JP2007517504A - 融合担体として種子貯蔵蛋白を利用する植物種子中の融合ポリペプチドの高水準発現 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
歴史的には、高等植物における蛋白融合系は細胞内小器官内に外来蛋白を効率的に移入するための内因性植物蛋白のトランジット及び/またはシグナルペプチド及びN末端成熟領域を使用することに限定されていたか、または、選択的植物遺伝子発現をモニタリング、安定化及び/または増量するために利用されているGUSまたはGFPのようなマーカー蛋白のために使用されていた。
生産系としてのトランスジェニック植物の使用は期待される需要を満たすために大量の生産を必要とする化合物にとって理想的であると考えられる。トランスジェニック作物の利点には低資本投資、スケールアップの容易性及び病原体汚染の低い危険性が包含される。コメ系の高水準発現系が開発されており、種々の蛋白を良好に生産している。
トレフォイル(trefoil)モチーフのコンパクトな構造は蛋白分解性の消化に対するトレフォイル(trefoil)ペプチドの顕著な耐性の原因と考えられ、トレフォイル(trefoil)ペプチドを胃腸管の苛酷な環境において生存させ続けている。単一ドメインのヒトITFは7システイン残基を有し、そのうち6個はトレフォイル(trefoil)ドメインの構造を維持することに関与している。7番目のシステイン残基はトレフォイル(trefoil)ドメインの部分ではなく、C末端の3残基上流に位置する。
「生物学的活性」という用語は当業者によりその蛋白に典型的に帰属させられる何れかの生物学的活性を指す。
「融合担体」及び「融合相手」という用語は当業者により理解されるとおり互換的に使用される。
植物細胞または組織は種々の標準的手法を用いて上記発現コンストラクトを用いて形質転換される。ベクター配列は宿主ゲノム内に安定して組み込まれることが好ましい。
後述する実施例に記載されている発現系は特異的な配列系に基づいている。しかしながら、当業者の知る通り、本発明は特定の系に限定されない。即ち、別の実施形態においては、他のプロモーター及び他のシグナル配列を使用して単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現してよい。
ヒトITFDNA配列はゲンバンク(GenBank)アクセッション番号L08044に基づくものとした。この配列は75アミノ酸のITFペプチドのオープンリーディングフレームをコードする。コメ穀粒中の成熟ITFの発現のために、60アミノ酸の成熟ITFペプチドをコードするDNA配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化した(ITF、図1)。
Gns9プロモーターにより駆動されるハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(Hph)遺伝子よりなり、NOSターミネーターが後続する選択可能なマーカープラスミドpAPI176は全ての植物形質転換のための選択可能なマーカーDNAセグメントを与えた。プラスミドDNAを適切な酵素で消化することによりDNAを線状化し、次に1%低融点アガロースゲルにより分離した。分離後、DNAフラグメントをアガロースゲルスライスから溶離させ、アガロースをアガラーゼ(Agarase)で消化することにより除去した。
蛋白抽出のためにITF融合蛋白のコンストラクトを含有するトランスジェニック植物に由来する個々の脱穀したコメ穀粒を粉砕プレートのウェル中に入れた。各ウェルに抽出緩衝液であるトリス緩衝食塩水(TBS)+0.35MNaCl0.2mlを添加した。穀粒をゲノムグラインダー(Genome Grinder)を用いて12分間1300ストローク/分で粉砕した。得られた種子抽出液を4000rpmで20分間遠心分離し、種子上澄みを新しいプレートに移した。
或いは、10脱穀コメ穀粒を合わせ、抽出緩衝液であるTBS+0.35MNaCl2ml中において乳鉢で粉砕し、次に37℃で1.5時間混合した。混合スラリーを12000rpmで12分間遠心分離し、上澄みを2mlエッペンドルフ試験管に移し、後の分析のために−20℃で保存した。
種子抽出液の容量の六分の一をゲルにロードしたため、総融合蛋白は約60μg/穀粒または総穀粒重量の0.3%と推定される。穀粒当たり総蛋白の約300〜400μgが一般的に抽出緩衝液で抽出され、従って組み換え融合蛋白は総可溶性蛋白の約15〜20%である。ITFは重量において融合蛋白の約四分の一であり、従って、ITFは約15μg/穀粒または0.075%穀粒重量である。
コメ種子貯蔵蛋白抽出液の2次元ゲル電気泳動によれば、19kDaのグロブリン蛋白は完全ではないが大部分は単一成分であり、蛋白のファミリーとして存在するとは考えられない。19kDaグロブリン蛋白のコメ内乳中の含有量はグルテン蛋白含有量の概ね10%であるが、19kDaグロブリン蛋白はコメ内乳における単一の遺伝子の最も大量の産物であり、そして、この観点において、コメ内乳における非相同ペプチドの発現のための融合担体として操作するために最も優れた選択肢である。グロブリン遺伝子を予め単離し、特性化し、DNA配列を決定した。非相同ペプチドの高水準発現のために潜在的融合相手として使用してよい別の単子葉植物種子蛋白は、コメグルテリン、オリジン及びプロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン及びグルテニン、トウモロコシゼイン及びグルテリン、エンバクグルテリン、モロコシカフィリン、アワペニセチン及びライムギセカリンを包含する。
