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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Expression
von heterologen Proteinen in Pflanzensamen
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Die
Expression von heterologen Proteinen in Pflanzensamen ermöglicht beispielsweise
die Produktion großer
Mengen von leicht zu erntenden Polypeptiden sowie die Expression
von Proteinen, welche die Getreidequalität verbessern. Ausführungen
zu diesem Konzept können
in US-Patent Nr. 5,714,474 ("Production
of enzymes in seeds and their uses") gefunden werden.
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Hordein-Speicherproteine
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Die
Samenspeicherproteine der Gerste machen etwa 8 bis 15 des Trockengewichts
des reifen Getreidekorns der Gerste aus. Die hauptsächlichen
Samenspeicherproteine der Gerste sind alkohollösliche Prolamine, die als Hordeine
bezeichnet werden, und in zwei Hauptgruppen (B und C) und in zwei
Nebengruppen (D und γ)
eingeteilt werden (Shewry 1993). Abhängig vom Stickstoffgehalt machen
diese vier Gruppen etwa 35 bis 55 % des Gesamtproteins im Gerstensamen
aus. Die B- und C-Hordeine machen etwa 70-80 % bzw. 10-20 % der
gesamten Hordein-Fraktion aus, wobei geringe Mengen D-Hordein (2
bis 4 %) und γ-Hordein
(nicht genau bestimmt) vorkommen. Die B-, D- und γ-Hordeine
sind schwefelreiche Prolamine, während
die C-Hordeine schwefelarme Prolamine sind (Bright und Shewry 1983).
Die Hordeine werden koordiniert in dem sich entwickelnden, stärkereichen
Endospermgewebe gebildet (Giese et al. 1983; Sørensen et al. 1989). Sie
werden co-translational in das Lumen des rauen endoplasmatischen
Retikulums transportiert, wobei gleichzeitig das Signalpeptid abgespalten
wird, und sie werden schließlich
in Proteinkörperchen
eingelagert (Cameron-Mills 1980; Cameron-Mills und von Wettstein 1980; Cameron-Mills
und Madrid 1989).
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Genetische
Untersuchungen zeigen, dass alle Hordeine von Strukturgenen auf
Chromosom 5 (1H) der Gerste kodiert werden; die Loci Hor1, Hor2,
Hor3 und Hor5 auf Chromosom 5 kodieren für das C-, B-, D-, bzw. γ-Hordein-Polypeptid
(Jensen et al. 1980; Shewry et al., 1980; Blake et al. 1982; Shewry
et al. 1983; Shewry und Parmar 1987). Die Gene für B-, C- und D-Hordein sind
isoliert und charakterisiert worden (Brandt et al. 1985; Forde et
al. 1985; Rasmussen und Brandt 1986; Sorensen et al. 1996). Die
B- und C-Hordeine werden von Multigenfamilien kodiert, die 10 bis
20 Mitglieder umfassen, während
D-Hordein von einem einzelnen Gen kodiert wird (Brandt et al. 1985;
Rasmussen und Brandt 1986; Sørensen
et al. 1996). Die Regulation und Expression dieser Hordein-Promotoren
ist mit Hilfe von transienten Expressionsassays im Endosperm der
Gerste untersucht worden (Entwistle et al. 1991; Müller und
Knudsen 1993; Sorensen et al. 1996). Wie in diesen Assays durch
Verwendung von Promotor-uidA-Fusionen festgestellt wurde, ist der
D-Hordein-Promotor 3- bis 5-mal aktiver als die untersuchten Promotoren
von B- oder C-Hordein (Sorensen et al. 1996). Der B-Hordein-Promotor
wurde auch unter Verwendung einer stabilen Transformation von Tabak
mit Promotor-cat-Fusionen untersucht (Marris et al. 1988).
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Obwohl
die Gene für
B-, C- und D-Hordein isoliert und charakterisiert worden sind, ist
ihre Regulation und Expression nur in transienten Expressionsassays
bei der Gerste und in stabil transformiertem Tabak untersucht worden
(Brandt et al. 1985; Forde et al. 1985; Marris et al. 1988; Sorensen
et al. 1996).
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In
Gerste, Weizen und Mais werden die hauptsächlich vorkommendenen, hochgradig
unlöslichen
Prolamin-Speicherproteine an Polysomen synthetisiert, die eng mit
dem endoplastischen Retikulum (ER) assoziiert sind. (Siehe Seeds:
Physiology of Development and Germination, 2nd ed.,
Hrsg. Bewley and Black, Plenum Press, New York, 1994).
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Neu
synthetisierte Proteine durchqueren die ER-Membran in das Lumen,
wo sie zu kleinen Partikeln assoziieren, die nach und nach größere Aggregate
und Proteinkörperchen
bilden (welche im Elektronenmikroskop beobachtet werden können).
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Im
sich entwickelnden Endosperm von Weizen reichern sich zwei Arten
von Proteinkörperchen
unabhängig
voneinander an: Körperchen
mit geringer Dichte, die sich früher
entwickeln, und Körperchen
mit hoher Dichte, die sich später
entwickeln und vom ER abgeleitet sind. Die Proteine mit hoher Dichte
werden gebildet, wenn die Aggregation von Proteinen im Inneren des
Lumens des ER eine Belastung auf die Membran ausübt und ihr Zerreißen verursacht.
Die Membran kann sich frei von Proteinaggregaten neu bilden, nachdem
ein Intervall aufgetreten ist, in dem der Proteinkörper selbst
nicht von einer Membran gebunden ist. In anderen Getreidearten (außer in Weizen
und Gerste), wie beispielsweise in Hirse, Reis, Mais und Sorghum,
verbleiben die Proteinkörperchen
sogar im reifen Samen als einzelne membrangebundene Einheiten.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine transgene monokotyle Pflanze bereit,
die einen für
die Samenreifung spezifischen Promotor und eine in funktionsfähiger Weise
mit diesem Promotor verknüpfte
Signal-DNA-Sequenz, die für
eine monokotyle samenspezifische Sequenz kodiert, welche in der
Lage ist, ein damit verknüpftes
Polypeptid zielgerichtet zu einem Proteinspeicherkörper in
monokotylen Samen zu leiten, und eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Protein kodiert,
das kein Samenspeicherprotein ist, wobei die DNA-Sequenz in funktionsfähiger Weise
mit der Signal-DNA-Sequenz verknüpft
ist, umfasst, wie es in den anliegenden Ansprüchen definiert ist.
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Die
Erfindung stellt ferner transgene Samen dieser transgenen Pflanzen
bereit, die als Bezugsquelle für
die exprimierten Polypeptide nützlich
sind, oder die Qualität
des Getreides verbessern können.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung sind die bereitgestellten transgenen Pflanzen stabil transformierte
monokotyle Pflanzen, beispielsweise Getreidepflanzen, wie Gerste
oder Weizen. In bestimmten Ausführungsformen
stellt die Erfindung stabil transformierte Gerstenpflanzen mit Genotypen
bereit, umfassend: Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian
III, Galena, Salome, Steptoe, Klages und Baronesse. Die Erfindung
stellt ferner stabil transformierte Weizenpflanzen mit Genotypen
bereit, umfassend: Anza, Karl, Bobwhite und Yecora Rojo.
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Die
Erfindung stellt ferner Samen von stabil transformierten Pflanzen
bereit, die das ausgewählte
Polypeptid in ihren Samen exprimieren. Das Polypeptid kann verwendet
werden, um die Qualität
des Getreides zu verbessern, oder es kann zu einem Zeitpunkt der
maximalen Expression oder Stabilität aus dem Samen extrahiert
werden, um für
andere Zwecke verwendet zu werden.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1A ist ein schematisches Diagramm einer
Strategie mit vier Primern zur Herstellung chimärer Produkte unter Verwendung
der Polymerasekettenreaktion (PCR).
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1B ist ein schematisches Diagramm einer
Strategie mit drei Primern zur Herstellung chimärer Produkte unter Verwendung
der Polymerasekettenreaktion (PCR).
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1C ist eine Karte eines Konstrukts, das
(von 5' nach 3') den B1-Hordein-Promotor,
die B1-Hordein-Signalsequenz, das uidA-Gen
und den nos 3'-Terminator
umfasst.
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2A und 2B zeigen
Alignments von Konstrukten, die den B1-Hordein-Promotor,
das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator
umfassen, mit (2A) oder ohne (2B) B1-Hordein-Signalsequenz.
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3 zeigt
die Nukleinsäuresequenz
des B1-Hordein-Promotors und die B1-Hordein-Signalsequenz aus 57 bp (unterstrichen).
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4 zeigt
die Nukleinsäuresequenz
des D-Hordein-Promotors und die D-Hordeinsignalsequenz aus 63 bp
(unterstrichen).
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5 ist
ein Balkendiagramm, das die GUS-Aktivität in reifen Gerstensamen zeigt,
die Konstrukte exprimieren, welche den B1-Hordein-Promotor,
das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator
entweder mit (+SS) oder ohne (–SS)
die B1-Hordein-Signalsequenz umfassen.
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6 ist
ein Balkendiagramm, das die GUS-Aktivität in unreifen Gerstensamen
zeigt, die Konstrukte exprimieren, welche den B1-Hordein-Promotor,
das uidA-Gen und den nos 3'-Terminator
entweder mit (+SS) oder ohne (–SS)
die B1-Hordeinsignalsequenz umfassen.
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7 ist
eine elektronenmikroskopische Aufnahme, in der ein Immunsignal spezifisch
für Proteinkörper in
GUS-exprimierendem unreifem Endosperm einer Linie ist, die mit dem
B1-Hordein-uidA-DNA-Konstrukt transformiert wurde,
das die N-terminale Signalpeptidsequenz aus 19 Aminosäuren enthält.
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SEQUENZPROTOKOLL
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Die
Nukleinsäuresequenzen
und Aminosäuresequenzen,
die in dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufgeführt sind, werden unter Verwendung
von Standardbuchstabenabkürzungen
für Nukleotidbasen
sowie dem 3 Buchstabenkode für
Aminosäuren
gezeigt. Es ist jeweils nur ein Strang jeder Nukleinsäuresequenz
gezeigt, wobei es jedoch verständlich
ist, dass der komplementäre
Strang durch Verweis auf den gezeigten Strang eingeschlossen ist.
- SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz des Gersten-B1-Hordein-Promotors
und die Signalsequenz.
- SEQ ID NO: 2 zeigt die Aminosäuresequenz der Gersten-B1-Hordein-Signalsequenz.
- SEQ ID NO: 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz des Gersten-D-Hordein-Promotors
und der Signalsequenz.
- SEQ ID NO: 4 zeigt die Aminosäuresequenz der Gersten-D-Hordein-Signalsequenz.
- SEQ ID NOs: 5-16 zeigen PCR-Primer, die zur Amplifikation der
vorliegend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle verwendet wurden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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I. Abkürzungen und Definitionen
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A. Abkürzungen
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- BMW:
- Hochmolekulargewicht
- CAT:
- Chloramphenicol-Acetyltransferase
- GUS:
- β-Glucuronidase
- uidA:
- β-Glucuronidase-Gen
- PCR:
- Polymerasekettenreaktion
- PEG:
- Polyethylenglykol
- MS-Medium:
- Medium nach Murashige
und Skoog
- CIM:
- Kallus-Induktionsmedium
- IIM:
- intermediäres Inkubationsmedium
- RM:
- Regenerierungsmedium
- 2,4-D:
- 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
- BAP:
- 6-Benzylaminopurin
- 2iP:
- N6-(2-Isopentyl)adenin
- GFP:
- grün fluoreszierendes Protein
- CaMV:
- Blumenkohlmosaikvirus
- rbcS:
- RUBISCO (D-Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase/Oxygenase)
kleine Untereinheit
-
B. Definitionen
-
Soweit
nicht anderweitig angegeben, werden technische Begriffe gemäß der herkömmlichen
Gebrauchsweise verwendet. Definitionen herkömmlicher Begriffe der Molekularbiologie
können
in Lewin, Genes V, veröffentlicht
bei Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew
et al. (Hrsg.), The Encyclopedia of Molecular Biology, veröffentlicht
bei Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); und Robert A.
