ES2276475T3 - Poduccion de proteinas en semillas de plantas. - Google Patents

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Abstract

Una planta monocotiledónea transgénica que comprende: (a) un promotor específico de maduración de las semillas (b) ligada de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas capaz de elegir como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiledóneas y (c) una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA está ligada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA.

Description

Producción de proteínas en semillas de plantas.
Fundamento de la invención Expresión de proteínas heterólogas en semillas de plantas
La expresión de proteínas heterólogas en semillas de plantas ofrece la posibilidad, por ejemplo, de producir grandes cantidades de polipéptidos recolectados con facilidad, y de expresar proteínas que mejoran la calidad de sus granos. Discusiones de estos conceptos pueden encontrarse en la patente de EE.UU. No. 5.714.474 ("Producción de enzimas en semillas y sus usos").
Proteínas de reserva hordeínas
Las proteínas de reserva de las semillas de la cebada representan, aproximadamente, 8 a 15% del peso seco de los granos maduros de la cebada. Las principales proteínas de reserva de las semillas de la cebada son prolaminas solubles en alcohol, denominadas hordeínas, clasificadas en dos grupos principales, B y C, y dos grupos menores, D y \gamma (Shewry, 1993). Dependiendo de los niveles de nitrógeno, estos 4 grupos representan, aproximadamente, 35 a 55% de la proteína total de las semillas de la cebada. Las hordeínas B y C representan, aproximadamente, 70 a 80% y 10 a 20%, respectivamente, de la fracción total de hordeínas, con pequeñas cantidades de hordeínas D (2-4%) y \gamma (sin determinar con precisión). Las hordeínas B, D y \gamma son prolaminas ricas en azufre mientras que las hordeínas C son prolaminas pobres en azufre (Bright y Shewry, 1983). Las hordeínas son sintetizadas coordinadamente en el tejido del endospermo amiláceo en desarrollo (Giese et al., 1983; Sørensen et al., 1989). Estas hordeínas son transportadas conjuntamente en la traducción al lumen del retículo endoplásmico rugoso, con escisión simultánea del péptido señal, y son depositadas finalmente en los cuerpos proteínicos (Cameron-Mills, 1980; Cameron-Mills y von Wettsein, 1980; Cameron-Mills y Madrid, 1989).
Análisis genéticos realizados ponen de manifiesto que todas las hordeínas están codificadas por genes estructurales sobre el cromosoma 5 (1H) de la cebada; los lugares Hor1, Hor2, Hor3 y Hor5 sobre el cromosoma 5 codifican los polipéptidos de las hordeínas C, B, D y \gamma, respectivamente (Jensen et al., 1980; Shewry et al., 1980; Blake et al., 1982; Shewry et al., 1983; Shewry y Parmar, 1987). Los genes para las hordeínas B, C y D han sido aislados y caracterizados (Brandt et al., 1985; Forde et al., 1985; Rasmussen y Brandt, 1986; Sørensen et al., 1996). Las hordeínas B y C están codificadas por familias multigénicas que comprenden 10 a 20 miembros mientras que la hordeína D está codificada por un solo gen (Brandt et al, 1985; Rasmussen y Brandt, 1986; Sørensen et al., 1996). La regulación y expresión de estos promotores de hordeínas han sido estudiadas mediante ensayos de expresión transitoria (Entwistle et al., 1991; Müller y Knudsen, 1993; Sørensen et al., 1996) en el endospermo de la cebada. Como ha sido determinado por estos ensayos usando fusiones de promotor-uidA, el promotor de la hordeína D es 3 a 5 veces más activo que los promotores de las hordeínas B y C ensayados (Sørensen et al., 1996) El promotor de la hordeína B ha sido estudiado también usando la transformación estable del tabaco con las fusiones de promotor-cat (Marris et al., 1988).
Aún cuando los genes para las hordeínas B, C y D han sido aislados y caracterizados, su regulación y su expresión solamente han sido estudiadas en ensayos de expresión transitoria en la cebada y en el tabaco transformado establemente (Brandt et al., 1985; Forde et al., 1985; Marris et al., 1988; Sørensen et al., 1996).
En la cebada, el trigo y el maíz, las principales proteínas de reserva del tipo prolamina, altamente insolubles, son sintetizadas sobre polisomas estrechamente vinculadas con el retículo endoplásmico (ER) (Véase Seeds: Physiology of Development and Germination, 2ª ed. compiladores Bewley y Black, Plenum Press, Nueva York, 1994). Las proteínas nuevamente sintetizadas atraviesan la membrana del ER hacia el lumen, donde se agregan en partículas pequeñas, que finalmente forman agregados y cuerpos proteínicos de mayor tamaño (que pueden observarse en micrografías electrónicas).
En el trigo, dos tipos diferentes de cuerpos proteínicos se acumulan independientemente dentro del endospermo en desarrollo: cuerpos de baja densidad que se desarrollan más pronto y cuerpos de alta densidad que se desarrollan más tarde y que son derivados desde el ER. Las proteínas de alta densidad se forman cuando la agregación de proteínas en el interior del lumen produce esfuerzo sobre la membrana y ocasiona su rotura. La membrana puede reconstituirse sin el agregado de proteína al cabo de un intervalo en el que el propio cuerpo proteínico no está unido por una membrana. En otros cereales además del trigo y la cebada, tales como el mijo, el arroz, el maíz y el sorgo, los cuerpos proteínicos permanecen como entidades diferenciadas unidas a la membrana, incluso en las semillas maduras.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una planta monocotiledónea transgénica que comprende un promotor específico de la maduración de las semillas, y enlazada de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas capaz de elegir como diana un polipéptido enlazado a un cuerpo proteínico de reserva en semillas monocotiledóneas, y una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de las semillas, en donde la secuencia de DNA está enlazada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA, según se define en las reivindicaciones que se acompañan.
La invención proporciona también semillas transgénicas de estas plantas transgénicas, que son útiles como fuente del polipéptido expresado, o que pueden mejorar la calidad del grano.
En realizaciones particulares de la invención, las plantas transgénicas proporcionadas son plantas monocotiledóneas transformadas establemente, por ejemplo plantas de cereales, tales como la cebada o el trigo. En realizaciones particulares la invención proporciona plantas de cebada transformadas establemente a partir de genotipos que incluyen: Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptone, Klages y Baronesse. La invención proporciona también plantas de trigo transformadas establemente a partir de genotipos que incluyen. Anza, Karl, Bobwhite y Yecora Rojo.
La invención proporciona también semillas de plantas transformadas establemente que expresan en su semilla el polipéptido seleccionado. El polipéptido puede ser empleado para mejorar la calidad del grano o puede ser extraído de la semilla en el momento de máxima expresión o estabilidad para ser utilizado para otros fines.
Descripción breve de los dibujos
La Fig. 1A es un diagrama esquemático de una estrategia de cuatro cebadores para obtener productos quiméricos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La Fig. 1B es un diagrama esquemático de una estrategia de tres cebadores para obtener productos quiméricos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La Fig. 1C es un mapa de una construcción que incluye (desde 5' a 3'), el promotor de la hordeína B_{1}, la secuencia señal de la hordeína B_{1}, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3' de nos.
Las Figs. 2A y B muestran alineaciones de construcciones que comprenden el promotor de la hordeína B_{1}, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3' de nos con (2A) o sin (2B) la secuencia señal de la hordeína B_{1}.
La Fig. 3 muestra la secuencia de los ácidos nucleicos del promotor de la hordeína B_{1} y la secuencia señal de lo hordeína B_{1} de 57 pares de bases (subrayada).
La Fig. 4 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor de la hordeína D y la secuencia señal de la hordeína D de 63 pares de bases (subrayada).
La Fig. 5 es un diagrama de barras que muestra la actividad de GUS en semillas de cebada maduras que expresan construcciones que comprenden el promotor de la hordeína B_{1}, el gen uidA, y la secuencia de terminación de 3' de nos o bien con (+SS) o sin (-SS) la secuencia señal de la hordeína B_{1}.
La Fig. 6 es un diagrama de barras que muestra la actividad de GUS en semillas de cebada inmaduras que expresan construcciones que comprenden el promotor de la hordeína B_{1}, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3' de nos o bien con (+SS) o sin (-SS) la secuencia señal de la hordeína B_{1}.
La Fig. 7 es una fotomicrografía electrónica en la que una inmunoseñal es específica de cuerpos proteínicos en el endosperma inmaduro que expresa GUS de una línea que ha sido transformada con la construcción de DNA de la hordeína B_{1}-uidA que contiene la secuencia del péptido señal del extremo amino terminal de 19 aminoácidos.
Lista de secuencias
Las secuencias de los ácidos nucleicos y de los aminoácidos que se indican en la lista de secuencias que se acompaña, se muestran usando las abreviaturas literales estándar para las bases de los nucleótidos, y el código de tres letras para los aminoácidos. Solamente se expone una de las cadenas de cada secuencia de ácidos nucleicos, pero ha de entenderse que la cadena complementaria está incluida mediante cualquier referencia a la cadena expuesta.
La Seq. I.D. Nº 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor y de la secuencia señal de la hordeína B_{1} de la cebada.
La Seq I.D. No. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal de la hordeína B_{1} de la cebada.
La Seq. I.D. No. 3 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor y de la secuencia señal de la hordeína D de la cebada.
La Seq. I.D. No. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal de la hordeína D de la cebada.
Las Seq. I.D. Nos. 5-16 muestran cebadores de PCR usados para amplificar las moléculas de ácidos nucleicos, según se describe en esta memoria.
Descripción detallada de la invención i. Abreviaturas y definiciones A. Abreviaturas
HMW:
peso molecular alto
CAT:
cloranfenicol acetil transferasa
GUS:
\beta-glucuronidasa
uidA:
gen de \beta-glucuronidasa
PCR:
reacción en cadena de la polimerasa
PEG:
polietilenglicol
Medio MS:
medio de Murashige y Skoog
CIM:
medio de inducción de callo
IIM:
medio de incubación intermedia
RM:
medio de regeneración
2,4-D:
ácido 2,4-diclorofenoxiacético
BAP:
6-bencilaminopurina
2iP:
N^{6}-(2-isopentil)adenina
GFP:
proteína fluorescente verde
CaMV:
virus del mosaico de la coliflor
rbcS:
subunidad pequeña de RUBISCO (D-ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa)
B. Definiciones
A menos que se indique de otro modo, los términos y expresiones técnicos se emplean según el uso convencional. Definiciones de términos y expresiones comunes en biología molecular pueden encontrarse en Genes V de Lewin publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9): Kendrew et al. (compiladores), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A Meyers (compilador), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Con objeto de facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones de términos y expresiones:
Promotor: Una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de una proteína. Esta definición incluye no solo moléculas que poseen las secuencias prototípicas, sino también promotores procedentes de homólogos génicos. También están incluidas moléculas que difieren de las moléculas prototípicas descritas en variaciones menores. Tales secuencias variantes pueden ser producidas por manipulación de la secuencia de nucleótidos de un promotor utilizando procedimientos estándar.
