CN106661590A - 赋予鞘翅目害虫抗性的dre4核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开涉及通过在鞘翅目害虫中对靶编码序列和转录的非编码序列的RNA干扰介导的抑制而控制鞘翅目害虫的核酸分子及其使用方法。本发明公开还涉及使表达的核酸分子对于控制鞘翅目害虫有用的方法、以及由此获得的植物细胞和植物。

Description

赋予鞘翅目害虫抗性的DRE4核酸分子
优先权声明
本申请要求2014年5月7日提交的“赋予鞘翅目害虫抗性的DRE4核酸分子”的美国临时专利申请系列号61/989,843的申请日的利益。
本公开的领域
本发明一般性地涉及由鞘翅目害虫引起的植物损害的遗传控制。在特定的实施方案中，本发明涉及目标编码和非编码序列的鉴定、及其重组DNA技术在鞘翅目或半翅目害虫细胞中转录后阻遏或抑制目标编码序列和非编码序列表达从而提供植保作用的用途。
背景
西方玉米根虫(WCR)(Diabrotica virgifera virgifera LeConte，玉米根萤叶甲)是北美的一种破坏性最大的玉米根虫物种，在美国中西部玉米种植区受到特别关注。北方玉米根虫(NCR)(巴氏根萤叶甲)是与WCR共栖大致相同范围的近缘物种。有几种叶甲属的其他相关亚种是北美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(MCR)[墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)]；南方玉米根虫(SCR)(十一星根萤叶甲)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata LeConte)；D.undecimpunctata tenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim。美国农业部目前估计玉米根虫每年造成10亿美元收入损失，包括8亿美元产量损失和2亿美元处理成本。
WCR卵和NCR卵两者都在夏季期间沉积在土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵阶段。卵是椭圆的、白色、且长度小于0.004英寸(0.010cm)。幼虫在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精确时间由于温度差异和位置而在各年间有所变化。新孵出的幼虫是白色的蠕虫，长度小于0.125英寸(0.3175cm)。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫经历三个幼虫龄。在进食几周后，幼虫蜕皮，进入蛹阶段。它们在土壤中化蛹，然后它们在7月和8月中以成虫从土壤出现。成体根虫长度约0.25英寸(0.635cm)。
玉米根虫幼虫在玉米和几种其他禾本科物种上完成发育。在黄色狗尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且作为成虫比玉米上饲养的幼虫具有更小的头壳尺寸。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-634。WCR成虫以玉米穗丝、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒为食。如果WCR成虫在存在玉米生殖组织之前出现，则它们可以以叶组织为食，由此减缓植物生长，且偶而杀死宿主植物。然而，当优选的穗丝和花粉变得可得到时，成虫会快速向其移动。NCR成虫也以玉米植物的生殖组织为食，但相比之下很少以玉米叶为食。
玉米中的大部分根虫损伤由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以细的玉米根毛为食，并钻入根尖中。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫进食经常导致修剪根，一直到玉米杆基部。严重的根损伤干扰根将水和养分转运到植物中的能力，降低植物生长，并导致籽粒产生减少，由此经常急剧降低总产量。严重的根损伤还经常导致玉米植物的倒伏，其使收获变得更难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可以导致穗尖的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。
可以通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，孢子形成革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌)、或这些手段的组合来尝试控制玉米根虫。作物轮作的重大缺陷是过度限制了农田的用途。此外，一些根虫物种可以在大豆田间产卵，因此会降低用玉米和大豆实施的作物轮作的效率。
化学杀虫剂是最为人们所倚重的实现玉米根虫控制的手段。然而，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫害所致的损失相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、大雨、和不适当的杀虫剂应用均可导致玉米根虫控制不充分。此外，杀虫剂的连续使用可能选择杀虫剂抗性根虫品系，并且由于杀虫剂中许多对非靶物种有毒性，有严重的影响环境之虞。
RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，由此对足够大小的整个或任何部分靶基因序列特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如，双链RNA(dsRNA)分子)导致由其编码的mRNA的降解。在最近几年，在许多物种和实验系统，例如线虫秀丽隐杆线虫、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞中，已经使用RNAi进行基因“敲低”。参见，例如Fire等人，(1998)Nature 391:806-811；Martinez等人，(2002)Cell 110:563-574；McManus和Sharp(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-747。
RNAi通过包括切丁酶(DICER)蛋白质复合物的内源途径完成mRNA的降解。切丁酶将长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短片段，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：乘客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。乘客链被降解，引导链则被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。微小抑制性核糖核酸(miRNA)分子可以类似地整合到RISC中。转录后基因沉默发生在引导链特异性结合mRNA分子的互补序列并且诱导Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割时。尽管在一些真核生物，诸如植物、线虫类和一些昆虫中，siRNA和/或miRNA的初始浓度有限，但已知此过程系统性地遍布于整个生物体。
美国专利No.7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根萤叶甲蛹分离的9112种表达序列标签(EST)序列的文库。在美国专利No.7,612,194和美国专利公开号2007/0050860中提出将与其中披露的玉米根萤叶甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的几个特定部分序列之一互补的核酸分子与启动子可操作连接，以在植物细胞中表达反义RNA。美国专利公开文本No.2010/0192265提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与具有未知且未公开的功能的玉米根萤叶甲基因的特定部分序列互补(该部分序列据称与秀丽隐杆线虫中的C56C10.3基因产物58％相同)。美国专利公开文本No.2011/0154545提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与玉米根萤叶甲外被体(coatomer)β亚基基因的两个特定部分序列互补。此外，美国专利No.7,943,819公开了自玉米根萤叶甲幼虫、蛹、和切开的中肠分离的906种表达序列标签(EST)序列的文库，并且提出了将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达双链RNA，所述核酸分子与玉米根萤叶带电的多泡体蛋白4b基因的特定部分序列互补。
除了V-ATP酶的几个特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美国专利No.7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中没有进一步提出使用其中列出的超过9000个序列中的任何特定序列进行RNA干扰。此外，美国专利No.7,612,194、以及美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都没有教示提供的超过9000个序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的、甚至没有教示其有任何其他方面的用处。除了带电多泡体蛋白4b基因的特定部分序列之外，美国专利No.7,943,819没有提出使用其文中的超过900个序列的任何特定序列进行RNA干扰。此外，美国专利No.7,943,819没有教示其提供的超过900个序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中会是致命的、甚至没有教示其有任何其他方面的用处。美国专利申请公开文本U.S.2013/040173和PCT申请公开文本WO2013/169923描述了源自玉米根萤叶甲Snf7基因的序列在玉米中进行RNA干扰的用途。(还公开于Bolognesi等人，(2012)PLos ONE 7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。
与玉米根虫DNA互补的绝大多数序列(如上述)用作dsRNA或siRNA时在玉米根虫物种中不是致命的。例如，Baum等人(2007,Nature Biotechnology 25:1322-1326)描述了RNAi对几个WCR基因靶的抑制作用。这些作者报告，在超过520ng/cm2的极高iRNA(例如，dsRNA)浓度下，他们测试的26个靶基因中有8个不能提供实验上显著的鞘翅目害虫死亡率。
公开
本文中公开了用于控制鞘翅目害虫和半翅目害虫的核酸分子(例如，靶基因、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)及其使用方法，所述鞘翅目害虫包括，例如，玉米根萤叶甲(D.virgifera LeConte)(西方玉米根虫，“WCR”)；巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫，“NCR”)；十一星根萤叶甲(南方玉米根虫，“SCR”)；墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫，“MCR”)；黄瓜条根萤叶甲；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctata Mannerheim。在具体的实例中，公开了示例性核酸分子，其与鞘翅目害虫的一个或多个天然核酸序列的至少一部分可以同源。
在这些和进一步的实例中，天然核酸序列可以是靶基因，其产物可以，例如但不限于：涉及代谢过程；涉及生殖过程；或者涉及幼虫发育。在一些实例中，借助于包含与靶基因同源的序列的核酸分子，靶基因表达的翻译后抑制在鞘翅目害虫中可以是致命的，或导致生长和/或发育降低。在具体的实例中，在具体实例中，可选择dre4基因作为转录后沉默的靶基因。因此，本文中公开了包含dre4基因的核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的互补序列、以及前述者的任何片段。
还公开了包含这样的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列能够在计算机上被逆向翻译为翻译为与dre4的基因产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽。进一步公开了包含编码这样的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列是能够在计算机上被逆向翻译为与dre4基因产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列的反向互补序列。
还公开了用于产生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)分子的cDNA序列，所述iRNA与dre4鞘翅目害虫靶基因的全部或部分互补。在特定的实施方案中，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和/或hpRNA可以在体外产生，或由遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。在特定的实例中，公开了可用于产生与SEQ ID NO:1的dre4基因的全部或部分互补的iRNA分子的cDNA分子。
进一步公开了抑制鞘翅目害虫中必需的dre4基因的表达的手段、以及向植物提供鞘翅目害虫抗性的手段。用于抑制鞘翅目害虫中的必需的dre4基因表达的手段包括由SEQID NO:2(dre4区1，本文中有时称为dre4reg1),SEQ ID NO:3(dre4区2，本文中有时称为dre4reg2),SEQ ID NO:4(dre4区3,本文中有时称为dre4reg3)，或其互补序列组成的单链或双链RNA分子。用于抑制鞘翅目害虫中的必需dre4基因表达的手段的功能等同物包括与包含SEQ ID NO:1的WCR基因的全部或部分基本上同源的单链或双链RNA分子。对植物提供鞘翅目dre4害虫抗性的手段是这样的DNA分子，其包含与启动子可操作连接的、编码抑制鞘翅目害虫中的必需dre4基因的表达的手段的核酸序列，其中所述DNA分子能够整合到玉米植物的基因组中。
公开了控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括向鞘翅目害虫提供iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)分子，所述iRNA分子在被鞘翅目害虫摄取之后发挥作用而抑制鞘翅目害虫体内的生物功能，其中所述iRNA分子包含选自以下的核苷酸序列的全部或部分:SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；包含SEQ ID NO:1的全部或部分的鞘翅目生物体(例如，WCR的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的全部或部分的鞘翅目生物的天然编码序列的互补序列；转录为包含SEQ ID NO:1的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目生物的天然非编码序列；和转录为包含SEQ ID NO:1的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目生物天然非编码序列的互补序列。
在具体实例中，公开了用于控制鞘翅目害虫群体的方法，包括向鞘翅目害虫提供iRNA(例如dsRNA，siRNA，miRNA，和hpRNA)，其中所述iRNA分子包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1的全部或部分；SEQ ID NO:1的全部或部分的互补序列；SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:2的互补序列；SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的互补序列。
本文中还公开了方法，其中可将dsRNA、siRNA、miRNA、和/或hpRNA在基于食料的测定中(diet-based assay)提供给鞘翅目害虫，或提供在表达dsRNA、siRNA、miRNA、和/或hpRNA的遗传修饰的植物细胞中。在这些和另外的实例中，dsRNA、siRNA、miRNA、和/或hpRNA可被鞘翅目害虫幼虫摄入。然后，本发明的dsRNA、siRNA、miRNA、和/或hpRNA的摄入可在幼虫中导致RNAi，进而可导致对于鞘翅目害虫的生存力必需的基因的沉默，并最终导致幼虫死亡。因此，公开了这样的方法，其中将包含示例性核酸序列的用于控制鞘翅目害虫的核酸分子提供给鞘翅目害虫。在特定的实例中，通过使用本发明的核酸分子控制的鞘翅目害虫可以是WCR、NCR、或NCR。
参考下文结合附图进行的对若干实施方案的详细说明，前述的特征以及其他特征将会更加自明。
附图简述
图1包括用于为dsRNA生成提供特异性模板的策略的图示，使用单一转录模板(图1A)和两个转录模板(图1B)。
序列表中的序列的简述
使用如37C.F.R.§1.822规定的核苷酸碱基的标准字母缩写，示出了所附序列表中列出的核酸序列。对于每个核酸序列仅显示了一条链，仅显示每个核酸序列的一条链，但应当理解，对任何对所展示的链的提述应理解为包括对互补链和反向互补链。在所附序列表中：
SEQ ID NO:1显示了示例性的叶甲属dre4DNA序列。
SEQ ID NO:2-4显示了示例性的用于体外dsRNA合成的叶甲属dre4的非连续片段(dre4reg1(区域1)、dre4reg2(区域2)、和dre4reg3(区域3))(位于5’和3’端的T7启动子序列未显示)。
SEQ ID NO:5显示T7噬菌体启动子的DNA序列。
SEQ ID NO:6显示了用于体外dsRNA合成YFP编码区区段的DNA序列(未显示在5’和3’端的T7启动子序列)。
SEQ ID NO:7-12显示用于扩增包含dre4reg1,dre4reg2和dre4reg3的dre4序列部分的引物。
SEQ ID NO:13显示了叶甲属dre4发夹v1-RNA形成序列(如在核酸分子中pDAB114546发现的)。dre4有义链由以大写字体列出的碱基位置组成，ST-LS1内含子由以下划线字体列出的碱基位置组成，且dre4反义链由以无下划线的小写字体列出的碱基位置组成：
TAACAGTTTCATACTTCTGGTCCACATATAATTTTAGTTCTTTTACCTCGGGAACTCTAGGCATTTGATTGACACTTTTGTATGACACAGTATTTTTTCTCACTTTCTCTTTATCTTTAGATCCAGATTGTTTTGCCAAACGCTCTTTTGCTTTTTCATTTAGTTGAGCTGCCAAgaatccttgcgtcatttggtgactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttc tacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaag aatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgac caaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttaagttgtgcgtgagtccattgttggcagctcaactaaatgaaaaagcaaaagagcgtttggcaaaacaatctggatctaaagataaagagaaagtgagaaaaaatactgtgtcatacaaaagtgtcaatcaaatgcctagagttcccgaggtaaaagaactaaaattatatgtggaccagaagtatgaaactgtta
SEQ ID NO:14显示叶甲属dre4发夹v2-RNA形成序列(如在核酸分子pDAB114547中发现的)。dre4有义链由以大写字体列出的碱基位置组成，ST-LS1内含子由以下划线字体列出的碱基位置组成，且dre4反义链由以无下划线的小写字体列出的碱基位置组成：
TTTTAGTTCTTTTACCTCGGGAACTCTAGGCATTTGATTGACACTTTTGTATGACACAGTATTTTTTCTCACTTTCTCTTTATCTTTAGATCCAGATTGTTTTGCCAAACGCTCTTTTGCTTTTTCAgaatccttgcgtcatttggtgactagt accggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatag tatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatat tttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttaagttgtgcgtgag tccattgtgaaaaagcaaaagagcgtttggcaaaacaatctggatctaaagataaagagaaagtgagaaaaaatactgtgtcatacaaaagtgtcaatcaaatgcctagagttcccgaggtaaaagaactaaaa
SEQ ID NO:15显示YFP发夹RNA形成序列v2(如在核酸分子pDAB110853中发现的)。YFP有义链由以大写字体列出的碱基位置组成，ST-LS1内含子由以下划线字体列出的碱基位置组成，YFP反义链由以无下划线的小写字体列出的碱基位置组成。
ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGgactagtaccggttgggaaaggtatgtttct gcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaat aaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatat atgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat
SEQ ID NO:16显示了包含ST-LS1内含子的序列。
SEQ ID NO:17显示了如在pDAB101556中发现的YFP蛋白编码序列。
SEQ ID NO:18显示膜联蛋白区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:19显示膜联蛋白区2的DNA序列。
SEQ ID NO:20显示了β血影蛋白2区域1的DNA序列。
SEQ ID NO:21显示了β血影蛋白2区域2的DNA序列。
SEQ ID NO:22显示mtRP-L4区1的DNA序列。
SEQ ID NO:23显示mtRP-L4区2的DNA序列。
SEQ ID NO:24-51显示了用于扩增膜联蛋白、β血影蛋白2、mtRP-L4和YFP等的基因区域以供dsRNA合成的引物。
SEQ ID NO:52显示编码TIP41样蛋白的玉米DNA序列。
SEQ ID NO:53显示了寡核苷酸T20NV的DNA序列。
SEQ ID NO:54-58显示了用于测量玉米转录物水平的引物和探针的序列。
SEQ ID NO:59显示用于二元载体主链检测的SpecR编码区的一部分的DNA序列。
SEQ ID NO:60显示用于基因组拷贝数分析的AAD1编码区的一部分的DNA序列。
SEQ ID NO:61显示玉米转化酶基因的DNA序列。
SEQ ID NO:62-70显示了用于基因拷贝数分析的引物和探针的序列。
SEQ ID NO:71-73显示了用于玉米表达分析的引物和探针的序列。
SEQ ID NO:74显示用于测量玉米转录物水平的探针的序列。
实施本发明的模式
I.若干实施方案的概览
本文中公开了用于遗传控制鞘翅目害虫侵染的方法和组合物。还提供了用于鉴定对于鞘翅目害虫的生命周期必需的一个或多个基因，作为靶基因用于RNAi介导的鞘翅目害虫群体控制的方法。可设计编码一个或多个dsRNA分子的DNA质粒载体来抑制生长、存活、发育、和/或生殖所必需的靶基因。在一些实施方案中，提供了通过与鞘翅目害虫中靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转录后阻抑靶基因表达或抑制靶基因的方法。在这些和另外的实施方案中，鞘翅目害虫可以摄取一种或多种从与靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子的全部或部分转录的dsRNA、siRNA、miRNA、和/或hpRNA分子，由此提供植物保护效果。
因此，一些实施方案涉及使用与靶基因的编码和/或非编码序列互补的dsRNA、siRNA、miRNA、和/或hpRNA对靶基因产物的表达进行序列特异性抑制，以实现对鞘翅目害虫的至少部分控制。公开了一组分离纯化的核酸分子，其包含，例如，如SEQ ID NO:1-4任一者中列出的核苷酸序列及其片段。在一些实施方案中，可以从这些序列、其片段、或包含这些序列之一的基因表达稳定化的dsRNA分子，用于靶基因的转录后沉默或抑制。在某些实施方案中，分离的和纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:1或其互补序列(例如SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:4；和SEQ ID NO:4的互补序列)的全部或一部分。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子的至少一种重组DNA序列的重组宿主细胞(例如，植物细胞)。在特定的实施方案中，dsRNA分子可以在被鞘翅目害虫摄取时产生，使鞘翅目害虫中的靶基因发生转录后沉默或抑制其表达。重组DNA序列可以包含，例如，下述的任何一种或多种：SEQ ID NO:1-4；SEQ ID NO:1-4中任一个的片段；或包含SEQ ID NO:1-4中的一个或多个的基因的部分序列；或其互补序列。
具体实施方案涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞在其基因组中具有重组DNA序列，所述重组DNA序列编码至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子，所述至少一种iRNA分子包含SEQ ID NO:1的全部或部分。所述iRNA分子当被鞘翅目害虫摄取时，可沉默或抑制鞘翅目害虫中包含SEQ ID NO:1的靶基因的表达，从而导致该鞘翅目害虫生长，发育，繁殖和/或摄食的停止。
在一些实施方案中，在其基因组中具有编码至少一种dsRNA分子的至少一种重组DNA序列的重组宿主细胞可以是转化的植物细胞。一些实施方案涉及包含这样的转化的植物细胞的转基因植物。除了这样的转基因植物之外，还提供了任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子、和转基因植物产品，它们均包含重组DNA序列。在特定的实施方案中，可以在转基因植物细胞中表达本发明的dsRNA分子。因此，在这些和其他实施方案中，可以从转基因植物细胞分离本发明的dsRNA分子。在特定的实施方案中，转基因植物是选自下组的植物，包括：玉米(玉蜀黍(Zea mays))、大豆(Glycine max)、和禾本科(Poaceae)的植物。
一些实施方案涉及用于调控鞘翅目害虫细胞中靶基因表达的方法。在这些和其他实施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含编码dsRNA分子的核苷酸序列。在特定的实施方案中，编码dsRNA分子的核苷酸序列可与启动子可操作连接，并且还可与转录终止序列可操作连接。在特定的实施方案中，用于调控鞘翅目害虫细胞中靶基因表达的方法可包括：(a)用包含编码dsRNA分子的核苷酸序列的载体转化植物细胞；(b)在足以容许形成包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养所述转化的植物细胞；(c)选择已将载体整合到其基因组中的转化的植物细胞；和(d)确定选择的转化的植物细胞包含由载体的核苷酸序列编码的dsRNA分子。可以从基因组中整合有载体、且包含由载体的核苷酸序列编码的dsRNA分子的植物细胞再生植物。
