては、前記両親媒性化合物に加えて、ポリカチオンを添加することができる。好ましいポリカリオンとしては、ポリ－Ｌ－リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾレニウム、ポリアリルアミン及びこれらに類する化合物などのポリマーなどが挙げられるがこれらに限られない。好適なポリカチオンは、エトキシル化ポリエチレンイミン（ｅＰＥＩ）である。
また、前記ポリカチオンは陽イオン性タンパク質であってもよい。陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進することができる。好適な陽イオン性タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質であり、例えばＨ１、Ｈ２Ａ又はＨ２Ｂなどのヒストンである。前記ヒストンは、牛胸腺などの天然ソースに由来していてもよいし、バクテリア内で合成された組換えタンパク質であってもよい。ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質は、ポリリジンなどのポリカチオン化合物に比べて種々の点で利点を有している。ＤＮＡ結合タンパク質は、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルやヒトヒストンＨ１のＣ末端ドメイン（ＮＬＳ－Ｈ１）の両方を有する組換えヒストンであってもよく、これは核局在化シグナルにリンクされている。陽イオン性タンパク質としては両親媒性分子と混合することでタンパク質の金粒子への結合効率が上がるものであれば特に限定されないが、ヒストンＨ１タンパク質が好ましい。
また、前記両親媒性化合物と、前記ポリカチオンを組み合わせて用いてもよい。例えば、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質の比率は、３：１程度が好ましい。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液は、さらに、核酸を含むことができる。
前記核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの誘導体などが挙げられる。
前記タンパクとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼなどの核酸代謝酵素が挙げられる。
前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのＣＡＳヌクレアーゼなどが挙げられる。
前記ＣＡＳヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ３、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９などが挙げられる。
前記タンパクの、前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度が５０μｇ／ｍＬ以上が好ましく、３００μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
前記金粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、少なくとも表面が金であればよく、中実構造のものでもよいし、コアシェル構造のものであっても、中空粒子であってもよく、金ナノロッドなどのナノ粒子であってもよい。
前記金粒子の金の純度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９９％以上が好ましい。
前記金粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましく、０．６μｍ以上が特に好ましい。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．５μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下がさらに好ましく、１．２μｍ以下が特に好ましく、１．１μｍ以下がさらに特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
前記被覆の時間の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３分間以上が好ましく、５分間以上がより好ましく、１０分間以上がさらに好ましい。
前記被覆の時間の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０分間以下が好ましく、２０分間以下がより好ましく、１０分間以下がさらに好ましい。
前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液と金粒子をピペッティングまたはタッピングにより混合し、静置する方法などが挙げられる。
前記金粒子へのタンパク質の結合量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、金粒子とタンパクの混合液を遠心し、上清に、×２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃３分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質を分離後、ＣＢＢ染色し、コントロール(金粒子なし)のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるタンパク質量を算出することができる。
本発明で両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を作成する際に使用する緩衝液の好ましい塩濃度の終濃度としては、２０ｍＭ以下が好ましく、より好ましくは１８ｍＭ以下、１６ｍＭ以下であっても良い。ここで「塩」とは、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する塩をいう。「塩」とは、例えば、食塩（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）、トリス（Ｔｒｉｓ・Ｃｌ）、Ｔｒｉｓ－ＯＡｃ、ＨＥＰＥＳ等が含まれるが、これらに限られず、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する物質であれば制限なく含まれる。なお、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）は塩に含まれない。塩としては、好ましくはアルカリ金属を含む。また「塩濃度」とは、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する塩の濃度をいう。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液は、さらに、その他の成分を含むことができる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＥＤＴＡ、ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなどが挙げられる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における、ＭｇＣｌ２、及びＤＴＴを除く塩濃度は、イオンクロマトグラフ法により測定することができる。前記イオンクロマトグラフ法では、あらかじめＭｇＣｌ２、及びＤＴＴを除く塩の濃度と応答との関係式を求めておき、サンプルについて得られた応答をその関係式に当てはめることで、該当する塩濃度を測定することができる。
（被覆金粒子を製造する方法）
本発明の被覆金粒子を製造する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法は、前述の両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法のとおりである。
