JP2023541418A - 減数分裂及び生殖系列プロモーターを使用する遺伝子編集及び部位特異的組込み事象の増加 - Google Patents

減数分裂及び生殖系列プロモーターを使用する遺伝子編集及び部位特異的組込み事象の増加 Download PDF

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Abstract

本開示は、誘導型エンドヌクレアーゼ及び減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターを使用してゲノム編集及び部位特異的組込み事象を増加させるための方法及び組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年9月10日に出願された米国仮特許出願第63/076,705号の優先権を主張する。
本開示は、植物における卵細胞及び胚組織中での誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸の発現と関連する組成物及び方法に関する。
配列表の組込み
175,219バイト(MS-Windows(登録商標)で測定)であり、2021年9月9日に作成されたファイル名「P34738WO00_SL.txt」に含まれる配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、その全体が参照により組み込まれる。
CRISPR(クラスター化され、規則的な間隔の短い回文構造の繰り返し)ヌクレアーゼ(例えば、Cas12a、CasX、Cas9)は、標的核酸分子にガイドRNAによって誘導されるタンパク質であり、そのヌクレアーゼは標的核酸分子の1つ又は2つの鎖を切断することができる。
米国特許第6,437,217号 米国特許第5,641,876号 米国特許第6,426,446号 米国特許第6,429,362号 米国特許第6,232,526号 米国特許第6,177,611号 米国特許第5,322,938号 米国特許第5,352,605号 米国特許第5,359,142号 米国特許第5,530,196号 米国特許第6,433,252号 米国特許第6,429,357号 米国特許第5,837,848号 米国特許第6,294,714号 米国特許第6,140,078号 米国特許第6,252,138号 米国特許第6,175,060号 米国特許第6,635,806号 米国特許出願第09/757,089号 米国特許第6,051,753号 米国特許第5,378,619号 米国特許第5,850,019号 米国特許第5,106,739号 米国特許第6,096,950号 WO0011200A2 米国特許第6,635,806号 WO 2019/084148 米国特許第5,550,318号 米国特許第5,538,880号 米国特許第6,160,208号 米国特許第6,399,861号 米国特許第6,153,812号 米国特許第5,159,135号 米国特許第5,824,877号 米国特許第5,591,616号 米国特許第6,384,301号 米国特許第5,750,871号 米国特許第5,463,174号 米国特許第5,188,958号 米国特許第5,049,386号 米国特許第4,946,787号 米国特許第4,897,355号 WO91/17424 WO91/16024 WO2014/093622 米国特許第6,194,636号 米国特許第6,232,526号 米国特許出願公開第2004/0216189号 US20190169596 US20200080096
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一態様では、本開示は、(a)異種卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができ、複合体が標的配列の改変を誘導する、植物を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、半数体誘導系統のゲノム中に安定に組み込まれる。いくつかの実施形態は、植物によって産生される種子に関する。一部の実施形態では、種子は、第1の核酸配列又は第2の核酸配列を欠く同じ品種の対照植物に由来する種子と比較して、標的配列を含む目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含む。
一態様では、本開示は、(a)異種減数分裂細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができ、複合体が標的配列の改変を誘導する、植物を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、半数体誘導系統のゲノム中に安定に組み込まれる。
一態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が少なくとも1つの卵細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、半数体誘導系統のゲノム中に安定に組み込まれる。
一態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種減数分裂細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、減数分裂細胞は、半数体誘導系統に由来する。
一態様では、本開示は、植物細胞のゲノムを編集する方法であって、(a)第1の植物を第2の植物と交配させる工程であって、第1の植物が、異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列を含み、第2の植物が、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含み、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、工程;並びに(b)工程(a)の交配から少なくとも1つの胚を取得する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの胚中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、第1の植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の植物は、ハイブリッド誘導体である。
一態様では、本開示は、植物細胞のゲノムを編集する方法であって、(a)第1の植物を第2の植物と交配させる工程であって、第1の植物が、異種減数分裂細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列を含み、第2の植物が、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含み、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、工程;並びに(b)工程(a)の交配から少なくとも1つの胚を取得する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、半数体誘導系統のゲノム中に安定に組み込まれる。
一態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程;並びに(c)少なくとも1つの植物を受精させて、少なくとも1つの胚を作出する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、工程(c)に由来する少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が少なくとも1つの胚中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、第1の植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の植物は、ハイブリッド誘導体である。
一態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの卵細胞中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、半数体誘導系統のゲノム中に安定に組み込まれる。
一態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程;並びに(c)工程(b)に由来する少なくとも1つの植物を受精させて、少なくとも1つの胚を作出する工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの胚中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、改変は、導入遺伝子の挿入である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、第1の植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の植物は、ハイブリッド誘導体である。
一態様では、本開示は、(a)異種卵細胞優先的プロモーター、減数分裂細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、又はその両方は、半数体誘導系統のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、半数体誘導系統のゲノム中に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、(a)1つ又は複数のTALE結合部位及び最小プロモーターに作動可能に連結されたDNA改変酵素をコードする第1の核酸配列;並びに(b)卵細胞優先的プロモーター、減数分裂細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結されたTALEをコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、最小プロモーターが、1つ又は複数のTALE結合部位に結合するTALEの非存在下ではDNA改変酵素の発現を駆動しない、組換えDNA構築物に関する。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、第3のプロモーターに作動可能に連結されたガイド核酸をコードする第3の核酸配列を更に含む。一部の実施形態では、DNA改変酵素は、誘導型ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、DNA改変酵素及び最小プロモーターをコードする第1の核酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれより多くのTALE結合部位に作動可能に連結される。一部の実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物中での発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第3の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、及び/又は第3の核酸配列は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、植物は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、ガイド核酸は、ボンバードメントによって植物に提供される。いくつかの実施形態は、組換えDNA構築物を含む植物に関する。いくつかの実施形態は、組換えDNA構築物を含む植物によって産生される種子に関する。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、半数体誘導系統のゲノム中に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、(a)1つ又は複数のTALE結合部位及び最小プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第1の核酸配列;並びに(b)卵細胞優先的プロモーター、減数分裂細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結されたTALEをコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、最小プロモーターが、1つ又は複数のTALE結合部位に結合するTALEの非存在下ではガイド核酸の発現を駆動しない、組換えDNA構築物に関する。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、第3のプロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第3の核酸配列を更に含む。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、ガイド核酸及び最小プロモーターをコードする第1の核酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれより多くのTALE結合部位に作動可能に連結される。一部の実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第3の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第3の核酸配列は、植物中での発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第3の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第1の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の核酸配列、第2の核酸配列、及び/又は第3の核酸配列は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。一部の実施形態では、植物は、半数体誘導系統に由来する。いくつかの実施形態は、組換えDNA構築物を含む植物に関する。いくつかの実施形態は、組換えDNA構築物を含む植物によって産生される種子に関する。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、半数体誘導系統のゲノム中に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、(a)誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;(b)第1のプロモーターをコードする第2の核酸配列;及び(c)卵細胞優先的プロモーター、減数分裂細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結されたDNA改変酵素をコードする第3の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、第3の核酸が、第1の核酸と第2の核酸との間に位置し、第3の核酸が、5'末端にDNA改変酵素のための第1の標的部位及び5'末端にDNA改変酵素のための第2の標的部位を含む、組換えDNA構築物に関する。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、第3のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第4の核酸配列を更に含む。一部の実施形態では、DNA改変酵素は、リコンビナーゼである。一部の実施形態では、第1及び第2の標的部位は、Lox部位である。一部の実施形態では、DNA改変酵素は、エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、DNA改変酵素は、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第3のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。いくつかの実施形態は、組換えDNA構築物を含む植物に関する。いくつかの実施形態は、組換えDNA構築物を含む植物によって産生される種子に関する。一部の実施形態では、植物は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、組換えDNA構築物は、半数体誘導系統のゲノム中に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素の高レベルの卵、胚、及び/又は減数分裂組織特異的発現は、植物細胞に、1)転写活性化因子に融合されたdCas12a又はdCas9等の、CRISPRエフェクタータンパク質をコードする配列に作動可能に連結された、Table 1(表1)に記載のプロモーターを含む発現構築物;2)最小プロモーター及びDNA改変酵素をコードする配列に作動可能に連結された1つ又は複数の標的部位を含む発現構築物;並びに3)1つ又は複数の標的部位とハイブリダイズするガイドRNAをコードする発現構築物を提供すること;並びにそれから植物を生成することによって達成される。一部の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれより多くの標的部位は、最小プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、卵、胚、及び/又は減数分裂組織中で高レベルのDNA改変酵素を発現する雌性植物が生成される。一部の実施形態では、雌性植物は異種交配され、ユニークな編集を含むR1植物の集団が同定される。
いくつかの実施形態では、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素の高レベルの卵、胚、及び/又は減数分裂組織特異的発現は、植物細胞に、1)TALEをコードする配列に作動可能に連結された、Table 1(表1)に記載のプロモーターを含む発現構築物及び2)最小プロモーター及びDNA改変酵素をコードする配列に作動可能に連結された1つ又は複数のTALE結合部位(TB)を含む発現構築物を提供すること;並びにそれから植物を生成することによって達成される。一部の実施形態では、1つ又は複数のガイド核酸をコードする発現構築物が更に提供される。一部の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれより多くのTBは、最小プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、卵、胚、及び/又は減数分裂組織中で高レベルのDNA改変酵素を発現する雌性植物が生成される。一部の実施形態では、雌性植物は異種交配され、ユニークな編集を含むR1植物の集団が同定される。
いくつかの実施形態は、単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、(a)植物細胞に、異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生する工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、第1の植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程;(c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程;(d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程を含む、方法に関する。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、目的の遺伝子内にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質又は非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、トランス作用性siRNA、又はその前駆体からなる群から選択される非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の植物は、自家受粉される。一部の実施形態では、第1の植物は、異種交配される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、子孫植物は、半数体である。一部の実施形態では、方法は、標的部位での改変について半数体子孫をスクリーニングする工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、半数体植物のゲノムの倍加を誘導する工程を更に含む。
いくつかの実施形態は、単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、(a)植物細胞に、異種の第1のプロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生する工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、第1の植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程;(c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程;(d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程を含む、方法に関する。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、目的の遺伝子内にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質又は非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、トランス作用性siRNA、又はその前駆体からなる群から選択される非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、減数分裂細胞優先的プロモーターは、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の植物は、自家受粉される。一部の実施形態では、第1の植物は、異系交配される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、子孫植物は、半数体である。一部の実施形態では、方法は、標的部位での改変について半数体子孫をスクリーニングする工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、半数体植物のゲノムの倍加を誘導する工程を更に含む。
単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、(a)植物細胞に、異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生する工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、第1の植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの卵細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程;(c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程;(d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程を含む、方法。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、目的の遺伝子内にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質又は非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、トランス作用性siRNA、又はその前駆体からなる群から選択される非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の植物は、自家受粉される。一部の実施形態では、第1の植物は、異種交配される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、子孫植物は、半数体である。一部の実施形態では、方法は、標的部位での改変について半数体子孫をスクリーニングする工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、半数体植物のゲノムの倍加を誘導する工程を更に含む。
単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、(a)植物細胞に、異種の第1のプロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生する工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、第1の植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの卵細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程;(c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程;(d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程を含む、方法。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、目的の遺伝子内にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質又は非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、トランス作用性siRNA、又はその前駆体からなる群から選択される非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、卵細胞優先的プロモーターは、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の植物は、自家受粉される。一部の実施形態では、第1の植物は、異種交配される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、子孫植物は、半数体である。一部の実施形態では、方法は、標的部位での改変について半数体子孫をスクリーニングする工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、半数体植物のゲノムの倍加を誘導する工程を更に含む。
単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、(a)植物細胞に、異種胚細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生する工程、(c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、胚細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、胚細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程;(d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程を含む、方法。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、目的の遺伝子内にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質又は非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、トランス作用性siRNA、又はその前駆体からなる群から選択される非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、PolIIIプロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第2のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の植物は、自家受粉される。一部の実施形態では、第1の植物は、異種交配される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、子孫植物は、半数体である。一部の実施形態では、方法は、標的部位での改変について半数体子孫をスクリーニングする工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、半数体植物のゲノムの倍加を誘導する工程を更に含む。
単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、(a)植物細胞に、異種の第1のプロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び異種胚細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生する工程、(c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、胚細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、胚細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程;(d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程を含む、方法。一部の実施形態では、改変は、ゲノムの二本鎖DNA分子内の互い違いの切断である。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。一部の実施形態では、標的配列は、目的の遺伝子内にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、タンパク質又は非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、トランス作用性siRNA、又はその前駆体からなる群から選択される非タンパク質コードRNAをコードする。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRエフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a(例えば、LbCas12a、FnCas12a)及びCasXからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、配列番号7と少なくとも90%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、植物のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、第1の核酸配列は、少なくとも1つの核局在化シグナルをコードする。一部の実施形態では、少なくとも1つの核局在化シグナルは、配列番号8及び9からなる群から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞優先的、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、減数分裂細胞特異的、卵細胞特異的又は胚組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、Adf1プロモーター及びEAL1プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、配列番号1～6、21～45及び65～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第1のプロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、Rab15プロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列は、1つ又は複数の自己切断性リボザイムに作動可能に連結される。一部の実施形態では、第1の植物は、自家受粉される。一部の実施形態では、第1の植物は、異種交配される。一部の実施形態では、植物細胞は、半数体誘導系統に由来する。一部の実施形態では、子孫植物は、半数体である。一部の実施形態では、方法は、標的部位での改変について半数体子孫をスクリーニングする工程を更に含む。一部の実施形態では、方法は、半数体植物のゲノムの倍加を誘導する工程を更に含む。