因此，还公开了在其基因组中整合有载体的转基因植物，所述载体具有编码dsRNA分子的核苷酸序列，其中转基因植物包含由所述载体的核苷酸序列编码的dsRNA分子。在特定的实施方案中，植物中dsRNA分子的表达足以调控接触所述转化的植物或植物细胞(例如通过以转化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物细胞为食)的鞘翅目害虫细胞中靶基因的表达。本文中公开的转基因植物可以展现出对鞘翅目害虫侵染的抗性和/或增强的耐受性。特定的转基因植物可以展现出对一种或多种选自下组的鞘翅目害虫的抗性和/或增强的耐受性：WCR、NCR、SCR、MCR、黄瓜条根萤叶甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctataMannerheim。
本文中还公开了用于将控制剂(如iRNA分子等)递送给鞘翅目害虫的方法。这样的控制剂可以直接或间接地阻碍鞘翅目害虫进食、生长或以其他方式致害宿主的能力。在一些实施方案中，提供了这样的方法，包括将稳定化的dsRNA分子递送至鞘翅目害虫以抑制鞘翅目害虫中的至少一种靶基因，从而减少或消除鞘翅目和/或半翅目害虫对植物的损害。在一些实施方案中，抑制鞘翅目害虫中靶基因表达的方法可以导致鞘翅目害虫生长、发育、生殖和/或进食的停止。在一些实施方案中，所述方法最终可导致鞘翅目害虫死亡。
在一些实施方案中，提供了包含本发明的iRNA(例如，dsRNA)分子的组合物(例如，局部用组合物)，供在植物、动物、和/或植物或动物的环境中使用以消除或降低鞘翅目害虫的侵染。在特定的实施方案中，组合物可以是要喂给鞘翅目害虫的营养组合物或食物来源。一些实施方案包括使鞘翅目害虫可得到所述营养组合物或食物来源。包含iRNA分子的组合物的摄入可导致一个或多个鞘翅目害虫细胞摄取所述分子，进而可导致鞘翅目害虫细胞中至少一种靶基因表达的抑制。通过在鞘翅目害虫的宿主中提供一种或多种包含本发明的iRNA分子的组合物，可以在任何存在鞘翅目害虫的宿主组织或环境之中或之上限制或消除鞘翅目害虫对植物或植物细胞的摄入或损伤。
本文中公开的组合物和方法可与用于控制鞘翅目害虫所致损害的其他方法和组合物组合一起使用。例如，本文中所描述的用于针对鞘翅目害虫保护植物的iRNA分子可以在这样的方法中使用，所述方法包括另外使用一种或多种针对鞘翅目害虫有效的化学剂、针对鞘翅目害虫有效的生物杀虫剂、作物轮作、或展现出与本发明的RNAi介导的方法和RNAi组合物的特征不同的特征(例如，在植物中重组产生对于鞘翅目害虫有害的蛋白质(例如，Bt毒素))的重组遗传技术。
II.缩写
dsRNA 双链核糖核酸
GI 生长抑制
NCBI 美国国家生物技术信息中心
gDNA 基因组DNA
iRNA 抑制性核糖核酸
ORF 开放阅读框
RNAi 核糖核酸干扰
miRNA 微小核糖核酸
shRNA 小发夹核糖核酸
siRNA 小抑制性核糖核酸
hpRNA 发夹核糖核酸
UTR 非翻译区
WCR 西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)
NCR 北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)
MCR 墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)
PCR 聚合酶链式反应
RISC RNA诱导的沉默复合物
SCR 南方玉米根虫(十一星根萤叶甲)
YFP 黄色荧光蛋白
III.术语
在以下描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚且一致的理解，包括要赋予此类术语的范围，提供了以下定义：
鞘翅目害虫：如本文中使用的，术语“鞘翅目害虫”指以玉米和其它真正的禾本科为食的叶甲属昆虫。在具体的例子中，鞘翅目害虫选自下列清单，包括：玉米根萤叶甲(WCR)；巴氏根萤叶甲(NCR)；十一星根萤叶甲(SCR)；墨西哥玉米根萤叶甲(MCR)；黄瓜条根萤叶甲；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
(与生物)接触：如本文中使用的，与生物(例如，鞘翅目害虫害虫)“接触”或被生物“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括核酸分子内化到生物中，例如但不限于：生物摄取分子(例如，通过进食)；使生物与包含核酸分子的组合物接触；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。
重叠群：如本文使用的，术语“重叠群”指从一组来源于单一遗传来源的重叠DNA区段重建而来的DNA序列。
玉米植物：如本文中使用的，术语“玉米植物”指物种玉蜀黍(玉米)的植物。
编码dsRNA：如本文中使用的，术语“编码dsRNA”包括这样的基因，其RNA转录产物能够形成分子内dsRNA结构(例如，发夹)或分子间dsRNA结构(例如，通过与靶RNA分子杂交)。
表达：如本文中使用的，编码序列(例如，基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括，例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的操作部分、非操作部分、或结构部分(常常包括蛋白质的合成)。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生物暴露于增加或降低基因表达的物质。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过控制对转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子比如mRNA的降解的作用，或通过在特异性蛋白分子已经产生之后的活化、失活、区室化、或降解，或它们的组合，由此发生基因表达的调节。通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，Northern(RNA)印迹、RT-PCR、Western(免疫)印迹，或体外、原位或体内蛋白活性测定，可以在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达。
遗传物质：如本文中使用的，术语“遗传物质”包括所有基因和核酸分子，诸如DNA和RNA。
抑制：如本文中使用的，术语“抑制”在用于描述对编码序列(例如基因)的影响时是指从编码序列转录的mRNA和/或编码序列的肽、多肽、或蛋白质产物的细胞水平的可测量的降低。在一些实例中，抑制编码序列的表达可以使得表达大致消失。“特异性抑制”是指在实现特异性抑制的细胞中对靶编码序列的抑制不对其他编码序列(例如，基因)的表达产生影响。
分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸、肽或蛋白质)是已经从该组分所天然存在的生物细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白质)实质性分开、分开产生、或纯化出来。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。如本文中使用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，核酸分子通常在长度上具有至少10个碱基。根据惯例，核酸分子的核苷酸序列从分子的5’至3’端阅读。核苷酸序列的“互补序列”是指与核苷酸序列的核碱基形成碱基对(即，A-T/U，和G-C)的核碱基的从5’至3’的序列。核酸序列的“反向互补序列”是指与该核苷酸序列的核碱基形成碱基对的从3’至5’的序列。
“核酸分子”包括DNA的单链和双链形式；RNA的单链形式；和RNA的双链形式(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转运RNA)(无论是装载还是卸下相应的酰化氨基酸)、和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、基因组DNA、和DNA-RNA杂交体。术语“核酸区段”和“核苷酸序列区段”，或更一般而言的“区段”，本领域技术人员会理解它们是功能性的术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列、和较小的工程化核苷酸序列，其编码或可适用于编码肽、多肽、或蛋白质。
寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪能够合成长度多达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核苷酸序列结合，因此它们可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA(寡脱氧核糖核苷酸)组成的寡核苷酸可以用于PCR，PCR是一种用于扩增DNA和RNA(逆转录成cDNA)序列的技术。在PCR中，寡核苷酸一般被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰核苷酸，它们通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。本领域技术人员易于理解，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，如不带电连接(uncharged linkage)的修饰：例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接(charged linkage)的修饰：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分的修饰：例如肽类；嵌入剂修饰：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂修饰；烷化剂(alkylator)修饰；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑结构，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的(hairpinned)、圆形的、挂锁形的结构。
如本文中使用的，就DNA而言，术语“编码序列”、“结构核苷酸序列”、或“结构核酸分子”是指这样的核苷酸序列，当被置于适当的调节序列控制下时，其通过转录和mRNA最终翻译成多肽。就RNA而言，术语“编码序列”指翻译成肽、多肽或蛋白质的核苷酸序列。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子所界定。编码序列包括但不限于：基因组DNA；cDNA；EST；和重组核苷酸序列。
基因组：如本文中所使用的，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色体DNA，并且也指存在于细胞的亚细胞组成部分内的细胞器DNA。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可以整合到植物细胞的核DNA中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。术语“基因组”在其应用于细菌时，指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入细菌中，使得DNA分子整合到细菌的基因组中。在这些和另外的实施方案中，DNA分子可以整合于染色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
序列同一性：如本文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”，在两个核酸或多肽序列的情况下，是指在指定比较窗口上以最大对应性比对时，这两个序列中相同的残基。
如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”可以是指通过在比较窗口上比较两个最优比对序列(例如，核酸序列或多肽序列)确定的值，其中为了实现这两个序列的最优比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通过确定在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认为是与参考序列是100％相同的，反之亦然。
用于比较的序列比对方法是本领域技术人员熟知的。各种程序和比对算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-153；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-10890；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-165；Pearson等人，(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-250。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如，Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可在几个来源访问，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)、以及在互联网上，其与几种序列分析程序结合使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上BLAST的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的默认BLOSUM62矩阵集的BLAST(Blastn)程序的“Blast 2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考序列具有较大相似性的核酸序列将显示出同一性百分比的增加。
可特异性杂交/特异性互补：如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明互补性的足够程度的术语，该互补性足以使得在核酸分子与靶核酸分子之间发生稳定且特异的结合。在两个核酸分子之间的杂交两种涉及核酸分子的核酸序列之间的反平行比对的形成。然后，两个分子能够与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够稳定，则可使用本领域中熟知的方法检出。核酸分子与其可特异性杂交的靶序列不一定是100％互补的。然而，对于特异性杂交必须存在的序列互补性量依赖所使用的杂交条件而变化。
导致特定严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)决定杂交严格性。洗涤缓冲液的离子强度和洗涤温度也影响严格性。关于获得特定严格性程度所需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且论述于例如Sambrook等人(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9章和11章，以及更新；以及Hames和Higgins(编辑)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。关于核酸杂交的进一步详细说明和指导例如可见于Tijssen,"Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,"收录于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995，以及更新。
如本文中使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与靶核酸分子内的同源序列之间存在大于80％序列匹配时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件为具有80％以上序列匹配的分子将会杂交的条件(即，具有小于20％的错配)；“高严格性”条件为具有90％以上匹配的序列将会杂交的条件(即，具有小于10％的错配)；并且“极高严格性”条件为具有95％以上匹配的序列将会杂交的条件(即，具有小于5％的错配)。
以下是代表性的非限制性杂交条件：
高严格性条件(检测出共享至少90％序列同一性的序列)：在5X SSC缓冲液中在65℃杂交16小时；在2X SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；并且在0.5X SSC缓冲液中在65℃洗涤两次，每次20分钟。
中等严格性条件(检测出共享至少80％序列同一性的序列)：在5X到6X SSC缓冲液中在65--70℃杂交16-20小时；在2X SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；并且在1X SSC缓冲液中在55-70℃洗涤两次，每次30分钟。
非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的序列会杂交)：在6X SSC缓冲液中在室温到55℃杂交16-20小时；在2X到3X SSC缓冲液中在室温到55℃洗涤至少两次，每次20-30分钟。
如本文中使用的，术语“基本上同源”或“实质性同源性”就连续核酸序列而言是指由这样的核酸分子产生的连续核苷酸序列，所述核酸分子在严格条件下与具有参考核酸序列的核酸分子杂交。例如，具有与SEQ ID NO:1的参考核酸序列基本上同源的序列的核酸分子是如下的那些核酸分子，所述核酸分子在严格条件(例如，所提出的中等严格性条件，见上文)下与具有SEQ ID NO:1的参考核酸序列的核酸分子杂交。基本上同源的序列可以具有至少80％序列同一性。例如，基本上同源的序列可以具有约80％到100％序列同一性，诸如约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约99.5％；和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交紧密相关。例如，当存在足够的互补程度时，核酸分子可特异性地杂交，以便避免核酸在特异性结合是期望的情况下(例如，在严格杂交条件下)与非靶序列的非特异性结合。
如本文中使用的，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共同的祖先核苷酸序列进化并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基因。
如本文中使用的，当以5’至3’方向阅读的序列的每个核苷酸与当以3’至5’方向阅读时的另一序列的每个核苷酸序列互补时，两个核酸序列分子被认为展现出“完全互补性”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将展现出与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中定义明确的，并且是本领域普通技术人员容易理解的。
可操作(地)连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系中时，则第一核苷酸序列与第二核酸序列是可操作连接的。当以重组方式产生时，可操作连接的核酸序列通常是连续的，并且在必要时可以将两个蛋白质编码区连接在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的ORF中)。然而，可操作连接的核酸不一定是连续的。
在有关调节序列和编码序列的情况下使用时，术语“可操作连接”意味着该调节序列影响该连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录的周期和水平/量、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻抑物结合序列；终止序列；和多腺苷酸化识别序列等。特定的调节序列可位于与其可操作连接的编码序列的上游和/或下游。并且，与编码序列可操作连接的特定调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
启动子：如本文中使用的，术语“启动子”是指可以在转录起始上游的、且可能涉及RNA聚合酶与其他蛋白质的识别和结合而启动转录的DNA区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码序列可操作连接，或者启动子可与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可与用于在细胞中表达的编码序列可操作连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织。这样的启动子称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”的。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可以在环境控制之下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性启动子、组织优先启动子、细胞类型特异性启动子、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性的启动子。
在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而增加。诱导型启动子的实例包括但不限于：来自响应于铜的ACEI系统的启动子；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因启动子；来自Tn10的Tet阻抑物；和来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质激素诱导(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425)。
示例性的组成型启动子包括，但不限于：来自植物病毒的启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，欧洲油菜ALS3结构基因5'的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)(美国专利No.5,659,026)。
另外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先启动子。用包含与组织特异性启动子可操作连接的编码序列的核酸分子转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码序列的产物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子特异性启动子，如来自菜豆蛋白基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，如来自Zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，如来自apg的启动子。
转化：如本文中使用的，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。当核酸分子通过核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由该细胞稳定复制时，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人，(1986)Nature 319:791-793)；脂质体转染(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)；显微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15:579-585)；土壤杆菌介导的转移(Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-4807)；直接DNA摄取；和微粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327:70)。
转基因：外源核酸序列。在一些实例中，转基因可以是编码dsRNA分子的一条或两条链的序列，所述dsRNA分子包含与存在于鞘翅目害虫中的核酸分子互补的核苷酸序列。在另外的实例中，转基因为反义核酸序列，其中所述反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。在又另外的实例中，转基因可以是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因。在这些和其他实例子中，转基因可以含有与转基因的编码序列可操作连接的调节序列(例如，启动子)。
载体：引入到细胞中，例如产生转化的细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体的实例包括但不限于：质粒；粘粒；噬菌体；和携带外源DNA进入细胞中的病毒。载体也可以是RNA分子。载体还可包括一种或多种基因、反义序列、和/或选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。任选地，载体包括辅助核酸分子实现进入细胞中的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对该作物有害的鞘翅目害虫的相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％至115％或更大的稳定化产量的栽培种。
除非特别指明或暗示，如本文中使用的术语“一个”、“一种”和“该”表示“至少一个/种”。
除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下出版物中找到分子生物学中常见术语的定义：例如，Lewin’s Genes X,Jones&Bartlett Publishers,2009(ISBN100763766321)；Krebs等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例以体积计。所有温度以摄氏度计。
IV.包含鞘翅目害虫序列的核酸分子
A.概述
本文中描述了可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。描述的核酸分子包括靶序列(例如，天然基因、和非编码序列)、dsRNA、siRNA、hpRNA、和miRNA。例如，在一些实施方案中描述了dsRNA、siRNA、miRNA和/或hpRNA分子，其可与鞘翅目害虫中的一种或多种天然核酸序列的全部或部分特异性地互补。在这些和另外的实施方案中，天然核酸序列可以是一种或多种靶基因，其产物可以例如但不限于：涉及代谢过程；涉及生殖过程；或者涉及幼虫发育。本文中描述的核酸分子在导入包含至少一种与该核酸分子特异性互补的天然核酸序列的细胞中时，可以在细胞中启动RNAi，随后降低或消除该天然核酸序列的表达。在一些实例中，借助于包含与靶基因特异性互补的序列的核酸分子，靶基因表达的表达的降低或消除在鞘翅目害虫中可以是致命的，或导致生长和/或生殖降低。
在一些实施方案中，可以选择鞘翅目害虫中的至少一种靶基因，其中靶基因包含dre4核苷酸序列。在具体的实例中，选择鞘翅目害虫的靶基因，其中靶基因包含新的dre4的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。。
在一些实施方案中，靶基因可以是包含能够在计算机上反向翻译为多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽包含与dre4的蛋白质产物的氨基酸序列至少85％相同(例如，约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或100％相同)的连续氨基酸序列。靶基因可以是鞘翅目害虫中任何这样的核酸序列，对该序列的转录后抑制会对鞘翅目害虫造成有害影响，或为植物提供针对鞘翅目害虫的保护益处。在具体的实例中，靶基因是这样的核酸分子，其包含能够在计算机上反向翻译为多肽的核苷酸序列，所述多肽包含连续的氨基酸序列，该连续的氨基酸序列与作为SEQ ID NO:2-4中任一者的计算机翻译产物的氨基酸序列至少85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同、或100％相同。