Meyers (Hrsg.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive
Desk Reference, veröffentlicht
bei VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) gefunden werden.
-
Um
einen Überblick über die
verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung zu ermöglichen,
werden die nachfolgenden Definitionen der Begriffe bereitgestellt:
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Promotor:
-
Eine
Nukleinsäuresequenz,
die die Transkription eines Proteins steuert. Dieser umfasst nicht
nur Moleküle
mit prototypischen Sequenzen, sondern auch Promotoren von Genhomologen.
Ebenfalls umfasst sind Moleküle,
die sich von den offenbarten prototypischen Molekülen durch
geringfügige
Abweichungen unterscheiden. Solche abweichenden Sequenzen können durch
Manipulation der Nukleotidsequenz eines Promotors unter Verwendung
von Standardverfahren erzeugt werden.
-
Hordein-Promotor:
-
Eine
Nukleinsäuresequenz,
die die Transkription eines Hordein-Proteins in den Samen einer Pflanze steuert.
Während
jeder beliebige Hordein-Promotor im Rahmen dieser Erfindung verwendet
werden kann, beschreiben die spezifisch durchgeführten Beispiele die Verwendung
der Promotorsequenzen des B1-Hordein-Gens
und des D-Hordein-Gens der Gerste. Nukleinsäuresequenzen der prototypischen
B1- und D-Hordein-Gene von Gerste sind in
SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3 sowie in 3 bzw. 5 gezeigt.
Die Promotorregion schließt
diejenigen Nukleotide aus, die für
die Signalsequenz kodieren (die unterstrichenen Sequenzen, die in
den 3 und 4 gezeigt sind). Der Fachmann
wird verstehen, dass die Länge
der Promotorregion auch größer oder
kleiner sein kann als die dargestellten Sequenzen. Beispielsweise
könnte
eine zusätzliche
5'-Sequenz aus der
stromaufwärts
gelegenen Region des Hordein-Gens an die Promotorsequenz angefügt werden,
oder es können
Basen von den dargestellten Sequenzen entfernt werden. Jede Hordein-Promotorsequenz
muss jedoch in der Lage sein, die Transkription einer in funktionsfähiger Weise
damit verknüpften
Sequenz in Pflanzensamen zu steuern.
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Die
Fähigkeit
eines Hordein-Promotors der Gerste, die Transkription eines Proteins
in einem Pflanzensamen zu steuern, kann problemlos festgestellt
werden, indem man die Promotorsequenz in funktionsfähiger Weise
mit einem offenen Leserahmen (ORF) (der vorzugsweise für ein leicht
nachzuweisendes Protein kodiert), wie beispielsweise mit dem offenen
Leserahmen von GUS, verknüpft,
das resultierende Konstrukt in Pflanzen einbringt und die Expression
des Proteins in den Samen dieser Pflanze feststellt, wie im nachfolgenden
ausführlich
beschrieben wird. Ein Hordein-Promotor wird üblicherweise eine samenspezifische
Expression verleihen, was bedeutet, dass die Expression des Proteins,
welches von dem in funktionsfähiger
Weise verknüpften
ORF kodiert wird, in den Samen der stabil transfizierten Pflanze
in der Regel mindestens doppelt so hoch sein wird (Bestimmung auf
Basis der Aktivität)
wie in anderen Geweben, beispielsweise in Blättern. Üblicherweise wird der Hordein-Promotor
in den Samen eine Expression erzeugen, die mindestens fünfmal höher ist
als die Expression in anderen Geweben der Pflanze. In manchen Fällen wird
die Expression des Proteins in den Samen endospermspezifisch sein.
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Funktionelle
Homologe des Hordein-Promotors der Gerste, die vorliegend offenbart
werden, können aus
anderen Pflanzenarten gewonnen werden, wie beispielsweise aus Monokotylen
einschließlich
aus Weizen, Reis und Mais. Spezifische Beispiele für solche
Homologe können
einen spezifischen Grad an Sequenzidentität mit dem prototypischen Hordein-Promotoren
aufweisen (z.B. mindestens 60 % Sequenzidentität). Die funktionellen Homologe
behalten die Hordein-Promotorfunktion bei, d.h. sie behalten die
Fähigkeit
bei, eine samenspezifische Expression von in funktionsfähiger Weise
damit verknüpften
ORFs zu verleihen, wenn diese in Pflanzen eingebracht werden.
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Wenn
daher vorliegend Bezug auf einen Hordein-Promotor genommen wird,
sollte verstanden werden, dass ein solcher Bezug nicht nur Moleküle mit den
Sequenzen der vorliegend offenbarten prototypischen Sequenzen (oder
Variationen dieser Sequenzen) umfasst, sondern auch Promotoren von
Homologen des Hordein-Gens. Ebenfalls umfasst von diesen Begriffen
sind Moleküle,
die sich von den offenbarten prototypischen Molekülen durch
geringfügige
Abweichungen unterscheiden. Solche abweichenden Sequenzen können durch
Manipulation der Nukleotidsequenz des Hordein-Promotors unter Verwendung
von Standardverfahren, wie beispielsweise durch ortsspezifische
Mutagenese oder Polymerasekettenreaktion, erzeugt werden.
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Hordein-Signalsequenz
(SS):
-
Die
Erfinder haben erkannt, dass das Einschließen einer Hordein-Signalsequenz
in Verbindung mit einem Hordein-Promotor zu einer verstärkten Expression
bestimmter heterologer Proteine in Samen führt. Insbesondere die Expression
eines Proteins in unreifen Samen wird in hohem Maße verstärkt, wenn
der für
das Protein kodierende ORF in funktionsfähiger Weise sowohl mit einem
Hordein-Promotor als auch mit einer Hordein-Signalsequenz verknüpft ist, im Vergleich zu einem äquivalenten
Konstrukt, in dem die Hordein-Signalsequenz fehlt. Ohne sich auf
Spekulationen festlegen zu wollen wird vorgeschlagen, dass die Hordein-Signalsequenz
die Expression eines Proteins, das von einem in funktionsfähiger Weise
verknüpften
ORF kodiert wird, zu einer geschützten
subzellulären
Stelle leitet, wie beispielsweise zu einer Vakuole oder zu einem
Proteinkörper.
Es wird ferner vorgeschlagen, dass Proteine, die zu solchen Vakuolen
geleitet werden, während bestimmter
Stadien der Samenreifung vor einer Proteolyse geschützt sind.
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Die
Hordein-Signalsequenz umfasst üblicherweise
die ersten 15-25
Aminosäuren
des offenen Leserahmens von Hordein, in der Regel etwa 18-21 Aminosäuren.
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Die
Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz
der Hordein-Signalsequenzen
der prototypischen Hordein-Gene B1 und D
der Gerste sind in SEQ ID NOS: 1-4 gezeigt. Der Fachmann wird verstehen,
dass diese bestimmten Signalsequenzen zwar im Rahmen der nachfolgend
beschriebenen Beispiele verwendet werden, die Erfindung jedoch nicht
auf diese spezifischen Sequenzen beschränkt ist. Beispielsweise können homologe
Sequenzen ebenso wirksam verwendet werden, sowie auch Sequenzen,
die in bestimmten Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen abweichen, vorausgesetzt,
dass solche Sequenzen zu erhöhten
Mengen des kodierten Proteins in unreifen Samen führen. Üblicherweise
wird eine "verstärkte Expression" eine Expression sein,
die etwa dem zweifachen dessen entspricht, was mit einem äquivalenten
Konstrukt beobachtet wird, dem die Signalsequenz fehlt. Demgemäß umfasst
der Begriff "Hordein-Signalsequenz" nicht nur die bestimmten vorliegend
gezeigten Sequenzen sondern auch Homologe und Varianten dieser Sequenzen.
-
Sequenzidentität:
-
Die Ähnlichkeit
zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen
oder zwei Aminosäuresequenzen
wird durch die Ähnlichkeit
zwischen den Sequenzen ausgedrückt,
die auch als Sequenzidentität
bezeichnet wird. Die Sequenzidentität wird häufig als prozentuale Identität (oder Ähnlichkeit
oder Homologie) gemessen; je höher
der Prozentsatz, desto ähnlicher
sind die beiden Sequenzen. Homologe der prototypischen Hordein-Promotoren und
Hordein-Signalsequenzen
werden einen relativ hohen Grad an Sequenzidentität zeigen,
wenn diese unter Verwendung von Standardverfahren in einem Alignment
dargestellt werden.
-
Verfahren
für das
Alignment von Sequenzen für
einen Vergleich sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Verschiedene
Programme und Algorithmen für
ein Alignment sind beschrieben in: Smith and Waterman (1981); Needleman
und Wunsch (1970); Pearson und Lipman (1988); Higgins und Sharp
(1988); Higgins und Sharp (1989); Corpet et al. (1988); Huang et
al. (1992) und Pearson et al. (1994). Altschul et al. (1994) liefert
eine ausführliche
Erörterung
von Verfahren für
das Sequenzalignment und die Homologieberechnung.
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Das
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) des NCBI (Altschul et
al. 1990) ist von verschiedenen Quellen verfügbar, einschließlich vom
National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD)
sowie aus dem Internet, und kann mit den Sequenzanalyseprogrammen
blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx verwendet werden. Es
kann abgerufen werden unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Eine Beschreibung des Verfahrens, mit dem die Sequenzidentität unter
Verwendung dieses Programms bestimmt werden kann, ist verfügbar unter
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
-
Homologe
der offenbarten prototypischen Hordein-Signalsequenzen sind üblicherweise
durch den Besitz einer mindestens 60 %igen Sequenzidentität charakterisiert,
die über
die gesamte Länge
des Alignments mit der Aminosäuresequenz
des Prototypen unter Verwendung von NCBI Blast 2.0 gezählt wird,
wobei gapped blastp auf die vorgegebenen Parameter eingestellt wird.
Proteine mit einer noch größerer Ähnlichkeit
zu den Referenzsequenzen werden eine steigende prozentuale Identität zeigen,
wenn sie nach diesem Verfahren bestimmt werden, wie beispielsweise
mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 90
% oder mindestens 95 % Sequenzidentität. Homologe Hordein-Promotoren
umfassen solche von Genen, die für Proteine
kodieren, die einen äquivalenten
Grad an Sequenzidentität
mit den Hordein-Proteinen B1 und D aufweisen
(d.h. mindestens 60 und bis zu mindestens 95 %).
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Oligonukleotide:
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Eine
lineare Polynukleotidsequenz mit einer Länge von bis zu etwa 100 Nukleotidbasen.
-
Vektor:
-
Ein
Nukleinsäuremolekül, wie es
in eine Wirtszelle eingebracht wird, wodurch eine transformierte Wirtszelle
gebildet wird. Ein Vektor kann Nukleinsäuresequenzen umfassen, die
es ihm erlauben, sich in einer Wirtszelle zu replizieren, wie beispielsweise
einen Replikationsursprung. Ein Vektor kann ferner ein oder mehrere
selektierbare Markergene und andere im Stand der Technik bekannte
genetische Elemente umfassen.