Promotor de hordeínas: Una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de una proteína de hordeína en las semillas de una planta. Si bien puede emplearse para esta invención cualquier promotor de hordeínas, los ejemplos específicos suministrados describen el uso de las secuencias de promotores procedentes de los genes de las hordeínas B_{1} y D de la cebada. Las secuencias de ácidos nucleicos de los genes de las hordeínas B_{1} y D de la cebada, prototípicos, se indican en las Seq. I.D. Nos. 1 y 3, respectivamente, así como en las Figs. 3 y 5, respectivamente. La región del promotor excluye aquellos nucleótidos que codifican la secuencia señal (las secuencias subrayadas que se indican en las Figs. 3 y 4). Los expertos en la técnica podrán apreciar que la longitud de la región del promotor puede ser también mayor o menor que la secuencia representada. Por ejemplo, una secuencia de 5' adicional desde la región aguas arriba del gen de hordeína puede añadirse a la secuencia del promotor, o pueden separarse bases desde las secuencias representadas. Sin embargo, cualquier secuencia del promotor de hordeínas debe ser capaz de dirigir la transcripción de una secuencia ligada operablemente en semilla de planta. La capacidad de un promotor de hordeína de la cebada para dirigir la transcripción de una proteína en una semilla de una planta puede verificarse fácilmente ligando de modo operable la secuencia del promotor a un marco de lectura abierto (ORF) (que codifica, preferiblemente, una proteína fácilmente detectable) tal como el marco de lectura abierto de GUS, introduciendo la construcción que resulta en una planta y verificando luego la expresión de la proteína en las semillas de la plante, según se describe en detalle más adelante. Un promotor de hordeína comunicará, típicamente, expresión específica de la semilla, lo que significa que la expresión de la proteína codificada por el ORF ligado de modo operable será, por lo general, por lo menos el doble (determinada en base a la actividad) en semillas de plantas transfectadas establemente, en comparación con la producida en otros tejidos tales como hojas. Más habitualmente, el promotor de hordeína producirá en semillas una expresión que es, por lo menos, 5 veces mayor que la expresión en otros tejidos de la planta. En muchos casos, la expresión de la proteína en las semillas será específica del endospermo.
Pueden obtenerse homólogos funcionales de los promotores de hordeínas de la cebada aquí descritos, desde otras especies de plantas, tales como de otras monocotiledóneas, incluyendo el trigo, el arroz y el maíz. Ejemplos específicos de tales homólogos pueden tener niveles especificados de identidad de secuencia con los promotores de hordeínas prototípicos (por ejemplo, por lo menos 60% de identidad de secuencia). Los homólogos funcionales retienen la función de los promotores de hordeínas, es decir, retienen la aptitud para conferir expresión específica de las semillas sobre ORFs ligados de modo operable cuando se introducen en plantas. Por consiguiente, cuando se hace referencia en esta memoria a un promotor de una hordeína, ha de entenderse que tal referencia incluye no solo moléculas que poseen las secuencias de las secuencias prototípicas aquí descritas (o variaciones de estas secuencias), sino también promotores procedentes de homólogos de genes de hordeínas. También están incluidas dentro del alcance de tales expresiones moléculas que difieren de las moléculas prototípicas descritas en variaciones menores. Tales secuencias variantes pueden ser producidas mediante manipulación de la secuencia de nucleótidos del promotor de hordeína usando procedimientos estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio o la reacción en cadena de la polimerasa.
Secuencia señal de hordeína (SS): Los inventores han descubierto que la inclusión de una secuencia señal de hordeína en conjunción con un promotor de hordeína proporciona una expresión mejorada en las semillas, de ciertas proteínas heterólogas. En particular, la expresión de una proteína en semillas inmaduras mejora grandemente cuando el ORF que codifica la proteína es ligado de modo operable a un promotor de hordeína y a una secuencia señal de hordeína, a ambos, en comparación con una construcción equivalente en la que la secuencia señal de hordeína está ausente. Aun cuando no es el deseo unirse a especulación alguna, se piensa que la secuencia señal de hordeína dirige la expresión de una proteína codificada por un ORF ligado de modo operable, hacia una situación subcelular protegida, tal como una vacuola o un cuerpo proteínico. Se piensa, además, que las proteínas dirigidas hacia tales vacuolas están protegidas de proteólisis durante ciertas etapas de la maduración de la semilla.
La secuencia señal de hordeína comprende, típicamente, aproximadamente los primeros 15-25 aminoácidos del marco de lectura abierto del gen de hordeína, más habitualmente aproximadamente 18-21 aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las secuencias señal de hordeína de los genes prototípicos de las hordeínas B_{1} y D de la cebada, se indican en las Seq. I.D. 1-4. Los expertos en la técnica podrán apreciar que si bien estas secuencias señal particulares se utilizan en los ejemplos que se describen más adelante, la invención no se limita a estas secuencias específicas. Por ejemplo, pueden usarse secuencias homólogas tan eficazmente como pueden hacerlo secuencias que se diferencias en secuencias exactas de nucleótidos o de aminoácidos, con tal que tales secuencias den por resultado niveles mejorados en las semillas inmaduras, de la proteína codificada. Típicamente, "expresión mejorada" indica una expresión aproximadamente doble de la observada con una construcción equivalente que carece de la secuencia señal. Por tanto, la expresión "secuencia señal de hordeína" incluye no solo las secuencias particulares que se exponen en esta memoria, sino también homólogos y variantes de estas secuencias.
Identidad de secuencias: La semejanza entre dos secuencias de ácidos nucleicos, o dos secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de la semejanza entre las secuencias, a lo que se hace referencia de otro modo como identidad de secuencias. La identidad de secuencias se mide en términos de tanto por ciento de identidad (0 semejanza u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos de los promotores de hordeínas prototípicas y de las secuencias señal de hordeínas poseen un grado relativamente alto de identidad de secuencias cuando se alinean usando métodos estándar.
En la técnica son bien conocidos métodos de alineación de secuencias para efectuar las comparaciones. Diversos programas y algoritmos de alineación han sido descritos por Smith y Waterman (1981); Needleman y Wunsch (1970); Pearson y Lipman (1988); Higgins y Sharp (1988); Higgins y Sharp (1989); Corpet et al., (1988); Huang et al., (1992); y Pearson et al., (1994). Alschul et al., (1994) presentan una consideración detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homologías.
El Instrumento Básico de Investigación de Alineaciones Locales del NCBI (NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)) (Altschul et al., 1990) puede obtenerse de varias procedencias, incluyendo el Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para usar en conexión con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblasx. Puede accederse a ellos en htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Una descripción de como determinar la identidad de secuencias usando este programa se encuentra disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
Los homólogos de las secuencias señal de hordeínas prototípicas se caracterizan típicamente por la posesión de una identidad de secuencias del 60% por lo menos, contada a lo largo de la alineación de longitud total, con la secuencia de aminoácidos del prototipo usando NCBI Blast 2,0; blastp abierto establecido para parámetros con defectos Las proteínas con, todavía, mayor semejanza con las secuencias de referencia muestran tantos por ciento de identidades crecientes cuando se determinan por este método, tales como al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencias. Los promotores de hordeínas homólogos incluyen los procedentes de genes que codifican proteínas que poseen niveles equivalentes de identidad de secuencias con las proteínas de las hordeínas B_{1} y D (es decir, al menos 60% y hasta 95% por lo menos).
Oligonucleótido: Una secuencia lineal de polinucleótidos de una longitud de hasta aproximadamente 100 bases de nucleótidos.
Vector: Una molécula de ácido nucleico introducida en una célula huésped, con lo que produce una célula huésped transformada, Un vector puede incluir secuencias de ácidos nucleicos que le permitan replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector puede incluir también uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.
Transformada: Una célula transformada es una célula en la se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante técnicas de biología molecular. Tal como se emplea en esta memoria, el término "transformación" engloba todas las técnicas mediante las que una molécula de ácido nucleico pudiera ser introducida en una célula tal, incluyendo transfección con vectores virales, transformación con vectores plasmídicos e introducción de DNA simple por electroporación, lipofección y aceleración de partículas, e incluye transformantes tanto transitorios como estables.
Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o una proteína o un orgánulo) que ha sido sustancialmente separado o purificado partiendo de otros componentes biológicos de la célula del organismo en la que los componentes existen de modo natural, es decir, otros DNA y RNA, proteínas y orgánulos, cromosómicos y extracromosómicos Los ácidos nucleicos y las proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas que se han purificado mediante métodos estándar de purificación. El término incluye también ácidos nucleicos y proteínas que se han preparado mediante expresión recombinante en una célula huésped así como también ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
Ligada de modo operable: Una primera secuencia de ácidos nucleicos está ligada de modo operable con una segunda secuencia de ácidos nucleicos cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos está colocada en relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está ligado de modo operable con una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de DNA ligadas de modo operable están contiguas y cuando es necesario unir dos regiones que codifican proteínas, están situadas en el mismo marco de lectura.
Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es uno que tiene una secuencia que no ocurre de modo natural o posee una secuencia que ha sido obtenida mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia por otra parte, separados. Esta combinación artificial se consigue frecuentemente mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos de ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.
cDNA (DNA complementario): Un fragmento de DNA que carece de segmentos no codificantes, internos (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El cDNA es sintetizado en el laboratorio mediante transcripción inversa a partir de RNA mensajero extraído de células.
ORF (marco de lectura abierto): Una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican aminoácidos sin codones de terminación. Estas secuencias habitualmente son traducibles en un péptido.
Planta transgénica: Tal como se usa en esta memoria, esta expresión se refiere a una planta que contiene material genético recombinante que no se encuentra normalmente en plantas de este tipo y que ha sido introducido en la planta en cuestión (o en progenitores de la planta) mediante manipulación humana. Así pues, una planta que se cultiva partiendo de una célula vegetal en la que se ha introducido por transformación DNA recombinante, es una planta transgénica, como lo son todos los vástagos de esa planta que contienen el transgeno introducido (tanto si se ha sido producido sexual como asexualmente).
La expresión "planta transgénica" incluye, asimismo, partes de plantas, incluyendo el fruto, las semillas y el polen.
La presente invención es aplicable tanto a plantas dicotiledóneas (por ejemplo, el tomate, la patata, la soja, el algodón, el tabaco, etc.) como a plantas monocotiledóneas incluyendo, pero no limitado a ellas, monocotiledóneas gramíneas tales como el trigo (Triticum spp), el arroz (Oriza spp.), la cebada (Hordeum spp.), la avena (Avena spp), el centeno (Secale spp.), el maíz (Zea mays), el sorgo y el mijo (Pennisettum spp.). Por ejemplo, la presente invención puede ser empleada con genotipos de cebada incluyendo, aunque no limitado a ellos, Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages y Baronesse, y con genotipos del trigo incluyendo, aunque no limitado a ellos, Yecora Rojo, Bobwhite, Karl y Anza. En general, la invención es particularmente útil en cereales.
Maduración de las semillas: Maduración de las semillas o desarrollo de los granos se refiere al período que se inicia con la fertilización en la que reservas alimenticias metabolizables (por ejemplo, proteínas, lípidos, almidón, etc.) son depositadas en la semilla en crecimiento, en particular en órganos de almacenamiento de la semilla, incluyendo el endospermo, la testa, la capa de aleurona, el embrión y el epitelio escuteliforme, dando como resultado el agrandamiento y llenado de la semilla, y que finaliza con la desecación de la semilla.
Inducible: Se caracteriza por un promotor que está regulado por la presencia o ausencia de una molécula pequeña; el término incluye tanto inducción directa como indirecta.
Promotor específico de la maduración de las semillas: Un promotor inducido durante la maduración de las semillas, por ejemplo, aumentado en 25% o más durante la maduración de la semillas.