生殖プロモーターを用いた正逆F1植物における編集。トランスジェニックR1系統を、雌性又は雄性として使用して、正逆F1を生成した。黒色のバーは、F1植物中に存在する新しい編集によって示されるように、雌性又は雄性の親によって提供された場合に活性なLbCas12aを示す事象のパーセントを表す。灰色のバーは、新しい編集を含有するF1個体のパーセントである。明灰色のバーは、F1中に見出されるユニークな編集の数である。 LbCas12aのTALE誘導性発現のために設計されたベクターを図示する。35S(-46)は、35S最小プロモーターである。TBは、TALE結合部位を示す。 トウモロコシ葉プロトプラストにおけるCas12a及びTALEのRNA発現。 植物体におけるLbCas12aのTALE誘導性減数分裂細胞/胚/卵細胞優先的発現のために設計されたT-DNAベクターを図示する。LBは、左境界を示す。RBは、右境界を示す。Pは、プロモーターを示す。35S(-46)は、35S最小プロモーターである。TBは、TALE結合部位である。 強力な構成的プロモーターによって駆動されるCas12aの減数分裂細胞/胚/卵細胞優先的発現のために設計されたT-DNAベクターを図示する。Pは、プロモーターを示す。Creは、Creリコンビナーゼに関する。矢頭は、方向性を表す。
別途定義しない限り、使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ある用語が単数形で提供される場合、本発明者らはまた、複数のその用語によって記載される本開示の態様も企図する。参照により組み込まれる参考文献で使用される用語及び定義に相違がある場合、本出願で使用される用語は、本明細書で与えられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、種々の業界で特異的な辞書、例えば、「The American Heritage(登録商標)Science Dictionary」(Editors of the American Heritage Dictionaries、2011、Houghton Mifflin Harcourt、Boston and New York)、「McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms」(第6版、2002、McGraw-Hill、New York)、又は「Oxford Dictionary of Biology」(第6版、2008、Oxford University Press、Oxford and New York)によって例示されるように、それらが使用される業界におけるその通常の意味を有する。本発明者らは、作用機構又は作用様式に限定されることを意図しない。その参考文献は、例示目的のみで提供される。
本開示の実施は、別途指摘しない限り、当技術分野の技術の範囲内である、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、植物生物学、ゲノミクス、バイオテクノロジー、及び遺伝学の従来の技術を含む。例えば、Green and Sambrook、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第4版(2012); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubelら(編)(1987)); Plant Breeding Methodology (N.F. Jensen、Wiley-Interscience (1988)); Methods In Enzymologyシリーズ(Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson、B. D. Hames and G. R. Taylor(編)(1995)); Harlow and Lane(編)(1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Animal Cell Culture (R. I. Freshney(編) (1987)); Recombinant Protein Purification: Principles And Methods、18-1142-75、GE Healthcare Life Sciences; C. N. Stewart、A. Touraev、V. Citovsky、T. Tzfira(編)(2011) Plant Transformation Technologies (Wiley-Blackwell);並びにR. H. Smith (2013) Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments (Academic Press, Inc.)を参照されたい。
例えば、全ての特許、公開特許出願、及び非特許刊行物を含む、本明細書で引用される参考文献はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
選択肢群が提示される場合、その選択肢群を構成するメンバーの任意且つ全ての組合せが具体的に想定される。例えば、ある項目が、A、B、C、及びDからなる群から選択される場合、本発明者らは、それぞれの選択肢を個別に(例えば、Aのみ、Bのみなど)、並びにA、B、及びD;A及びC;B及びC等の組合せを具体的に想定する。
本明細書で使用される場合、単数での用語並びに単数形の「a」、「an」及び「the」は、例えば、本文が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で提供される、任意の組成物、核酸分子、ポリペプチド、細胞、植物等は、本明細書で提供される任意の方法と共に使用するために具体的に想定される。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、植物の卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中で優先的に、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼを発現させるための組成物及び方法に関する。一部の実施形態では、植物の卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中でのCRISPR/Cas編集システムの成分の優先的発現のための組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態は、卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中で、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼを優先的に提供する発現カセットを含む親から、ユニークな編集を有する子孫を産生するための組成物及び方法に関する。一部の実施形態では、卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中で優先的に、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼを優先的に発現する雌性親植物が提供される。一部の実施形態では、卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中で優先的に、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼを優先的に発現する雄性親植物が提供される。一部の実施形態では、2つ以上の種子がユニークな編集を含む種子の集団であって、卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中で優先的に、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼを発現する親から産生される、種子の集団が提供される。本明細書に記載の組成物及び方法において有用な発現エレメントの非限定例は、Table 1(表1)に提供される。
本明細書で使用される場合、「卵細胞」とは、植物の雌性配偶体によって産生される半数体卵細胞を指す。半数体花粉細胞による受精時に、二倍体接合子が形成され、胚を生じる。本明細書で使用される場合、「胚組織」とは、葉、茎、及び根組織のための前駆組織、並びに1つ又は複数の子葉を含む二倍体組織を指す。胚組織は、最終的には種子中に組み込まれる。胚が発芽し始めたら、苗又は植物体が生成される。本明細書で使用される場合、減数分裂とは、配偶子を産生する有性生殖生物中での細胞分裂のプロセスを指す。減数分裂は、最終的には4つの半数体細胞を生じる2回の細胞分裂を含む。減数分裂細胞とは、減数分裂を受ける細胞を指す。
ある態様では、本開示は、異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。ある態様では、本開示は、異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。ある態様では、本開示は、異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物細胞のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。
ある態様では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。ある態様では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。ある態様では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物細胞のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、組換えDNA構築物を提供する。
ある態様では、本開示は、異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、植物を提供する。ある態様では、本開示は、異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、植物を提供する。ある態様では、本開示は、異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、植物を提供する。
ある態様では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、植物を提供する。ある態様では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、植物を提供する。ある態様では、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(b)減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物を含む植物であって、少なくとも1つのガイド核酸が、植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、植物を提供する。
ある態様では、本開示は、本明細書で提供される任意の植物の種子を提供する。
核酸及びアミノ酸
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」の使用は、本開示をデオキシリボ核酸(DNA)を含むポリヌクレオチドに限定することを意図しない。例えば、リボ核酸(RNA)分子も想定される。当業者であれば、ポリヌクレオチド及び核酸分子が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合せを含んでもよいことを認識するであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然に存在する分子と、合成アナログとの両方を含む。本開示のポリヌクレオチドはまた、限定されるものではないが、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムループ構造等を含むあらゆる形態の配列も包含する。ある態様では、本明細書で提供される核酸分子は、DNA分子である。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、RNA分子である。ある態様では、本明細書で提供される核酸分子は、一本鎖である。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、二本鎖である。
本明細書で使用される場合、核酸(DNA又はRNA)分子、タンパク質、構築物、ベクター等を参照する用語「組換え」とは、ヒトの介入なくしては隣接して、若しくはごく近くに天然に存在しないポリヌクレオチド若しくはタンパク質配列の組合せを含む、核酸(DNA又はRNA)分子、タンパク質、構築物等、及び/又は互いに関して異種である少なくとも2つのポリヌクレオチド若しくはタンパク質配列を含む、ポリヌクレオチド分子、タンパク質、構築物等を含む、人工のものであり、天然には通常見出されない、及び/又はそれが天然には通常見出されない状況で存在する核酸又はアミノ酸分子又は配列を指す。
一態様では、本明細書で提供される方法及び組成物は、ベクターを含む。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、外因性遺伝物質を細胞中に運搬するためのビヒクルとして使用されるDNA分子を指す。
ある態様では、ベクターに由来する1つ又は複数のポリヌクレオチド配列は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。ある態様では、ベクターに由来する1つ又は複数のポリヌクレオチド配列は、植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。
ある態様では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、単一のベクター中に提供される。別の態様では、第1の核酸配列は、第1のベクター中に提供され、第2の核酸配列は、第2のベクター中に提供される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、少なくとも2つの共有的に連結されたアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。ポリペプチドの例は、タンパク質である。本明細書で提供されるタンパク質は、本明細書で提供される核酸分子によってコードされてもよい。
核酸を、当技術分野で日常的な技術を使用して単離することができる。例えば、核酸を、限定されるものではないが、組換え核酸技術、及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なPCR技術は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual、Dieffenbach & Dveksler(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1995に記載されている。組換え核酸技術としては、例えば、核酸を単離するために使用することができる、制限酵素消化及びライゲーションが挙げられる。また、単離された核酸を、単一の核酸分子として、又は一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成することもできる。DEAEイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法によって天然源(例えば、生体試料)からポリペプチドを精製することができる。ポリペプチドを、例えば、発現ベクター中の核酸を発現させることによって精製することもできる。更に、精製されたポリペプチドを、化学合成によって取得することができる。ポリペプチドの純度を、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はHPLC分析を使用して測定することができる。
限定されるものではないが、核酸を、ハイブリダイゼーションを使用して検出することができる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Sambrookら(1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY)で詳細に考察されている。
ポリペプチドを、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が挙げられる。本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。本明細書で提供されるポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。本明細書で提供される抗体を、当技術分野で公知の方法を使用して、マイクロタイタープレート等の固相支持体に付着させることができる。
2つ以上のヌクレオチド又はタンパク質配列を参照して本明細書で使用される用語「パーセント同一性」又は「パーセント同一」は、(i)比較ウィンドウ上で2つの最適に整列された配列(ヌクレオチド又はタンパク質)を比較すること、(ii)両方の配列中に同一の核酸塩基(ヌクレオチド配列について)又はアミノ酸残基(タンパク質について)が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、(iii)一致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、次いで、(iv)この商に100%を乗じて、パーセント同一性を得ることによって算出される。「パーセント同一性」が特定の比較ウィンドウを特定せずに参照配列に関して算出される場合、パーセント同一性は、アラインメントの領域上の一致した位置の数を、参照配列の全長で除算することによって決定される。したがって、本出願の目的のために、2つの配列(クエリー及び対象)が最適に整列される時(そのアラインメントにおけるギャップを許容する)、クエリー配列に関する「パーセント同一性」は、その全長(又は比較ウィンドウ)にわたってクエリー配列中の位置の総数で除算した後、100%を乗じた2つの配列間の同一の位置の数に等しい。配列同一性のパーセンテージがタンパク質を参照して使用される場合、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が類似する化学的特性(例えば、電荷又は疎水性)を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させない、保存的アミノ酸置換によって異なることが多いと認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性を、上方に調整して、置換の保存的性質について補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。
2つのヌクレオチド配列を参照して本明細書で使用される用語「パーセント配列相補性」又は「パーセント相補性」は、パーセント同一性の概念と類似しているが、クエリー配列及び対象配列が線状に配置され、ループ、ステム又はヘアピン等の二次フォールディング構造なしに最適に塩基対形成する場合、対象配列のヌクレオチドと最適に塩基対形成するか、又はそれにハイブリダイズするクエリー配列のヌクレオチドのパーセンテージを指す。そのようなパーセント相補性は、2つのDNA鎖の間、2つのRNA鎖の間、又はDNA鎖とRNA鎖との間であってもよい。「パーセント相補性」を、(i)比較ウィンドウ上で線状且つ完全に伸びた配置(すなわち、フォールディング又は二次構造なし)の2つのヌクレオチド配列を最適に塩基対形成させるか、又はハイブリダイズさせること、(ii)比較ウィンドウ上の2つの配列間で塩基対形成する位置の数を決定して、相補的な位置の数を得ること、(iii)相補的な位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、及び(iv)この商に100%を乗じて、2つの配列のパーセント相補性を得ることによって算出することができる。2つの配列の最適な塩基対形成を、水素結合を介する、G-C、A-T、及びA-U等の公知のヌクレオチド塩基の対形成に基づいて決定することができる。「パーセント相補性」が特定の比較ウィンドウを特定せずに参照配列に関して算出される場合、パーセント同一性は、2つの線状配列間の相補的な位置の数を、参照配列の全長で除算することによって決定される。したがって、本出願の目的のために、2つの配列(クエリー及び対象)が最適に塩基対形成する時(ミスマッチ又は塩基対を形成しなかったヌクレオチドを許容する)、クエリー配列に関する「パーセント相補性」は、その全長にわたってクエリー配列中の位置の総数で除算した後、100%を乗じた2つの配列間の塩基対形成した位置の数に等しい。
配列のパーセント同一性を算出するためのそれらの最適なアラインメントのために、2つ以上のヌクレオチド又はタンパク質配列間の配列同一性又は類似性を比較するために使用することができる、ClustalW又はBasic Local Alignment Search Tool(BLAST(登録商標))等の、様々なペアワイズ又は多配列アラインメントアルゴリズム及びプログラムが当技術分野で公知である。他のアラインメント及び比較方法が当技術分野で公知であるが、2つの配列間のアラインメント及びパーセント同一性(上記のパーセント同一性範囲を含む)を、ClustalWアルゴリズムによって決定することができる。例えば、Chenna R.ら、「Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs」、Nucleic Acids Research 31: 3497～3500頁(2003); Thompson JDら、「Clustal W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice」、Nucleic Acids Research 22: 4673～4680頁(1994); Larkin MAら、「Clustal W and Clustal X version 2.0」、Bioinformatics 23: 2947～48頁(2007);及びAltschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990)「Basic local alignment search tool」、J. Mol. Biol. 215:403～410頁(1990)(これらの全内容及び開示は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、第1の核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切なin vitro及び/又はin vivo条件下、配列特異的、逆平行様式で(すなわち、核酸は相補的核酸に特異的に結合する)、非共有的相互作用(例えば、ワトソン-クリックの塩基対)により第2の核酸分子に「ハイブリダイズ」することができる。当技術分野で公知のように、標準的なワトソン-クリックの塩基対は、チミン(T)と対形成するアデニン(A)、ウラシル(U)と対形成するアデニン(A)、及びシトシンと対形成するグアニン(G)を含む。更に、2つのRNA分子(例えば、dsRNA)間のハイブリダイゼーションについては、グアニン塩基がウラシルと対形成することも当技術分野で公知である。例えば、G/U塩基対は、mRNA中のコドンと塩基対形成するtRNAアンチコドンの文脈において遺伝子コードの縮重性(すなわち、冗長性)を一部担っている。本開示の文脈では、対象DNA-標的化RNA分子のタンパク質結合セグメント(dsRNA二重鎖)のグアニンは、ウラシルと相補的であり、逆の場合も同じであると考えられる。そのため、G/U塩基対を、対象DNA-標的化RNA分子のタンパク質結合セグメント(dsRNA二重鎖)の所与のヌクレオチド位置で作製することができる場合、その位置は、非相補的であるとは考えられないが、その代わりに、相補的であると考えられる。
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、周知であり、Sambrook, J.、Fritsch, E. F.及びManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor (1989)、特に、その中のChapter 11及びTable 11.1;並びにSambrook, J. and Russell, W.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor (2001)に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定付ける。
ハイブリダイゼーションには、2つの核酸が相補的配列を含有することが必要であるが、塩基間のミスマッチはあってもよい。2つの核酸間のハイブリダイゼーションにとって適切な条件は、当技術分野で周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が高いほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関する融点(Tm)の値は高くなる。相補性の範囲が短い核酸(例えば、35以下のヌクレオチドにわたる相補性)間のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が重要になる(Sambrookらを参照されたい)。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも10ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さの例は、少なくとも15ヌクレオチド;少なくとも18ヌクレオチド;少なくとも20ヌクレオチド;少なくとも22ヌクレオチド;少なくとも25ヌクレオチド;及び少なくとも30ヌクレオチドである。更に、当業者であれば、温度及び洗浄溶液の塩濃度を、相補領域の長さ及び相補性の程度等の因子によって必要に応じて調整することができることを認識するであろう。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能又はハイブリダイズ可能であるその標的核酸の配列と100%相補的である必要はないことが当技術分野で理解される。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような1つ又は複数のセグメント(例えば、ループ構造又はヘアピン構造)にわたってハイブリダイズしてもよい。例えば、アンチセンス化合物の20個のヌクレオチドのうちの18個が標的領域と相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、90パーセントの相補性を表す。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドとクラスター化するか、又はそれが散在していてもよく、互いに、又は相補的ヌクレオチドと連続的である必要はない。核酸内の核酸配列の特定の範囲間のパーセント相補性を、当技術分野で公知のBLAST(登録商標)プログラム(basic local alignment search tools)及びPowerBLASTプログラム(Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215、403～410頁; Zhang and Madden、Genome Res.、1997、7、649～656頁を参照されたい)を使用して、又はSmith and Watermanのアルゴリズム(Adv. Appl. Math.、1981、2、482～489頁)を使用し、デフォルト設定を使用するGapプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix、Genetics Computer Group社、University Research Park、Madison Wis.)を使用することにより、日常的に決定することができる。
編集の生成
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、親植物の卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中で優先的に、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼを発現させることによって子孫植物のゲノム中で遺伝的編集を産生するための組成物及び方法に関する。一部の実施形態では、DNA改変酵素を発現する親植物は、雌性である。一部の実施形態では、DNA改変酵素を発現する親植物は、雄性である。
本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集」又は「編集」とは、部位特異的様式でのヌクレオチド配列の任意の改変を指す。本開示では、ゲノム編集技術は、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、デアミナーゼ、メチラーゼ、ヘリカーゼ及びその任意の組合せ等の、DNA改変酵素の使用を含む。ある態様では、「改変」は、シチジン又はデオキシシチジンの、それぞれ、ウリジン又はデオキシウリジンへの加水分解的脱アミノ化を含む。一部の実施形態では、配列特異的編集システムは、アデニンデアミナーゼを含む。ある態様では、「改変」は、アデニン又はアデノシンの加水分解的脱アミノ化を含む。ある態様では、「改変」は、アデノシン又はデオキシアデノシンの、それぞれ、イノシン又はデオキシイノシンへの加水分解的脱アミノ化を含む。ある態様では、「改変」は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも1000個、少なくとも1500個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、少なくとも5000個、又は少なくとも10,000個のヌクレオチドの挿入を含む。一部の実施形態では、「改変」は、1つ又は複数の導入遺伝子の挿入を含む。別の態様では、「改変」は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも1000個、少なくとも1500個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、少なくとも5000個、又は少なくとも10,000個のヌクレオチドの欠失を含む。更なる態様では、「改変」は、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも1000個、少なくとも1500個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、少なくとも5000個、又は少なくとも10,000個のヌクレオチドの反転を含む。更に別の態様では、「改変」は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも1000個、少なくとも1500個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、少なくとも5000個、又は少なくとも10,000個のヌクレオチドの置換を含む。更に別の態様では、「改変」は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも25個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも1000個、少なくとも1500個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、少なくとも5000個、又は少なくとも10,000個のヌクレオチドの重複を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「A」の「C」、「G」又は「T」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「C」の「A」、「G」又は「T」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「G」の「A」、「C」又は「T」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「T」の「A」、「C」又は「G」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「C」の「U」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「G」の「A」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「A」の「G」への置換を含む。一部の実施形態では、「改変」は、核酸配列中の「T」の「C」への置換を含む。
