MXPA00007707A - Alteracion de composiciones de aminoacidos en semillas - Google Patents
Alteracion de composiciones de aminoacidos en semillasInfo
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Abstract
La presente invención proporciona una semilla de planta el endosperma de la cual se caracteriza porque tiene un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado. La presente invención también proporciona casetes de expresión, vectores, células vegetales y un método para incrementar el valor nutricional de las semillas.
Description
ALTERACIÓN DE COMPOSICIONES DE AMINOÁCIDOS EN SEMILLAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las formulaciones de alimentos basadas en plantas de cultivo deben suplementarse típicamente con aminoácidos específicos para proporcionar a los animales con nutrientes esenciales los cuales son necesarios para su crecimiento. Este suplemento es necesario debido a que, en general, las plantas de cultivo contienen bajas proporciones de diversos aminoácidos los cuales son esenciales para, y no pueden ser sintetizados por, animales monogástricos . Las semillas de plantas de cultivo contienen diferentes clases de proteínas de semilla. La composición de aminoácidos de estás semillas reflejan la composición de las clases prevalecientes de proteínas. Las limitaciones de aminoácidos se deben usualmente a las deficiencias de aminoácidos de estás prevalecientes clases de proteínas. Entre los aminoácidos necesarios para la nutrición animal, aquellos que son de disponibilidad limitada en plantas de cultivo incluyen la metionina, lisina y, treonina. Los intentos para aumentar los niveles de estos aminoácidos por reproducción, selección de mutantes, y/o cambios de la composición de las proteínas de almacenamiento acumuladas en las semillas de plantas de cultivo, han cumplido con acierto limitado, o se acompañaron por una pérdida de rendimiento. Por ejemplo, aunque las semillas de planta de maíz
que contienen un factor de transcripción mutante, (opaco 2), o un gen a-zema mutante, (harinoso 2), exhiben niveles elevados de lisina enlazada y total, existe una estructura de endospermo de semilla alterada la cual es mas susceptible a daño y pestes. También son típicas las perdidas significativas de rendimiento. Un medio alternativo para mejorar los niveles de aminoácidos libres en una planta de cultivo es la modificación de la biosmtesis de aminoácidos en la planta. La introducción de un gen acido dudrodipicolinico sintasa insensible a la regulación de la retroalimentacion ("DHDPS"), el cual codifica una enzima que cataliza la primera reacción única a la ruta biosintetica de lisma, dentro de las plantas ha resultado en un aumento en los niveles de lisina libre en las hojas y semillas de aquellas plantas. Un aumento en los niveles de lisma libre en el embrión resulta en una cantidad reducida de aceite en las semillas. Adicionalmente, puede perderse lisina libre durante el proceso de molienda en húmedo reduciendo el valor alimenticio del producto gluten del proceso. La expresión del gen lysC, el cual codifica una bacteria mutante aspartato cinasa que esta desensibilizada por la inhibición de la retroalimentacion mediante Usina y treonina, a partir de un promotor especifico de semillas en plantas de tabaco, ha resultado en un aumento de la
biosíntesis de metionina y treonina en las semillas de aquellas plantas. Ver Karchi, et al . ; The Plant J, ; Vol. 3; p. 721; (1993) . Sin embargo, la expresión del gen lysC resulta en solamente un aumento de 6-7% en el nivel de treonina o metionina total en la semilla. La expresión del gen lysC en las semillas tiene un impacto mínimo en el valor nutricional de aquellas semillas y, así, aun se requiere la suplementación de la alimentación que contiene semillas transgénicas lysC con aminoácidos, tales como metionina y treonina. Existen estrategias genéticas moleculares adicionales disponibles para mejorar la calidad de aminoácido de las proteínas de planta. Cada una involucra la manipulación molecular de genes de planta y la generación de plantas transgénicas. La modificación de secuencia de proteína involucra la identificación de un gen que codifica una proteína principal, preferiblemente una proteína de almacenamiento, como el objetivo para la modificación para contener más codones de aminoácidos esenciales. Un aspecto importante de está propuesta es el de ser capaz de seleccionar una región de la proteína que puede modificarse sin afectar la estructura completa, estabilidad, función, y otras propiedades celulares y nutricionales de la proteína. El desarrollo de la tecnología de síntesis de ADN
permite el diseño y síntesis de un gen que codifica una nueva proteína con composiciones de aminoácidos esenciales deseables. Por ejemplo, los investigadores han sintetizado una secuencia de ADN de 292 pares de bases que codifica un polipéptido compuesto de 80% de aminoácidos esenciales y lo usaron con el promotor de nopalin sintetasa (NOS) para construir un gen quimérico. La expresión de este gen en el tubérculo de papa transgénica ha resultado en una acumulación de está proteína a un nivel de 0.02% a 0.35% de la proteína total de la planta. Este bajo nivel de acumulación es posible debido a la debilidad del promotor NOS y/o la inestabilidad de la nueva proteína. El tabaco se ha usado como una planta de prueba para demostrar la factibilidad de está propuesta transfiriendo un gen quimérico que contiene el promotor de fasiolina de frijol y el ADNc de una proteína rica en azufre Proteína de Nuez del Brasil ("BNP"), (18% en moles de metionina y 8% en moles de cisteina) dentro del tabaco. El análisis de aminoácidos indica que el contenido de metionina en las semillas transgénicas se mejora cerca del 30% sobre aquellas de las semillas no transformadas. Este mismo gen quimérico también se ha transformado en un cultivo comercial, cañóla, y se lograron niveles similares de mejoramiento. Sin embargo, un efecto adverso es que el contenido de lisina disminuye. Adicionalmente, la BNP ha sido
identificada como un alérgeno alimenticio principal. Asi no es practico ni deseable usar BNP para mejorar el valor nutricional de las plantas de cultivo. Asi, existe una necesidad de mejorar el valor nutricional de las semillas de planta. La modificación genética no debe acompañarse por efectos laterales dañinos tales como alergenicidad, calidad anti-nutpcional o un rendimiento deficiente. Es un objeto de la presente invención proporcionar una semilla, el endospermo de la cual contiene niveles elevados de un aminoácido esencial. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para aumentar el valor nutpcional de la alimentación. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para modificar genéticamente semillas de tal forma que aumente las cantidades de aminoácidos esenciales los cuales están presentes en cantidades relativamente bajas en semillas no modificadas. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para aumentar el contenido nutpcional de las semillas sin efectos laterales dañinos tales como alergenicidad o calidad anti-nutricional , Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para aumentar el contenido nutricional
de las semillas mientras que se mantiene un alto rendimiento. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para la expresión de un polipéptido en una semilla que tiene niveles de un aminoácido preseleccionado suficiente para reducir u obviar la suplementación de la alimentación. De acuerdo con la presente invención se proporciona una semilla de planta transformada, el endospermo de la cual se caracteriza por tener un nivel elevado de al menos un aminoácido preseleccionado comparado con una semilla a partir de una planta correspondiente la cual no se ha transformado, en donde el aminoácido es lisina, treonina, o triptofano y opcionalmente un aminoácido que contiene azufre. También se proporciona una semilla a partir de una planta la cual se ha transformado para expresar una proteína heteróloga en el endospermo de la semilla, en donde la semilla exhibe un nivel elevado de un aminoácido esencial. También se proporciona un cásete de expresión que comprende un promotor preferido de endospermo de semilla unido operablemente a un gen estructural que codifica un polipéptido que tiene un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado. También se proporcionan semillas y plantas transformadas que contienen el cásete de expresión. • También se proporciona un método para elevar el nivel de un aminoácido preseleccionado en el endospermo de la
semilla de planta. El método comprende la transformación de las células vegetales introduciendo el cásete de expresión, recuperando las células transformadas, regenerando una planta transformada y recolectando las semillas de la misma. Como se utiliza en la presente, un "gen estructural" significa una secuencia o segmento de ADN recombinante o hexogeno que codifica un polipéptido. Como se utiliza en la presente, "ADN recombinante" es una secuencia segmento de ADN que se ha aislado a partir de una célula, purificado, sintetizado o amplificado. Como se utiliza en la presente, "aislado" significa ya sea físicamente aislado de la célula o sintetizado in vi tro sobre la base de la secuencia de un segmento aislado de ADN. Como se utiliza en la presente, el término niveles
"incrementado" o "elevado" del aminoácido preseleccionado en una proteína significa que la proteína contiene una cantidad elevada de un aminoácido preseleccionado comparado con la cantidad en una proteína promedio.. Como se utiliza en la presente, niveles
"incrementado" o "elevado" o cantidades de aminoácidos preseleccionados en una planta o semilla transformada son los niveles que son mayores que los niveles o cantidades en la planta o semilla no transformada correspondiente. Como se utiliza en la presente, "polipéptidos"