Secuencia señal/conductora/diana/de transporte: Una secuencia de polipéptidos del extremo amino terminal o del extremo carboxilo terminal que es eficaz para situar al mismo tiempo que la traducción o después de la traducción, el polipéptido o la proteína a la que está unida en una vacuola intracelular seleccionada u otro cuerpo de almacenamiento de proteínas, cloroplasto, mitocondria o retículo endoplásmico, o espacio extracelular o región de la semilla, tal como el endospermo, después de secreción desde la célula. Un ejemplo en la cebada es la secuencia señal de hordeína, pero otros ejemplos incluyen secuencias señal del maíz (Bagga et al., Plant Cell 9:1683-1696, 1997, en el que la expresión conjunta de los genes del maíz delta-zein y beta-zein da por resultado la acumulación estable de delta-zein en cuerpos que derivan del retículo endoplásmico formados por el beta-zein.; Torrent et al., Plant Molecular Biology 34:139-149, 1997 en el que gamma-zeinas modificadas, ricas en lisina, se acumulan en cuerpos proteínicos de los endospermos del maíz transformados transitoriamente); en el arroz (Wu et al., Plan Journal 14:673-683. 1998, en el que el resto GCN4 es esencial para la expresión génica específica del endospermo, y está activado por Opaque-2, en plantas transgénicas de arroz; Zheng et al., Plant Physiology 109:777-786, 1995, en el que befa-faseolina de la judía fue expresada en el endospermo del arroz transgénico, principalmente en los cuerpos proteínicos vacuolares de tipo II cercanos a la capa de aleurona); en el trigo (Grimwadw et al., Plant Molecular Biology 30:1067-1073, 1996, en el que se describen modelos de expresión de genes que codifican proteínas del gluten del trigo); en el tabaco con legúmina (Conrad et al., Journal of Plant Physiology 152:708-711, 1998) que describe la producción a gran escala de proteínas farmacéuticas en plantas transgénicas de tabaco usando dos promotores de haba Vicia específicos de las semillas procedentes de la legúmina B4 por lo que el producto estaba retenido en el retículo endoplásmico); y soja transformada por ingeniería genética usando el gen de lectina (Takaiwa et al., Plant Science 111:39-49, 1995, en el que genes de glicinina de soja, fusionados transcripcionalmente a un promotor del gen de glutenina de la proteína de reserva del arroz, específico del endospermo, fueron introducidos en el genoma del tabaco por transformación mediada con Agrobacterium, y fueron expresados específicamente en el cotiledón y el embrión de semillas de soja en maduración).
Secuencia de procesamiento terminal o de terminación: Una secuencia de DNA situada en 3' respecto a la región codificante que hace que la RNA polimerasa termine la transcripción de un gen, y se disocie desde el DNA. Un ejemplo es la secuencia de terminación de 3' de nos. Una secuencia de terminación puede ocurrir también durante el procesamiento posterior a la transcripción de mRNA in vivo, como indicación de que una molécula de mRNA precursora debe ser escindida proporcionando una especie madura de mRNA que será traducida. Un segmento que contiene una señal de procesamiento terminal puede ser obtenida comparando cDNA que codifica un producto expresado en el endospermo que codifica el mismo producto, identificando con ello el término 3' del cDNA. Mediante el aislamiento de un segmento de DNA genómico que comprende 50 a 100 pares de bases sobre cualquiera de los dos lados del término 3', se asegura la obtención de un segmento con la señal de procesamiento terminal.
Cuerpo proteínico: Estructura intracelular que contiene proteínas dentro de una estructura membranosa unitaria. En algunos casos se alude a esta estructura como una vacuola.
Proteína de reserva de semillas: una proteína vegetal endógena que es sintetizada y que se acumula durante la maduración de la semilla, se almacena en el grano seco y se moviliza durante la maduración. Tales proteínas se almacenan frecuentemente en el cuerpo proteínico de una semilla de una planta. Ejemplos de tales proteínas de reserva incluyen araquina, avenina, cocosina, conarquina, concocosina, conglutina, conglicinina, convicina, crambina, cruciferina, cucurbitina, edestina, excelesina, gliadina, gluten, glitenina, glicinina, heliantina, hordeína, kafirina, legúmina, napina, orizina, penisetina, faseolina, psofocarpina, secalina, vicilina, vicina y zeína.
II. Expresión de proteínas específica de las semillas usando construcciones de promotor de hordeína/secuencia señal de hordeína a. Construcciones
La presente invención proporciona construcciones recombinantes que son adecuadas para obtener expresión de alto nivel de un polipéptido especificado, en semillas de plantas. Las construcciones pueden representarse, en general, como Ph-hSS-X, en cuya representación Ph es un promotor de hordeína, hSS es una secuencia señal de hordeína y X es una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido especificado. Cada uno de estos tres componentes está ligado de modo operable al próximo, es decir, el promotor de hordeína está ligado el extremo 5' de la secuencia que codifica la secuencia señal de hordeína, y la secuencia señal de hordeína está ligada de modo operable a la secuencia X. La construcción contiene también, habitualmente, secuencias reguladoras de 3', tales como la región de 3', de Nos.
Las características de promotores de hordeínas y secuencias señal se han descrito anteriormente. Los genes de hordeínas B1 y D han sido descritos por Brandt et al., (1985) y Sørensen et al., (1996). Cuando el promotor es Ph, el polipéptido "X" puede ser cualquier polipéptido con excepción de un polipéptido de hordeína, y en realizaciones particulares es diferente de una proteína de reserva de las semillas, o incluso de una proteína específica de las semillas. Los polipéptidos X que pueden ser expresados en semillas de plantas según se describe en esta memoria, como parte de una construcción P-X, P-SS-X, Ph-X o Ph-SS-X, incluyen proteínas no específicas de las semillas tales como proteínas terapéuticas humanas (por ejemplo, eritropoyetina, activador del plasminógeno tisular, uroquinasa y prouroquinasa, hormonas del crecimiento, citoquinas, factor VIII, epoyetina-\alpha, factor estimulante de las colonias de granulocitos, anticuerpos, vacunas, etc.), o proteínas más específicas de plantas tales como enzimas para la biosíntesis del almidón (por ejemplo, ADP glucosapirofosforilasa. EC 2.7.7.27; almidón sintasa, EC 2.4.1.21; y enzima de ramificación, R,Q) y proteínas específicas de las semillas tales como las que confieren valor nutritivo mejorado a las semillas. Ácidos nucleicos que codifican tales proteínas son bien conocidos en la técnica. La región codificante para una proteína tal puede ser modificada de tal modo que se ajuste más estrechamente al uso del codón preferido predispuesto para una célula huésped particular.
Otras proteínas heterólogas codificadas por el gen quimérico incluyen polipéptidos que forman epítopos inmunológicamente activos y enzimas que catalizan la conversión de metabolitos intracelulares, con la consiguiente acumulación de metabolitos seleccionados en las células.
La casete de expresión o genes quiméricos en el vector transformante poseen típicamente una región de terminación de la transcripción en el extremo opuesto desde la región reguladora de la iniciación de la transcripción. La región de terminación de la transcripción puede estar asociada, normalmente, con la región de iniciación de la transcripción procedente de un gen diferente. La región de terminación de la transcripción puede seleccionarse, en particular para la estabilidad del mRNA, para mejorar la expresión. Regiones de terminación de la transcripción ilustrativas incluyen la secuencia de terminación de NOS procedente del plásmido Ti de Agrobacterium y la secuencia de terminación de la \alpha-amilasa del arroz.
Colas de poliadenilación se añaden comúnmente también a la casete de expresión para optimizar altos niveles de transcripción y la apropiada terminación de la transcripción, respectivamente.
Métodos estándar de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, pueden ser empleados para producir estas construcciones.
b. Principios generales de transformación de plantas
La introducción en plantas de la construcción Ph-HSS-X se consigue, típicamente, utilizando técnicas estándar. El enfoque básico consiste en clonar la construcción en un vector de transformación que se introduce después en células de la planta mediante una cualquiera de varias técnicas (por ejemplo, electroporación) y se seleccionan las plantas de la progenie que contienen la construcción introducida. Preferiblemente, la totalidad o parte del vector de transformación se integra de modo estable en el genoma de la célula de la planta. A la parte del vector de transformación que se integra en la célula vegetal y que contiene la secuencia Ph-hSS-X introducida (el "transgeno" intoducido) puede hacerse referencia como la casete de expresión recombinante.
La selección de plantas de la progenie que contienen el transgeno introducido puede llevarse a cabo basándose en la detección de la expresión de la proteína X o de semillas, o determinando la resistencia mejorada a un agente químico (tal como un antibiótico) como resultado de la inclusión de un gen marcador seleccionable dominante incorporado en el vector de transformación.
Las bibliografías técnicas y científicas están repletas de ejemplos de la modificación de características de plantas llevada a cabo con éxito, por transformación con secuencias de ácidos nucleicos clonados. Ejemplos seleccionados que sirven para ilustrar el conocimiento de este campo de la tecnología, incluyen:
Patente de EE.UU. No. 5.571.706 ("Plant Virus Resistance Gene and Methods")
Patente de EE.UU. No. 5.677.175 ("Plant Pathogen Induced Proteins")
Patente de EE.UU. No. 5.510.471 ("Chimeric Gene for the Transformation of Plants")
Patente de EE.UU. No. 5.750.386 ("Pathogen-Reistant Transgenic Plants")
Patente de EE.UU. No. 5.597.945 ("Plants Genetically Enhanced for Disease Resistance")
Patente de EE.UU. No. 5.589.615 ("Process for the Production of Transgenic Plants with Increased Nutritional Value Via the Expression of Modified 2S Storage Albumins")
Patente de EE.UU. No. 5.750.871 ("Transformation and Foreign Gene Expression in Brassica Species")
Patente de EE.UU. No. 5.268.526 ("Overexpression of Phytochrome in Transgenic Plants")
Patente de EE.UU. No. 5.780.708 ("Fertile Transgenic Corn Plants")
Patente de EE.UU. No. 5.538.880 ("Method For Preparing Fertile Transgenic Corn Plants")
Patente de EE.UU. No. 5.773.269 ("Fertile Transgenic Oat Plants")
Patente de EE-UU. No. 5.736.369 ("Method For Producing Transgenic Cereal Plants")
Patente de EE.UU. No. 5.610.042 ("Methods For Stable Transformation of Wheat").
Estos ejemplos incluyen descripciones de selección de vectores de transformación, de técnicas de transformación y de la preparación de construcciones destinadas a expresar un transgeno introducido. A la luz de lo anteriormente expuesto y de la provisión en esta memoria de construcciones Ph-hSS-X, resulta evidente que los expertos en la técnica serán capaces de introducir estas construcciones en plantas con objeto de producir plantas que expresan en sus semillas la proteína (X) deseada.
c. Tipos de plantas
Las construcciones Ph-hSS-X de la presente invención pueden ser expresadas convenientemente en una amplia variedad de plantas superiores obteniendo una expresión de polipéptidos seleccionados, específica de las semillas, Se supone que la invención es particularmente aplicable a plantas monocotiledóneas de cereales que incluyen cebada, trigo, arroz, centeno, maíz, mijo, sorgo y forraje de avena y hierbas de césped. En particular, los métodos de transformación descritos en esta memoria permitirán que la invención sea usada con genotipos de la cebada que incluyen Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Golden Promise, Steptoe, Klages y Baronesse, y genotipos de trigo, importantes desde el punto de vista comercial, que incluyen Yecora Rojo, Bobwhite, Karl y Anza.