ある態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、工程を含む、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、工程を含む、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの卵細胞中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、工程を含む、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;並びに(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程であって、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの卵細胞中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、工程を含む、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物細胞のゲノムを編集する方法であって、(a)第1の植物を第2の植物と交配させる工程であって、第1の植物が、異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列を含み、第2の植物が、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含み、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、工程;並びに(b)工程(a)の交配から少なくとも1つの胚を取得する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの胚中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物細胞のゲノムを編集する方法であって、(a)第1の植物を第2の植物と交配させる工程であって、第1の植物が、異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列を含み、第2の植物が、胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含み、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、工程;並びに(b)工程(a)の交配から少なくとも1つの胚を取得する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの胚中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程;並びに(c)少なくとも1つの植物を受精させて、少なくとも1つの胚を作出する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、工程(c)に由来する少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの胚中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物のゲノムを編集する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸が、ゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程;並びに(c)少なくとも1つの植物を受精させて、少なくとも1つの胚を作出する工程を含み、誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイド核酸が、工程(c)に由来する少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの胚中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種減数分裂優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;及び(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの卵細胞中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、減数分裂優先的な第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;及び(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、植物の少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;及び(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの卵細胞中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;及び(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、卵細胞優先的な第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;及び(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、植物の少なくとも1つの卵細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの卵細胞中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;及び(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程;並びに(c)工程(b)に由来する少なくとも1つの植物を受精させて、少なくとも1つの胚を作出する工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの胚中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、植物において部位特異的組込みを生成する方法であって、(a)植物細胞に、(i)異種プロモーターに作動可能に連結された二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列;(ii)1つ又は複数のガイド核酸が、(A)植物のゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる;及び(B)目的の遺伝子をコードする核酸配列を挟む第1の部位及び第2の部位にハイブリダイズすることができる、胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された1つ又は複数のガイド核酸をコードする第2の核酸配列;並びに(iii)目的の遺伝子をコードする第3の核酸配列を導入する工程;(b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程;並びに(c)工程(b)に由来する少なくとも1つの植物を受精させて、少なくとも1つの胚を作出する工程を含み;誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAが、少なくとも1つの胚内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、標的配列、第1の部位、及び第2の部位内で二本鎖切断を生成し、目的の遺伝子が、少なくとも1つの胚中の標的部位に組み込まれる、方法を提供する。
調節エレメント
プロモーター、リーダー(5'UTRとしても知られる)、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域(又は3'UTR)等の調節エレメントは、生きている細胞中での遺伝子の全体的発現において統合的な役割を果たしている。本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」とは、遺伝子調節活性を有するDNA分子を指す。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子調節活性」とは、例えば、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の転写及び/又は翻訳に影響することによって、作動可能に連結された翻訳可能なDNA分子の発現に影響する能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン及び3'UTR等の調節エレメントは、遺伝子操作によって植物表現型を改変するのに有用である。調節エレメントは、その遺伝子発現パターン、例えば、構成的発現又は時間、空間、発生、組織、環境、生理、病理、細胞周期、及び/若しくは化学応答性発現、及びその任意の組合せ等の正及び/又は負の効果、並びに定量的若しくは定性的指標を特徴としてもよい。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現パターン」は、作動可能に連結されたDNA分子の、転写されるRNA分子への任意のパターンの転写である。転写されるRNA分子を、翻訳してタンパク質分子を産生することができるか、又はそれは二本鎖RNA(dsRNA)、転移RNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)等のアンチセンス又は他の調節RNA分子を提供することができる。本明細書で使用される場合、用語「タンパク質発現」は、転写されるRNA分子のタンパク質分子への任意のパターンの翻訳である。タンパク質発現は、その時間、空間、発生、又は形態学的品質、並びに定量的又は定性的指標を特徴としてもよい。
当技術分野で一般的に理解されるように、用語「プロモーター」とは、RNAポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び/又はTATAボックスを含有し、結合した転写可能なポリヌクレオチド配列及び/又は遺伝子(又は導入遺伝子)の転写及び発現を援助する、又は促進するDNA配列を指す。プロモーターを、遺伝子のゲノムコピーの5'非翻訳領域(5'UTR)から最初に単離することができる。プロモーターを、合成的に産生する、既知の、又は天然に存在するプロモーター配列又は他のプロモーター配列から変化させる、又は誘導することができる。プロモーターはまた、2つ以上の異種配列の組合せを含むキメラプロモーターを含んでもよい。したがって、本出願のプロモーターは、組成において類似するが、公知の、又は本明細書で提供される他のプロモーター配列と同一ではないプロモーター配列のバリアントを含んでもよい。プロモーターを、構成的、発生的、組織特異的、細胞周期特異的、誘導的等の、プロモーターに作動可能に連結された関連するコード又は転写可能配列又は遺伝子(導入遺伝子を含む)の発現パターンと関連する様々な基準に従って分類することができる。
一部の実施形態では、プロモーターは、リーダー配列の5'側に作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、用語「リーダー」とは、遺伝子の非翻訳5'領域(5'UTR)から単離され、一般的に、転写開始部位(TSS)とタンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントと定義されるDNA分子を指す。或いは、リーダーは、合成的に産生された、又は操作されたDNAエレメントであってもよい。リーダーを、作動可能に連結された転写可能なDNA分子の発現をモジュレートするための5'調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子を、異種プロモーターと共に、又はその天然プロモーターと共に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、2つ以上のエレメント間の機能的連結を指す。例えば、目的のポリヌクレオチドと、調節配列(例えば、プロモーター)との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結されたエレメントは、連続的又は非連続的であってもよい。
生物の特定の組織内で発現し、他の組織中では発現しないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと称される。生物の他の組織と比較して生物のある特定の組織中での増強された発現を駆動するプロモーターは、「組織優先的」プロモーターと称される。したがって、「組織優先的」プロモーターは、植物の特定の組織中で比較的高いか、又は優先的な発現を引き起こすが、植物の他の組織中ではより低レベルの発現を示す。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。更なる態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、組織優先的プロモーターである。ある態様では、組織優先的プロモーターは、組織特異的プロモーターを含む。
生物の減数分裂細胞内で発現し、非減数分裂細胞中では発現しないプロモーターは、「減数分裂細胞特異的」又は「減数分裂特異的」プロモーターと称される。生物の他の細胞と比較して生物の減数分裂細胞中での増強された発現を駆動するプロモーターは、「減数分裂細胞優先的」又は「減数分裂優先的」プロモーターと称される。したがって、「減数分裂細胞優先的」又は「減数分裂優先的」プロモーターは、減数分裂を受けている植物の細胞中で比較的高いか、又は優先的な発現を引き起こすが、植物の他の細胞中ではより低レベルの発現を示す。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、減数分裂特異的プロモーターである。更なる態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、減数分裂優先的プロモーターである。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、減数分裂特異的プロモーターを含む。細胞周期依存的様式で発現するプロモーターは、「細胞周期特異的」プロモーターと称される。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、細胞周期特異的プロモーターである。更なる態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、細胞周期優先的プロモーターである。ある態様では、細胞周期優先的プロモーターは、細胞周期特異的プロモーターを含む。
プロモーター活性の脱アミノ化を、当技術分野で標準的な任意の方法を使用して実施することができる。例えば、限定されるものではないが、目的のプロモーターを使用して、フルオロフォア又は他の報告分子の発現を駆動し、発現された分子の濃度を使用して、異なる細胞又は組織型におけるプロモーター活性を決定することができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、植物の卵、減数分裂、及び/又は胚細胞中での優先的な、DNA改変酵素、例えば、誘導型ヌクレアーゼの発現に関する。本明細書に記載の組成物及び方法において有用な発現エレメントの非限定例は、Table 1(表1)に提供される。
一実施形態では、Table 1(表1)に開示されたプロモーター配列の断片が提供される。プロモーター断片は、上記のような、卵、胚、及び/又は減数分裂発現活性を含んでもよく、単独で、又はキメラプロモーターの構築において、若しくは他の発現エレメント及び発現エレメント断片と組み合わせて等、他のプロモーター及びプロモーター断片と組み合わせて有用であり得る。一部の実施形態では、少なくとも約50個、少なくとも約75個、少なくとも約95個、少なくとも約100個、少なくとも約125個、少なくとも約150個、少なくとも約175個、少なくとも約200個、少なくとも約225個、少なくとも約250個、少なくとも約275個、少なくとも約300個、少なくとも約500個、少なくとも約600個、少なくとも約700個、少なくとも約750個、少なくとも約800個、少なくとも約900個、又は少なくとも約1000個の連続するヌクレオチドの、又はそれより長い、本明細書に開示されるプロモーター活性を有するDNA分子を含むプロモーターの断片が提供される。一部の実施形態では、少なくとも約50個、少なくとも約75個、少なくとも約95個、少なくとも約100個、少なくとも約125個、少なくとも約150個、少なくとも約175個、少なくとも約200個、少なくとも約225個、少なくとも約250個、少なくとも約275個、少なくとも約300個、少なくとも約500個、少なくとも約600個、少なくとも約700個、少なくとも約750個、少なくとも約800個、少なくとも約900個、少なくとも約1000個、少なくとも約1050個、少なくとも約1100個、又は少なくとも約1150個の連続するヌクレオチドの、TATAボックスを含み、本明細書に開示されるプロモーター活性を有する、配列番号1～6、21～45、65～69又は75～88に対する少なくとも約85パーセントの同一性、少なくとも約86パーセントの同一性、少なくとも約87パーセントの同一性、少なくとも約88パーセントの同一性、少なくとも約89パーセントの同一性、少なくとも約90パーセントの同一性、少なくとも約91パーセントの同一性、少なくとも約92パーセントの同一性、少なくとも約93パーセントの同一性、少なくとも約94パーセントの同一性、少なくとも約95パーセントの同一性、少なくとも約96パーセントの同一性、少なくとも約97パーセントの同一性、少なくとも約98パーセントの同一性、少なくとも約99パーセントの同一性、又は少なくとも約100パーセントの同一性を有するDNA配列を含むプロモーターの断片が提供される。出発プロモーター分子からそのような断片を産生するための方法は、当技術分野で周知である。
ある態様では、減数分裂細胞優先的又は減数分裂優先的プロモーターは、DMC1プロモーターを含む。ある態様では、減数分裂細胞優先的又は減数分裂優先的プロモーターは、Mps1プロモーターを含む。ある態様では、減数分裂細胞優先的又は減数分裂優先的プロモーターは、Adf1プロモーターを含む。ある態様では、減数分裂細胞優先的又は減数分裂優先的プロモーターは、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。
ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、誘導型ヌクレアーゼ等の、DNA改変酵素をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Table 1(表1)に記載された発現エレメントは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、DMC1プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、DMC1プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DMC1プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、Mps1プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、Mps1プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Mps1プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、Adf1プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、Adf1プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、Adf1プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも80%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも85%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも90%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも95%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも96%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも97%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも98%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と少なくとも99%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DMC1プロモーターは、配列番号4と100%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。
ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも80%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも85%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも90%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも95%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも96%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも97%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも98%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と少なくとも99%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Mps1プロモーターは、配列番号5と100%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。
ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも80%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも85%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも90%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも95%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも96%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも97%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも98%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と少なくとも99%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、Adf1プロモーターは、配列番号6と100%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。
ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも96%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも97%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも98%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも99%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、減数分裂優先的プロモーターは、配列番号4～6、83～85からなる群から選択される核酸配列と100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。
本明細書で使用される場合、「卵細胞優先的プロモーター」とは、植物の他の細胞又は組織型と比較して、卵細胞中でのより高い、又は優先的発現を示すプロモーターを指す。卵細胞優先的プロモーターは、限定されるものではないが、助細胞、反足細胞、中心細胞、外皮細胞、柱頭細胞、及び花柱細胞等の近隣細胞中での発現を示すことができる。卵細胞優先的プロモーターはまた、他の子房細胞、例えば、胚珠中での発現を示すこともできる。卵細胞優先的プロモーターが、卵細胞中でのより高い、又は優先的な発現を示す限り、卵細胞優先的プロモーターは、限定されるものではないが、花粉細胞、根細胞、胚細胞、茎細胞、分裂組織細胞、花細胞、及び葉細胞等の他の植物組織中での発現を示すこともできる。
本明細書で使用される場合、「卵細胞特異的プロモーター」とは、卵細胞中でのみ発現を示すプロモーターを指す。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、卵細胞特異的プロモーターを含む。
本明細書で使用される場合、「胚珠組織優先的プロモーター」とは、植物の他の細胞又は組織型と比較して、少なくとも1つ又は全部の胚珠組織中でのより高い、又は優先的発現を示すプロモーターを指す。種子植物では、胚珠は、雌性生殖細胞を生じ、それを含有する構造である。本明細書で使用される場合、胚珠は、初期には雌性配偶体の半数体組織を生じる非還元組織から構成される。雌性配偶体は、4つのユニークな細胞型: 1つの卵細胞、中心細胞、2つの助細胞及び3つ以上の反足細胞を含む、「成熟卵嚢」に更に発生する。本明細書で使用される場合、胚珠優先的プロモーターは、受粉前又は受粉後の胚珠中での発現を示すことができる。胚珠優先的プロモーターは、他の子房細胞中での発現を示すこともできる。
本明細書で使用される場合、「胚珠組織特異的プロモーター」とは、胚珠中でのみ発現を示すプロモーターを指す。ある態様では、胚珠組織優先的プロモーターは、胚珠組織特異的プロモーターを含む。
本明細書で使用される場合、「胚組織優先的プロモーター」とは、植物の他の細胞又は組織型と比較して、胚組織中でのより高い、又は優先的発現を示すプロモーターを指す。胚組織優先的プロモーターは、限定されるものではないが、胚乳細胞、子葉細胞、及び種皮細胞等の近隣細胞中での発現を示すことができる。胚組織優先的プロモーターが、胚組織中でより高い、又は優先的な発現を示す限り、胚組織優先的プロモーターは、限定されるものではないが、花粉細胞、根細胞、卵細胞、茎細胞、分裂組織細胞、花細胞、及び葉細胞等の他の植物組織中での発現も示すことができる。
本明細書で使用される場合、「胚特異的プロモーター」とは、胚組織中でのみ発現を示すプロモーターを指す。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、胚組織特異的プロモーターを含む。
本明細書で使用される場合、「接合子細胞優先的プロモーター」とは、植物の他の細胞又は組織型と比較して、接合子中でのより高い、又は優先的発現を示すプロモーターを指す。半数体花粉細胞による卵細胞の受精時に、二倍体接合子が形成され、胚を生じる。接合子組織優先的プロモーターが、接合子中でより高い、又は優先的な発現を示す限り、接合子細胞優先的プロモーターは、限定されるものではないが、花粉細胞、卵細胞、茎細胞、分裂組織細胞、胚乳細胞、子葉細胞、花細胞、葉細胞及び胚組織等の他の植物細胞中での発現も示すことができる。
本明細書で使用される場合、「接合子細胞特異的プロモーター」とは、接合子中でのみ発現を示すプロモーターを指す。ある態様では、接合子細胞優先的プロモーターは、接合子細胞特異的プロモーターを含む。
受粉時の受精卵は接合子に発生し、これは胚組織を生じるため、同プロモーターは両方とも、卵細胞優先的、接合子細胞優先的及び胚組織優先的であってよいことが理解されるであろう。
ある態様では、胚組織優先的又は胚組織特異的プロモーターは、DSUL1プロモーターを含む。ある態様では、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターは、EA1プロモーターを含む。ある態様では、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターは、ES4プロモーターを含む。ある態様では、卵細胞優先的又は胚組織特異的プロモーターは、EAL1プロモーターを含む。ある態様では、卵細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターは、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。
ある態様では、DSUL1プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、DSUL1プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、DSUL1プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、EA1プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、EA1プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EA1プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、ES4プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、ES4プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、ES4プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、EAL1プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、EAL1プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸に作動可能に連結される。ある態様では、EAL1プロモーターは、TALEをコードする核酸に作動可能に連結される。
ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも80%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも85%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも90%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも95%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも96%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも97%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも98%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と少なくとも99%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、DSUL1プロモーターは、配列番号1と100%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。
ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも80%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも85%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも90%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも95%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも96%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも97%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも98%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と少なくとも99%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、EA1プロモーターは、配列番号2と100%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。
ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも80%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも85%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも90%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも95%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも96%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも97%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも98%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と少なくとも99%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。ある態様では、ES4プロモーターは、配列番号3と100%同一である核酸配列、又はその機能的断片を含む。
ある態様では、卵細胞優先的プロモーター、胚珠組織優先的プロモーター、接合子細胞優先的又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも80%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも96%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも97%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも98%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも99%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。ある態様では、卵細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターは、配列番号1～3、21～45、65～69、75～82、86～88からなる群から選択される核酸配列と100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む。
プロモーター配列の断片が、作動可能に連結された核酸分子の転写を駆動するように機能することができることは、当技術分野で理解されている。例えば、限定されるものではないが、1000bpのプロモーターが500bpにトランケートされ、500bpの断片が転写を駆動することができる場合、500bpの断片は、「機能的断片」と称される。
ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼ等の、DNA改変酵素をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞優先的プロモーターは、TALEをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼ等の、DNA改変酵素をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、卵細胞特異的プロモーターは、TALEをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼ等の、DNA改変酵素をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織優先的プロモーターは、TALEをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼ等の、DNA改変酵素をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、胚組織特異的プロモーターは、TALEをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、構成的プロモーターからの、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素の、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織優先的又は特異的発現を提供するための方法及び組成物に関する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素をコードする転写可能なポリヌクレオチドは、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中での優先的又は特異的な介在ポリヌクレオチド配列の切り出しによって構成的プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、介在配列は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現されるリコンビナーゼによって切り出される。一部の実施形態では、介在配列は、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって切り出される。
植物の全て又は多くの組織における発現を駆動するプロモーターは、「構成的」プロモーターと称される。発生のある特定の期間又は段階の発現を駆動するプロモーターは、「発生的」プロモーターと称される。「誘導的」プロモーターは、熱、低温、乾燥、光等の環境刺激、又は創傷若しくは化学物質適用等の他の刺激に応答して転写を開始するプロモーターである。プロモーターはまた、異種、同種、キメラ、合成等である等、その起源の観点から分類することもできる。
本明細書で使用される場合、プロモーターを参照する用語「異種」は、その関連する転写可能なDNA配列、コード配列若しくは遺伝子(若しくは導入遺伝子)に対して異なる起源を有する、及び/又は形質転換しようとする植物中には天然に存在しないプロモーター配列である。用語「異種」は、より広くは、プロモーターと、関連する転写可能なDNA配列、コード配列又は遺伝子等の、2つ以上のDNA分子又は配列の組合せを指してもよく、その場合、そのような組合せは人工のものであり、天然には通常見出されない。
ある態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、構成的プロモーターである。更に別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、誘導的プロモーターである。ある態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、及び誘導的プロモーターからなる群から選択される。
RNAポリメラーゼIII(PolIII)プロモーターを使用して、ガイドRNA等の非タンパク質コードRNA分子の発現を駆動することができる。ある態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、PolIIIプロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるPolIIIプロモーターは、非タンパク質コードRNAをコードする核酸分子に作動可能に連結される。更に別の態様では、本明細書で提供されるPolIIIプロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸分子に作動可能に連結される。更に別の態様では、本明細書で提供されるPolIIIプロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸分子に作動可能に連結される。更なる態様では、本明細書で提供されるPolIIIプロモーターは、CRISPR RNA(crRNA)をコードする核酸分子に作動可能に連結される。別の態様では、本明細書で提供されるPolIIIプロモーターは、トレーサーRNA(tracrRNA)をコードする核酸分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、非タンパク質コードRNA(例えば、gRNA、単一ガイドRNA、crRNA、tracrRNA等)をコードする核酸分子は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中での優先的又は特異的な介在ポリヌクレオチド配列の切り出しによってPolIIIプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、介在配列は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現されるリコンビナーゼによって切り出される。一部の実施形態では、介在配列は、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって切り出される。
PolIIIプロモーターの非限定例としては、U6プロモーター、H1プロモーター、5Sプロモーター、2型アデノウイルス(Ad2)VAIプロモーター、tRNAプロモーター、及び7SKプロモーターが挙げられる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Schramm and Hernandez、2002、Genes & Development、16:2593～2620頁を参照されたい。ある態様では、本明細書で提供されるPolIIIプロモーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、5Sプロモーター、2型アデノウイルス(Ad2)VAIプロモーター、tRNAプロモーター、及び7SKプロモーターからなる群から選択される。別の態様では、本明細書で提供されるガイドRNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、5Sプロモーター、2型アデノウイルス(Ad2)VAIプロモーター、tRNAプロモーター、及び7SKプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結される。別の態様では、本明細書で提供される単一ガイドRNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、5Sプロモーター、2型アデノウイルス(Ad2)VAIプロモーター、tRNAプロモーター、及び7SKプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結される。別の態様では、本明細書で提供されるCRISPR RNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、5Sプロモーター、2型アデノウイルス(Ad2)VAIプロモーター、tRNAプロモーター、及び7SKプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結される。別の態様では、本明細書で提供されるトレーサーRNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、5Sプロモーター、2型アデノウイルス(Ad2)VAIプロモーター、tRNAプロモーター、及び7SKプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結される。
ある態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、ダリアモザイクウイルス(DaMV)プロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、U6プロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、アクチンプロモーターである。ある態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターである。ある態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
ある態様では、構成的プロモーターは、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモータープロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される。
本明細書で使用することができるプロモーターを記載する例としては、限定されるものではないが、米国特許第6,437,217号(トウモロコシRS81プロモーター)、米国特許第5,641,876号(コメアクチンプロモーター)、米国特許第6,426,446号(トウモロコシRS324プロモーター)、米国特許第6,429,362号(トウモロコシPR-1プロモーター)、米国特許第6,232,526号(トウモロコシA3プロモーター)、米国特許第6,177,611号(構成的トウモロコシプロモーター)、米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号及び第5,530,196号(35Sプロモーター)、米国特許第6,433,252号(トウモロコシL3オレオシンプロモーター)、米国特許第6,429,357号(コメアクチン2プロモーター並びにコメアクチン2イントロン)、米国特許第5,837,848号(根特異的プロモーター)、米国特許第6,294,714号(光誘導的プロモーター)、米国特許第6,140,078号(塩誘導的プロモーター)、米国特許第6,252,138号(病原体誘導的プロモーター)、米国特許第6,175,060号(リン欠乏誘導的プロモーター)、米国特許第6,635,806号(ガンマ-コイキシンプロモーター)、及び米国特許出願第09/757,089号(トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター)が挙げられる。有用であり得る更なるプロモーターは、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター(Ebertら、1987)、オクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導性プラスミド上に担持されている)、カリモウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)19Sプロモーター(Lawtonら、Plant Molecular Biology (1987) 9: 315～324頁)、CaMV 35Sプロモーター(Odellら、Nature (1985) 313: 810～812頁)、ゴマノハグサモザイクウイルス35S-プロモーター(米国特許第6,051,753号;同第5,378,619号)、スクロースシンターゼプロモーター(Yang and Russell、Proceedings of the National Academy of Sciences、USA (1990) 87: 4144～4148頁)、R遺伝子複合体プロモーター(Chandlerら、Plant Cell (1989) 1: 1175～1183頁)、及びクロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、PC1SV(米国特許第5,850,019号)、並びにAGRtu.nos(GenBank受託番号V00087; Depickerら、Journal of Molecular and Applied Genetics (1982) 1: 561～573頁; Bevanら、1983)プロモーターである。
プロモーターハイブリッドを使用及び構築して、転写活性を増強する(米国特許第5,106,739号を参照されたい)、又は所望の転写活性、誘導性及び組織特異性若しくは発生特異性を組み合わせることもできる。植物において機能するプロモーターとしては、限定されるものではないが、誘導的、ウイルス性、合成、構成的、時間調節性、空間調節性、及び空間-時間調節性であるプロモーターが挙げられる。組織増強性、組織特異的、又は発生調節性である他のプロモーターも当技術分野で公知であり、本開示の実施において有用であると想定される。
ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、構成的プロモーターは、Creが卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で優先的又は選択的に発現される、介在Cre発現カセットのCre媒介性切り出しによって、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
ある態様では、誘導的プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、誘導的プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、誘導的プロモーターは、TALEをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
ある態様では、発生的プロモーターは、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、CasXヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、ガイド核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、単一ガイドRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、ガイドRNA酸は、自己切断性リボザイムによって挟まれている。ある態様では、発生的プロモーターは、リコンビナーゼ(例えば、Creリコンビナーゼ)をコードする核酸配列に作動可能に連結される。ある態様では、発生的プロモーターは、TALEをコードする核酸配列に作動可能に連結される。
本明細書で使用される場合、用語「リーダー」とは、遺伝子の転写開始部位(TSS)と、タンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントを指す。それは、遺伝子のゲノムコピーの非翻訳5'領域から単離される。リーダーを、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調節するための5'調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子を、異種プロモーターと共に、又はその天然プロモーターと共に使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「3'転写終結分子」又は「3'UTR」とは、mRNA分子の3'非翻訳領域(3'UTR)を産生するために転写中に使用されるDNA配列を指す。ポリA尾部としても知られる、mRNA分子の3'非翻訳領域を、特異的切断及び3'ポリアデニル化によって生成することができる。3'UTRを、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結し、その下流に配置することができ、それはポリアデニル化シグナル及び転写、mRNAのプロセシング、又は遺伝子発現に影響することができる他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリA尾部は、mRNAの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当技術分野における3'転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ3'領域(Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80: 4803～4807頁(1983)を参照されたい);コムギhsp17 3'領域;エンドウルビスコスモールサブユニット3'領域;ワタE6 3'領域(米国特許第6,096,950号);WO0011200A2に開示された3'領域;及びコイキシン3'UTR(米国特許第6,635,806号)である。3'UTRは、典型的には、特定の遺伝子の組換え発現にとって有益である。3'UTRを、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調節するための3'調節エレメントとして使用することができる。3'UTRを、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の組織/細胞優先的発現を調節するための3'調節エレメントとして使用することができる。3'UTRを、異種プロモーターと共に、又はその天然プロモーターと共に使用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態を実行するのに有用な3'UTRの非限定例としては、配列番号46～64、70～74、89～102が挙げられる。
DNA改変酵素
いくつかの実施形態は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中でのゲノム編集システムの1つ又は複数の成分の優先的又は特異的発現のための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態は、ゲノム編集システムの1つ又は複数の成分をコードする異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結された、Table 1(表1)に記載の遺伝子調節エレメントに関する。ゲノム編集システムを使用して、宿主細胞のゲノムに、1つ又は複数の挿入、欠失、置換、塩基改変、転座、又は反転を導入することができる。一部の実施形態では、Table 1(表1)に記載の遺伝子調節エレメントは、CRISPR-Casエフェクタータンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、又は転写活性化因子(TAL)タンパク質等の、配列特異的DNA改変酵素をコードする異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、配列特異的DNA改変酵素は、融合タンパク質であってよい。一部の実施形態では、配列特異的DNA改変酵素は、誘導型ヌクレアーゼであってよい。
誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸分子(例えば、ガイドRNA)と複合体(例えば、リボ核タンパク質)を形成し、次いで、その複合体を、標的配列内の標的部位に誘導するヌクレアーゼである。誘導型ヌクレアーゼの1つの非限定例は、CRISPRヌクレアーゼである。
CRISPR(クラスター化され、規則的な間隔の短い回文構造の繰り返し)ヌクレアーゼ(例えば、Cas9、CasX、Cas12a(Cpf1とも称される)、CasY)は、標的核酸分子にガイドRNA(「gRNA」)によって誘導される細菌に見出されるタンパク質であり、次いで、エンドヌクレアーゼは標的核酸分子の1つ又は2つの鎖を切断することができる。CRISPRヌクレアーゼの起源は細菌であるが、多くのCRISPRヌクレアーゼが、真核細胞中で機能することが示されている。
いかなる特定の科学的理論によっても制限されるものではないが、CRISPRヌクレアーゼは、相補的標的部位とハイブリダイズするガイドRNA(gRNA)と複合体を形成し、それによって、CRISPRヌクレアーゼを標的部位に誘導する。クラスIIのCRISPR-Casシステムでは、スペーサーを含むCRISPRアレイが、認識された侵入DNAとの遭遇中に転写され、低分子干渉CRISPR RNA(crRNA)にプロセシングされる。crRNAは、繰り返し配列及び侵入する病原体中の特定のプロトスペーサー配列と相補的であるスペーサー配列を含む。スペーサー配列は、真核ゲノム中の標的配列と相補的であるように設計することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、CRISPR-Casエフェクタータンパク質をコードする異種の転写可能なDNA分子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、CRISPR-Casエフェクタータンパク質は、I型CRISPR-Casシステム、II型CRISPR-Casシステム、III型CRISPR-Casシステム、IV型CRISPR-Casシステム、V型CRISPR-Casシステム、又はVI型CRISPR-Casシステムから選択される。CRISPR-Casエフェクタータンパク質の例としては、限定されるものではないが、Cas9、C2c1、C2c3、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas12a ( Cpf1とも称される)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas12i、Cas12g、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3''、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (Csnl及びCsx12としても知られる)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4 (dinG)、Csf5、Cas14a、Cas14b、及びCas14cエフェクタータンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、そのヌクレアーゼ活性部位(例えば、RuvC、HNH、及び/又はNUCドメイン)中に突然変異を含むCRISPR-Casエフェクタータンパク質に作動可能に連結される。そのヌクレアーゼ活性部位中に突然変異を有し、したがって、最早ヌクレアーゼ活性を含まないCRISPR-Casエフェクタータンパク質は、一般的には、「デッド」、例えば、dCasと称される。一部の実施形態では、そのヌクレアーゼ活性部位中に突然変異を有するCRISPR-Casエフェクタータンパク質ドメイン又はポリペプチドは、突然変異がない同じCRISPR-Casエフェクタータンパク質と比較して、損なわれた活性又は低下した活性を有してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節エレメントは、そのヌクレアーゼ活性部位中に突然変異を有するCRISPR-Casエフェクタータンパク質に作動可能に連結され、逆転写酵素に作動可能に連結されたニッカーゼ活性を生成する。
CRISPRエフェクタータンパク質は、その活性形態でその対応するcrRNAと結合する。クラスIIエンドヌクレアーゼCas9と類似する、CasXは、機能的活性を有するために、トランス活性化crRNA(tracrRNA)と称される別の非コードRNA成分を必要とする。本明細書で提供される核酸分子は、crRNAとtracrRNAとを、本明細書では「単一ガイドRNA」(sgRNA)と称される1つの核酸分子に組み合わせることができる。Cas12aは、tracrRNAを標的部位に誘導することは必要ない;Cas12aについては、crRNAのみで十分である。gRNAは、活性CRISPRヌクレアーゼ複合体を標的部位に誘導し、そこでCRISPRヌクレアーゼは標的部位を切断することができる。
CRISPRエフェクタータンパク質及びガイドRNAが複合体を形成する場合、システム全体は「リボ核タンパク質」と呼ばれる。本明細書で提供されるリボ核タンパク質はまた、更なる核酸又はタンパク質を含んでもよい。
ある態様では、CRISPRエフェクタータンパク質及びガイド核酸は、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、CRISPRエフェクタータンパク質及びガイド核酸は、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、Cas9ヌクレアーゼ及びガイド核酸は、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、Cas9ヌクレアーゼ及びガイド核酸は、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、Cas12aヌクレアーゼ及びガイド核酸は、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼ及びガイド核酸は、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、CasXヌクレアーゼ及びガイド核酸は、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、CasXヌクレアーゼ及びガイド核酸は、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、CRISPRエフェクタータンパク質及びガイドRNAは、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、CRISPRエフェクタータンパク質及びガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、Cas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAは、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、Cas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、Cas12aヌクレアーゼ及びガイドRNAは、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼ及びガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、CasXヌクレアーゼ及びガイドRNAは、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、CasXヌクレアーゼ及びガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。ある態様では、誘導型ヌクレアーゼ及び単一ガイドRNAは、卵細胞中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、誘導型ヌクレアーゼ及び単一ガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、CasXヌクレアーゼ及び単一ガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。別の態様では、Cas9ヌクレアーゼ及び単一ガイドRNAは、胚組織中でリボ核タンパク質を形成する。
ある態様では、リボ核タンパク質は、卵細胞中の標的部位内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する。ある態様では、リボ核タンパク質は、胚組織中の標的部位内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する。ある態様では、リボ核タンパク質は、卵細胞中の標的部位内で少なくとも1つの一本鎖切断を生成する。ある態様では、リボ核タンパク質は、胚組織中の標的部位内で少なくとも1つの一本鎖切断を生成する。
CRISPRリボ核タンパク質による標的部位の切断のための必要条件は、標的部位の近くの保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の存在である。CRISPRヌクレアーゼに応じて、切断は、PAM部位からある特定の数のヌクレオチド内(例えば、Cas12aについては18～23ヌクレオチドの間)で起こり得る。PAM部位は、I型及びII型CRISPR関連タンパク質についてのみ必要であり、異なるCRISPRエンドヌクレアーゼは、異なるPAM部位を認識する。限定されるものではないが、Cas12aは、少なくとも以下のPAM部位:TTTN、及びYTNを認識することができる;CasXは、少なくとも以下のPAM部位:TTCN、TTCA、及びTTC(ここで、Tはチミンであり;Cはシトシンであり;Aはアデニンであり;Yはチミン又はシトシンであり;Nはチミン、シトシン、グアニン、又はアデニンである)を認識することができる。
Cas12aは、クラスIIのV型CRISPR/CasシステムのRNA誘導型ヌクレアーゼである。Cas12aヌクレアーゼは、二本鎖DNA分子を切断する場合に互い違いの切断を生成する。二本鎖DNAの互い違いの切断は、少なくとも1つのヌクレオチドの一本鎖DNA突出部をもたらす。これは、二本鎖DNAを切断する時に一本鎖DNA突出部をもたらさない、平滑末端切断(Cas9によって生成されるもの等)とは対照的である。