ヒトAOD9604DNA配列はヒト成長ホルモンのC末端フラグメントに基づくものとした(Natera et al.,Biochem.Mol.Biol.Int.33,1011−1021,1994)。配列は16アミノ酸のAODペプチドに対するオープンリーディングフレームをコードし、オーストラリアメルボルンのメタボリックスリミテッド(Metabolics Ltd.,Melbourne,AUS)により提供されたものである。コメ穀粒中におけるAODの発現のために、16アミノ酸AODペプチドをコードするDNA配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化(図6)した。
バイナリベクターJH2600中のT−DNAの右及び左の境界によりフランキングされているGns9プロモーターにより駆動されnosターミネーターが後続するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(Bar)遺伝子よりなる選択可能なマーカープラスミドpAPI412は、全植物形質転換のための選択可能なマーカーDNAセグメントを提供した。プラスミドpAPI412及びpAPI507、pAPI499及びpAPI502をアグロバクテリウムLBA4404株内に独立して形質転換し、そして個々のプラスミドを含有するアグロバクテリウム株を選択培地上一夜生育後に1:1比で混合した。コメのアグロバクテリウム媒介形質転換は本質的には米国特許第5,591,616号に記載の操作法に従って実施した。成熟コメ胚より得たコメカルスをファンら(Huang et al.)の記載に従って形質転換用に調製した。コメ品種TP309から誘導したコメカルスにプラスミドpAPI412及びAODプラスミドを含有するアグロバクテリウムLBA4404を接種した。3日間の共インキュベーションの後、8〜9週間、カルスを5mg/lのビアラホスを含有する選択培地中に移した。生存カルスを再生培地上、次いで定着培地上で完全植物となるまで再生させた。トランスジェニック植物(以下の表1)は温室内で成熟するまで育成し、そしてR1種子を採取して発現の分析に付した。
蛋白抽出のためにAOD融合蛋白のコンストラクトを含有するトランスジェニック植物に由来する個々の脱穀したR1コメ穀粒を粉砕プレートのウェル中に入れた。各ウェルに抽出緩衝液であるトリス緩衝食塩水(TBS)+0.35MNaCl0.2mlを添加した。穀粒をゲノムグラインダー(Genome Grinder)を用いて12分間300ストローク/分で粉砕した。得られた種子抽出液を4000rpmで20分間遠心分離し、種子上澄みを新しいプレートに移した。
或いは、10脱穀コメ穀粒を合わせ、抽出緩衝液であるTBS+0.35MNaCl2ml中において乳鉢で粉砕し、次に37℃で1.5時間混合した。混合スラリーを12000rpmで12分間遠心分離し、上澄みを2mlエッペンドルフ試験管に移し、後の分析のために−20℃で保存した。
ヒトIGF−1DNA配列はゲンバンク(GenBank)アクセッション番号M11568のゲンバンク(GenBank)蛋白配列に基づいたものとした。配列は70アミノ酸ペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。コメ穀粒中のIGF−1の発現のために、70アミノ酸IGF−1ペプチドをコードするDNA配列を内因性コメ遺伝子の発現に特異的なコドン表に基づいてコドン最適化した(図16)。2組み換えDNAをコメ穀粒中でIGF−1を発現するために調製した。第1に、グロブリン貯蔵蛋白の成熟部分(GLB)、トリプトファン残基及びIGF−1ペプチドを含有する完全合成遺伝子を合成した(コメ好適コドン使用)。この合成遺伝子はGLB−W−IGF−1融合蛋白をコードしている。更に、ネイティブの成熟グロブリン中の唯一のトリプトファン残基をこのGLB−W−IGF−1融合蛋白中でプロリン残基(アミノ酸127位)に変換する(図18)ことにより、最終的に成熟グロブリン蛋白のC末端に新しく導入されたトリプトファン残基においてN−クロロスクシンイミドによるグロブリン融合担体からのIGF−1ペプチドの化学的放出を促進させた(図18)。
約200個のTP309種子を脱穀し、50%v/vの市販脱色剤で25分間滅菌し、各々5分間3回滅菌水で洗浄した。滅菌した種子を10日間2mg/lの2,4−Dを添加したN6培地の入ったプレート7枚上に置き、カルス形成を誘導した。一次カルスを切り出し、3週間新鮮N6培地上に置いた。二次カルスを一次カルスから分離し、同じN6培地上において3次カルスを形成させた。3次カルスをボンバードメントに使用するか、2週おきに4〜5回継代培養した。各継代培養のカルスをボンバードメントに用いることができる。
Claims (36)
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現を示す単子葉植物種子を製造する方法であって、
(a)以下の(i)、(iii)、(iv)及び/または(ii)の要素を含むキメラ遺伝子で単子葉植物を形質転換する工程と、
(i)植物細胞中で活性なプロモーター、
(ii)シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した第1のDNA配列、