La invención puede aplicarse también a plantas dicotiledóneas, que incluyen, aun cuando no se limitan a ellas, soja, algodón, judías, colza/canole, alfalfa, lino, girasol, cártamo, crucíferas, algodón, lino, cacahuete, trébol; hortalizas y legumbres tales como lechuga, tomate, calabaza, mandioca, patata, zanahoria, rábano, guisante, lentejas, repollo, coliflor, brócoli, coles de Bruselas, pimientos; y frutas tales como frutas cítricas, manzanas, peras, melocotones, albaricoques y nueces.
d: Construcción de vectores
Varios vectores recombinantes, adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas, han sido descritos con inclusión de los descritos por Pouwels et al., (1987), Weissbach y Weissbach (1989), y Gelvin et al., (1990). Típicamente, los vectores de transformación de plantas incluyen uno o más ORFs bajo el control de la transcripción de secuencias reguladoras de 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. La selección de secuencias reguladoras de 5' y 3' adecuadas, para las construcciones de la presente invención, se ha discutido anteriormente. Genes de marcadores seleccionables dominantes que permiten la selección fácil de transformantes, incluyen lo que codifican genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina y espectinomicina) y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo, fosfinotricina acetiltransferasa).
e. Técnicas de transformación y regeneración
Métodos de transformación y regeneración de células de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas son conocidos, y la técnica de transformación apropiada será determinada por el técnico. La elección del método variará con el tipo de planta que ha de ser transformada; los expertos en la técnica podrán reconocer la adecuabilidad de métodos particulares para tipos dados de plantas. Los métodos adecuados pueden incluir, aunque no se limita a ellos: electroporación de protoplastos de plantas, transformación con mediación de liposomas; transformación con mediación de polietilenglicol (PEG), transformación usando virus; microinyección de células vegetales; bombardeo de células vegetales con micro-proyectiles; infiltración en vacío; y transformación con mediación de Agrobacterium tumefaciens (AT). Procedimientos operatorios típicos para transformar y regenerar plantas figuran descritos en los documentos de patentes citados al comienzo de esta sección.
f. Selección de plantas transformadas
Después de la transformación y regeneración de plantas con el vector de transformación, se seleccionan habitualmente las plantas transformadas usando un marcador seleccionable dominante incorporando en el vector de transformación. Típicamente, tal marcador comunica resistencia a antibióticos o a herbicidas a las plántulas procedentes de las semillas de las plantas transformadas, y la selección de transformantes puede conseguirse exponiendo las plántulas a concentraciones apropiadas del antibiótico.
Una vez seleccionadas las plantas transformadas y cultivadas hasta madurez para permitir el establecimiento de semillas, las semillas pueden ser recolectadas y analizadas para determinar la expresión de polipéptido "X" expresado.
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III. Uso de polipéptidos expresados en las semillas
Las células transformadas como se ha indicado anteriormente, se usan para regenerar plantas, y las semillas procedentes de las plantas se dejan madurar, típicamente en el campo, con la producción subsiguiente de proteína heteróloga en las semillas.
Los polipéptidos expresados en las semillas utilizando los métodos descritos en esta memoria, pueden ser recolectados desde las semillas en cualquier punto una vez comenzada la expresión de la proteína. Es decir, no es necesario que las semillas hayan sufrido maduración antes de la recolección. Las proteínas expresadas pueden ser aisladas a partir de las semillas, si se desea, mediante métodos convencionales de purificación de proteínas. Por ejemplo, la semilla puede ser molida y después de ello sometida a extracción con un medio de extracción acuoso u orgánico, seguido de purificación de la proteína extraña extraída. Alternativamente, dependiendo de la naturaleza de la proteína expresada y del uso a que se destina, las semillas pueden ser utilizadas directamente sin purificación de la proteína expresada.
Existen diferencias en los tipos de acumulación de diferentes polipéptidos o diferentes fracciones dentro de la semilla. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de GUS con la línea transgénica GPDhGN-6-9-6 alcanza el máximo en aproximadamente 20 días, mientras que la expresión de GUS en la línea GPBhGN-4-34-7-1-2 es mayor a los 10-14 días que a los 20 días. Estos diferentes tipos de expresión pueden ser verificados y los péptidos pueden ser extraídos en el momento en que se espera la expresión máxima.
Cuando la proteína ha sido elegida como objetivo para un cuerpo intracelular seleccionado, tal como una vacuola de reserva de proteína, plastidio o mitocondria, el cuerpo intracelular puede ser fraccionado primeramente a partir de un homogeneizado de células de semilla, y después fraccionado hasta obtener la proteína deseada en forma enriquecida o purificada.
IV. Sistemas de expresión alternativos
Los sistemas de expresión descritos en los ejemplos que figuran más adelante, están basados en el sistema de promotor/secuencia señal de hordeína de la cebada. Sin embargo, los expertos en la técnica podrán apreciar que la invención no se limita a este sistema particular. Así, en otras realizaciones, pueden emplearse otros promotores y otras secuencias señal para expresar polipéptidos en semilla de plantas, en particular cereales.
Las construcciones que emplean tales secuencias pueden representarse como:
P-X ó P-SS, en las que X es el polipéptido que ha de ser expresado (que puede ser una proteína no vegetal o especifica no de semillas o una proteína de reserva no de planta, P es un promotor específico de la maduración de semillas, SS es una secuencia señal, tal como una secuencia que elige como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo intracelular, tal como un cuerpo proteínico en el que se almacena la proteína.
El promotor P puede ser un promotor específico de las semillas (incluyendo, aun cuando no limitado, a específico del endospermo o específico del embrión). Un promotor es específico de las semillas si su expresión en la semilla de una planta es por lo menos diez veces mayor que en las hojas o en la raíces de la planta, cuando el promotor es expresado del modo más activo durante la maduración de las semillas, y se considera específico del endospermo si su expresión en el endospermo es por lo menos cinco veces mayor que en otros tejidos de la semilla cuando el promotor es expresado del modo más activo durante el desarrollo de las semillas. Cualquier elemento o promotor del control de la transcripción, específico de las semillas, bien conocidos, puede ser utilizado además de los promotores de hordeínas de la cebada, incluyendo, pero no limitado a ellos, promotores procedentes de cualquier gen que codifique una proteína de reserva de las semillas, tales como promotores bien conocidos procedentes de genes que codifican; una glutelina, orizina o prolamina del arroz; una gliadina o glutenina del trigo; zeína o glutelina de maíz; glutelina de la avena; kafirina del sorgo; penisetina del mijo; o secalina del centeno, por ejemplo.
Con objeto de aumentar los niveles de un polipéptido expresado, es preferible que la proteína se acumule en una posición subcelular en la que el polipéptido esté protegido de proteólisis (es decir, que la degradación proteolítica del polipéptido esté reducida un 10% por lo menos, más típicamente un 25% por lo menos y lo más típico, 50% por lo menos). Como resultado, se prefiere expresar el polipéptido en forma de un polipéptido de fusión que comprenda, en el mismo marco de lectura, la secuencia codificante para el polipéptido, y la secuencia codificante para un péptido (a lo que se alude indistintamente como una secuencia (o péptido) señal, conductora, de transporte o diana) lo que ocasiona que la proteína de fusión sea dirigida conjuntamente con la traducción o después de la traducción hacia un compartimiento subcelular o a ser secretada desde la célula. Preferiblemente, el péptido señal hace que la proteína de fusión sea dirigida hacia un compartimiento subcelular protegido tal como la vacuola. Por ejemplo, puede hacerse referencia a un péptido señal que hace que una proteína se acumule en una vacuola como un péptido de objetivo vacuolar. El péptido señal está situado, preferiblemente, en el extremo 5' ó 3' de la proteína de fusión. Puede usarse cualquier péptido conductor o péptido señal bien conocido que ocasione la localización, conjuntamente con la traducción o después de la traducción, de un polipéptido expresado hacia un compartimiento subcelular protegido tal, puede ser usado, además de los péptidos señal de las hordeínas de la cebada. Otros péptidos señal y conductores tales incluye, aun cuando no se limita a ellos, péptidos señal procedentes de genes específicos de semillas de monocotiledóneas tales como : una glutelina (por ejemplo, del arroz, el trigo, el maíz, la avena, etc.), prolamina, hordeína, gliadina, gltenina, zeina, albúmina, globulina, ADP glucosapirofosforilasa, almidón sintasa, enzima de ramificación, Em y heno. Otra clase ejemplar de secuencias señal son secuencias eficaces para favorecer la secreción de polipéptidos desde células de aleuronas durante la germinación de la semilla, incluyendo las secuencias señal asociadas con \alpha-amilasa, proteasa. carboxipeptidasa, endoproteasa, ribonucleasa, DNAsa/RNAsa, (1-3)-\beta-glucanasa, (1-3)(1-4)\beta-glucanasa, esterasa, fosfatasa ácida, pentosamina, endoxilanasa, \beta-xilopiranosida, arabinofuranosidasa, \alpha-glucosidasa, (1-6) \alpha-glucanasa, peroxidasa y lisofosfolipasa.
El péptido señal puede ser escindido mediante enzimas celulares conjuntamente con la traducción o después de la traducción. Alternativamente, si el péptido señal no es escindido, el polipéptido de fusión puede ser escindido después de la purificación del polipéptido de fusión, si se desea. Para este fin, puede introducirse una secuencia de aminoácidos entre el péptido señal y la proteína heteróloga para facilitar la escisión enzimática o química para separar el péptido señal.
Los que ejemplos que figuran seguidamente sirven para ilustrar la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Generación de construcciones Ph-hSS-X
Se empleó la reacción en cadena de la polimerasa para producir construcciones para introducir en plantas. Los métodos empleados fueron variantes de los descritos por Higuchi et al., (1990), Horton et al., (1990), Pont-Kingdon et al., (1994) y Lefebvre et al., (1995). Los métodos fueron empleados para producir una construcción Ph-hSS-X en la que Ph era el promotor de la hordeína B_{1} específico del endospermo de la cebada, hSS era la secuencia señal de la hordeína B_{1} de la cebada y X era el ORF de \beta-glucuronidasa (uidA; gus) de Escherichia coli. La construcción incluía, además, la secuencia de terminación de 3' de la nopalina sintasa (nos). Se usaron dos métodos de construcción de
PCR : un método de cuatro cebadores ilustrado en la Fig. 1A y un método de tres cebadores ilustrado en la Fig. 1B.
Todas las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador (MJ Research Inc.) usando DNA polimerasa de Pfu recombinante (Stratagene) en un volumen de reacción de 100 \mul. El tampón de reacción contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,2), KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 6 mM, MgCl_{2} 2 mM, Triton-X-100 0,1%, BSA sin nucleasa, 10 \mug/ml y 50 \muM de cada desoxirribonucleósido trifosfato. Las condiciones de la PCR fueron 25 ciclos de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min y 72ºC durante 2 min, con una etapa final de extensión a 72ºC durante 7 min.
Las estrategias de la PCR recombinante se indican en la Figura 1. Los dos cebadores que se solapan fueron:
5'-GCGGCAACAAGTACATTGCATTACGTCCTGTAGAAACCCCA-3' (cebador BC) (Seq. I.D. Nº 5) y
5'-TGGGGTTTCTACAGGACGTAATGCAATCGTACTTGTTGCCGC-3' (cebador cb) (Seq. I.D. No. 6);
La secuencia del cebador cb es el complemento inverso del cebador BC. Estos cebadores contienen parte de la secuencia codificante de uidA y parte de la secuencia codificante del péptido señal procedente del promotor de hordeína B_{1}. Los dos cebadores externos eran:
5'-GTAAAGCTTTAACAACCCACACATTG-3' (cebador A) (Seq. I.D. No. 7) y
5'-CGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACA-3' (cebador d) (Seq. I.D. No. 8)
cada uno de ellos con un sitio único de enzima de restricción (subrayado), Hind III y EcoR I, respectivamente
Los fragmentos Bhorss (promotor de la hordeína B_{1} que contiene la secuencia del péptido señal) y uidAnos (secuencia codificante de uidA más la secuencia de terminación de 3' de nos) se obtuvieron usando las condiciones siguientes de PCR.