ある態様では、本明細書で提供されるCas12aヌクレアーゼは、ラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)のCas12a(LbCas12a)ヌクレアーゼである。別の態様では、本明細書で提供されるCas12aヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)のCas12a(FnCas12a)ヌクレアーゼである。ある態様では、Cas12aヌクレアーゼは、LbCas12a及びFnCas12aからなる群から選択される。
ある態様では、Cas12aヌクレアーゼ、又はCas12aヌクレアーゼをコードする核酸は、ストレプトコッカス(Streptococcus)、カンピロバクター(Campylobacter)、ニトラティフラクター(Nitratifractor)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、パルビバクラム(Parvibaculum)、ロゼブリア(Roseburia)、ナイセリア(Neisseria)、グルコナセトバクター(Gluconacetobacter)、アゾスピリルム(Azospirillum)、スピロヘータ(Sphaerochaeta)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、コリネバクター(Corynebacter)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、ロドバクター(Rhodobacter)、リステリア(Listeria)、パルジバクター(Paludibacter)、クロストリジウム(Clostridium)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、クロストリジアリジウム(Clostridiaridium)、レプトトリキア(Leptotrichia)、フランシセラ(Francisella)、レジオネラ(Legionella)、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)、メタノメチオフィルス(Methanomethyophilus)、ポルフィロモナス(Porphyromonas)、プレボテラ(Prevotella)、バクテロイデテス(Bacteroidetes)、ヘルココッカス(Helcococcus)、レトスピラ(Letospira)、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)、デスルホナトロナム(Desulfonatronum)、オピトゥトゥス科(Opitutaceae)、ツベリバチルス(Tuberibacillus)、バチルス(Bacillus)、ブレビバチルス(Brevibacilus)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、アシドアミノコッカス(Acidaminococcus)、ペレグリニバクテリア(Peregrinibacteria)、ブチリビブリオ(Butyrivibrio)、パルクバクテリア(Parcubacteria)、スミセラ(Smithella)、カンジダタス(Candidatus)、モラクセラ(Moraxella)、及びレプトスピラ(Leptospira)からなる群から選択される細菌属に由来する。
ある態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも80%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも95%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも96%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも97%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも98%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも99%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、Cas12aヌクレアーゼは、配列番号7からなる群から選択されるポリヌクレオチドと100%同一である配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
CasXは、細菌門デルタプロテオバクテリア及びプランクトミケスにおいて同定されたクラスIIのCRISPR-Casヌクレアーゼの型である。Cas12aと同様、CasXヌクレアーゼは、二本鎖DNA分子を切断する場合に互い違いの切断を生成する。しかしながら、Cas12aと違って、CasXヌクレアーゼは、標的核酸を標的化及び切断するために、crRNA及びtracrRNA、又は単一ガイドRNAを必要とする。
ある態様では、本明細書で提供されるCasXヌクレアーゼは、デルタプロテオバクテリア門に由来するCasXヌクレアーゼである。別の態様では、本明細書で提供されるCasXヌクレアーゼは、プランクトミケス門に由来するCasXヌクレアーゼである。限定されるものではないが、更なる好適なCasXヌクレアーゼは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO 2019/084148に記載のものである。
ある態様では、二本鎖DNA分子中で互い違いの切断を生成することができる誘導型ヌクレアーゼは、Cas12a及びCasXからなる群から選択される。ある態様では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas12a及びCasXからなる群から選択される。
ある態様では、誘導型ヌクレアーゼは、RNA誘導型ヌクレアーゼである。別の態様では、誘導型ヌクレアーゼは、CRISPRヌクレアーゼである。別の態様では、誘導型ヌクレアーゼは、Cas12aヌクレアーゼである。別の態様では、誘導型ヌクレアーゼは、CasXヌクレアーゼである。
本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」(NLS)とは、細胞の核への輸送のためのタンパク質を「タグ付けする」アミノ酸配列を指す。ある態様では、本明細書で提供される核酸分子は、核局在化シグナルをコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、2つ以上の核局在化シグナルをコードする。
ある態様では、本明細書で提供されるCRISPRエフェクタータンパク質は、核局在化シグナルを含む。ある態様では、本明細書で提供されるCas9エフェクタータンパク質は、核局在化シグナルを含む。ある態様では、核局在化シグナルは、Cas12aヌクレアーゼのN末端上に位置する。更なる態様では、核局在化シグナルは、Cas9エフェクタータンパク質のC末端上に位置する。更に別の態様では、核局在化シグナルは、Cas9エフェクタータンパク質のN末端とC末端との両方の上に位置する。
ある態様では、本明細書で提供されるCas12aエフェクタータンパク質は、核局在化シグナルを含む。ある態様では、核局在化シグナルは、Cas12aエフェクタータンパク質のN末端上に位置する。更なる態様では、核局在化シグナルは、Cas12aエフェクタータンパク質のC末端上に位置する。更に別の態様では、核局在化シグナルは、Cas12aエフェクタータンパク質のN末端とC末端との両方の上に位置する。
ある態様では、本明細書で提供されるCasXエフェクタータンパク質は、核局在化シグナルを含む。ある態様では、核局在化シグナルは、CasXエフェクタータンパク質のN末端上に位置する。更なる態様では、核局在化シグナルは、CasXエフェクタータンパク質のC末端上に位置する。更に別の態様では、核局在化シグナルは、CasXエフェクタータンパク質のN末端とC末端との両方の上に位置する。
ある態様では、リボ核タンパク質は、少なくとも1つの核局在化シグナルを含む。別の態様では、リボ核タンパク質は、少なくとも2つの核局在化シグナルを含む。ある態様では、本明細書で提供される核局在化シグナルは、配列番号8又は9によってコードされる。
様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏りを示す。コドンの偏り(生物間のコドン使用の差異)は、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳の効率と相関することが多く、次いで、特に、翻訳されるコドンの特性及び特定の転移RNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞中での選択されたtRNAの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて所与の生物中での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用表は、例えば、www[dot]kazusa[dot]or[dot]jp[forwards slash]codonで利用可能な「コドン使用データベース」で容易に利用可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適合させることができる。Nakamuraら、2000、Nucl. Acids Res. 28:292頁を参照されたい。特定の植物細胞中での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Gene Forge(Aptagen社; Jacobus、PA)等も利用可能である。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」とは、ある配列の少なくとも1個のコドン(例えば、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個又はそれより多くのコドン)を、元のアミノ酸配列を維持しながら(例えば、サイレント突然変異を導入する)、植物細胞の遺伝子中でより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の植物細胞中での発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを指す。
ある態様では、誘導型ヌクレアーゼをコードする配列中の1個又は複数のコドン(例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個又はそれより多くの、又は全部のコドン)は、特定のアミノ酸のための最も頻繁に使用されるコドンに対応する。別の態様では、Cas9エフェクタータンパク質、Cas12aエフェクタータンパク質又はCasXエフェクタータンパク質をコードする配列中の1個又は複数のコドン(例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個又はそれより多くの、又は全部のコドン)は、特定のアミノ酸のための最も頻繁に使用されるコドンに対応する。植物におけるコドン使用に関しては、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Campbell and Gowri、1990、Plant Physiol.、92: 1～11頁;及びMurrayら、1989、Nucleic Acids Res.、17:477～98頁が参照される。
ある態様では、核酸分子は、植物のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。ある態様では、核酸分子は、植物のためにコドン最適化されているCas9エフェクタータンパク質をコードする。ある態様では、核酸分子は、植物のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。ある態様では、核酸分子は、植物のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。
別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、植物細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、単子葉植物種のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、双子葉植物種のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、裸子植物種のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、被子植物種のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、トウモロコシ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ダイズ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、コメ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、コムギ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ワタ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ソルガム細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、アルファルファ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、サトウキビ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、トマト細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、キュウリ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ジャガイモ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、タマネギ細胞のためにコドン最適化されている誘導型ヌクレアーゼをコードする。
別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、植物細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、単子葉植物種のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、双子葉植物種のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、裸子植物種のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、被子植物種のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、トウモロコシ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ダイズ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、コメ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、コムギ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ワタ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ソルガム細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、アルファルファ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、サトウキビ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、シロイヌナズナ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、トマト細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、キュウリ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ジャガイモ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、タマネギ細胞のためにコドン最適化されているCas12aエフェクタータンパク質をコードする。
別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、植物細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、単子葉植物種のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、双子葉植物種のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、裸子植物種のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、被子植物種のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、トウモロコシ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ダイズ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、コメ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、コムギ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ワタ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ソルガム細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、アルファルファ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、サトウキビ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、シロイヌナズナ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、トマト細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、キュウリ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ジャガイモ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。更なる態様では、本明細書で提供される核酸分子は、タマネギ細胞のためにコドン最適化されているCasXエフェクタータンパク質をコードする。
ガイド核酸
本明細書で使用される場合、「ガイド核酸」とは、CRISPRエフェクタータンパク質(例えば、限定されるものではないが、Cas9、Cas12a、CasX)とのリボ核タンパク質(例えば、複合体)を形成した後、リボ核タンパク質を、標的核酸分子中の特定の配列に誘導し、そこで、ガイド核酸と、標的核酸分子とが、相補的配列を共有する、核酸を指す。ある態様では、本明細書で提供されるリボ核タンパク質は、少なくとも1つのガイド核酸を含む。
ある態様では、ガイド核酸は、DNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、RNAを含む。ある態様では、ガイド核酸は、DNA、RNA、又はその組合せを含む。ある態様では、ガイド核酸は、一本鎖である。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも部分的に二本鎖である。
ガイド核酸がRNAを含む場合、それを「ガイドRNA」と称することもできる。別の態様では、ガイド核酸は、DNA及びRNAを含む。別の態様では、ガイドRNAは、一本鎖である。別の態様では、ガイドRNAは、二本鎖である。更なる態様では、ガイドRNAは、部分的に二本鎖である。
ある態様では、ガイド核酸は、ガイドRNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも1つのガイドRNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも2つのガイドRNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも3つのガイドRNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも5つのガイドRNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも10のガイドRNAを含む。
別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも10個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも11個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも12個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも13個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも14個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも15個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも16個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも17個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも18個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも19個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも20個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも21個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも22個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも23個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも24個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも25個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも26個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも27個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも28個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも30個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも35個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも40個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも45個のヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも50個のヌクレオチドを含む。
別の態様では、ガイド核酸は、10ヌクレオチド～50ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、10ヌクレオチド～40ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、10ヌクレオチド～30ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、10ヌクレオチド～20ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、16ヌクレオチド～28ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、16ヌクレオチド～25ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、16ヌクレオチド～20ヌクレオチドを含む。
ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも70%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも75%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも80%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも85%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも90%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも91%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも92%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも93%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも94%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも95%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも96%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも97%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも98%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する少なくとも99%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する100%の配列相補性を含む。別の態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する70%～100%の配列相補性を含む。別の態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する80%～100%の配列相補性を含む。別の態様では、ガイド核酸は、標的部位に対する90%～100%の配列相補性を含む。ある態様では、ガイド核酸は、標的部位にハイブリダイズすることができる。
上記のように、CasX及びCas9等の一部の誘導型ヌクレアーゼは、機能的活性を有するために、トランス活性化crRNA(tracrRNA)と称される別の非コードRNA成分を必要とする。本明細書で提供されるガイド核酸分子は、crRNAとtracrRNAとを、本明細書では「単一ガイドRNA」(sgRNA)と称される1つの核酸分子に組み合わせることができる。gRNAは、活性CasX複合体を標的配列内の標的部位に誘導し、そこでCasXは標的部位を切断することができる。他の実施形態では、crRNA及びtracrRNAは、別々の核酸分子として提供される。ある態様では、ガイド核酸は、crRNAを含む。別の態様では、ガイド核酸は、tracrRNAを含む。更なる態様では、ガイド核酸は、sgRNAを含む。
標的部位
本明細書で使用される場合、「標的配列」とは、改変(例えば、切断、脱アミノ化、部位特異的組込み)が望まれるDNA分子の選択された配列又は領域を指す。標的配列は、標的部位を含む。
本明細書で使用される場合、「標的部位」とは、CRISPRエフェクタータンパク質によって改変される(例えば、切断される)標的配列の部分を指す。非標的核酸(例えば、非標的ssDNA)又は非標的領域とは対照的に、標的部位は、ガイド核酸又はガイドRNAに対する有意な相補性を含む。
ある態様では、標的部位は、ガイド核酸と100%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と99%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と98%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と97%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と96%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と95%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と94%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と93%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と92%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と91%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と90%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と85%相補的である。別の態様では、標的部位は、ガイド核酸と80%相補的である。
ある態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位を含む。ある態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位を含む核酸配列に隣接している。別の態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位の5ヌクレオチド以内にある。更なる態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位の10ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位の15ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位の20ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位の25ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的部位は、少なくとも1つのPAM部位の30ヌクレオチド以内にある。
ある態様では、標的部位は、遺伝子DNA内に位置する。別の態様では、標的部位は、遺伝子内に位置する。別の態様では、標的部位は、目的の遺伝子内に位置する。別の態様では、標的部位は、遺伝子のエクソン内に位置する。別の態様では、標的部位は、遺伝子のイントロン内に位置する。別の態様では、標的部位は、遺伝子の5'-UTR内に位置する。別の態様では、標的部位は、遺伝子の3'-UTR内に位置する。別の態様では、標的部位は、遺伝子間DNA内に位置する。
ある態様では、標的DNA分子は、一本鎖である。別の態様では、標的DNA分子は、二本鎖である。
ある態様では、標的配列は、ゲノムDNAを含む。ある態様では、標的配列は、核ゲノム内に位置する。ある態様では、標的配列は、染色体DNAを含む。ある態様では、標的配列は、プラスミドDNAを含む。ある態様では、標的配列は、プラスミド内に位置する。ある態様では、標的配列は、ミトコンドリアDNAを含む。ある態様では、標的配列は、ミトコンドリアゲノム内に位置する。ある態様では、標的配列は、プラスチドDNAを含む。ある態様では、標的配列は、プラスチドゲノム内に位置する。ある態様では、標的配列は、葉緑体DNAを含む。ある態様では、標的配列は、葉緑体ゲノム内に位置する。ある態様では、標的配列は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノム、及びプラスチドゲノムからなる群から選択されるゲノム内に位置する。