-
Transformiert:
-
Eine
transformierte Zelle ist eine Zelle, in die durch molekularbiologische
Verfahren ein Nukleinsäuremolekül eingebracht
worden ist. Wie vorliegend verwendet umfasst der Begriff Transformation
alle Methoden, durch die ein Nukleinsäuremolekül in eine Zelle eingebracht
werden kann, einschließlich
die Transfektion mit viralen Vektoren, die Transformation mit Plasmidvektoren
sowie das Einbringen nackter DNA durch Elektroporation, Lipofektion
und Beschleunigung mittels einer Partikel-Gun, und er umfasst transiente
sowie auch stabile Transformanten.
-
Isoliert:
-
Ein "isolierter" biologischer Bestandteil
(wie beispielsweise eine Nukleinsäure oder ein Protein oder ein Organell),
der im Wesentlichen von anderen biologischen Bestandteilen der Zelle
des Organismus, in der der Bestandteil natürlicherweise vorkommt, d.h.
von anderer chromosomaler und extrachromosomaler DNA und RNA, Proteinen
und Organellen, getrennt oder gereinigt wurde. Nukleinsäuren und
Proteine, die "isoliert" worden sind, umfassen
Nukleinsäuren
und Proteine, die durch Standardreinigungsverfahren gereinigt worden sind.
Der Begriff umfasst ferner Nukleinsäuren und Proteine, die durch
rekombinante Expression in einer Wirtszelle hergestellt worden sind,
sowie chemisch synthetisierte Nukleinsäuren.
-
In
funktionsfähiger
Weise verknüpft:
Eine
erste Nukleinsäuresequenz
ist in funktionsfähiger
Weise mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz
verknüpft,
wenn die erste Nukleinsäuresequenz
in einem funktionalen Zusammenhang mit der zweiten Nukleinsäuresequenz
gebracht wird. Beispielsweise ist ein Promotor in funktionsfähiger Weise
mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor die
Transkription oder die Expression der kodierenden Sequenz bewirkt. Üblicherweise
sind in funktionsfähiger
Weise verknüpfte
DNA-Sequenzen zusammenhängend
und (sofern notwendig, um zwei für
Proteine kodierende Regionen zu verbinden) im selben Leserahmen.
-
Rekombinant:
-
Eine
rekombinante Nukleinsäure
ist eine solche, die eine Sequenz aufweist, die nicht natürlich vorkommt,
oder die eine Sequenz aufweist, die durch eine künstliche Kombination von zwei
ansonsten getrennten Sequenzsegmenten erzeugt wurde. Diese künstliche
Kombination wird oftmals durch chemische Synthese oder in den meisten
Fällen
durch künstliche
Manipulation von isolierten Nukleinsäuresegmenten erreicht, z.B. durch
gentechnische Verfahren.
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cDNA (komplementäre DNA):
-
Ein
Stück DNA,
dem interne, nicht-kodierende Segmente (Introns) und regulatorische
Sequenzen, die die Transkription bestimmen, fehlen. cDNA wird im
Labor durch reverse Transkription von Boten-RNA hergestellt, die
aus Zellen extrahiert wurden.
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ORF (offener Leserahmen):
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Eine
Folge von Nukleotidtriplets (Kodons), die für Aminosäuren ohne jegliches Terminationskodon
kodieren. Diese Sequenzen sind üblicherweise
in ein Peptid translatierbar.
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Transgene Pflanze:
-
Wie
vorliegend verwendet bezeichnet dieser Begriff eine Pflanze, die
rekombinantes genetisches Material enthält, welches normalerweise nicht
in Pflanzen dieser Art gefunden wird und welches durch menschliche
Manipulation in die besagte Pflanze (oder in Vorläufer dieser
Pflanze) eingebracht worden ist. Somit ist eine Pflanze, die ausgehend
von einer Pflanzenzelle angezüchtet
wird, in die rekombinante DNA durch Transformation eingebracht wurde,
eine transgene Pflanze sowie auch alle Nachfahren dieser Pflanze,
die das eingebrachte Transgen enthalten (entweder durch sexuelle
oder asexuelle Produktion erzeugt).
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Der
Begriff "transgene
Pflanze" umfasst
ferner Teile von Pflanzen, einschließlich Frucht, Samen und Pollen.
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Die
vorliegende Erfindung ist sowohl auf dikotyle Pflanzen (z.B., Tomate,
Kartoffel, Sojabohne, Baumwolle, Tabak, etc.) als auch auf monokotyle
Pflanzen anwendbar, einschließlich
(jedoch nicht beschränkt
auf) auf grasartige monokotyle Pflanzen, wie beispielsweise Weizen
(Triticum spp.), Reis (Oryza spp.), Gerste (Hordeum spp.), Hafer
(Avena spp.), Roggen (Secale spp.), Mais (Zea mays), Sorghum und
Hirse (Pennisettum spp.). Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise
mit Genotypen der Gerste verwendet werden, einschließlich (jedoch
nicht beschränkt
auf) Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena,
Salome, Steptoe, Klages, Baronesse; und mit Genotypen von Weizen,
einschließlich
(jedoch nicht beschränkt
auf) Yecora Rojo, Bobwhite, Karl und Anza. Die Erfindung ist im
Allgemeinen bei Getreiden besonders nützlich.
-
Samenreifung:
-
Samenreifung
oder Kornentwicklung bezieht sich auf einen Zeitraum, der mit der
Befruchtung beginnt, und in dem Nährstoffreserven (z.B. Proteine,
Lipide, Stärke
etc.) in dem sich entwickelnden Samen gespeichert werden, insbesondere
in Speicherorganen des Samens, einschließlich dem Endosperm, der Testa,
der Aleuronschicht, dem Embryo und dem Scutellumepithel, was zu
einer Vergrößerung und
Ausfüllung
des Samens führt,
und der mit der Trocknung des Samens endet.
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Induzierbar:
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Charakterisiert
durch einen Promotor, der in Gegenwart oder Abwesenheit eines kleinen
Moleküls hochreguliert
wird; umfasst ist sowohl eine direkte als auch eine indirekte Induktion.
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Für die Samenreifung spezifischer
Promotor:
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Ein
Promotor, der während
der Samenreifung induziert wird, beispielsweise ein solcher, der
um 25 % oder mehr während
der Samenreifung erhöht
ist.
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Signal-/Leader-/Ziel-/Transport-Sequenz:
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Eine
N-terminale oder C-terminale Polypeptidsequenz, die bewirkt, dass
das Polypeptid oder Protein, an das sie angeheftet ist, co-translational
oder post-translational zu einer ausgewählten intrazelluläre Vakuole oder
zu einem Proteinspeicherkörper,
einem Chloroplasten, zu Mitochondrien oder zum endoplasmatischen Retikulum
oder nach der Sekretion aus der Zelle zu einem extrazellulären Raum
oder einer extrazellulären
Region des Samens, wie beispielsweise dem Endosperm, gebracht wird.
Ein Beispiel in Gerste ist die Hordein-Signalsequenz, wobei jedoch
andere Beispiele folgendes umfassen: Signalsequenzen in Mais (Bagga
et al., Plant Cell 9:1683-1696, 1997, in der eine Co-Expression
des delta-Zein-Gens und des beta-Zein-Gens aus Mais zu einer stabilen
Anreicherung von delta-Zein in vom endoplasmatischen Retikulum abgeleiteten
Kör pern führt, die
aus beta-Zein gebildet werden; Torrent et al., Plant Molecular Biology,
34:139-149, 1997, in der sich Lysinreiche modifizierte gamma-Zeine
in Proteinkörpern
von transient transformierten Mais-Endospermien anreichern); in
Reis (Wu et al., Plant Journal 14:673-683, 1998, wobei das GCN4-Motiv
in transgenen Reispflanzen essentiell für die endospermspezifische
Genexpression ist und durch Opaque-2 aktiviert wird; Zheng et al., Plant
Physiology 109:777-786, 1995, in der beta-Phaseolin aus der Bohne
in transgenem Reis-Endosperm exprimiert wird, primär in den
vakuolären
Proteinkörpern
vom Typ-II nahe der Aleuron-Schicht); in Weizen (Grimwade et al.,
Plant Molecular Biology 30:1067-1073, 1996, in der die Expressionsmuster
von Genen beschrieben werden, die für Weizenglutenproteine kodieren);
in Tabak mit Legumin (Conrad et al., Journal of Plant Physiology
152:708-711, 1998, in der die Produktion von pharmazeutischen Proteinen
im großen
Maßstab
in transgenen Tabakpflanzen unter Verwendung zweier samenspezifischer
Vicia faba-Promotoren von Legumin B4 offenbart wird, so dass das
Produkt im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten wurde); und in Soja,
der unter Verwendung des Lektin-Gens bearbeitet wurde (Takaiwa et
al., Plant Science 111:39-49, 1995, in der Sojabohnenglycinin-Gene,
die transkriptional mit einem endospermspezifischen Promotor des
Gens für
das Speicherproteins Gluteilin aus Reis fusioniert waren, mittels
Agrobacteriumvermittelter Transformation in das Tabakgenom eingebracht
wurden, und spezifisch im Kotyledon und Embryo des reifenden Sojabohnensamens exprimiert
wurden).
-
Terminale Prozessierung
oder Terminationssequenz:
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Eine
DNA-Sequenz, die 3' von
der kodierenden Sequenz lokalisiert ist, und die RNA-Polymerase
dazu zwingt, die Transkription eines Gens abzubrechen und von der
DNA zu dissoziieren. Ein Beispiel ist der nos 3'-Terminator.
-
Ein
Terminator kann darüber
hinaus während
der posttranskriptionalen Prozessierung der mRNA in vivo auftreten,
um anzuzeigen, wo ein Vorläufer-mRNA-Molekül gespalten
werden soll, um eine reife mRNA-Spezies zu erhalten, die translatiert
wird. Ein Segment, das ein terminal prozessierendes Signal enthält, kann
durch Vergleich von cDNA erhalten werden, die ein Endosperm-exprimiertes
Produkt kodiert, welches für
dasselbe Produkt kodiert, wobei der 3'-Terminus der cDNA identifiziert wird.
Durch Isolierung eines genomischen DNA-Segments, das 50 bis 100
Basenpaare auf jeder Seite des 3'-Terminus
umfasst, kann man sicher sein, dass ein Segment mit dem terminalen
prozessierenden Signal erhalten wird.
-
Proteinkörper:
-
Intrazelluläre Struktur,
die Proteine innerhalb einer einheitlichen Membranstruktur enthält. In einigen Fällen wird
diese Struktur als Vakuole bezeichnet.
-
Samenspeicherprotein:
-
Ein
endogenes Pflanzenprotein, das synthetisiert und während der
Samenreifung angereichert wird, in dem getrockneten Korn gespeichert
wird und während
der Reifung mobilisiert wird. Solche Proteine werden oft in einem
Proteinkörper
in einem Pflanzensamen gespeichert. Beispiele für solche Speicherproteine umfassen
Arachin, Avenin, Cocosin, Conarchin, Concocosin, Conglutin, Conglycinin,
Convicin, Crambin, Cruciferin, Cucurbitin, Edestin, Excelsin, Gliadin,
Gluten, Glytenin, Glycinin, Helianthin, Hordein, Kafirin, Legumin,
Napin, Oryzin, Pennisetin, Phaseolin, Psophocarpin, Secalin, Vicilin,
Vicin und Zein.