(1) Para Bhorss, 20 ng de molde (el clon genómico de hordeína B_{1} que contiene el plásmido 2-4/Hind III, Brandt et al., 1985) y 40 pmol de los cebadores A y cb se mezclaron con 100 \mul de tampón de PCR 1X (Stratagene), (II) Para uidAnos, 20 ng de molde (el plásmido pDMC201.4 que contiene uidA y nos sin promotor (McElroy et al., 1995); el gen uidA fue derivado del plásmido pGUSN358->S modificado mediante mutagénesis dirigida al sitio para estudios de objetivo vacuolar (Farrell et al., 1990) y 40 pmol de los cebaddores BC y d fueron mezclados con 100 \mul de tampón de PCR 1X. Después de añadir 2,5 unidades de DNA polimerasa de Pfu, las mezclas de reacción fueron cubiertas con 50 \mul de aceite mineral.
En la estrategia de cuatro cebadores, los dos productos principales de la PCR en la primera reacción fueron 0,49 kb para el Bhorss y 2,07 kb para el uidAnos. Una parte alícuota de los dos primeros conjuntos de reacciones de PCR se diluyó 50 veces sin purificación en gel y 5 \mul de productos diluidos fueron utilizados directamente como moldes para la segunda reacción de PCR. Cuarenta pmol de cebadores externos (cebadores A y b) y 2,5 unidades de DNA polimerasa de Pfu fueron añadidos a 100 \mul de tampón de PCR 1X. Para la estrategia de tres cebadores, se produjo en la primera reacción un fragmento más corto de Bhorss de 0,49 kb y este primer producto de la PCR (denominado megacebador) se diluyó 50 veces. Para la segunda reacción de PCR, cinco \mul del megacebador de Bhorss diluido (Bhorss), veinte ng de molde (pDMC201.4) y 40 pmol de cebadores externos (A y d) se mezclaron hasta un volumen final de 100 \mul con tampón de PCR 1X.
El segundo conjunto de reacciones de PCR usando ambas estrategias modificadas de tres y cuatro cebadores produjo un fragmento de 2,56 kb que contenía los fragmentos de DNA Bhorss y uidAnos (Fig. 1C). Se obtuvo una cantidad más pequeña del producto quimérico usando la estrategia de 3 cebadores con relación a la estrategia de 4 cebadores. Se llevó a cabo una tercera reacción de PCR obteniendo cantidades suficientes del producto quimérico para el bombardeo con microproyectiles. El producto de la PCR procedente de la estrategia de 3 cebadores se diluyó 50 veces; 5 \mul de este producto diluido se añadieron como molde a 40 pmol de los cebadores A/d en el seno de 100 \mul de tampón de PCR 1X. Los productos quiméricos finales, amplificados en un volumen final de 2 X 100 \mul (2 reacciones) procedentes de ambas estrategias de 3 cebadores y 4 cebadores, fueron purificados en un gel de agarosa al 0,7% usando el kit de extracción de gel QIAquick (Quiagen Inc.). Los fragmentos de DNA purificados fueron eluídos en 50 \mul de tampón TE 1X, analizados mediante digestión con enzimas de restricción y utilizados en experimentos de bombardeo con microproyectiles sin subclonación posterior para el ensayo de estrategias de construcción de DNA.
Ejemplo 2 Ensayos transitorios en células de cebada
Antes del bombardeo con microproyectiles, espigas de cebada (variedad de primavera Golden Promise) que contenían embriones inmaduros (15-25 días después de la polinización) fueron esterilizadas con agente de blanqueo al 20% (v/v) (hipoclorito sódico al 5,25%) durante 10-15 minutos y enjuagadas brevemente 3 x 5 minutos con agua estéril.
Se separó asépticamente, a mano, el endospermo de cada uno de los embriones y se colocaron "lado acanalado hacia abajo" sobre medio basal MS (Murashige y Skoog) (8) suplementado con maltosa, 30 mg/l, tiamina.HCl, 1,0 mg/l, mio-inositol, 0,25 mg/l, hidrolizado de caseína, 1,0 g/l y prolina, 0,69 mg/l, y se solidificó con Phytagel'' (Sigma), 3,5 g/l. El bombardeo de DNA se llevó a cabo utilizando partículas de oro de 1 \mum (Analytical Scientific, Inc.) recubiertas con 12,5 \mul de los fragmentos de DNA eluídos (aproximadamente 1-2 \mug) empleando las modificaciones siguientes de un procedimiento operatorio publicado (Lemaux et al., 1996). Las partículas de oro y otros componentes necesarios para la precipitación fueron reducidos a mitad de volumen. El precipitado de DNA/microproyectil se resuspendió en 36 \mul de etanol absoluto; 15 \mul de la suspensión se usaron por bombardeo en un dispositivo Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad) a 7584 kPa. El tejido del endospermo bombardeado fue incubado a 24 \pm 1ºC en oscuridad durante 1 día y teñido para determinar la actividad de GUS (Jefferson et al., 1987). Los resultados (no indicados) mostraron expresión de GUS en el tejido del endospermo y son concordantes con el hecho de que la construcción de DNA quimérico producida mediante las reacciones de PCR antes descritas, está dentro de lo previsto permitiendo con ello la obtención de un producto génico de uidA funcional. Después de la confirmación in vivo de la funcionalidad, el producto quimérico fue subclonado en un vector, confirmado posteriormente mediante secuenciación del DNA y usado para la transformación estable de cebada con objeto de estudiar el objetivo en la proteína.
Ejemplo 3 Expresión estable de construcciones Ph-X en la cebada Materiales y Métodos Plantas
La variedad de primavera, de dos filas, de cebada, Golden Promise, fue cultivada en cámaras de cultivo según se ha descrito anteriormente (Wan y Lemaux 1994; Lemaux et al., 1996).
Acidos nucleicos
El plásmido p16 (Sørensen et al, 1996) contiene la cadena principal de pUC18 con el gen de la \beta-glucuronidasa (uidA; gus) controlado mediante 550 bp del promotor de la hordeína B_{1} específico del endospermo de la cebada y terminado por la señal de poliadenilación de 3' de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, nos. El plásmido pD11-Hor3 (Sorensen et al, 1996) contiene uidA bajo el control de 434 bp del promotor de la hordeína D y la secuencia de terminación de nos. El pAHC20 (Christensen y Quail, 1996) contiene bar inducido por el promotor de ubiquitina del maíz, primer intrón y terminado por el extremo 3' nos. Ambas de estas construcciones incluyen promotores de hordeínas pero no incluyen una secuencia señal de hordeínas. Por tanto, son construcciones del tipo: Ph-X. El pAHC25 (Christensen y Quail, 1996) consiste en uidA y bar, cada uno de ellos bajo el control del promotor de la ubiquitina del maíz (Ubil) y primer intrón y terminado en nos.
Métodos de transformación
Se obtuvieron líneas transgénicas estables de cebada que contenían hordeína B_{1}-uidA y hordeína D-uidA, siguiendo las modificaciones de un protocolo publicado (Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Las modificaciones fueron requeridas para la transformación de genotipos comerciales de cebada, y el método descrito en esta memoria puede ser usado para transformar genotipos comerciales de monocotiledóneas incluyendo la cebada y el trigo que son recalcitrantes a la transformación usando los métodos publicados (por ejemplo los genotipos de cebada Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages y Baronesse y los genotipos del trigo Anza, Karl, Bobwhite y Yecora Rojo).
Plantas de cebada donantes de embriones inmaduros fueron cultivadas en el suelo, en condiciones reguladas, en cámaras de crecimiento según se ha descrito (Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Embriones zigóticos inmaduros fueron esterilizados en la superficie, colocados sobre medio DBC2 con el lado del escutelo hacia abajo, e incubados a 24 \pm 1ºC. Los tejidos regenerativos fueron mantenidos durante 3-4 semanas y después cortados en trozos pequeños (aproximadamente de 3 a 5 mm), hechos pasar a medio DBC2 de nueva aportación, y cultivados en condiciones de luz débil. Después de un período adicional de tres semanas, los sectores encallecidos verdes fueron cortados en trozos pequeños (de 3 a 5 mm aproximadamente) y hechos pasar a medio DBC2 de nueva aportación. Los tejidos regenerativos verdes fueron mantenidos sobre el medio DBC2 con subcultivo a intervalos de 3-4 semanas.
Para el bombardeo, tejidos regenerativos verdes (de 3 a 5 mm aproximadamente, de 4 meses) fueron colocados en oscuridad a 24 \pm 1ºC durante 1 día, y hechos pasar después a medio DBC2 que contenía manitol 0,2 M y sorbitol 0,2 M. Cuatro horas después del tratamiento con el osmoticum, los tejidos verdes fueron bombardeados según ha sido descrito por Lemaux et al., (1996) con partículas de oro (Analytical Scientific Instruments, Alameda, CA) revestidas con pAHC25, una mezcla de pAHC20 y p16 (relación molar 1:2), o una mezcla de pAHC20 y pD11-Hor3 (relación molar 1:2). Al cabo de 16-18 horas después del bombardeo, los tejidos verdes fueron hechos pasar a medio DBC2 sin osmoticum y cultivados a 24 \pm 1ºC bajo condiciones de luz débil (aproximadamente 10 \mu&, 16 h de luz).
Después de un período inicial de cultivo de 3 a 4 semanas en medio no selectivo, cada fragmento de tejido verde fue dividido en 1 a 2 trozos (de 4 a 5 mm aproximadamente, dependiendo del tamaño del fragmento de tejido original) y hechos pasar a medio DBC2 suplementado con 5 mg/L de bialafos para efectuar la selección de bar. Se seleccionaron tejidos verdes sobre medio DBC2 y tejidos de 4 mm a 5 mm fueron subcultivados a intervalos de 3 a 4 semanas. Los callos resistentes al bialafos fueron regenerados sobre medio FHG (Hunter 1998) que contenía 1 mg/lL de 6-bencilaminopurina (BAP) y 3 mg/L de bialafos. Los retoños regenerados fueron transferidos a cajas Magenta que contenían medio de enraizamiento (medio de inducción de callo, sin fitohormonas) que contenía 3 mg/L de bialafos. Cuando los retoños alcanzaron la parte superior de la caja, las plántulas fueron pasadas al suelo y cultivadas hasta madurez en el invernadero.
El medio DBC2 usado para la transformación está basado en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con maltosa, 30 g/L, tiamina.HCl 1,0 mg/L, mio-.inositol 0,25 g/L, hidrolizado de caseína 1,0 g/L, prolina 0,69 g/L, y solidificado con 3,5 g/L de Phytagel (Sigma, St. Louis, MO). El medio se suplementó adicionalmente con 2,5 mg/L de la auxina vegetal ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 0,1 mg/L de la citoquinina vegetal 6-bencilaminopurina (BAP) y cobre 5 \muM (al estado de sulfato de cobre). Se encontró que se requería la presencia de la elevada cantidad de cobre y la relación de auxina alta/citoquinina baja para la generación eficiente del material regenerativo verde procedente de los genotipos de la cebada y del trigo que, de otro modo, son recalcitrantes a la transformación. Sin embargo, la composición del medio DBC2 puede variarse dependiendo del genotipo particular que haya de ser transformado. Los ingredientes principales del medio están comprendidos dentro de los intervalos siguientes:
una auxina en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/l hasta aproximadamente 5 mg/L, una citoquinina en una concentración de 0 mg/L hasta aproximadamente 5 mg/L y cobre en una concentración de aproximadamente 0,1 \muM hasta aproximadamente 50 \muM (y más típicamente aproximadamente 1 a 10 \muM). Puede obtenerse una transformación más eficiente cuando se emplea maltosa en el medio como fuente de carbono en una concentración de hasta aproximadamente 60 g/L, más típicamente, aproximadamente 30 g/L (o bien en lugar de sacarosa o en mezcla con ésta).