ある態様では、標的配列は、遺伝子DNAを含む。本明細書で使用される場合、「遺伝子DNA」とは、1つ又は複数の遺伝子をコードするDNAを指す。別の態様では、標的配列は、遺伝子間DNAを含む。遺伝子DNAとは対照的に、「遺伝子間DNA」は、非コードDNAを含み、遺伝子をコードするDNAを欠く。ある態様では、遺伝子間DNAは、2つの遺伝子の間に位置する。
ある態様では、標的配列は、遺伝子をコードする。本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、機能的単位(例えば、限定されるものではないが、タンパク質、又は非コードRNA分子)を産生することができるポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、1つ若しくは複数のエクソン、1つ若しくは複数のイントロン、5'-UTR、3'-UTR、又はその任意の組合せを含んでもよい。「遺伝子配列」は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、1つ若しくは複数のエクソン、1つ若しくは複数のイントロン、5'-UTR、3'-UTR、又はその任意の組合せをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。一態様では、遺伝子は、非タンパク質コードRNA分子又はその前駆体をコードする。別の態様では、遺伝子は、タンパク質をコードする。一部の実施形態では、標的配列は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、エクソン、イントロン、スプライス部位、5'-UTR、3'-UTR、タンパク質コード配列、非タンパク質コード配列、miRNA、プレmiRNA及びmiRNA結合部位からなる群から選択される。
非タンパク質コードRNA分子の非限定例としては、マイクロRNA(miRNA)、miRNA前駆体(プレmiRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子RNA(18～26ヌクレオチド長)及びそれをコードする前駆体、ヘテロクロマチンsiRNA(hc-siRNA)、Piwi結合RNA(piRNA)、ヘアピン二本鎖RNA(ヘアピンdsRNA)、トランス作用siRNA(ta-siRNA)、天然に存在するアンチセンスsiRNA(nat-siRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、トレーサーRNA(tracrRNA)、ガイドRNA(gRNA)、及び単一ガイドRNA(sgRNA)が挙げられる。ある態様では、非タンパク質コードRNA分子は、miRNAを含む。ある態様では、非タンパク質コードRNA分子は、siRNAを含む。ある態様では、非タンパク質コードRNA分子は、ta-siRNAを含む。ある態様では、非タンパク質コードRNA分子は、miRNA、siRNA、及びta-siRNAからなる群から選択される。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」とは、標的配列中に組み込まれるタンパク質若しくは非タンパク質コードRNA分子をコードするポリヌクレオチド配列、又は或いは、リボ核タンパク質によって編集されるタンパク質若しくは非タンパク質コードRNA分子をコードする内因性ポリヌクレオチド配列を指す。ある態様では、目的の遺伝子は、タンパク質をコードする。別の態様では、目的の遺伝子は、非タンパク質コードRNA分子をコードする。ある態様では、目的の遺伝子は、標的DNA分子に対して外因性である。ある態様では、目的の遺伝子は、標的DNA分子中の内因性遺伝子を置き換える。
突然変異
ある態様では、本明細書で提供されるリボ核タンパク質又は方法は、卵、胚、及び/又は減数分裂細胞の標的配列中で少なくとも1つの突然変異を生成する。
ある態様では、本明細書で提供される植物から産生される種子は、卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列又は異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸を欠く同じ系統又は品種の対照植物の種子と比較して、標的部位を含む目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含む。ある態様では、本明細書で提供される植物から産生される種子は、胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列又は異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸を欠く同じ系統又は品種の対照植物の種子と比較して、標的部位を含む目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含む。
ある態様では、本明細書で提供される植物から産生される種子は、異種プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列又は卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸を欠く同じ系統又は品種の対照植物の種子と比較して、標的部位を含む目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含む。ある態様では、本明細書で提供される植物から産生される種子は、異種プロモーターに作動可能に連結された誘導型ヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸を欠く同じ系統又は品種の対照植物の種子と比較して、標的部位を含む目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含む。
本明細書で使用される場合、「突然変異」とは、同じ生物に由来する天然に存在する参照核酸又はアミノ酸配列と比較した、核酸又はアミノ酸配列に対する天然には存在しない変更を指す。突然変異を同定する場合、参照配列は、同じ核酸(例えば、遺伝子、非コードRNA)又はアミノ酸(例えば、タンパク質)に由来するべきであることが理解されるであろう。2つの配列間の差異が突然変異を含むかどうかを決定する際に、2つの異なる種の相同配列間又は単一の種の2つの異なる品種の相同配列間で比較を行うべきではないことが当技術分野で理解されるであろう。むしろ、同じ生物の編集された(例えば、突然変異した)配列と、内因性の編集されていない(例えば、「野生型」)配列との間で比較を行うべきである。
いくつかの型の突然変異が、当技術分野で公知である。ある態様では、突然変異は、挿入を含む。「挿入」とは、内因性参照ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較した、それぞれ、所与のポリヌクレオチド又はアミノ鎖配列に対する1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の付加を指す。別の態様では、突然変異は、欠失を含む。「欠失」とは、内因性参照ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較した、それぞれ、所与のポリヌクレオチド又はアミノ鎖配列に対する1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の除去を指す。別の態様では、突然変異は、置換を含む。「置換」とは、内因性参照ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較した、それぞれ、所与のポリヌクレオチド又はアミノ鎖配列に対する1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の置き換えを指す。別の態様では、突然変異は、反転を含む。「反転」とは、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列のセグメントが末端から末端まで逆転している場合を指す。ある態様では、本明細書で提供される突然変異は、挿入、欠失、置換、及び反転からなる群から選択される突然変異を含む。
ある態様では、植物又は種子は、目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含み、少なくとも1つの突然変異は、野生型タンパク質と比較して、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質からの1つ又は複数のアミノ酸の欠失をもたらす。
ある態様では、植物又は種子は、目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含み、少なくとも1つの突然変異は、野生型タンパク質と比較して、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質内に1つ又は複数のアミノ酸の置換をもたらす。
ある態様では、植物又は種子は、目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を含み、少なくとも1つの突然変異は、野生型タンパク質と比較して、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質内に1つ又は複数のアミノ酸の挿入をもたらす。
遺伝子のコード領域中の突然変異(例えば、エクソン突然変異)は、突然変異したメッセンジャーRNA(mRNA)がタンパク質又はポリペプチドに翻訳される時にトランケートされたタンパク質又はポリペプチドをもたらし得る。ある態様では、本開示は、タンパク質又はポリペプチドのトランケーションをもたらす突然変異を提供する。本明細書で使用される場合、「トランケートされた」タンパク質又はポリペプチドは、内因性対照タンパク質又はポリペプチドと比較して、少なくとも1つ少ないアミノ酸を含む。例えば、内因性のプロテインAが100個のアミノ酸を含む場合、トランケート型のプロテインAは、1～99個のアミノ酸を含んでもよい。
いかなる科学的理論によっても制限されるものではないが、タンパク質又はポリペプチドのトランケーションを引き起こすための1つの方法は、内因性遺伝子のmRNA転写物への未成熟終止コドンの導入によるものである。ある態様では、本開示は、内因性遺伝子のmRNA転写物中に未成熟終止コドンをもたらす突然変異を提供する。本明細書で使用される場合、「終止コドン」とは、タンパク質翻訳の終結を伝えるmRNA転写物内のヌクレオチドトリプレットを指す。「未成熟終止コドン」とは、内因性mRNA転写物中の通常の終止コドン位置よりも早いところ(例えば、5'側)に位置する終止コドンを指す。限定されるものではないが、「UAG」、「UAA」、「UGA」、「TAG」、「TAA」、及び「TGA」を含む、いくつかの終止コドンが当技術分野で公知である。
ある態様では、種子又は植物は、少なくとも1つの突然変異を含み、少なくとも1つの突然変異は、野生型メッセンジャーRNAと比較して、目的の遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA中への未成熟終止コドンの導入をもたらす。
ある態様では、本明細書で提供される突然変異は、ヌル突然変異を含む。本明細書で使用される場合、「ヌル突然変異」とは、突然変異を含む遺伝子によってコードされるタンパク質に対して完全な機能喪失をもたらす突然変異、又は、或いは、ゲノム遺伝子座によってコードされる低分子RNAに対して完全な機能喪失をもたらす突然変異を指す。ヌル突然変異は、mRNA転写物産生の欠如、低分子RNA転写物産生の欠如、タンパク質機能の欠如、又はその組合せを引き起こし得る。
本明細書で提供される突然変異は、内因性遺伝子の任意の部分に位置してもよい。ある態様では、本明細書で提供される突然変異は、内因性遺伝子のエクソン内に位置する。別の態様では、本明細書で提供される突然変異は、内因性遺伝子のイントロン内に位置する。更なる態様では、本明細書で提供される突然変異は、内因性遺伝子の5'非翻訳領域内に位置する。更に別の態様では、本明細書で提供される突然変異は、内因性遺伝子の3'非翻訳領域内に位置する。更に別の態様では、本明細書で提供される突然変異は、内因性遺伝子のプロモーター内に位置する。
ある態様では、突然変異は、遺伝子内のスプライス部位に位置する。スプライス部位での突然変異は、mRNAプロセシング中のエクソンのスプライシングを阻害し得る。1つ又は複数のヌクレオチドがスプライス部位で挿入、欠失、又は置換される場合、スプライシングは摂動し得る。摂動したスプライシングは、成熟mRNA配列に由来する、スプライスされていないイントロン、失われるエクソン、又はその両方をもたらし得る。典型的には、いつもではないが、適切なスプライシングのためには、「GU」配列がイントロンの5'末端に必要とされ、「AG」配列がイントロンの3'末端に必要とされる。これらのスプライス部位のいずれかが突然変異している場合、スプライシングの摂動が起こり得る。
ある態様では、種子又は植物は、少なくとも1つの突然変異を含み、少なくとも1つの突然変異は、目的の遺伝子からの1つ又は複数のスプライス部位の欠失を含む。別の態様では、種子又は植物は、少なくとも1つの突然変異を含み、少なくとも1つの突然変異は、目的の遺伝子からの1つ又は複数のスプライス部位内に位置する。
ある態様では、突然変異は、部位特異的組込みを含む。ある態様では、部位特異的組込みは、標的配列への所望の配列の全部又は一部の挿入を含む。
本明細書で使用される場合、「部位特異的組込み」とは、植物ゲノム内の所望の部位又は遺伝子座(例えば、標的配列)に挿入される、又は組み込まれる所望の配列(例えば、外因性遺伝子、編集された内因性遺伝子)の全部、又は一部を指す。本明細書で使用される場合、「所望の配列」とは、植物又は植物細胞のゲノム中に組み込まれる核酸配列を含むDNA分子を指す。所望の配列は、導入遺伝子又は構築物を含んでもよい。ある態様では、所望の配列を含む核酸分子は、相同組換え及び/又は相同性指向修復によって標的化された挿入事象を促進するための所望の配列を挟む1つ又は2つのホモロジーアームを含む。
ある態様では、本明細書で提供される方法は、標的配列への所望の配列の部位特異的組込みを含む。
植物のゲノム内の任意の部位又は遺伝子座を、本開示の導入遺伝子又は構築物の部位特異的組込みのために選択することができる。ある態様では、標的配列は、B、又は過剰染色体内に位置する。
部位特異的組込みのために、本明細書で提供される誘導型ヌクレアーゼ又はリボ核タンパク質を介して二本鎖切断(DSB)又はニックを最初に標的配列で作製することができる。次いで、所望の配列の存在下で、DSB又はニックを、所望の配列及び標的配列のホモロジーアーム間の相同組換え(HR)によって、又は非相同末端結合(NHEJ)によって修復し、標的配列中に所望の配列の全部又は一部の部位特異的組込みをもたらし、DSB又はニックの部位での標的化された挿入事象を作出することができる。
ある態様では、部位特異的組込みは、細胞にとって内因性のNHEJ修復機構の使用を含む。別の態様では、部位特異的組込みは、細胞にとって内因性のHR修復機構の使用を含む。
ある態様では、二本鎖切断の修復は、同じ系統又は品種の対照植物と比較して、目的の遺伝子中に少なくとも1つの突然変異を生成する。
ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも5個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列分子の少なくとも10個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも15個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも20個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも25個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも100個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも250個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも1000個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の少なくとも2000個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。
ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～3500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～2500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～1500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～750個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～250個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の5個の連続するヌクレオチド～150個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の25個の連続するヌクレオチド～2500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の25個の連続するヌクレオチド～1500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の25個の連続するヌクレオチド～750個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の50個の連続するヌクレオチド～2500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の50個の連続するヌクレオチド～1500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の50個の連続するヌクレオチド～750個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の100個の連続するヌクレオチド～2500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の100個の連続するヌクレオチド～1500個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。ある態様では、突然変異は、標的配列への所望の配列の100個の連続するヌクレオチド～750個の連続するヌクレオチドの組込みを含む。
ある態様では、本明細書で提供される方法は、標的配列中の編集又は突然変異を検出することを含む。突然変異誘発された、又は編集された植物又は植物細胞のスクリーニング及び選択は、当業者には公知の任意の方法によるものであってよい。スクリーニング及び選択方法の例としては、限定されるものではないが、サザン分析、ポリヌクレオチドの検出のためのPCR増幅、ノーザンブロット、RNase保護、プライマー伸長、RNA転写物を検出するためのRT-PCR増幅、サンガー配列決定、次世代配列決定技術(例えば、Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、並びにポリペプチドを検出するための酵素結合イムノアッセイが挙げられる。in situハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色等の他の技術を使用して、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドの存在又は発現を検出することもできる。上で参照された全ての技術を実施するための方法は、当技術分野で公知である。
リコンビナーゼ
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織において部位特異的組換えを優先的又は特異的に誘導するための方法及び組成物に関する。本明細書に記載のいくつかの実施形態は、リコンビナーゼの卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織優先的又は特異的発現を提供するための方法及び組成物に関する。本明細書に記載のいくつかの実施形態は、部位特異的組換えを誘導して、DNA改変酵素をコードするポリヌクレオチドを構成的プロモーターに作動可能に連結することによって、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素を優先的又は特異的に発現させるための方法及び組成物に関する。一部の実施形態では、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素をコードする転写可能なポリヌクレオチドは、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中での優先的又は特異的な介在ポリヌクレオチド配列のリコンビナーゼ媒介性切り出しによって構成的プロモーターに作動可能に連結される。
DNA鎖の交換が、互いに少なくともいくらかの配列相同性を有するDNAセグメント間で起こる場合に、部位特異的組換えが起こる。部位特異的リコンビナーゼはまた、リコンビナーゼによって切断される、短い、特異的DNA配列であり、DNA鎖の交換、次いで、鎖修復を可能にする「組換え部位」を認識し、それに結合することもできる。典型的には、それぞれのリコンビナーゼタンパク質は、特異的でユニークな組換え部位に結合する。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」とは、DNA内の部位特異的組換え事象を触媒することができる酵素を指す。リコンビナーゼは、DNAを切り出す、DNAを挿入する、DNAを反転させる、DNAを転座させる、及び/又はDNAを交換することができる。
ある態様では、本開示は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で特異的又は優先的にリコンビナーゼを提供するための方法及び組成物を提供する。ある態様では、本開示は、Table 1(表1)に記載のプロモーターに作動可能に連結されたリコンビナーゼをコードする核酸配列を提供する。ある態様では、組換え核酸構築物は、Table 1(表1)に記載のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのリコンビナーゼをコードする配列を含む。ある態様では、Table 1(表1)に記載のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのリコンビナーゼをコードする配列を含む組換え核酸構築物は、DNA改変酵素、組換え部位によって挟まれた介在配列、及び構成的プロモーターをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物と共に植物細胞に提供され、ここで、介在配列の切り出しは、卵、胚、及び/又は減数分裂組織において優先的に、DNA改変酵素をコードするポリヌクレオチドを、構成的プロモーターに作動可能に連結する。
ある態様では、リコンビナーゼは、チロシンリコンビナーゼである。ある態様では、チロシンリコンビナーゼは、Creリコンビナーゼ及びFlpリコンビナーゼからなる群から選択される。
ある態様では、リコンビナーゼは、Creリコンビナーゼである。Cre-loxは、バクテリオファージP1に由来する部位特異的組換えシステムである。Cre-loxを使用して、核酸配列を反転させる、核酸配列を欠失させる、又は核酸配列を転座させることができる。このシステムでは、Creリコンビナーゼは、一対のlox核酸配列を組み換える。Lox部位は、34個のヌクレオチドを含み、最初と最後の13ヌクレオチド(アーム)はパリンドロームである。組換え中に、Creリコンビナーゼタンパク質は、異なる核酸上の2つのlox部位に結合し、lox部位で切断する。切断された核酸は、一緒にスプライシング(相互転座)され、組換えが完了する。
ある態様では、リコンビナーゼは、フリッパーゼ(Flp)である。Flp-FRT部位特異的組換えシステムは、パン酵母サッカロミセス・セレビジア(Saccharomyces cerevisiae)に由来する2μのプラスミドに由来し、Cre-loxシステムと類似している。Flpは、フリッパーゼ認識標的(FRT)部位間の組換えを誘導することができる。FRT部位は、34個のヌクレオチドを含む。FlpはFRT部位の「アーム」に結合し(一方のアームは逆向きにある)、介在核酸配列のいずれかの末端でFRT部位を切断する。切断後、Flpは、2つのFRT部位間で核酸配列を組み換える。
ある態様では、組換え部位は、lox部位である。ある態様では、lox部位は、loxP部位、lox2272部位、loxN部位、lox511部位、lox5171部位、lox71部位、lox66部位、loxLTR部位、M2部位、M3部位、M7部位、及びM11部位からなる群から選択される。ある態様では、組換え部位は、FRT部位である。
TALE
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物組織中で、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素を優先的に発現させるためのTALE活性化因子の使用に関する。いくつかの実施形態では、誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素の高レベルの卵、胚、及び/又は減数分裂組織特異的発現は、植物細胞に、1)TALEをコードする配列に作動可能に連結された、Table 1(表1)に記載のプロモーターを含む発現構築物及び2)最小プロモーター及びDNA改変酵素をコードする配列に作動可能に連結された1つ又は複数のTALE結合部位(TB)を含む発現構築物を提供すること;並びにそれから植物を生成することによる。一部の実施形態では、1つ又は複数のガイド核酸をコードする発現構築物が更に提供される。一部の実施形態では、DNA改変酵素の卵、胚、及び/又は減数分裂組織特異的発現のレベルを、TBの数を変更することによってモジュレートすることができる。
本明細書で使用される場合、「TALEタンパク質」とは、転写活性化因子様エフェクター(TALE)タンパク質又はその相同体を指す。TALEタンパク質は、植物病原性細菌属キサントモナス(Xanthomonas)又はラルストニア(Ralstonia)に由来するビルレンス因子として元々同定された。これらのタンパク質は、植物細胞中での宿主遺伝子の転写を変更するために植物病原性細菌によって分泌される。TALEタンパク質は、DNA結合リピートのドメインを介して、核中のDNAに結合し、そこで、それらは転写活性化因子として作用し、それによってビルレンスに寄与する。TALEは、核に移動し、そこで、それは宿主ゲノム中の特定の遺伝子の調節領域中の特定のDNA配列を認識し、それに結合する。TALEは、33～34アミノ酸の13～28のリピートモノマーから構成される中央DNA結合ドメインを有する。各モノマーのアミノ酸は、12及び13位の超可変性アミノ酸残基を除いて、高度に保存されている。2つの可変性アミノ酸は、リピート可変二残基(RVD)と呼ばれる。RVDのアミノ酸対NI、NG、HD、及びNNは、それぞれ、アデニン、チミン、シトシン、及びグアニン/アデニンを優先的に認識し、RVDのモジュレーションは、連続したDNA塩基を認識することができる。アミノ酸配列とDNA認識とのこの単純な関係は、適切なRVDを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによって特定のDNA結合ドメインの操作を可能にした。本明細書で使用される場合、「TALE結合部位」(TBS)とは、TALEタンパク質の「TALE DNA結合ドメイン」によって認識及び結合される特定のDNA配列を指す。
植物
任意の植物又は植物細胞を、本明細書で提供される方法及び組成物と共に使用することができる。ある態様では、植物は、トウモロコシ植物、コメ植物、ソルガム植物、コムギ植物、アルファルファ植物、オオムギ植物、キビ植物、ライムギ植物、サトウキビ植物、ワタ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物、トマト植物、タマネギ植物、キュウリ植物、シロイヌナズナ植物、及びジャガイモ植物からなる群から選択される。ある態様では、植物は、被子植物である。ある態様では、植物は、裸子植物である。ある態様では、植物は、単子葉植物である。ある態様では、植物は、双子葉植物である。ある態様では、植物は、ネギ科(Alliaceae)、ウルシ科(Anacardiaceae)、セリ科(Apiaceae)、ヤシ科(Arecaceae)、キク科(Asteraceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、ジャケツイバラ科(Caesalpiniaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、ツツジ科(Ericaceae)、マメ科(Fabaceae)、クルミ科(Juglandaceae)、アオイ科(Malvaceae)、ネムノキ科(Mimosaceae)、クワ科(Moraceae)、バショウ科(Musaceae)、ラン科(Orchidaceae)、マメ亜科(Papilionaceae)、マツ科(Pinaceae)、イネ科(Poaceae)、バラ科(Rosaceae)、ミカン科(Rutaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、及びナス科(Solanaceae)からなる群から選択される科の植物である。
ある態様では、植物細胞は、トウモロコシ細胞、コメ細胞、ソルガム細胞、コムギ細胞、アルファルファ細胞、オオムギ細胞、キビ細胞、ライムギ細胞、サトウキビ細胞、ワタ細胞、ダイズ細胞、キャノーラ細胞、トマト細胞、タマネギ細胞、キュウリ細胞、シロイヌナズナ細胞、及びジャガイモ細胞からなる群から選択される。ある態様では、植物細胞は、被子植物細胞である。ある態様では、植物細胞は、裸子植物細胞である。ある態様では、植物細胞は、単子葉植物細胞である。ある態様では、植物細胞は、双子葉植物細胞である。ある態様では、植物細胞は、ネギ科、ウルシ科、セリ科、ヤシ科、キク科、アブラナ科、ジャケツイバラ科、ウリ科、ツツジ科、マメ科、クルミ科、アオイ科、ネムノキ科、クワ科、バショウ科、ラン科、マメ亜科、マツ科、イネ科、バラ科、ミカン科、アカネ科、及びナス科からなる群から選択される科の植物細胞である。
本明細書で使用される場合、「品種」とは、その種内の他のあり得る品種からそれらを分離するある特定の遺伝的形質を共有する種(限定されるものではないが、トウモロコシ(Zea mays))内の植物群を指す。品種は、近交系又は交配種であってよいが、市販の植物は、雑種強勢を利用するために交配種であることが多い。交配種の栽培品種内の個体は、同種であり、ほぼ遺伝的に同一であり、多くの遺伝子座がヘテロ接合状態にある。
本明細書で使用される場合、「近交系」は、遺伝的均一性のために育種された系統を意味する。ある態様では、本明細書で提供される種子は、近交系種子である。ある態様では、本明細書で提供される植物は、近交系植物である。
本明細書で使用される場合、用語「交配種」とは、少なくとも2つの遺伝的に類似していない親間の交配の子孫を意味する。限定されるものではないが、交配スキームの例としては、単交雑、改変単交雑、二重改変単交雑、三系交雑、改変三系交雑、及び二重交雑が挙げられ、ここで、改変交雑中の少なくとも一方の親は、姉妹系統間の交雑の子孫である。ある態様では、本明細書で提供される種子は、交配種の種子である。ある態様では、本明細書で提供される植物は、交配種の植物である。
形質転換
方法は、本明細書で提供される任意の植物又は植物細胞中への任意の核酸分子の一過的形質転換又は安定な組込みを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「安定な組込み」又は「安定に組み込まれた」とは、標的細胞又は植物が形質転換された生物の次世代に、移行されるDNAを渡すのを可能にする、標的細胞又は植物のゲノムDNA中へのDNAの移行を指す。安定な形質転換には、形質転換される生物の生殖細胞内への移行されるDNAの組込みが必要である。本明細書で使用される場合、「一過的に形質転換された」又は「一過的形質転換」とは、形質転換される生物の次世代に移行しない、細胞中へのDNAの移行を指す。一過的形質転換では、形質転換されるDNAは、典型的には、形質転換される細胞のゲノムDNA中に組み込まれない。一態様では、方法は、植物細胞又は植物を、本明細書で提供される1つ又は複数の核酸分子で安定に形質転換する。別の態様では、方法は、植物細胞又は植物を、本明細書で提供される1つ又は複数の核酸分子を一過的に形質転換する。