-
II. Samenspezifische Expression
von Proteinen unter Verwendung von Hordein-Promotor/Hordein-Signalsequenz-Konstrukten
-
a. Konstrukte
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst rekombinante Konstrukte, die geeignet
sind, einen hohen Grad an Expression eines spezifischen Polypeptids
in Pflanzensamen zu erzielen. Die Konstrukte können allgemein als Ph-hSS-X
wiedergegeben werden, wobei Ph ein Hordein-Promotor ist, hSS eine
Hordein-Signalsequenz, und X ein Nukleinsäuremolekül ist, das für das spezifische
Polypeptid kodiert. Jeder dieser drei Bestandteile ist in funktionsfähiger Weise
mit dem nächsten
verknüpft,
d.h. der Hordein-Promotor
ist mit dem 5'-Ende
der für
die Hordein-Signalsequenz kodierenden Sequenz verknüpft, und
die Hordein-Signalsequenz ist in funktionsfähiger Weise mit der X-Sequenz
verknüpft.
Das Konstrukt wird darüber
hinaus üblicherweise
3'-regulatorische Sequenzen
umfassen, wie beispielsweise die Nos 3'-Region.
-
Die
Eigenschaften von Hordein-Promotoren und Signalsequenzen sind oben
beschrieben. Die B1- und D-Hordein-Gene
sind von Brandt et al. (1985) und Sorensen et al. (1996) beschrieben
worden. Wenn der Promotor Ph ist, kann das Polypeptid "X" jedes beliebige Polypeptid außer das
Hordein-Polypeptid sein, und in bestimmten Ausführungsformen handelt es sich
um kein Samenspeicherprotein oder um kein samenspezifisches Protein.
Die Polypeptide X, die wie vorliegend beschrieben in Pflanzensamen
als Teil von P-X-, P-SS-X-, Ph-X- oder Ph-SS-X-Konstrukten exprimiert werden können, umfassen
nicht samenspezifische Proteine, wie beispielsweise humane therapeutische
Proteine (z.B. Erythropoietin, Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase oder
Prourokinase, Wachstumshormone, Zytokine, Faktor VIII, Epoetin-α, Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor,
Antikörper,
Impfstoffe usw.) oder pflanzenspezifische Proteine, wie beispielsweise
Enzyme für
die Stärkebiosynthese (z.B.
ATP-Glucosepyrophosphorylase, EC 2.7.7.27; Stärkesynthase, EC 2.4.1.21; und
verzweigendes Enzym, R, Q) und samenspezifische Proteine, wie beispielsweise
diejenigen, die dem Samen einen erhöhten Nährwert verleihen. Nukleinsäuren, die
für solche
Proteine kodieren, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
Die kodierende Region für
ein solches Protein kann so modifiziert sein, dass es in höherem Maße der bevorzugten
Kodonverwendung einer bestimmten Wirtszelle entspricht.
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Andere
heterologe Proteine, die von chimären Genen kodiert werden, umfassen
Polypeptide, die immunologisch aktive Epitope bilden, und Enzyme,
die die Umwandlung von intrazellulären Metaboliten katalysieren,
wobei es zu einem konsequenten Aufbau der ausgewählten Metaboliten in der Zelle
kommt.
-
Die
Expressionskassette oder die chimären Gene in dem transformierenden
Vektor weisen üblicherweise
eine Transkriptions-Terminationsregion
am entgegengesetzten Ende zu der regulatorischen Region für die Transkriptionsinitiation
auf. Die Transkriptionsterminationsregion kann normal mit der Transkriptionsinitiationsregion
aus einem anderen Gen assoziiert sein. Die Transkriptionsterminationsregion
kann selektiert sein, insbesondere hinsichtlich der Stabilität der mRNA,
um die Expression zu verstärken.
Beispielhafte Transkriptionsterminationsregion umfassen den NOS-Terminator
aus dem Ti-Plasmid von Agrobakterium und den Terminator der α-Amylase
aus Reis.
-
Polyadenylierungs-Anhänge werden
ebenfalls üblicherweise
der Expressionskassette zugefügt,
um einen optimal hohen Transkriptionsgrad bzw. eine geeignete Transkriptionstermination
zu erhalten.
-
Molekularbiologische
Standardverfahren, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion
können verwendet
werden, um diese Konstrukte herzustellen.
-
b. Allgemeine Grundlagen
der Pflanzentransformation
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Das
Einbringen des Ph-hSS-X-Konstrukts in Pflanzen wird üblicherweise
durch Verwendung von Standardverfahren erreicht. Der grundlegende
Ansatz besteht darin, das Konstrukt in einen Transformationsvektor zu
klonieren, der anschließend
durch eines von mehreren Verfahren (z.B. Elektroporation) in die
Pflanzenzellen eingebracht wird, und Nachkommenpflanzen, die das
eingebrachte Konstrukt enthalten, zu selektieren. Vorzugsweise wird
der gesamte oder ein Teil des Transformationsvektors stabil in das
Genom der Pflanzenzelle integrieren. Der Teil des Transformationsvektors,
der in die Pflanzenzelle integriert, und der die eingebrachte Ph-hSS-X-Sequenz
(das eingebrachte "Transgen") enthält, kann
als die rekombinante Expressionskassette bezeichnet werden.
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Die
Selektion von Nachkommenpflanzen, die das eingebrachte Transgen
enthalten, kann auf Basis des Nachweises der Expression von Protein
X oder anhand von Samen oder anhand einer erhöhten Resistenz gegen ein chemisches
Mittel (wie beispielsweise ein Antibiotikum) als Ergebnis des Einschlusses
eines dominanten, selektierbaren Marker-Gens erfolgen, das in den
Transformationsvektor eingebracht wurde.
-
Erfolgreiche
Beispiele für
die Modifikation von Pflanzeneigenschaften durch Transformation
mit klonierten Nukleinsäuresequenzen
sind in der technischen und wissenschaftlichen Literatur vielfältig vorhanden. Ausgewählte Beispiele,
die dazu dienen, das Wissen auf diesem Stand der Technologie zu
veranschaulichen, umfassen:
- US-Patent Nr. 5,571,706 ("Plant Virus Resistance
Gene and Methods")
- US-Patent Nr. 5,677,175 ("Plant
Pathogen Induced Proteins")
- US-Patent Nr. 5,510,471 ("Chimeric
Gene for the Transformation of Plants")
- US-Patent Nr. 5,750,386 ("Pathogen-Resistant
Transgenic Plants")
- US-Patent Nr. 5,597,945 ("Plants
Genetically Enhanced for Disease Resistance")
- US-Patent Nr. 5,589,615 ("Process
for the Production of Transgenic Plants with Increased Nutritional
Value Via the Expression of Modified 2S Storage Albumins")
- US-Patent Nr. 5,750,871 ("Transformation
and Foreign Gene Expression in Brassica Species")
- US-Patent Nr. 5,268,526 ("Overexpression
of Phytochrome in Transgenic Plants")
- US-Patent Nr. 5,780,708 ("Fertile
Transgenic Corn Plants")
- US-Patent Nr. 5,538,880 ("Method
For Preparing Fertile Transgenic Corn Plants")
- US-Patent Nr. 5,773,269 ("Fertile
Transgenic Oat Plants")
- US-Patent Nr. 5,736,369 ("Method
for Producing Transgenic Cereal Plants")
- US-Patent Nr.5,610,042 ("Methods
For Stable Transformation of Wheat").
-
Die
Beispiele umfassen die Beschreibung der Auswahl eines Transformationsvektors,
von Transformationsverfahren und von der Konstruktion von Konstrukten,
die erstellt werden, um ein eingebrachtes Transgen zu exprimieren.
Im Hinblick auf das oben gesagte und die vorliegende Bereitstellung
des Ph-hSS-X-Konstrukts
ist es ersichtlich, dass der Fachmann in der Lage sein wird, diese
Konstrukte in Pflanzen einzubringen, um Pflanzen herzustellen, die
das gewünschte
Protein (X) in ihren Samen exprimieren.
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c. Pflanzentypen
-
Die
Ph-hSS-X-Konstrukte der vorliegenden Erfindung können in nützlicher Weise in einer großen Vielzahl
von höheren
Pflanzen exprimiert werden, um eine samenspezifische Expression
ausgewählter
Polypeptide zu erreichen. Es wird erwartet, dass die Erfindung insbesondere
bei monokotylen Getreidepflanzen anwendbar sein wird, einschließlich bei
Gerste, Weizen, Reis, Roggen, Mais, Tricalat, Hirse, Sorghum, sowie
bei Futterhafer und Rasengräsern.
Die vorliegend beschriebenen Transformationsverfahren werden es
insbesondere ermöglichen,
dass die Erfindung mit Genotypen der Gerste, einschließlich Morex,
Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Golden Promise,
Steptoe, Klages und Baronesse, sowie mit kommerziell wichtigen Genotypen
des Weizens, einschließlich
Yecora Rojo, Bobwhite, Karl und Anza, verwendet werden kann.
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Die
Erfindung kann ferner bei dikotylen Pflanzen angewendet werden,
einschließlich
(jedoch nicht beschränkt
auf) Sojabohne, Baumwolle, Bohnen, Raps/Canola, Alfalfa, Flachs,
Sonnenblume, Distel, Brassica, Baumwolle, Flachs, Erdnuss, Klee;
bei Gemüse
wie Salat, Tomate, Kürbisse,
Cassava, Kartoffel, Karotte, Rettich, Erbse, Linsen, Kohl, Blumenkohl,
Brokkoli, Rosenkohl, Pfeffer; und bei Baumfrüchten wie beispielsweise Zitrusfrüchte, Äpfel, Birnen,
Pfirsiche, Aprikosen und Walnüsse.
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d. Vektorkonstruktion
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Mehrere
rekombinante Vektoren, die für
die stabile Transfektion von Pflanzenzellen oder für die Etablierung
von transgenen Pflanzen geeignet sind, sind beschrieben worden,
einschließlich
diejenigen, die in Pouwels et al., (1987), Weissbach und Weissbach
(1989) und Gelvin et al. (1990) beschrieben worden sind.
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Üblicherweise
umfassen Pflanzentransformationsvektoren einen oder mehrere ORFs
unter der Transkriptionskontrolle von 5'- und
3'-regulatorischen
Sequenzen sowie einen dominanten, selektierbaren Marker. Die Auswahl
geeigneter 5'- und
3'-regulatorischer
Sequenzen für
die Konstrukte der vorliegenden Erfindung ist oben diskutiert worden.
Dominante selektierbare Markergene, welche die einfache Selektion
von Transformanten erlauben, umfassen diejenigen, die für antibiotische
Resistenzgene kodieren (z.B. eine Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin,
Bleomycin, G418, Streptomycin oder Spektinomycin) sowie für Herbizidresistenzgene
(z.B. Phosphinothricin-Acetyltransferase).
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e. Transformations- und
Regenerierungsverfahren
-
Verfahren
für die
Transformation und Regenerierung sowohl von monokotylen als auch
von dikotylen Pflanzenzellen sind bekannt, und das geeignete Transformationsverfahren
wird vom Anwender bestimmt werden. Die Wahl des Verfahrens wird
mit dem Pflanzentyp variieren, der transformiert werden soll; der
Fachmann wird die Eignung bestimmter Verfahren für bestimmte Pflanzentypen erkennen.