significa proteínas, fragmentos de proteínas, proteínas modificadas, secuencias de aminoácidos y secuencias sintéticas de aminoácidos. Como se utiliza en la presente, "planta transformada" significa una planta la cual comprende un gen estructural el cual se introduce dentro del genoma de la planta por transformación. Como se utiliza en la presente, "planta no transformada" se refiere a una planta de tipo silvestre, es decir, una en donde el genoma no se ha alterado por la introducción del gen estructural. ' Como se utiliza en la presente, "planta" incluye pero no se limita a las células vegetales, tejido vegetal y semillas de planta. Como se utiliza en la presente, "promotor preferido de endospermo de semilla" es un promotor el cual promueve preferencialmente la expresión del gen estructural en el endospermo de la semilla. Como se utiliza en la presente con respecto a un gen estructural que codifica un polipéptido, el término
"expresa" significa que el gen estructural se incorpora dentro del genoma de las células, de manera que el producto codificado por el gen estructural se produce dentro de las células . Como se utiliza en la presente el término
"aminoácido esencial" significa un aminoácido el cual se sintetiza solamente por plantas o microorganismos o el cual no se produce por animales en cantidades suficientes para soportar el desarrollo y crecimiento normal. Como se utiliza en la presente, el término
"proteína, de alto contenido de lisina" significa que la proteína tiene al menos aproximadamente 7% en moles de lisina, de preferencia aproximadamente 7% en moles hasta aproximadamente 50% en moles de lisina, y de mayor preferencia aproximadamente 7% en moles hasta aproximadamente 40% en moles de lisina y de mayor preferencia aproximadamente 7% en moles hasta aproximadamente 30% en moles. Como se utiliza en la presente, el término "proteína de alto contenido de azufre" significa que la proteína contiene al menos aproximadamente 6% en moles de metionina y/o cisteina de preferencia aproximadamente 6% en moles hasta aproximadamente 40% en moles, de mayor preferencia aproximadamente 6% en moles hasta aproximadamente 30% en moles y de mayor preferencia 6% en moles hasta 25% en moles. La presente invención proporciona una semilla de planta transformada, el endospermo de la cual se caracteriza porque tiene un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado comparado a la semilla de una planta correspondiente la cual no se ha transformado. Se prefiere
que el nivel del aminoácido preseleccionado este elevado en el endospermo de preferencia a otras partes de la semilla. El aminoácido preseleccionado es un aminoácido esencial tal como lisina, cisterna, metionina, treonina, tpftofano, argimna, valina, leucma, isolucina, histilina o combinaciones de los mismos, preferiblemente, el aminoácido preseleccionado es lisma, treomna, cisterna, triptofano, o combinaciones de los mismos y opcionalmente metionina. Se prefiere especialmente que el polipeptido tenga un contenido aumentado de lisina asi como también un aminoácido que contiene azufre es decir, metionina y/o cisterna. El polipeptido puede ser una proteina endógena o heterologa. Cuando se expresa una protema endógena, el aminoácido preseleccionado es lisina, cisterna, treonina, triftofano, arginina, valma, leucina y solucina, estipna o combinaciones de los mismos y opcionalmente metionma. Cuando la proteina es una proteina heterologa, cualquiera de los aminoácidos preseleccionados descritos anteriormente o combinaciones de los mismos esta presente en cantidades elevadas. Generalmente la cantidad de los aminoácidos preseleccionados en la semilla de la presente invención es al menos aproximadamente 10% en peso mayor que en una semilla no transformada correspondiente, de preferencia aproximadamente 10% en peso hasta aproximadamente 10 veces mayor, de mayor
preferencia aproximadamente 15% en peso hasta aproximadamente 10 veces mayor y de mayor preferencia aproximadamente 20% hasta aproximadamente 10 veces mayor. Un polipéptido que tiene una cantidad elevada del aminoácido preseleccionado se expresa en el endospermo de la semilla de planta transformada en una cantidad suficiente para aumentar la cantidad de ' al menos un aminoácido preseleccionado en la semilla de la planta transformada relativa a la cantidad del aminoácido preseleccionado en la semilla de una planta no transformada correspondiente. La selección del gen estructural se basa en la composición de aminoácidos deseada del polipéptido codificado por el gen estructural, y la capacidad del polipéptido para acumularse en la semilla. La composición de aminoácidos de polipéptido puede manipularse por métodos, tales como mutagénesis dirigida al sitio del gen estructural que codifica el polipéptido, de tal forma que resulte en la expresión de un polipéptido que es aumentado en la cantidad de un aminoácido particular. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para aumentar los niveles de lisina, metionina, cisteina, treonina y/o triftofano y/o para disminuir los niveles de asparagina y/o glutamina. Los derivados difieren de la proteína tipo silvestre por una o más sustituciones, inserciones, substracciones del aminoácido o similares. Típicamente las
sustituciones de aminoácidos son conservativas. En las regiones de homología a la secuencia nativa, las variantes tienen preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, de mayor preferencia al menos 95% de identidad. Ejemplos típicos de proteínas adecuadas incluyen inhibidor de quimiotripcina de cebada, cebada de alfa hordotionina, proteínas de albúmina de soya 2S, proteína de arroz con metionina elevada y proteína de girasol con metionina elevada y derivados de cada proteína. La cebada de alfa hordotionina se ha modificado para aumentar el nivel de los aminoácidos particulares. Las secuencias de los genes que expresan proteínas alfa hordotionina de modificadas con aminoácidos esenciales incrementados están basadas en la secuencia del RNAm del gen nativo de la proteína alfa hordotionina de Hordeum vulgare (número de acceso X05901, Ponz et al . 1986 Eur.J. Biochem. 156:131-135) . Las proteínas hordotionina modificadas se describen en las Patentes Norteamericanas Números de Serie 08/838,763 presentada el 10 de Abril de 1997; 08/824,379 presentada el 26 de Marzo de 1997; 08/824,382 presentada el 26 de Marzo de 1997; y la Patente Norteamericana Número 5,703,409 publicada el 30 de Diciembre de 1997, las descripciones de las cuales se incorporan en su totalidad en la presente por referencia.
La alfa hordotionina es una proteina de 45 aminoácidos la cual se estabiliza por cuatro enlaces bisulfuro que resultan de ocho residuos de cisterna. En su forma nativa, la proteina es especialmente rica en residuos de arginma y Usina, conteniendo cinco residuos (10% de cada uno. Sin embargo, esta privada del aminoácido esencial metionina) . La alfa hordotiomna se ha modificado para aumentar la cantidad de diversos aminoácidos tales como lisma, treonina o metionina. La proteina se ha sintetizado y la estructura tridimensional determinada por modelo de computadora. El modelo de la protema predice que los diez residuos cargados (argimna en las posiciones 5, 10, 17, 19 y 30, y lisina en las posiciones 1, 23, 32, 38 y 45) todos ocurren en la superficie de la molécula. Las cadenas laterales de los aminoácidos polares (asparagina en la posición 11, glutamina en la posición 22 y treonina en la posición 41) también ocurre en la superficie de la molécula. Ademas, los aminoácidos hidrofobicos, (tales como las cadenas laterales de leucma las posiciones 8, 15, 24 y 33 y valina en la posición 18) también son accesibles por solvente El modelo tridimensional de la proteina indica que el residuo de argimna en la posición 10 es importante para retener la estructura tridimensional apropiada y el doblado posible a través de interacciones de enlace de hidrogeno con
el residuo C-terminal de la proteína. Una sustitución de Usina, metionina o treonina en ese punto rompería está red de enlace de hidrógeno, conduciendo a la desestabilización de la estructura. El péptido sintético que tiene esta sustitución no podría hacerse doblar correctamente, lo cual soporta este análisis . La conservación del residuo de arginina en la posición 10 proporciona una proteína la cual se dobla correctamente. La alfa hordotionina se ha modificado para contener 12 residuos de lisina en el péptido de hordotinina maduro, referido como HT12. (Rao et al . 1994 Protein Engineering 7 (12) :1485-1493 y WO 94/16078 publicado el 21 de julio de 1994) . La descripción de cada uno de estos se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. El análisis adicional de las sustituciones que no alteran la estructura tridimensional de la molécula conducen a la reposición de Asparagina-11, Glutamina-22 y Treonina-41 con residuos de lisina sin virtualmente impedimento estérico. El compuesto resultante contiene 27% de residuos de lisina. Otras combinaciones de estás sustituciones también se hicieron, incluyendo cambios en los residuos de aminoácidos en una o más posiciones 5, 11, 17, 19, 22, 30 y 41 son lisina, y el resto de los .residuos en esas posiciones son los residuos en las posiciones correspondientes en la ordotionina tipo silvestre.
Puesto que la treomna es un aminoácido polar, los residuos de aminoácido polar de superficie, asparagina en la posición 11 y glutamina en la posición 22, pueden sustituirse, y los aminoácidos cargados, lisina en las posiciones 1, 23, 32 y 38 y arginma en las posiciones 5, 17, 19 y 30, también pueden sustituirse con treonina La molécula puede sintetizarse por síntesis de peptido en fase solida. Mientras que la secuencia anterior es ilustrativa de la presente invención, no intenta ser una limitación. Las sustituciones con treonina también pueden realizarse en las posiciones que contienen aminoácidos cargados. Solamente la arginina en la posición 10 y lisma en la posición 45 son importantes para mantener la estructura de la proteina Uno también puede sustituir en los sitios que tienen aminoácidos hidrofobicos . Estos incluyen las posiciones 8, 15, 18 y 24.