ある態様では、誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸分子は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。ある態様では、Cas12aヌクレアーゼをコードする核酸分子は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。ある態様では、CasXヌクレアーゼをコードする核酸分子は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。ある態様では、ガイド核酸をコードする核酸分子は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。ある態様では、ガイドRNAをコードする核酸分子は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。ある態様では、単一ガイドRNAをコードする核酸分子は、植物のゲノム中に安定に組み込まれる。
細胞を、組換え核酸分子又は構築物で形質転換するためのいくつかの方法が当技術分野で公知であり、本出願の方法に従って使用することができる。当技術分野で公知の細胞の形質転換のための任意の好適な方法又は技術を、本発明の方法に従って使用することができる。植物の形質転換のための有効な方法としては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性又はリゾビウム(Rhizobium)媒介性形質転換等の細菌媒介性形質転換及びマイクロプロジェクタイルボンバードメント媒介性形質転換が挙げられる。細菌媒介性形質転換又はマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって形質転換ベクターを用いて外植片を形質転換した後、これらの外植片を培養等してトランスジェニック植物を再生又は発生させるための様々な方法が、当技術分野で公知である。
ある態様では、方法は、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、ポリエチレングリコール媒介性形質転換によって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、バイオリスティック形質転換によって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、リポソーム媒介性トランスフェクションによって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、ウイルス形質導入によって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、1つ又は複数の送達粒子の使用によって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、マイクロインジェクションによって細胞に核酸分子を提供することを含む。ある態様では、方法は、エレクトロポレーションによって細胞に核酸分子を提供することを含む。
ある態様では、核酸分子は、アグロバクテリウム媒介性形質転換、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介性トランスフェクション、ウイルス形質導入、1つ又は複数の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群から選択される方法によって細胞に提供される。
減圧浸潤、圧力、超音波処理、及びシリコンカーバイド繊維撹拌等の形質転換のための他の方法も当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の方法と共に使用することについて想定される。
細胞を形質転換する方法は、当業者には周知である。例えば、組換えDNAでコーティングされた粒子を用いるマイクロプロジェクタイルボンバードメント(例えば、バイオリスティック形質転換)によって植物細胞を形質転換するための特定の指示は、米国特許第5,550,318号;第5,538,880号;第6,160,208号;第6,399,861号;及び第6,153,812号に見出され、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、米国特許第5,159,135号;第5,824,877号;第5,591,616号;第6,384,301号;第5,750,871号;第5,463,174号;及び第5,188,958号に記載され、それらは全て参照により本明細書に組み込まれる。植物を形質転換するための更なる方法は、例えば、Compendium of Transgenic Crop Plants (2009) Blackwell Publishingに見出すことができる。当業者には公知の任意の適切な方法を使用して、本明細書で提供される核酸分子のいずれかで植物細胞を形質転換することができる。
リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号、及び第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商標)及びLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適であるカチオン性及び中性脂質としては、FelgnerのWO91/17424; WO91/16024に記載のものが挙げられる。送達は、細胞(例えば、in vitro若しくはex vivo投与)又は標的組織(例えば、in vivo投与)に対するものであってよい。
核酸分子の1つ又は複数のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその成分は、WO2014/093622で使用される通りである。ある態様では、核酸分子又はタンパク質を細胞に提供する方法は、送達粒子による送達を含む。ある態様では、核酸分子を植物細胞又は植物に提供する方法は、送達ベシクルによる送達を含む。ある態様では、送達ベシクルは、エキソソーム及びリポソームからなる群から選択される。ある態様では、核酸分子を植物細胞又は植物に提供する方法は、ウイルスベクターによる送達を含む。ある態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。別の態様では、核酸分子を植物細胞又は植物に提供する方法は、ナノ粒子による送達を含む。ある態様では、核酸分子を植物細胞又は植物に提供する方法は、マイクロインジェクションを含む。ある態様では、核酸分子を植物細胞又は植物に提供する方法は、ポリカチオンを含む。ある態様では、核酸分子を植物細胞又は植物に提供する方法は、カチオン性オリゴペプチドを含む。
ある態様では、送達粒子は、エキソソーム、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ナノ粒子、ポリカチオン、及びカチオン性オリゴペプチドからなる群から選択される。ある態様では、本明細書で提供される方法は、1つ又は複数の送達粒子の使用を含む。別の態様では、本明細書で提供される方法は、2つ以上の送達粒子の使用を含む。別の態様では、本明細書で提供される方法は、3つ以上の送達粒子の使用を含む。
核酸の植物細胞中への移行を容易にするための好適な薬剤としては、植物の外部の透過性を増大させる薬剤、又は植物細胞のオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドへの透過性を増大させる薬剤が挙げられる。組成物の植物細胞中への移行を容易にするためのそのような薬剤としては、化学的薬剤、又は物理的薬剤、又はその組合せが挙げられる。条件付けのための化学的薬剤としては、(a)界面活性剤、(b)有機溶媒、水性溶液、若しくは有機溶媒の水性混合物、(c)酸化剤、(e)酸、(f)塩基、(g)油、(h)酵素、又はそれらの組合せが挙げられる。
ポリヌクレオチドにより植物を透過に条件付けるのに有用な有機溶媒としては、DMSO、DMF、ピリジン、N-ピロリジン、ヘキサメチルホスホラミド、アセトニトリル、ジオキサン、ポリプロピレングリコール、水と混和するか、又は非水性系中でホスホヌクレオチドを溶解する他の溶媒(合成反応において使用されるもの等)が挙げられる。界面活性剤又は乳化剤を含む、又は含まない天然由来の、又は合成の油を使用することができ、例えば、植物起源の油、作物油(www(dot)herbicide(dot)adjuvants(dot)comでオンラインで公共的に利用可能な9th Compendium of Herbicide Adjuvantsに列挙されたもの等)、例えば、パラフィン油、ポリオール脂肪酸エステル、又はポリエチレンイミン若しくはN-ピロリジン等のアミド若しくはポリアミンで改変された短鎖分子を有する油を使用することができる。
有用な界面活性剤の例としては、脂肪酸のナトリウム又はリチウム塩(獣脂又は獣脂アミン又はリン脂質等)及び有機シリコーン界面活性剤が挙げられる。他の有用な界面活性剤としては、非イオン性有機シリコーン界面活性剤、例えば、トリシロキサンエトキシレート界面活性剤を含む有機シリコーン界面活性剤又はポリアルキレンオキシド改変ヘプタメチルトリシロキサンとアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルとのコポリマー(Silwet(登録商標)L-77として市販されている)等のシリコーンポリエーテルコポリマーが挙げられる。
有用な物理的薬剤は、(a)カーボランダム、コランダム、砂、カルサイト、軽石、ガーネット等の研磨剤、(b)カーボンナノチューブ等のナノ粒子又は(c)物理的な力を含んでもよい。カーボンナノチューブは、Kamら(2004) Am. Chem. Soc、126 (22):6850～6851頁、Liuら(2009) Nano Lett、9(3): 1007～1010頁、及びKhodakovskayaら(2009) ACS Nano、3(10):3221～3227頁によって開示されている。物理的な力の薬剤としては、加熱、冷却、陽圧の印加、又は超音波処理が挙げられる。方法の実施形態は、必要に応じて、インキュベーション工程、中和工程(例えば、酸、塩基、若しくは酸化剤を中和するため、又は酵素を不活化するため)、洗浄工程、又はその組合せを含んでもよい。本発明の方法は、ある特定の遺伝子のサイレンシングのため、増強された効果を有するであろう他の薬剤の適用を更に含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドが除草剤耐性を提供する遺伝子を調節するように設計される場合、その後の除草剤の適用は、除草剤の効能に対する劇的な効果を有し得る。
ポリヌクレオチドによる植物細胞の透過への実験室条件付けのための薬剤としては、例えば、化学的薬剤の適用、酵素処理、加熱若しくは冷却、陽圧若しくは陰圧を用いた処理、又は超音波処理が挙げられる。植物を畑において条件付けるための薬剤としては、界面活性剤及び塩等の化学的薬剤が挙げられる。
ある態様では、形質転換又はトランスフェクトされる細胞は、植物細胞である。形質転換のためのレシピエント植物細胞又は外植片標的としては、限定されるものではないが、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、分裂組織細胞、胚細胞、胚乳細胞、根細胞、新芽細胞、茎細胞、鞘細胞、花細胞、花房細胞、柄細胞、小花柄細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花托細胞、花弁細胞、萼片細胞、花粉細胞、葯細胞、花糸細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、師部細胞、つぼみ細胞、又は維管束組織細胞が挙げられる。別の態様では、本開示は、植物葉緑体を提供する。更なる態様では、本開示は、表皮細胞、孔辺細胞、トリコーム細胞、根毛細胞、貯蔵根細胞、又は塊茎細胞を提供する。別の態様では、本開示は、プロトプラストを提供する。別の態様では、本開示は、植物カルス細胞を提供する。稔性植物を再生することができる任意の細胞が、本開示の実施のための有用なレシピエント細胞として企図される。限定されるものではないが、未熟胚又は胚部分、苗の頂端分裂組織、小胞子等を含む種々の組織源からカルスを開始することができる。カルスとして増殖することができるこれらの細胞は、形質転換のためのレシピエント細胞として働くことができる。本開示のトランスジェニック植物を作製するための実用的な形質転換の方法及び材料(例えば、種々の培地及びレシピエント標的細胞、未熟胚の形質転換、及び稔性トランスジェニック植物のその後の再生)は、例えば、米国特許第6,194,636号及び第6,232,526号並びに米国特許出願公開第2004/0216189号に開示されており、それらは全て参照により本明細書に組み込まれる。形質転換された外植片、細胞又は組織を、当技術分野で公知のような、カルスの誘導、選択、再生等の更なる培養工程にかけることができる。組換えDNA挿入物を含有する形質転換された細胞、組織又は外植片を、当技術分野で公知の方法に従って、培養物、プラグ又は土壌中でトランスジェニック植物に増殖、発生又は再生させることができる。一態様では、本開示は、生殖物質ではなく、植物の自然の生殖を媒介しない植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、生殖物質であり、植物の自然の生殖を媒介する植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、光合成によってそれ自身を維持することができない植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、体細胞植物細胞を提供する。体細胞は、生殖系列細胞とは対照的に、植物の生殖を媒介しない。一態様では、本開示は、非生殖性植物細胞を提供する。
半数体/半数体誘導系統の使用
いくつかの実施形態は、半数体誘導技術と組み合わせた、本明細書に記載の方法及び組成物の使用に関する。本明細書で使用される場合、「半数体」細胞又は核は、単一セットの非対染色体(x)を含む。対照的に、「二倍体」細胞又は核は、相同的な対を形成することができる2つの完全なセットの染色体(2x)を含む。本明細書で使用される場合、「半数体植物」は、半数体核ゲノムを含む複数の細胞を含む胞子体を記載する。本明細書で提供される半数体植物は、母系半数体植物であってよく、これは、それがその母系核ゲノムを保持しながら、その父系核ゲノムを喪失していることを意味する。或いは、本明細書で提供される半数体植物は、父系半数体植物であってよく、これは、それがその父系核ゲノムを保持しながら、その母系核ゲノムを喪失していることを意味する。典型的には、母系ミトコンドリア及びプラスチド(例えば、葉緑体)ゲノムは、母系と父系との両方の半数体植物中で保持される。
一部の実施形態では、「倍加半数体(DH)」法が、ホモ接合性植物を迅速に産生するために使用される。DH植物の子孫は、遺伝的に均一な材料であり、育種家は、育種サイクルの早期段階で遺伝的に固定された材料上のその目的の形質を評価し、したがって、育種効率を増大させることができる(Gilles LMら、Curr Biol. 2017 Oct 23;27(20):R1095～R1097頁を参照されたい)。DH技術は、2つの主な工程に依拠する: (1)半数体胚又は植物体を生成するための半数体誘導系、及び(2)これらの植物体の二倍性を回復するための染色体倍加工程。
「半数体誘導(HI)」は、胚発生の間の親誘導株染色体の喪失を特徴とする一部の植物における現象である。本明細書で使用される場合、「半数体誘導(HI)植物」は、1セットの染色体を除去することによって子孫植物において半数化を誘導することができる植物である。母系半数体誘導は、送粉(雄性)親によって誘発される。父系半数体誘導は、雌性親によって誘発される。
半数体誘導系統は、特に、トウモロコシのための植物育種において日常的に使用されている。限定されるものではないが、ストック6、MHI(Moldovian Haploid Inducer)、中間体配偶体(ig1)突然変異、KEMS、RWK、ZEM、ZMS、KMSを含む、いくつかの公知の半数体誘導トウモロコシ系統が存在する。半数体誘導系統はまた、操作されたセントロメアヒストン3(CENH3)バリアントの使用によってシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、カラシナ(Brassica juncea)及びトウモロコシにおいて作出されている(Ravi and Chan. 2010. Nature. 464:615～6190頁を参照されたい)。一部の態様では、本明細書に記載の半数体誘導系統は、トウモロコシストック6系統、ig-1遺伝子座に突然変異を担持するトウモロコシ植物、MHI誘導系統、KEMS誘導系統、RWK誘導系統、ZEM誘導系統、ZMS誘導系統、KMS誘導系統を含む。一部の態様では、半数体誘導系統は、改変型MATRILINEAL/NOT LIKE DAD/ZmPHOSPHOLIPASE-A1 (MATL/NLD/ZmPLA1)遺伝子を含む。一部の態様では、本明細書に記載の半数体誘導系統は、改変型CEN H3バリアントを含む。
DH技術は作物の改良に対する種々の制約を克服するためのいくつかの異なる分子技術と共に使用することができるため、作物育種プログラムに対して半数体誘導系によってもたらされる利益は多様である。一例は、作物に対するゲノム編集技術の適用を拡大するための半数体誘導系の使用である。ゲノム編集成分(例えば、誘導型ヌクレアーゼに関する)を半数体誘導系統に導入した後、非誘導トウモロコシ系統と交配することができる。次いで、半数体子孫を、ヌクレアーゼ誘導性突然変異についてスクリーニングした後、ゲノム倍加を誘導して、二倍体の、編集成分を含有しない、ゲノム編集された栽培品種を産生する。この方法は、US20190169596 (出願番号US16/275200)に詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示を、ここで、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、特許請求の範囲を本開示に限定することを意図するものではなく、むしろ、ある特定の実施形態の例示であることを意図するものであることを理解すべきである。当業者が想到する例示される方法における任意の変化は、本開示の範囲内にあることが意図される。
(実施例1)
生殖細胞突然変異又は鋳型DNAの標的化された組込みを生成するための減数分裂卵細胞又は胚組織中でのCas12aの発現
減数分裂を受けるトウモロコシ卵細胞及び/又はトウモロコシ胚細胞(減数分裂細胞)中でCas12aを優先的に発現させるために、いくつかのアグロバクテリウムT-DNAベクターを生成した。Table 2(表2)を参照されたい。
これらのカセット中の植物コドン最適化されたLbCas12a配列(配列番号7)は、5'及び3'末端のNLS配列(配列番号8及び配列番号9)によって挟まれ、コメ脂質転移タンパク質(LTP)遺伝子(配列番号8としてUS20200080096に記載されている)に由来する転写終結配列に作動可能に連結された。それぞれのベクターはまた、PolIII ZmU6プロモーター(配列番号10)の制御下でユニークなトウモロコシゲノム部位(ZmTS1)を標的とするCas12a gRNAをコードする発現カセット;カセットが目的の遺伝子(GOI)に作動可能に連結された構成的プロモーターを含む、ZmTS1標的部位によって挟まれた発現カセット;及び除草剤グリホサートに対する耐性を付与する選択マーカーのための発現カセットも含有していた。トウモロコシ01DKD2栽培品種胚を、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって上記のベクターを用いて形質転換し、R0植物を、形質転換されたトウモロコシ細胞から再生させた。各構築物から生成した59～153個のR0苗に由来する葉試料から、DNAを抽出した。ゲノム標的部位を配列決定し、標的突然変異の存在について分析した。Taqmanに基づくアッセイも実施して、Cas12aを担持する構築物のコピー数を同定した。ZmDSULを除く全ての生殖プロモーターについて、R0世代のZmTS1部位に突然変異は検出されなかった。ZmDSUL:LbCas12a(構築物1)は、R0苗において約32%の標的部位突然変異率を示した(Table 3(表3)を参照されたい)。新しく形質転換された(又はR0)植物のZmTS1標的部位での突然変異の欠如が予想され、その場合、LbCas12a発現は生殖組織に限定される。
それぞれの形質転換された構築物に由来する20個のR0系統を成熟するまで増殖させ、それぞれの形質転換されたトウモロコシ植物に由来する少なくとも1つの穂を自家受粉させた。10個のR1系統を選択し、1系統あたり最大で16個の苗を成長させ、ZmTS1中の突然変異についてスクリーニングし、突然変異率(切断率)を算出した。Taqmanアッセイも実施して、LbCas12a発現カセットの存在及びコピー数を決定した。構築物2～5から生成された全ての系統間の全体の標的部位突然変異率は、約1.1%～14%の範囲であった。平均突然変異率をTable 3(表3)に示す。ZmDSUL::LbCas12a(構築物1)を発現する4個のR1苗を試験したところ、突然変異は観察されなかった。減数分裂を受ける細胞中でのCas12a及びその認識gRNAの同時発現は、ZmTS1標的部位での二本鎖切断を生成すると予想され、その後の不完全なDNA修復は、受粉によって作出された卵細胞及び胚においてユニークな突然変異を生成する。
個々のR0系統から生成されたR1植物における突然変異率は、Table 4(表4)～8(表8)に示されるように変化し得る。例えば、最も高い切断率のプロモーター、ZmES4では、単一コピーのCpf1カセットを有する一部の系統は、0%の突然変異率を示したが、別の系統は約11%の突然変異率を示した。観察された最も高い突然変異率は46%であり、2コピーのZmES4:LbCas12aを有するR0系統から生じたものであった。ZmES4:Cas12a植物では、試験した全ての系統間で一貫して、2コピーのCas12aを有するR0系統は、1コピーのRo系統よりも高い標的突然変異率を有していた(Table 7(表7)を参照されたい)。
標的突然変異率の信頼性を増大させるために、ZmES4:LbCas12a形質転換体から3個のR0系統を選択した。選択された系統について、152、112、及び86個のR1苗をスクリーニングした。その突然変異率は、それぞれ、74.2%、49.4%、及び8.3%であった。74.2%及び49.4%の突然変異率が観察された系統は、2コピーのZmES4:Cas12aを有するR0系統に由来するR1種子であった。
R1植物におけるユニークな標的突然変異:卵及び助細胞中でLbCas12aを選択的に発現すると予想される、ZmES4::LbCas12aに由来する2つのR0系統(ZM_S22321326及びZM_S22321323)を分析して、作出された突然変異の型を評価した。5つの突然変異植物を、ZM_S22321326系統から産生した。ZmTS1 gRNA標的遺伝子座からの配列決定の結果は、5つ全部の植物が標的部位にユニークな突然変異を有することを示していた。49個の突然変異苗を、2コピーのZmES4:LbCas12aを有するZM_S22321323 R0系統から分析した。49個の突然変異苗のうち、56個の標的部位突然変異が同定された。これは、一部の植物が異種突然変異を含有していたことを示唆している。49個の植物は、合計で23個のユニークな突然変異を有していた。
Cas12aを発現する植物における鋳型DNAの部位特異的組込みに関する試験
Cas12a及びgRNA発現カセットに加えて、それぞれのベクターはまた、ZmTS1 gRNA標的配列によって挟まれた目的の遺伝子(GOI)のための発現カセットを含有していた。生殖組織におけるCas12aの発現は、GOIカセットの両側で二本鎖切断を作出し、それをT-DNAから放出すると予想される。この放出されたDNAは、ゲノムZmTS1標的部位での標的化された挿入のためのドナーとして働くことができる。CRISPR-Cpf1複合体がゲノム内の標的部位を切断する場合、非相同末端結合(NHEJ)DNA修復経路は、ドナーGOIカセットをゲノム標的部位に挿入することができる。この形態のSDIは、トランス断片標的化(TFT)としても知られる。TFTによってSDIについて試験するために、WO2019084148に記載されたものと類似するフランクPCRアッセイを使用して、推定標的挿入を同定した。予想される挿入フランキング配列をPCR増幅するようにプライマーを設計した。4つの別々のPCR反応を実行した:センス方向に位置する潜在的な挿入物のための左フランクPCR及び右フランクPCR、並びにアンチセンスの向きに位置する挿入物のための左フランクPCR及び右フランクPCR。R0系統の初期スクリーニングにおいて、2つの植物がフランク陽性PCRを示した。両方ともZmES4:LbCas12a系統において同定され、両方ともただ1つのフランクPCR産物を産生した。一方のフランク陽性植物は確立された突然変異率(11.11%)を有する系統にあったが、他方のフランク陽性植物は0%の突然変異率を有する系統にあった。
まとめると、データは、LbCas12aが、減数分裂を受ける細胞中で優先的に、又は単独で発現するプロモーターDMC1、Mps1又はAdf1の制御下で発現される場合、生殖編集を達成することができることを示していた。また、LbCas12aがZmES4及びZmEA1のようなプロモーターを発現する卵又は胚によって発現される場合、生殖編集を達成することもできる。更に、このデータは、単一のR0植物が、ユニークな標的部位編集をそれぞれ有する多くのR1子孫を産生することができることを証明する。これは、これらのプロモーターを使用して、形質転換された植物あたり産生されるユニークな編集の頻度を増加させるように、ヌクレアーゼの発現を駆動することができることを示唆している。
生殖細胞突然変異はF1世代に継承可能である
ZmES4::LbCas12a R0事象ZM_S22321323に由来する2つのR1個体を成熟するまで増殖させ、交配物を、野生型01DKD2テスターを用いて受粉させた。R1植物-1は、標的部位のヌクレオチド15に7bpの欠失を含み(Table 11(表11)中の突然変異3を参照されたい)、R1植物-2は、標的部位のヌクレオチド16に9bpの欠失を含んでいた(Table 11(表11)中の突然変異9を参照されたい)。それぞれのF1系統について32個の苗を植え、ZmTS1標的部位中の突然変異の継承についてスクリーニングした。植物-1の交配物に由来する32個のF1苗のうちの11個が成長し、それらのうちの6個が、R1事象特異的突然変異を継承した。植物-2の交配物に由来する32個の苗のうちの5個が成長し、それらのうちの3個が、R1事象特異的突然変異を継承した。
(実施例2)
生殖細胞突然変異を生成するための減数分裂を受ける細胞中でのCas12aの発現
トウモロコシ卵細胞及び/又はトウモロコシ胚における、減数分裂を受けるトウモロコシ細胞中でCas12aを優先的に発現させるためにいくつかの構築物を生成する。Table 12(表12)を参照されたい。
Table 12(表12)に記載された発現カセット中の植物コドン最適化されたLbCas12a配列(配列番号7)は、5'及び3'末端のNLS配列(配列番号8及び配列番号9)によって挟まれている。Table 12(表12)に記載されたそれぞれの構築物を、PolIII ZmU6プロモーター(配列番号10)の制御下の標的部位と相補的なgRNAをコードする構築物(「gRNA構築物」)と同時に、当技術分野で日常的に使用されるバイオリスティック形質転換法を使用して、トウモロコシ細胞中に導入する。或いは、Table 12(表12)に記載された構築物を、バイオリスティックに、又はアグロバクテリウムT-DNAベクターを介して、gRNA構築物を含有する細胞中に形質転換することができる。得られる形質転換されたトウモロコシ細胞は、構築物7～13のうちの1つ、並びにgRNA構築物を含む。トウモロコシ植物を、形質転換されたトウモロコシ細胞から再生させ、成熟まで増殖させる。それぞれの形質転換されたトウモロコシ植物に由来する少なくとも1つの穂を受粉させる。受粉の結果生じる種子を、標的部位における突然変異についてスクリーニングし、構築物8～13を使用して産生された突然変異の数及び型を、構築物7を使用して産生された形質転換されたトウモロコシ植物と比較する。構築物8～13からのCas12a及びgRNA構築物からのその認識ガイドRNAの同時発現は、標的部位のゲノムDNAにおける二本鎖切断をもたらすと共に、その後のDNA修復は1つ又は複数のユニークな突然変異を生成すると予想される。
(実施例3)
生殖細胞突然変異を生成するためにCas12aが構成的に発現される卵又は胚組織におけるgRNAの発現
減数分裂細胞、トウモロコシ卵細胞及び/又はトウモロコシ胚においてPolIIプロモーターの制御下で標的部位と相補的なガイドRNA(gRNA)を優先的に発現させるためにいくつかの構築物を生成する。Table 13(表13)を参照されたい。転写後、Pol-II産物は、5'キャップ及びポリA尾部で迅速に改変され、核から輸出される。これらの改変及び局在化の変更は、gRNAの効率的な使用を妨げ得る。gRNAの利用可能性及び性能を最適化するために、自己切断性リボザイムを、gRNAカセット設計中に組み込む。自己切断性リボザイムは、PolII発現された転写物からのgRNA転写物の切断/プロセシングを容易にして、正確なガイド分子を産生することが報告されている(Wangら、2018、J. of Integrative Plant Biol、60:8、626～631頁を参照されたい)。
Table 13(表13)に記載された構築物を、当技術分野で日常的に使用される形質転換法を使用してトウモロコシ細胞中に安定に導入する。更に、5'及び3'末端のNLS配列(配列番号2及び配列番号3)によって挟まれたCas12aタンパク質をコードし、遍在性のZmUbqM1プロモーター(配列番号11)の制御下にある植物コドン最適化された核酸配列(配列番号1)を含む構築物(「Cas12a構築物」)を、Table 13(表13)に提供されたそれぞれの構築物と共に同時導入する。得られる形質転換されたトウモロコシ細胞は、構築物14～20のうちの1つ、並びにCas12a構築物を含む。トウモロコシ植物を、形質転換されたトウモロコシ細胞から再生させ、成熟まで増殖させる。それぞれの形質転換されたトウモロコシ植物に由来する少なくとも1つの穂を受粉させる。受粉の結果生じる種子を、標的部位における突然変異についてスクリーニングし、構築物15～20を使用して産生された突然変異の数及び型を、構築物14を使用して産生された形質転換されたトウモロコシ植物と比較する。gRNAの選択的発現は、それぞれの減数分裂細胞、卵細胞中で、又は受粉によって作出されたそれぞれの胚中で1つ又は複数のユニークな突然変異を生成すると予想される。
(実施例4)
生殖細胞突然変異を生成するための減数分裂を受ける細胞、卵細胞又は胚組織中での単一の転写物としてのCas12a及びgRNAの発現
減数分裂を受ける細胞、トウモロコシ卵細胞及び/又はトウモロコシ胚において単一の転写物としてLbCas12a及び標的部位と相補的なガイドRNA(gRNA)を優先的に発現させるためにいくつかの構築物を生成する。Table 14(表14)を参照されたい。
Table 14(表14)に記載されたそれぞれの構築物を、当技術分野で日常的に使用されるバイオリスティック形質転換法又はアグロバクテリウム形質転換法を使用してトウモロコシ細胞中に安定に導入する。得られる形質転換されたトウモロコシ細胞は、構築物21～27のうちの1つを含む。トウモロコシ植物を、形質転換されたトウモロコシ細胞から再生させ、成熟まで増殖させる。それぞれの形質転換されたトウモロコシ植物に由来する少なくとも1つの穂を受粉させる。LbCas12a及びgRNAは、プロモーターが発現する細胞中で単一の転写物の一部として転写される。続いて、リボザイム媒介性切断が起こり、gRNAセグメントを放出する。転写物から転写されるLbCas12aタンパク質は、gRNAとリボ核タンパク質(RNP)を形成する。RNPは、標的部位で二本鎖切断を生成し、その後の修復は、それぞれの減数分裂細胞、卵細胞中で、又は受粉によって作出されたそれぞれの胚中で1つ又は複数のユニークな突然変異を生成するであろう。受粉の結果生じる種子を、標的部位における突然変異についてスクリーニングし、構築物22～27を使用して産生された突然変異の数及び型を、構築物21を使用して産生された形質転換されたトウモロコシ植物と比較する。
(実施例5)
交配による突然変異の生成
構築物8～13のうちの1つ(実施例2、Table 2(表2)を参照されたい)を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を生成し、開花期まで増殖させる。実施例2のgRNA構築物を含む更なるトランスジェニックトウモロコシ植物も生成し、開花期まで増殖させる。構築物8～13のうちの1つを含むトウモロコシ植物を、gRNA構築物を含むトウモロコシ植物と交配し、得られる胚中で発現されるCas12a及びgRNAを含む子孫トウモロコシ植物を生成する。
