BR112020005227A2 - resistência derivada de nepentesina-1 a patógenos fúngicos nas principais plantas de cultura - Google Patents

resistência derivada de nepentesina-1 a patógenos fúngicos nas principais plantas de cultura Download PDF

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Giuseppe Dionisio
Claus Krogh Madsen
Inger Bæksted HOLME
Thomas Povl ETZERODT
Inge FOMSGAARD
Lise Nistrup JØRGENSEN
Henrik Brinch-Pedersen
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Aarhus Universitet
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Abstract

A invenção se refere a planta de cereal geneticamente modificada que tem um construto de DNA recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de aspartil protease (EC 3.4.23.12) cuja expressão, particularmente em grão, confere resistência à doença fúngica melhorada em comparação com uma planta de cereal parental da qual a referida planta de cereal geneticamente modificada foi derivada. A invenção se refere ainda a um método para produzir uma planta de cereal geneticamente modificada da invenção compreendendo transformar uma ou mais células de uma planta de cereal parental com o construto de DNA recombinante; assim como a um método para fabricar o grão geneticamente modificado para produção de uma cultura de plantas de cereal geneticamente modificadas que exibem resistência aumentada a uma doença fúngica devido à expressão do construto de DNA recombinante. Adicionalmente, o uso de grão produzido por uma planta de cereal geneticamente modificada da invenção inclui a fabricação de uma composição, compreendendo uma composição de grão moído, uma forragem animal ou forragem animal peletizada em vapor.

Description

RESISTÊNCIA DERIVADA DE NEPENTESINA-1 A PATÓGENOS FÚNGICOS NAS
PRINCIPAIS PLANTAS DE CULTURA CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção fornece uma planta de cultura geneticamente modificada que tem um construto de DNA recombinante compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de aspartil protease (EC 3.4.23.12) cuja expressão melhorada, particularmente em grão ou semente, confere resistência à doença fúngica melhorada em comparação com uma planta de cultura parental da qual a referida planta de cultura geneticamente modificada foi derivada. A invenção fornece adicionalmente um método para produzir uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção compreendendo transformar uma ou mais células de uma planta parental com um construto de DNA recombinante. Ainda é fornecido um método para fabricar o grão ou semente geneticamente modificado para produção de uma cultura de plantas geneticamente modificadas que exibem resistência aumentada a uma doença fúngica devido à expressão do construto de DNA recombinante. Ademais, o uso de grão ou semente produzido por uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção inclui seu uso na fabricação de uma composição, compreendendo uma composição de grão moído, uma forragem animal ou forragem animal peletizada em vapor.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Patógenos fúngicos provocam perdas consideráveis em produtividade e qualidade de culturas economicamente importantes. A fusariose da espiga (FHB) ou giberela é uma das doenças fúngicas principais da família Triticeae em regiões temperadas e quentes e úmidas do mundo. A doença está atrelada a várias espécies Fusarium, onde F. graminearum e F. culmorum são economicamente as mais relevantes. A infecção por doença provoca uma redução significativa em produtividade e qualidade de cultura devido a grãos murchos e sua contaminação com micotoxinas. Nos 1990s, a epidemia de FHB provocou uma perda econômica estimada de 2,7 bilhões de dólares apenas nos EUA. As espécies Fusarium, que provocam FHB, produzem toxinas que pertencem aos tricotecenos como Desoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV) e seus derivados incluindo 3-acetildesoxinivalenol (3-ADON), 15-ADON e 4- acetilnivalenol. As mesmas também produzem micotoxinas como zearalenona (ZEA), moniliformina, fumonisinas e butenolido. A maioria dessas micotoxinas está associada à virulência fúngica e provoca toxicose em humanos e animais.
[003] O gerenciamento de FHB com base no uso de cultivares resistentes com bons tratos agronômicos forneceria potencialmente uma estratégia de controle simples e eficaz. Entretanto, até o momento, poucos acessos a trigo e cevada, ou outras plantas de cultura principais com resistência moderada a FHB foram relatados. A resistência a FHB é um trato quantitativo, governado pelos efeitos combinados de diversos loci de trato quantitativo (QTL), epistasia e o ambiente. Um QTL principal (Fhb1) no cromossomo 3BS e outro QTL menor derivado do cultivar chinês Sumai são as principais fontes de resistência genética a FHB em trigo. Em contrapartida, fontes de resistência a FHB em cevada são limitadas e fornecem apenas um nível modesto de resistência. Devido à natureza poligênica de resistência a FHB, o desenvolvimento de cultivares resistentes com tratos agronômicos adequados é ainda um desafio. A descoberta de genes antifúngicos ou antitoxina fornece uma estratégia potencial para o desenvolvimento de cultivares resistentes a FHB; que pode conferir adicionalmente resistência a outras doenças fúngicas. Consequentemente, a presente invenção aborda o problema de fornecer genes antifúngicos de origem vegetal que são capazes de conferir resistência a FHB provocada por Fusarium; e outras doenças fúngicas (por exemplo, Aspergillus) quando expressados em cultivares de cereal, assim como em outras plantas de culturas como legumes e algodão.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] De acordo com uma primeira modalidade, a invenção fornece uma planta de cultura geneticamente modificada que tem um construto de DNA recombinante integrado de modo estável no genoma da planta de cultura; o referido construto compreendendo um gene operacionalmente ligado a um promotor de origem heterólogo ou homólogo, em que - o referido promotor direciona expressão do referido gene operacionalmente ligado pelo menos em grão ou semente da referida planta, e - o referido gene compreende uma sequência de codificação que codifica um peptídeo sinal fusionado em terminal N a um polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC 3.4.23.12), e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo tem pelo menos 88% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446, SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 32 a 453 e SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 29 a 460, e em que a referida planta de cultura é selecionada a partir do grupo consistindo em uma planta de cereal, legume e algodão, e em que a expressão do referido gene confere resistência melhorada a uma doença fúngica provocada por uma espécie de Fusarium e/ou Aspergillus em comparação com uma planta de cultura parental da qual a referida planta de cultura geneticamente modificada foi derivada.
[005] A invenção fornece adicionalmente grão ou semente geneticamente modificado produzido pela planta de cereal geneticamente modificada da invenção.
[006] Em uma segunda modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção compreendendo: a) transformar uma ou mais células de uma planta de cultura parental selecionada a partir de uma planta de cereal, legume ou algodão com um construto de DNA recombinante compreendendo um gene operacionalmente ligado a um promotor de origem heterólogo ou homólogo, em que: - o referido promotor direciona expressão do referido gene operacionalmente ligado em pelo menos grão ou semente da referida planta, e, - o referido gene compreende uma sequência de codificação que codifica um peptídeo sinal fusionado em terminal N a um polipeptídeo que tem atividade de aspartil protease (EC 3.4.23.12), e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo tem pelo menos 89% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446, SEQ ID NO:45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; SEQ ID NO:47 de resíduos de aminoácido 32 a 453 e SEQ ID NO:49 de resíduos de aminoácido 29 a 460, e b) selecionar células de planta de cultura transformadas, em que o genoma das referidas células compreende uma cópia do referido construto de DNA recombinante; e c) regenerar uma planta de cultura geneticamente modificada a partir de células obtidas na etapa (b).
[007] Em uma terceira modalidade, a invenção fornece um método para fabricar grão ou semente geneticamente modificado de acordo com a invenção para produção de uma cultura de plantas geneticamente modificadas que exibem resistência aumentada a uma doença fúngica provocada por uma espécie de Fusarium e/ou Aspergillus, o referido método compreendendo: a) triar uma população de plantas de cultura geneticamente modificadas, de acordo com a presente invenção, para o referido construto de DNA recombinante, e b) coletar semente das plantas selecionadas da etapa (a).
[008] Em uma quarta modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma planta de cultura que exibe resistência aumentada a uma doença fúngica provocada por uma espécie de Fusarium e/ou Aspergillus, o referido método compreendendo: a) obter uma amostra de ácidos nucleicos de uma planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a invenção, ou porção das mesmas; b) detectar na referida amostra a presença do referido construto de DNA recombinante; c) reproduzir uma planta de cultura compreendendo o referido construto de DNA recombinante com uma segunda planta de cultura do mesmo gênero para obter grãos ou sementes; e d) crescer pelo menos uma planta de cultura a partir dos referidos grãos ou sementes, em que a referida planta de cultura crescida a partir dos referidos grãos ou sementes compreendo o referido construto de DNA recombinante; e em que o referido construto de DNA recombinante compreende um gene operacionalmente ligado a um promotor de origem heterólogo ou homólogo, em que - o referido promotor direciona expressão do referido gene operacionalmente ligado pelo menos em grão da referida planta, e - o referido gene compreende uma sequência de codificação que codifica um peptídeo sinal fusionado em terminal N a um polipeptídeo que tem atividade de aspartil protease (EC 3.4.23.12), e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo tem pelo menos 85% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 12 resíduos de aminoácido 28 a 446; SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 32 a 453 e SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 29 a 460.
[009] Em uma quinta modalidade, a invenção fornece um uso de grão ou semente geneticamente modificado produzido por uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção (por exemplo, cereal ou legume), para a fabricação de uma composição, em que a referida composição é qualquer uma dentre: a. uma composição de grão ou semente moído, b. forragem animal, e c. forragem animal peletizada em vapor.