Geeignete Verfahren können umfassen
(sind jedoch nicht beschränkt
auf): Elektroporation von Pflanzen-Protoplasten; Liposomen-vermittelte
Transformation; Polyethylenglykol (PEG)-vermittelte Transformation;
Transformation unter Verwendung von Viren, Mikroinjektion von Pflanzenzellen;
Mikroprojektil-Bombardement von Pflanzenzellen; Vakuuminfiltration sowie
eine durch Agrobacterium tumefaciens (AT)- vermittelte Transformation. Typische
Verfahren zur Transformation und Regenerierung von Pflanzen werden
in den Patentdokumenten beschrieben, die zu Beginn dieses Abschnitts
aufgeführt
sind.
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f. Selektion von transformierten
Pflanzen
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Nach
der Transformation und Regenerierung von Pflanzen mit dem Transformationsvektor
werden die transformierten Pflanzen üblicherweise unter Verwendung
eines dominanten, selektierbaren Markers, der in den Transformationsvektor
eingebaut ist, selektiert. Üblicherweise
wird ein solcher Marker den Keimlingen der transformierten Pflanzen
eine Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, und die Selektion
von Transformanien kann erreicht werden, indem die Keimlinge geeigneten
Konzentrationen des Antibiotikums ausgesetzt werden.
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Nachdem
transformierte Pflanzen selektiert und bis zur Reife angezüchtet worden
sind, um die Samenanlage zu ermöglichen,
können
die Samen geerntet und in Bezug auf die Expression des exprimierten "X"-Polypeptids untersucht werden.
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III. Verwendung von im
Samen exprimierten Polypeptiden
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Die
wie oben beschrieben transformierten Zellen werden zur Regenerierung
von Pflanzen verwendet, und Samen aus diesen Pflanzen wird die Reifung
erlaubt, die üblicherweise
auf einem Feld stattfindet, wobei konsequent das heterologe Protein
in den Samen hergestellt wird.
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Die
unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren in Samen
exprimierten Polypeptide können
zu einem beliebigen Zeitpunkt nach Beginn der Expression aus den
Samen geerntet werden. Dies bedeutet, dass es für die Samen nicht notwendig
ist, dass diese vor der Ernte eine Reifung durchlaufen haben. Die
exprimierten Proteine können
(sofern dies gewünscht
ist) durch herkömmliche
Verfahren der Proteinaufreinigung aus den Samen isoliert werden.
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Beispielsweise
können
die Samen gemahlen und anschließend
mit einem wässrigen
oder organischen Extraktionsmedium extrahiert werden, gefolgt von
einer Aufreinigung des extrahierten Fremdproteins. Abhängig von
der Art des exprimierten Proteins und der beabsichtigten Verwendung
können
die Samen auch direkt ohne Aufreinigung des exprimierten Proteins
verwendet werden.
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Es
gibt Unterschiede hinsichtlich der Anreicherungsmuster bei verschiedenen
Polypeptiden oder Fraktionen innerhalb des Samens. Es wurde beispielsweise
herausgefunden, dass die GUS-Expression
mit der transgenen Zelllinie GPDhGN-6-9-6 ein Maximum bei etwa 20
Tagen aufweist, während
die GUS-Expression in der Zelllinie GPBhGN-4-34-7-1-2 an den Tagen
10-14 einen höheren
Wert aufweist als nach 20 Tagen. Diese differentiellen Expressionsmuster
können
verfolgt werden, und die Peptide können zum erwarteten Expressionsmaximum
extrahiert werden.
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Wenn
das Protein zu einem ausgewählten
intrazellulären
Körper
gebracht worden ist, wie beispielsweise zu einer Proteinlagerungsvakuole,
einem Plastid oder einem Mitochondrium, kann der intrazelluläre Körper zunächst aus
einem Zellhomogenisat des Samens extrahiert und anschließend weiter
fraktioniert werden, um das gewünschte
Protein in angereicherter oder aufgereinigter Form zu erhalten.
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IV. Alternative Expressionssysteme
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Die
in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Expressionssysteme
basieren auf dem System aus Hordein-Promotor/Signalsequenz der Gerste. Dem
Fachmann wird jedoch verständlich
sein, dass die Erfindung nicht auf dieses spezielle System beschränkt ist.
-
Somit
können
in anderen Ausführungsformen
andere Promotoren und andere Signalsequenzen verwendet werden, um
Polypeptide in den Samen von Pflanzen, insbesondere in Getreide,
zu exprimieren.
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Konstrukte,
die solche Sequenzen verwenden, können dargestellt sein als:
P-X
oder P-SS-X, wobei X das zu exprimierende Polypeptid ist (welches
ein nicht pflanzliches oder ein nicht samenspezifisches oder ein
nicht pflanzliches Speicherprotein sein kann), P ein für die Samenreifung
spezifischer Promotor ist, SS eine Signalsequenz ist, wie beispielsweise
eine Sequenz, die ein damit verknüpftes Polypeptid gezielt zu
einem intrazellulären
Körper
leitet, wie beispielsweise zu einem Proteinkörper, in dem das Protein gespeichert
wird.
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Der
Promotor P kann ein samenspezifischer Promotor sein (umfassend,
jedoch nicht beschränkt
auf, einen endospermspezifischen oder einen embryospezifischen Promotor).
Ein Promotor ist samenspezifisch, wenn seine Expression in einem
Samen einer Pflanze mindestens 10-fach höher ist als in den Blättern oder
in den Wurzeln der Pflanze, wenn der Promotor während der Samenreifung am stärksten exprimiert
wird, und er wird als endospermspezifisch angesehen, wenn seine
Expression im Endosperm mindestens 5-fach höher ist als in anderen Geweben
eines Samens, wenn der Promotor am stärksten während der Samenreifung exprimiert
wird. Jedes hinreichend bekannte samenspezifische Transkriptions-Kontrollelement
oder jeder hinreichend bekannte samenspezifische Promotor kann zusätzlich zu
den Hordein-Promotoren der Gerste verwendet werden, einschließlich (jedoch
nicht beschränkt
auf) Promotoren von einem beliebigen Gen, das für ein Speicherprotein kodiert,
wie beispielsweise die hinreichend bekannten Promotoren von Genen,
die für
folgendes kodieren:
z.B. ein Reisglutelin, Reisoryzin oder
Reisprolamin; ein Weizengliadin oder Weizenglutenin; ein Maiszein
oder Maisglutelin; ein Haferglutelin; ein Sorghumkaferin; ein Hirsepennisetin
oder ein Roggensekalin.
-
Um
die Mengen eines exprimierten Polypeptids zu erhöhen, ist es vorteilhaft, dass
sich das Protein an einer subzellulären Stelle anreichert, an der
das Polypeptid vor einer Proteolyse geschützt ist (d.h. der proteolytische
Abbau des Polypeptids wird um mindestens 10 % verringert, üblicherweise
um mindestens 25 %, wobei eine Verringerung um mindestens 50 % noch üblicher
ist). Es wird daher bevorzugt, das Polypeptid als Fusionspolypeptid
zu exprimieren, das im selben Leserahmen die kodierende Sequenz
für das
Polypeptid und die kodierende Sequenz für ein Peptid (vorliegend in
austauschbarer Weise als Signal-, Leader-, Transport- oder Targeting-Sequenz
oder Peptid bezeichnet) umfasst, welche dazu führt, dass das Fusionsprotein co-translational
oder post-translational zu einem subzellulären Kompartiment geleitet wird
oder aus der Zelle ausgeschieden wird. Vorzugsweise führt das
Signalpeptid dazu, dass das Fusionsprotein zu einem geschützten subzellulären Kompartiment
geleitet wird, wie beispielsweise zu einer Vakuole. Ein Signalpeptid,
welches dazu führt,
dass sich ein Protein in einer Vakuole anreichert, kann beispielsweise
als vakuoläres
Targeting-Peptid bezeichnet werden. Das Signalpeptid ist vorzugsweise
am 5'- oder am 3'-Ende des Fusionsproteins lokalisiert.
Jedes beliebige hinreichend bekannte Leader- oder Signalpeptid,
das zu einer co-translationalen oder post-translationalen Lokalisierung
eines exprimierten Polypeptids in einem solchen geschützten subzellulären Kompartiment
führt,
kann zusätzlich
zu den Hordein-Signalpeptiden aus der Gerste verwendet werden.
-
Weitere
Signalpeptide und Leader dieser Art umfassen (sind jedoch nicht
beschränkt
auf) Signalpeptide aus samenspezifischen Genen einer monokotylen
Pflanze, wie beispielsweise: ein Glutelin (z.B. aus Reis, Weizen,
Mais, Hafer, usw.), Prolamin, Hordein, Gliadin, Glutenin, Zein,
Albumin, Globulin, ATP-Glucosepyrophosphorylase,
Stärkesynthase,
verzweigendes Enzym, Ein und lea. Eine andere beispielhafte Klasse
von Signalsequenzen sind Sequenzen, die in wirksamer Weise die Sekretion
von Polypeptiden von Aleuronzellen während der Samenkeimung fördern, einschließlich der
Signalsequenzen, die mit der α-Amylase,
Protease, carboxypeptidase, Endoprotease, Ribonuklease, Dnase/Rnase,
(1-3)-β-Glucanase,
(1-3)(1-4)-β-Glucanase, Esterase,
Säurephosphatase,
Pentosamin, Endoxylanase, β-Xylopyranosidase,
Arabinofuranosidase, α-Glucosidase,
(1-6)-α-Glucanase,
Peroxidase und Lysophosopholipase assoziiert sind.
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Die
Signalpeptide können
durch zelluläre
Enzyme co-translational oder post-translational abgespalten werden.
Wenn das Signalpeptid nicht abgespalten wird, kann alternativ dazu
das Fusionspolypeptid nach der Reinigung des Fusionspolypeptids
abgespalten werden, sofern dies gewünscht ist. Zu diesem Zweck
kann eine Aminosäuresequenz
zwischen dem Signalpeptid und dem heterologen Protein eingebracht
werden, um die enzymatische oder chemische Spaltung zur Entfernung
des Signalpeptids zu ermöglichen.
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Die
folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Erzeugung
von Ph-hSS-X-Konstrukten
-
Die
Polymerasekettenreaktion wurde verwendet, um Konstrukte für die Einbringung
in Pflanzen herzustellen. Die verwendeten Verfahren waren Abwandlungen
von den Verfahren, die von Higuchi et al. (1990), Horton et al.
(1990), Pont-Kingdon et al. (1994) und Lefebvre et al. (1995) beschrieben
wurden. Die Verfahren wurden verwendet, um ein Ph-hSS-X-Konstrukt
herzustellen, in dem Ph der endospermspezifische B1-Hordein-Prmotor
aus der Gerste war, hSS die B1-Hordein-Signalsequenz
aus der Gerste war, und X der ORF für die β-Glucuronidase (uidA; gus) aus
Escherichia coli war. Das Konstrukt umfasste ferner den 3'-Terminator der Nopalinsynthase
(nos). Zwei PCR-Konstruktionsverfahren wurden verwendet: ein Verfahren
mit 4 Primern, das in 1A dargestellt
ist, sowie ein Verfahren mit 3 Primern, das in 1B dargestellt
ist.
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Alle
PCR-Reaktionen wurden mit einem Thermocycler (MJ Research Inc.)
unter Verwendung rekombinanter Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) in
einem 100 μl-Reaktionsvolumen
durchgeführt.
Der Reaktionspuffer enthielt 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM KCl,
6 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgCl2, 0,1
% Triton X-100, 10 μg/ml
nukleasefreies BSA und 50 μM
eines jeden Desoxyribonukleosidtriphosphats. Die PCR-Bedingungen waren
25 Zyklen bei 94 °C
für 1 Minute,
55 °C für 1 Minute
und 72 °C
für 2 Minuten,
mit einem abschließenden Extensionsschritt
bei 72 °C
für 7 Minuten.