(iii)単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第2のDNA配列、
(iv)非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第3のDNA配列、
ここで第2、第3及び/または第1のDNA配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に単子葉植物種子貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び/またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードし、
(b)融合蛋白を含有する種子を製造するのに十分な時間形質転換単子葉植物細胞から単子葉植物を成育させる工程と、
(c)単子葉植物から種子を収穫する工程と、
を含む方法。 - 単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項1記載の方法。
- 単子葉植物がコメである請求項2記載の方法。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが約10kDa以下である請求項1記載の方法。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが5〜100アミノ酸長である請求項1記載の方法。
- キメラ遺伝子が更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第4のDNA配列を含み、そして、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中に入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項1記載の方法。
- 融合蛋白を切断して非相同ペプチドまたはポリペプチドを単子葉植物種子貯蔵蛋白から分離する工程を更に含む請求項1記載の方法。
- キメラ遺伝子が更に少なくとも1つの選択的精製タグ及び/または少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第4のDNA配列を含み、融合蛋白が更に少なくとも1つの選択的精製タグ及び/または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項7記載の方法。
- 融合蛋白を切断して単子葉植物種子貯蔵蛋白から非相同ペプチドまたはポリペプチドを分離する工程を更に含む請求項8記載の方法。
- 少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Xa因子、トロンビン、V8プロテアーゼ、Genenase(登録商標)、α−溶解蛋白またはタバコエッチ(Tobacco etch)ウィルスプロテアーゼである請求項8記載の方法。
- 少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項10記載の方法。
- 融合蛋白が化学的切断剤により切断される請求項7記載の方法。
- 化学的切断剤が臭化シアンである請求項12記載の方法。
- 以下のa)、c)、d)及び/またはb)の要素を含む形質転換された単子葉植物細胞であって、
a)植物細胞中で活性なプロモーター、
b)シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した第1のDNA配列、
c)単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第2のDNA配列、
d)非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第3のDNA配列、
ここで、第2、第3及び/または第1のDNA配列は翻訳フレーム内に連結され、そして共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び/またはシグナル配列を含む融合蛋白を共にコードしている単子葉植物細胞。 - 単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項14記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- 単子葉植物がコメである請求項15記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが約10kDa以下である請求項14記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが5〜100アミノ酸長である請求項14記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- キメラ遺伝子が更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第4のDNA配列を含み、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中に入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項14記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- キメラ遺伝子が更に少なくとも1つの選択的精製タグ及び/または少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第4のDNA配列を含み、そして、融合蛋白が更に少なくとも1つの選択的精製タグ及び/または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項14記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- 