（金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法）
本発明の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
前記スポット工程において、金粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリヤーフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させる。前記マクロキャリヤーフィルムとしては、親水性のマクロキャリヤーフィルム（３Ｍ社「ＳＨ２ＣＬＨＦ」など）、又は、親水性のコーティング剤によりコーティングしたマクロキャリヤーフィルムを用いるのが好ましい。
親水性フィルムやマクロキャリアの親水性のコーティングに用いられる親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、３－スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、１－カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体が挙げられる。
（細胞へのタンパク質導入方法）
本発明の細胞へのタンパク質導入方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
前記該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程は、前述の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法のとおりである。
前記細胞にタンパク質を撃ち込む工程において、タンパク質を撃ち込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マクロキャリヤーフィルム、ターゲットの完熟胚の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ヘリウムガスをマクロキャリヤーフィルムに向かって発射する方法などが挙げられる。
また、本発明の金粒子の被覆方法によれば、マクロキャリアから撃ち出されやすい金粒子が得られる。すなわち、本発明の方法により、タンパク質を金粒子に被覆し、マクロキャリアにスポットして撃ち込んだ場合、通常の金粒子よりもマクロキャリアに残存する金粒子が減少するという効果が得られる。
前記細胞へのタンパク質導入方法により、タンパク質および／または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子を得ることができる。
（ゲノム編集方法）
前記金粒子を被覆する方法、前記被覆金粒子を製造する方法、前記金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法、又は前記細胞へのタンパク質導入方法により、ゲノム編集を行うことができ、その結果、ゲノム編集された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子を得ることができる。
本発明におけるゲノム編集の対象となる生物は、遺伝子銃により金粒子が導入される生物であれば、特に制限されず、動物、植物、微生物であってもよい。前記植物としては、被子植物及び裸子植物を含む種子植物であってもよく、前記被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。また、以下の植物についても本発明を適用し得る。
前記単子葉植物としては、いずれの種類であってもよいが、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物などが挙げられる。
前記イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビなどが挙げられる。前記ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガスなどが挙げられる。前記バショウ科植物としては、バナナなどが挙げられる。前記パイナップル科植物としては、パイナップルなどが挙げられる。前記ラン科植物としては、ランなどが挙げられる。
前記双子葉植物としては、例えば、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、およびタデ科植物などが挙げられる。
前記アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー、ダイコンなどが挙げられる。前記マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ササゲ、アルファルファなどが挙げられる。前記ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシなどが挙げられる。前記ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカなどが挙げられる。前記ヒルガオ科植物としては、アサガオ、サツマイモ（カンショ）、ヒルガオなどが挙げられる。前記バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴなどが挙げられる。前記クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキなどが挙げられる。前記アオイ科植物としては、ワタ、ケナフなどが挙げられる。前記キク科植物としては、レタスなどが挙げられる。前記ヒユ科植物としては、テンサイ（サトウダイコン）などが挙げられる。前記タデ科植物としては、ソバなどが挙げられる。
前記裸子植物としては、マツ、スギ、イチョウ及びソテツなどが挙げられる。
（タンパク質の金粒子への結合を促進する方法）
本発明のタンパク質の金粒子への結合を促進する方法は、陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
前記陽イオン性タンパク質は、前述のとおりである。
（実施例１）
用いたｂｕｆｆｅｒ
以下のｂｕｆｆｅｒを用いて実験を行った。
Figure 0007416384000002
Figure 0007416384000003
（実施例２）
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）の影響
方法
（１）１．５ｍＬチューブに３μｇ ＳｐＣａｓ９（ＴａＫａＲａ）、１μｇ ｓｇＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２．０μＬ、×１０ 各種ｂｕｆｆｅｒ １μＬを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
（２）両親媒性分子である、Ｂｉｓ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ＯＤＡＰ（両親媒性分子１）または１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質混粒子（３：１）（両親媒性分子２）（１３３０μｇ／ｍＬを１．２５μＬ）、３６０μｇ 金粒子（直径０．６μｍ）を添加し、ピペッティングにより混ぜ、１０分間静置（最終ｖｏｌｕｍｅ １０μＬ）する。
（３）遠心後、上清を新しいエッペンチューブへ移し、×２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬを加え、９５℃３分間加熱する。
（４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質（Ｃａｓ９）を分離後、ＣＢＢ染色する。
（５）各処理区において、Ｃａｓ９タンパク質由来のバンドを定量化する。コントロール（金粒子なし）のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるＣａｓ９タンパク質量を算出する。