依照本发明提供了核苷酸序列，其表达生成包含核苷酸序列的RNA分子，所述核苷酸序列与由鞘翅目害虫中的编码序列编码的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，在鞘翅目害虫摄入表达的RNA分子后，可以获得鞘翅目害虫细胞中编码序列的下调。在特定的实施方案中，鞘翅目害虫细胞中编码序列的下调可以对鞘翅目害虫的生长、生存力、增殖、和/或生殖产生有害影响。
在一些实施方案中，靶序列包括转录的非编码RNA序列，诸如5’UTR；3’UTR；剪接前导序列；内含子序列；末端内含子(outron)序列(例如，随后在反式剪接中修饰的5'UTRRNA)；donatron序列(例如，提供反式剪接的供体序列需要的非编码RNA)；和鞘翅目害虫靶基因的其他非编码转录RNA。这样的序列可以衍生自单顺反子和多顺反子基因两者。
因此，本文中结合一些实施方案还描述了包含至少一种核苷酸序列的iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA和hpRNA)，所述核苷酸序列与鞘翅目害虫中的靶序列的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，iRNA分子可以包含与多个靶序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个靶序列的全部或部分互补的核苷酸序列。在特定的实施方案中，iRNA分子可以在体外产生，或通过遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。还公开了cDNA序列，其可以用于产生与鞘翅目害虫中的靶序列的全部或部分特异性地互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、和/或hpRNA分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体。转化的宿主靶标可以从重组DNA构建体表达有效水平的dsRNA、siRNA、miRNA分子、和/或hpRNA分子。因此，还描述了植物转化载体，其包含与在植物细胞中功能性的异源启动子可操作连接的至少一个核苷酸序列，其中核苷酸序列的表达生成包含与鞘翅目害虫中的靶序列的全部或部分特异性互补的核苷酸序列的RNA分子。
在一些实施方案中，可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子可以包括：从叶甲属(Diabrotica)分离的包含dre4(例如SEQ ID NO:1-4中的任一者)的天然核酸序列的全部或部分；在表达时生成这样的RNA分子的核苷酸序列，所述RNA分子包含与由dre4编码的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补的核苷酸序列；iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA和hpRNA)，所述iRNA分子包含与dre4的全部或部分特异性地互补的至少一个核苷酸序列；可用于产生dsRNA分子、siRNA分子、miRNA和/或hpRNA分子的cDNA序列，所述分子与dre4的全部或部分特异性地互补；以及用于在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体，其中转化的宿主靶标包含前述核酸分子的一种或多种。
B.核酸分子
本发明提供了，除其他事项外，抑制鞘翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子；和能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制鞘翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达的DNA分子。
本发明的一些实施方案提供了分离的核酸分子，其包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的互补序列；被转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；被转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；被转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，以及被转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列。在特定的实施方案中，分离的核酸序列与鞘翅目害虫的接触或被其摄取可抑制鞘翅目害虫的生长、发育、生殖和/或进食。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包含至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)DNA序列，其能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制鞘翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达。这样的DNA序列可以与在包含该DNA分子的细胞中具备功能的启动子序列可操作连接，以启动或增强编码的能够形成dsRNA分子的RNA的转录。在一个实施方案中，所述至少一个(例如，一个、两个、三个、或更多个)DNA序列可衍生自包含SEQID NO:1的核苷酸序列。SEQ ID NO:1的衍生物包括SEQ ID NO:1的片段。在一些实施方案中，这样的片段可包含例如SEQ ID NO:1的至少约19个连续核苷酸、或其互补序列。因此，这样的片段可包含，例如，SEQ ID NO:1的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个连续核苷酸，或其互补序列。在这些实施方案以及进一步的实施方案中，这样的片段可以包含，例如，SEQ ID NO:1的多于约19个连续核苷酸，或其互补序列。因此，SEQ ID NO:1的片段可以包含，例如，SEQ ID NO:1的19个、20个、21个、约25个(例如22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、和29个)、约30个、约40个(例如35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、和45个)、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个或更多个连续核苷酸，或其互补序列。
一些实施方案包括将部分或完全稳定化的dsRNA分子导入鞘翅目害虫中以抑制鞘翅目害虫的细胞、组织或器官中靶基因的表达。当表达为iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)并被鞘翅目害虫摄取时，包含SEQ ID NO:1的一个或多个片段的核酸序列可以引起下列一项或多项：鞘翅目害虫的死亡、生长抑制、性别比变化、产卵量(broodsize)减少、感染停止、和/或进食停止。例如，在一些实施方案中，提供了dsRNA分子，其包含含有与鞘翅目害虫靶基因序列基本上同源的约19到约300个核苷酸的核苷酸序列，且包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一个或多个片段。这样的dsRNA分子的表达可以例如导致摄取dsRNA分子的鞘翅目害虫的死亡和/或生长抑制。
在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含：与包含SEQ ID NO:1的靶基因互补的核苷酸序列、和/或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，在鞘翅目害虫中抑制所述靶基因导致对于鞘翅目害虫的生长、发育、或其他生物学功能必需的蛋白质或核苷酸序列物质的减少或消除。选择的核苷酸序列可以与下列各项展现出约80％到约100％序列同一性：SEQ ID NO:1；在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的连续片段；或前述项任一者的互补序列。例如，选定的核苷酸序列可以与下列各项展现出约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:1；在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的连续片段；或前述项任一者的互补序列。
在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制靶基因表达的DNA分子可以包含与存在于一个或多个鞘翅目害虫物种中的天然核酸序列的全部或部分特异性地互补的单个核苷酸序列，或者DNA分子可以是从多个这样的特异性互补序列构建而成的嵌合体。
在一些实施方案中，核酸分子可以包含以“间隔物序列”分开的第一和第二核苷酸序列。间隔物序列可以是任何包含促进第一和第二核苷酸序列之间的二级结构形成(在期望的情况下)的核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，间隔物序列是mRNA的有义或反义编码序列的一部分。或者，间隔物序列可以包含能够与核酸分子可操作连接的核苷酸或其同源物的任何组合。
例如，在一些实施方案中，DNA分子可以包含编码一种或多种不同RNA分子的核苷酸序列，其中每种不同RNA分子分别包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列彼此互补。第一和第二核苷酸序列在RNA分子内可以通过间隔物序列连接。间隔物序列可以构成第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的一部分。包含第一和第二核苷酸序列的RNA分子的表达可以通过第一和第二核苷酸序列的特异性碱基配对而导致本发明的dsRNA分子的形成。第一核苷酸序列或第二核苷酸序列可以与对于鞘翅目害虫而言天然的核酸序列(例如，靶基因、或转录的非编码序列)、其衍生物、或其互补序列基本上相同。
dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸序列的双链，并且可以包含对磷酸-糖主链或核苷的修饰。可以适宜调整RNA结构的修饰以使得特异性抑制能够发生。在一个实施方案中，可以通过普遍存在的酶促过程来修饰dsRNA分子，以便能够生成siRNA分子。此酶促过程可以利用体外或体内的RNA酶III酶，如真核生物中的切丁酶。参见Elbashir等人，(2001)Nature 411:494-498；以及Hamilton和Baulcombe(1999)Science 286(5441):950-952。切丁酶或功能等效的RNA酶III酶将较大的dsRNA链和/或hpRNA分子切割成较小的寡核苷酸(例如，siRNA)，每个所述寡核苷酸长度为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的siRNA分子具有2到3个核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羟基末端。由RNA酶III酶生成的siRNA分子在细胞中解旋，并分成单链RNA。然后，siRNA分子与从靶基因转录的RNA序列特异性地杂交，并且这两种RNA分子随后通过固有的细胞RNA降解机制而被降解。这个过程可以导致由靶生物中的靶基因编码的RNA序列的有效降解或消除。结果导致靶向基因的转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源RNA酶III酶从异源核酸分子产生的siRNA分子可以有效介导鞘翅目害虫中靶基因的下调。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包括至少一种可被转录成单链RNA分子的非天然存在的核苷酸序列，所述单链RNA分子能够在体内通过分子间杂交形成dsRNA分子。这样的dsRNA序列常常进行自组装，并且可以在鞘翅目害虫的营养来源中提供，以实现靶基因的转录后抑制。在这些和另外的实施方案中，本发明的核酸分子可以包含两种不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每种序列与鞘翅目害虫中的不同靶基因特异性地互补。当向鞘翅目害虫以dsRNA分子的形式提供这样的核酸分子时，dsRNA分子抑制鞘翅目害虫中至少两种不同靶基因的表达。
C.获得核酸分子
可以使用鞘翅目害虫中的多种天然序列作为靶序列来设计本发明的核酸分子，如iRNA和编码iRNA的DNA分子。然而，天然序列的选择并非是直截了当的过程。鞘翅目害虫的天然序列中仅有少数会是有效的靶标。例如，无法肯定地预测特定的天然序列是否可以被本发明的核酸分子有效下调，或者特定的天然序列的下调是否会对鞘翅目害虫的生长、生存力、增殖和/或生殖具有有害影响。绝大多数的鞘翅目害虫天然序列，如自其分离的EST(例如，如美国专利7,612,194和美国专利7,943,819中所列出的)，对鞘翅目害虫，如WCR或NCR的生长、生存力、增殖和/或生殖没有有害影响。同样无法预测，在可以对鞘翅目害虫具有有害影响的天然序列中，哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与这样的天然序列互补的核酸分子，并且在进食后对鞘翅目害虫造成有害影响，同时不对宿主植物引起损害。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子(例如，要在鞘翅目害虫的宿主植物中提供的dsRNA分子)被选择为靶向这样的cDNA序列，其编码对于鞘翅目害虫存活必需的蛋白质或蛋白质部分(如涉及代谢或分解代谢生物化学途径、细胞分裂、生殖、能量代谢、消化、宿主植物识别等的氨基酸序列)。如本文中描述的，靶生物摄入含有一种或多种dsRNA——所述dsRNA的至少一个区段与靶害虫生物细胞中产生的RNA的至少一个基本上相同的区段特异地互补——的组合物，可以导致靶生物的死亡或其他抑制。可以使用从鞘翅目害虫衍生的核苷酸序列(DNA或RNA)来构建对鞘翅目害虫侵染有抗性的植物细胞。例如，可以转化鞘翅目害虫的宿主植物(例如，玉蜀黍或大豆)，使其含有从鞘翅目害虫衍生的如本文中提供的一种或多种核苷酸序列。转化到宿主中的核苷酸序列可以编码一种或多种RNA，其在转化的宿主内的细胞或生物学流体中形成dsRNA序列，因此，如果/当鞘翅目害虫与转基因宿主形成营养关系时，使得dsRNA可用。这可以导致鞘翅目害虫细胞中一种或多种基因表达的阻抑，最终导致死亡或其生长或发育的抑制。
因此，在一些实施方案中，靶向实质参与鞘翅目害虫的生长、发育和生殖的基因。本发明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在鞘翅目害虫的生存力、运动、迁移、生长、发育、感染性、进食位置的建立和生殖中发挥重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或转录因子。另外，本发明中使用的天然鞘翅目害虫核苷酸序列也可以从植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能对于本领域技术人员是已知的，且其核苷酸序列与鞘翅目害虫的基因组中的靶基因可特异性地杂交。通过杂交鉴定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，本发明提供了用于获得包含用于产生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)分子的核苷酸序列的核酸分子的方法。一种这样的实施方案包括：(a)对一种或多种靶基因分析其在鞘翅目害虫中在dsRNA介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自靶向的鞘翅目害虫的核苷酸序列的全部或部分或其同源物，所述靶向的鞘翅目害虫在dsRNA介导的阻抑分析中展现出改变的(例如，降低的)生长或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的DNA克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；(e)对包含步骤(d)中分离的克隆的cDNA或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子包含RNA序列的全部或大部分或其同源物；和(f)化学合成基因序列的全部或大部分、或siRNA、或miRNA、或hpRNA或mRNA或dsRNA。
在另外的实施方案中，用于获得包含用于产生大部分的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)分子的核苷酸序列的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其与来自靶向的鞘翅目害虫的天然核苷酸序列的一部分特异性地互补；和(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA插入物，其中扩增的核酸分子包含siRNA或miRNA或shRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA分子的大部分。
本发明的核酸可以通过多种途径分离、扩增、或产生。例如，可以通过PCR扩增从gDNA或cDNA文库衍生的靶核酸序列(例如，靶基因或靶转录的非编码序列)、或其部分而获得iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)分子。可以从靶生物提取DNA或RNA，并且可以使用本领域普通技术人员已知的方法从其制备核酸文库。可使用自靶生物生成的gDNA或cDNA文库进行靶基因的PCR扩增和测序。可以使用确认的PCR产物作为体外转录的模板以在最低限度的启动子的情况下生成有义和反义RNA。或者，可以使用标准化学，如亚磷酰胺化学，通过许多技术(参见，例如Ozaki等人，(1992)Nucleic Acids Research,20:5205-5214；和Agrawal等人，(1990)Nucleic Acids Research,18:5419-5423)，包括使用自动化DNA合成仪(例如，P.E.Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)392或394型DNA/RNA合成仪)的任一者来合成核酸分子。参见，例如，Beaucage等人，(1992)Tetrahedron,48:2223-2311；美国专利4,415,732、4,458,066、4,725,677、4,973,679、和4,980,460。也可以采用备选化学，其生成非天然主链基团，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。
本发明的RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、或hpRNA分子可以由本领域技术人员可以通过手动或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含含有编码RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、或hpRNA分子的序列的核酸分子的细胞中体内产生。还可以通过部分或完全有机合成产生RNA，可以通过体外酶促或有机合成引入任何经修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶)合成RNA分子。可用于克隆和表达核苷酸序列的表达构建体是本领域中已知的。参见，例如，美国专利5,593,874、5,693,512、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在导入细胞中之前纯化化学合成或通过体外酶促合成合成的RNA分子。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法、或其组合从混合物纯化RNA分子。或者，可以在不纯化或最小程度纯化的情况下使用化学合成或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可以将RNA分子干燥贮存或溶解在水溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐以促进dsRNA分子双链体链的退火和/或稳定化。
在实施方案中，可以通过单一自身互补的RNA链或者从两条互补RNA链形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在体内或在体外合成。细胞的内源RNA聚合酶可以在体内介导一条或两条RNA链的转录，或者可以使用克隆的RNA聚合酶在体内或在体外介导转录。通过宿主器官、组织、或细胞类型中的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子进行)；刺激宿主中的环境条件(例如，通过使用响应于感染、胁迫、温度、和/或化学诱导物的诱导型启动子)；和/或在宿主的某个发育阶段或年龄人工造成转录(例如，通过使用发育阶段特异性启动子)，在鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制可以是宿主靶向的。形成dsRNA分子的RNA链(不论是体外还是体内转录的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能够也可以不能被细胞翻译机制翻译成多肽。
D.重组载体和宿主细胞转化
在一些实施方案中，本发明还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、或植物细胞)中的DNA分子，其中DNA分子包含这样的核苷酸序列，该核苷酸序列在表达为RNA并被鞘翅目害虫摄取后，可实现对鞘翅目害虫的细胞、组织或器官中靶基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包含能够在植物细胞中表达为iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)分子以抑制鞘翅目害虫中靶基因表达的核酸序列。为了启动或增强表达，这样的重组核酸分子可以包含一种或多种调节序列，所述调节序列可以与能够表达为iRNA的核酸序列可操作连接。在植物中表达基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表达本发明的核苷酸序列。参见，例如，国际PCT公开号WO06/073727；和美国专利公开号2006/0200878Al)。
在具体的实施方案中，本发明的重组DNA分子可以包含编码dsRNA分子的核酸序列。这样的重组DNA分子可以编码这样的dsRNA分子，它们在被摄取后能够抑制鞘翅目害虫细胞中内源靶基因的表达。在许多实施方案中，转录的RNA可以形成dsRNA分子，所述dsRNA分子可以以稳定化形式提供；例如，以发夹和茎和环结构的形式提供。
在这些和进一步的实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自下组的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列转录而形成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列。
在特定的实施方案中，编码dsRNA分子的重组DNA分子可以在一个转录序列内包含至少两个核苷酸序列区段，这样的序列如此排列，使得该转录序列包含相对于至少一个启动子处于有义取向的第一核苷酸序列区段，且包含所述第一核苷酸序列区段的反向互补序列的第二核苷酸序列区段处于反义取向，其中有义核苷酸序列区段和反义核苷酸序列区段由约五(约5)到约一千(约1000)个核苷酸的间隔物序列区段连接或相连。间隔物序列区段可以在有义和反义序列区段之间形成环。有义核苷酸序列或反义核苷酸序列区段可以与靶基因(例如，包含SEQ ID NO:1的基因)或其片段(例如，SEQ ID NO:2-4中任一者)的核苷酸序列基本上同源。然而，在一些实施方案中，重组DNA分子可以编码没有间隔物序列的dsRNA分子。在实施方案中，有义编码序列和反义编码序列可具有不同长度。
通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒，可以容易地将鉴定为对鞘翅目害虫具有有害影响或者针对鞘翅目害虫的植物保护效果的序列掺入表达的dsRNA分子中。例如，可以通过如下步骤将这样的序列表达为具有茎和环结构的发夹：采用对应于靶基因序列(例如，SEQ ID NO:1及其片段)的第一区段；将此序列与第二区段间隔物区连接，所述第二区段间隔物区与第一区段不是同源或互补的；并将这与第三区段连接，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的分子内碱基配对而形成茎和环结构，其中环结构形成并包含第二区段。参见，例如，美国专利公开文本2002/0048814和2003/0018993；以及国际PCT公开文本WO94/01550和WO98/05770。可以例如以双链结构诸如茎环结构(例如，发夹)形式生成dsRNA分子，由此通过共表达靶基因的片段(例如在另外的植物表达盒上的靶基因的片段)增强靶向天然鞘翅目害虫序列的siRNA的产生，这可导致siRNA产生增强，或者降低甲基化以防止dsRNA发夹启动子的转录基因沉默。
本发明的实施方案包括将本发明的重组核酸分子导入植物中(即，转化)以实现一种或多种iRNA分子的鞘翅目害虫抑制水平的表达。重组DNA分子可以例如是载体，如线性或闭合环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如将本发明的核酸序列适当地插入载体中，在一种或多种宿主中发挥功能以驱动连接的编码序列或其他DNA序列表达的合适启动子控制下。许多载体可用于此目的，适当载体的选择主要将取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。根据其功能(例如，DNA扩增或DNA表达)及与其相容的特定宿主细胞，每种载体含有不同的组分。
为了对转基因植物赋予鞘翅目害虫抗性，例如可以在重组植物的组织或流体内将重组DNA转录成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分子)。iRNA分子可包含与可引起宿主植物物种损害的鞘翅目害虫内的相应转录核苷酸序列基本上同源且可特异性杂交的核苷酸序列。例如，鞘翅目害虫可以通过摄取包含iRNA分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿主植物细胞中转录的iRNA分子。因此，靶基因的表达在侵染转基因宿主植物的鞘翅目害虫内受到iRNA分子阻抑。在一些实施方案中，对靶鞘翅目害虫中靶基因表达的阻抑可以生成对害虫侵染有抗性的植物。
为了使iRNA分子能够被递送给与已经用本发明的重组核酸分子转化的植物细胞有营养关系的鞘翅目害虫，需要在植物细胞中表达(即，转录)iRNA分子。因此，重组核酸分子可以包含与一种或多种调节序列(诸如在宿主细胞中发挥功能的异源启动子序列)可操作连接的本发明的核苷酸序列，所述宿主细胞诸如其中要扩增核酸分子的细菌细胞，或其中要表达核酸分子的植物细胞。