Puesto que metiomna es un aminoácido hidrofobico, los residuos de aminoácidos hidrofobicos de la superficie, leucina en las posiciones 8, 15, y 33 y valma en la posición 18, se sustituyeron con metionina. Los aminoácidos polares de superficie, asparagina en la posición 11, glutamina en la posición 22 y treonina en la posición 41, se sustituyen con metiomna. La molécula se sintetiza por síntesis de peptido en fase solida y se dobla en una estructura estable Tiene siete residuos de metionina (15 5%) e incluye las ocho cisternas, la protema modificada tiene un contenido de
aminoácido azufrado de 33%. Mientras que las proteínas descritas anteriormente son ilustrativas de polipeptidos adecuados los cuales pueden expresarse en la planta transformada, no intenta ser una limitación. Las sustituciones de metionina también pueden realizarse en las posiciones que contienen aminoácidos cargados. Solamente arginma en la posición 10 es importante para mantener la estructura de la proteina a través de una red de enlaces de hidrogeno con cerina en la posición 2 y lisina en la posición 45. Asi, uno puede sustituir metionina por lisina en las posiciones 1, 23, 32, y/o 38, y por arginina en las posiciones 5, 17, 19 y/o 30. Muchas otras proteínas también son apropiadas, por ejemplo la protema codificada por el gen estructural puede ser una proteina de semilla rica en lisina y/o azufre, tal como albúmina de soya 2S descrita en la Patente Norteamericana Numero de Serie 08/618,911 presentada el 20 de Marzo de 1996, y el inhibidor de quimotppsina de cebada, Williamson et al . , Eur. J. Biochem 165.99-106 (1987), las descripciones de cada una se incorporan por referencia. Los derivados de estos genes pueden ser por mutagenesis dirigida al sitio para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipeptido codificado. Por ejemplo el gen que codifica para el polipeptido elevado en lisina de cebada (BHL) , se deriva del inhibidor de
quimiotripcina de cebada, Patente Norteamericana Número de Serie 08/740,682 presentada el 1 de noviembre de 1996 y PCT/US97/20441 presentada el 31 de octubre de 1997, las descripciones de cada una se incorporan en la presente por referencia. El gen que codifica para el gen de albúmina de soya mejorado (ESA), se deriva de la albúmina de soya 2S descrita en la Patente Norteamericana Número de Serie 08/618,911, la descripción de la cual se incorpora en la presente en su totalidad por referencia. Otros ejemplos de proteínas de planta ricas en azufre dentro del alcance de la invención incluyen proteínas de planta enriquecidas con cisteina pero no con metionina, tales como la purotionina del endospermo de trigo (Mak y Jones; Can. J. Biochem; Vol.22; p. 83J; (1976); incorporada en la presente en su totalidad por referencia) , las albúminas de bajo peso molecular de chícharo (Higgins, et al . ; J. Biol .Chem. ; Vol. 261; p. 11124; (1986); incorporada en la presente en su totalidad por referencia) así como también los genes de albúmina 2S de otros organismos. Ver por ejemplo, Coulter, et al . ; J. Exp. Bot . ; Vol.41; p. 1541; (1990); incorporado en la presente en su totalidad por referencia. Tales proteínas también incluyen proteínas de planta ricas en metionina tales como las de semillas de girasol (Lilley, et al . ; In: Proceedinq of the World Conqress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal
Feedstuffs; Applewhite, H. (ed) ; American Oil Chemists Soc.; Champaign, IL; pp. 497-502; (1989); incorporadas en la presente en su totalidad por referencia), maíz (Pedersen, et al . ; j. Biol. Chem. p 261; p, 6279; (1986); Kirihala, et al . ; Gene, Vol. 71; p. 359; (1988); ambas incorporadas en la presente en su totalidad por referencia) , y arroz (Musumura, et al . ; Plant Mol. Biol.; Vol. 12; p. 123; (1989); incorporada en la presente en su totalidad por referencia).
La presente invención también proporciona un método para modificar genéticamente las plantas para aumentar el nivel de al menos un aminoácido preseleccionado en el endospermo de la semilla para incrementar el valor nutricional de las semillas. El método comprende la introducción de un cásete de expresión dentro de células vegetales regenerables para producir células vegetales transformadas. El cásete de expresión comprende un promotor preferido de endospermo de semilla unido operablemente a un gen estructural que codifica un polipéptido elevado en contenido del aminoácido preseleccionado. - Una planta transformada fértil se regenera de las células transformadas, y las semillas se aislan de la planta. El gen estructural se transmite a través de un ciclo sexual normal completo de la planta transformada a la siguiente generación.
El polipéptido se sintetiza en la semilla del endospermo de la planta el cual se ha transformado por la inserción del cásete de expresión descrito anteriormente. La secuencia' para la molécula nucleótida ya sea ARN o ADN, puede fácilmente derivarse de la secuencia de aminoácido para el polipéptido seleccionado usando textos de referencia estándar. La plantas que pueden usarse en el método de la invención incluyen plantas de cereal monocotiledonias . Las plantas preferidas incluyen maíz, trigo, arroz, cebada, avenas, sorgo, mijo y centeno. La planta más preferida es maí z . Las semillas derivadas de plantas regeneradas de células vegetales transformadas, partes de planta o tejidos de planta, o progenie derivada de las plantas transformadas regeneradas, pueden usarse directamente como alimentación o alimento, o puede ocurrir procesamiento adicional. Transformación La transformación de las plantas de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo esencialmente en cualquiera de las diversas formas conocidas a aquellos expertos en la técnica de la biología molecular de planta. Estás incluyen, pero no se limitan a, bombardeo de microproyectil, microinyección, electroporación de protoplastos o células que comprende paredes de células faciales, y transferencia de ADN
mediada por Agrojbacteriujn. I ADN usado para transformación El ADN útil para la introducción dentro de las células vegetales incluye ADN que se ha derivado o aislado de cualquier fuente, que pueda caracterizarse subsecuentemente como estructura, tamaño y/o función, químicamente alterado, e introducido después dentro de la planta. Un ejemplo de ADN "derivado" de una fuente, sería una. secuencia o segmento de ADN que se identifica como un fragmento útil dentro de un organismo dado, y el cual se sintetiza después en una forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" a parir de una fuente sería una secuencia de ADN útil que se corta o retira de la fuente por medios químicos, por ejemplo por el uso de endonucleasas de restrinción, de manera que pueda manipularse adicionalmente, por ejemplo amplificarse, para uso en la invención, por la metodología de la ingeniería genética. Por lo tanto, el ADN útil incluye ADN completamente sintético, ADN semisintético, ADN aislado de fuentes biológicas, y ADN derivado de ARN. El ADN aislado de fuentes biológicas, o ADN derivado de ARN incluye, pero no se limita a, ADN o ARN de genes de planta, y genes de no plantas tales como aquellos de bacterias, levaduras, animales o virus. El ADN o ARN puede incluir genes modificados, porciones de genes, o genes quiméricos, que incluyen genes del mismo o de
diferente genotipo. El término "gen quimérico" o "ADN quimérico" se define como un gen o secuencia o segmento de ADN que comprende al menos dos secuencias o segmentos de ADN de especies que no recombinan ADN bajo condiciones naturales, o cuyas secuencias o segmentos de ADN se colocan o enlazan en una forma que no se presentan normalmente en el genoma nativo de plantas sin trasformar. Un gen estructural de la invención puede identificarse por métodos estándar, por ejemplo protocolos enriquecidos, o sondas, dirigidas al aislamiento de un nucleótido o secuencias de aminoácidos particulares. El gen estructural puede identificarse obteniendo y/o seleccionando de una biblioteca de ADN o ADNc generada del ácido nucleico derivado de un tipo particular de célula, líneas de células, células primarias, o tejido. La selección de los fragmentos de ADN que codifican todo o una porción del gen estructural puede lograrse por placas de selección de una biblioteca genómica o ADNc para la hibridización de una sonda del gen estructural de otros organismos o por placas de selección de una biblioteca de expresión de ADNc para enlazar los anticuerpos que reconocen específicamente el polipéptido codificado por el gen estructural . Los fragmentos de ADN que se hibridizan en una
sonda de gen estructural de otros organismos y/o placa que transportan fragmentos de ADN que son inmunoreactivos con anticuerpos para el polipéptido codificado por el gen estructural pueden subclonarse dentro de un vector y secuenciarse y/o usarse como sondas para identificar otros ADNc o secuencias genómicas que codifican toda o una porción del gen estructural. Las porciones de la copia o copias genómicas del gen estructural pueden secuenciarse parcialmente e identificarse por métodos estándar que incluyen ya sea homología de secuencia de ADN a otros genes homólogos o por comparación de secuencias de aminoácidos codificados con secuencias de polipéptidos conocidas. Una vez que las porciones del gen estructural se identifican, pueden obtenerse copias completas del gen estructural por métodos estándar, que incluye clonación o síntesis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotidos complementarios al gen estructural. La presencia de una copia aislada de longitud completa . del gen estructural puede verificarse por comparación de su secuencia de aminoácidos deducida con la secuencia de aminoácidos de las secuencias del polipéptido nativo . Como se discutió anteriormente, el gen estructural que codifica el polipéptido puede modificarse para aumentar
el contenido de residuos particulares de aminoácidos en ese polipeptido por métodos bien conocidos en la técnica, que incluye, pero no se limitan a, mutagenesis dirigida al sitio As , los derivados de los polipeptidos que ocurren naturalmente pueden hacerse por sustitución de nucleotidos del gen estructural de manera que resulte en un polipeptido que tiene un aminoácido diferente en la posición en el polipeptido que corresponde al codon con la sustitución de nucleotido La introducción de múltiples cambios de aminoácidos en un polipeptido puede resultar en un polipeptido que este significativamente enriquecido con un aminoácido preseleccionado Como se noto anteriormente, la selección del polipeptido codificado por el gen estructural se basara en la composición de aminoácidos del polipeptido y su capacidad para acumularse en la semilla El aminoácido puede seleccionarse por su valor nutpcional para producir una cualidad de valor agregado a la planta o parte de la planta Los aminoácidos deseables para cualidades de valor agregado, asi como una fuente para limitar la síntesis de una proteina endrogena incluye, pero no se limita a, l s na, treomna, triftofano, metionina, y cisterna Casetes de Expresión y Vectores de Expresión De acuerdo a la presente invención, un gen estructural se identifica, aisla, y combina con un promotor