少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Xa因子、トロンビン、V8プロテアーゼ、Genenase(登録商標)、α−溶解蛋白またはタバコエッチ(Tobacco etch)ウィルスプロテアーゼである請求項20記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- 少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項21記載の形質転換された単子葉植物細胞。
- 以下のa)、c)、d)及び/またはb)の要素含むキメラ遺伝子であって、
a)植物細胞中で活性なプロモーター、
b)シグナル配列をコードするプロモーターに作動可能に連結した任意の第1のDNA配列、
c)単子葉植物種子貯蔵蛋白をコードするプロモーターに作動可能に連結した第2のDNA配列、
d)非相同ペプチドまたはポリペプチドをコードするプロモーターに作動可能に連結した第3のDNA配列、
第2、第3及び/または第1のDNA配列は翻訳フレーム内に連結され、共に貯蔵蛋白及び非相同ペプチドまたはポリペプチド及び/またはシグナル配列を含む融合蛋白をコードしているキメラ遺伝子。 - 単子葉植物がトウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ライコムギまたはサトウモロコシから選択される請求項23記載のキメラ遺伝子。
- 単子葉植物がコメである請求項24記載のキメラ遺伝子。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが約10kDa以下である請求項23記載のキメラ遺伝子。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが5〜100アミノ酸長である請求項23記載のキメラ遺伝子。
- 更にメチオニンまたはトリプトファン残基をコードするプロモーターに作動可能に連結した第4のDNA配列を含み、融合蛋白が更に非相同のペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白との間にフレームの中入るように操作されているメチオニンまたはトリプトファン残基を含む請求項23記載のキメラ遺伝子。
- 更に少なくとも1つの選択的精製タグ及び/または少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位をコードするプロモーターに作動可能に連結した第4のDNA配列を含み、そして、融合蛋白が更に少なくとも1つの選択的精製タグ及び/または非相同ペプチドまたはポリペプチドと単子葉植物種子貯蔵蛋白の間の翻訳フレーム内に融合した少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位を含む請求項23記載のキメラ遺伝子。
- 少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼ、第Xa因子、トロンビン、V8プロテアーゼ、Genenase(登録商標)、α−溶解蛋白またはタバコエッチ(Tobacco etch)ウィルスプロテアーゼである請求項29記載のキメラ遺伝子。
- 少なくとも1つの特異的プロテアーゼ切断部位がエンテロキナーゼである請求項30記載のキメラ遺伝子。
- 単子葉植物種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現方法であって、
a)単子葉植物成熟種子発現系において単子葉植物種子貯蔵蛋白に非相同ペプチドまたはポリペプチドを融合させる工程と、
b)成熟単子葉植物種子中で非相同ペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程と、
を含む方法。 - 単子葉植物種子中の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現が種子貯蔵蛋白の非存在下の非相同ペプチドまたはポリペプチドの発現より少なくとも20倍高値である請求項32記載の方法。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが少なくとも15〜20μg/単子葉植物種子の水準で発現される請求項32記載の方法。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが種子の全可溶性蛋白の少なくとも3.0%である請求項32記載の方法。
- 非相同ペプチドまたはポリペプチドが種子の全可溶性蛋白の少なくとも5.0%である請求項35記載の方法。
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