适合于用于本发明的核酸分子的启动子包括诱导型、病毒的、合成的、或组成型的那些启动子，它们都是本领域中熟知的。描述这样的启动子的非限制性实例包括美国专利6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(CaMV 35S启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)；6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原体诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)启动子)；及美国专利公开号2009/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。其他启动子包括胆脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-5749)和章鱼碱合酶(OCS)启动子(两者都在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组(caulimovirus)启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:315-324)；CaMV35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:810-812；玄参花叶病毒35S启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-6628)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-4148)；R基因复合物启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell 1:1175-1183)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；FMV 35S(美国专利5,378,619和6,051,753)；PClSV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-573；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-187)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子包含组织特异性启动子，如根特异性启动子。根特异性启动子驱动专门或优先在根组织中表达可操作连接的编码序列。根特异性启动子的实例是本领域中已知的。参见，例如，美国专利5,110,732；5,459,252和5,837,848；Opperman等人，(1994)Science 263:221-3；和Hirel等人，(1992)Plant Mol.Biol.20:207-18。在一些实施方案中，可以在两个根特异性启动子之间克隆依照本发明的用于鞘翅目害虫控制的核苷酸序列或片段，所述根特异性启动子相对于所述核苷酸序列或片段以相反的转录方向排布，在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达以在转基因植物细胞中产生RNA分子，RNA分子随后可形成dsRNA分子，如上文所述。鞘翅目害虫可以摄取植物组织中表达的iRNA分子，从而实现对靶基因表达的阻抑。
可任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其他调节序列包括5'UTR，5'UTR作为位于启动子序列和编码序列之间的翻译前导序列发挥功能。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA中，并且其可以影响初级转录物的加工和/或RNA的稳定性。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导物(美国专利No.5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物rubisco前导序列等。参见，例如，Turner和Foster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性实例包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GENBANK TM登录号V00087；和Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
其他与感兴趣的核酸分子可操作连接的调节序列还包括3'非翻译序列、3'转录终止区、或多腺苷酸化区。这些是位于核苷酸序列下游的遗传元件，并且包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸、和/或能够影响转录或mRNA加工的其他调节信号。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前体的3'端。多腺苷酸化序列可以源自多种植物基因或T-DNA基因。3'转录终止区的一个非限制性实例是胆脂碱合酶3'区(nos 3'；Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。在Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1:671-80中提供了使用不同3'非翻译区的实例。多腺苷酸化信号的非限制性实例包括来自豌豆RbcS2基因的信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(GENBANK TM登录号E01312)。
一些实施方案可以包括植物转化载体，该植物转化载体包含分离纯化的DNA分子，该DNA分子包含与本发明的一种或多种核苷酸序列可操作连接的至少一种上文描述的调节序列。在表达时，一种或多种核苷酸序列生成一种或多种包含核苷酸序列的RNA分子，所述核苷酸序列与鞘翅目害虫中的天然RNA分子的全部或部分特异性地互补。因此，核苷酸序列可以包含编码靶向的鞘翅目害虫RNA转录物内存在的核糖核苷酸序列的全部或部分的区段，并且可以包含靶向的鞘翅目害虫转录物的全部或部分的反向重复。植物转化载体可以含有与超过一种靶序列特异性互补的序列，由此容许产生超过一种dsRNA以抑制靶鞘翅目害虫的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。可以将与不同基因中存在的核苷酸序列特异性互补的核苷酸序列区段组合成单一复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续的或者由间隔物序列分开。
在一些实施方案中，可以通过在同一质粒中依次插入另外的核苷酸序列来修饰已经含有本发明的至少一个核苷酸序列的本发明质粒，其中所述另外的核苷酸序列与原有的至少一个核苷酸序列可操作连接于相同的调节元件。在一些实施方案中，核酸分子可以设计为抑制多种靶基因。在一些实施方案中，要抑制的多种基因可以获自相同的鞘翅目害虫物种，这样做可以增强核酸分子的有效性。在其他实施方案中，基因可以来自不同的鞘翅目害虫，这样可以拓宽药剂有效的鞘翅目害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑、或表达和阻抑的组合时，可以制造多顺反子DNA元件。
本发明的重组核酸分子或载体可以包含赋予转化的细胞，诸如植物细胞可选择表型的选择标志物。也可以使用选择标志物来选择包含本发明的重组核酸分子的植物或植物细胞。标志物可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素，等等)、或除草剂抗性(例如，草甘膦等)。选择标志物的实例包括但不限于编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等选择的neo基因；编码双丙氨磷抗性的bar基因；编码草甘膦抗性的突变体EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因。可用多种选择标志物，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素、大观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。这样的选择标志物的实例展示于，例如美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。
本发明的重组核酸分子或载体还可以包含可筛选标志物。可以使用可筛选标志物来监测表达。示例性筛选标志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码已知的多种生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)；R基因座基因，其编码调节植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac."收录于18 th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson和R.Appels编辑，(New York:Plenum),pp.263-82)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码已知多种生色底物的酶(例如，PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；萤光素酶基因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因,其编码能转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene 46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone)(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重组核酸分子来制备表现出对鞘翅目害虫的易感性降低的转基因植物。例如，可以通过将编码iRNA分子的核酸分子插入植物转化载体中，并将这些导入植物中来制备植物转化载体。
用于宿主细胞转化的适合方法包括任何能将DNA导入细胞中的方法，如通过原生质体转化(参见，例如，美国专利No.5,508,184)，通过干燥/抑制介导的DNA摄取(参见，例如，Potrykus等人.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)，通过电穿孔(参见，例如，美国专利No.5,384,253)，通过用碳化硅纤维搅拌(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)，通过土壤杆菌介导的转化(参见，例如，美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通过加速DNA包被的颗粒(参见，例如，美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利5,591,616、7,060,876和7,939,3281中。通过应用诸如此类的这些技术，几乎任何物种的细胞都可被稳定转化。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可再生为转基因生物。可以使用任何这些技术来产生转基因植物，例如在转基因植物的基因组中包含编码一种或多种iRNA分子的一种或多种核酸序列。
用于将表达载体导入植物中的广泛使用的方法是基于各种土壤杆菌物种的天然转化系统。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是将植物细胞遗传转化的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Ti(诱导肿瘤)-质粒含有被称为T-DNA的大片段，其被转移到转化的植物中。Ti质粒的另一个片段，Vir区，负责T-DNA的转移。T-DNA区的边界为末端重复序列。在修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，Vir区的功能用于转移以T-DNA边界序列为界的外来DNA。T区还可含有用于转基因细胞和植物有效恢复的选择标志物、以及插入用于转移诸如编码核酸的dsRNA之类序列的多克隆位点。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌土壤杆菌的Ti质粒(参见，例如，美国专利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及欧洲专利No.EP 0 122791)或发根土壤杆菌的Ri质粒。其他的植物转化载体包括，例如但不限于，由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及在欧洲专利No.EP 0 120 516中所描述的那些载体，以及从任何前述文献来源的那些载体。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌，如中华根瘤菌属、根瘤菌属、和中慢生根瘤菌属，以介导到许多各种各样的植物中的基因转移。通过获取卸甲Ti质粒和适合的二元载体，可以使这些植物相关的共生细菌能够胜任基因转移。
在提供外源DNA到受体细胞的递送之后，通常鉴定出转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化细胞的能力，人们可能期望采用如前提出的选择或筛选标志物基因，其中转化载体用来再生转化体。在采用选择标志物的情况下，通过使细胞暴露于选择剂或药剂，鉴定出在潜在转化的细胞群中的转化细胞。在采用筛选标志物的情况下，可针对期望的标志物基因性状来筛选细胞。
暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的介质中进行培养。在一些实施方案中，可通过包含其他物质，如生长调节剂来改良任何适合的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基本培养基上，直到可得到足够的组织用于启动植物再生工作时为止，或者在重复多轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生时为止(例如，典型地约2周)，然后转移到有助于芽形成的介质中。定期转移培养物，直到已经出现充分的芽形成时为止。一旦形成芽，将它们转移到有助于根形成的介质中。一旦形成足够的根，可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了证实再生植物中感兴趣核酸分子(例如，编码一种或多种iRNA分子的DNA序列，所述iRNA分子抑制鞘翅目害虫中的靶基因表达)的存在，可以进行多种测定法。这样的测定法例如包括：分子生物学测定，如Southern和northern印迹、PCR、和核酸测序；生物化学测定，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA和/或免疫印迹)或借助于酶功能；植物部分测定，如叶或根测定；和再生的全植物的表型分析。
可例如通过使用对感兴趣核酸分子特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增来分析整合事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于，来源于分离的宿主植物愈伤组织的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，所述愈伤组织预期含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子，然后进行标准克隆和PCR扩增产物的序列分析。PCR基因分型方法已被很好地描述(例如Rios,G等人，(2002)Plant J.32:243-53)，并可应用于来源于任何植物物种(例如，玉米或大豆)或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。
采用依赖于土壤杆菌的转化方法形成的转基因植物一般含有插入一个染色体中的单个重组DNA序列。该单个重组DNA序列被称为“转基因事件”或“整合事件”。这样的转基因植物对于插入的外源序列而言是半合的。在一些实施方案中，通过含有单个外源基因序列的独立分离的转基因植物与自身(例如T0植物)有性交配(自交)以产生Tl种子，可获得相对于转基因为纯合的转基因植物。所产生的Tl种子的四分之一相对于所述转基因是纯合的。萌发Tl种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试一般使用SNP测定或热扩增测定，使得允许在杂合子和纯合子之间进行区分(即，接合型测定)。
在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有鞘翅目害虫-抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9种或10种或更多种不同iRNA分子。可以从引入不同转化事件中的多种核酸序列、或从引入单一转化事件中的单一核酸序列表达iRNA分子(例如，dsRNA分子)。在一些实施方案中，在单一启动子的控制下表达多个iRNA分子。在其他实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个iRNA分子。可以表达包含多个核酸序列的单一iRNA分子，所述核酸序列各自与在相同鞘翅目害虫物种的不同群体中或在不同的鞘翅目害虫物种中的一个或多个鞘翅目害虫内的不同基因座(例如，由SEQ ID NO:1限定的基因座)同源。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制造转基因植物。例如，可将包含编码iRNA分子的核苷酸序列的重组核酸分子导入易于转化的第一植物品系中而产生转基因植物，其中转基因植物可与第二植物品系杂交而使编码iRNA分子的核苷酸序列渗入到第二植物品系中。
本发明还包括含有本发明的一种或多种序列的商业产品。特定的实施方案包括从含有本发明的一种或多种核苷酸序列的重组植物或种子生产的商业产品。含有本发明的一种或多种序列的商业产品预期包括但不限于：植物的粗粉/粕(meal)、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，或包含含有本发明的一种或多种序列的重组植物或种子的任何粗粉、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物或动物饲料产品。本文中考虑的一种或多种商品或商业产品中的本发明的一种或多种序列的检测实际上证明，商品或商业产品是从为了使用dsRNA介导的基因阻抑方法控制鞘翅目植物害虫的目的，设计为表达本发明的一种或多种核苷酸序列的转基因植物所生产的。
在一些方面，包括由自转化的植物细胞衍生的转基因植物产生的种子和商业产品，其中种子或商业产品包含可检出量的本发明的核酸序列。在一些实施方案中，例如，可以通过获得转基因植物并从它们制备食物或饲料来生产这样的商业产品。包含本发明的一种或多种核酸序列的商业产品包括例如但不限于：植物的粗粉/粕、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，和包含含有本发明的一种或多种序列的重组植物或种子的任何粗粉/粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品。在一种或多种商品或商业产品中的检出本发明的一种或多种序列，实际上证明该商品或商业产品是由为了控制鞘翅目害虫的目的，设计为表达本发明的一种或多种iRNA分子的转基因植物生产的。
在一些实施方案中，包含本发明的核酸分子的转基因植物或种子也可在其基因组中包含至少一个其他的转基因事件，包括但不限于：自其转录靶向鞘翅目害虫中与由SEQID NO:1限定的基因座不同的基因座的iRNA分子的转基因事件，所述不同的基因座例如，选自下组的一个或多个基因座：Caf1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公开号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公开号2013/0091601)、和RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)；自其转录靶向与鞘翅目害虫不同的生物(例如，植物寄生性线虫)中的基因的iRNA分子的转基因事件；编码杀虫蛋白(例如，苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白)的基因，例如，Cry34Ab1(美国专利6,127,180、6,340,593、和6,624,145)、Cry35Ab1(美国专利6,083,499、6,340,593、和6,548,291)、在单一事件中的“Cry34/35Ab1”组合(例如，玉米事件DAS-59122-7；美国专利No.7,323,556)、Cry3A(例如，美国专利No.7,230,167)、Cry3B(例如，美国专利No.8,101,826)、Cry6A(例如，美国专利No.6,831,062)、及其组合(例如，美国专利申请2013/0167268、2013/0167269、和2013/0180016)；耐除草剂基因(例如，提供草甘膦、草丁膦、麦草畏或2,4--D耐受性的基因(例如，美国专利No.7,838,733))；以及促成转基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如产量增加、脂肪酸代谢改变、或细胞质雄性不育的恢复。在特定的实施方案中，可以在植物中将编码本发明iRNA分子的序列与其他昆虫控制或抗病性性状组合以实现增强的昆虫损害和植物疾病控制的期望性状。例如，由于对所述性状的抗性的概率在田间将发生降低，组合采用独特作用模式的昆虫控制性状可以对受保护的转基因植物提供优越的持久性，该持久性优于含有单一控制性状的植物。
V.鞘翅目害虫中的靶基因阻抑
A.概述
在本发明的一些实施方案中，可以对鞘翅目害虫提供至少一种可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在鞘翅目害虫中导致RNAi介导的基因沉默。在特定的实施方案中，可以对鞘翅目害虫提供iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、和hpRNA)。在一些实施方案中，可以通过使核酸分子与鞘翅目害虫接触对鞘翅目害虫提供可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以在鞘翅目害虫的进食基质，例如营养组合物中提供可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以通过摄取被鞘翅目害虫摄取的包含核酸分子的植物材料来提供可用于控制鞘翅目害虫的核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子通过表达导入植物材料中的重组核酸序列而存在于植物材料中，所述导入例如通过用包含重组核酸序列的载体转化植物细胞，并从转化的植物细胞再生植物材料或全植物来进行。
B.RNA介导的靶基因阻抑
在实施方案中，本发明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)，可以设计此类分子使之靶向鞘翅目害虫(例如，WCR、SCR、或NCR)的转录组中的必需天然核苷酸序列(例如，必需基因)，例如设计有至少一条链包含与靶序列特异性互补的核苷酸序列的iRNA分子。如此设计的iRNA分子的序列可以与靶序列相同，或者可以含有不会阻止iRNA分子与其靶序列之间的特异性杂交的错配。
本发明的iRNA分子可以在用于鞘翅目害虫中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害虫对植物(例如，包含iRNA分子的受保护的转化植物)引起的损害水平或发生率。如本文中使用的，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因转录成mRNA及随后mRNA翻译而产生的蛋白质水平，包括降低基因或编码序列的蛋白质表达，包括任何公知的转录后抑制表达和转录阻抑表达的方法。通过从靶向阻抑的基因转录的mRNA的全部或部分与用于阻抑的相应iRNA分子之间的特异性同源性而介导转录后抑制。另外，转录后抑制是指通过核糖体结合的细胞中可用的mRNA量的实质性和可测量降低。
在其中RNAi分子是dsRNA分子的实施方案中，酶切丁酶可以将dsRNA分子切割成短siRNA分子(大约20个核苷酸长度)。借助于切丁酶对dsRNA分子的活性而生成的双链siRNA分子可以分成两个单链siRNA：“乘客链”和“引导链”。乘客链可以被降解，而引导链可以掺入RISC中。通过引导链与mRNA分子的特异性互补序列的特异性杂交，随后通过酶Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割而发生转录后抑制。
在本发明的实施方案中，可以使用任何形式的iRNA分子。本领域技术人员会理解的是，在制备过程中及在对细胞提供iRNA分子的步骤过程中，dsRNA分子一般比单链RNA分子更稳定，并且一般在细胞中也是更稳定的。因此，例如，虽然在一些实施方案中siRNA和miRNA分子可能是同等有效的，但是dsRNA分子可以由于其稳定性而被选用。
在特定的实施方案中，提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列可以在体外表达以产生iRNA分子，所述iRNA分子与由鞘翅目害虫基因组内的核苷酸序列编码的核酸分子基本上同源。在某些实施方案中，体外转录的iRNA分子可以是包含茎环结构的稳定化的dsRNA分子。在鞘翅目害虫接触体外转录的iRNA分子后，可以发生对鞘翅目害虫中靶基因(例如，必需基因)的转录后抑制。
在本发明的一些实施方案中，在用于对鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制的方法中可利用至少一种包含核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段(例如，SEQ ID NO:2-4中任一者)；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ IDNO:1的叶甲属生物的天然编码序列的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
在一些实施方案中，用于在鞘翅目害虫中转录后抑制靶基因的方法可以利用至少一种包含核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸分子选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如WCR)的天然编码序列的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的互补序列；包含SEQID NO:1的叶甲属生物(例如，WCR)的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；包含SEQID NO:1的叶甲属生物的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段；和转录成包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物的天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列。在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少80％相同(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于至少一个鞘翅目害虫细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。在具体的实例中，这样的核酸分子可以包含含有SEQ ID NO:1-4中任一者的核苷酸序列及其互补序列。
在实施方案中，RNAi转录后抑制系统能够容忍靶基因中预期由于遗传突变、株系多态性、或进化趋异而可能发生的序列变异。相应地，导入的核酸分子与靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA可以不到绝对同源，只要导入的核酸分子与靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA可特异性杂交即可。而且，相对于靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA，导入的核酸分子可以是小于全长的。