[010] Em um sexta modalidade, a invenção fornece um uso de uma espécie geneticamente modificada de Gossypium (por exemplo, Gossypium hirsuta) para a fabricação de algodão.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO FIGURAS
[011] Figura 1. Ilustração mostrando (a) a anotação de sequência principal e (b) a estrutura 3D prevista de proteína HvNEP-1, identificando os resíduos 1 a 29 de peptídeo sinal (SP), pró-domínio (PD), sequência de inserção específica de nepentesina compreendendo resíduos de aminoácido 151 a 172 (NAP-I), e D116 e D322, os dois resíduos aspárticos catalíticos dentro do bolso catalítico (DAS e DPG) e aba de tirosina (Y186) que mantém o substrato dentro do bolso.
[012] Figura 2. Alinhamento de sequências múltiplo da proteína HvNEP-1 e proteínas de endoprotease aspártica de planta relacionadas. As sequências na Figura 2A são: Hordeum vulgare nepentesina 1 (HvNEP-1) (M0W9B2: SEQ ID NO: 2); Aegilops tauschii (XP-020183092.1); Triticum aestivum (W5EU17); Triticum urartu (T1NBT2); Hordeum vulgare phytepsin (P42210: SEQ ID NO: 36); Nepenthes mirabilis Nep1 (UNIPROT: K4MIM1: SEQ ID NO:37) e Hordeum vulgare UNIPROT: CND41 (BAK02683: SEQ ID NO:38). As sequências na Figura 2B são: Hordeum vulgare nepentesina 1 (HvNEP-1) (M0W9B2); Aegilops tauschii (XP-
020183092.1); Triticum aestivum (W5EU17); Triticum aestivum (A0A1D6RYR6); e Triticum urartu (T1NBT2). Os resíduos são sombreados em cinza claro ou cinza escuro dependendo do nível de conservação dentre as sequências
[013] Figura 3 Apresentação gráfica de atividade inibitória de HvNEP-1, mostrada como percentual de inibição de atividade de fitase, por (i) uma faixa de pH e (ii) uma faixa de temperatura. O ensaio compreendeu 5 μg de HvNEP-1, 2,5 U/mL de fitase de A. ficuum e 2 mM de substrato de fitato de sódio, que foi incubado por 1 h usando os seguintes tampões: pH 2,0 a 2,5, 100 mM de formato; pH 3,0 a 5,5, 100 mM de acetato; pH 6,0 a 7,0, 100 mM de fosfato de sódio; pH 8,0, 100 mM de Tris-HCl a 37 °C. O ensaio em (ii) foi realizado usando 100 mM de tampão de acetato pH 5,0, incubado por 1 h. A atividade de HvNEP- 1 foi calculada como percentual de inibição de fitase, em comparação com a amostra correspondente sem HvNEP-1, como controles. Os valores são a média de 3 réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam médias ±sd de réplicas.
[014] Figura 4 Apresentação gráfica (histograma) da atividade inibitória residual de HvNEP-1 após incubação por 1 h a 37 °C na presença dos inibidores de protease: E-64 (50 µM), pepstatina A (100 µM), fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF, 1 mM), EDTA (5 mM) e DMSO (3%). A atividade inibitória residual foi medida conforme descrito na Figura 3, e o percentual de atividade residual foi calculado em relação à amostra correspondente sem inibidor de protease, como controle. Os valores são a média de 3 réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam médias ±sd de réplicas.
[015] Figura 5 Apresentação gráfica de atividade residual de fitase de A. ficuum (a) e fitases de TaPAPhy (B) após tratamento com as proteases HvNEP-1 ou pepsina em diferentes razões de concentração de fitase para protease (p:p). Os valores são a média de 3 réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam média + ±sd de réplicas.
[016] Figura 6 Apresentação gráfica de atividade residual de fitase detectada em extratos de fitase brutos (100 µg) de F. graminearum 7775 e F. culmorum 8984 medida na presença de razões de concentração crescentes de HvNEP-1 protease (p:p), usando fitato de sódio como substrato. Os valores são a média de 3 réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam média + ±sd de réplicas.
[017] Figura 7 Apresentação gráfica de biomassa de cepa JCM 9873 de F. graminearum durante crescimento por um período de 8 dias na presença ou ausência de HvNEP-1 protease; os valores são a média de 3 réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam média ±sd de réplicas.
[018] Figura 8 Apresentação gráfica de produção de 15-ADON por cepa JCM9873 de F. graminearum durante crescimento por um período de 8 dias na presença ou ausência de HvNEP-1 protease. Na presença de HvNEP1, a produção de 15-ADON produção por F. graminearum foi não detectável. Os valores são a média de 3 réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam médias ±sd de réplicas.
[019] Figura 9 Apresentação gráfica dos níveis de expressão relativos de genes TRI em cepa JCM9873 de F. graminearum após cultura com e sem e, então, detectados por análise qPCR. A expressão gênica de TRI4, TRI5, TRI6 e TRI12 foi normalizada usando níveis de expressão de gene GADPH. Os asteriscos nas barras representam: diferenças significativas (*), altamente significativas (**) e muito altamente significativas (***) em expressão de gene TRI com e sem HvNEP-1 protease.
[020] Figura 10 Apresentação gráfica dos níveis de expressão relativos de HvNEP-1 protease, em linhagens de cevada transgênica de HvNEP-1 selecionadas determinadas por análise RT-PCR. As linhagens selecionadas são transformadas com um construto gênico compreendendo um promotor de D-hordeína operacionalmente ligado a um gene que codifica um peptídeo sinal de D- hordeína fusionado a ΔHvNEP-1 que tem uma sequência KDEL de terminal C, operacionalmente ligado a um terminador NOS. Os valores são a média de três réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam média ±sd.
[021] Figura 11 Apresentação gráfica do percentual de infecção de linhagens de cevada transgênica de HvNEP-1 selecionadas pontuadas 3 semanas após inoculação com esporos de F. graminearum (FG) ou esporos de F. culmorum (FC), ou inoculadas com controle de água (MQ). Os valores são a média de três réplicas técnicas independentes, e as barras de erro representam média ±sd.
[022] Figura 12 Apresentação gráfica da análise de AUDPC (área sob curva progressiva de doença) de linhagens de cevada transgênica de HvNEP-1 selecionadas pontuadas 3 semanas após inoculação com esporos de linhagens de cevada transgênica de HvNEP-1 selecionadas pontuadas 3 semanas após inoculação com esporos de F. graminearum (FG) ou esporos de F. culmorum (FC), ou inoculadas com controle de água (MQ). (FG) ou esporos de F. culmorum (FC),
ou inoculadas com controle de água (MQ). A AUDPC mínima e máxima por tratamento são indicadas com barras de erro.
[023] Figura 13 tabula os níveis de micotoxinas desoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV) e zearalenona (ZON) detectadas em linhagens de cevada transgênica de HvNEP-1 selecionadas pontuadas 3 semanas após inoculação com esporos de F. graminearum (FG) ou esporos de F. culmorum (FC), ou inoculadas com controle de água (MQ). FC+ e FG+ denotam grãos que mostram sintomas de FHB, enquanto que FC- e FG- denotam grãos sem sintomas de FHB com F. culmorum (FC) e F. graminearum (FG). Os limites de detecção para DON, NIV e ZEA são >50 µg, >50 µg e >5 µg por kg de DW, respectivamente.
[024] Figura 14. Alinhamento de sequências múltiplo da proteína nepentesina-1 (HvNEP-1) de H. vulgare de Hordeum vulgare e proteínas NEP-1 codificadas por ortólogos de NEP-1 de Zea mays, Glycine max e Gossypium hirsuta. As sequências alinhadas são: HvNEP-1 (UNIPROT: M0W9B2; SEQ ID NO: 2); ZmNEP-1 (ID de proteína: XP_008668084.1; SEQ ID NO:45); GmNEP-1 (ID de proteína: XP_003523200.1; SEQ ID NO:47); e GhNEP-1 (ID de proteína: XP_016704203.1; SEQ ID NO:49). Os resíduos dos tríades catalíticos (D[A/T][S/G]) e (D[P/S]G) são dispostos em caixas, a aba de tirosina (Y) é disposta em caixa; a posição da sequência de "inserção" de NEP-I, ([V/L]…….[A/M/V/I) caracterizada por 4 resíduos de cisteína resíduos nas NEP-1s codificadas por ortólogo, é indicada por uma linhagem contínua. ABREVIATURAS E TERMOS:
[025] Número gi: (identificador genInfo) é um número inteiro exclusivo que identifica uma sequência particular, independente da fonte de base de dados, que é atribuído por NCBI a todas as sequências processadas no Entrez, incluindo sequências de nucleotídeos de DDBJ/EMBL/GenBank, sequências de proteínas de SWISS-PROT, PIR e muitas outras.
[026] Identidade de sequência de aminoácidos: O termo "identidade de sequência" conforme usado no presente documento, indica uma medida quantitativa do grau de homologia entre duas sequências de aminoácidos de comprimento substancialmente igual. As duas sequências a serem comparadas precisam ser alinhadas para render um melhor ajuste possível, por meio da inserção de lacunas ou, alternativamente, truncamento nas extremidades das sequências de proteína. A identidade de sequência pode ser calculada como ((Nref-Ndif)100)/(Nref), em que Ndif é o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que Nref é o número de resíduos em uma das sequências. A identidade de sequência pode ser alternativamente calculada pelo programa BLAST, por exemplo, o programa BLASTP (Pearson W.R e D.J. Lipman (1988)) (www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Em uma modalidade da invenção, o alinhamento é realizado com o método de alinhamento de sequências ClustalW com parâmetros predefinidos conforme descrito por Thompson J., et al 1994, disponível em http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/.