或いは、構築物15～20のうちの1つ(実施例3、Table 13(表13)を参照されたい)を含むトランスジェニックトウモロコシ植物を生成し、開花期まで増殖させる。実施例3のCas12a構築物を含む更なるトランスジェニックトウモロコシ植物も生成し、開花期まで増殖させる。構築物15～20のうちの1つを含むトウモロコシ植物を、Cas12a構築物を含むトウモロコシ植物と交配し、得られる胚中で発現されるCas12a及びgRNAを含む子孫トウモロコシ植物を生成する。
Cas12a及びgRNAの同時発現は、標的部位内に二本鎖切断を生成し、それによって、それぞれの細胞中でユニークな突然変異を生成し、そこでCRISPRシステムの両成分が発現される。得られる胚、又は得られる胚から生じる植物をスクリーニングして、標的部位における突然変異を同定する。
(実施例6)
異なる生殖細胞突然変異を生成するための正逆F1の卵細胞又は胚組織中での減数分裂中のCas12aの発現
実施例1に記載されたトウモロコシ減数分裂組織、卵及び/又はトウモロコシ胚細胞中でCas12aを優先的に発現するT-DNAベクターを含有するR1種子を植えた。構築物の一覧についてはTable 15(表15)を参照されたい。
構築物あたり4～10の独立した事象を表すそれぞれの形質転換された構築物に由来する30個のR1個体を成熟まで増殖させ、正逆交配を全ての個体を用いて試みた。F1種子を、構築物あたり、方向あたり6～29個の交配物から回収した。それぞれのF1穂からの最大で72個の苗を成長させ、ZmTS1標的部位における突然変異についてスクリーニングし、突然変異率(切断率)を算出した。Table 16(表16)を参照されたい。
Taqmanアッセイも実施して、LbCas12a発現カセットのコピー数を決定した。全てのF1間の全体の標的部位突然変異率は、0～14%の範囲であり、指向性発現を示した(図1及びTable 16(表16))。
F1突然変異率を、事象親(R1)に由来する突然変異率と比較して、どれぐらい多くの新しい編集(F1に存在し、R1親には存在しない)が生成されるかを決定した。これらのデータを、図1にまとめる。ZmES4:LbCas12a構築物は、雌性からの最も高い切断率を示した(新しい編集を含有する試料の平均12%)。ZmDMC1:LbCas12aは、雄性からの最も高い切断率を示した(新しい編集を含有する試料の平均14%)。
ZmES4:LbCas12aは、雌性親によって担持された場合、新しい編集を有する高いパーセンテージのF1植物を産生しただけでなく、F1植物において多数のユニークな編集も産生した(図1、Table 17(表17))。雌性親によって担持された場合、ZmES4:LbCas12aは、F1植物において検出された場合、39種の異なる突然変異型を産生した。試験した他のプロモーターは、1つの子孫において最大で4つのユニークな編集型を産生した(図1を参照されたい)。
ZmES4:LbCas12a F1植物において観察された新しい編集は、非常に豊富であった。標的部位の配列決定により、突然変異アレルを含有する40%～100%の配列決定リードが示されたが、これらの編集が、胚/接合子発生の初期に作製され、したがって、植物において固定されることを示している(Table 17(表17))。植物において固定されるようになる編集は、その植物の生殖系列に存在し、したがって、その子孫に継承されるであろう。
ZmES4は、何世代にもわたって高い胚/接合子発現を保持し、多くの独立事象が、LbCas12aの機能的活性を示す。それぞれの事象におけるほぼ全ての編集された植物が、ユニークな編集を含有する(Table 17(表17))。更に、試験した1つを除く全てのZmES4事象が、新しい編集を産生し、事象あたりの突然変異率は、最大20%であった(Table 17(表17))。
(実施例7)
半数体誘導系統から標的ゲノムに対する編集を可能にするためのトウモロコシ卵細胞、減数分裂細胞又は胚中でのCas12aの発現
別の系統と交配した場合、半数体を生成する半数体誘導(HI)系統の接合子、胚、卵及び/又は減数分裂細胞中でCas12aを優先的に発現させるためのベクターを生成する。胚、卵及び/又は減数分裂細胞中での発現を駆動するのに有用なプロモーター及び調節配列の非限定例は、Table 1(表1)に提供されている。植物コドン最適化されたLbCas12a配列が5'及び3'末端のNLS配列によって挟まれ、Table 1(表1)に記載のプロモーターに作動可能に連結された発現カセットが提供される。それぞれのベクターはまた、ユニークなトウモロコシゲノム標的部位を標的とする1つ又は複数のCas12a gRNAをコードする発現カセット;及び必要に応じて、除草剤グリホサートに対する耐性を付与する選択マーカーをコードする発現カセットも含有してもよい。ベクターを、半数体誘導系統に直接形質転換するか、又はベクターを含有する事象を異なる生殖質中で生成させた後、半数体誘導系統中で交配することができる。得られる「編集インデューサー」は、半数体誘導形質並びにCas12a及び必要に応じて、標的部位を指向するgRNAをコードする発現カセットを含有するであろう。一部の実施形態では、gRNAを、Cas12aを発現するカセットから別々に半数体誘導系統又はWT生殖質に送達することができる。
半数体誘導ゲノムから発現される誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Casシステム)等のDNA改変酵素によって誘導される編集は、受精後短期間に起こるが、半数体誘導系統によって寄与されるゲノムの除去前に起こり得る編集の効率によって制限される。半数体誘導が雌性親によって寄与されるシステムでは、受精の直前又は受精後すぐの母体ゲノムからのゲノム編集成分の強力な発現を有することは、望ましい特徴である。したがって、ZmES4プロモーター(実施例6を参照されたい)等の、母体組織(例えば、卵及び胚組織)中で高レベルに発現するプロモーターの同定及び使用が非常に望ましい。
上記の発現構築物を含む事象を担持する誘導系統(編集インデューサー)を、雌性として雄性野生型生殖質と交配する。雄性野生型親に由来する花粉が雌性半数体誘導親と接触した後、誘導親から発現される編集機構(例えば、CRISPR/Casシステム)が雄性親から継承したゲノムと接触し、改変を誘導する期間(受精の直前/受精中、及び/又は受精後)が存在するであろう。ある特定の実施形態では、ゲノム編集は、誘導交配の子孫がその生活環の接合子期にある間に起こる。ある特定の実施形態では、ゲノム編集には、潜在的には子孫植物の組織中で数回の減数分裂に及ぶ、より長い期間が必要である。
野生型ゲノムの編集後、誘導系統ゲノム及び編集機構(例えば、Cas12a及びgRNA)をコードする発現カセットは、母体半数体誘導系統に特徴的であるゲノム除去の機構の1つによってある特定の頻度の子孫において細胞から失われ、したがって、雄性ゲノム中に編集を含有するが、編集機構をコードする発現カセットを含有しない、対応する頻度の半数体子孫植物が得られる。ゲノムDNAの配列決定、分子マーカーを用いた遺伝子型決定、及び植物又は種子マーカーを用いた表現型決定を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、半数体子孫を同定することができる。半数体子孫を、標的部位の配列決定を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって標的部位での編集についてスクリーニングすることができる。編集された半数体を選択した後、コルヒチン処理等の、当技術分野で公知の任意の方法を使用して倍加させる。倍加された半数体は、編集されたアレルについてホモ接合性であり、育種パイプラインにおいて利用することができる。
単一の編集誘導系統を使用して、複数の生殖質にわたって幅広いユニークな編集を作出し、生殖質依存的形質転換の制約を軽減することができる。更に、卵、胚、及び/又は減数分裂組織中で編集機構(例えば、Cas12a及びgRNA)を発現する誘導系統は、様々なユニークな編集を産生し、特定の編集を同定するか、又は様々な編集されたアレルを生成するために複数のトランスジェニック事象を作出する必要性を排除することができる。
(実施例8)
TALE活性化因子はトウモロコシプロトプラストにおけるロバストなLbCas12a発現を駆動することができる
本実施例は、卵、胚、及び/又は減数分裂植物細胞中での転写可能なポリヌクレオチドのロバスト且つ特異的な発現を誘導するためのTALEの使用を記載する。
転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、C末端活性化ドメインを含み、TALEがプロモーターで、又はその近くでTALE結合部位に結合したら、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチドの発現を活性化する/増加させることができる転写因子である。TALEがCas12aの発現を促進することができるかどうかを試験するために、トウモロコシDNAKイントロンに作動可能に連結され、Cas12aをコードするポリヌクレオチド配列の上流に置いた最小35S(-46)プロモーターを使用するいくつかのカセットを設計した(図2を参照されたい)。最小35S(-46)プロモーターは、TATAボックスを有するが、遺伝子発現を誘導する転写因子結合部位を欠く。それぞれ、1～6個のTALEタンパク質結合部位(TB)(配列番号15)が最小35S(-46)プロモーターの上流に置かれた35S(-46):Lb.Cas12aカセットを含む、3つの発現構築物を生成した(Table 7(表7)を参照されたい)。対照として、LbCas12aをコードするポリヌクレオチド配列を、構成的ユビキチンプロモーターに作動可能に連結した。最後に、C末端活性化ドメイン(配列番号17)が完全な35Sプロモーターに作動可能に連結されたTALEタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号16)を含む別々の発現構築物も生成した。
Table 18(表18)に記載された構築物を、TALE発現構築物を含む、及び含まないトウモロコシ葉プロトプラスト中にトランスフェクトした。18～24時間後、RNAを単離し、Cas12a及びTALEの発現を、TaqManアッセイを使用して定量した(図3を参照されたい)。
データは、1XTB:Cas12a、3XTB:Cas12a及び6XTB:Cas12a構築物が、TALE発現の非存在下ではUbq:Cas12a対照ほどよく発現しないことを示していた(図3を参照されたい)。しかしながら、TALE発現の存在下では、Cas12aの高い発現が観察され、発現はTALE結合部位の数と共に増加した。3XTB:Cas12a及び6XTB:Cas12a構築物は、Ubq:Cas12a対照よりも高いCas12a発現を示した(図3を参照されたい)。このデータは、TALEタンパク質が、TALE結合部位に作動可能に連結された遺伝子の高い発現を誘導することができるだけでなく、どれぐらい多くのTALE結合部位が含まれるかに応じて発現をモジュレートすることもできることを示唆している。
(実施例9)
LbCas12aのTALE誘導性減数分裂/胚/卵細胞優先的発現
組織/細胞優先的プロモーターの潜在的なマイナス面は、それらがロバストに発現されない傾向があるということである。本実施例は、この制限を克服し、組織/細胞優先的様式で、Cas12a等の転写可能なポリヌクレオチドのロバストな発現を誘導するために生成された構築物を記載する。
卵、胚及び/又は減数分裂細胞中での優先的な、ロバストなTALE誘導性Cas12a発現のためのいくつかの構築物を生成した。5'及び3'末端のNLS配列によって挟まれ、1、3、又は6個のTALE結合部位と共にOsLTP転写終結配列及び最小35S(-46)プロモーターに作動可能に連結された植物コドン最適化されたLbCas12aコード配列を含む構築物を生成した。また、卵、胚及び/又は減数分裂細胞中で優先的に、又は単独で発現するプロモーターに作動可能に連結されたTALEコード配列(配列番号16)を含む発現構築物も生成した。優先的な胚、卵及び/又は減数分裂細胞発現を駆動するためのプロモーター及び調節配列の非限定例は、Table 1(表1)に提供されている。構成的ユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたTALEコード配列を含む発現カセットを、対照として生成する。アグロバクテリウム媒介性形質転換によって、トウモロコシ01DKD2栽培品種胚を、上記の発現カセット及び植物PolIIIプロモーターの制御下のユニークなトウモロコシゲノム標的部位(ZmTS1)と相補的なCas12a gRNAをコードする発現カセット及び除草剤グリホサートに対する耐性を付与する選択マーカーのための発現カセットを含むベクターで形質転換し、形質転換されたトウモロコシ細胞からR0植物を生成する。それぞれの形質転換された構築物に由来するいくつかのR0系統を成熟するまで増殖させ、それぞれの形質転換されたトウモロコシ植物に由来する少なくとも1つの穂を受粉させる。いくつかのR1系統を選択し、苗を成長させ、標的部位中のLbCas12aにより誘導された編集についてスクリーニングし、編集率を算出する。上記のCas12a、gRNA及びTALE発現ベクターを含む植物が生殖期に達した時、減数分裂細胞、卵細胞、及び/又は胚細胞中で優先的に発現されたTALEは、35S(-46):Lb.Cas12aの上流のTALEタンパク質結合部位に結合し、減数分裂細胞、卵細胞、及び/又は胚細胞中での優先的なロバストな発現を誘導することが予測される。形質転換されたR0系統から生成されたR1植物は、ZmTS1標的部位で有意な数のユニークな突然変異を示すと予想される。
(実施例10)
CRISPR/Cas12a編集システム成分の組織優先的高発現
本実施例は、強力な構成的プロモーターによって駆動されるCas12aの減数分裂細胞/胚/卵細胞優先的発現を可能にするベクターの設計を記載する。
5'から3'の順に、左境界(LB)配列;フォワード方向の選択マーカーカセット;フォワード方向の強力な発現プロモーターをコードする配列;フォワード方向の第1のlox部位、第1の3'UTR(非翻訳領域);リバース方向の第2の3'UTR、減数分裂細胞、卵細胞、及び/又は胚細胞中で優先的に、又は単独で発現するプロモーターに作動可能に連結された、リバース方向のCREリコンビナーゼをコードする配列を含むCREリコンビナーゼカセット;第1と同じ方向の第2のlox部位;フォワード方向の植物コドン最適化されたLbCas12aヌクレアーゼをコードし、フォワード方向の第3の3'UTRに作動可能に連結された配列;並びに必要に応じて、LbCas12aガイドRNA発現カセットを含む、組換えアグロバクテリウムT-DNA構築物を産生する。組換えT-DNA構築物を、図5に例示する。強力なプロモーターの非限定例としては、カリフラワーモザイクウイルス由来35Sプロモーター(配列番号18)、シトラスイエロー(Citrus Yellow)モザイクウイルス由来プロモーター(配列番号19)、モロコシ(Sorghum bicolor)由来ユビキチンプロモーター(配列番号20)、及びトウモロコシユビキチンプロモーター(配列番号11)が挙げられる。
上記のベクターは、CRISPR/Cas編集システム成分及び卵細胞及び/又は胚細胞及び/又は減数分裂を受ける細胞中でCreリコンビナーゼを優先的に発現する発現カセットによって中断される構成的な強力/高発現プロモーターをコードする配列を含む発現カセットを含む。卵、胚及び/又は減数分裂細胞中でのCreの優先的発現が、lox部位間の配列の切り出し及びCRISPR/Cas編集システム成分をコードする配列の、構成的な強力/高発現プロモーターとの作動可能な連結を引き起こすように、Cre発現カセットは、同じ方向のlox部位によって挟まれている。切り出される配列は、Cre発現カセット及び構成的な強力/高発現プロモーターによって開始され得る意図しない転写を終結させることが意図される第1の3'UTR配列を含む。
このベクターを、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって植物細胞に導入する。Creリコンビナーゼが卵、胚及び/又は減数分裂細胞中で発現されたら、それはlox部位間の配列の切り出しを媒介し、Creが発現される組織中でのみ、Cas12aの高い発現を可能にする。

Claims (59)

  1. 植物のゲノムを編集する方法であって、
    (a)植物細胞に、
    (i)異種卵細胞優先的プロモーター、異種胚組織優先的プロモーター、及び異種減数分裂細胞優先的プロモーターからなる群から選択される異種の第1のプロモーターに作動可能に連結されたCRISPRエフェクタータンパク質をコードする第1の核酸配列;並びに
    (ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸がゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列
    を導入する工程;並びに
    (b)工程(a)の植物細胞から少なくとも1つの植物を再生させる工程
    を含み、CRISPRエフェクタータンパク質及び少なくとも1つのガイド核酸が、植物の少なくとも1つの卵細胞、少なくとも1つの胚細胞又は少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの卵細胞、少なくとも1つの胚細胞、又は少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、方法。
  2. 異種の第1のプロモーターが、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される異種卵細胞優先的プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  3. 異種の第1のプロモーターが、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む異種卵細胞優先的プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  4. 異種の第1のプロモーターが、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される胚組織優先的プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  5. 異種の第1のプロモーターが、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む胚組織優先的プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  6. 異種の第1のプロモーターが、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  7. 異種の第1のプロモーターが、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項1に記載の方法。
  8. CRISPRエフェクタータンパク質が、Cas9、Cas12a、Cas12b及びCasXからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  9. 植物を異系交配して子孫植物を産生する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
  10. 植物が半数体誘導株であり、子孫植物が半数体である、請求項9に記載の方法。
  11. 子孫植物の細胞をコルヒチンで処理して、倍加半数体植物を生成する工程を更に含む、請求項10に記載の方法。
  12. 植物のゲノムを編集する方法であって、
    (a)第1の植物を第2の植物と交配させる工程であって、第1の植物が、異種卵細胞優先的プロモーター、異種胚組織優先的プロモーター、及び異種減数分裂細胞優先的プロモーターからなる群から選択される異種プロモーターに作動可能に連結されたCRISPRエフェクタータンパク質をコードする第1の核酸配列を含み、第2の植物が、異種の第2のプロモーターに作動可能に連結される少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列を含み、少なくとも1つのガイド核酸がゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、工程;並びに
    (b)工程(a)の交配から少なくとも1つの胚を取得する工程であって、CRISPRエフェクタータンパク質及び少なくとも1つのガイド核酸が、少なくとも1つの卵細胞、少なくとも1つの胚細胞、又は少なくとも1つの減数分裂細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの卵細胞、少なくとも1つの胚細胞、又は少なくとも1つの減数分裂細胞中の標的配列内で少なくとも1つの改変を生成する、工程
    を含む、方法。
  13. 異種の第1のプロモーターが、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される異種卵細胞優先的プロモーターである、請求項12に記載の方法。
  14. 異種の第1のプロモーターが、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む異種卵細胞優先的プロモーターである、請求項12に記載の方法。
  15. 異種の第1のプロモーターが、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される胚組織優先的プロモーターである、請求項12に記載の方法。
  16. 異種の第1のプロモーターが、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む胚組織優先的プロモーターである、請求項12に記載の方法。
  17. 異種の第1のプロモーターが、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項12に記載の方法。
  18. 異種の第1のプロモーターが、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項12に記載の方法。
  19. CRISPRエフェクタータンパク質が、Cas9、Cas12a、Cas12b及びCasXからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
  20. 異種の第2のプロモーターが、PolIIIプロモーターである、請求項12に記載の方法。
  21. 改変された標的配列を含む、請求項1に記載の方法によって生成される植物。
  22. (a)1つ又は複数のTALE結合部位及び最小プロモーターに作動可能に連結されたCRISPRエフェクタータンパク質をコードする第1の核酸配列;並びに(b)卵細胞優先的プロモーター、減数分裂細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結されたTALEをコードする第2の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、最小プロモーターが、1つ又は複数のTALE結合部位に結合するTALEの非存在下ではDNA改変酵素の発現を駆動しない、組換えDNA構築物。
  23. 第3のプロモーターに作動可能に連結されたガイド核酸をコードする第3の核酸配列を更に含む、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  24. 1つ又は複数のTALE結合部位が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれより多くのTALE結合部位からなる、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  25. TALEをコードする第2の核酸配列が、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  26. TALEをコードする第2の核酸配列が、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む異種卵細胞優先的プロモーターに作動可能に連結される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  27. TALEをコードする第2の核酸配列が、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  28. TALEをコードする第2の核酸配列が、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む異種胚組織優先的プロモーターに作動可能に連結される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  29. TALEをコードする第2の核酸配列が、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される減数分裂細胞優先的プロモーターに作動可能に連結される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  30. TALEをコードする第2の核酸配列が、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む減数分裂細胞優先的プロモーターに作動可能に連結される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  31. CRISPRエフェクタータンパク質が、Cas9、Cas12a、Cas12b及びCasXからなる群から選択される、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  32. 最小プロモーターが、35S(-46)プロモーターである、請求項22に記載の組換えDNA構築物。
  33. 請求項22に記載の組換えDNA構築物をそのゲノム中に含む植物。
  34. (a)CRISPRエフェクタータンパク質をコードする第1の核酸配列;(b)第1のプロモーターをコードする第2の核酸配列;及び(c)卵細胞優先的プロモーター、減数分裂細胞優先的プロモーター又は胚組織優先的プロモーターからなる群から選択される異種の第2のプロモーターに作動可能に連結されたDNA改変酵素をコードする第3の核酸配列を含む組換えDNA構築物であって、第3の核酸が、第1の核酸と第2の核酸との間に位置し、第3の核酸が、5'末端にDNA改変酵素のための第1の標的部位及び5'末端にDNA改変酵素のための第2の標的部位を含む、組換えDNA構築物。
  35. 第3のプロモーターに作動可能に連結されたガイド核酸をコードする第4の核酸配列を更に含む、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  36. 異種の第2のプロモーターが、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される卵細胞優先的プロモーターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  37. 異種の第2のプロモーターが、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む卵細胞優先的プロモーターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  38. 異種の第2のプロモーターが、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される胚組織優先的プロモーターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  39. 異種の第2のプロモーターが、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む胚組織優先的プロモーターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  40. 異種の第2のプロモーターが、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  41. 異種の第2のプロモーターが、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  42. CRISPRエフェクタータンパク質が、Cas9、Cas12a、Cas12b及びCasXからなる群から選択される、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  43. 第1のプロモーターが、OCSプロモーター、CaMV 19Sプロモーター、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、及びユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  44. DNA改変酵素が、Creリコンビナーゼである、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  45. 第1の標的部位及び第2の標的部位が、lox部位である、請求項44に記載の組換えDNA構築物。
  46. DNA改変酵素が、CRISPRエフェクタータンパク質である、請求項34に記載の組換えDNA構築物。
  47. 第1の標的部位及び第2の標的部位が、ガイド核酸のための標的部位である、請求項46に記載の組換えDNA構築物。
  48. 請求項34に記載の組換えDNA構築物をそのゲノム中に含む植物。
  49. 単一の形質転換された植物細胞からユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を生成する方法であって、
    (a)植物細胞に、
    (i)減数分裂優先的プロモーター、卵細胞優先的プロモーター、胚細胞優先的プロモーターからなる群から選択される異種の第1のプロモーターに作動可能に連結されたCRISPRエフェクタータンパク質をコードする第1の核酸配列;及び
    (ii)異種の第2のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのガイド核酸をコードする第2の核酸配列であって、少なくとも1つのガイド核酸がゲノム内の標的配列にハイブリダイズすることができる、第2の核酸配列
    を導入する工程;並びに
    (b)工程(a)の植物細胞から第1の植物を再生させる工程であって、CRISPRエフェクタータンパク質及び少なくとも1つの核酸が、第1の植物の少なくとも1つの減数分裂細胞、卵細胞、又は胚細胞内でリボ核タンパク質を形成し、リボ核タンパク質が、少なくとも1つの減数分裂細胞、卵細胞、又は胚細胞中の標的配列内で少なくとも1つの二本鎖切断を生成する、工程;
    (c)工程(b)の第1の植物を受粉させる工程;
    (d)工程(c)から産生された2つ以上の種子を発芽させて、ユニークな編集を有する2つ以上の子孫植物を産生する工程
    を含む、方法。
  50. 異種の第1のプロモーターが、EA1プロモーター及びES4プロモーターからなる群から選択される異種卵細胞優先的プロモーターである、請求項49に記載の方法。
  51. 異種の第1のプロモーターが、配列番号2～3、21～38、41～45、及び65～82からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む異種卵細胞優先的プロモーターである、請求項49に記載の方法。
  52. 異種の第1のプロモーターが、DSUL1プロモーター、EA1プロモーター、ES4プロモーター、及びEAL1プロモーターからなる群から選択される胚組織優先的プロモーターである、請求項49に記載の方法。
  53. 異種の第1のプロモーターが、配列番号1～3、29～40、43～45、及び86～88からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む胚組織優先的プロモーターである、請求項49に記載の方法。
  54. 異種の第1のプロモーターが、DMC1プロモーター、Mps1プロモーター、及びAdf1プロモーターからなる群から選択される減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項49に記載の方法。
  55. 異種の第1のプロモーターが、配列番号4～6及び83～85からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列又はその機能的断片を含む減数分裂細胞優先的プロモーターである、請求項49に記載の方法。
  56. CRISPRエフェクタータンパク質が、Cas9、Cas12a、Cas12b及びCasXからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
  57. 異種の第2のプロモーターが、PolIIIプロモーターである、請求項49に記載の方法。
  58. 第1の植物が、半数体誘導株である、請求項49に記載の方法。
  59. 第1の植物が雌性であり、異種の第1のプロモーターがES4である、請求項49に記載の方法。
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