使用本发明的iRNA技术抑制靶基因是序列特异性的；即，靶向与iRNA分子基本上同源的核苷酸序列进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用包含与靶基因序列的一部分相同的核苷酸序列的RNA分子进行抑制。在这些和另外的实施方案中，可以使用包含相对于靶基因序列具有一个或多个插入、缺失和/或点突变的核苷酸序列的RNA分子。在特定的实施方案中，iRNA分子和靶基因的一部分可以共享例如至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％、和100％的序列同一性。或者，dsRNA分子的双链体区可以与靶基因转录物的一部分可特异性地杂交。在可特异性杂交的分子中，展现出较大同源性的小于全长的序列可补偿较长的、同源性较低的序列。dsRNA分子的双链体区中与靶基因转录物的一部分相同的核苷酸序列的长度可以是至少约20(例如19)、至少约25、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500个、和/或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于约20个到约100个核苷酸的序列。在特定的实施方案中，可以使用大于约200个到300个核苷酸的序列。在特定的实施方案中，根据靶基因的大小，可以使用大于约500个到1000个核苷酸的序列。
在某些实施方案中，可以将鞘翅目害虫中靶基因的表达在鞘翅目害虫细胞内抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得发生显著抑制。显著抑制是指高于阈值的抑制，所述抑制导致可检出的表型(例如，生长停止、进食停止、发育停止、和诱导性死亡，等等)，或与所抑制的靶基因对应的RNA和/或基因产物的可检出降低。虽然在本发明的某些实施方案中，在鞘翅目害虫的基本上所有细胞中均发生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶基因的细胞子集中发生抑制。
在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由展现出与启动子DNA序列或其互补序列的实质性序列同一性的dsRNA分子的存在所介导，从而产生所谓的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可以摄取或接触此类dsRNA分子的鞘翅目害虫中针对靶基因发挥效果，例如通过害虫摄取或接触含有dsRNA分子的植物材料。在启动子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特异性地设计为抑制或阻抑鞘翅目害虫细胞中一种或多种同源或互补序列的表达。美国专利5,107,065、5,231,020、5,283,184、和5,759,829中公开了通过反义或有义取向的RNA进行转录后基因阻抑以调节植物细胞中的基因表达。
C.对鞘翅目害虫提供的iRNA分子的表达
可以许多体外或体内形式的任一种进行表达用于在鞘翅目害虫中RNAi介导的基因抑制的iRNA分子。然后，可以对鞘翅目害虫提供iRNA分子，例如通过使iRNA分子与害虫接触，或通过引起害虫摄取或以别的方式内在化iRNA分子。本发明的一些实施方案包括鞘翅目害虫的经转化的宿主植物、经转化的植物细胞、和经转化的植物的后代。经转化的植物细胞和经转化的植物可以工程化改造为例如在异源启动子控制下表达一种或多种iRNA分子，以提供害虫保护效果。因此，当在鞘翅目害虫在进食期间食用转基因植物或植物细胞时，害虫可以摄取转基因植物或细胞中表达的iRNA分子。也可以将本发明的核苷酸序列导入广泛而多样的原核和真核微生物宿主中以产生iRNA分子。术语“微生物”包括原核和真核物种，如细菌和真菌。
基因表达的调控可以包括对此类表达的部分或完全阻抑。在另一个实施方案中，用于阻抑鞘翅目害虫中基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提供基因阻抑量的至少一种如本文中所描述的核苷酸序列在转录后形成的dsRNA分子，其至少一个区段与鞘翅目害虫细胞内的mRNA序列互补。根据本发明的鞘翅目和或半翅目害虫所摄取的dsRNA分子，包括其修饰的形式，如siRNA、miRNA、或hpRNA分子，可以与从包含选自下列核苷酸序列的核酸分子转录的RNA分子至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或100％相同，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:1。因此，提供了用于制备本发明的dsRNA分子的分离的且基本上纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重组DNA构建体，其在导入鞘翅目害虫时阻抑或抑制其中的内源编码序列或靶编码序列的表达。
特定的实施方案提供了用于递送iRNA分子以转录后抑制鞘翅目植物害虫中的一种或多种靶基因并控制鞘翅目植物害虫群体的递送系统。在一些实施方案中，所述递送系统涉及包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转录的RNA分子的宿主细胞内容物的摄取。在这些和另外的实施方案中，创建转基因植物细胞或转基因植物，其含有可提供本发明的稳定化dsRNA分子的重组DNA构建体。包含编码特定iRNA分子的核酸序列的转基因植物细胞和转基因植物可以如下产生：采用重组DNA技术(这些基础技术是本领域中熟知的)构建包含编码本发明的iRNA分子(例如，稳定化的dsRNA分子)的核苷酸序列的植物转化载体；以此转化植物细胞或植物；并以此生成含有转录的iRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。
为了对转基因植物赋予鞘翅目害虫抗性，可以例如将重组DNA分子转录成iRNA分子，如dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、或hpRNA分子。在一些实施方案中，从重组DNA分子转录的RNA分子可以在重组植物的组织或流体内形成dsRNA分子。这样的dsRNA分子可以包含在核苷酸序列的一部分中，所述核苷酸序列与可侵染宿主植物的类型的鞘翅目害虫内的DNA序列转录的相应核苷酸序列相同。鞘翅目害虫内靶基因的表达被所述摄入的dsRNA分子所阻抑，并且鞘翅目害虫中靶基因表达的阻抑导致，例如，鞘翅目害虫的进食停止，最终结果是例如，转基因植物被保护免于受到该鞘翅目害虫的进一步损害。已经显示dsRNA分子的调控作用可适用于害虫中表达的多种基因，包括例如负责细胞代谢或细胞转化的内源基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；和编码涉及细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
为了从体内转基因或表达构建体转录，可以在一些实施方案中使用调节区(例如，启动子、增强子、沉默子、和多聚腺苷酸化信号)以转录一条或多条RNA链。因此，在一些实施方案中，如上文提出的，在产生iRNA分子中使用的核苷酸序列可以与在植物宿主细胞中有功能的一种或多种启动子序列可操作连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源启动子。在可操作连接的启动子序列控制下的本发明的核苷酸序列可以进一步被其他有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的序列所侧翼。这样的序列可以位于可操作连接启动子的上游、表达构建体3'端的下游、并且可以同时存在于启动子的上游和表达构建体3'端的下游。
一些实施方案提供了用于降低由以植物为食的鞘翅目害虫引起的对宿主植物(例如，玉米植物)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表达本发明的至少一种核酸分子的转化植物细胞，其中所述核酸分子在被鞘翅目害虫摄取后发挥功能以抑制鞘翅目害虫内靶序列的表达，该表达抑制导致鞘翅目害虫的死亡、生长降低、和/或生殖降低，由此降低由鞘翅目害虫引起的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
在一些实施方案中，提供了用于提高玉米作物产量的方法，其中所述方法包括将本发明的至少一种核酸分子导入玉米植物中；栽培玉米植物以容许表达包含核酸序列的iRNA分子，其中包含所述核酸序列的iRNA分子的表达可抑制鞘翅目害虫生长和/或鞘翅目害虫损害，由此降低或消除由于鞘翅目害虫侵染所致的产量损失。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
在一些实施方案中，提供了用于调控鞘翅目害虫中靶基因表达的方法，所述方法包括：用包含编码本发明的至少一种核酸分子的核酸序列的载体转化植物细胞，其中所述核苷酸序列与启动子和转录终止序列可操作连接；在足以容许形成包含多个转化植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；选择已经将核酸分子整合到其基因组中的转化植物细胞；对转化植物细胞筛选由整合的核酸分子编码的iRNA分子的表达；选择表达iRNA分子的转基因植物细胞；并且用选择的转基因植物细胞喂养鞘翅目害虫。也可以从表达由整合的核酸分子编码的iRNA分子的转化植物细胞再生植物。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和另外的实施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
可以将本发明的iRNA分子作为来自掺入植物细胞基因组中的重组基因的表达产物、或者掺入应用于种植前种子的包衣或种子处理中而掺入植物物种(例如，玉米)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。本发明的实施方案中还包括用于将iRNA分子投送给鞘翅目害虫的递送系统。例如，可以将本发明的iRNA分子直接导入鞘翅目害虫细胞中。用于导入的方法可以包括将iRNA与来自鞘翅目害虫宿主的植物组织直接混合，以及对宿主植物组织应用包含本发明的iRNA分子的组合物。例如，可将iRNA分子喷雾到植物表面上。或者，可以通过微生物表达iRNA分子，并且可以将微生物应用到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入根或茎中。如上文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以足以杀死已知侵染植物的鞘翅目害虫的量表达至少一种iRNA分子。通过化学或酶促合成产生的iRNA分子也可以以符合常见农业实践的方式配制，并且作为喷雾产品使用以控制鞘翅目害虫所致的植物损害。配制剂可以包含有效的叶覆盖需要的适当粘着剂(sticker)和湿润剂，以及保护iRNA分子(例如，dsRNA分子)免于UV损伤的UV保护剂。这样的添加剂通常在生物杀虫剂产业中使用，并且是本领域技术人员熟知的。这样的应用可以与其他喷雾杀虫剂应用(基于生物学的或其他的)组合以增强针对鞘翅目害虫的植物保护。
本文中所讨论的所有参考文献，包括本文引用的出版物，专利和专利申请，均通过引用并入本文，只要与本公开的明确细节不冲突，如同单独地和具体地明示将每篇参考文献通过引用并入本文一样。本文所讨论的参考文献仅为其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中任何内容不应被解释为承认发明人无权凭借在先发明而先于这些公开。
提供以下实施例以展示某些具体特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限于本文中描述的具体特征或方面。
实施例
实施例1：样品制备和昆虫食料生物测定
合成了若干dsRNA分子(包括对应于dre4reg1(SEQ ID NO:2)，dre4reg2(SEQ IDNO:3)，和dre4reg3(SEQ ID NO:4)者)，并使用 RNAi试剂盒或T7体外转录试剂盒纯化。将纯化的dsRNA分子准备在100X稀释的TE缓冲液pH7.4中，并且所有生物测定均包含由该缓冲液组成的对照处理，用作WCR(玉米根萤叶甲)的死亡率或生长抑制的背景检查。使用NANODROPTM 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)测量生物测定缓冲液中dsRNA分子的浓度。
在使用饲喂人工昆虫食料的新生昆虫幼虫的生物测定中测试样品的昆虫活性。WCR卵获自CROP CHARACTERISTICS，INC(Farmington，MN)。
生物测定在特别为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘(C-D INTERNATIONAL，Pitman，NJ)中进行。每个孔含有约1.0mL设计用于鞘翅目昆虫生长的人工食料。通过移液管将60μL等份的dsRNA样品递送到每个孔的食料的表面(40μL/cm2)。dsRNA样品浓度作为孔中每平方厘米(ng/cm2)表面积(1.5cm2)的dsRNA量来计算。将处理的托盘保持在通风橱中，直到食料表面上的液体蒸发或吸收到食料中。
在破壳后的几个小时内，用湿润的骆驼毛刷拾取幼虫个体，并且将其放置在处理的食料(每孔一个或两个幼虫)上。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盘上带虫的孔，并通气以允许气体交换。将生物测定盘在受控环境条件(28℃，～40％相对湿度，16:8(光照:黑暗))下保持9天，而后记录暴露于每个样品的昆虫总数、死亡的昆虫数、和存活昆虫的重量。计算每个处理的平均百分比死亡率和平均生长抑制。生长抑制(GI)计算如下:
GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，
其中TWIT是处理中活昆虫的总重量；
TNIT是处理中的昆虫总数；
TWIBC是背景检查中的活昆虫的总重量(缓冲液对照)；和
TNIBC是背景检查中的昆虫总数(缓冲液对照)。
使用JMPTM软件(SAS，Cary，NC)进行统计学分析。
LC50(致死浓度)定义为50％的测试昆虫被杀死时的剂量。GI50(生长抑制)定义为试验昆虫的平均生长(例如活体重)为在背景检查样品中观察到的平均值的50％时的剂量。
重复的生物测定证明，特定样品被摄取后导致了玉米根虫幼虫的令人惊讶且意想不到的死亡率和生长抑制。
实施例2：候选靶基因的鉴定
选择多个WCR(玉米根萤叶甲)发育期进行汇集的转录组分析，以提供通过RNAi转基因植物抗虫技术控制的候选靶基因序列。
在一个范例中，从约0.9gm的完整第一龄WCR幼虫(孵化后4到5天；保持在16℃)分离总RNA，并使用下述基于苯酚/TRI 的方法(MOLECULAR RESEARCH CENTER,Cincinnati,OH)进行纯化：
将幼虫于室温在具有10mL TRI 的15mL匀浆器中均质化，直到获得均匀的悬浮液时为止。在室温温育5分钟后，将匀浆分配到1.5mL微量离心管中(每管1mL)，添加200μL氯仿，并将混合物强力振摇15秒。让提取物在室温静置10分钟之后，通过在4℃以12,000x g离心分离各个相。将上层相(占约0.6mL)小心转移到另一个无菌的1.5mL管中，并添加等体积的室温异丙醇。在室温温育5到10分钟之后，将混合物在12,000x g(4℃或25℃)离心8分钟。
将上清液小心取出并弃去，并将RNA离心沉淀通过用75％乙醇涡旋振荡洗涤两次，在每次洗涤后通过在7,500x g(4℃或25℃)离心5分钟回收。小心去除乙醇，让离心沉淀风干3至5分钟，然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过在260nm和280nm测量吸光度(A)测定RNA浓度。一次从约0.9gm幼虫的典型提取产生超过1mg的总RNA，其中A260/A280比为1.9。如此提取的RNA在80℃贮存，直到进一步加工。
通过使等份跑1％琼脂糖凝胶确定RNA质量。使用经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水稀释的无菌的10x TAE缓冲液(Tris乙酸盐EDTA；1x浓度为0.04M Tris乙酸盐，1mM EDTA(乙二胺四乙酸钠盐，pH 8.0)制成琼脂糖凝胶溶液。使用1x TAE作为运行缓冲液。在使用前，用(INVITROGEN INC.,Carlsbad,CA)清洁电泳槽和造孔梳。将2μL RNA样品与8μL TE缓冲液(10mM Tris HCl pH 7.0；1mM EDTA)和10μL RNA样品缓冲液(目录号70606；EMD4Bioscience,Gibbstown,NJ)混合。将样品于70℃加热3分钟，冷却至室温，每孔上样5μL(含有1μg到2μg RNA)。将市售的RNA分子量标记物在分离的孔中同时运行以进行分子大小比较。在60伏特下跑胶2小时。
由服务提供商(EUROFINS MWG Operon,Huntsville,AL)利用随机引发从幼虫总RNA制备标准化的cDNA文库。在EUROFINS MWG Operon通过GS FLX 454TitaniumTM系列化学以1/2板的规模对标准化的幼虫cDNA文库进行测序，其产生具有平均读段长度348bp的超过600,000个读段。将350,000个读段装配成超过50,000个重叠群。使用公众可访问的程序F0RMATDB(可在NCBI访问)将未装配的读段和重叠群两者都转换成可BLAST的数据库。
类似地从其他WCR发育期收获的材料制备了总RNA和标准化的cDNA文库。合并代表各个发育期的cDNA文库成员，构建了用于靶基因筛选的汇集的转录组文库。
使用关于特定基因在其他昆虫(诸如果蝇和拟谷盗属)中的致死RNAi效应的信息，选择用于RNAi靶向的候选基因。假设这些基因对于鞘翅目昆虫的存活和生长是必需的。对于选定的靶基因，在转录物组序列数据库中鉴定其同源物，如下文所述。通过PCR扩增靶基因的全长或部分序列来制备用于产生双链RNA(dsRNA)的模板。
使用候选蛋白质编码序列针对含有未装配的叶甲属序列读段或已装配的重叠群的可BLAST数据库进行TBLASTN搜索。对于与叶甲属序列的显著命中(定义为：对于重叠群同源性，好于e-20；对于未装配的序列读段同源性，好于e-10)，使用BLASTX针对NCBI非冗余数据库加以确认。此BLASTX搜索的结果确认，在TBLASTN搜索中鉴定的叶甲属同源物候选基因序列确实包含叶甲属基因，或者是针对叶甲属序列中存在的非叶甲属候选基因序列的最佳命中。在大多数情况下，被注释为编码蛋白质的拟谷盗属候选基因呈现出明确的与叶甲属转录物组序列中的一种或多种序列的序列同源性。在少数情况下可明显看出，某些基于与非叶甲属候选基因的同源性选择的叶甲属重叠群或未装配的序列读段有重叠，而且重叠群的装配未能连接起这些重叠。在这些情况下，使用SEQUENCHERTM v4.9(GENE CODESCORPORATION,Ann Arbor,MI)将序列装配成更长的重叠群。
一个编码叶甲属DRE4的候选靶基因(dre4；SEQ ID NO:1)被鉴定为可以导致鞘翅目害虫死亡、WCR中生长抑制、或发育抑制的基因。
在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，DRE4是核小体重组织中涉及的易化染色质转录(Facilitates Chromatin Transcription(FACT))复合物的一个组分。FACT参与许多需要DNA作为模板的过程，如mRNA延伸、DNA复制、和DNA修复。在转录延伸的过程中，FACT复合物充当组蛋白伴侣(chaperone)，它既使核小体结构去稳定，又恢复核小体结构，同时易化RNA聚合酶II的通过。叶甲属dre4序列(SEQ ID NO:1)与来自西方蜜蜂(Apismellifera)(GENBANK登录号XM_624003.3)的dre4基因的片段有些亲缘关系。dre4dsRNA转基因可与其他dsRNA分子组合以提供冗余的RNAi靶向和协同的RNAi效应。表达靶向dre4的dsRNA的转基因玉米事件用于防止玉米根虫引起的噬根性损害(root feeding damage)。dre4dsRNA转基因提供了新的作用模式，可以用来与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术在昆虫抗性管理基因叠加(Insect Resistance Management gene pyramid)中组合，以减缓根虫群体对这两种根虫控制技术中的任一者发展抗性。
利用上述的叶甲属候选基因，本文中称为dre4，的序列的全长(SEQ ID NO:1)或部分(SEQ ID NO:2-4)克隆来生成用于dsRNA合成的PCR扩增子。
实施例3：扩增靶基因产生dsRNA
设计引物通过PCR扩增每个靶基因的编码区部分。参见表1。在适当的情况下，将T7噬菌体启动子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQ ID NO:5)引入扩增的有义或反义链的5'端。参见表1。使用(Life Technologies，Grand Island，NY)从WCR提取总DNA，其中使用Pestle Motor Mixer(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)在室温下在1.5mL微量离心管中使WCR幼虫和成虫均质化，直到获得均匀的悬浮液。在室温下温育5分钟后，将匀浆离心以除去细胞碎片，并将1mL上清液转移到一支新管中。加入200μl氯仿，并将混合物剧烈摇动15秒。让提取物在室温下静置2-3分钟后，通过在4℃下以12,000在物离心来分离各相。将上层相(占约0.6mL)小心地转移到另一无菌1.5mL管中，并加入500μl室温异丙醇。在室温下温育10分钟后，将混合物在4℃以12,000合物离心10分钟。小心地取出上清液并弃去，将RNA离心沉淀通过与75％乙醇一起涡旋洗涤两次，每次洗涤后通过在7,500×g(4℃或25℃)离心5分钟来回收。小心地除去乙醇，使离心沉淀风干3至5分钟，然后溶解在无核酸酶的无菌水中。
然后利用总RNA，借助第一链合成系统和制造商提供的寡聚dT引发说明(Life Technologies,Grand Island,NY)制作第一链cDNA。使用该第一链cDNA作为模板和相对定位以扩增天然靶基因序列的全部或部分的引物进行PCR反应。还从包含黄色荧光蛋白(YFP)(SEQ ID NO:6；Shagin等人，(2004)Mol.Biol.Evol.21(5):841-50)编码区的DNA克隆扩增了dsRNA。
表1.用于扩增示例性dre4靶基因和YFP阴性对照基因的编码区部分的引物和引物对
实施例4：RNAi构建体
通过PCR制备模板和dsRNA合成.
图1A中显示了一种提供特异性模板用于产生dre4和YFP dsRNA的策略。使用表1中的引物对、以及从分离自WCR第一龄幼虫或成虫的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，制备了准备在dre4dsRNA合成中使用的模板DNA。对于每个选定的dre4和YFP靶基因区，PCR扩增在扩增的有义和反义链的5'端导入了一个T7启动子序列(YFP区段扩增自YFP编码区的DNA克隆)。然后将靶基因的每个区域的两个PCR扩增片段以大约相等的量混合，使用该混合物作为dsRNA产生用的转录模板。参见图1A。被特定引物对扩增的dsRNA模板序列是:SEQ IDNO:2(dre4reg1)、SEQ ID NO:3(dre4reg2)、SEQ ID NO:4(dre4reg3)、和YFP(SEQ ID NO:6)。合成用于昆虫生物测定的双链RNA，并使用 RNAi试剂盒遵循制造商的说明书(INVITROGEN)或者T7体外转录试剂盒遵循制造商的说明书(New England Biolabs,Ipswich,MA)进行纯化。使用NANODROPTM 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。
植物转化载体的构建
使用化学合成的片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)的组合以及标准分子克隆方法，组装了包含具有dre4(SEQ ID NO:1)的区段的用于发夹形成的靶基因构建体的入门载体(pDAB114540和pDAB114541)。通过(在单一转录单位内)安排两个拷贝的靶基因区段彼此相反取向来易化RNA初级转录物形成分子内发夹，其中两个区段相隔一个ST-LS1内含子序列(SEQ ID NO:16；Vancanneyt等人，(1990)Mol.Gen.Genet.220(2):245-50)。因此，初级mRNA转录物含有被内含子序列分开的两个dre4基因区段，其中两个区段互为大的反向重复序列。用玉米泛素1启动子的拷贝(美国专利No.5,510,474)来驱动初级mRNA发夹转录物的产生，并用包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区(ZmPer5 3'UTR v2；美国专利No.6,699,984)的片段来终止表达发夹RNA的基因的转录。
入门载体pDAB114540包含dre4发夹v1RNA构建体(SEQ ID NO:13)，其含有dre4(SEQ ID NO:1)的一个区段。
入门载体pDAB114541包含dre4发夹v2-RNA构建体(SEQ ID NO:14)，其含有不同于pDAB114540中所见的dre4(SEQ ID NO:1)区段。
使用上述入门载体pDAB114540和pDAB114541与典型的二元目标载体(pDAB115765)进行标准重组反应，产生了用于土壤杆菌介导的玉米胚转化的dre4发夹RNA表达转化载体(分别为pDAB114546和pDAB114547)。SEQ ID NO:13显示了pDAB114546中所见的dre4发夹v1-RNA形成序列，SEQ ID NO:14显示了pDAB114547中所见的dre4发夹v2-RNA形成序列。
通过典型的二元目标载体(pDAB109805)与入门载体pDAB101670的标准重组反应，构建了包含表达YFP发夹dsRNA的基因的阴性对照二元载体pDAB110853。入门载体pDAB101670包含处于玉米泛素1启动子(如上文)的表达控制之下的YFP发夹序列(SEQ ID NO:15)和包含来自玉米过氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻译区的片段。
二元目标载体pDAB115765包含处于甘蔗杆状DNA病毒(ScBV)启动子(Schenk等人，(1999)Plant Molec.Biol.39:1221-30)的调节之下的除草剂抗性基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；AAD-1v3)(美国专利7838733(B2)，和Wright等人，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。一个人工5'UTR序列定位在SCBV启动子区段的3'端与AAD-1编码区的起始密码子之间，该5'UTR序列由来自玉米线条病毒(MSV)外壳蛋白基因5'UTR和来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因的内含子6的序列组成。利用一个包含玉米脂肪酶基因的3'非翻译区(ZmLip 3'UTR；美国专利No.7,179,902)的片段来终止AAD-1mRNA的转录。
通过典型的二元目标载体(pDAB9989)与入门载体pDAB100287的标准重组反应，构建了另一个包含表达YFP蛋白的基因的阴性对照二元载体pDAB101556。二元目标载体pDAB9989包含处于玉米泛素1启动子(如上文)的表达调节之下的除草剂抗性基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；AAD-1v3)(如上文)和一个包含来自玉米脂肪酶基因的3'非翻译区(ZmLip 3'UTR；如上文)的片段。入门载体pDAB100287包含处于玉米泛素1启动子(如上文)的表达控制之下的YFP编码区(SEQ ID NO:17)和一个包含来自玉米过氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻译区的片段。
实施例5:候选靶基因的筛选
在基于食料的测定中，当将设计为抑制实施例2中鉴定的靶基因序列的合成dsRNA给予至WCR时，引起了死亡和生长抑制。在这个测定中观察到，dre4reg1、dre4reg2、和dre4reg3表现出的效力相比于其他筛选的dsRNA大幅增加。
重复的生物测定证明，对分别来源于dre4reg1、dre4reg2、和dre4reg3的dsRNA制备物的摄取导致西方玉米根虫幼虫的死亡和/或生长抑制。表2和表3显示了在WCR幼虫暴露于这些dsRNA 9天之后的基于食料的饲喂生物测定的结果，以及从黄色荧光蛋白(YFP)编码区(SEQ ID NO:6)制备的dsRNA的阴性对照样品获得的结果。
表2.利用西方玉米根虫幼虫进食9天之后获得的dre4dsRNA食料进食测定的结果。ANOVA分析发现在平均百分比死亡率和平均生长抑制(GI)上的显著差异。使用Tukey--Kramer检验分离平均值。