La tinción histoquímica para determinación de GUS fue efectuada (Jefferson et al. 1987) usando ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónico (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO). Las muestras fueron incubadas durante la noche a 37ºC en tampón de ensayo de GUS.
Las medidas cuantitativas de la actividad de GUS fueron llevadas a cabo por el método de Jefferson et al., (1987) usando como sustrato 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucuronida (MUG) (Sigma, St. Louis, MO). Partiendo de líneas homozigóticas se aisló un único endospermo inmaduro 10-14, 20 y 30 días después de polinización o a partir de endospermo maduro, se congeló en nitrógeno líquido y se trituró en el seno de tampón de extracción de GUS; cada tratamiento tuvo 4 replicados. Después de centrifugar se utilizaron los sobrenadantes para determinar la actividad de GUS. Se midió la fluorescencia de la 4-metilumbeliferona (4-MU) (Sigma, St. Louis, MO) en un minifluorómetro dedicado TKO 100 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) en una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Las proteínas fueron extraídas como se ha descrito anteriormente (Jefferson, 1987); Jefferson et al., 1987) y se midieron las concentraciones de proteína de los extractos según Bradford (1976) usando reactivo de Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA).
Para determinar la sensibilidad a herbicidas de las plantas T_{0} y su progenie, se aplicó en forma de capa a una sección del limbo de la hoja en la fase de 4 a 5 hojas, usando una torunda de algodón, una solución al 0,25% (v/v) de solución de Basta^{TM} (concentración de partida, 200 g/L de fofinotricina, Hoechst AG. Frankfurt, Alemania) más Tween 20 al 0,1%. Las plantas fueron calificadas 1 semana después de la aplicación del herbicida.
El DNA genómico total procedente de callos independientes o tejidos de hojas independientes, fue purificado según ha sido descrito por Dellaporta (1993). Para ensayar la presencia de uidA en el DNA genómico de líneas transformadas putativamente, 250 ng de DNA genómico fueron amplificados mediante PCR usando el conjunto de cebadores, UIDA1 (5'-AGCGGCCGCATTACGTCCTGTAGAAACC-3') (Seq. I.D. No. 9) y UID2R (5'-AGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTG-3') (Seq. I.D. No. 10). La presencia de bar se ensayó usando el conjunto de cebadores, BAR5F (5'-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3') (Seq. I.D. No. 11) y BAR1R (5'-ATATCC
GAGCGCCTCGTGCATGCG-3') (Seq. I.D. No. 12) (Lemaux et al., 1996). Las fueron realizadas con DNA polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) en una reacción de 25 \mul. Veinticinco \mul del producto de la PCR con colorante de carga, fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% con bromuro de etidio, y se fotografió usando luz UV. La presencia de un fragmento de 1,8 kb con los cebadores UIDA era consistente con un fragmento de uidA intacto; un fragmento interno de 0,34 kb fue obtenido con los cebadores BAR. Para realizar análisis de hibridación de DNA, 10 \mug de DNA genómico total procedente de tejido de las hojas de cada línea fueron sometidos a digestión con EcoRI y BamHI, se separó sobre un gel de agarosa al 1,0%, se transfirió a una membrana Zeta-Probe GT (Bio-Rad, Hercules, CA) y se hibridó con una sonda radiomarcada, específica de uidA, siguiendo las indicaciones del fabricante. El fragmento XbaI de 1,8 kb conteniendo uidA fue purificado usando un kit de extracción de gel QIAEX (QIAGEN, Chatsworth, CA) y marcado con \alpha-^{32}P-dCTP usando cebadores aleatorios.
Resultados
Veintidós líneas independientes de callo de cebada transformadas de modo estable, que contenían fusiones de promotor de hordeína B_{1}-uidA ó de hordeína D-uidA, se obtuvieron en una primera serie de transformaciones. Trece líneas eran regenerables, siete transformantes de hordeína B_{1}-uidA y seis transformantes de hordeína D-uidA. Se aisló DNA genómico desde el callo de transformantes regenerables. Se llevó a cabo análisis de PCR usando los cebadores UIDA y BAR. La amplificación por PCR dio por resultado un fragmento de uidA intacto de 1,8 kb y un fragmento de bar interno de 0,34 kb, en la progenie T_{1}. Del tejido de las hojas deT_{0} de las 13 líneas ensayadas, sin embargo, uno (GPDhGN-22) no produjo un fragmento, amplificado por PCR, para uidA (Tabla 2). Después de hibridación Southern de DNA genómico procedente de tejido de las hojas de los 7 transformantes de hordeína B_{1}-uidA y los 6 transformantes de hordeína D-uidA, doce de las trece líneas transformadas produjeron los fragmentos de fusión esperados de hordeínas-uidA de 2,35 kb ó 2,25 kb. La línea restante (GPDhGN-22) no produjo fragmento alguno de hibridación con uidA, aun cuando esta línea contenía las bandas de hibridación de bar de tamaño apropiado (los resultados no están indicados).
Diferentes tejidos procedentes de transformantes estables fueron ensayados para determinar la actividad histoquímica de GUS. Se apreció una fuerte expresión de GUS en los tejidos de endospermo transformados con ambos promotores de hordeínas B_{1} y D, pero no en tejidos del embrión, el ovario, el estigma y la antera, ni en los tejidos de las hojas. Se observó en todos los tejidos expresión de GUS bajo el control del promotor de la ubiquitina del maíz (Ubil); no se observó expresión de GUS en el testigo sin transformar. Las raíces y retoños de germinación procedentes de las semillas de T_{1} de los transformantes de fusión de promotores de hordeínas B_{1} ó D-uidA, tampoco tenían actividad histoquímica de GUS observable (resultados no indicados).
Las actividades relativas de las construcciones de hordeína B_{1}- y D-uidA fueron determinadas mediante análisis fluorométrico de GUS en extractos de semillas en crecimiento y maduras de líneas homozigóticas (Tabla 1). Las actividades específicas de GUS inducidas por el GUS inducido por el promotor de B_{1} tenían niveles máximos de expresión a los 10 a 20 días después de la polinización. El promotor de la hordeína D mostró un tipo de desarrollo con actividades específicas máximas a los 20 a 30 días después de la polinización.
La actividad enzimática de la fosfinotricina acetiltransferasa (PAT, producto de bar) y GUS, en plantas T_{0} y su progenie, se ensayó aplicando a las hojas en forma de capa Basta, para PAT, y mediante ensayo histoquímico para GUS. El tejido de la hoja procedente de plantas T_{0} de las trece líneas independientes puso de manifiesto resistencia a Basta (Tabla 2). En la progenie T_{1} siete de las trece líneas ensayadas para uidA y bar mostraron un tipo de segregación 3:1 para la expresión de GUS (Tabla 2). De las seis líneas restantes, una línea (GPDhGN-6) tenía una relación de segregación de 43:2 para la expresión de GUS; otra línea (GPDhGN-22) expresaba PAT pero no contenía uidA, otra línea (GPBhGN-13) no contenía ni uidA ni bar, y tres líneas (GPBhGN-2, GPDhGN-12 y GPDhGN-14) eran estériles. El endospermo de T_{1} procedente de todas las líneas transgénicas de T_{0} fértiles que tenían señales positivas de hibridación de DNA para uidA [fragmentos de 2,35 kb y 2,25 kb para los genes de hordeína B_{1}-uidA y de hordeína D-uidA, respectivamente, puso de manifiesto fuerte actividad de GUS (Tabla 2) excepto GPBhGN-13 y GPDhGN-14. El gen bar había sido transmitido de modo estable a la progenie T_{1} de todas las líneas fértiles excepto la GPBhGN-13; se obtuvo una línea homozigótica de expresión estable (GPDhGN-16) (Tabla 2). La expresión de uidA inducida por el promotor de la hordeína B_{1} o de la hordeína D había sido heredada también de modo estable en la progenie T_{2} de las 7 líneas independientes ensayadas (GPBhGN-4, -7, -12, -14 y GPDhGN-6, -11 y 16) (Tabla 1). La expresión del gen uidA estaba transmitida de modo estable en una línea ensayada en la generación T_{5} (GPBhGN-4), en las dos líneas ensayadas en T_{4} (GPBhGN-7 y GPDhGN-16), 3 líneas en T_{3} (GPBhGN-12, GPDhGN-6 y –11), 1 línea en T_{2} (GPBhGN-14) y 1 línea en T_{1} (GPBhGN-3) (Tabla 1). Se obtuvieron líneas transgénicas homozogóticas que expresaban uidA de modo estable, de los casos GPBhGN-4, -7. GPDhGN-6 y -16 (Tablas 1 y 2).
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
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TABLA 2 Actividades específicas de GUS en semillas de cebada transgénica en desarrollo y maduras
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La actividad de GUS se determinó por análisis fluorométricos de extractos de proteínas procedentes del endospermo en desarrollo y maduro de líneas homozigóticas. Los valores de la actividad de GUS representan la media \pm la desviación típica de cuatro ensayos repetidos para cada uno de los tratamientos.
Las líneas GPBhGN-4-34-7-1-2 y GPDhGN-6-9-6 son líneas homozigóticas transformadas con construcciones de hordeína-B_{1}-uidA (p16) y hordeína D-uidA (pD11-Her3), respectivamente, que producen las semillas de T_{5} y T_{3}, respectivamente.
Ejemplo 4 Comparación de la expresión en semillas de plantas de cebada transformadas de modo estable con las construcciones Ph-hss-X ó Ph-X
Para determinar el efecto de la secuencia señal de hordeínas sobre los niveles de expresión de proteínas, plantas de cebada fueron transformadas con construcciones en la que el promotor de la hordeína B_{1} estaba ligado operablemente al gen uidA o bien con la secuencia señal de la hordeína B_{1} (construcción pdBhssGN5-6) o bien sin la secuencia señal (construcción pdBhGN1-2) como ilustra la Fig. 2. Los detalles y los resultados de estos procedimientos de ensayo se describen más adelante.
Materiales y Métodos Plásmidos
Se prepararon dos construcciones de DNA que contenían el promotor de la hordeína B_{1} y la región de codificación de gus con o sin la secuencia del péptido señal, para ensayar la funcionalidad de las fusiones de promotor de la hordeína B_{1}- gus y estudiar su objetivo:
(1) pdBhssGN5-6 (con secuencia señal, Fig. 2ª): La construcción de DNA quimérico que contiene el promotor de hordeína B_{1}-secuencia señal-uidA-nos, producida usando los métodos de PCR descritos en el Ejemplo 1, fue sometida a digestión con HindIII y SnaB1, y el fragmento HindIII/SnaB1 fue ligado en el plásmido pDMC201.4 digerido con HindIII/SnaB1 (McElroy et al., 1995) generando el plásmido pdBhssGN5-6. El plásmido pDMC201.4 contiene uidA y nos sin promotor; el gen uidA fue derivado del plásmido pGUSN358->S modificado mediante mutagénesis dirigida al sitio para estudios de elección de diana vacuolar (Farrell y Beachy, 1990). El fragmento amplificado por PCR (promotor de hordeína B_{1} con su secuencia de péptido señal más la región de unión con el uidA de 5') del producto quimérico fue confirmado mediante secuenciación del DNA.