preferido de endospermo de semilla para proporcionar un cásete de expresión recombinante. La construcción de tales casetes de expresión los cuales pueden emplearse junto con la presente invención son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica a la luz de la presente descripción. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al . ; Molecular Cloninq: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, New York; (1989); Gelvin, et al . ; Plant Molecular Biology Manual; (1990) Plant Biotechnology: Commercial Prospects and Problems, eds Prakash, et al . ; Oxford _ IBH Publishing Co.; New Delhi, India; (1993); y Heslot, et al . ; Molecular Biology and Genetic Enqineering of Yeasts,- CRC Press, Inc., USA; (1992); cada uno incorporada en su totalidad en la presente por referencia. Los promotores preferidos útiles en la práctica de la invención son aquellos promotores preferidos de endospermo de semilla que permiten la expresión selectiva del gen estructural en el endospermo de la semilla para evitar cualesquier efectos dañinos potenciales asociados con la expresión' del gen estructural en el embrión. Se ha encontrado que cuando los promotores preferidos de endospermo se emplean, el nivel total del aminoácido preseleccionado en la semilla se aumenta comparado con una semilla producida que emplea un promotor preferido de embrión, tal como el promotor de globulina 1. Cuando se
emplea el promotor de globulina 1, el polipéptido se expresa por el gen estructural, pero la cantidad total del aminoácido preseleccionado no se aumenta. Ejemplos de promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotor de gamma zeina de 27kD y promotor ceroso. Ver los siguientes sitios que se relacionan al promotor gamma zeina de 27kD: Boronat,A: Martínez, M. C, Reina, M., Puigdomenech, P. y Palau, J.; El aislamiento y la secuencia de un gen glutelina-2 de 28 kD de maíz: Los elementos comunes en las regiones de flanqueo 5' entre los genes de zeina y gluteina; Plant Sci. 47, 95-102(1986) y Reina, M., Ponte, I., Guillen, P., Boronat, A y Palau, J., Sequence analysis of a genomic clone encoding a Zc2 protein from Zea mays W64 A, Nucleic Acids Res. 18 (21), 6426 (1990). Ver los siguientes sitios relacionados al promotor ceroso: Kloesgen, R. B., Gierl, A., Schwarz-Sommer , ZS. y Saedler, H., Molecular analysis of the waxy locus of Zea mays, Mol . Gen. Genet. 203, 237-244 (1986) . Las descripciones de cada uno de estos se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. Sin embargo, pueden emplearse otros promotores preferidos de endospermo. II. ENTREGA DE ADN A LAS CÉLULAS El cásete o vector de expresión puede introducirse dentro de células procarióticas o eucarióticas por métodos
corrientemente disponibles los cuales se describen en la literatura. Ver por ejemplo, Weismg et al , Ann. Rev. Genet. 2: 421-477 (1988). Por ejemplo, el cásete o vector de expresión puede introducirse dentro de las células vegetales por métodos que incluyen, pero no se limitan a, transformación mediada por ?grobacterium, electroforación, poración PEG, bombardeo de microproyectil, microinyeccion de protoplastos de células vegetales o calus embpogenico, entrega de fibra de Silicon, virus infecciosos o viroides tales como retrovirus, el uso de liposoma y similares, todos de acuerdo con procedimientos bien conocidos. La introducción de construcciones de ADN usando la precipitación de polietilenglicol se describe en Paszkowski et al . , Embo J . 3: 2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporacion se describen en Fromm et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. 82: 5324 (1985). Las técnicas de transformación balística se describen en Klein et al . , Nature 327: 70-73 (1987) . La descripción de cada una de estas se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. Se ha mostrado que la introducción y expresión de genes extranjeros en las plantas es posible usando el T-ADN del plasmido que induce tumor (Ti) de Agrobacterium turne f aciens . Usando técnicas de ADN recombmante y genética bacteriana, puede insertarse una amplia variedad de ADNs extranjeros dentro de T-ADN en Agrobacterium . Después de la
infección por la bacteria que contiene el plásmido recombinante Ti, el ADN extraño se inserta dentro de los cromosomas de la planta huésped, produciendo así una célula diseñada genéticamente y eventualmente una planta diseñada genéticamente. Una segunda propuesta es introducir plásmidos que inducen raíces (Ri) como los vectores gen. Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens estén bien descritas en la literatura. Ver, por ejemplo Horsch et al . , Science 233:496-498 (1984) y Fraley et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. 80: 4803 (1983). La transformación por Agrobacterium del maíz se describe en la Patente Norteamericana No. 5,550,318. La descripción de cada una de estás se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. Otros métodos de tranfección o transformación incluyen (1) transformación de Agrobacterium mediado por rhizogenes (ver por ejemplo, Linhtenstein and Fuller In: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, C.P., y Draper, J, In: ADN Cloning, Vol. II, D.M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985). La solicitud PCT/US87/02512 (WO 88/02405 publicada el 7 de abril de 1988) describe la cepa A4 del A. rhizogenes y su plásmido Ri junto con los vectores de A. tumefaciens pARC8 o pARC16 (2) levantamiento de ADN mediado por liposoma (ver, por ejemplo, Freeman et ai., Plant Cell Physiol. 25: 1353,
1984), (3) el método de torbellino (ver, por ejemplo, Kindle, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 87: 1228, (1990). La descripción de cada uno de estos se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. El ADN también puede introducirse dentro de las plantas por la transferencia directa de ADN dentro del polen como se describe por Zhou et al . , Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol . , 107:367 (1987); Luo et al . , Plañe Mol. Biol. Repórter, 6:165 (1988). La descripción de cada una de estás se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. La expresión de los genes que codifican el polipéptido puede obtenerse por inyección del ADN dentro de los órganos reproductores de una planta como se describe por Pena et al . , Nature 325.:274 (1987). La descripción de la cual se incorpora en su totalidad en la presente por referencia . El ADN también puede inyectarse directamente dentro de las células de embriones inmaduros y la rehidratación de embriones de secados como se describe por Neuhaus et al . , Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987); y Benbrook et al . , in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, ?toneham, Mass., pp. 27-54 (1986) . La descripción de cada una de estás se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. Las células vegetales útiles para la transformación
incluyen células cultivadas en cultivos de suspensión, callos, embriones, tejido de meristeno, polen y similares. Se conoce una diversidad de virus de plantas que pueden emplearse como vectores en la técnica e incluyen el virus mosaico de la coliflor (CaMV), virus gemini, virus mosaico del brome, y virus mosaico del tabaco. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido que induce tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et al . , Meth. In Enzymol., 153:253-277 (1987). Estos vectores son vectores que integran plantas porque en la transformación, los vectores integran una porción de vector de ADN dentro del genoma de la planta huésped. La . descripción de la cual se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. Un vector particularmente preferido es un plásmido, mediante el cual se quiere dar a entender una molécula de ADN circular de doble hebra que no es una parte de los cromosomas de las células. Los vectores ejemplares de A. tumefa ciens útiles en la presente son los plásmidos pKYLXd y pKYLX7 de Schardl et al . , Gene, 61:1-11 (1987) y Berger et al . , Proc. Nati. Acad. Sci USA., 86:8402-8406 (1989). Otro vector útil en la presente es el plásmido pBI101.2 que está disponible de Clontech -Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . La descripción de cada uno de estos se incorpora en su totalidad en la
presente por referencia. Una célula en la cual el material genético extraño en un vector se expresa funcionalmente, ha sido "transformado" por el vector y se le refiere como un "transformante". El ADN o ADNc genómico que codifica el gen de interés puede usarse en está invención. El gen de interés también puede construirse parcialmente de un clon de ADNc y parcialmente de un clon genómico. Cuando el gen de interés se ha aislado, se hacen las construcciones genéticas las cuales contienen las secuencias reguladoras necesarias para proporcionar la expresión eficiente del gen en la célula huésped. De acuerdo a está invención, la construcción genética contendrá (a) una secuencia genética que codifica para el polipéptido de interés y (b) una o más secuencias reguladoras enlazadas operablemente a cada lado del gen estructural de interés. Típicamente, las secuencias reguladoras serán un promotor o un terminador. Las secuencias reguladoras pueden ser de fuentes autólogas o heterólogas. El vector de clonación típicamente portará un principio de replicación, así como genes específicos que son capaces de proporcionar marcadores de selección fenotípica en células huésped transformadas. Típicamente, se usan genes que confieren resistencia a los antibióticos o herbicidas
seleccionados Después que el material genético se introduce dentro de las células objeto, las células y/o colonias transformadas exitosamente pueden aislarse por selección sobre la base de estos marcadores Los marcadores típicos seleccionables que incluyen genes que codifican para la resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada) , el gen estreptomicinfosfotransferasa (SPP) que codifica para la resistencia a la estreptomicina, el gen neomicmfosfotransferasa (NPT II) que codifica la resistencia a la kanamicina o geneticma, el gen higromicinfosfotransferasa (HPT) que codifica para la resistencia a la higromicina Los genes que codifican para la resistencia a los herbicidas incluyen los genes que actúan para inhibir la adición de acetolactato sintasa (ALS) , en particular los herbicidas del tipo sulfonilurea (por ejemplo los genes de acetatolactato smtasa (ALS) conteniendo mutaciones que conducen a la resistencia en particular de las mutaciones ?4 y/o Hra) , los genes que codifican para resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina smtasa, tal como fosfínotpcina o basta (por ejemplo el gen pat o bar) , u otros de los genes conocidos en la técnica El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorosulfuron
Típicamente, se usará en la práctica de está invención una célula huésped intermediaria para aumentar el número de copias del vector de clonación. Con un número aumentado de copias, el vector que contiene el gen de interés puede aislarse en cantidades significativas para la introducción dentro de las células vegetales deseadas. Las células huésped que pueden usarse en la práctica de está invención incluyen procariotidos, que incluyen huéspedes bacterianos tales como E. Coli , S . Typhimurium y Serra tia marcescens . Huéspedes eukarioticos tales como levaduras u hongos filamentosos también pueden usarse en está invención. Puesto que estos huéspedes también son microorganismos, será esencial asegurar que se usen en el vector promotores de planta que no causan expresión del polipéptido en la bacteria. El vector de clonación aislado se introducirá después dentro de la célula vegetal usando cualquier técnica de transformación conveniente como se describió anteriormente. III Regeneración y Análisis de Transformantes Después de la transformación, se involucra la regeneración para obtener una planta completa desde células transformadas y la presencia del gen o genes estructurales o "transgen o transgenes" en la planta regenerada se detecta por prueba. La semilla derivada de la planta se prueba
entonces por los niveles de aminoácidos preseleccionados. Dependiendo del tipo de planta y el nivel de expresión del gen, la introducción del gen estructural dentro del endospermo de la semilla de la planta puede incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en una cantidad útil para suplementar la calidad nutricional de aquellas semillas. Usando técnicas conocidas, pueden regenerarse protoplastos y células o cultivos de tejido para formar plantas fértiles completas que llevan y expresan el gen para un polipéptido de acuerdo a está invención. En consecuencia, una modalidad altamente preferida de la presente invención es una planta de maíz transformada, las células de las cuales contienen al menos una copia de las secuencias de ADN de un cásete de expresión que contiene un gen que codifica un polipéptido que contiene cantidades elevadas de un aminoácido esencial, tal como una proteína HT12, BHL o ESA. Las técnicas para regenerar plantas desde el cultivo de tejidos, tales como protoplastos transformados o líneas de células de callo, son conocidas en la técnica por ejemplo, ver Phillips, et al . ; Plant Cell Tissue Organ Culture; Vol. 1; p. 123; (1981); Patterson, et al . ; Plant Sci. ; Voi. 42; p. 125; (1985); Wrigt, et al Plant Cell Reports; Vol 6; p. 83; (1087) y Barwale, et al . ; Planta; Vol. 167; p. 473; (1986); cada una incorporada en su totalidad en
la presente por referencia. La selección de un método apropiado está dentro de la experiencia de la técnica. Los ejemplos de la práctica de la presente invención detallados en la presente se refieren específicamente a las plantas de maíz. Sin embargo, la presente ' invención también se aplica a otras plantas de cereal. Los vectores de expresión utilizados en la presente son demostrablemente capaces de operación en células de plantas de cereales tanto en cultivo de tejidos como en plantas completas. La invención descrita en la presente es así operable en especies monocotiledóneas para transformar células vegetales individuales y para lograr plantas completas intactas, las cuales pueden regenerarse de células vegetales transformadas y las cuales expresan polipéptidos preseleccionados. Los genes estructurales introducidos se expresan en las células vegetales transformadas y se transmiten establemente (somáticamente y sexualmente) a la siguiente generación de células producidas. El vector debe ser capaz de introducir, mantener, y expresar un gen estructural en células vegetales. El gen estructural se pasa a la progenie por transmisión sexual normal. Para confirmar la presencia del gen o genes estructurales o "transgen o transgenes" en las plantas de regeneración, o semillas o progenie derivada de la planta
regenerada, pueden realizarse una diversidad de pruebas. Tales pruebas incluyen tinción Southern y Northern; PCR; pruebas que detectan la presencia de un producto polipéptido, por ejemplo por medios inmunológicos (ELISA y tinciones Western) o por función enzimática; pruebas de parte de planta, tales como pruebas de hoja, semilla o raíz; y también, analizando el fenotipo de la planta regenerada completa . En donde las técnicas de análisis de ADN pueden conducirse usando ADN aislado de cualquier parte de una planta, el ARN se expresará en el endospermo de la semilla y en consecuencia será necesario preparar ARN para análisis de esos tejidos. Las técnicas de PCR pueden usarse para la detección y cuantificación del ARN producido de genes estructurales introducidos. En está aplicación de PCR es necesario primero invertir la transcripción de ARN en ADN usando, enzimas tales como transcriptasa inversa, y después a través del uso de técnicas convencionales de PCR amplificar el ADN. Aún cuando son útiles, en la mayoría de los casos las técnicas de PCR, no demostrarán la integridad del producto de ARN. Puede obtenerse información adicional acerca de la naturaleza del producto ARN puede obtenerse por tinción Northern. Esté técnica demostrará la presencia de una especie de ARN y da información acerca de la integridad de ese ARN.
La presencia o ausencia de una especie de ARN también puede determinarse usando hibridaciones de punto o ranura de tinción Northern. Estás técnicas son modificaciones de la tinción Northern y solamente demostrarán la presencia o ausencia de una especie de ARN. Mientras que la tinción Southern y PCR pueden usarse para detectar el gen estructural en cuestión, no proporcionan información respecto que a si el gen estructural se está expresando. La expresión puede evaluarse identificando específicamente los productos polipéptidos de los genes estructurales introducidos o evaluando los cambios fenotípicos originados por su expresión. Las pruebas para la producción e identificación de polipéptidos específicos puede hacer uso de las propiedades físicas-químicas, estructurales, funcionales, u otras de los polipéptidos. Las propiedades únicas físicas-químicas o estructurales permiten separar e identificar los polipéptidos por procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis de gen nativo o desnaturalizante o enfoque isoléptico, o por técnicas cromatográficas tales como cromatografía de intercambio iónico o exclusión de gen. Las estructuras únicas de los polipéptidos individuales ofrecen oportunidades para el uso de anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos tales como la prueba ELISA. Las combinaciones de los enfoques pueden
emplearse con todavía mayor especificidad tal como la tinción Western en la cual los anticuerpos se usan para localizar productos de gen individuales que han sido separados por técnicas electroforéticas . Las técnicas adicionales pueden emplearse para confirmar absolutamente la identidad del producto de interés tal como la evaluación por secuencia de aminoácidos seguida de purificación. Aunque estos están entre los más comúnmente empleados, otros procedimientos pueden usarse adicionalmente. Muy frecuentemente, la expresión de un producto del gen se determina evaluando los resultados fenotípicos de su expresión. Estás pruebas también pueden tomar muchas formas, que incluyen pero no se limitan a, analizar los cambios en la composición química, morfología, o propiedades fisiológicas de la planta. En particular, el contenido elevado del aminoácido preseleccionado debido a la expresión de genes estructurales que codifican polipéptidos pueden detectarse por el análisis de aminoácidos. Las técnicas de multiplicación útiles en la presente invención son bien conocidas en la técnica. La presente invención se describirá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos detallados. Se entiende, sin embargo, que existen muchas extensiones, variaciones, y modificaciones sobre el tema básico de la presente invención más allá de los mostrados en los ejemplos
y descripción, los cuales están dentro del espíritu y alcance de la presente invención. Ejemplos EJEMPLO 1 Construcción del gen HT12 y de otros genes que codifica polipéptidos que tienen un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado . Como se notó anteriormente, la secuencia del gen HT12 se basa en la secuencia de ARNm del gen nativo de alfa hordotionina de Hordeum vulgare (número de acceso X05901, Ponz et al . 1986 Eur.J. Biochem. 156:131-135) modificado para introducir 12 residuos de lisina dentro del péptido maduro de hordotionina (Ver Rao et al 1994 Protein Engineerting 7 (12) :1485-1493, y WO 94/16078 publicado el 21 de julio de 1994) . ' EL ADNc de alfa hordotionina que comprende la secuencia completa que codifica alfa hordotionina se aisla por rt-PCR de ARNm a partir del desarrollo de semilla de cebada. Los cebadores se diseñan basados en la secuencia publicada de alfa hordotionina para amplificar el gen y para introducir un sitio Ncol en el codón de inicio (ATG) y un sitio BamHI después del codón de retén de la secuencia que codifica tionina para facilitar la clonación. Los cebadores se diseñan como HTPCR1 (5'-AGTATAAGTAAACACACCATCACACCCTTGAGGCCCTTGCTGGTGGCCATGGTG-3' ) Y
HTPCR2 (5'- CCTCACATCCCTTAGTGCCTAAGTTCGACGTCGGGCCCTCTAGTCGACGGATCCA-3' ) . Estos cebadores se usan en una reacción PCR para amplificar la alfa hordotionina por métodos convencionales. El producto PCR resultante se purifica y se clona dentro del vector pBSKP digerido BamHI/NcoI (Stratagene, La Jolla, CA) y secuenciado en ambas hebras para confirmar su identidad. El clon se designa pBSKP-HT (sec. ID 1). Los cebadores se diseñan para mutagenesís dirigida al sitio de ADN de hebras sencillas para introducir 12 codones para lisina, basados en la estructura del péptido de hordotionina 12 (Ref: Rao et al 1994 Protein Enqineerinq 7 ( 12 ): 1485-1493) y se designa HT12mutl (5'-AGCGGAAAATGCCCGAAAGGCTTCCCCAAATTGGC-3' ) , HT12mut2 (5'-TGCGCAGGCGTCTGCAAGTGTAAGCTGACTAGTAGCGGAAAATGC-3 ' ) , HT12mut3 (5'-TACAACCTTTGCAAAGTCAAAGGCGCCAAGAAGCTTTGCGCAGGCGTCTG-3' ) , .