[027] De preferência, os números de substituições, inserções, adições ou deleções de um ou mais resíduos de aminoácido no polipeptídeo em comparação com seu polipeptídeo comparador são limitados, isto é, não mais que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições, não mais que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 inserções, não mais que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 adições e não mais que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 deleções. De preferência, as substituições são substituições de aminoácido conservadoras: limitadas a trocas dentro dos membros do grupo 1: Glicina, Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina; grupo 2: Serina, Cisteína, Selenocisteína, Treonina, Metionina; grupo 3: prolina; grupo 4: Fenilalanina, Tirosina, Triptofana; grupo 5: Aspartato, Glutamato, Asparagina, Glutamina.
[028] Planta de cereal: é um membro da Família Poaceae; essa família abrange a tribo Triticeae, assim como outros membros incluem o gênero Oryza (por exemplo, Oryza sativa), Zea (por exemplo, Zea mays) e Sorghum (por exemplo, Sorghum bicolor). A tribo Triticeae abrange o gênero Triticum (por exemplo, Triticum aestiva) e Hordeum (por exemplo, Hordeum vulgare).
[029] Promotor heterólogo: um promotor é uma região de DNA que inicia a transcrição de um gene operacionalmente ligado. Um promotor heterólogo é um promotor de origem heteróloga em relação ao gene ao qual é operacionalmente ligado, que é um promotor que tem uma sequência de ácidos nucleicos e função que é diferente (heterólogo em origem) do promotor que é operacionalmente ligado ao respectivo gene por natureza.
[030] Um promotor heterólogo e o gene ao qual é operacionalmente ligado pode se originar do genoma de uma planta comum de origem. Nesse caso, quando um membro individual da planta de origem é transformado com um fragmento de DNA compreendendo o referido promotor heterólogo operacionalmente ligado ao referido gene, a planta transformada resultante é definida como uma planta intragênica.
[031] Promotor homólogo: é um promotor que é homólogo em origem ao gene ao qual é operacionalmente ligado; de modo que uma sequência de ácidos nucleicos contínua compreendendo o referido promotor e seu gene operacionalmente ligado esteja presente em um locus dentro do genoma de uma planta de origem. Quando um membro individual da planta de origem é transformado com um fragmento de DNA compreendendo o referido promotor operacionalmente ligado ao referido gene, a planta transformada resultante é definida como uma planta cisgênica.
[032] Gene nativo: é um gene endógeno presente no genoma de uma planta encontrada na natureza.
[033] Construto de DNA recombinante: é um polinucleotídeo não natural compreendendo fragmentos de ácido nucleico derivados de polinucleotídeos de origem diferente que são combinados através do uso de tecnologia de DNA recombinante e cuja sequência de ácidos nucleicos não está presente nos genomas de plantas encontradas na natureza. O construto de DNA recombinante é adequado para inserção no genoma de um organismo (por exemplo, genoma de planta de cereal) por meio de transformação. Os genes que são integrados de modo estável no genoma de uma planta hospedeira são herdados na progênie produzida em gerações de planta subsequentes da planta transformada.
[034] Botão: é o órgão portador do grão de uma planta de cereal, que se desenvolve em um ou mais brotos (galhos) que crescem após o broto parental inicial crescer a partir de uma semente de cereal germinante.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[035] Os patógenos fúngicos das plantas de cultura principais, como cereais, legumes (por exemplo, feijão-soja) e algodão, requerem uma fonte de fósforo. Uma fonte principal de fósforo para tais patógenos é fósforo armazenado como fitato no grão ou sementes dessas plantas de cultura. Em grãos de cereal, o fósforo é também encontrado em uma forma ligada, predominantemente, (~70%) como fitato armazenado na camada de aleurona do grão. A fim de acessar o fósforo ligado a fitato em tais sementes e grãos de cereal e estabelecer com sucesso uma infeção, um patógeno precisa de atividade de fitase. As fitases estão frequentemente entre a paleta de enzimas secretadas produzidas por patógenos fúngicos das principais plantas de cultura, incluindo cereais, legumes e algodão.
[036] As plantas desenvolveram inibidores de enzimas microbianas patogênicas como componentes de defesa. A presente invenção aborda o problema de desenvolvimento genético de plantas de cultura aprimoradas (em particular, plantas de cereal, legume e algodão que têm resistência melhorada em relação aos patógenos fúngicos, em particular, espécie de Fusarium e Aspergillus, que é a causa das principais doenças fúngicas, incluindo fusariose da espiga (FHB) ou giberela em cereais. I Uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção
[037] A invenção fornece uma planta de cultura geneticamente modificada, em particular, uma planta selecionada dentre um cereal; um legume (sendo um membro da família Fabaceae; em particular, Glycine spp; como G. max, também conhecido como feijão-soja); ou uma planta da família Gossypium (algodão) (por exemplo, Gossypium spp., G. hirsuta). Em uma modalidade, a planta de cultura geneticamente modificada é um cereal pertencente à família Poaceae, em particular, um membro da tribo Triticeae ou da tribo Andropogoneae.
[038] O genoma da planta de cultura é geneticamente modificado através da introdução de um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1. Esse polipeptídeo pertence a uma nova família de endoproteases aspárticas do tipo nepentesina-1 identificadas no presente documento que são nativas de plantas de cereal (Triticeae e Andropogoneae), assim como plantas de legume e algodão. A identificação tem como base uma homologia estrutural entre o polipeptídeo e a nepentesina-1 e a nepentesina-2 encontradas no fluido de jarro de plantas carnívoras, em particular, a presença de bolso catalítico formado pelas tríades catalíticas (DAS e DPG) e a posse de uma sequência de inserção específica de nepentesina (NAP-I), conforme detalhado no Exemplo 1.3 (figura 2, 14). Esses membros dessa nova família encontrada em Triticeae compartilham um alto grau de homologia estrutural, distinguindo os mesmos de outras proteases aspárticas encontradas em cereais. Os membros de polipeptídeo dessa nova família exibem ainda algumas propriedades funcionais em comum com as nepentesinas (EC
3.4.23.12), com base nas propriedades exibidas por um membro de polipeptídeo
(obtido por expressão recombinante em levedura) conforme detalhado no Exemplo 2.3. Consequentemente, a atividade catalítica do polipeptídeo pode ser classificada como pertencente a EC 3.4.23.12.
[039] Um membro nativo das endoproteases aspárticas do tipo nepentesina-1 encontradas na planta de cereal, Hordeum vulgare, é HvNEP-1. O gene nativo H. vulgare que codifica HvNEP-1 (que tem sequência de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1), codifica um polipeptídeo que tem 453 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). A sequência de aminoácidos principal codificada pelo gene nativo de HvNEP-1 inclui um peptídeo sinal de terminal N putativo (resíduos de aminoácido 1 a 29) e um pró-domínio previsto (resíduos de aminoácido 30 a 80) e um domínio de proteína madura. A sequência de aminoácidos principal de membros adicionais da nova família de endoprotease aspártica do tipo nepentesina-1 que são nativos das plantas de cereal (em particular Triticeae), assim como as plantas de cultura Glycine max e Gossypium hirsutum, é alinhada com a sequência de HvNEP-1 nas Figuras 2B e 14 respectivamente.
[040] A sequência de aminoácidos principal de um polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica do tipo nepentesina-1 expressada em uma planta de cereal geneticamente modificada compreende um peptídeo sinal de terminal N que alveja de modo cotransducional o polipeptídeo expressado para transportar para o retículo endoplasmático. O peptídeo sinal é fusionado para o polipeptídeo transportado compreendendo um domínio pró e um domínio maduro. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo transportado, que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1, tem pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 2 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [HvNEP-1; UNIPROT: M0W9B2] ou SEQ ID NO: 4 de resíduos 1 a 425. Alternativamente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo transportado,
que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1, tem pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com: SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [Ae.tNEP-1; NCBI: XP_020183092.1]; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [TaNEP-1; UNIPROT: W5EU17_WHEAT]; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [TaNEP-1; UNIPROT: A0A1D6RYR6_WHEAT); SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446 [TuNEP-1; UNIPROT: T1NBT2_TRIUA]; e SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453 [ZmNEP-1; ID de proteína: XP_008668084.1].
[041] Em uma modalidade, o peptídeo sinal de terminal N fusionado para o polipeptídeo transportado é um peptídeo sinal derivado de uma proteína de armazenamento de grão de cereal nativo. O peptídeo de sinais adequado inclui um peptídeo sinal de D-hordeína que tem SEQ ID NO: 14 (derivada de UNIPROT:I6TRS8); peptídeo sinal de C-hordeína que tem SEQ ID NO:16 (derivada de UNIPROT: Q41210); um peptídeo sinal de D-hordeína que tem SEQ ID NO:18 (derivada de UNIPROT: Q0PIV6), um peptídeo sinal de glutenina que tem SEQ ID NO: 20 (derivada de UNIPROT: P08488), e um peptídeo sinal de gliadina que tem SEQ ID NO:22 (derivada de UNIPROT: Q41529). Adicionalmente, um peptídeo sinal adequado inclui o peptídeo sinal nativo correspondente ao polipeptídeo de NEP-1 selecionado; por exemplo, o peptídeo sinal de HvNEP-1 que tem SEQ ID NO:24; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 1 a 29 [Ae.tNEP-1]; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 1 a 29 [TaNEP-1]; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 1 a 29 [TaNEP-1); SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 1 a 27 [TuNEP-1]; e SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 1 a 26 [ZmNEP-1; ID de proteína: XP_008668084.1].