*SEM＝均值的标准误差。括弧中的字母指示统计水平。不连接相同字母的水平有显著差异(P<0.05)。
**TE＝Tris HCl(1mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH7.2.
***YFP＝黄色荧光蛋白
表3. dre4 dsRNA对WCR幼虫的口服效力(ng/cm2)的总结
基因名 LC50 范围 GI50 范围
dre4reg1 43.71 33.36-57.43 25.63 15.46-42.47
dre4reg2 64.77 49.55-85.30 27.97 14.63-53.46
dre4reg3 3.57 2.41-5.04 2.77 1.15-6.65
以前有人提出，某些叶甲属物种基因可以用于RNAi介导的昆虫控制。参见美国专利公开号2007/0124836，其公开了906个序列，以及美国专利7,612,194，其公开了9,112个序列。然而已经确定了，其中建议的许多对RNAi介导的昆虫控制基因对控制叶甲属是无效的。还确定了，与表明其他对于RNAi介导的昆虫控制有用的基因相比，序列dre4reg1、dre4reg2、和dre4reg3各自提供了令人惊奇和出乎意料的优越的叶甲属控制。
例如，美国专利7,612,194提出，膜联蛋白、β血影蛋白2和mtRP-L4都在RNAi介导的昆虫控制中有效。SEQ ID NO:18为膜联蛋白区1(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO:19为膜联蛋白区2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO:20为β血影蛋白2区1(Reg 1)的DNA序列，SEQ ID NO:21为β血影蛋白2区2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO:22为mtRP-L4区1(Reg 1)的DNA序列，并且SEQ ID NO:23为mtRP-L4区2(Reg 2)的DNA序列。还使用了YFP序列(SEQ ID NO:6)产生用作阴性对照的dsRNA。
分别利用上述序列通过实施例3中的方法来产生dsRNA。提供用于产生dsRNA的特异性模板的策略显示在图1B中。使用表4中的引物对和从分离自WCR第一龄幼虫的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，制备了准备了在dsRNA合成中使用的模板DNA。(YFP从DNA克隆扩增。)对于每个选择的靶基因区，进行两个单独的PCR扩增。第一个PCR扩增在扩增的有义链的5'端引入T7启动子序列。第二个反应在反义链的5'端引入T7启动子序列。然后将每个靶基因区的两个PCR扩增片段以大致相等的量混合，并将混合物用作dsRNA产生的转录模板。参见图1B。合成双链RNA，并使用RNAi试剂盒遵循制造商的说明书(INVITROGEN)进行纯化。使用NANODROPTM 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。并通过上述相同的基于食料的生物测定方法测试每一种dsRNA。表4列出了用来产生膜联蛋白Reg1、膜联蛋白Reg2、β血影蛋白2Reg1、β血影蛋白2Reg2、mtRP-L4Reg1、和mtRP-L4Reg2dsRNA分子的引物的序列。在图1B描绘的方法中使用的YFP引物序列也在表4中列出。表5呈现了WCR幼虫在暴露于这些dsRNA分子9天之后的基于食料的饲喂生物测定的结果。重复的生物测定证明，在以上西方玉米根虫幼虫中，摄取这些dsRNA没有导致超过TE缓冲液、水、或YFP蛋白等对照样品中所见的死亡或生长抑制。
表4.用来扩增基因的编码区的多个部分的引物和引物对。
表5.利用西方玉米根虫幼虫9天之后获得的食料进食测定的结果。
*TE＝Tris HCl(10mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH8。
**YFP＝黄色荧光蛋白
实施例6：包含杀虫dsRNA的转基因玉米组织
土壤杆菌介导的转化
在土壤杆菌介导的转化之后，制成了通过表达稳定地整合到植物基因组中的嵌合基因而产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种包含靶向包含dre4的基因，SEQ IDNO:1，的dsRNA分子的dsRNA分子)的转基因玉米细胞、组织、和植物。采用超二元或二元转化载体的玉米转化方法是本领域中已知的，正如例如美国专利8,304,604中(在此通过提述并入其全部内容)所描述。通过转化的组织在含吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力选择转化的组织，并视情况适宜对它们筛选dsRNA产生。可以将一部分这样的转化的组织培养物提供给新生玉米根虫幼虫以进行生物测定，基本上如实施例1中所描述。
土壤杆菌培养启动
将包含上述(实施例4)二元转化载体pDAB114515、pDAB115770、pDAB110853或pDAB110556的土壤杆菌菌株DAt13192细胞(WO 2012/016222A2)的甘油储划线接种在含有适当抗生素的AB基本培养基平板(Watson等人，(1975)J.Bacteriol.123:255-64)上，并在20℃培养3天。然后将培养物划线接种在含有相同抗生素的YEP平板(gm/L:酵母提取物10；蛋白胨10；NaCl 5)上，并在20℃温育1天。
土壤杆菌培养
在实验当天，以适合于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的储液，并将其移液到无菌的一次性250mL烧瓶中。接种培养基(Frame等人，(2011)GeneticTransformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.收录于Plant Embryo Culture Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe andE.C.Yeung,(Eds),Springer Science and Business Media,LLC.pp 327-341)含有:2.2gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素(Frame等人，ibid.)；68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH为5.4)。将乙酰丁香酮以200μM的终浓度(从100％二甲亚砜中的1M储液)添加到含有接种培养基的烧瓶中，并充分混合溶液。
对于每种构建体，来自YEP平板的1或2个满接种环的土壤杆菌悬浮在一次性50mL无菌离心管内15mL的接种培养基/乙酰丁香酮储液中，在分光光度计中在550nm(OD550)处测量溶液的光密度。然后使用另外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬液稀释到0.3到0.4的OD550。然后将土壤杆菌悬液的管水平放置在设置为在室温下约75rpm的平台摇床上，并在进行胚切开的同时振摇1到4小时。
穗消毒和胚分离
未成熟玉米胚从玉米近交系B104(Hallauer等人，(1997)Crop Science 37:1405-6)植物获得，所述植物在温室中培养，并进行自花授粉或近亲授粉以产生穗。在授粉后大约10到12天收获穗。在实验当天，将穗脱壳，并通过浸没在20％市售漂白剂(ULTRAGermicidal Bleach，6.15％次氯酸钠；加两滴吐温TM 20)的溶液中并振摇20到30分钟进行表面消毒，随后在层流罩内在无菌去离子水中冲洗三次。从每个穗无菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm长)并随机分配到微量离心管中，每根微量离心管含有2.0mL的液体接种培养基中的适当土壤杆菌细胞的悬液，其中含200μM乙酰丁香酮，并添加了2μL的10％BREAK-S233表面活性剂(EVONIK INDUSTRIES；Essen,Germany)。对于一套给定的实验，每次转化均使用来自汇集的穗的胚。
土壤杆菌共培养
在分离之后，将胚在摇动平台上放置5分钟。然后将管的内容物倾倒到共培养基的平板上，所述培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/LL--脯氨酸；在KOH中的3.3mg/L的麦草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌醇(myo-inositol)；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；200μM溶于DMSO中的乙酰丁香酮；和3gm/L GELZANTM，pH为5.8。用无菌一次性移液管移除液态土壤杆菌悬液。然后借助于显微镜，使用无菌镊子使胚定向为盾片面向朝上。盖上平板，用3MTMMICROPORETM医用胶带密封，并放置在具有大约60μmol m-2s-1的光合有效辐射(PAR)的连续光照的25℃培养箱中。
愈伤组织选择和转基因事件的再生
在共培养期之后，将胚转移到静息培养基上，静息培养基的组成为:4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；溶于KOH中的3.3mg/L的麦草畏；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；0.5g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa,KS)；250mg/L羧苄青霉素；和2.3gm/LGELZANTM；pH为5.8。将不超过36个胚移到每个平板上。将平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7到10天。然后将愈伤的胚转移(<18个/板)到选择培养基I上，所述培养基由具有100nM吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)(0.0362mg/L；用于选择包含AAD-1基因的愈伤组织)的静息培养基(上文)构成。将平板返回到透明盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将愈伤的胚转移(<12个/板)到选择培养基II上，所述培养基由具有500nM吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)(0.181mg/L)的静息培养基组成。将平板返回到透明盒中，在27℃下在大约50μmol m-2s- 1PAR的连续光照下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
将增殖中的胚性愈伤组织转移到(<9个/板)预再生培养基上。预再生培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；45gm/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L MES；溶于NaOH中的0.5mg/L萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/L脱落酸；1mg/L 6-苄氨基嘌呤；250mg/L羧苄青霉素；2.5gm/L GELZANTM；和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸；pH为5.8。将平板保存在透明盒中，在27℃下在大约50μmol m- 2s-1PAR的连续光照下温育7天。然后将再生中的愈伤组织转移到(<6个/板)PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)中的再生培养基上，在28℃以每天16小时光照/8小时黑暗(以大约160μmol m-2s-1PAR)温育14天，直到发出芽和根为止。再生培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；60gm/L蔗糖；100mg/L肌醇；125mg/L羧苄青霉素；3gm/L GELLANTM胶；和0.181mg/L吡氟氯禾灵酸(R-Haloxyfop acid)；pH为5.8。然后分离具有主根的小芽，并不经选择直接转移到伸长培养基上。伸长培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30gm/L蔗糖；和3.5gm/L GELRITETM:pH为5.8。
通过它们在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力而选择出转化植物芽，将所述芽从PHYTATRAYSTM移栽到填充有生长培养基(PROMIX BX；PREMIER TECH HORTICULTURE)的小盆中，小盆用杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆盖，然后在CONVIRON生长室中炼苗(27℃昼/24℃夜，16小时光周期，50-70％RH，200μmol m-2s-1PAR)。在一些情况下，分析推定的转基因小植物的转基因相对拷贝数，这使用设计用于检测整合到玉米基因组中的AAD1除草剂耐受基因的引物通过定量实时PCR测定来完成。此外，利用RNA qPCR测定来检测在推定的转化体表达的dsRNA中ST-LS1内含子序列的存在。然后将选定的转化小植物移动到温室中，以便进一步生长和测试。
转移T 0 植物和在温室中定植以进行生物测定和产生种子
当植物达到V3-V4期时，将其移栽到IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物中，在温室中(光曝露类型:光或同化作用；高光限值:1200PAR；16-小时昼长；27℃昼/24℃夜)培植至开花。
将要用于昆虫生物测定的植物从小盆移栽到TINUSTM 350-4(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES,Acheson,Alberta,Canada)(每每事件一个植物)。在移栽到约四天后，侵染植物以进行生物测定。
通过对T0转基因植物的穗丝授粉，其中花粉从非转基因良种近交系B104或其他适当的花粉供体采集而来，并种植所得的种子而获得T1代植物。在可能时进行互交。
实施例7:转基因玉米组织的分子分析
对在评估噬根损害的同日从温室培植的植物采集的叶和根的样品进行了玉米组织的分子分析(例如，RNA qPCR)。
用对StPIN-II 3'UTR的RNA qPCR测定结果来验证发夹转基因的表达。用针对表达的RNA中ST-LS1内含子序列(为形成dsRNA发夹分子所必需)的RNA qPCR测定结果来验证发夹转录物的存在。测量了相对于内源玉米基因的RNA水平的转基因RNA表达水平。
通过DNA qPCR分析检测基因组DNA中AAD1编码区的一部分，用来估计转基因插入拷贝数。从培植在环境室中的植物采集样品用于这些分析。将结果与旨在检测单拷贝天然基因的一部分的测定法的DNA qPCR结果进行比较，并将简单事件(具有一个或两个转基因拷贝)推进到温室中的进一步研究。
另外，用旨在检测大观霉素抗性基因(SpecR；包含在T-DNA外部的二元载体质粒上)的一部分的qPCR测定法来确定转基因植物是否含有无关的整合的质粒骨架序列。
发夹RNA转录物表达水平:Per 5 3'UTR qPCR
通过Per 5 3'UTR序列的实时定量PCR(qPCR)来分析愈伤组织细胞事件或转基因植物，以确定全长发夹转录物的相对表达水平，与内部玉米基因(SEQ ID NO:52；GENBANK登录号BT069734)的转录物水平比较，所述内部玉米基因编码TIP41-样蛋白(即，GENBANK登录号AT4G34270的玉米同源物；具有74％同一性的tBLASTX得分)。使用RNAEASYTM96试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)分离RNA。洗脱后，根据试剂盒建议的方案进行总RNA的DNAse1处理。然后在NANODROPTM8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC)上将RNA定量，并将浓度归一化为25ng/μL。大体上按照制造商推荐的方案，使用高容量cDNA合成试剂盒(INVITROGEN)制备第一链cDNA，反应体积10μL，含有5μL变性RNA。略微改变该方案以包括将10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)(SEQ ID NO:53；TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V是A、C、或G，N是A、C、G、或T/U)添加到随机引物储备预混物的1mL管中，以制备随机引物和寡dT混合的工作储备液。
在cDNA合成后，以无核酸酶的水将样品以1:3稀释，并储存在-20℃直到用于测定时为止。
在LIGHTCYCLERTM 480(ROCHE DIAGNOSTICS,Indianapolis,IN)上以10μL的反应体积分别进行StPIN-II和TIP41样转录物的实时PCR测定。对于PIN II测定，利用引物StPinIIF2TAG(SEQ ID NO:54)和StPinIIR2TAG(SEQ ID NO:55)、以及StPinIIFAM2TAG(SEQID NO:74)进行反应。对于TIP41-样参考基因测定，使用引物TIPmxF(SEQ ID NO:56)和TIPmxR(SEQ ID NO:57)、以及标记有HEX(六氯荧光素)的探针HXTIP(SEQ ID NO:58)。
所有测定都包括没有模板的阴性对照(仅有预混物)。为制备标准曲线，在源板中还包括空白(源孔中加水)，以检查样品交叉污染。在表6中列出了引物和探针序列。用于检测各种转录物的反应成分配方在表7中公开，PCR反应条件概述于表8中。在465nm处激发FAM(6-羧基荧光素亚磷酰胺)荧光部分，并测量在510nm处的荧光；HEX(六氯荧光素)荧光部分的对应值为533nm和580nm。
表6.用于转基因玉米中转录物水平的分子分析的多核苷酸序列。
*TIP41-样蛋白。
**NAv序列无法从供应商获得
表7.用于转录物检测的PCR反应配方。
表8.用于RNA qPCR的热循环仪条件。
使用LIGHTCYCLERTM软件v1.5，根据供应商的推荐利用二阶导数最大算法计算Cq值，通过相对定量分析数据。对于表达分析，使用ΔΔCt方法(即，2-(Cq TARGET–Cq REF))计算表达值，所述方法依赖于比较两个靶之间的Cq值的差异，其中假定对于优化的PCR反应条件，每个循环产物都加倍，基值选择为2。
发夹转录物大小和完整性:Northern印迹测定
利用Northern印迹(RNA印迹)分析来确定在表达dre4发夹dsRNA的转基因植物中dre4发夹RNA的分子大小，从而获得转基因植物的另外的分子表征。
所有的材料和设备在使用之前用RNAZAPTM(AMBION/INVITROGEN)处理。将组织样品(100mg到500mg)采集到2mL SAFELOCK EPPENDORF管中，用配备三个钨珠的KLECKOTM组织粉碎器(GARCIA MANUFACTURING,Visalia,CA)在1mLTRIZOL(INVITROGEN)中破碎5分钟，然后在室温(RT)下温育10分钟。任选地，将样品在4℃在11,000rpm下离心10分钟，并将上清液转移到新鲜的2mL SAFELOCK EPPENDORF管中。在将200μL的氯仿添加到匀浆中之后，通过翻转该管2到5分钟进行混合，在室温下温育10分钟，并在4℃在12,000x g下离心15分钟。将上层相转移到无菌的1.5mL EPPENDORF管中，添加600μL的100％异丙醇，在室温温育10分钟到2小时之后，然后在4°到25℃在12,000x g下离心10分钟。弃去上清液，用1mL的70％乙醇将RNA离心沉淀物洗涤两次，在两次洗涤之间，在4°到25℃在7,500x g下离心10分钟。弃去乙醇，将离心沉淀物快速风干3到5分钟，然后重悬在50μL无核酸酶的水中。
使用8000(THERMO-FISHER)对总RNA定量，并将样品归一化为5μg/10μL。然后向每个样品中加入10μL的乙二醛(AMBION/INVITROGEN)。将5到14ng的DIG RNA标准标志物预混物(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,IN)分配并添加到等体积的乙二醛中。在50℃使样品和标志物RNA变性45分钟，并保存在冰上，直到上样到在NORTHERNMAXTM10X乙二醛运行缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25％SEAKEM GOLDTM琼脂糖(LONZA,Allendale,NJ)凝胶上为止，通过在65伏特/30mA下电泳2小时15分钟分离RNA。
电泳之后，在2X SSC冲洗凝胶5分钟，在凝胶DOC工作站(BIORAD,Hercules,CA)上成像，然后在RT过夜使RNA被动转移到尼龙膜(MILLIPORE)上，其中使用10X SSC作为转移缓冲液(由3M氯化钠和300mM柠檬酸三钠组成的20X SSC，pH 7.0)。转膜后，在2X SSC中冲洗膜5分钟，通过UV使RNA与该膜交联(AGILENT/STRATAGENE)，并使该膜在RT下干燥2天。
使膜在ULTRAHYBTM缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中预杂交1到2小时。探针由含有感兴趣序列(例如，SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的反义序列部分，视情况适宜)的PCR扩增产物组成，其通过ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序用地高辛配基标记。在杂交管中推荐的缓冲液中60℃的温度下杂交过夜。杂交后，对印迹进行DIG洗涤，包装，暴露于胶片1到30分钟，然后将胶片显影，所有这些都通过DIG试剂盒的供应商推荐的方法来进行。
转基因拷贝数确定
将大约等同于2个叶冲孔块的玉米叶片收集在96孔的收集平板(QIAGEN)中。用配备一个不锈钢珠的KLECKOTM组织粉碎器(GARCIAMANUFACTURING,Visalia,CA)在BIOSPRINT96TM AP1溶解缓冲液(与BIOSPRINT96TM PLANT KIT一起提供；QIAGEN)中进行组织破碎。组织浸软之后，使用BIOSPRINT96TM PLANT KIT和BIOSPRINT96TM提取机器人以高通量形式分离基因组DNA(gDNA)。在设立qPCR反应之前，以2:3的DNA:水稀释基因组DNA。
qPCR分析
通过使用480系统的实时PCR，借助水解探针测定来进行转基因检测。使用PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0设计了要在水解探针测定中用于检测ST-LS1内含子序列(SEQ ID NO:16)、或检测SpecR基因(即，负载在二元载体质粒上的大观霉素抗性基因；SEQ ID NO:70；在表9中的SPC1寡核苷酸)的一部分的寡核苷酸。此外，使用PRIMER EXPRESS软件(APPLIED BIOSYSTEMS)设计了要在水解探针测定中用于检测AAD-1耐除草剂基因(SEQ ID NO:64；在表9中的GAAD1寡核苷酸)的区段的寡核苷酸。表9显示了引物和探针序列。测定用内源玉米染色体基因(转化酶(SEQ ID NO:61；GENBANK登录号U16123；在本文中称为IVR1)的试剂多重化，所述基因用作内部参考序列以确保在每个测定中都存在gDNA。为了扩增，制备了在10μL体积的多重反应物中的1X终浓度的480PROBES母液混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)，其含有每种引物各0.4μM，以及每种探针各0.2μM(表10)。如表11中概述进行两步扩增反应。FAM-和HEX-标记探针的荧光团活化和发射如上文所述；CY5偶联物在650nm处最大激发，并且在670nm处发最大荧光。
使用拟合点算法(软件发行版本1.5)和相对定量模块(基于ΔΔCt方法)，根据实时PCR数据确定Cp得分(荧光信号与背景阈值杂交的点)。如前所述处理数据(上文；RNA qPCR)。
表9.用于基因拷贝数确定和二元载体质粒骨架检测的引物和探针(具有荧光偶联物)的序列。
CY5＝花青-5
表10.用于基因拷贝数分析和质粒骨架检测的反应成分
成分 量(μL) 储液 终浓度
2X缓冲液 5.0 2X 1X
适当的正向引物 0.4 10μM 0.4
适当的反向引物 0.4 10μM 0.4
适当的探针 0.4 5μM 0.2
IVR1-正向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-反向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-探针 0.4 5μM 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
总计 10.0
NA*＝不适用
ND**＝未测定
表11.用于DNA qPCR的热循环仪条件
实施例8.转基因玉米的生物测定
体外昆虫生物测定
通过生物测定方法来证实在植物细胞中产生的本主题发明的dsRNA的生物活性。参见，例如，Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-6。人们能够例如通过在受控的饲喂环境下给靶昆虫喂食来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织或组织片来证实效力。或者，从来源于产生杀虫dsRNA的植物的各种植物组织制备提取物，并将提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物测定的人工食料上面。将这样的饲喂测定的结果与类似方式进行的采用来自不产生杀虫dsRNA的宿主植物的适当对照组织、或其他对照样品的生物测定进行比较。
关于转基因玉米事件的昆虫生物测定
选择从经洗涤的卵孵化的两条西方玉米根虫幼虫(1到3日龄)并将其置于生物测定托盘的每个孔中。然后将这些孔用“拉-揭”(PULL N’PEEL)护盖(BIO-CV-16,BIO-SERV)覆盖，并置于具有18小时/6小时光照/黑暗周期的28℃培养箱中。在初始侵染9日之后，评估幼虫死亡率，其按照死亡昆虫占的每次处理中昆虫总数的百分比来计算。将昆虫样品在-20℃冷冻两天，然后汇集来自每个处理的昆虫幼虫并称重。生长抑制百分比按照实验处理的平均重量除以两个对照孔处理的平均重量的均值来计算。数据表示为(阴性对照的)生长抑制百分比。将超过对照平均重量的平均重量归一化为零。
温室中的昆虫生物测定
从CROP CHARACTERISTICS(Farmington,MN)收到带有西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲)卵的土壤。在28℃温育WCR卵10到11天。洗掉卵上的土壤，将卵置于0.15％琼脂溶液中，浓度调节至每0.25mL等份大约75个到100个卵。将一份卵悬浮液加入培养皿中以设置孵化平板，用于监测孵化速率。
用150到200个WCR卵侵染中生长的玉米植物周围的土壤。允许昆虫摄食2周，在这段时间之后，对每个植物给出“根评级”。利用一个节损伤量表进行分级，大体上如Oleson等人，(2005,J.Econ.Entomol.98:1-8)所述。将通过了这个生物测定的植物移栽到5加仑的盆中供产生种子。用杀虫剂处理移植物以防止进一步根虫损害和昆虫释放到温室中。将植物人工授粉以产生种子。保存由这些植物产生的种子以评估植物的T1和后续世代。
温室生物测定包括两种阴性对照植物。转基因阴性对照植物通过用包含设计为产生黄色荧光蛋白(YFP)的基因或YFP发夹dsRNA的载体转化而生成(参见实施例4)。非转化的阴性对照植物从品系7sh382或B104的种子培植而来。在两个不同的日期进行生物测定，其中每一组植物材料中均包括阴性对照。
表12显示了dre4-发夹植物的分子分析和生物测定的结果汇总。考察总结在表12中的生物测定结果揭示了一项令人惊奇和出乎意料的观察结果，即，大多数包含表达含有SEQ ID NO:1区段(例如，如在SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中例示的)的dre4发夹dsRNA的构建体的转基因玉米植物受到保护而免于通过喂养西方玉米根虫幼虫招致的根损害。37个被分级的事件中的二十二个具有0.5或更低的根评级。表13显示了阴性对照植物的分子分析和生物测定的合并结果。大多数植物没有针对WCR幼虫喂养的保护，尽管34个被分级的植物中有五个具有0.75或更低的根评级。在阴性对照植物组中有时观察到一些具有低的根评级的植物的存在反映了在温室环境中进行这种类型的生物测定的变化性和困难。
表12.表达dre4-发夹的玉米植物的温室生物测定和分子分析结果。
*RTL＝针对TIP4样基因转录物水平测量的相对转录物水平。
**NG＝由于植物尺寸小而未评级。
***ND＝未进行。
表13.包括转基因与非转基因玉米植物的阴性对照植物的温室生物测定及分子分子结果
*RTL＝针对TIP4-样基因转录物水平测量的相对转录物水平。
**NG＝由于植物尺寸小而未评级。
***ND＝未进行。
实施例9：包含鞘翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例6中所述生成10个到20个转基因T0玉米植物。获得另外的10-20个表达针对RNAi构建体的发夹dsRNA的T1玉米独立品系用于玉米根虫攻击。发夹dsRNA可按照SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14中所列出而衍生，或进一步包含SEQ ID NO:1。更多的发夹dsRNA可以衍生自例如鞘翅目害虫序列，例如像Caf1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公开号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公开号2013/0091601)、或RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)。这些通过RT-PCR或其他分子分析方法得以证实。来自选定的独立T1系的总RNA制备物任选地用于RT-PCR，其中引物被设计为在每个RNAi构建体中的发夹表达盒的ST-LS1内含子中结合。另外，用于RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内siRNA产生所需要的预加工mRNA，并用于确认所述预加工mRNA的产生。对于每个靶基因的期望条带的扩增可确认每个转基因玉米植物中发夹RNA的表达。随后任选地利用RNA印迹杂交在独立转基因系中确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
而且，与靶基因具有80％以上序列同一性、具有错配序列的RNAi分子对玉米根虫的影响类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。错配序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，由此产生出能够影响摄食中的鞘翅目害虫的生长、发育和生存力的植物加工的siRNA。
对应于靶基因的dsRNA、siRNA、或miRNA的植物内递送以及被鞘翅目害虫进食后的摄取，导致鞘翅目害虫中的靶基因由于RNA介导的基因沉默而下调。当靶基因在发育的一个或多个阶段发挥重要作用的时候，鞘翅目害虫的生长、发育和生殖受到影响，而且在WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根萤叶甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctata Mannerheim的至少一者的情况下，会导致鞘翅目害虫无法成功侵染、摄食、发育、和/或生殖，或导致其死亡。然后通过靶基因的选择和RNAi的成功应用来控制鞘翅目害虫。
转基因RNAi品系和非转化玉米的表型比较
选用于创建发夹dsRNA的靶鞘翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此预期靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体的(系统性)RNAi的产生或活化对转基因植物不会有任何有害影响。然而，将转基因系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的那些转基因系进行比较。比较了植物根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长和生长模式上没有可观察到的差异。植物地上部特征，诸如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观之类，是相似的。总的来说，在体外以及在温室土壤中培养时，在转基因系和没有表达靶iRNA分子的那些品系之间没有可观察的形态差异。
实施例10.包含鞘翅目害虫序列和另外的RNAi构建体的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含异源编码序列，所述异源编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物的iRNA分子，对这样的转基因植物通过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1的基因的dsRNA分子)。基本上如实施例4中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因Hi II或B104玉米植物的玉米悬浮细胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源编码序列，所述异源编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物的iRNA分子。
实施例11.包含RNAi构建体和另外的鞘翅目害虫控制序列的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物的iRNA分子的异源编码序列(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1的基因的dsRNA分子)，对于这样的转基因玉米植物，通过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526:59-67)进行二次转化以产生一种或多种杀虫蛋白分子，例如，Cry3、Cry34和Cry35杀虫蛋白。基本上如实施例4中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因B104玉米植物的玉米悬浮细胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物的iRNA分子的异源编码序列。获得产生用于控制鞘翅目害虫的iRNA分子和杀虫蛋白的双重转化植物。
序列表
<110> 美国陶氏益农公司
Fraunhofer IME
University of Giessen
Narva, Ken E.