HT12mut4 (5'- GCAAGAGTTGCTGCAAGAGTACCCTGGGAAGGAAGTGCTACAACCTTTGC-3' ) . El análisis de secuencia se usa para verificar la secuencia deseada del plásmido resultante, designada pBSKP-HT12 (sec. ID 2) . - Similarmente, los genes que codifican - otros derivados de hordotionina, como se describió anteriormente, (ver Patentes Norteamericanas Números 08/838,763 presentada el 10 de abril de 1997; 08/824,379 presentada el 26 de marzo de 1997; 08/824,382 presentada el 26 de marzo de 1997: y la
Patente Norteamericana Número 5,703,409 expedida el 30 de diciembre de 1997), el gen que codifica la albúmina mejorada de soya (ESA) (Ver Patente Norteamericana Número de Serie 08/618,911), y los genes que codifican BHL y otros derivados del inhibidor de cimotripcina • de cebada (Ver Patente Norteamericana Número de Serie 08/740,682 presentada el 1 de noviembre de 1996 y PCT/US97/20441 presentada el 31 de octubre de 1997) se construyen por mutagénesis dirigida al sitio desde pBSKP-HT, un subclon del gen 3 de albúmina de soya 2S en el vector pBSKP (Stratagene, LaJolla, CA) , y un subclon del inhibidor de quimotripsina de cebada en el vector pBSKP, respectivamente. EJEMPLO 2 Construcción de vectores para la expresión de la semilla preferida' de polipéptidos que tiene un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado Un fragmento de ADN de 442bp que contiene el gen modificado de hordotionina que codifica HT12 se aisla del plásmido pBSKP-HT12 por digestión de restricción de NcoI/BaHI. El PHP3630 es un subclon del gen preferido de endospermo de gamma zeina de 27kD (número de acceso al Banco de genes X58197) en el vector pBSKP (Stratagene), el cual se modifica por mutagéneis dirigida al sitio por inserción de un sitio Ncol en el codón de inicio (ATG) de la secuencia que codifica gamma zeina de 27kD. La secuencia que codifica gamma
zeina de 27kD se reemplaza con la secuencia que codifica HT12. El vector de expresión resultante que contiene la construcción del gen quimérico gz : .HT12 : :gz, designado como PHP8001 (Sec. ID 3) , se verifica por análisis de digestión de restricción extensiva y secuencia de ADN. Similarmente, el fragmento de ADN de 442bp que contiene la secuencia de decodificación HT12 se inserta entre el promotor de globulina 1 y el terminador de globulina 1 del gen de globulina 1 de maíz del embrión preferido (numero de acceso al Banco de gen X59083) , y entre el promotor ceroso y el termmador ceroso del gen ceroso preferido de endospermo (numero de acceso al Banco de gen M24258) . Las secuencias de codificación cerosa y de globulina 1, respectivamente, se reemplazan con la secuencia que codifica HT12. Los genes quiméricos resultantes glbl : :HT12 : - glbl, y wx-:HT12::wx se designan como PHP 7999 (Sec. ID 4), y PHP 5025 (Sec. ID 5).
En una forma similar, los vectores de expresión que contienen los genes que codifican otros derivados de hordotiomna (Ver Rao et al 1994 Protein Enqmeepng 7 (12) :1485-1493, y WO 94/16078 publicada el 21 de julio de 1994), el gen que codifica la albúmina de soya mejorada (ESA) (Ver Patente Norteamericana Numero de Serie 08/618,911,), y los genes que codifican BHL y otros derivados de quimiotppsina de cebada (Ver Patente Norteamericana Numero de Serie 08/740,682 presentada el 1 de noviembre de 1996 y
PCT/US97/20441 presentada el 31 de octubre de 1997) se construyen por la inserción de las secuencias de codificación correspondientes entre el promotor y el termmador del gen de gamma sina de 27kD, y el gen de globulina 1 y el gen ceroso, respectivamente. Los genes quiméricos resultantes son por ejemplo gz::ESA::gz y gz::BHL::gz, designados como PHP11260 (Sec. ID 6) y como PHP11427 (Sec. ID 7), respectivamente. Los vectores de expresión resultantes se usan junto con los casetes de expresión del marcador seleccionables PHP3528 (CAMV: : Bar :: Pinll mejorado) para transformación de bombardeo de partículas de embriones inmaduros de maíz. EJEMPLO 3 Preparación de Plantas Transgénicas El método general de transformación genética usado para producir plantas de maíz transgenicas es mediada por el bombardeo de embriones inmaduros responsivos embriogenicamente con partículas de tungsteno asociado con plasmados de ADN, los plasmidos consisten de un gel marcador seleccionable y uno no seleccionable . Preparación del Tejido Los embriones inmaduros del "Tipo Elevado II" son el objeto de la transformación mediada por bombardeo de partículas. Este genotipo es el Fi de dos lineas genéticas de raza pura, pariente B, y pariente A, derivadas de A188XB73. Ambos parientes se seleccionan por una alta competencia de
embriogénesis somática. Ver Armstrong, et al., "Development and Availability of Germplasm with High Type II Culture Formation Response" Maize Genetics Cooperation Newsletter, Vol. 65, pp. 92 (1991); incorporada en su totalidad en la presente por referencia. Las mazorcas de las plantas Fi se vuelven propias o hermanan, y los embriones se disectan asépticamente de cariopses en desarrollo cuando el escutelo se vuelve opaco al principio. La etapa apropiada ocurre aproximadamente 9-13 días después de la post-polinización, y de forma más general aproximadamente 10 días de la polinización, y depende de las condiciones de crecimiento. Los embriones son de aproximadamente 0.75 a 1.5 mm de longitud. Las mazorcas son esterilizadas de la superficie con 20-50% Clorox durante 30 minutos, seguido por tres lavados con agua destilada estéril.
Los embriones inmaduros se cultivan, el escutelo se orienta hacia arriba, en medio de inducción embriogénica que comprende sales básales N6 (Chu, et al "Establishment of an
Efficient Médium for Anther Culture of Rice Through Comparative Experiments on the Nitrogen Sources, "Scientia Sínica, (Peking), Vol. 18, pp. 659-668 (1975); incorporada en su totalidad en la presente por referencia; vitaminas de Ericksson (ver Ericksson, T., "Studies on the Growth Requeriments and Growth Measurements of Haplopappus qracilis, " Physol . Plant, Vol. 18, pp . 976-993(1965);
incorporada en su totalidad en la presente por referencia) , 0.5 mg/1 de tiamina, HCl, 30 gm/1 de sacarosa, 2.88 gm/1 de L-prolina, 1 mg/1 de ácido 2, 4-diclorofenoxiacético, 2 gm/1 de Gelrite, y 8.5 mg/1 AgN03. El medio se esteriliza en autoclave a 121°C durante
minutos y se dispensa dentro de cajas de petri de 100 X 25 mm. El AgN?3 se filtra-esteriliza y se agrega al medio después de esterilizar en autoclave. Los tejidos se cultivan en completa oscuridad a 28°C. Después de aproximadamente 3 a 7 días, en general aproximadamente 4 días, el escutelo del embrión se ha inchado a aproximadamente al doble de su tamaño original y las protuberancias en la superficie coleorizal del escutelo indica la concepción del tejido embriogénico. Hasta el 100% de los embriones exhiben esta respuesta, pero más comúnmente, la frecuencia de la. respuesta embriogénica es aproximadamente 80%. Cuando se observa la respuesta embriogénica, los embriones se transfieren a aun medio que comprende medio de inducción modificado para contener 120 gm/1 de sacarosa. Los embriones se orientan con el polo coleorizal, el tejido embriogénicamente responsivo, hacia arriba del medio de cultivo. Se ubican diez embriones por caja de petri en el centro de una caja de petri en un área de aproximadamente 2 cm de diámetro. Los embriones se mantienen sobre este medio durante -3-16 hr, preferiblemente 4 horas en completa
oscuridad a 28°C justo antes del bombardeo con partículas asociado con los DNA de plésmido que contienen los genes marcadores seleccionables y no seleccionables . Para efectuar el bombardeo de partículas de los embriones, las partículas de aglomerado de DNA se aceleran usando un dispositivo de aceleración de partículas DuPont PDS-1000. La aglomeración de partículas de DNA se hace sonicar brevemente y se depositan 10 µl en macro portadores y se deja evaporar el etanol. El macroportador se acelera sobre una pantalla de retención de acero inoxidable por la ruptura de un diafragma de polímero (disco de ruptura). La ruptura se efectúa por el helio presurizado. Dependiendo de la presión de rompimiento del disco de ruptura, la velocidad de la aceleración de las partículas de DNA puede variar. Comúnmente se usan presiones de disco de ruptura de 200 a 1800 psi, siendo más preferidas aquellas de 650 a 1100 psi, y siendo las más altamente preferidas aproximadamente 900 psi. Las presiones de rompimiento del disco de ruptura son aditivas de manera que pueden usarse discos múltiples para efectuar un rango de presiones de ruptura. Preferiblemente, el entrepaño que contiene el plato con los embriones está a 5 cm abajo del fondo de la plataforma del macroportador (repisa #3), pero pueden ubicarse a otras distancias. Para efectuar el bombardeo de partícula de embriones inmaduros cultivados, se instala en el