[042] Em uma modalidade adicional, a sequência de aminoácidos principal de um polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 expressada em uma planta de cereal geneticamente modificada pode incluir um sinal de retenção de retículo endoplasmático (ER) fusionado para o terminal C do polipeptídeo codificado e expressado. Os sinais de retenção de ER adequados podem ser selecionados dentre um marcador de KDEL, SEKDEL e HDEL.
[043] Nas plantas de cereal do tipo selvagem, a atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 foi detectada inicialmente no grão de cereal (Exemplo 1). A transformação de plantas de cereal do tipo selvagem com um gene que codifica um polipeptídeo da invenção serve para melhorar o nível de expressão desse gene na planta e melhorar correspondentemente o nível de atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1. O gene que codifica o polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 em uma planta de cereal geneticamente modificada pode ser expressado especificamente em tecido em um tecido do grão de cereal durante o desenvolvimento de grão ou pode ser expressado constitutivamente em ambos os tecidos grão de cereal e outras partes de planta. A fim de obter a expressão de gene específica de grão, um promotor específico de grão de cereal de origem heteróloga é fusionado cognitivamente para o gene que codifica o polipeptídeo. Por exemplo, o promotor heterólogo pode ser usado para direcionar a expressão específica de tecido do gene cognato da invenção no tecido de armazenamento de endosperma, lema ou aleurona do grão. Os promotores heterólogos adequados para direcionar a expressão específica de endosperma durante o desenvolvimento de um grão de cereal incluem um promotor que direciona, por natureza, a expressão de um gene de D-hordeína que tem SEQ ID NO: 25; um gene de C-hordeína que tem SEQ ID NO: 26, gene de B-hordeína que tem SEQ ID NO: 27; um gene de glutenina que tem SEQ ID NO: 28, um gene de α-gliadina que tem SEQ ID NO: 29, um gene de α-zeína que tem SEQ ID NO: 50, e um gene de glutelina GluB-1 que tem SEQ ID NO: 51. Os promotores heterólogos adequados para direcionar expressão específica de aleurona durante o desenvolvimento de um grão de cereal incluem um promotor que direciona, por natureza a expressão de um gene de LTP1 que tem SEQ ID NO: 41. Os promotores constitutivas incluem os promotores de CaMV35S e ubiquitina [n° de acesso NCBI: AR287190]. Alternativamente, o promotor homólogo do gene que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser usado para acionar sua expressão; por exemplo, o promotor que direciona, por natureza, a expressão do gene de HvNEP1 que tem SEQ ID NO: 40.
[044] A planta de cereal geneticamente modificada da invenção pertence à família Poaceae; e pode ser, por exemplo, selecionada dentre o gênero de Triticum, Hordeum, Secale, Triticale, Sorghum, Zea e Oryza. Em particular, a planta de cereal pode ser uma espécie selecionada dentre Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Secale cereale, Oryza sativa, Zea mays e um híbrido Triticale. Mais particularmente, a planta de cereal geneticamente modificada da invenção é uma espécie de Triticum ou Hordea.
[045] Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de cereal geneticamente modificada intragênica compreendendo um construto de DNA recombinante integrado no genoma da planta de cereal, em que o construto compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC
3.4.23.12), e em que o promotor heterólogo e seu gene operacionalmente ligado são ambos derivados do genoma do progenitor da planta de cereal geneticamente modificada.
[046] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece uma planta cisgênica de cereal geneticamente modificada compreendendo um construto de DNA recombinante integrado no genoma da planta de cereal, em que o construto compreende um promotor homólogo operacionalmente ligado a um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC
3.4.23.12), em que o promotor homólogo é o promotor nativo para seu gene operacionalmente ligado e ambos são derivados do genoma do progenitor da planta de cereal geneticamente modificada.
[047] Uma modalidade preferencial da invenção fornece uma espécie geneticamente modificada de Hordeum, compreendendo um construto de DNA recombinante, o referido construto compreendendo um gene que codifica um peptídeo sinal fusionado a um HvNEP-1 que tem SEQ ID NO: 4; em que o gene é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo que tem uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 25, 26 ou 27. De preferência, o peptídeo sinal tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 14, 16 e 18.
[048] Uma modalidade preferencial da invenção fornece uma espécie geneticamente modificada de Triticum, compreendendo um construto de DNA recombinante, o dito construto compreendendo um gene que codifica um peptídeo sinal fusionado à proteína de NEP-1 que tem uma sequência selecionada dentre o grupo: SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [Ae.tNEP-1; NCBI: XP_020183092.1]; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451[TaNEP-1; UNIPROT: W5EU17_trigo]; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451[TaNEP-1; UNIPROT: A0A1D6RYR6_trigo); de SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446 [TuNEP-1; UNIPROT: T1NBT2_TRIUA]; em que o gene é ligado de modo funcional a um promotor heterólogo que tem uma sequência de SEQ ID NO: 28 ou 29. De preferência, o peptídeo sinal tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 1 a 29 [Ae.tNEP-1]; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 1 a 29 [TaNEP-1]; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 1 a 29 de [TaNEP-1); SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 1 a 27 de [TuNEP-1].
[049] Uma outra modalidade preferencial da invenção fornece uma espécie geneticamente modificada de Zea mays, compreendendo um construto de DNA recombinante, o referido construto compreendendo um gene que codifica um peptídeo sinal fusionado a um HvNEP-1 que tem SEQ ID NO: 4 ou to ZmNEP-1 que tem SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; em que o gene é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo que tem uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 50 ou 51. De preferência, o peptídeo sinal tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 14, 16 e 18 ou SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 1 a 26.
[050] Quando a planta de cultura geneticamente modificada é um legume; em particular um spp., de Glycine (como G. max); a planta é modificada para compreender um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 (EC 3.4.23.12). Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1, tem pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 2 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [HvNEP-1; UNIPROT: M0W9B2] fusionado para o peptídeo sinal de D-hordeína de terminal N (SEQ ID NO:14). Alternativamente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1, tem pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com: SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 1 a 453 (em que o peptídeo sinal nativo é fusionado para a proteína madura) ou 32 a 453, correspondente à proteína madura [GmNEP-1; ID de proteína: XP_003523200.1] e fusionado para uma peptídeo sinal heterólogo preferencial.
[051] Quando a planta de cultura geneticamente modificada é um membro da família Gossypium, em particular, um spp., de Gossypium (como G. hirsuta); a planta é modificada para compreender um gene que codifica um polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 (EC 3.4.23.12). Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo, que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1, tem pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 2 de resíduos de aminoácido 30 a 451 [HvNEP-1; UNIPROT: M0W9B2] fusionado para o peptídeo sinal de D-hordeína de terminal N (SEQ ID NO:14). Alternativamente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1, tem pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade de sequência de aminoácidos com: SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 1 a 460 (em que o peptídeo sinal nativo é fusionado para a proteína madura) ou 29 a 460 de correspondente à proteína madura [GhNEP-1; ID de proteína: XP_016704203.1] e fusionado para um peptídeo sinal heterólogo preferencial. O gene que codifica o polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 no referido legume ou membro geneticamente modificado da família Gossypium, pode ser expressado especificamente em tecido no tecido de semente durante o desenvolvimento; ou pode ser expressado constitutivamente em ambos os tecidos de semente e outras partes de planta. A fim de obter a expressão de gente especificamente de semente, um promotor específico de semente é fusionado cognitivamente para o gene que codifica o polipeptídeo.
[052] Os promotores adequados para direcionar expressão específica de semente no referido legume geneticamente modificado incluem um promotor que tem SEQ ID NO: 52 que direciona, por natureza, a expressão de um β- conglicinina; ou um promotor que tem SEQ ID NO: 53 que direciona, por natureza, a expressão de um gene de soyAP1.
[053] Os promotores adequados para direcionar expressão específica de semente no referido membro geneticamente modificado da família Gossypium (em particular, G. hirsuta) incluem um promotor que tem SEQ ID NO: 54 que direciona, por natureza, a expressão de um gene de α-globina de G. hirsutum; ou um promotor que tem SEQ ID NO: 55 que direciona, por natureza, a expressão de um gene de proteína de armazenamento (Gh- sp) de G. hirsutum. II Resistência fúngica de uma planta de cereal geneticamente modificada da invenção
[054] Uma planta de cultura geneticamente modificada (em particular, uma planta de cereal, legume ou algodão) compreendendo um gene que direciona a expressão melhorada de um polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 em desenvolvimento de grão ou semente de o planta é mais resistente à doença fúngica que a planta parental a partir da qual foi derivada por modificação genética.
[055] Em particular, a planta de cultura geneticamente modificada da invenção exibe resistência melhorada à infeção por Fusarium e, de preferência, aos patógenos tanto de Fusarium quanto de Aspergillus. A resistência melhorada ao ataque patógeno por isolados de F. graminearum e F. culmorum é ilustrada em relação às plantas de cereal geneticamente modificadas de acordo com a invenção no Exemplo 5. Nesse exemplo, a porcentagem média de infeção de botões em desenvolvimento que varia de 3,41 a 23,08 % nas plantas geneticamente modificadas de Hordeum vulgare, enquanto a porcentagem média de infecção em botões de planta parentais de controle varia de 31,88 a 50 % tanto para a cepa de F. graminearum quanto para a cepa de F. culmorum. A progressão de FHB nos botões infectados por um período de semanas foi também reduzida nas plantas geneticamente modificadas de Hordeum vulgare em comparação às plantas de controle.