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Die
rekombinanten PCR-Strategien sind in 1 gezeigt.
Die zwei überlappenden
Primer waren:
5'-GCGGCAACAAGTACATTGCATTACGTCCTGTAGAAACCCCA-3' (BC-Primer) (SEQ
ID NO: 5) und
5'-TGGGGTTTCTACAGGACGTAATGCAATCGTACTTGTTGCCGC-3' (cb-Primer) SEQ
ID NO: 6); die Sequenz des cb-Primers ist die umgekehrte komplementäre Sequenz
des BC-Primers. Diese Primer enthalten einen Teil der für uidA kodierenden
Sequenz und einen Teil der für
das Signalpeptid kodierenden Sequenz aus dem B1-Hordein-Promotor. Die beiden
externen Primer waren:
5'-GTAAAGCTTTAACAACCCACACATTG-3' (A-Primer) (SEQ
ID NO: 7 und
5'-CGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACA-3' (d-Primer) (SEQ
ID NO: 8), wobei diese jeweils eine einzelne Restriktionsschnittstelle
(unterstrichen) enthielten, nämlich
HindIII bzw. EcoRI.
-
Bhorss
(B1-Hordein-Promotor, der die Signalsequenz
enthält)- und uidAnos (für uidA kodierende
Sequenz plus nos 3'-Terminator)-Fragmente
wurden unter Verwendung der nachfolgenden PCR-Bedingungen erhalten.
(I) Bei Bhorss wurden 20 ng Matrize (ein das 2-4/HindIII-Plasmid
enthaltender genomischer Klon von B1-Hordein;
Brandt et al., 1985) und 40 pmol der Primer A und cb in 100 μl 1 × PCR-Puffer
(Stratagene) gemischt. (II) Bei uidAnos wurden 20 ng Matrize (das
Plasmid pDMC201.4, das uidA und nos ohne Promotor enthält (McElroy
et al., 1995); das uidA-Gen wurde von dem pGUSN358->S-Plasmid erhalten,
das durch ortsspezifische Mutagenese für Untersuchungen zum Vakuolen-Targeting
verändert
worden war (Farrell et al., 1990)) und 40 pmol der Primer BC und
d in 100 μl
1 × PCR-Puffer
gemischt. Nach Zugabe von 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase wurden
die Reaktionsmischungen mit 50 μl
Mineralöl überschichtet.
-
In
der Strategie mit 4 Primern waren die beiden Hauptprodukte der PCR
in der ersten Reaktion 0,49 kb für
Bhorss und 2,07 kb für
uidAnos. Ein Aliquot der ersten beiden Gruppen von PCR-Reaktionen wurde
50 mal ohne Gelaufreinigung verdünnt,
und 5 μl
des verdünnten
Produktes wurden direkt als Matrize für die zweite PCR-Reaktion verwendet.
40 pmol externe Primer (A- und
d-Primer) sowie 2,5 Einheiten Pfu-DNA-Polymerase wurden zu 100 μl 1 × PCR-Puffer
gegeben.
-
Bei
der Strategie mit 3 Primern wurde ein kürzeres Bhorss-Fragment von 0,49
kb durch PCR in der ersten Reaktion erzeugt, und dieses erste PCR-Produkt
(Megaprimer genannt) wurde 50 mal verdünnt. Bei der zweiten PCR-Reaktion
wurden 5 μl
des verdünnten
Bhorss-Megaprimers (Bhorss), 20 ng Matrize (pDMC201.4) und 40 pmol
externe Primer (A und d) in einem Endvolumen von 100 μl in 1 × PCR-Puffer
gemischt.
-
Die
zweite Gruppe von PCR-Reaktionen, die sowohl die modifizierte Strategie
mit 3 als auch die mit 4 Primern verwendete, erzeugte ein Fragment
von 2,56 kb, das die DNA-Fragmente Bhorss und uidAnos enthielt (1C). Im Verhältnis zu der Strategie mit
4 Primern wurde bei Verwendung der Strategie mit 3 Primern eine geringere
Menge des chimären
Produkts erzeugt. Eine dritte PCR-Reaktion wurde ausgeführt, um
ausreichende Mengen des chimären
Produkts für
ein Mikroprojektil-Bombardement
zu erhalten. Das PCR-Produkt aus der Strategie mit 3 Primern wurde
50-fach verdünnt;
5 μl von
diesem verdünnten
Produkt wurden als Matrize zu 40 pmol A/d-Primern in 100 μl 1 × PCR-Puffer
gegeben. Die finalen chimären
Produkte, die in einem Endvolumen von 2 × 100 μl (2 Reaktionen) mittels der
Strategie mit 3 Primern sowie aus der mit 4 Primern amplifiziert
worden waren, wurden aus einem 0,7 % Agarosegel unter Verwendung
des QIAquick-Gelextraktions-Kits (Qiagen Inc.) gereinigt. Die gereinigten
DNA-Fragmente wurden in 50 μl
1 × TE-Puffer eluiert, durch Restriktionsenzymverdau
analysiert und in Mikroprojektil-Bombardement-Experimenten ohne
weitere Subklonierung verwendet, um die Strategien bezüglich der
DNA-Konstruktion
zu untersuchen.
-
Beispiel 2: Transiente
Assays in Zellen der Gerste
-
Vor
dem Mikroprojektil-Bombardement wurden Gersteähren (Frühjahrssorte Golden Promise),
die unreife Embryonen (15-25 Tage nach der Bestäubung) enthielten, für 10 bis
15 Minuten in 20 (v/v) Bleichmittel (5,25 % Natriumhypochlorit)
sterilisiert, und kurz 3 × 5
Minuten mit sterilem Wasser gewaschen. Das Endosperm wurde aseptisch
von jedem Embryo manuell abgetrennt und mit der gefurchten Seite
nach unten auf MS (Murashige und Skoog)-Basalmedium (8) gelegt,
das mit 30 mg/l Maltose, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,25 mg/l Myo-Inositol,
1,0 g/l Caseinhydrolysat, 0,69 mg/l Prolin supplementiert und mit
3,5 g/l Phytagel (Sigma) verfestigt war. Das DNA-Bombardement wurde
unter Verwendung von 1 μm
Goldpartikeln (Analytical Scientific, Inc.) durchgeführt, die
mit 12,5 μl
der eluierten DNA-Fragmente
(ungefähr
1 bis 2 μg)
beschichtet waren, wobei die folgenden Modifikationen eines veröffentlichten
Verfahrens (Lemaux et al., 1996) verwendet wurden. Goldpartikel
und andere Bestandteile, die für
die Präzipitation
notwendig waren, wurden auf die Hälfte ihres Volumens verringert.
Das DNA/Mikroprojektilpräzipitat
wurde in 36 μl
reinem Ethanol resuspendiert; 15 μl
der Suspension wurden pro Bombardement in einer Biolistic PDS-1000/He-Vorrichtung
(Bio-Rad) bei 1100 psi verwendet. Das beschossene Endosperm wurde
bei 24 ± 1 °C im Dunkeln
für einen
Tag inkubiert und im Hinblick auf die GUS-Aktivität gefärbt (Jefferson et al., 1987).
Die Ergebnisse (nicht gezeigt) zeigten eine Expression von GUS im
Endospermgewebe und stimmen mit der Tatsache überein, dass sich das chimäre DNA-Konstrukt,
welches durch die oben beschriebenen PCR-Reaktionen hergestellt
worden war, im Leserahmen befindet, wodurch die Erzeugung eines
funktionellen uidA-Genprodukts ermöglicht wird.
-
Nach
der Bestätigung
der Funktionalität
in vivo wurde das chimäre
Produkt in einen Vektor subkloniert, durch DNA-Sequenzierung bestätigt und für die stabile Transformation
von Gerste zur Untersuchung des Proteintargetings verwendet.
-
Beispiel 3: Stabile Expression
von Ph-X-Konstrukten in Gerste Material und Methoden
-
Pflanzen
-
Die
zweizeilige Frühjahrsgerstensorte
Golden Promise wurde wie zuvor beschrieben in Wachstumskammern angezüchtet (Wan
und Lemaux, 1994; Lemaux et al. 1996).
-
Nukleinsäuren
-
Das
Plasmid p16 (Sorensen et al. 1996) enthält ein pUC18-Rückgrat mit dem Gen für die β-Glucuronidase
(uidA; gus), das von 550 bp des endospermspezifischen B1-Hordein-Promotors
aus Gerste kontrolliert und von dem 3'-Polyadenylierungssignal nos der Nopalinsynthase
aus Agrobacterium tumefaciens terminiert wird. Das Plasmid pD11-Hor3
(Sorensen et al. 1996) enthält
uidA, das von 434 bp des D-Hordein-Promotors kontrolliert wird,
sowie einen nos-Terminator. pAHC20 (Christensen und Quail 1996)
enthält
bar, das von dem Ubiquitin-Promotor und dem ersten Intron aus Mais
gesteuert und von dem nos 3'-Ende
terminiert wird. Beide Konstrukte umfassen Hordein-Promotoren, jedoch
keine Hordein-Signalsequenz. Daher entsprechen sie Konstrukten des
Typs: Ph-X. pAHC25 (Christensen und Quail 1996) besteht aus uidA
und bar, wobei jedes unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors
(Ubi1) und des ersten Introns aus Mais stehen und von nos terminiert werden.
-
Transformationsverfahren
-
Stabile
transgene Zelllinien von Gerste, die B1-Hordein-uidA
und D-Hordein-uidA enthielten, wurden nach Modifikationen des veröffentlichten
Protokolls (Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al. 1996) erhalten.
Die Modifikationen waren für
die Transformation von kommerziellen Genotypen der Gerste erforderlich.
Das vorliegend beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um
kommerzielle Genotypen von monokotylen Pflanzen, einschließlich Gerste
und Weizen, zu transformieren, die sich der Transformation unter
Verwendung veröffentlichter
Verfahren widersetzen (beispielsweise die Genotypen der Gerste Harrington,
Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe,
Klages und Baronesse sowie die Genotypen des Weizens Anza, Karl,
Bobwhite und Yecora Rojo).
-
Die
Donor-Gerstenpflanzen wurden zur Gewinnung der unreifen Embryonen
wie beschrieben unter kontrollierten Bedingungen in Wachstumskammern
auf Erde angezüchtet
(Wan und Lemaux, 1994; Lemaux et al. 1996). Unreife zygotische Embryonen
wurden oberflächensterilisiert,
mit der Scutellumseite nach unten auf DBC2-Medium aufgebracht und
bei 24 ± 1 °C inkubiert.
Regenerative Gewebe wurden für
3 bis 4 Wochen beibehalten, anschließend in kleine Stücke geschnitten
(etwa 3 bis 5 mm), auf frisches DBC2-Medium überführt und unter abgeblendeten
Lichtbedingungen angezüchtet.
Nach weiteren 3 Wochen wurden grüne
Kallusbereiche in Stücke
gebrochen (etwa 3 bis 5 mm) und auf frisches DBC2-Medium überführt. Grüne regenerative Gewebe
wurden auf DBC2-Medium gehalten, wobei in Intervallen von 3 bis
4 Wochen Subkultivierungen erfolgten.
-
Für das Bombardement
wurden grüne
regenerative Gewebe (etwa 3 bis 5 mm, 4 Monate alt) für 1 Tag im
Dunkeln bei 24 ± 1 °C gehalten,
anschließend
auf DBC2-Medium überführt, das
0,2 M Mannitol und 0,2 M Sorbitol enthielt.