dispositivo un disco de ruptura y un macroportador con aglomerados secos de partículas de DNA. La presión de He entregada al dispositivo se ajusta 200 psi arriba de la presión de rompimiento del disco de ruptura. Se coloca una caja de petp con los embriones objeto dentro de la cámara de vacio y se ubica en el camino proyectado de las partículas aceleradas. Se crea un vacio en la cámara, de preferencia aproximadamente 28 pulgadas de Hg. Después de operar el dispositivo, el vacio se libera y la caja de petri se elimina. Los embriones bombardeados permanecen en el medio ajustado osmóticamente durante el bombardeo, y preferiblemente durante dos días subsecuentemente, aunque los embriones pueden permanecer en este medio durante 1 a 4 días. Los embriones se transfieren a un medio de selección que comprende sales básales N6, vitaminas de Ericksson, 0.5 mg/1 de tiamina HCl, 30 mg/1 de sacarosa, 1 mg/1 de acido 2,4-diclorofenoxiacetico, 2 gm/1 de Gelrite, 0.85 mg/1 de AgN?3 y 3 mg/1 de bialafos. El bialafos se agrega filtrado esterilizado. Los embriones se subcultivan en un medio de selección fresco a intervalos de 10 a 14 días Después de aproximadamente 7 semanas, el tejido embriogenico, putativamente transgenico para genes marcadores seleccionables y no seleccionables, se ve proliferar de aproximadamente 7% de los embriones bombardeados. El tejido
putativo transgénico se rescata, y ese tejido derivado de embriones individuales se considera ser un evento y se propaga independientemente en medio de selección. Se logran dos ciclos de propagación clonal, por selección visual para los fragmentos contiguos más pequeños de tejido embriogénico organizado . Para la regeneración de plantas transgénicas, el tejido embriogénico se subcultiva a un medio que comprende sales de MS y vitaminas (Murashige, T. and F. Skoog, "A revised médium for rapid grosth and bio assays with tobáceo tissue cultures", Physiologia Plantarum; Vol. 15; pp. 473-497; 1962; incorporado en su totalidad en la presente por referencia), 100 mg/1 de mio-inositol, 60 gm/1 de sacarosa, 3 gm/1 de Gelrite, 0.5 mg/1 de zeatina, 1 mg/1 de ácido indol-3-ácético, 26.4 ng/1 de ácido cis-trans-abscísico, y 3 mg/1 de bialafos en cajas de petri de 100 X 25 mm y se encuban en la oscuridad a 28°C hasta que el desarrollo de embriones somáticos maduros, bien formados pueden visualizarse. Esto requiere aproximadamente 14 días. Los embriones somáticos • bien formados son opacos y de color crema, y están comprendidos de un escutelo y coleoptilo identificable. Los embriones se subcultivan individualmente en medio de germinación que comprende sales de MS y vitaminas, 100 mg/1 mio-inositol, 40 gm/1 de sacarosa y 1.5 gm/1 de Gelrite en cajas de petri de 100 X 25 mm y se
encuban bajo luz 16 h: fotoperiodo de 8 h. de oscuridad y 40 µEinsteinsmo-2 seg-1 de tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los embriones somáticos han germinado y producen un retoño y raíz bien definidos. Las plantas individuales se subcultivan en un medio de germinación en tubos de vidrio de 125 x 25 mm para permitir el desarrollo adicional de la planta. Las plantas se mantienen bajo una luz 16 h: fotoperiodo de 8 h de oscuridad y 40 µEinsteinsmo"2 seg"1 de tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, las plantas están bien establecidas y se transplantas a suelo hortícola, se endurecen y plantan en mezclas de suelo de invernadero comercial y se crecen hasta madurez sexual en un invernadero. Una línea consanguínea de élite se usa como un macho para polinizar plantas transgénicas regeneradas. Preparación de Partículas Quince mg de partículas de tungsteno (General Electric), 0.5 a 1.8 µm, preferiblemente 1 a 1.8 µm, y de mayor preferencia 1 µm, se agregan a 2 ml de ácido nítrico concentrado. Está suspención se hace sonicar a 0°C durante 20 minutos (Branson Sonifier Model 450, 40% de salida, ciclo de trabajo constante) . Las partículas de tungsteno se hacen pella por centrifugación a 10000 rpm (Biofuge) durante 1 min y el sobrenadante se elimina. Se agregan dos ml de agua
destilada estéril a la pella y se hacen sonicar brevemente para resuspender las partículas. La suspención se hace pella, se agrega 1 ml de etanol absoluto a la pella y se hace sonicar brevemente para resuspender las partículas. Se lava, se hace -pella, y se resuspenden las partículas 2 veces adicionales con agua destilada estéril, y las partículas se resuspenden finalmente en 2 ml de agua destilada estéril, las partículas se subdividen en alícuotas de 250 µl y se almacenan congeladas. Preparación de la asociación de plásmido de ADN partícula El patrón de partícula de tungsteno se hace sonicar brevemente en un sonicador de baño de agua (Branson Sonifier Model 450, 20% de salina, ciclo constante de trabajo) y 50 µl se transfieren a un tubo de microcentrífuga. Se agrega plásmido de ADN a las partículas hasta una cantidad final de ADN de 0.1 a 10 µg en un volumen total de 10 µl, y se hace sonicar brevemente. Preferiblemente se usa 1 µg de ADN total. Específicamente, 5 µl de PHP8001 (gz : :HT12 : : gz) y 5 µl de PHP3528 (CAMV: : Bar: :PinII mejorado) a 0.1 µg/µl en regulador de TE, se agrega a la suspensión de partículas. Cincuenta µl de CaCl2 2.5 M estéril acuoso se agrega, y la mezcla se hace sonicar brevemente y agitar. Se agregan veinte µl de espermidina de 0.1 M estéril acuosa y la mezcla se hace sonicar brevemente y se agita. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos con sonicación breve
intermitente. La suspención de partículas se centrifuga, y el sobrenadante se elimina. Se agregan doscientos cincuenta µl de etanol absoluto a la pella y se hace sonicar brevemente.
La suspención se hace pella, el sobrenadante se elimina, y se agregan 60 µl de etanol absoluto. La suspención se hace sonicar brevemente antes de cargar la aglomeración de partícula de ADN en macroportadores . EJEMPLO 4 Análisis de semillas de plantas transgénicas por polipéptidos recombinantes qae tienen un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado . Preparación de harinas de semilla de maíz Semillas secas individuales o reunidas cosechadas de plantas transformadas de invernadero o del campo se preparan en una de las siguientes formas: A. Las semillas se embeben en agua estéril durante la noche (16-20 h) a 4°C. La semilla embebida se disecta en embrión, endospermo y pericarpio. Los embriones y endospermo se congelan separadamente en N2 líquido, los pericarpios se desechan. El tejido congelado se muele con un mortero y manilla de cerámica enfriado con N2 líquido hasta una harina fina. Las harinas se secan bajo vació y se almacenan en -20°C o -80°C. B La semilla completa 'se muele hasta una harina fina con un molino de bolas (Klecko) , o a mano con mortero y
^¡?L
manilla de cerámica. Para análisis de endospermo solamente, los embriones se eliminan con un taladro y se desechan. El endospermo remanente con el pericarpio se muelen en un molino de bolas o con mortero y manilla. Análisis ELISA Se produce antisuero antiHT12 policlonal de conejo con HT12 sintético (Ver Rao et al . supra) en los laboratorios Bethyl . Se desarrolló una prueba HT12 ELISA y se realizó por el departamento de Bioquímica Analítica de Pioneer Hi-International, Inc., esencialmente como se describe por Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publication, New York (1988). Las pruebas cuantitativas de ELISA se realizan primero en harinas reunidas para identificar eventos positivos. Los eventos positivos se analizan adicionalmente por ELISA cuantitativa o granos individuales para determinar el nivel relativo de la relación de la expresión HT12 y la segregación del transgen. Entre 97 eventos probados, 59 muestran niveles de expresión de HT12 >1000 ppm. Los eventos más altos tienen niveles de expresión HT12 a 2-5% de la proteína total de semillas. Los resultados típicos para los niveles de HT12 para granos completos de maíz de tipo silvestre, para un evento (TC2031) de maíz transformado con el gen quimérico gz : :HT12 : : gz, que expresa HT12 en el endospermo, por un evento (TC320) de maíz transformado con el gen quimérico wx : : HT12 : : wx, que expresa
HT12 en el endospermo, y para un evento (TC2027) de maíz transformado con el gen quimérico glbl :: HT12 :: glbl, que expresa HT12 en el embrión, están en la Tabla 1. Similarmente, se produce antisuero, pruebas ELISA se desarrollan y las pruebas de semilla de plantas transformadas se realizan para otros derivados de hordotionina (Ver Rao et al . 1994 Protein Engineerinq 7 (12) :1485-1493, y WO 94/16078 publicada el 21 de julio de 1994), para la albúmina de soya mejorada (ESA) (Ver Patente Norteamericana No. de Serie 08/618,911) y para BHL y otros derivados del inhibidor de quimotripcina de cebada (Ver Patente Norteamericana No. de Serie 08/740,682 presentada el I de noviembre de 1996 y PCT/US97/20441 presentada el 31 de octubre de 1997), respectivamente.' Análisis en qel de Poliacrilamida e Inmunotinción Extractos SDS de harinas, marcadores de peso molecular, y un control positivo de HT12 sintético (ver Rao et al. supra ) se separaron en geles 16.5% u 8-22% de poliacrilamida gradiente Tris-Tricina (Schagger, H., y Von Jagow, G. 1987 Anal. Biochem., 166:368). Para el análisis de inmunotinción, los geles son transferidos a membranas de PVDF en 100 mM de CAPS, pH 11; 10% de metanol usando un papel secante semiseco (Hoefer, San Francisco, CA) . Después de transferir la membrana se bloquea en BLOTTO (4% de leche en polvo en Tris regulado con solución salina, pH 7.5) (Johnson,