[056] As indicações sobre o mecanismo subjacente em que a expressão da proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 em uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção melhora a resistência fúngica são observadas a partir do efeito de HvNEP-1 recombinantemente expressado no crescimento e na produção de toxina através de Fusarium cultivado no meio de crescimento controlado. As culturas de crescimento de Fusarium foram inibidas significativamente quando cultivadas na presença de HvNEP-1, que reflete o efeito inibitório na infeção por Fusarium e a progressão da doença fúngica em plantas de cereal geneticamente modificadas que expressam HvNEP-1. É importante ressaltar que tanto a produção quanto a expressão de genes (TRI4, TRI5 e TRI6) exigidas para síntese de tricoteceno fúngico foram inibidas em culturas de Fusarium pela presença de HvNEP-1 (conforme mostrado no Exemplo
3.3). Mais especificamente, as enzimas fitase produzidas por culturas de Fusarium, que desempenham um papel essencial na liberação de fosfato exigida para crescimento de Fusarium em grãos de cereal, são inibidas fortemente por HvNEP-1 (conforme mostrado no Exemplo 3.1). Surpreendentemente, as fitases fúngicas são mais sensíveis à inibição por endoprotease aspártica do tipo nepentesina-1 da invenção em comparação às fitases nativas dos grãos de cereal (consulte o Exemplo 2). Adicionalmente, a capacidade de as proteinases aspárticas do tipo nepentesina-1 da invenção inibirem fitases fúngicas não é compartilhada por outras proteases aspárticas (pepsina) que indicam que a endoprotease aspártica do tipo nepentesina-1 forma uma classe distinta e exclusiva de enzimas, cujas propriedades seletivas de substrato conferem resistência ao ataque fúngico. III Métodos para produzir e detectar uma planta de cultura geneticamente modificada da invenção
[057] Uma molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 a ser expressada na planta de cultura da invenção (consulte a seção I) pode ser derivada através de amplificação específica de sequência da sequência correspondente do gene de NEP-1 nativo a partir do DNA genômico extraído da respectiva planta. A molécula de ácido nucleico pode ser também produzida sinteticamente para compreender uma sequência de codificação para o respectivo polipeptídeo; e cuja sequência de nucleotídeos é, de preferência, otimizada para expressão na respectiva planta. Exemplos de moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos que têm atividade de proteinase aspártica do tipo nepentesina-1 para expressão em uma planta de cultura de acordo com a invenção são fornecidos na listagem de sequência. A molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para usar na invenção é ligada de modo funcional (fusionada) a regiões reguladoras cis compreendendo uma molécula de ácido nucleico promotora de origem heteróloga e, de preferência, também uma molécula de ácido nucleico terminadora. O promotor pode ser constitutivo; ou, de preferência, um promotor específico de tecido que direciona expressão específica de tecido de grão ou semente em desenvolvimento da planta de cultura. Quando a planta de cultura é um cereal, de preferência, o promotor é um promotor específico de endosperma, por exemplo, um promotor que aciona a expressão de um gene de proteína de armazenamento nativo para a planta de cereal a ser geneticamente modificadas.
[058] A molécula de ácido nucleico terminadora pode ser similarmente derivada de um terminador que termina a expressão de um gene de proteína de armazenamento nativo para a planta de cultura a ser geneticamente modificada; ou o terminador pode ser um terminador de CaMV 35S (SEQ ID NO: 30) ou um terminador derivado do gene nopalina sintase (SEQ ID NO: 31) isolado a partir de Agrobacterium tumefaciens.
[059] Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo para uso na invenção operacionalmente ligado a regiões reguladoras cis é introduzida em um construto de ácido nucleico (vetor pWBVec8; Gynheung et al., 1988), garante a clonagem eficiente nas cepas de E. coli e, subsequentemente, cepas de Agrobacterium, e que possibilita a transformação estável das plantas de cultura da invenção. Tais vetores incluem sistemas vetoriais binários e cointegrados, que são adequados para a transformação mediada por T-DNA. Os sistemas vetoriais são, em geral, caracterizados por terem pelo menos os genes vir, que são exigidos para transformação mediada por Agrobacterium, e sequências delimitadoras de T-DNA.
[060] A transformação por Agrobacterium envolve tipicamente a transferência do vetor binário que carrega o DNA estranho de interesse (por exemplo, vetor pWBVec8) para uma cepa apropriada de Agrobacterium, e pode ser realizada conforme descrito por Gynheung et al., (1988). Por exemplo, a transformação de uma espécie de planta de cereal parental por Agrobacterium recombinante pode ser realizada através de cocultivação de uma suspensão de células de Agrobacterium transformadas com embriões de grãos de célula imaturos isolados em um meio de crescimento seletivo sólido após o procedimento descrito por Bartlett et al., (2008) e Holme, et al. (2012). O tecido transformado é regenerado no meio seletivo que carrega um marcador de resistência ao antibiótico ou herbicida presente entre os limites de T-DNA do vetor binário.
[061] Os transformantes positivos podem ser identificados ao usar PCR de um iniciador 5’ com ligação a um sítio localizado na região de promotor a montante da sequência de codificação de NEP-1 e de um iniciador 3’ localizado no interior da sequência de codificação para a proteinase aspártico do tipo nepentesina-1; como distinguir o gene inserido a partir de um gene nativo que codifica uma proteinase aspártica.
[062] Os genes cis em plantas cisgênicas podem ser identificados com o uso de análise de southern blot padrão ou por meio de iPCR (Triglia et al., 1988), em que uma ou mais cópias de um gene e suas respectivas regiões de flanqueamento no genoma são amplificadas, e, então, comparadas. Dessa maneira, iPCR pode ser usado para distinguir e identificar um gene inserido no genoma de uma planta cisgênica de cereal geneticamente modificada da invenção por transformação e uma cópia nativa do gene no genoma. III Uso de plantas de cultura geneticamente modificadas da invenção
[063] Os grão e sementes geneticamente modificados produzidos por plantas de cultura geneticamente modificadas da invenção têm um risco inferior de contaminação com toxinas e micotoxinas devido à sua resistência melhorada à infeção por doença fúngicas, em particular, infecções de Fusarium. A infeção por essas doenças fúngicas é acompanhada pela produção de toxinas pertencentes aos tricotecenos (por exemplo, Desoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV) e seus derivados incluindo 3-acetildesoxinivalenol (3-ADON), 15-ADON e 4- acetilnivalenol) e micotoxinas (por exemplo, zearalenona, moniliformina, fumonisinas e butenolido). Uma vez que tanto as toxinas quanto as micotoxinas carregam um risco à saúde quando usadas como alimentação para animais ou para consumo humano, há uma vantagem em usar o grão derivado de plantas de cereal geneticamente modificado da invenção. Consequentemente, o grão ou sementes produzidas por plantas de cultura geneticamente modificadas da invenção podem ser usadas na produção de forragem animal; processado para consumo humano ou usadas para fabricação de fibra/fios.
[064] As etapas de processamento tradicional realizadas quando o uso de grão de cereal geneticamente modificado da invenção incluem uma ou mais etapas a seguir: i. Limpeza/condicionamento de grão de cereal: Primeiramente, o grão geneticamente modificado é limpo. Por exemplo, o grão pode ser passado através dos ímãs e/ou detectores de metal para remover qualquer contaminação metálica. As máquinas podem ser usadas para separar quaisquer outras sementes, pedras ou poeira que possam ter sido misturados com o trigo. ii. Grão de moagem: O grão limpo e condicionado é mesclado com outros tipos de grão em proporções diferentes para gerar tipos diferentes de farinha.
[065] O grão moído passa por rolos especiais denominados rolos de ruptura. Eles rompem cada grão em três partes: germe de grão de cereal, farelo e endosperma. As peneiras peneiram as três partes separadas em fluxos diferentes. iii Mistura: As frações de farelo, germe e endosperma que foram separadas podem ser opcionalmente mescladas, e podem ser moídas para gerar tipos diferentes de composição de grão de cereal moído, como farinha de trigo integral, usando todas as partes do grão; a Farinha marrom contém cerca de 85% do grão original, mas com um pouco de farelo e germe removidos; e a Farinha branca é feita apenas a partir do endosperma. iv. Peletização a vapor: A composição de grão de cereal moído pode ser combinada com ingredientes de forragem em uma máquina de peletização a vapor, em que os componentes são expostos ao vapor a uma temperatura de cerca de 80 oC a 90 oC por um período de tempo suficiente para reduzir a população microbiana a níveis seguros para consumo animal, e o produto é convertido em péletes secos.
EXEMPLOS Exemplo 1: Detecção, isolação e identificação de um inibidor de fitase fúngica de Hordeum vulgare
[066] O extrato de proteína cru (CPE) foi extraído a partir dos grãos de cevada cv. Invictus fracionado e analisado para a capacidade de inibir a fitase de a. ficuum conforme a seguir:
[067] 1.1 Extração de fitase: Os grãos (5 g) foram moídos em um pó fino com o uso de um moinho rotativo (controle de moinho de tubo IKA), e as proteína de grão foram extraídas em solução tampão de acetato de sódio a 25 mM 1:10 (p/v) (pH 5,5) contendo 0,1 mM de CaCl2, por agitação constante (300 rpm) a 25 oC por 1 h. O sobrenadante de extrato foi coletado por centrifugação (3392×g, por 30 minutos a 4 oC), ao qual o sulfato de amônio foi adicionado a 60% de saturação, e as proteínas precipitadas foram coletadas por centrifugação (7000×g, 15 min, 259 a 4 °C). O pélete de proteína foi ressuspenso em 50 mL de tampão de acetato a 25 mM (pH 4,5) e dializado contra tampão de Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5) durante a noite. O sobrenadante foi coletado por centrifugação (7000×g, 30 min, 4 °C) e concentrado (corte em Vivaspin Turbo 30 kDa). As proteínas (>30 kDa) foram carregadas para um dispositivo de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida ÄKTA Cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) equipado com uma coluna Superdex G200, e as frações coletadas por FPLC foram avaliadas em relação à inibição de fitase de Aspergillus ficuum que emprega o ensaio de fitase descrito abaixo. As frações que tem atividade inibitória de fitase foram analisadas por Espectrometria de Massa (MS) de acordo com Dionisio, G. et al. (2011), para identificar o inibidor de fitase entre as proteína detectadas.