Frey, Meghan
Rangasamy, Murugesan
Arora, Kanika S.
Veeramani, Balaji
Gandra, Premchand
Worden, Sarah E.
Vilcinskas, Andreas
Knorr, Eileen
<120> 赋予鞘翅目害虫抗性的DRE4核酸分子
<130> 75747
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3423
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 1
atggctaatg tcaatttaga caaacagtct tttcaccgta gattaaagaa gctctacaat 60
tcatggcaaa ataccgatgg agaaaatggt ttctcaaaaa tggatgcttt agtcactgca 120
gtcggcaaag acgatgatat tgtgtacagc aaatcaggtg cattgcaaat atggctgttg 180
ggctacgaac ttacagatac tattatggtt cttgtagaga aaaaagctta tttcttaacc 240
agtaaaaaga aggttgaatt tcttcggcaa gccgaactta aagagaagga tgagaaccaa 300
atccaactaa acttgttggt ccgcgataaa gacagcgacg aagcaaaatt taaaattctt 360
tgtgaagcta taaaggagag caaaaatggt aaaactttgg gggtttttgc aaaggataat 420
tattctggat cttttgttga taattggaaa gcaatgctca agaaacaaga atttcaaact 480
gcggatatga gttctcagat tgcttacctc attagcccta aagaagaatc tgaaattact 540
accatgaaaa aagcatctca ggtaactgta gatgtattca caaagtattt aaaagatcag 600
attatggaga ttattgattc ggaaaagaaa gtcaagcata gcaaactagc agaaggagtt 660
gaatctgcca taagtgataa aaaatatgtc tcaggggttg atgttaatca agttgatatg 720
tgctaccctg ccattataca gtctggaggc acttacaatt taaaattcag tgttattagt 780
gataaaaatt cactacattt tggagccatt gtttgttctc taggcgctcg ctataagtca 840
tactgttcca acatcgtccg aaccttgtta gtaaacccca cagaggaaat ccaaaacaac 900
tataattttc ttttaacaat tgaagaggag ttaataaaag tgcttcagaa tggagtaaaa 960
ttgtcggaag tttatgacac tggttacaat atggttaaaa aggaaaagcc aaatttagct 1020
gaccatttga ccaaaaattt tggattcgca atggggatag aattcaaaga aaattccctg 1080
attattggac caaaaactac agttgaagcc aaaaagggga tggtgttcaa tttaaatata 1140
ggtttttcta atttggaaaa taaggaagct tctgacaagg agggaaaaat atatgcttta 1200
ttcattggag atactgtttt ggttaatgaa ggtcagccag caagtgtctt aacaccatcc 1260
aagaagaaga ttaagaacat cggtattttc cttaaagatg attctgacgc agaagaaaat 1320
gatgaggaaa aagaaaacac tccgaaaaag accgaaattt tgggaagggg taaaagaact 1380
gctgttattg aatcaaaact gcgtactgaa cacagcaccg aagaaaaaag aaaagagcac 1440
cagaaagaat tggcagctca actaaatgaa aaagcaaaag agcgtttggc aaaacaatct 1500
ggatctaaag ataaagagaa agtgagaaaa aatactgtgt catacaaaag tgtcaatcaa 1560
atgcctagag ttcccgaggt aaaagaacta aaattatatg tggaccagaa gtatgaaact 1620
gttattttac ctatttatgg aattgcggta cctttccata tttctacaat caaaaatatt 1680
tctcaatcta ttgagggaga ctacacctat ttgcgtatta actttttcca tcccggtaca 1740
actatgggca gaaatgaagg taatgtctgg tctcagcctg aagcaacttt ccttaaagaa 1800
ttaacatata ggagtaccaa tacaaaagaa ccaggagtag taactgctcc ctcgtctaac 1860
cttaatacag cctttcgtct aattaaagaa gttcaaagga aatttaagac acgagaagct 1920
gaagaaaaag aaaaagagga tttggttaaa caggacacat tagtactttc acagaataaa 1980
ggaaatccta aattaaaaga tctgtatatt aggccaaata ttgtttcaaa acgtatgaca 2040
ggatcattag aagctcacac taatggtttt aggtatactt ctgtgagggg tgataaagta 2100
gacattcttt acaacaacat caagaatgcc ttctttcaac cgtgtgatgg agaaatgata 2160
attctgttac attttcacct aaaacatgct atcatgttcg gaaaaaagaa acatgttgac 2220
gttcaattct atacggaagt cggagaaatt accacagatt tgggcaaaca tcaacacatg 2280
cacgatcgag atgatctggc tgctgagcag tcggaaagag agctcagaca aaaattgaaa 2340
actgcattca aaagtttttg tgaaaaggtt gaatctatga caaaacaaga aattgaattt 2400
gatacaccat tccgggagtt gggatttcca ggagccccct tccgctctac agtccttctc 2460
cagcctacat ctggttgttt ggttaacctg actgaatggc ctccatttgt tgtcacccta 2520
gaagatgtag agttagtaca ttttgaacgt gtacaattcc acctgaagaa cttcgatatg 2580
gtgtttgttt ttaaggagta tcttaaaaag actgtcatgg taaatgctat accaatgaat 2640
atgctggatc atgtaaaaga atggttaaat tcttgtgaca ttagatattc tgaaggagtt 2700
cagtctctta attgggtcaa aattatgaaa accattacag atgatccaga aggtttcttt 2760
gacagtggtg gttggacttt ccttgaccca gaatctgacg aagaacaagc taaagaagaa 2820
gaatcagaag aagaagatga agcgtatcaa ccgtctgatt tagaagaagt aggatctgat 2880
tggagcgaag aagactctga atattcggaa ggtgatactg aagatgatga cgatgatgaa 2940
gatgcttctg aagatctagg atctgacgaa gaatcgggaa aagactggtc tgatcttgaa 3000
cgtgaagcgg aagaagagga tagagaaaaa gtttatactg ctgaagacga aggtgacaga 3060
agaaataaac atcgcagcaa gggtcatgat aaattttcat ccaaaggtgg caaatcatca 3120
aaagataaaa gcagacatag cagtagcagt cataagagcc ctagcaaaca taactcctct 3180
tcaagcagta gtaaacattc accttcaaaa gataaggacc gaaacagcag ttcaaaaagt 3240
agggacaaag atagacactc atcatcgaac cataaatctt ctagccactc atcctcatct 3300
agagataagg acaaggacag aaaaaagagc tcgtcttctc acaaaagcag cagttctggc 3360
gataaaaaga gacaaagaag tcccagcggt gacaaacacc actcgaagaa atctagaaag 3420
tga 3423
<210> 2
<211> 175
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 2
taacagtttc atacttctgg tccacatata attttagttc ttttacctcg ggaactctag 60
gcatttgatt gacacttttg tatgacacag tattttttct cactttctct ttatctttag 120
atccagattg ttttgccaaa cgctcttttg ctttttcatt tagttgagct gccaa 175
<210> 3
<211> 127
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 3
ttttagttct tttacctcgg gaactctagg catttgattg acacttttgt atgacacagt 60
attttttctc actttctctt tatctttaga tccagattgt tttgccaaac gctcttttgc 120
tttttca 127
<210> 4
<211> 459
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 4
cttcatttct gcccatagtt gtaccgggat ggaaaaagtt aatacgcaaa taggtgtagt 60
ctccctcaat agattgagaa atatttttga ttgtagaaat atggaaaggt accgcaattc 120
cataaatagg taaaataaca gtttcatact tctggtccac atataatttt agttctttta 180
cctcgggaac tctaggcatt tgattgacac ttttgtatga cacagtattt tttctcactt 240
tctctttatc tttagatcca gattgttttg ccaaacgctc ttttgctttt tcatttagtt 300
gagctgccaa ttctttctgg tgctcttttc ttttttcttc ggtgctgtgt tcagtacgca 360
gttttgattc aataacagca gttcttttac cccttcccaa aatttcggtc tttttcggag 420
tgttttcttt ttcctcatca ttttcttctg cgtcagaat 459
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子寡核苷酸
<400> 5
ttaatacgac tcactatagg gaga 24
<210> 6
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分编码区
<400> 6
caccatgggc tccagcggcg ccctgctgtt ccacggcaag atcccctacg tggtggagat 60
ggagggcaat gtggatggcc acaccttcag catccgcggc aagggctacg gcgatgccag 120
cgtgggcaag gtggatgccc agttcatctg caccaccggc gatgtgcccg tgccctggag 180
caccctggtg accaccctga cctacggcgc ccagtgcttc gccaagtacg gccccgagct 240
gaaggatttc tacaagagct gcatgcccga tggctacgtg caggagcgca ccatcacctt 300
cgagggcgat ggcaatttca agacccgcgc cgaggtgacc ttcgagaatg gcagcgtgta 360
caatcgcgtg aagctgaatg gccagggctt caagaaggat ggccacgtgc tgggcaagaa 420
tctggagttc aatttcaccc cccactgcct gtacatctgg ggcgatcagg ccaatcacgg 480
cctgaagagc gccttcaaga tct 503
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 7
ttaatacgac tcactatagg gagataacag tttcatactt ctggtccac 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 8
ttaatacgac tcactatagg gagattggca gctcaactaa atgaaaaag 49
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 9
ttaatacgac tcactatagg gagattttag ttcttttacc tcgggaactc 50
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 10
ttaatacgac tcactatagg gagatgaaaa agcaaaagag cgtttgg 47
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 11
ttaatacgac tcactatagg gagacttcat ttctgcccat agttgtac 48
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 12
ttaatacgac tcactatagg gagaattctg acgcagaaga aaatgatg 48
<210> 13
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
taacagtttc atacttctgg tccacatata attttagttc ttttacctcg ggaactctag 60
gcatttgatt gacacttttg tatgacacag tattttttct cactttctct ttatctttag 120
atccagattg ttttgccaaa cgctcttttg ctttttcatt tagttgagct gccaagaatc 180
cttgcgtcat ttggtgacta gtaccggttg ggaaaggtat gtttctgctt ctacctttga 240
tatatatata ataattatca ctaattagta gtaatatagt atttcaagta tttttttcaa 300
aataaaagaa tgtagtatat agctattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta 360
atttataact tttctaatat atgaccaaaa catggtgatg tgcaggttga tccgcggtta 420
agttgtgcgt gagtccattg ttggcagctc aactaaatga aaaagcaaaa gagcgtttgg 480
caaaacaatc tggatctaaa gataaagaga aagtgagaaa aaatactgtg tcatacaaaa 540
gtgtcaatca aatgcctaga gttcccgagg taaaagaact aaaattatat gtggaccaga 600
agtatgaaac tgtta 615
<210> 14
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
ttttagttct tttacctcgg gaactctagg catttgattg acacttttgt atgacacagt 60
attttttctc actttctctt tatctttaga tccagattgt tttgccaaac gctcttttgc 120
tttttcagaa tccttgcgtc atttggtgac tagtaccggt tgggaaaggt atgtttctgc 180
ttctaccttt gatatatata taataattat cactaattag tagtaatata gtatttcaag 240
tatttttttc aaaataaaag aatgtagtat atagctattg cttttctgta gtttataagt 300
gtgtatattt taatttataa cttttctaat atatgaccaa aacatggtga tgtgcaggtt 360
gatccgcggt taagttgtgc gtgagtccat tgtgaaaaag caaaagagcg tttggcaaaa 420
caatctggat ctaaagataa agagaaagtg agaaaaaata ctgtgtcata caaaagtgtc 480
aatcaaatgc ctagagttcc cgaggtaaaa gaactaaaa 519
<210> 15
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 15
atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60
aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120
aaggactagt accggttggg aaaggtatgt ttctgcttct acctttgata tatatataat 180
aattatcact aattagtagt aatatagtat ttcaagtatt tttttcaaaa taaaagaatg 240
tagtatatag ctattgcttt tctgtagttt ataagtgtgt atattttaat ttataacttt 300
tctaatatat gaccaaaaca tggtgatgtg caggttgatc cgcggttact ttcccactga 360
ggcatctccg tagcctttcc cacgtatgct aaaggtgtgg ccatcaacat tcccttccat 420
ctccacaacg taaggaatct tcccatgaaa gagaagtgct ccagatgaca t 471
<210> 16
<211> 225
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 16
gactagtacc ggttgggaaa ggtatgtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat 60
tatcactaat tagtagtaat atagtatttc aagtattttt ttcaaaataa aagaatgtag 120
tatatagcta ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct 180
aatatatgac caaaacatgg tgatgtgcag gttgatccgc ggtta 225
<210> 17
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 17
atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60
aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120
aaggttgatg cacagttcat ctgcacaact ggtgatgttc ctgtgccttg gagcacactt 180
gtcaccactc tcacctatgg agcacagtgc tttgccaagt atggtccaga gttgaaggac 240
ttctacaagt cctgtatgcc agatggctat gtgcaagagc gcacaatcac ctttgaagga 300
gatggcaact tcaagactag ggctgaagtc acctttgaga atgggtctgt ctacaatagg 360
gtcaaactca atggtcaagg cttcaagaaa gatggtcatg tgttgggaaa gaacttggag 420
ttcaacttca ctccccactg cctctacatc tggggtgacc aagccaacca cggtctcaag 480
tcagccttca agatctgtca tgagattact ggcagcaaag gcgacttcat agtggctgac 540
cacacccaga tgaacactcc cattggtgga ggtccagttc atgttccaga gtatcatcac 600
atgtcttacc atgtgaaact ttccaaagat gtgacagacc acagagacaa catgtccttg 660
aaagaaactg tcagagctgt tgactgtcgc aagacctacc tttga 705
<210> 18
<211> 218
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 18
tagctctgat gacagagccc atcgagtttc aagccaaaca gttgcataaa gctatcagcg 60
gattgggaac tgatgaaagt acaatmgtmg aaattttaag tgtmcacaac aacgatgaga 120
ttataagaat ttcccaggcc tatgaaggat tgtaccaacg mtcattggaa tctgatatca 180
aaggagatac ctcaggaaca ttaaaaaaga attattag 218
<210> 19
<211> 424
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<220>
<221> misc_feature
<222> (393)..(393)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (394)..(394)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (395)..(395)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
ttgttacaag ctggagaact tctctttgct ggaaccgaag agtcagtatt taatgctgta 60
ttctgtcaaa gaaataaacc acaattgaat ttgatattcg acaaatatga agaaattgtt 120
gggcatccca ttgaaaaagc cattgaaaac gagttttcag gaaatgctaa acaagccatg 180
ttacacctta tccagagcgt aagagatcaa gttgcatatt tggtaaccag gctgcatgat 240
tcaatggcag gcgtcggtac tgacgataga actttaatca gaattgttgt ttcgagatct 300
gaaatcgatc tagaggaaat caaacaatgc tatgaagaaa tctacagtaa aaccttggct 360
gataggatag cggatgacac atctggcgac tannnaaaag ccttattagc cgttgttggt 420
taag 424
<210> 20
<211> 397
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 20
agatgttggc tgcatctaga gaattacaca agttcttcca tgattgcaag gatgtactga 60
gcagaatagt ggaaaaacag gtatccatgt ctgatgaatt gggaagggac gcaggagctg 120
tcaatgccct tcaacgcaaa caccagaact tcctccaaga cctacaaaca ctccaatcga 180
acgtccaaca aatccaagaa gaatcagcta aacttcaagc tagctatgcc ggtgatagag 240
ctaaagaaat caccaacagg gagcaggaag tggtagcagc ctgggcagcc ttgcagatcg 300
cttgcgatca gagacacgga aaattgagcg atactggtga tctattcaaa ttctttaact 360
tggtacgaac gttgatgcag tggatggacg aatggac 397
<210> 21
<211> 490
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 21
gcagatgaac accagcgaga aaccaagaga tgttagtggt gttgaattgt tgatgaacaa 60
ccatcagaca ctcaaggctg agatcgaagc cagagaagac aactttacgg cttgtatttc 120
tttaggaaag gaattgttga gccgtaatca ctatgctagt gctgatatta aggataaatt 180
ggtcgcgttg acgaatcaaa ggaatgctgt actacagagg tgggaagaaa gatgggagaa 240
cttgcaactc atcctcgagg tataccaatt cgccagagat gcggccgtcg ccgaagcatg 300
gttgatcgca caagaacctt acttgatgag ccaagaacta ggacacacca ttgacgacgt 360
tgaaaacttg ataaagaaac acgaagcgtt cgaaaaatcg gcagcggcgc aagaagagag 420
attcagtgct ttggagagac tgacgacgtt cgaattgaga gaaataaaga ggaaacaaga 480
agctgcccag 490
<210> 22
<211> 330
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 22
agtgaaatgt tagcaaatat aacatccaag tttcgtaatt gtacttgctc agttagaaaa 60
tattctgtag tttcactatc ttcaaccgaa aatagaataa atgtagaacc tcgcgaactt 120
gcctttcctc caaaatatca agaacctcga caagtttggt tggagagttt agatacgata 180
gacgacaaaa aattgggtat tcttgagctg catcctgatg tttttgctac taatccaaga 240
atagatatta tacatcaaaa tgttagatgg caaagtttat atagatatgt aagctatgct 300
catacaaagt caagatttga agtgagaggt 330
<210> 23
<211> 320
<212> DNA
<213> Diabrotica virgifera
<400> 23
caaagtcaag atttgaagtg agaggtggag gtcgaaaacc gtggccgcaa aagggattgg 60
gacgtgctcg acatggttca attagaagtc cactttggag aggtggagga gttgttcatg 120
gaccaaaatc tccaacccct catttttaca tgattccatt ctacacccgt ttgctgggtt 180
tgactagcgc actttcagta aaatttgccc aagatgactt gcacgttgtg gatagtctag 240
atctgccaac tgacgaacaa agttatatag aagagctggt caaaagccgc ttttgggggt 300
ccttcttgtt ttatttgtag 320
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 24
ttaatacgac tcactatagg gagacaccat gggctccagc ggcgccc 47
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 25
agatcttgaa ggcgctcttc agg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 26
caccatgggc tccagcggcg ccc 23
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 27
ttaatacgac tcactatagg gagaagatct tgaaggcgct cttcagg 47
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 28
ttaatacgac tcactatagg gagagctcca acagtggttc cttatc 46
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 29
ctaataattc ttttttaatg ttcctgagg 29
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 30
gctccaacag tggttcctta tc 22
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 31
ttaatacgac tcactatagg gagactaata attctttttt aatgttcctg agg 53
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 32
ttaatacgac tcactatagg gagattgtta caagctggag aacttctc 48
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 33
cttaaccaac aacggctaat aagg 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 34
ttgttacaag ctggagaact tctc 24
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 35
ttaatacgac tcactatagg gagacttaac caacaacggc taataagg 48
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 36
ttaatacgac tcactatagg gagaagatgt tggctgcatc tagagaa 47
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 37
gtccattcgt ccatccactg ca 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 38
agatgttggc tgcatctaga gaa 23
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 39
ttaatacgac tcactatagg gagagtccat tcgtccatcc actgca 46
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 40
ttaatacgac tcactatagg gagagcagat gaacaccagc gagaaa 46
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 41
ctgggcagct tcttgtttcc tc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 42
gcagatgaac accagcgaga aa 22
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 43
ttaatacgac tcactatagg gagactgggc agcttcttgt ttcctc 46
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 44
ttaatacgac tcactatagg gagaagtgaa atgttagcaa atataacatc c 51