D.A., Gausch, J. W., Sportsman, J. R., y Eider, J. H. 1984, Gene Anal. Tech., 1:3). Las tinciones se incuban con anti-HT12 de conejo (el mismo usado para ELISA) diluido 1:2000 a 1:7500 en BLOTTO por 2 h a temperatura ambiente (22 °C) o durante la noche a 4°C. Las tinciones se lavaron 4-5X con BLOTTO, después se incubaron 1-2 h con peroxidasa de rábano picante-cabra anti-conejo IgG (Promega, Madison, Wl) diluido 1:7500 a 1:15000 en BLOTTO. Después del anticuerpo secundario, las tinciones se lavaron 3X con BLOTTO seguido por 2 lavados con Tris-regulado con solución salina, pH 7.5. Las tinciones se incuban brevemente con substrato de quimioluminicencia mejorada (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL) , y se envolvieron en envoltura plástica. Las bandas reactivas se visualizan después de la exposición a películas de rayos X (Kodak Biomax MR) después de tiempos cortos de exposición que varían de 5-120 seg. La semilla transgénica HT12 muestra una banda distintiva no vista en la semilla de tipo silvestre en la posición y peso molecular correcto como se juzga por el estándar de control positivo HT12 y los marcadores de peso molecular. Estos resultados indican que el prepropéptido HT12 expresado está siendo correctamente procesado como HT nativo en cebada. También se observan bandas co-migrantes del polipéptido novedoso con el control positivo HT12 en geles de poliacrilamida teñidos de Coomassie cargados con lOmg de
proteína total extraída que indica una expresión sustancial y acumulación de proteína TH12 en la semilla. Similarmente, otros derivados de hordotionina, albúmina de soya, albúmina mejorada de soya (ESA) , BHL y otros derivado del inhibidor de quimotripcina de cebada se detectan por gel de 'poliacrilamida y análisis de inmunotinción . Análisis de la composición de aminoácido Las harinas de semilla, endospermo o embrión que expresan un polipéptido recombinante que tiene un nivel elevado de un aminoácido preseleccionado se mandan a la Instalación de Estructura de Proteínas de la Universidad de Iowa para el análisis de la composición de aminoácidos usando protocolos estándar para la digestión y el análisis. Los resultados típicos- para la composición de aminoácidos de granos completos de maíz tipo silvestre para un evento (TC2031) de maíz transformado con el gen quimérico gz::HT12::gz que expresa HT12 en el endospermo, para un evento (TC320) de maíz transformado con el gen quimérico wx : : HT12 : : wx, que expresa HT12 en el endospermo, y para un evento (TC2027) de maíz transformado con el gen quimérico glbl : : HT12 : :glbl, que expresa HT12 en el embrión y están en la Tabla 1. Tabla 1: Análisis de HT12 por ELISA y la composición de aminoácidos de harina de granos completos de maíz de tipo
silvestre y de maíz transformado que expresa HT12 recombinante . transgen ninguno x::HT12::wx gz::HT12::gz glbl::HT12::glbl evento tipo silvestre TC320 TC2031 TC2027 ELISA
HT 12 ppm de proteípa ppm de proteípa ppm de proteína ppm de proteípa • 0.00 6200 8000 22600 AA Harina % Harina % Harina % Harina % n=3 n=2 p=3 n=4 Lis 0.29 0.38 0.39 0.2 . Arg 0.52 0.58 0.56 0.45 Cis 0.12 0.19 0.17 0.22 Los resultados de la Tabla I demuestran que el maíz que expresa HT12 recombinante en el endosperma muestra un incremento significativo del aminoácido preseleccionado lisina . Tabla 2 : SECUENCIA DE INFORMACIÓN SECUENCIA DE ID GEN PROMOTOR Sec 1: pBSKP-HT Ninguna 3361-2947
Sec 2: pBSKP-HT12 Ninguna 3361-2947
Sec 3: PHP8001gz::HTl2..gzvector de expresión 676-2198 2199-2612
Sec 4: PHP7999 glbl::HT12.:gl_ l vector de expres¡ón 3271-1834 1834-1420
Sec 5: PHP5025 wx::HT::wx vector de expresión 43-1342 1343-1757
Sec 6: PHP 11260 gz::ESA::gz vector de expresión 676-2198 2199-2675 Sec 7: PHP11427 gz::BHL::gz 676-2198 2199-2450 La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos, porque debe entenderse que pueden hacerse muchas variaciones y modificaciones a la vez que permanece dentro del espíritu y alcance de la invención definida por las reivindicaciones .
Claims (9)
1. 19. Una semilla de una planta de cereal la cual ha sido transformada para expresar una proteína heteróloga en el endospermo de la semilla, caracterizada porque la semilla exhibe un nivel elevado de un aminoácido esencial comparado a una planta la cual no ha sido transformada. 20. Un método para aumentar el valor nutricional de una semilla de planta de cereal caracterizado porque comprende: transformar una célula vegetal huésped con un vector que comprende un cásete de expresión que comprende un promotor preferido de endospermo de semilla unido operablemente a un gen estructural que codifica a un polipéptido elevado en contenido de un aminoácido preseleccionado; recuperación de las células transformadas; regeneración de una planta transformada; y recuperación de las semillas desde la misma. 21. La semilla producida por el método de conformidad con la reivindicación 20. 2
2. Un método para aumentar el valor nutricional de una semilla de planta de cereal caracterizado porque comprende : a) transformar una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un promotor preferido de endospermo de semilla unido operablemente a un polinucleótido que codifica una proteína de lisina elevada y metionina elevada; b) regenerar una planta transformada desde la célula transformada; y c) recuperar semillas -transformadas que tienen lisina y metionina incrementadas comparadas a una semilla de planta de cereal no transformada correspondiente. 2
3. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la semilla de planta es maíz. 2
4. Una semilla de una planta de cereal la cual ha sido transformada para expresar en el endospermo de la semilla una proteína de lisina elevada y metionina elevada, caracterizada porque el endospermo de la semilla comprende niveles elevados de lisina y metionina comparados con un endospermo de una semilla de planta de cereal no transformada correspondiente. 2
5. La semilla de conformidad con la reivindicación 24, la caracterizada porque maíz. 2
6. Un cásete de expresión caracterizado porque comprende un promotor preferido de endospermo unido operablemente a una secuencia del nucleótido que codifica una proteína con lisina elevada y metionina elevada. 2
7. El vector caracterizado porque comprende el cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 26. 2
8. Una planta de cereal caracterizada porque comprende el cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 26. 2
9. La planta de cereal de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque es maíz. 30. La célula de la planta de cereal de conformidad con la reivindicación 28. 31. La célula de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque es maíz. 32. La semilla producida por la planta de cereal de conformidad con la reivindicación 28. 33. La semilla de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque es maíz. 34. La semilla de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el contenido de lisina y metionina en el endospermo de la semilla están incrementados cada uno en al menos aproximadamente 10% en peso comparado a un endospermo de una semilla de planta de cereal no transformada correspondiente. 35. La semilla de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el contenido de lisina y metionina en el endospermo de la semilla están incrementados cada uno en al menos aproximadamente 15% en peso comparado a un endospermo de una semilla de planta de cereal no transformada correspondiente. 36. La semilla de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el contenido de lisina y metionina en el endospermo de la semilla están cada uno incrementados en al menos aproximadamente 20% en peso comparado a un endospermo de una semilla de planta de cereal no transformada correspondiente. 37. El producto de alimento o alimentación caracterizado porque comprende la semilla de conformidad con la reivindicación 24. 38. El producto de alimento o alimentación de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende harina integral, harina, sémola, maíz machacado, gachas, o forraje. 39. Un método para aumentar el valor nutpcional de una semilla de planta de cereal caracterizado porque comprende: a) transformar una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un promotor preferido de endospermo de semilla unido operablemente a un polinucleótido que codifica una proteína con lisina elevada y metionina elevada, en donde el polinucleótido comprende alfa hordotionina de cebada, inhibidor de quimiotripcina de cebada, proteína de albúmina de soya 2S (ESA) , albúmina de chícharos, proteína de maíz de 15KD rica en azufre de Sec. ID No. 16, la proteína de maíz de 10KD rica en metionina de Sec. ID No. 18, prolamina de arroz rica en azufre, purotionina de endospermo de trigo o albúmina de alfalfa rica en azufre; b) regenerar una planta transformada desde la célula transformada; y d) recuperar semillas transformadas que tienen lisina y metionina incrementada comparada a una semilla de planta de cereal no transformada correspondiente.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09020716 | 1998-02-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| MXPA00007707A true MXPA00007707A (es) | 2001-07-31 |
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