[068] 1.2 ensaio de fitase: A atividade de fitase e sua inibição foi medida de acordo com um método com molibdato de amônio (Engelen AJ, et al., 1994). Em suma, 100 μl de fração de FPLC (0±1 mg mL-1) foram incubadas com 10 μl (2,5 U mL-1) de fitase de A. ficuum, 1 mM de fitato de sódio e 400 μl de tampão de acetato de sódio (pH 5,5) contendo 0,1 mM de CaCl2, a 37 oC por 1 hora. A reação foi terminada ao adicionar 800 μl de solução de parada (heptamolibdato de amônio a 20 mM, vanadato de amônio a 5 mM e ácido nítrico a 6% à concentração final) à mistura de reação. Após a centrifugação (4226×g, 5 min), a absorbância do sobrenadante foi medida a 415 nm com o uso de um leitor de placa de 96 poços (Epoch, Bio-Tek, EUA). A atividade residual de fitase foi determinada em relação a uma amostra em branco.
[069] 1.3 Identidade do inibidor de fitase candidato: A análise de MS da principal fração inibitória identificou peptídeos a partir de 30 proteínas diferentes; dos quais 4 peptídeos corresponderam a uma proteína não caracterizada anotada como tendo atividade de aspartil protease (Uniprot: M0W9B2). Esse inibidor candidato foi estimado por MS como tendo peso molecular de 48,915 kDa.
[070] Um gene de cevada candidato foi previsto a partir do número de acesso Uniprot identificado (M0W9B2) e tblastN contra a sequência genômica de cevada na base de dados de NCBI e no servidor de BLAST de cevada IPK. O gene candidato teve um quadro um quadro de leitura aberto (ORF) de 1362 bp que codifica uma proteína de 453 aminoácidos com um peso molecular previsto de 48,9 kDa. A proteína deduzida codificou um pré-proenzima com um peptídeo sinal putativo, um pró-domínio e um polipeptídeo longo interrompido pela sequência de inserção específica de nepentesina (NAP-I) (Figura 1a). A sequência NAP-I é prevista com base na sequência NAP conforme descrito para nepentesinas e homólogos (Athauda et al., 2004). Com base na organização de estrutura primária do tipo endoprotease aspártica de nepentesina (NPAP) característica da proteína deduzida, foi identificado como um HvNEP-1 (isto é, uma endoprotease aspártica do tipo nepentesina-1 de cevada). A estrutura em 3D prevista da proteína madura exibe um bolso catalítico formado por duas tríades catalíticas (DAS e DPG) sustentadas pelo resíduo Tyr (Y186) como um aba (Figura 1b). O alinhamento de múltiplas sequências de HvNEP-1 e das proteases aspárticas relacionadas revelaram que os resíduos Asp catalíticos são conservados, mas não a aba Tyr. Os resíduos que formam os tríades catalíticas com Asp diferem das proteases aspárticas características (DTG/DSG e DTG). Além disso, a sequência NAP-I contém dois resíduos Cys em vez de quatro descritos para as principais proteínas de NPAPs (Figura 2). A proteína mostrou <20% de homologia com as nepentesinas da espécie Nepenthes. Exemplo 2: Clonagem, expressão e propriedades do HvNEP-1
[071] 2.1 Clonagem de gene HvNEP-1: Um gene candidato foi previsto a partir da sequência de Uniprot: M0W9B2, e tblastN contra a sequência genômica de cevada na base de dados de NCBI e no servidor de BLAST de cevada IPK. O DNA genômico (gDNA) foi extraído a parti das folhas de 6 dias de idade de cevada cv. As mudas de invictus conforme descrito por Doyle et al., 1991. A sequência de codificação de HvNEP-1 correspondente aos resíduos de aminoácido 30 a 453 codificados (sequência de codificação de peptídeo sinal negativo; ΔHvNEP-1) foi amplificado por PCR com o uso de gDNA como modelo e iniciadores específicos de gene, e DNA polimerase de Herculase II, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). O fragmento de DNA de 1,5 kbp amplificado foi purificado em gel e clonado no vetor pCRII-TOPO Blunt de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os clones selecionados foram avaliados em relação à inserção através da digestão de restrição, e ao sequenciamento (Eurofins Genomics).
[072] 2.2 Expressão de gene HvNEP-1: A sequência de ΔHvNEP-1 que compreende adicionalmente a sequência 3’ que codifica um marcador de His6 de terminal C foi clonada no vetor pGAPZαA a jusante de uma sequência de codificação de sinal de secreção de sinal de fator de acasalamento alfa com o uso de fusão (Zhu et al., 2007), sob o controle do promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAP) (Figura 3); e transformada em cepa KM71 de Pichia pastoris. A expressão de proteína HvNEP-1 em Pichia foi confirmada por espectrometria de massa (MS) de tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF), SDS-PAGE e Western blotting. Os níveis de HvNEP-1 no meio de crescimento foi 1,2 mg/mL. A análise de Western blot com o uso de anticorpos monoclonais anti-His6 de camundongo (Roche) e conjugado de fosfatase alcalina de IgG de anti-camundongo de cabra (BioRad, Hercules, CA), identificou uma proteína com um tamanho aproximado de 92 kDa. A massa teórica prevista do HvNEP-1 truncado é 47 kDa, indicando que o HvNEP- 1 expressado por Pichia forma um homodímero.
[073] 2.3 Propriedades de HvNEP-1: A atividade enzimática de HvNEP-1 (expressado em Pichia), foi medida indiretamente, ao incubar a enzima na presença de fitase de Aspergillus ficuum, como substrato, e, então, detectando a porcentagem de inibição da atividade de fitase medida de acordo com Engelen (1994). O HvNEP-1 exibiu atividade de pico para inibir fitase de A. ficuum no pH 5,0 e a temperatura de 40 °C (Figura 3). A sensibilidade de HvNEP-1 aos inibidores de protease foi característica de uma endoprotease aspártica do tipo nepentesina-1. O HvNEP-1 foi fortemente inibido pelo inibidor de protease, pepstatina A (98,2 % de perda de atividade), enquanto PMSF, E-64, EDTA e DMSO inibiram a atividade enzimática em 13,5%, 6,4%, 9,7% e 2,7% respectivamente (Figura 4).
[074] A seletividade de substrato de HvNEP-1 foi comparada com pepsina (protease de ácido aspártico na atividade de A. ficuum (EC 3.1.3.8) e fitase de trigo TaPAPhy (EC 3.1.3.26). Embora tanto a fitase fúngica quanto a fitase de trigo foram altamente sensíveis à inibição de HvNEP-1 (Figura 5); a sensibilidade de fitase fúngica foi claramente mais forte, uma vez que a atividade residual de fitase de A. ficuum foi reduzida na razões de fitase:protease de 1:500 (Figura 5i), enquanto a atividade de fitase de TaPAPhy residual foi reduzido primeiramente na razões de fitase:protease de 1:100 (Figura 5ii). Em contrapartida, ambas as fitases foram resistentes à pepsina, pois a atividade de fitase não foi afetada após a exposição à pepsina mesmo na razão de fitase:protease de 1:20. Exemplo 3: HvNEP-1 é um inibidor de fitases de Fusarium e o crescimento e a produção de toxina da espécie Fusarium.
[075] 3.1 HvNEP-1 inibe a fitase de Fusarium: O HvNEP-1 inibiu fortemente as fitases nos extratos crus derivados de F. graminearum 7775 e F. culmorum
8984. A incubação com HvNEP-1 em uma razão de fitase: protease de apenas 1:500 de HvNEP-1 (p/p), à temperatura ambiente por 1 h foi suficiente para provocar inibição (Figura 6).