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 45
acctctcact tcaaatcttg actttg 26
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 46
agtgaaatgt tagcaaatat aacatcc 27
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 47
ttaatacgac tcactatagg gagaacctct cacttcaaat cttgactttg 50
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 48
ttaatacgac tcactatagg gagacaaagt caagatttga agtgagaggt 50
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 49
ctacaaataa aacaagaagg acccc 25
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 50
caaagtcaag atttgaagtg agaggt 26
<210> 51
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 51
ttaatacgac tcactatagg gagactacaa ataaaacaag aaggacccc 49
<210> 52
<211> 1150
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 52
caacggggca gcactgcact gcactgcaac tgcgaatttc cgtcagcttg gagcggtcca 60
agcgccctgc gaagcaaact acgccgatgg cttcggcggc ggcgtgggag ggtccgacgg 120
ccgcggagct gaagacagcg ggggcggagg tgattcccgg cggcgtgcga gtgaaggggt 180
gggtcatcca gtcccacaaa ggccctatcc tcaacgccgc ctctctgcaa cgctttgaag 240
atgaacttca aacaacacat ttacctgaga tggtttttgg agagagtttc ttgtcacttc 300
aacatacaca aactggcatc aaatttcatt ttaatgcgct tgatgcactc aaggcatgga 360
agaaagaggc actgccacct gttgaggttc ctgctgcagc aaaatggaag ttcagaagta 420
agccttctga ccaggttata cttgactacg actatacatt tacgacacca tattgtggga 480
gtgatgctgt ggttgtgaac tctggcactc cacaaacaag tttagatgga tgcggcactt 540
tgtgttggga ggatactaat gatcggattg acattgttgc cctttcagca aaagaaccca 600
ttcttttcta cgacgaggtt atcttgtatg aagatgagtt agctgacaat ggtatctcat 660
ttcttactgt gcgagtgagg gtaatgccaa ctggttggtt tctgcttttg cgtttttggc 720
ttagagttga tggtgtactg atgaggttga gagacactcg gttacattgc ctgtttggaa 780
acggcgacgg agccaagcca gtggtacttc gtgagtgctg ctggagggaa gcaacatttg 840
ctactttgtc tgcgaaagga tatccttcgg actctgcagc gtacgcggac ccgaacctta 900
ttgcccataa gcttcctatt gtgacgcaga agacccaaaa gctgaaaaat cctacctgac 960
tgacacaaag gcgccctacc gcgtgtacat catgactgtc ctgtcctatc gttgcctttt 1020
gtgtttgcca catgttgtgg atgtacgttt ctatgacgaa acaccatagt ccatttcgcc 1080
tgggccgaac agagatagct gattgtcatg tcacgtttga attagaccat tccttagccc 1140
tttttccccc 1150
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
tttttttttt tttttttttt vn 22
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 54
gggtgacggg agagatt 17
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 55
cataacacac aactttgatg cc 22
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 56
tgagggtaat gccaactggt t 21
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 57
gcaatgtaac cgagtgtctc tcaa 24
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 58
tttttggctt agagttgatg gtgtactgat ga 32
<210> 59
<211> 151
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 59
gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc 60
ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga 120
cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa g 151
<210> 60
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分编码区
<400> 60
tgttcggttc cctctaccaa gcacagaacc gtcgcttcag caacacctca gtcaaggtga 60
tggatgttg 69
<210> 61
<211> 4233
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 61
agcctggtgt ttccggagga gacagacatg atccctgccg ttgctgatcc gacgacgctg 60
gacggcgggg gcgcgcgcag gccgttgctc ccggagacgg accctcgggg gcgtgctgcc 120
gccggcgccg agcagaagcg gccgccggct acgccgaccg ttctcaccgc cgtcgtctcc 180
gccgtgctcc tgctcgtcct cgtggcggtc acagtcctcg cgtcgcagca cgtcgacggg 240
caggctgggg gcgttcccgc gggcgaagat gccgtcgtcg tcgaggtggc cgcctcccgt 300
ggcgtggctg agggcgtgtc ggagaagtcc acggccccgc tcctcggctc cggcgcgctc 360
caggacttct cctggaccaa cgcgatgctg gcgtggcagc gcacggcgtt ccacttccag 420
ccccccaaga actggatgaa cggttagttg gacccgtcgc catcggtgac gacgcgcgga 480
tcgttttttt cttttttcct ctcgttctgg ctctaacttg gttccgcgtt tctgtcacgg 540
acgcctcgtg cacatggcga tacccgatcc gccggccgcg tatatctatc tacctcgacc 600
ggcttctcca gatccgaacg gtaagttgtt ggctccgata cgatcgatca catgtgagct 660
cggcatgctg cttttctgcg cgtgcatgcg gctcctagca ttccacgtcc acgggtcgtg 720
acatcaatgc acgatataat cgtatcggta cagagatatt gtcccatcag ctgctagctt 780
tcgcgtattg atgtcgtgac attttgcacg caggtccgct gtatcacaag ggctggtacc 840
acctcttcta ccagtggaac ccggactccg cggtatgggg caacatcacc tggggccacg 900
ccgtctcgcg cgacctcctc cactggctgc acctaccgct ggccatggtg cccgatcacc 960
cgtacgacgc caacggcgtc tggtccgggt cggcgacgcg cctgcccgac ggccggatcg 1020
tcatgctcta cacgggctcc acggcggagt cgtcggcgca ggtgcagaac ctcgcggagc 1080
cggccgacgc gtccgacccg ctgctgcggg agtgggtcaa gtcggacgcc aacccggtgc 1140
tggtgccgcc gccgggcatc gggccgacgg acttccgcga cccgacgacg gcgtgtcgga 1200
cgccggccgg caacgacacg gcgtggcggg tcgccatcgg gtccaaggac cgggaccacg 1260
cggggctggc gctggtgtac cggacggagg acttcgtgcg gtacgacccg gcgccggcgc 1320
tgatgcacgc cgtgccgggc accggcatgt gggagtgcgt ggacttctac ccggtggccg 1380
cgggatcagg cgccgcggcg ggcagcgggg acgggctgga gacgtccgcg gcgccgggac 1440
ccggggtgaa gcacgtgctc aaggctagcc tcgacgacga caagcacgac tactacgcga 1500
tcggcaccta cgacccggcg acggacacct ggacccccga cagcgcggag gacgacgtcg 1560
ggatcggcct ccggtacgac tatggcaagt actacgcgtc gaagaccttc tacgaccccg 1620
tccttcgccg gcgggtgctc tgggggtggg tcggcgagac cgacagcgag cgcgcggaca 1680
tcctcaaggg ctgggcatcc gtgcaggtac gtctcagggt ttgaggctag catggcttca 1740
atcttgctgg catcgaatca ttaatgggca gatattataa cttgataatc tgggttggtt 1800
gtgtgtggtg gggatggtga cacacgcgcg gtaataatgt agctaagctg gttaaggatg 1860
agtaatgggg ttgcgtataa acgacagctc tgctaccatt acttctgaca cccgattgaa 1920
ggagacaaca gtaggggtag ccggtagggt tcgtcgactt gccttttctt ttttcctttg 1980
ttttgttgtg gatcgtccaa cacaaggaaa ataggatcat ccaacaaaca tggaagtaat 2040
cccgtaaaac atttctcaag gaaccatcta gctagacgag cgtggcatga tccatgcatg 2100
cacaaacact agataggtct ctgcagctgt gatgttcctt tacatatacc accgtccaaa 2160
ctgaatccgg tctgaaaatt gttcaagcag agaggccccg atcctcacac ctgtacacgt 2220
ccctgtacgc gccgtcgtgg tctcccgtga tcctgccccg tcccctccac gcggccacgc 2280
ctgctgcagc gctctgtaca agcgtgcacc acgtgagaat ttccgtctac tcgagcctag 2340
tagttagacg ggaaaacgag aggaagcgca cggtccaagc acaacacttt gcgcgggccc 2400
gtgacttgtc tccggttggc tgagggcgcg cgacagagat gtatggcgcc gcggcgtgtc 2460
ttgtgtcttg tcttgcctat acaccgtagt cagagactgt gtcaaagccg tccaacgaca 2520
atgagctagg aaacgggttg gagagctggg ttcttgcctt gcctcctgtg atgtctttgc 2580
cttgcatagg gggcgcagta tgtagctttg cgttttactt cacgccaaag gatactgctg 2640
atcgtgaatt attattatta tatatatatc gaatatcgat ttcgtcgctc tcgtggggtt 2700
ttattttcca gactcaaact tttcaaaagg cctgtgtttt agttcttttc ttccaattga 2760
gtaggcaagg cgtgtgagtg tgaccaacgc atgcatggat atcgtggtag actggtagag 2820
ctgtcgttac cagcgcgatg cttgtatatg tttgcagtat tttcaaatga atgtctcagc 2880
tagcgtacag ttgaccaagt cgacgtggag ggcgcacaac agacctctga cattattcac 2940
ttttttttta ccatgccgtg cacgtgcagt caatccccag gacggtcctc ctggacacga 3000
agacgggcag caacctgctc cagtggccgg tggtggaggt ggagaacctc cggatgagcg 3060
gcaagagctt cgacggcgtc gcgctggacc gcggatccgt cgtgcccctc gacgtcggca 3120
aggcgacgca ggtgacgccg cacgcagcct gctgcagcga acgaactcgc gcgttgccgg 3180
cccgcggcca gctgacttag tttctctggc tgatcgaccg tgtgcctgcg tgcgtgcagt 3240
tggacatcga ggctgtgttc gaggtggacg cgtcggacgc ggcgggcgtc acggaggccg 3300
acgtgacgtt caactgcagc accagcgcag gcgcggcggg ccggggcctg ctcggcccgt 3360
tcggccttct cgtgctggcg gacgacgact tgtccgagca gaccgccgtg tacttctacc 3420
tgctcaaggg cacggacggc agcctccaaa ctttcttctg ccaagacgag ctcaggtatg 3480
tatgttatga cttatgacca tgcatgcatg cgcatttctt agctaggctg tgaagcttct 3540
tgttgagttg tttcacagat gcttaccgtc tgctttgttt cgtatttcga ctaggcatcc 3600
aaggcgaacg atctggttaa gagagtatac gggagcttgg tccctgtgct agatggggag 3660
aatctctcgg tcagaatact ggtaagtttt tacagcgcca gccatgcatg tgttggccag 3720
ccagctgctg gtactttgga cactcgttct tctcgcactg ctcattattg cttctgatct 3780
ggatgcacta caaattgaag gttgaccact ccatcgtgga gagctttgct caaggcggga 3840
ggacgtgcat cacgtcgcga gtgtacccca cacgagccat ctacgactcc gcccgcgtct 3900
tcctcttcaa caacgccaca catgctcacg tcaaagcaaa atccgtcaag atctggcagc 3960
tcaactccgc ctacatccgg ccatatccgg caacgacgac ttctctatga ctaaattaag 4020
tgacggacag ataggcgata ttgcatactt gcatcatgaa ctcatttgta caacagtgat 4080
tgtttaattt atttgctgcc ttccttatcc ttcttgtgaa actatatggt acacacatgt 4140
atcattaggt ctagtagtgt tgttgcaaag acacttagac accagaggtt ccaggagtat 4200
cagagataag gtataagagg gagcagggag cag 4233
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 62
tgttcggttc cctctaccaa 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 63
caacatccat caccttgact ga 22
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 64
cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 65
tggcggacga cgacttgt 18
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 66
aaagtttgga ggctgccgt 19
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 67
cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 68
cttagctgga taacgccac 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 69
gaccgtaagg cttgatgaa 19
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 70
cgagattctc cgcgctgtag a 21
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 71
gtatgtttct gcttctacct ttgat 25
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物寡核苷酸
<400> 72
ccatgttttg gtcatatatt agaaaagtt 29
<210> 73
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 73
agtaatatag tatttcaagt atttttttca aaat 34
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Probe oligonucleotide
<400> 74
aagtctaggt tgtttaaagg ttaccgagc 29

Claims (56)

1.一种与异源启动子可操作连接的分离的多核苷酸，该多核苷酸包含至少一个选自下组的核苷酸序列：
SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:1的互补序列，SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段，SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如WCR)天然编码序列，包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物天然编码序列的互补序列，转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列，转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的互补序列，包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物(例如WCR)天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，包含SEQID NO:1的叶甲属生物天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，和转录为包含SEQID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的互补序列；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:13的互补序列；SEQID NO:14；以及SEQ ID NO:14的互补序列。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该至少一种核苷酸序列可操作地连接于在植物细胞中有功能的异源启动子。
4.一种植物转化载体，其包含权利要求1的多核苷酸。
5.权利要求1的多核苷酸，其中所述叶甲属生物选自：玉米根萤叶甲(D.v.virgiferaLeConte)；巴氏根萤叶甲(D.barberi Smith and Lawrence)；十一星根萤叶甲(D.u.howardi)；墨西哥玉米根萤叶甲(D.v.zeae)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteataLeConte)；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctata Mannerheim。
6.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是核糖核酸(RNA)分子。
7.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)分子。
8.权利要求1的多核苷酸，其还包含编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的多肽的多核苷酸。
9.权利要求8的多核苷酸，其中所述来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括Cry3、Cry34和Cry35的组。
10.由权利要求7的多核苷酸表达产生的双链核糖核酸分子。
11.权利要求10的双链核糖核酸分子，其中使所述多核苷酸序列与鞘翅目害虫接触抑制与权利要求1的核苷酸序列特异性互补的内源核苷酸序列的表达。
12.权利要求11的双链核糖核酸分子，其中使所述核糖核苷酸分子与鞘翅目害虫接触能杀死或抑制所述鞘翅目害虫的生长、繁殖和/或进食。
13.权利要求10的双链核糖核酸分子，其包含第一、第二和第三多核苷酸序列，其中第一多核苷酸序列包含权利要求1的多核苷酸，
其中第三多核苷酸序列通过第二多核苷酸序列与第一多核苷酸序列连接，且其中第三多核苷酸序列基本上是第一多核苷酸序列的反向互补序列，使得第一多核苷酸序列和第三多核苷酸序列当被转录成核糖核酸时杂交以形成所述双链核糖核苷酸分子。
14.权利要求6的多核苷酸，选自长度为约19至约30个核苷酸的单链核糖核酸分子和双链核糖核酸分子。
15.由权利要求7的多核苷酸表达产生的核糖核酸分子，其中所述核糖核酸分子选自长度为约19至约30个核苷酸之间的单链核糖核酸分子和双链核糖核酸分子。
16.包含权利要求1的多核苷酸的植物转化载体，其中所述至少一个核苷酸序列可操作地连接于在植物细胞中有功能的异源启动子。
17.用权利要求1的多核苷酸转化的细胞。
18.权利要求17的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
19.权利要求17的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
20.权利要求19的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
21.权利要求17的细胞，其中该细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的多核苷酸。
22.权利要求21的细胞，其中所述来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括Cry3、Cry34和Cry35的组。
23.用权利要求1的多核苷酸转化的植物。
24.权利要求23的植物，其中该植物包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的多核苷酸。
25.权利要求24的植物，其中所述来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括Cry3、Cry34和Cry35的组。
26.权利要求23的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。
27.权利要求23的植物，其中所述至少一个核苷酸序列在该植物中表达为双链核糖核酸分子。
28.权利要求20的细胞，其中所述细胞是玉米细胞。
29.权利要求23的植物，其中所述植物是玉米。
30.权利要求23的植物，其中所述至少一个核苷酸序列在该植物中表达为核糖核酸分子，当鞘翅目害虫摄取该植物的一部分时，该核糖核酸分子抑制该鞘翅目害虫的与所述至少一个核苷酸序列特异性互补的内源核苷酸序列的表达。
31.权利要求1的多核苷酸，其包含多于一种选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1；SEQID NO:1的互补序列；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的互补序列；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物天然编码序列的互补序列；转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列；和转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的互补序列。
32.包含权利要求31的多核苷酸的植物转化载体，其中所述核苷酸序列分别与在植物细胞中有功能的异源启动子可操作地连接。
33.用权利要求31的多核苷酸转化的细胞。
34.用权利要求31的多核苷酸转化的植物。
35.权利要求34的植物，其中所述多于一种核苷酸序列在该植物细胞中表达为双链核糖核酸分子。
36.权利要求33的细胞，其中所述细胞是玉米细胞。
37.权利要求35的植物，其中所述植物是玉米。
38.权利要求30的植物，其中所述鞘翅目害虫是叶甲属物种(Diabroticasp.)。
39.权利要求31的植物，其中所述鞘翅目害虫选自下组：玉米根萤叶甲(D.virgiferavirgifera LeConte)；巴氏根萤叶甲(D.barberi Smith and Lawrence)；墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)；十一星根萤叶甲(D.undecimpunctatahowardi)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteata LeConte)；D.undecimpunctata tenella；和D.undecimpunctata undecimpunctata Mannerheim。
40.由根据权利要求23的植物产生的商业产品，其中所述商业产品包含可检测量的权利要求1的多核苷酸。
41.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，包括提供包含双链核糖核酸分子的作用剂，所述双链核糖核酸分子在与鞘翅目害虫接触时起作用以抑制鞘翅目害虫中的生物学功能，其中所述作用剂包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:1的互补序列，SEQID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段，SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物天然编码序列，包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物天然编码序列的互补序列，转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列，转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的互补序列，包含SEQ ID NO:1的叶甲属生物天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，包含SEQ IDNO:1的叶甲属生物天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，和转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的叶甲属生物天然非编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；。
42.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，包括提供包含第一和第二多核苷酸序列的作用剂，所述第一和第二多核苷酸序列在与鞘翅目害虫接触时起作用以抑制鞘翅目害虫内的生物学功能，其中第一多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1的约19至约30个连续核苷酸表现出约90％至约100％的同一性的区域，并且其中所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列特异性杂交。
43.权利要求42的方法，其中所述第一多核苷酸还包含与选自下组的鞘翅目害虫基因的约19个到约30个连续核苷酸显示约90％到约100％序列同一性的区域：液泡ATP酶的C亚单位；液泡ATP酶的H亚单位；以及Rho1小GTP结合蛋白。
44.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
在鞘翅目害虫的宿主植物中提供包含权利要求1的多核苷酸的转化植物细胞，其中所述多核苷酸被表达以产生核糖核酸分子，所述核糖核酸分子在与属于所述群体的鞘翅目害虫接触时起作用以抑制该鞘翅目害虫中的靶序列的表达，并导致鞘翅目害虫或鞘翅目害虫群体的生长相对于在缺少所述转化植物细胞的相同物种的宿主植物上的生长减少。
45.权利要求44的方法，其中所述核糖核酸分子是双链核糖核酸分子。
46.权利要求44的方法，其中所述鞘翅目害虫群体相对于侵袭缺乏所述转化植物细胞的相同物种的宿主植物的鞘翅目害虫群体减少。
47.一种在植物中防治植物鞘翅目害虫侵染的方法，包括在鞘翅目害虫的食料中提供权利要求1的多核苷酸。
48.权利要求47的方法，其中所述食料包含被转化而表达权利要求1的多核苷酸的植物细胞。
49.一种用于提高玉米作物产量的方法，所述方法包括：
将权利要求3的多核苷酸引入玉米植物中以产生转基因玉米植物；和
栽培所述玉米植物以允许所述至少一个核苷酸序列表达；其中所述至少一个核苷酸序列的表达抑制鞘翅目害虫感染或由鞘翅目害虫感染引起的生长和产量损失。
50.权利要求49的方法，其中所述至少一个核苷酸序列的表达产生RNA分子，所述RNA分子阻遏已接触所述玉米植物的一部分的鞘翅目害虫中的至少第一靶基因。
51.一种用于产生转基因植物细胞的方法：
用包含与植物启动子和转录终止序列可操作地连接的权利要求1的多核苷酸的载体转化植物细胞；
在足以允许生发出包含多个转化植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养转化植物细胞；
选择已将至少一个核苷酸序列整合到其基因组中的转化植物细胞；
对转化植物细胞筛选由所述至少一个核苷酸序列编码的核糖核酸分子的表达；和
选择表达所述dsRNA的植物细胞。
52.一种用于产生抗鞘翅目害虫转基因植物的方法，所述方法包括：
提供由权利要求51的方法产生的转基因植物细胞；和
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中由所述至少一个核苷酸序列编码的核糖核酸分子的表达足以调控与所述转化植物接触的鞘翅目害虫中的靶基因的表达。
53.权利要求51所述的方法，其中所述转化的植物细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽的核苷酸序列。
54.权利要求53的方法，其中所述来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括Cry3、Cry34和Cry35的组。
55.一种控制鞘翅目害虫群体的方法，包括对鞘翅目害虫群体提供包含用于抑制鞘翅目害虫中必需dre4基因的表达的手段的作用剂。
56.权利要求55所述的方法，其中提供所述作用剂包括向对鞘翅目害虫侵袭敏感的植物中导入用于提供鞘翅目dre4害虫抗性的手段。
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