結果を図２～４に示す。図２は両親媒性分子非存在下において、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｈ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。タンパク質の金粒子への結合量は、各種ｂｕｆｆｅｒ組成（表１参照）に関わらず、４０％－５５％と低かった。
図３は両親媒性分子として１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を使用し、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｉ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。
１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質存在下における、塩濃度のタンパク質の金粒子への結合量は、各種ｂｕｆｆｅｒ組成（表１参照）に関わらず高かった（図３）。
図４はＴｒｉｓ－ＨＣｌの終濃度を１．０ｍＭ、ＮａＣｌの終濃度を０－３５ｍＭとし（表２参照）、両親媒性分子として１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を使用した際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。図４に示すように、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を１０％添加した場合、塩濃度にかかわらずほぼ１００％のタンパク質の金粒子への結合量を示した。ただし、ＮａＣｌが０ｍＭの場合は、タンパク質の金粒子への結合量は８５％程度に低下し、また、ＮａＣｌの終濃度が１５ｍＭを超えると、タンパク質の金粒子への結合量は減少した。すなわち、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を添加した場合の好ましいＮａＣｌの終濃度は１５ｍＭ以下と考えられる。
（実施例３）
両親媒性分子添加による茎頂へのＲＮＰ導入効率の向上
方法
（１）１．５ ｍＬチューブに１２μｇ ＳｐＣａｓ９（ＴａＫａＲａ）、５μｇ ｓｇＲＮＡ、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ（Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） １μＬ、×１０ Ｃｕｔ Ｓｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ５μＬを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
（２）室温１０分間静置した後、Ｂｉｓ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ＯＤＡＰまたは１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質混合物（３：１、１３３０μｇ／ｍＬ）を０．５－５μＬ加え、さらに室温で５分間静置する。
（３）１８００μｇ金粒子を加え、氷上で１０分間静置する。
（４）遠心後上清を捨て、２１μＬ Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ＋５μＬ ＧＦＰ ｐｌａｓｍｉｄ（１μｇ／μＬ）を加え、超音波処理により攪拌する。
（５）疎水性フィルム（マクロキャリア）または親水性フィルムに６μＬずつ塗布し、４回／３０茎頂／プレートの撃ち込みを行う。
（６）翌日、ＧＦＰ蛍光を有する茎頂を数え、ＧＦＰ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｃａｓ９タンパク質）が撃ち込まれた茎頂の割合を算出する。
結果を表３に示す。疎水性フィルムを用いた場合では、本実験条件下においては、両親媒性分子の有無に関わらず、茎頂でのＧＦＰ発現は見られなかった。一方、親水性フィルムを用いた場合、両親媒性分子の非存在下では、茎頂でのＧＦＰ発現効率は２３．３％程度であった。一方、両親媒性分子を添加することで、その効率は８０％以上となることがわかった。よって、本発明の被覆方法によれば、金粒子へのタンパク質の結合が促進されるだけでなく、マクロキャリアからの撃ち出しの効率も高くなることがわかった。
Figure 0007416384000004
（実施例４）
両親媒性分子によるゲノム編集個体の取得
方法
（１）１．５ ｍＬチューブに１２μｇ ＳｐＣａｓ９（ＴａＫａＲａ）、５μｇ ｓｇＲＮＡ、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ（Ｒｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） １μＬ、×１０ Ｃｕｔ Ｓｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ５μＬを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
（２）室温１０分間静置した後、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質混合物（３：１、１３３０μｇ／ｍＬ）を５μＬ加え、さらに室温で５分間静置する。
（３）１８００μｇ 金粒子を加え、氷上で１０分間静置する。
（４）遠心後上清を捨て、２６μＬ Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加え、超音波処理により攪拌する。
（５）親水性フィルムに６μＬずつ塗布し、４回／３０茎頂／プレートの撃ち込みを行う。
（６）翌日、茎頂においてＧＦＰ蛍光の見られる個体を選抜し、そのまま生育させる。ＧＦＰプラスミドを導入していない場合は、全個体をそのまま生育させる。
（７）Ｔ０世代第５葉、止葉およびＴ１世代幼葉をサンプリングし、ＣＡＰＳ解析により、変異の有無を確認する。
ゲノム編集の標的遺伝子としてはコムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子を用いた。ｓｇＲＮＡ標的配列として、ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣ（配列番号１、下線部はＰＡＭ配列）
を用いた。ｓｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）のうち、ｃｒＲＮＡには、
ＧＵＵＧＣＣＧＵＡＧＧＵＧＣＣＣＧＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号２）
を用いた。Ｃａｓ９はＴａＫａＲａ社から購入したＳｐＣａｓ９タンパク質を用いた。上記標的配列をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で切断（ＤＳＢ）し、ＤＳＢ修復過程で起こる塩基挿入／欠失をＣＡＰＳ解析（ＰＣＲ＋制限酵素処理）により検出した（特開２０１７－２０５１０４の実施例１３参照）。
結果を表４に示す。両親媒性分子の未添加時には、ゲノム編集された個体は見られなかった。
Figure 0007416384000005
１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を用いて被覆金粒子を調製したところ、ＧＦＰプラスミドの有無に関わらず、制限酵素ＢｃｎＩで切断されないバンドが見られた。すなわち、表４に示すように、ゲノム編集が起きていることが１％以上の効率で確認された。
以上より、本発明の金粒子へのタンパク質結合法は植物のゲノム編集に有効であることが示された。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
＜２＞ 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
＜３＞ 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有する、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法である。