(2) pdBhCN1-2 (sin secuencia señal, Fig. 2B): cebadores Bhor3 (5'-cgcatgcGTGCAGGTGTATGAGTCATT-3') (Seq. I.D. No. 13) y Bhor2R (5'-ccctccagaAGTGGATTGGTGTTAACT-3') (Seq. I.D. No. 14) conteniendo los sitios SphI y XbaI, cada uno de ellos con un sitio único de enzima de restricción (letras minúsculas), respectivamente, fueron usados para la amplificación de la región 5' de la hordeína B_{1} de 0,55 kb usando el plásmido p16 que contenía el promotor de hordeína B_{1}-uidA-nos (Sørensen et al., 1996) como molde. El fragmento amplificado por PCR de 0,55 kb fue sometido a digestión con SphI y XbaI y ligado en pUC19 sometido a digestión con SphI/XbaI generando el pBhor-1. Se preparó el pBhGN-1 reemplazando el promotor CaMV35S en p35SGN-3 (que contenía promotor CaMV35S-uidA-nos) con el fragmento SphI/XbaI hordeína B_{1} procedente de pBhor-1. El fragmento HindIII/SnaBI procedente de pBhGN-1 fue repuesto con el fragmento HindIII/SnaBI en pDMC201.4 generando pdBhGN1-2. Así, la región de flanqueo de hordeína B_{1} de 5' de 120 bp estaba suprimida en el pdBhssGN5-6 y en el pdBhGN1-2.
Las dos construcciones de DNA quimérico resultantes fueron introducidas en tejidos del endospermo de la cebada inmaduros usando bombardeo con microproyectiles para realizar ensayos de expresión génica estable. Los métodos de determinación de transformación estable, tinción y cuantificación de GUS y sensibilidad a Basta, se realizaron según se describe en el Ejemplo 3.
Aislamiento de DNA genómico, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación de transferencia de DNA
El DNA genómico procedente de callos o tejidos de hojas, independientes, fue purificado según se ha descrito (Dellaporta, 1993). Para ensayar la presencia de uidA en el DNA genómico de líneas transformadas putativamente, 250 ng de DNA genómico fueron amplificados mediante PCR usando el conjunto de cebadores UIDA1 y UID2R. El conjunto de cebadores, Bhor8 (5'-GAAGAGATGAAGCCTGGCTAC-3') (Seq. I.D. No. 15) y GUS5516 (5'-CGATCCA
GACTGAATGCCCACAGG-3') (Seq. I.D. No.16) se usó para distinguir entre el promotor de hordeína B_{1} con y sin la secuencia señal. Es de esperar un producto híbrido de 229 bp procedente de la construcción que contienen el promotor de hordeína B_{1} con la secuencia señal, mientras que se espera un producto de PCR de 178 bp procedente de la construcción que contiene el promotor de hordeína B_{1} sin la secuencia señal. La presencia de bar fue ensayada usando el conjunto de cebadores, BAR5F y BAR1R (Lemaux et al., 1996). La amplificación se llevó a cabo con DNA polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) en una reacción de 25 \mul. Veinticinco \mul del producto de PCR con colorante de carga fueron sometidos a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8%, con bromuro de etidio, y se fotografió usando luz UV. La presencia de un fragmento de 1,8 kb con los cebadores de UIDA era consistente con la presencia de un fragmento de uidA intacto; se produjo un fragmento interno de 0,34 kb con los cebadores de BAR. Para los análisis de hibridación de DNA, 10 \mug de DNA genómico total procedente del tejido de las hojas de cada una de las líneas, fue sometido a digestión con HindII y SacI, separados sobre un gel de agarosa al 1,0%, transferidos a membrana Zeta-Probe GT (Bio-Rad, Hercules, CA) e hibridados con una sonda radiomarcada específica de uidA, siguiendo las indicaciones del fabricante. El fragmento XbaI de 1,8 kb que contenía uidA, procedente de pB1221, fue purificado usando el kit de extracción de gel QIAEX (QIAGEN, Chatsworth, CA) y marcado con \alpha-^{32}P-dCTP usando cebadores aleatorios.
Ensayo de marcado por el método del inmunooro
Endospermos inmaduros, transgénicos y no transgénicos, fueron recolectados aproximadamente 20 días después de la polinización usando un método de refrigeración de alta presión (McDonald, 1998). Los tejidos fueron embebidos en resina blanca y se efectuó el ensayo por el método inmunocitoquímico según se ha descrito anteriormente (Philip et al., 1998).
Resultados Análisis de PCR y de hibridación de transferencia de DNA de plantas transgénicas
Para ensayar la funcionalidad de la secuencia del péptido señal del extremo amino terminal del promotor de la hordeína B_{1} y estudiar los mecanismos de elección de dianas, los presente inventores obtuvieron 10 líneas de cebada independientes transformadas de modo estable, que contenían o bien pdBhssGN5-6 o pdBhGN1-2. De éstas, tres líneas procedentes de cada construcción de DNA eran líneas expresadas conjuntamente con los genes uidA y bar. Se aisló DNA genómico desde estos transformantes. Se efectuó análisis de PCR usando los cebadores UIDA y BAR. La amplificación por PCR dio por resultado fragmentos de uidA intactos de 1,8 kb e internos de bar de 0,34 kb. procedentes de seis líneas (Tabla 3). Se observó una diferencia de tamaño de 51 bp entre los fragmentos amplificados desde los transformantes de hordeína B_{1}-uidA con y sin la secuencia señal, lo que se justifica por la presencia de la secuencia señal en las líneas GPdBhGN-1, -2 y -16.
Expresión de hordeína-uidA en plantas transgénicas
Semillas de T_{1} fueron ensayadas para determinar la actividad histoquímica de GUS. Se apreció una fuerte expresión de GUS en los tejidos de endospermo transformados con ambos promotores de la hordeína-B_{1} con y sin la secuencia señal, pero no en los embriones. La expresión de GUS procedente de las dos construcciones de hordeína B_{1}-uidA era muy evidente en el endospermo en desarrollo, en especial en las células periféricas de tejido del endospermo y de tejido del endospermo próximo al lado escutelar. El promotor de hordeína B_{1} con la secuencia señal tenía, todavía, una expresión más fuerte en el endospermo que la que tenía sin la secuencia señal. No se observó expresión de GUS en los tejidos del testigo sin transformar.
Las actividades relativas de las construcciones de hordeína B_{1}-uidA fueron determinadas mediante análisis fluorométrico de GUS en extractos de semillas, en desarrollo y maduras, de líneas homozigóticas. Las actvidades específicas de GUS inducidas por el promotor de hordeína B_{1} con la secuencia señal, eran más altas, tanto en las semillas en desarrollo como en la semillas maduras, que sin la secuencia señal (Figs. 6 y 7). En particular los tejidos de endospermo en desarrollo transformados con el promotor de hordeína B_{1} con la secuencia señal, tenían más de 30 veces la actividad de GUS, en comparación con el promotor de hordeína B_{1} sin la secuencia señal.
Análisis de la progenie T_{0} a T_{2}
La actividad enzimática de la fosfinotricina acetiltansferasa (PAT, producto de bar) y de GUS en plantas T_{0} y su progenie, fue ensayada por aplicación de Basta en forma de capa, a las hojas, para PAT y mediante análisis histoquímico para GUS. El tejido de hojas procedente de plantas T_{0} de las seis líneas independientes puso de manifiesto resistencia a Basta (Tabla 1). En la progenie T_{1} las seis líneas ensayadas para determinar uidA mostraban un tipo de segregación de 3:1 para la expresión de GUS. Los genes bar habían sido transmitidos también de modo estable a la progenie T_{1} de cinco líneas excepto la GPdBhssGN-10; la línea GPdBhssGN-10 no expresó PAT, Se obtuvieron líneas transgénicas homozigóticas que expresaban uidA de modo estable, de los 4 casos GPdBhGN-1, GPdBhssGN-7, -10 y -23.
Microscopía electrónica y marcado con el método del inmunooro
La inmunoseñal observada a nivel del microscopio electrónico, era específica de cuerpos proteínicos en el endospermo inmaduro que expresa GUS, de la línea que había sido transformada con la construcción de DNA de hordeína B_{1}-uidA que contenía la secuencia del péptido señal del extremo amino terminal, de 19 aminoácidos (Fig. 7).
Discusión
La investigación precedente ensaya la funcionalidad de los promotores de la hordeína B_{1} de la cebada, con y sin la secuencia del péptido señal del extremo amino terminal, de 19 aminoácidos, usando ensayos de expresión tanto transitoria como estable, en la cebada. En concordancia con estudios anteriormente realizados (Müller y Knudesen, 1993); Sørensen et al., 1996), se observó en el endospermo en desarrollo expresión transitoria de GUS bajo el control de la fusión de promotor de hordeína B_{1}-uidA sin la secuencia señal, pero no en los embriones. El promotor de hordeína B_{1} con la secuencia señal puso de manifiesto el mismo tipo de expresión, pero con una mas fuerte expresión. El análisis por PCR confirmó la presencia de uidA y bar en el DNA genómico procedente de plantas T_{0} de 6 líneas diferentes transformadas de modo estable con promotores de hordeína B_{1} con y sin la secuencia señal.
Semillas de cebada en desarrollo y maduras, transformadas de modo estable, fueron caracterizadas en términos de especificidad de los tejidos y cadencia de la expresión de GUS inducida por el promotor de hordeína. Gus, inducido por ambos promotores de hordeína B_{1}, con y sin la secuencia señal, era expresado exclusivamente en tejido del endospermo y no en otros tejidos. Además, la existencia de la secuencia señal con el promotor de hordeína B_{1}, mejoró espectacularmente la expresión de GUS en el endospermo transgénico en desarrollo. Este hecho está en concordancia con los resultados de Fiedler y Conrad (1995) de que una proteína Fv de una sola cadena (scFv) de unión a antígeno solamente era detectable en semillas de plantas de tabaco transformadas con construcciones que contenían una secuencia de péptido señal. Después de almacenamiento de semillas de tabaco transgénicas, maduras, durante un año, a temperatura ambiente, no había pérdida de proteína scFV ni de su actividad de unión a antígeno, mientras que en plantas transformadas con construcciones sin péptido señal no tuvo lugar acumulación de scFv ni en el fruto maduro ni en las semillas en desarrollo. Ellos suponían que la falta de expresión de la proteína de GUS en el citosol es resultado de la regulación de la traducción o posterior a la traducción por las proteasas citosólicas, que degradan la proteína scFv si no entra en el camino secretorio. En contraste con ello, los niveles de mRNAs de GUS en las semillas en desarrollo y la actividad de GUS en las semillas maduras, eran consistentemente superiores en las líneas de tabaco transformadas que contenían la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal, de 32 aminoácidos, del gen de lectina específico del embrión de la soja en comparación con las que carecían de esta secuencia (Phillip et al., observación sin publicar). La expresión de GUS procedente de las dos construcciones de hordeína B_{1}-uidA era muy evidente, en especial en las células periféricas de tejido de endospermo en desarrollo y el tejido de endospermo próximo al lado escutelar de la cebada transformada.
Podía esperarse que las plantas transgénicas con un sitio único de integración transgénica, dieran una relación de segregación para el transgeno (y su expresión) de 3:1. Las seis líneas dieron tal relación para la expresión de GUS. Se obtuvieron líneas transgénicas homozigóticas, que expresan GUS de modo estable desde 4 líneas.
La expresión de PAT inducida por el promotor de la ubiquitina del maíz había sido heredada también de modo estable en la progenie T_{1} de cinco líneas transgénicas; sin embargo, una línea (GPdBhssGN-10) no mostraba expresión de PAT en la progenie T_{2}.
Los resultados presentados en esta memoria indican que el promotor de la hordeína D y de la hordeína B_{1} pueden ser utilizados para desarrollar un sistema para limitar la expresión génica extraña extraño exclusivamente al endospermo de las semillas de la cebada. Además, los resultados indican que el uso de plantas transformadas con un promotor específico de las semillas, con la secuencia señal, mejoraba espectacularmente la expresión transgénica. Este hecho permite la creación de nuevas variedades de cultivos con fines indefinidos y farmacéuticos usando estrategias de elección de dianas vacuolares.