[076] 3.3 HvNEP-1 inibe crescimento de Fusarium e produção de toxinas: A atividade antifúngica de HvNEP-1 recombinantemente expressado contra Fusarium foi analisada com o uso de culturas fúngicas preparadas de acordo com Etzerodt, T. et al. (2015). Uma composição que compreende HvNEP-1 (3,47 mg) ou serina protease Ronozyme ProAct (L) EC 3.4.21.- (suprida por Novozymes) como um controle, em 100 µL de tampão de acetato a 100 mM de pH 5,5 foram adicionados em uma cultura fúngica de 1 mL (107 esporos/mL) no dia 1 e, novamente, no dia 2 de incubação com agitação (22 ⁰C, 130 rpm) por 2, 3, 6 e 8 dias. Nos respectivos dias, massa micelial foi coletada por centrifugação (velocidade máxima de 20 min), seca por congelamento e pesada. Os perfis de toxina foram analisados de acordo com Etzerodt, T. et al. (2015). A expressão de genes envolvidos na síntese de tricoteceno fúngico foi analisada ao extrair o RNA total da massa micelial, colhida após 10 dias de cultura (Chomczynski et al. 2006). As amostras de RNA foram tratadas com DNase (Roche) e transcritos reversamente com o uso do Superscript III-RT (Invitrogen) e a fixação de oligo (dT) 21T contendo iniciador. As transcrições reversas da sequências de codificação TRI4 [XM_011323872.1; SEQ ID NO:32], TRI5 [XM_011323870.1; SEQ
ID NO: 33], TRI6 [que codificam GenBank: CEF78358.1] e TRI12 [que codificam GenBank: ANO39668.1] foram quantificadas por qPCR (6 µL de Mistura principal de Power SYBR Green (Applied Biosystems), 1 µL de cDNA diluído, 2,4 µL de mistura de iniciador a µM e 2,6 µL de água Mili-Q estéril), em um volume final de 12 µL; e os produtos detectados em um sistema de detecção de sequência AB7900HT (Applied Biosystems).
[077] O HvNEP-1 inibiu fortemente tanto o crescimento quanto a produção de toxina, conforme observado pela redução no acúmulo de biomassa nas culturas fúngicas por um período de 8 dias de incubação (Figuras 7 e 8). A expressão dos genes TRI4, TRI5 e TRI6 foi suprimida por HvNEP-1, (Figura 9), em particular, TRI6, cuja supressão foi altamente significativa. Exemplo 4: HvNEP-1 que superexpressam linhagem de Hordeum vulgare
[078] As linhagens transgênicas de Hordeum vulgare que expressam um gene de HvNEP-1 foram obtidas por transformação mediada por Agrobacterium, conforme a seguir:
[079] 4.1 Construção de vetor de transformação de gene HvNEP-1: A sequência de codificação de HvNEP-1 [SEQ ID NO:3] que codifica ΔHvNEP-1 (sem o peptídeo sinal de HvNEP-1 nativo) foi amplificada por PCR a partir do gDNA de Hordeum vulgare. A amplificação por PCR foi usada para criar uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de fusão que compreende um peptídeo sinal de HordD de terminal N [SEQ ID NO: 14] e um SEKDEL de terminal C [SEQ ID NO: 39] que serve como um retículo endoplasmático (ER) que classifica a sequência. A sequência de ácidos nucleicos que codifica essa proteína de fusão de HvNEP-1 foi fusionada a jusante de um promotor de HordD [SEQ ID NO:25] e inserida a montante do Agrobacterium tumefaciens-derivado do terminador NOS [SEQ ID NO: 31] no vetor de transformação pWBVec8 (Gynheung et al., 1988).
[080] 4.2 Geração de linhagens transgênicas de Hordeum vulgare de HvNEP-1: O construto de vetor de transformação de HvNEP-1 foi introduzido na cepa de Agrobacterium AGL0 competente conforme descrito Gynheung et al., (1988). Os transformantes foram selecionados pelo crescimento em placas de LB contendo 100 µg/mL de espectinomicina e 25 µg /mL de Rifampicina por 72 h a 28 ⁰C; e as colônias positivas foram identificadas por PCR. Os clones positivos foram cultivados em meio de MG/L ((Manitol a 5 g/L, ácido L-glutâmico a 1 g/L, KH2PO4 a 0,25 g/L, NaCl a 0,1 g/L, MgSO4*7H2O a 0,1 g/L, Biotina a 1 mg/L, Triptona a 5 g/L, Extrato de levedura a 2,5 g/L) contendo 100 µg/mL de espectinomicina e 25 µg/mL de Rifampicina e, então, usados para transformação de embrião de cevada imaturo após o procedimento descrito por Bartlett et al., (2008) e Holme, et al. (2012).
[081] Após a transformação, a seleção e a regeneração de plantas T0, o gDNA foi isolado a partir de folhas jovens (de acordo com Doyle et al., 1991); e a seleção de transformantes positivos foi confirmada por PCR com o uso de iniciadores diretos e reversos [SEQ ID NO: 34 e 35] com sítios de ligação no interior do promotor de HordD e o gene de HvNEP-1 rendendo um fragmento de PCR de 759 bp.
[082] Vinte linhagens transgênicas de HvNEP-1 (geração T0) mostraram expressão de HvNEP-1 detectável, a expressão mais alta foi observada na linhagem NEP20 (0,4166), a expressão mais baixa na linhagem NEP20-02 (0,0114) (Figura 10) em relação a linhagens não transformadas (GP). Exemplo 5: Linhagens transgênicas de Hordeum vulgare de HvNEP-1 exibem resistência ao Fusarium
[083] As linhagens transgênicas de HvNEP-1 infectadas por Fusarium foram avaliadas em relação à resistência à fusariose da espiga (FHB) e ao acúmulo de micotoxina no estágio de crescimento 85 a 87 (de acordo com a escala de Zadoks
(Zadoks, et al., 1974)).
[084] 5.1 Infecção por Fusarium: As suspensões de esporos isolados de F. graminearum 7775 e F. culmorum 8984 que têm um quimiótipo DON foram preparadas de acordo com Etzerodt, T. et al. (2015). Cada suspensão de esporos (1×105 esporos por mL em água, contendo tween 20 a 0,04%) foi usada para aspergir botões inoculados de linhagens transgênicas de HvNEP-1 T0 de 8 semanas de germinação (estágios de Zadoks 60). Os botões de controle foram aspergidos com água MQ. As plantas golden promise (GP) não transformadas no mesmo estágio de desenvolvimento foram tratadas similarmente com suspensões de esporos Fusarium e água MQ. As plantas inoculadas e simuladas foram cobertas com sacos plásticos e cultivadas em um ambiente controlado (18 a 21 ⁰C e umidade relativa de 70 a 75%). A gravidade da doença de FHB de 10 linhagens transgênicas T0 foi em comparação com plantas Golden Promise de cv de Hordeum vulgure não transformadas, e pontuadas como porcentagem de sementes infectadas nos 3 primeiros botões amadurecidos em cada planta nas semanas 1, 2 e 3 após a inoculação.
[085] 5.2 Gravidade de doença: A pontuação de doença mostrou um redução substancial na gravidade de FHB nas linhagens transgênicas de HvNEP-1 (Figura 11) cuja porcentagem média de infeção variou de 3,41 a 23,08 %, enquanto a porcentagem média de infecção nas plantas GP de controle variou de 31,88 a 50 % para tanto para a cepa de F. graminearum quanto para a cepa de F. culmorum. A progressão de FHB nos botões de linhagens transgênicas e nas plantas GP de controle foi avaliada em relação às primeiras semanas após a inoculação, e à AUDPC (curva de progresso de doença sob área) calculada (Figura 12). A AUDPC média de progresso de FHB foi maior nas plantas de cevada GP que nas linhagens transgênicas de HvNEP-1.
[086] 5.3 Produção de micotoxina: Os níveis de micotoxina detectados após a inoculação com esporos de cepas de F. graminearum ou F. culmorum mostraram uma redução geral na produção de micotoxina nas linhagens transgênicas de HvNEP-1 em comparação com as plantas de cevada GP de controle (Figura 13). Exemplo 6 Clonagem e expressão transgênica de HvNEP-1 e seus genes ortólogos em maís (Zea mays), feijão-soja (Glycine max) e algodão (Gossypium hirsuta)
[087] 2.1 Clonagem de Zea mays, cDNA de ZmNEP-1 : mRNA é extraído a partir de folhas de mudas de Zea mays e usado para gerar cDNA conforme descrito por Yockteng et al (2013). O cDNA de ZmNEP-1 tem o número de sequência de Ref NCBI: XM_008669862.2, e compreende uma sequência de codificação para a proteína de ZmNEP-1 que tem ID de proteína: XP_008668084.1. Uma sequência de DNA que compreende a sequência de codificação para ZmNEP-1 que tem resíduos de aminoácido 1 a 453 [SEQ ID NO: a 45]; e a proteína madura que tem resíduos de aminoácido 27a 453 [SEQ ID NO:45], são amplificadas por PCR com o uso de cDNA como modelo e iniciadores específicos de gene, e DNA polimerase de Herculase II, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). O fragmento de DNA amplificado é purificado por gel e clonado no vetor pCRII-TOPO Blunt de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os clones selecionados são avaliados em relação à inserção por digestão por restrição e sequenciamento (Eurofins Genomics).
[088] 2.2 Clonagem de gene GmNEP-1 de Glycine max
[089] O DNA genômico (gDNA) foi extraído das folhas de mudas de G. max conforme descrito por Doyle et al., 1991. O gene GmNEP-1 tem ID de Gene: 100811294 em número de sequência Ref de NCBI: NC_016091.3, e compreende uma sequência de codificação para a proteína GmNEP-1 que tem Sequência de
Referência NCBI: XP_003523200.1. Uma DNA sequência compreendendo a sequência de codificação para GmNEP-1 que tem resíduos de aminoácido 1 a 453 [SEQ ID NO: 47]; e a proteína madura que tem resíduos de aminoácidos 32 a 453 [SEQ ID NO:47], são amplificadas por PCR usando gDNA como modelo e iniciadores específicos de gene, e DNA polimerase de Herculase II, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os fragmentos de DNA amplificados são purificados por gel e clonados no vetor pCRII-TOPO Blunt de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os clones selecionados são avaliados em relação à inserção por digestão por restrição e sequenciamento (Eurofins Genomics).