-
4
Stunden nach Behandlung mit dem Osmotikum wurden grüne Gewebe
wie von Lemaux et al. (1996) beschrieben mit Goldpartikeln (Analytical
Scientific Instruments, Alameda, CA) beschossen, die mit pAHC25, mit
einer Mischung aus pAHC20 und p16 (molares Verhältnis 1 : 2) oder mit einer
Mischung von pAHC20 und pD11-Hor3 (molares Verhältnis 1 : 2) beschichtet waren.
16 bis 18 Stunden nach dem Bombardement wurden grüne Gewebe
auf DBC2-Medium ohne Osmotikum überführt und
bei 24 ± 1 °C unter abgeblendeten
Lichtverhältnissen
angezüchtet
(etwa 10 μE,
16 h Licht).
-
Nach
einer anfänglichen
Kultivierung für
3 bis 4 Wochen auf nicht selektivem Medium wurde jedes Stück des grünen Gewebes
in 1 bis 2 Stücke
gebrochen (etwa 4 bis 5 mm, abhängig
von der Größe des ursprünglichen
Gewebestücks)
und für
die bar-Selektion
auf DBC2-Medium überführt, das
mit 5 mg/l Bialaphos supplementiert war. Die grünen Gewebe wurden auf DBC2-Medium
selektiert, und Gewebe von 4 mm bis 5 mm wurden in Intervallen von
3 bis 4 Wochen subkultiviert. Bialaphos-resistente Kalli wurden
auf FHG-Medium (Hunter 1988) regeneriert, das 1 mg/l 6-Benzylaminopurin
(BAP) und 3 mg/l Bialaphos enthielt. Regenerierte Sprößlinge wurden
in Magenta-Boxen überführt, die
Wurzelmedium (rooting medium) (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone)
enthielten, welches 3 mg/l Bialaphos enthielt. Wenn die Keimlinge
den Deckel der Box erreichten, wurden die Pflänzchen auf Erde überführt und
bis zur Reife in einem Gewächshaus
angezüchtet.
-
Das
DBC2-Medium, das für
die Transformation verwendet wurde, basiert auf MS-Medium (Murashige und
Skoog, 1962), das mit 30 g/l Maltose, 1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,25
g/l myo-Inisitol, 1,0 g/l Caseinhydrolysat und 0,69 g/l Prolin supplementiert
ist und mit 3,5 g/l Phytagel (Sigma, St. Louis, MO) verfestigt wird.
-
Das
Medium war darüber
hinaus mit 2,5 mg/l des Pflanzenauxins 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D),
0,1 mg/l des Pflanzenzytokinins 6-Benzylaminopurin (BAP) und 5 μM Kupfer
(als Kupfersulfat) supplementiert. Die Gegenwart einer erhöhten Menge
Kupfer sowie ein Verhältnis
von viel Auxin/wenig Zytokinin hat sich als notwendig für die wirksame
Erzeugung des grünen
regenerativen Materials aus Phänotypen
der Gerste und des Weizens herausgestellt, die sich ansonsten der
Transformation widersetzen. Die Zusammensetzung des DBC2-Mediums
kann jedoch in Abhängigkeit
von dem jeweiligen zu transformierenden Genotyp verändert werden.
Die Hauptbestandteile des Mediums werden sich im Rahmen der folgenden
Bereiche bewegen: ein Auxin in einer Konzentration von etwa 0,1
mg/l bis etwa 5 mg/l, ein Zytokinin in einer Konzentration von 0
mg/l bis etwa 5 mg/l und Kupfer in einer Konzentration von etwa
0,1 μM bis
etwa 50 μM
(wobei etwa 1 bis 10 μM üblicher
sind). Eine effizientere Transformation kann erreicht werden, wenn
als Kohlenstoffquelle im Medium Maltose in einer Konzentration von
bis zu etwa 60 g/l verwendet wird, üblicherweise etwa 30 g/l (entweder
anstelle der Sucrose oder in Kombination mit Sucrose).
-
Es
wurde eine histochemische Färbung
im Hinblick auf GUS durchgeführt
(Jefferson et al. 1987), wobei 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc) (Gold Biotechnology,
Inc., St. Louis, MO) verwendet wurde. Die Proben wurden über Nacht
bei 37 °C
in einem GUS-Assaypuffer inkubiert.
-
Quantitative
Messungen der GUS-Aktivität
wurden nach dem Verfahren von Jefferson et al. (1987) unter Verwendung
des 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid
(MUG)-Substrats (Sigma, St. Louis, MO) durchgeführt. Aus homozygoten Linien
wurde ein einzelnes unreifes Endosperm 10 bis 14, 20 und 30 Tage
nach der Bestäubung
isoliert oder aus reifem Endosperm, in flüssigem Stickstoff gefroren
und in GUS-Extraktionspuffer gemahlen; jede Behandlung wurde mit
4 Ansätzen
durchgeführt.
-
Nach
der Zentrifugation wurden die Überstände dazu
verwendet, die GUS-Aktivität
zu bestimmen. Die Fluoreszenz von 4-Methylumbelliferon (4-MU) (Sigma,
St. Louis, MO) wurde auf einem geeigneten TKO 100 Minifluorometer
(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) bei einer Anregungswellenlänge von
365 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen. Die
Proteine wurden wie zuvor beschrieben extrahiert (Jefferson 1987,
Jefferson et al. 1987), und die Proteinkonzentrationen in den Extrakten
wurden nach Bradford (1976) gemessen, wobei das BioRad-Reagenz (Bio-Rad,
Richmond, CA) verwendet wurde.
-
Um
die Herbizidsensitivität
der T0-Pflanzen und ihre Nachkommen zu bestimmen,
wurde ein Teil der Blattspreite im Blattstadium 4 bis 5 unter Verwendung
eines Baumwolltupfers mit 0,25 Lösung
(v/v) der BastaTM-Lösung (Anfangskonzentration
200 g/l Phosphinothricin, Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) plus 0,1
% Tween 20 gefärbt.
Die Pflanzen wurden 1 Woche nach der Herbizidanwendung bewertet.
-
Es
wurde die gesamte genomische DNA aus unabhängigen Kalli oder Blattgeweben
wie von Dellaporta (1993) beschrieben aufgereinigt. Um das Vorhandensein
von uidA in genomischer DNA der putativ transformierten Zelllinien
zu untersuchen, wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung
des Primersets aus UIDA1 (5'-AGCGGCCGCATTACGTCCTGTAGRAACC-3' (SEQ ID NO: 9) und
UID2R (5'-AGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCC-3') (SEQ ID NO: 10)
amplifiziert. Das Vorhandensein von bar wurde unter Verwendung des
Primersets aus BRR5F (5'-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3') (SEQ ID NO: 11)
und BAR1R (5'-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3') (SEQ ID NO: 12)
(Lemaux et al. 1996) untersucht. Die Amplifikationen wurden mit
einer Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt. 25 μl des PCR-Produktes
wurden mit Ladepuffer elektrophoretisch auf einem 0,8%igen Agarosegel mit
Ethidiumbromid getrennt und unter Verwendung von UV-Licht photographiert.
-
Das
Vorhandensein eines 1,8 kb-Fragments bei den UIDA-Primern stimmte
mit einem intakten uidA-Fragment überein; mit den 8AR-Primern wurde ein
internes 0,34 kb-Fragment erzeugt. Für die DNA-Hybridisierungsanalyse
wurden 10 μg
der genomischen Gesamt-DNA von Blattgewebe jeder Zelllinie mit EcoRI und
BamHI verdaut, auf einem 1 eigen Agarosegel getrennt, auf eine Zeta-Probe GT-Membran
(Bio-Rad, Hercules, CA) überführt und
mit einer radioaktiv markierten uidA-spezifischen Sonde gemäβ den Anweisungen des
Herstellers hybridisiert. Das uidA enthaltende 1,8 kb-XbaI-Fragment
aus pBI221 wurde unter Verwendung des QIAEX Gelextraktionskits (QIAGEN),
Chatsworth, CA) gereinigt und unter Verwendung von Zufallsprimern mit α-32P-dCTP markiert.
-
Ergebnisse
-
Zweiundzwanzig
unabhängige,
stabil transformierte Kalluslinien der Gerste, die entweder B1- oder D-Hordein-Promotor-uidA-Fusionen enthielten,
wurden aus einer ersten Serie von Transformationen erhalten. 13
Linien waren regenerierbar, sieben B1-Hordein-uidA-Transformanten
und sechs D-Hordein-uidA-Transformanten.
Es wurde die genomische DNA aus dem Kallus von regenerierbaren Transformanten
isoliert. Die PCR-Analyse wurde unter Verwendung der UIDA- und BAR-Primern
durchgeführt.
Die PCR-Amplifikation führte
in den T1-Nachkommen zu einem intakten uidA-Fragment
von 1,8 kb und einem internen bar-Fragment von 0,34 kb. Von den
T0-Blattgewebe der 13 untersuchten Linien
produzierte jedoch eine (GPDhGN-22) kein PCR-amplifiziertes Fragment
für uidA
(Tabelle 2). Nach Southern-Hybridisierung der genomischen DNA aus Blattgewebe
der sieben B1-Hordein-uidA-Transformanten und
der sechs D-Hordein-uidA-Transformanten produzierten 12 der 13 transformierten
Linien die erwarteten Hordein-uidA-Fusionsfragmente von 2,35 kb
oder 2,25 kb.
-
Die
verbleibende Linie (GPDhGN-22) produzierte keine Fragmente, die
mit uidA hybridisierten, obwohl diese Linie Banden enthielt, die
mit bar hybridisierten und von geeigneter Größe waren (Daten nicht gezeigt).
-
Verschiedene
Gewebe von stabilen Transformanten wurden in Bezug auf die histochemische GUS-Aktivität untersucht.
Eine starke GUS-Expression wurde in Endospermgeweben beobachtet,
die sowohl mit dem T1- als auch mit dem
D-Hordein-Promotor transformiert worden waren, jedoch nicht den
Geweben von Embryo, Fruchtknoten, Stigma, Anthere oder Blatt. Eine
GUS-Expression unter
Kontrolle des Ubiquitin-Promotors (Ubil) aus Mais wurde in allen
Geweben beobachtet: keine GUS-Expression wurde in der nicht transformierten
Kontrolle beobachtet. Keimende Wurzeln und Sprößlinge von T1-Samen
von B1- oder D-Hordein-Promotor-uidA-Fusionstransformanten
wiesen ebenfalls keine sichtbare histochemische GUS-Aktivität auf (Daten nicht
gezeigt).
-
Die
relativen Aktivitäten
der B1- und D-Hordein-uidA-Konstrukte wurden
durch fluorimetrische Analyse von GUS in Extrakten von sich entwickelnden
und reifen Samen von homozygoten Linien bestimmt (Tabelle 1). Die
spezifischen Aktivitäten
von GUS, das von dem B1-Promotor gesteuert
wurde, hatten maximale Expressionsmengen bei 10 bis 20 Tagen nach
der Bestäubung.
Der D-Hordein-Promotor zeigte ein Entwicklungsmuster mit Peakspezifischen
Aktivitäten
bei 20 bis 30 Tagen nach der Bestäubung.
-
Die
Enzymaktivität
von Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT, Produkt von bar) und
GUS wurde in T0-Pflanzen und ihren Nachkommen
durch Färbung
der Blätter
mit Basta für
PAT und durch einen histochemischen Assay auf GUS untersucht. Blattgewebe
von T0-Pflanzen aller dreizehn unabhängigen Linien
zeigten eine Basta-Resistenz (Tabelle 2).