Ejemplo 5 Expresión específica del embrión
Este ejemplo utiliza el promotor Glb1 del maíz, con o sin deleción de una secuencia de flanqueo de 5', fusionado al gen informador bacteriano, gen de la \beta-glucuronidasa (uidA; gus), para demostrar la funcionalidad del promotor Glb1 del maíz en la cebada transgénica, para la expresión específica del embrión.
Una variedad de cultivo de cebada, de primavera, de dos hileras, Golden Premise, se cultivó en cámaras de cultivo según ha sido descrito anteriormente (Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996).
Plásmidos
El ppGlb1GUS (Liu y Kriz, 1996), un plásmido que contiene el gen informador uidA bajo el control del promotor de globulina (Glb1) específico del embrión del maíz y terminado en nos, se obtuvo de DEKALB Plant Genetics, Mystic, CT. El ppGlb1GUS se sometió a digestión con EcoRI separando una región de flanqueo de globulina de 5', de 1,04 kb. El fragmento de EcoRI de 2,58 kb que contenía el promotor de globulina de 0,36 kb, la secuencia codificante uidA y la secuencia de terminación de 3' de nos, fue ligado en el pUC19 digerido con EcoRI, generando el pdGlbGUS-6. Por tanto, la región de flanqueo de globulina de 5', de 1,04 kb, estaba suprimida en el pdGlbGUS-6. Las dos construcciones de DNA quimérico anteriores fueron introducidas utilizando bombardeo con microproyectiles, en tejidos del endospermo inmaduro de la cebada para efectuar ensayos de expresión génica transitoria y estable.
Expresión génica transitoria de los genes uidA inducida por promotores de globulina
Espigas de aproximadamente 20 a 25 días después de la polinización fueron esterilizadas en la superficie durante 10 a 15 minutos con agente de blanqueo al 20% (hipoclorito sódico al 5,25%), seguido de 3 lavados con agua estéril. Los tejidos inmaduros de embriones y endospermos fueron separados asépticamente y colocados con el escutelo hacia arriba sobre medio MS (Murashige y Skook, 1962) suplementado con 3,5 g/L de Phytagel (Sigma, St. Loius, MO) con o sin tratamiento osmótico (Cho et al., 1998b). Los tejidos fueron bombardeados usando una pistola Biolistic PDS-1000 He (Bio-Rad, Hercuels, CA) a 7584 kPa con partículas de oro de 1,0 \mum recubiertas o bien con ppGlb1GUS o bien con pdGlbGUS-6, según el protocolo de Lemaux et al., (1996) El tratamiento osmótico incluye manitol 0,2 M y sorbitol 0,2 M para dar una concentración final de 0,4 M con pre-tratamiento de 4 h y post-tratamiento de 1 ó 2 d.
Transformaciones estables de la cebada
Se obtuvieron líneas GP transgénicas, estables, mediante bombardeo con micropartículas esencialmente según ha sido descrito por Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996; y Cho et al., 1998a. Partículas de oro (1,0 \mum) fueron recubiertas con 25 \mug de pAHC20 y ppGlbGUS o pdGlbGUS-6 de relación molar 1:1, y se usaron en experimentos de bombardeo según se ha descrito anteriormente. El plásmido pAHC20 (Christensen y Quail, 1996) contiene el gen de resistencia a herbicidas, bar, procedente de Streptomyces hygroscopicus bajo el control del promotor Ubil de la ubiquitina del maíz y primer intrón y secuencia de terminación de 3' de nos. Callos resistentes al Bialafos fueron regenerados sobre medio FHG (Hunter, 1988) que contenía 1 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP) y 3 mg/L de bialafos. Los retoños regenerados fueron hechos pasar a cajas Magenta que contenían medio de enraizamiento (medio de inducción de callo sin fitohormonas) que contenía 3 mg/L de bialafos. Cuando los retoños alcanzaron la parte superior de la caja, las plántulas fueroon hechas pasar al suelo y se cultivaron hasta madurez en el invernadero.
Análisis histoquímico y cuantitativo de la actividad de GUS
Se llevó a cabo tinción histoquímica para GUS usando ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónico (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO). Las muestras fueron incubadas durante la noche a 37ºC en tampón de ensayo de GUS.
Aplicación de herbicida
Para determinar la sensibilidad a herbicidas de plantas T_{0} y sus progenie, se aplicó en forma de capa a una sección del limbo de las hojas, en la fase de 4 a 5 hojas, utilizando una torunda de algodón, una solución al 0,25% (v/v) de solución de Basta^{TM} (concentración de partida, 200 g/L de fofinotricina, Hoechst AG, Frankfurt, Alemania) más Tween 20 al 0,1%. Las plantas fueron calificadas 1 semana después de aplicar el herbicida.
Aislamiento de DNA genómico, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación de transferencia de DNA
DNA genómico total procedente de callos o tejidos de hojas, independientes, fue purificado según se ha descrito (Dellaporta, 1993). Para ensayar la presencia de uidA en el DNA genómico de líneas transformadas putativamente, 250 ng de DNA genómico fueron amplificados por PCR usando el conjunto de cebadores UIDA1(5'-agcggccgcaT
TACGTCCTGTAGAAACC-3') y UID2R (5'-agagctcTCATTGTTTGCCTCCCTG-3');cada uno con un sitio de enzima de restricción (letras minúsculas) para subclonar otra construcción de DNA que contenía el gen uidA (Cho et al., 1998a;b) La presencia de bar fue ensayada usando el conjunto de cebadores BAR5F (5'-CATCGAGACAAGCA
CGGTCAACTTC-3') y BAR1R (5'-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3')(Lemaux et al., 1996). Las amplificaciones fueron realizadas con DNA polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) en una reacción de 25 \mul (Cho et al., 1998a;b). Veinticinco \mul del producto de la PCR con colorante de carga fueron sometidos a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8% con bromuro de etidio y se fotografió usando luz UV. La presencia de un fragmento de 1,8 kb con los cebadores UIDA era coherente con un fragmento intacto uidA; se produjo un fragmento interno de 0,34 kb con los cebadores BAR.
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Resultados Expresión génica transitoria de genes uidA de globulina
Para establecer inicialmente la funcionalidad del promotor de globulina específico del embrión del maíz, se usaron los plásmidos ppGlb1GUS y pdGlbGUS-6 en ensayos transitorios que llevaron consigo bombardeo con microproyectiles de endospermos y embriones de cebada inmaduros, respectivamente. Se incluyeron dos testigos, un testigo negativo bombardeado con tampón TE1x y otro positivo bombardeado con pAHC25 conteniendo uidA bajo el control del promotor constitutivo de la ubiquitina del maíz. GUS inducido por los promotores de globulina específicos del embrión del maíz, fue expresado débilmente en el tejido del embrión, pero no, en absoluto, en el tejido del endospermo. La expresión de GUS inducida por las dos fusiones de promotor de globulina-uida fue más fuerte en embriones inmaduros de la cebada con tratamiento osmótico que sin tratamiento osmótico. El grado del expresión génica de uidA en embriones, inducida por el promotor de globulina sin someter a deleción (ppGlb1GUS, 1,4 kb) apareció ligeramente más débil que el inducido por el promotor de globulina sometido a deleción (0,36 kb, pdGlbGUS-6). El tratamiento de ABA mejoró la expresión de GUS en embriones inmaduros sin tratamiento osmótico, pero no con tratamiento osmótico. El testigo negativo no manifestó expresión alguna de GUS.
Expresión específica de embriones en plantas transgénicas
Para ensayar adicionalmente las construcciones Glb1 del maíz-uidA, se obtuvieron diez líneas de cebada independientes transformadas de modo estable; 5 transformadas con el promotor de globulina sin someter a deleción y las otras cinco con promotor de globulina sometido a deleción. Se aisló DNA genómico procedente de transformantes regenerables y se llevó a cabo el análisis por PCR. Los resultados de la amplificación por PCR de genes uidA y bar procedentes de DNA genómico extraído de tejidos de callo, mostraron que las líneas transgénicas de la cebada daban por resultado la generación de ambos fragmentos, el de uidA intacto de 1,8 kb y el de bar interno de 0,34 kb.
Diferentes tejidos procedentes de transformantes estables fueron ensayados para determinar la actividad histoquímica de GUS. Se puso de manifiesto una débil expresión génica de uidA exclusivamente en el tejido de embriones transformados con los promotores Glb1 del maíz, pero no en el tejido del endospermo. Por otra parte, se observó en todos los tejidos expresión de GUS bajo el control del promotor de la ubiquitina del maíz) (Ubil); no se detectó expresión de GUS en el testigo negativo.
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<212> PRT
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<213> Hordeum vulgare 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Val Ala Val Ile Val Ala Leu Val}
\sac{Ala Leu Thr Thr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial; cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcaacaa gtacattgca ttacgtcctg tagaaacccc a 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggggtttct acaggacgta atgcaatcgt acttgttgcc gc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtaaagcttt aacaacccac acattg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 29
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggaattcga tctagtaaca tagatgaca 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
agcggccgca ttacgtcctg tagaaacc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctctca ttgtttgcct ccctg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcgagaca agcacggtca acttc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatccgagc gcctcgtgca tgcg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgcatgcgtg caggtgtatg agtcatt 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccctctagaa gtggattggt gttaact 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagagatga agcctggcta c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial. cebador de PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgatccagac tgaatgccca cagg 
\hfill
24

Claims (16)

1. Una planta monocotiledónea transgénica que comprende:
(a) un promotor específico de maduración de las semillas
(b) ligada de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas capaz de elegir como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiledóneas y
(c) una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA está ligada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA.
2. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal de DNA es una secuencia conductora del extremo amino terminal, específica de semillas monocotiledóneas.
3. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que el promotor está seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de glutelinas del arroz, orizinas del arroz, prolaminas del arroz, hordeínas de la cebada, gliadinas del trigo, glutelinas del trigo, zeínas del maíz, glutelinas del maíz, glutelinas de la avena, cafirinas del sorgo, penisetinas del mijo y secalinas del centeno.
4. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal de DNA está seleccionada entre las secuencias señal comprendidas en el grupo que consiste en genes de glutelina del arroz, globulina del arroz, hordeína D de la cebada y hordeína B_{1} de la cebada.
5. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiledónea está seleccionada entre el grupo que consiste en arroz, cebada y trigo.
6. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiledónea es el arroz.
7. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiledónea es la cebada.
8. La planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, en la que la planta es el trigo.
9. Una semilla transgénica producida desde la planta monocotiledónea transgénica según la reivindicación 1, que comprende
(a) un promotor específico de maduración de las semillas
(b) ligado de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiledóneas, capaz de elegir como objetivo un polipéptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiledóneas y
(c) una secuencia de DNA que codifica una proteína heteróloga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA está ligada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA.
10. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la secuencia señal de DNA es una secuencia conductora del extremo amino terminal específica de semillas monocotiledóneas.
11. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que el promotor está seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de glutelinas del arroz, orizinas del arroz, prolaminas del arroz, hordeínas de la cebada, gliadinas del trigo, glutelinas del trigo, zeínas del maíz, glutelinas del maíz, glutelinas de la avena, cafirinas del sorgo, penisetinas del mijo y secalinas del centeno.
12. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la secuencia señal de DNA está seleccionada entre las secuencias señal comprendidas en el grupo que consiste en genes de glutelina del arroz, globulina del arroz, hordeína D de la cebada y hordeína B_{1} de la cebada.
13. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea está seleccionada entre el grupo que consiste en arroz, cebada y trigo.
14. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea es el arroz.
\newpage
15. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea es el trigo.
16. La semilla transgénica monocotiledónea, según la reivindicación 9, en la que la semilla monocotiledónea es la cebada.
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