[090] 2.3 Clonagem de GhNEP-1 de Gossypium hirsutum
[091] O DNA genômico (gDNA) foi extraído das folhas de mudas de G. hirsutum conforme descrito por Doyle et al., 1991. O gene GhNEP-1 tem ID de Gene: 107919204 em número de sequência Ref de NCBI: NC_030097.1, e compreende uma sequência de codificação para a proteína GhNEP-1 que tem Sequência de Referência NCBI: XP_016704203.1. Uma sequência de DNA compreendendo a sequência de codificação para GhNEP-1 que tem resíduos de aminoácido 1 a 460 [SEQ ID NO:49]; e a proteína madura que tem resíduos de aminoácido 29 a 460 [SEQ ID NO:49], são amplificadas por PCR usando gDNA como modelo e iniciadores específicos de gene, e DNA polimerase de Herculase II, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os fragmentos de DNA amplificados são purificados por gel e clonados no vetor pCRII-TOPO Blunt de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os clones selecionados são avaliados em relação à inserção por digestão por restrição e sequenciamento (Eurofins Genomics).
[092] 2.4 Construtos transgênicos e suas transformação e expressão em Zea mays, Glycine max e Gossypium hirsutum
[093] As sequências de ácidos nucleicos que codificam cada uma das proteínas: ZmNEP-1, GmNEP-1 e GhNEP-1 são, cada uma, fusionadas a jusante de um promotor específico de semente e inseridas a montante do terminador NOS derivado de Agrobacterium tumefaciens [SEQ ID NO: 31] no vetor de transformação pWBVec8 (Gynheung et al., 1988). Os promotores específicos de semente usados são os seguintes: promotor de gene α-zeína [SEQ ID NO:50] para expressão em Z. mays; promotor de gene β-conglicinina [SEQ ID NO:52] para expressão em G. max; promotor de gene α-globina A [SEQ ID NO:54] para expressão em G. hirsuta.
[094] Para transformação de Z. mays, o vetor, compreendendo o respectivo construto de expressão de ZmNEP-1, é transformado na cepa competente de Agrobacterium AH101, que é introduzida nos embriões de Z. mays conforme descrito por Ishida Y et al., (2007).
[095] Para transformação de G. max, o vetor, compreendendo o respectivo construto de expressão de GmNEP-1, é transformado na cepa competente de Agrobacterium AH101, que é introduzida nos embriões de G. max conforme descrito por Li et al., (2007).
[096] Para transformação de G. hirsutum, o vetor, compreendendo o respectivo construto de expressão de GhNEP-1, é transformado na cepa competente de Agrobacterium LBA4404, que é introduzida nos segmentos de hipocotila de G. hirsutum conforme descrito por Firoozabady E et al., (1987).
[097] Os transformantes positivos são detectados por PCR usando iniciadores específicos de gene; e os transformantes selecionados são cultivados para regenerar plantas.
[098] 2.5 Triagem de transformantes para resistência à doença fúngica
[099] Para Z. mays, as espigas são selecionadas e inoculadas em estágio inicial de florescimento feminino com um inóculo de esporos de Fusarium graminearum e Aspergillus niger (5 × 105 esporos/mL), e a gravidade de doença é avaliada após 3 a 4 semanas de condições de crescimento úmidas usando uma escala de classificação de 7 classes conforme descrito por Reid LM et al., (2002).
[0100] Para G. max, as sementes de transformantes T0 positivos são inoculadas com esporos de F. graminearum e avaliadas em relação à gravidade de doença conforme descrito em Ellis ML, et al., (2011). Além disso, as sementes transgênicas são examinadas para os patógenos que portam sementes, dentre as espécies Aspergillus, conforme descrito em Boue et al. (2005).
[0101] Para G. hirsutum, as plantas transgênicas são inoculadas com esporos de espécies Aspergillus e Fusarium e, então, avaliados em relação à resistência de acordo com Doan HK et al (2015).
REFERÊNCIAS
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Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Planta de cultura geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que tem um construto de DNA recombinante integrado no genoma da planta de cultura; o referido construto compreendendo um gene operacionalmente ligado a um promotor heterólogo, em que: i. o referido promotor heterólogo direciona expressão específica de grão ou específica de semente do referido gene operacionalmente ligado, e ii. o referido gene compreende uma sequência de codificação que codifica um peptídeo sinal fusionado em terminal N a um polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC 3.4.23.12), e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo tem pelo menos 88% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; e SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446; SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 32 a 453 e SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 29 a 460, em que a referida planta de cultura é selecionada a partir do grupo consistindo em uma planta de cereal, soja e algodão, e em que a expressão do referido gene confere resistência melhorada a uma doença fúngica provocada por uma espécie de Fusarium e/ou Aspergillus em comparação com uma planta parental da qual a referida planta de cultura geneticamente modificada foi derivada.
2. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é um cereal; e em que a sequência de nucleotídeos do referido promotor heterólogo é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ
ID NO: 27; SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51; e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC 3.4.23.12) tem pelo menos 88% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; e SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446; SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453, e em que o referido promotor direciona expressão específica de endosperma do referido gene.
3. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de soja; e em que a sequência de nucleotídeos do referido promotor heterólogo é SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 53; e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC 3.4.23.12) tem pelo menos 88% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; ou SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 32 a 453.
4. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de algodão, e em que a sequência de nucleotídeos do referido promotor heterólogo é SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO: 55; e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo que tem atividade de endoprotease aspártica (EC 3.4.23.12) tem pelo menos 88% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; ou SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 29 a 460.
5. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos do referido peptídeo sinal é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24 e SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 1 a 26.
6. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos do referido peptídeo sinal é SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 1 a 31.
7. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos do referido peptídeo sinal é SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 1 a 28.
8. Planta de cultura geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 5, caracterizada pelo fato de que a referida planta de cultura é uma espécie de Triticum ou Hordeum ou Zea.
9. Grão ou semente geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de ser produzido por uma planta de cultura geneticamente modificada definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Método para produzir uma planta de cultura geneticamente modificada definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende: a. transformar uma ou mais células de uma planta de cultura parental selecionada a partir do grupo consistindo em uma planta de cereal, soja e algodão com um construto de DNA recombinante compreendendo um gene operacionalmente ligado a um promotor heterólogo, em que i. referido promotor direciona expressão específica de grão do referido gene operacionalmente ligado, e ii. referido gene compreende uma sequência de codificação que codifica um peptídeo sinal fusionado em terminal N a um polipeptídeo que tem atividade de aspartato endoprotease (EC 3.4.23.12), e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo tem pelo menos 88% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446, SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 32 a 453 e SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 29 a 460 de GhNEP-1, e b. selecionar células transformadas da referida planta, em que o genoma das referidas células compreende uma cópia do referido construto de DNA recombinante; e c. regenerar uma planta de cultura geneticamente modificada a partir de células obtidas na etapa (b).
11. Método para fabricar grão ou semente geneticamente modificados definidos na reivindicação 9, para produção de uma cultura de plantas de cultura geneticamente modificadas que exibem resistência aumentada a uma doença fúngica provocada por uma espécie de Fusarium e/ou Aspergillus, caracterizado pelo fato de que compreende: a. rastrear uma população de plantas para o referido construto de DNA recombinante, b. selecionar plantas identificadas na etapa (a) como compreendendo o referido construto de DNA recombinante e c. crescer e coletar grão ou semente de plantas selecionadas na etapa (b).
12. Método para produzir uma planta de cultura que exibe resistência aumentada a uma doença fúngica causada por uma espécie de Fusarium e/ou Aspergillus, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra de DNA genômico de uma planta de cultura definida na reivindicação 1, ou porção da mesma; b. detectar na referida amostra a presença do referido construto de DNA recombinante; c. reproduzir uma planta de cultura compreendendo o referido construto de DNA recombinante com uma segunda planta de cereal do mesmo gênero para obter grãos ou sementes; e d. crescer pelo menos uma planta de cultura a partir dos referidos grãos ou sementes, em que a referida planta de cultura crescida a partir dos referidos grãos ou sementes compreende o referido construto de DNA recombinante; e em que o referido construto de DNA recombinante compreende um gene operacionalmente ligado a um promotor heterólogo, em que i. referido promotor direciona expressão específica de grão do referido gene operacionalmente ligado, e ii. referido gene compreende uma sequência de codificação que codifica um peptídeo sinal fusionado em terminal N a um polipeptídeo que tem atividade de aspartil protease (EC 3.4.23.12), e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo tem pelo menos 88% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 8 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 10 de resíduos de aminoácido 30 a 451; SEQ ID NO: 12 de resíduos de aminoácido 28 a 446; SEQ ID NO: 45 de resíduos de aminoácido 27 a 453; SEQ ID NO: 47 de resíduos de aminoácido 32 a 453 e SEQ ID NO: 49 de resíduos de aminoácido 29 a 460.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido construto de DNA recombinante é detectado por amplificação de uma região da sequência de ácidos nucleicos do referido construto, em que a referida região tem uma extremidade 5’ dentro do promotor e uma extremidade
3’ dentro do gene.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a referida planta de cultura é uma espécie de Triticum ou Hordeum ou Zea.
15. Uso do grão ou semente geneticamente modificados produzidos por uma planta de cultura geneticamente modificada definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5, 6 e 8, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição, em que a referida composição é qualquer uma dentre: a. uma composição de grão ou semente moído, b. forragem animal, e c. forragem animal peletizada em vapor.
16. Uso de uma planta de cultura geneticamente modificada definida em qualquer uma das reivindicações 1, 4 e 7, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de algodão.
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