＜４＞ 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有する、細胞へのタンパク質導入方法である。
＜５＞ 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに核酸を含む、前記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞ 前記マクロキャリアが親水性フィルムである、前記＜３＞～＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞ 前記両親媒性分子が、リポソーム、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン、またはＢｉｓ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ＯＤＡＰである、前記＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞ 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに、ヒストンＨ１タンパク質を含む、前記＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞ ゲノム編集方法である、前記＜５＞～＜８＞のいずれかに記載の方法である。
＜１０＞ 前記＜４＞～＜８＞のいずれかに記載の方法によりタンパク質および／または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子である。
＜１１＞ 前記＜５＞～＜９＞のいずれかに記載の方法によりゲノム編集された、細胞、組織、器官生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子である。
＜１２＞ 陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
＜１３＞ 前記陽イオン性タンパク質がヒストンＨ１タンパク質である、前記＜１２＞に記載の方法である。
＜１４＞ さらに、両親媒性分子を添加することを特徴とする、前記＜１２＞または＜１３＞に記載の方法である。
＜１５＞ 前記両親媒性分子が、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンである、前記＜１４＞に記載の方法である。
本発明は、バイオテクノロジー産業、農業、新品種育種産業等において利用できる。

Claims (13)

  1. 両親媒性分子と陽イオン性タンパク質との組み合わせ、及びタンパク質を含む溶液を用い、
    前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質を含む組み合わせであり、
    前記タンパク質が、ＣＡＳヌクレアーゼであり、
    前記溶液の塩濃度が１６０ｍＭ以下である、金粒子にタンパク質を被覆する方法。
  2. 両親媒性分子と陽イオン性タンパク質との組み合わせ、及びタンパク質を含む溶液を用い、
    前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質を含む組み合わせであり、
    前記タンパク質が、ＣＡＳヌクレアーゼであり、
    前記溶液の塩濃度が１６０ｍＭ以下である、タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法。
  3. Ｂｉｓ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｏｘａｌｙｌｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ、または両親媒性分子と陽イオン性タンパク質との組み合わせ、及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、
    該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、
    を有し、
    前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質を含む組み合わせであり、
    前記タンパク質が、ＣＡＳヌクレアーゼであり、
    前記溶液の塩濃度が１６０ｍＭ以下であり、
    前記マクロキャリアが親水性フィルムである、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法。
  4. Ｂｉｓ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｏｘａｌｙｌｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ、または両親媒性分子と陽イオン性タンパク質との組み合わせ、及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、
    該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、
    該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、
    を有し、
    前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質を含む組み合わせであり、
    前記タンパク質が、ＣＡＳヌクレアーゼであり、
    前記溶液の塩濃度が１６０ｍＭ以下であり、
    前記マクロキャリアが親水性フィルムである、細胞（ただし、ヒト細胞を除く）へのタンパク質導入方法。
  5. 前記溶液が、さらに核酸を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. ゲノム編集方法である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、前記１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンと前記ヒストンＨ１タンパク質を３：１の比率で含む組み合わせである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ＣＡＳヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 請求項４に記載の方法によりタンパク質を導入される、もしくは請求項５または６に記載の方法によりタンパク質および／または核酸を導入される、細胞、組織、器官、生物個体または種子の製造方法。
  10. 請求項６に記載の方法によりゲノム編集される、細胞、組織、器官、生物個体または種子の製造方法。
  11. 両親媒性分子と陽イオン性タンパク質との組み合わせ、及びタンパク質を含む溶液を用い、
    前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質を含む組み合わせであり、
    前記タンパク質が、ＣＡＳヌクレアーゼであり、
    前記溶液の塩濃度が１６０ｍＭ以下である、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法。
  12. 前記両親媒性分子と前記陽イオン性タンパク質との組み合わせが、前記１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンと前記ヒストンＨ１タンパク質を３：１の比率で含む組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＣＡＳヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項１１または１２に記載の方法。
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