-
Bei
den T
1-Nachkommen zeigten sieben von dreizehn
Linien, die sowohl auf uidA als auch auf bar untersucht worden waren,
ein 3 : 1-Segregationsmuster für
die Expression von GUS (Tabelle 2). Von den verbleibenden sechs
Linien wies eine Linie (GPDhGN-6) ein 43 : 2-Segregationsverhältnis für die GUS-Expression auf; eine
Linie (GPDhGN-22) exprimierte PAT, enthielt jedoch kein uidA, eine
Linie (GPBhGN-13) enthielt weder uidA noch bar und drei Linien (GPBhGN-2,
GPDhGN-12 und GPDhGN-14) waren steril. Das T
1-Endosperm
von allen fertilen transgenen T
0-Linien
zeigte positive DNA-Hybridisierungssignale für uidA [2,35 kb-Fragment bzw.
2,25 kb-Fragment für
das B
1-Hordein-uidA-Gen bzw. das D-Hordein-uidA-Gen]
auf, zeigte eine starke GUS-Aktivität (Tabelle 2), mit Ausnahme
von GPBhGN-13 und GPDhGN-14. Das bar-Gen war stabil auf die T
1-Nachkommen aller fertilen Linien übergegangen,
außer
bei GPBhGN-13; es wurde eine stabil exprimierende homozygote Linie
(GPDhGN-16) erhalten (Tabelle 2). Die Expression von uidA, das entweder
von dem B
1-Hordein-Promotor oder von dem
D-Hordein-Promotor
gesteuert wurde, wurde auch stabil auf die T
2-Nachkommen
aller 7 unabhängig
getesteten Linien (GPBhGN-4, -7, -12, -14, GPDhGN-6, -11 und -16)
vererbt (Tabelle 1). Die Expression des uidA-Gens war stabil in
der einen Linie übertragen
worden, welche in der T
5-Generation getestet
wurde (GPBhGN-4), in zwei Linien, die in der T
4 getestet
wurden (GPBhGN-7 und GPDhGN-16) in 3 Linien der T
3 (GPBhGN-12,
GPDhGN-6 und -11), in einer Linie der T
2 (GPBhGN-14)
und in einer Linie der T
1 (GPBhGN-3) (Tabelle
1). Homozygote transgene Linien, die uidA stabil exprimierten, wurden in
den Fällen
von GPBhGN-4, -7, GPDhGN-6 und -16 erhalten (Tabellen 1 und 2).
Tabelle
2. Spezifische GUS-Aktivitäten
in sich entwickelnden und reifen transgenen Gerstensamen
- Die GUS-Aktivität wurde durch fluorimetrische
Assays mit Proteinextrakten aus sich entwickelndem und reifem Endosperm
von homozygoten Linien bestimmt. Die Werte für die GUS-Aktivität stellen
Mittelwerte ± Standardabweichung
von 4 Ansätzen
für jede
Behandlung dar.
- GPBhGN-4-34-7-1-2 und GPDhGN-6-9-6 sind homozygote Linien, die
mit B1-Hordein-uidA (p16)-Konstrukten bzw.
D-Hordein-uidA (pD11-Her3)-Konstrukten
transformiert wurden, und T5- bzw. T3-Samen produzieren.
-
Beispiel 4: Vergleich
der Samenexpression in Gerstenpflanzen, die stabil mit Ph-hSS-X-Konstrukten
oder Ph-X-Konstrukten transformiert wurden
-
Um
die Wirkung der Hordein-Signalsequenz auf das Ausmaß der Proteinexpression
zu bestätigen, wurden
Gerstenpflanzen mit Konstrukten transformiert, in denen der Hordein
B1-Promotor in funktionsfähiger Weise
mit dem uidA-Gen verknüpft
war, entweder mit der Hordein-B1-Signalsequenz
(Konstrukt pdBhssGN5-6) oder ohne die Signalsequenz (Konstrukt pdBhGN1-2),
wie in 2 veranschaulicht ist. Details und Ergebnisse
dieser Verfahren sind nachfolgend beschrieben.
-
Material und Methoden
-
Plasmide
-
Es
wurden zwei DNA-Konstrukte, die den B1-Hordeinpromotor
und die kodierende Region gus mit oder ohne Signalpeptidsequenz
enthielten, hergestellt, um die Funktionalität der B1-Hordein-Promotor-gus-Fusionen
zu überprüfen und
ihr Targeting zu untersuchen:
- (1) pdBhssGNS-6
(mit Signalsequenz, 2A): das chimäre DNA-Konstrukt,
welches das B1-Hordein-Promotor-SignalsequenzuidA-nos
enthielt und nach den in Beispiel 1 beschriebenen PCR-Verfahren
hergestellt worden war, wurde mit HindIII und SnaBI verdaut, und
das HindIII/SnaBI-Fragment wurde in den HindIII-SnaBI-verdauten
pDMC201.4 (McElroy et al., 1995) ligiert, wobei das Plasmid pdBhssGNS-6
erzeugt wurde. Das pDMC201.4-Plasmid enthält uidA ohne Promotor sowie
nos; das uidA-Gen wurde aus dem pGUSN358->S-Plasmid erhalten, das durch ortsspezifische
Mutagenese für
Untersuchungen zum Vakuolen-Targeting
verändert
worden war (Farrell und Beachy, 1990). Das mittels PCR amplifizierte
Fragment (B1-Hordein-Promotor mit seiner
Signalpeptidsequenz plus die Verbindungsregion mit dem 5' uidA) des chimären Produkts
wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
- (2) pdBhGN1-2 (ohne Signalsequenz, 2B):
die SphI- und XbaI-Schnittstellen enthaltenden Primer Bhor3 (5'-cgcatgcGTGCAGGTGTATGAGTCATT-3') (SEQ ID NO: 13)
und Bhor2R (5'-ccctctagaAGTGGRTTGGTGTTAACT-3') (SEQ ID NO: 14),
jeder jeweils mit einer einzelnen Restriktionsenzymschnittstelle (klein
geschriebene Buchstaben), wurden für die Amplifikation der B1-Hordein-5'-Region von 0,55 kb verwendet, wobei
das Plasmid p16, welches B1-Horderin-Promotor-uidA-nos
enthielt (Sorensen et al., 1996) als Matrize verwendet wurde.
-
Das
mittels PCR amplifizierte Fragment von 0,55 kb wurde mit SphI und
XbaI geschnitten und in einen SphI/XbaI-verdauten pUC19 ligiert,
wobei pBhor-1 erzeugt wurde. pBhGN-1 wurde hergestellt, indem der CaMV35S-Promotor
in p35SGN-3 (der CaMV35S-Promotor-uidA-nos
enthielt) durch das SphI/XbaI-B1-Hordein-Fragment aus pBhor-1
ersetzt wurde. Das HindIII/SnaBI-Fragment aus pBhGN-1 wurde durch
das HindIII/SnaBI-Fragment in pDMC201.4 ersetzt, wobei pdBhGN1-2
erzeugt wurde. Die das B1-Hordein 5'-flankierende Region
von 120 bp war folglich sowohl in pdBhssGN5-6 als auch in pdBhGN1-2
deletiert.
-
Die
zwei resultierenden chimären
DNA-Konstrukte wurden für
Assays auf die stabile Genexpression unter Verwendung von Mikroprojektil-Bombardement
in unreifes Endospermgewebe der Gerste eingebracht. Stabile Transformationsverfahren,
GUS-Färbung
und GUS-Quantifizierung sowie die Basta-Sensitivität wurden
wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt.
-
Isolierung genomischer
DNA, Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Blot-Hybridisierung
-
Die
gesamte genomische DNA aus unabhängigen
Kalli oder Blattgeweben wurde wie beschrieben aufgereinigt (Dellaporta,
1993). Um die Gegenwart von uidA in genomischer DNA von putativ
transformierten Linien zu überprüfen, wurden
250 ng genomische DNA mittels PCR unter Verwendung des Primersets
aus UIDA1 und UID2R amplifiziert. Das Primerset aus Bhor8 (5'-GAAGAGATGAAGCCTGGCTAC-3') (SEQ ID NO: 15)
und GUS5516 (5'-CGATCCAGACTGAATGCCCACAGG-3') (SEQ ID NO: 16)
wurden verwendet, um zwischen dem B1-Hordein-Promotor
mit Signalsequenz und dem ohne Signalsequenz zu unterscheiden. Ein
Hybridprodukt aus 229 bp wird ausgehend von dem Konstrukt erwartet,
dass den B1-Hordein-Promotor mit der Signalsequenz
enthält,
während
ein PCR-Produkt aus 178 bp ausgehend von dem Konstrukt erwartet
wird, das den B1-Hordein-Promotor ohne die
Signalsequenz enthält.
-
Das
Vorhandensein von bar wurde unter Verwendung des Primersets aus
BAR5F und BAR1R (Lemaux et al. 1996) untersucht. Die Amplifikationen
wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion
durchgeführt.
25 μl des
PCR-Produkts wurden
mit Ladepuffer elektrophoretisch auf einem 0,8 %igen Agarosegel
mit Ethidiumbromid getrennt und unter Verwendung von UV-Licht photographiert. Das
Vorhandensein eines Fragments von 1,8 kb bei den UIDA-Primern verwies
auf ein intaktes uidA-Fragment; ein internes Fragment von 0,34 kb
wurde mit den BAR-Primern erzeugt. Für die DNA-Hybridisierungsanalyse
wurden 10 μg
der gesamten genomischen DNA aus dem Blattgewebe jeder Linie mit
HindII und SacI verdaut, auf einem 1 %igen Agarosegel getrennt und
auf eine Zeta-Probe GT-Membran (Bio-Rad, Hercules, CA) überführt und
mit einer radiomarkierten uidA-spezifischen Sonde gemäß den Anweisungen
des Herstellers hybridisiert. Das uidA-enthaltene XbaI-Fragment
von 1,8 kb aus pBI221 wurde unter Verwendung eines QIAEX-Gelextraktionskits
(QIRGEN, Chatsworth, CA) gereinigt und mit α-32P-dCTP
unter Verwendung von Zufallsprimern markiert.
-
Immunogold-Markierungsassay
-
Transgenes
und nicht transgenes unreifes Endosperm wurde etwa 20 Tage nach
der Bestäubung
unter Verwendung einer Hochdruckgefriermethode (McDonald, 1998)
geerntet. Die Gewebe wurden in weißes Harz eingebettet, und die
Immunhistochmie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Phillip
et al., 1998).
-
Ergebnisse
-
PCR und DNA-Blot-Hybridisierungsanalyse
von transgenen Pflanzen
-
Um
die Funktionalität
der N-terminalen Signalpeptidsequenz des B1-Hordein-Promotors
zu überprüfen, und
um die Mechanismen des Targetings zu untersuchen, erhielten wir
10 unabhängige,
stabil transformierte Gerstenlinien, die entweder pdBhssGNS-6 oder
pdBhGN1-2 enthielten.
-
Von
diesen Linien wurden 3 Linien von jedem DNA-Konstrukt mit uidA-
und bar-Genen co-exprimiert. Es wurde die genomische DNA dieser
Transformanten isoliert. Die PCR-Analyse wurde unter Verwendung
der UIDA- und BAR-Primer durchgeführt. Die PCR-Amplifikation führte bei
allen 6 Linien zu einem intakten uidA-Fragment von 1,8 kb und einem
internen bar-Fragment von 0,34 kb (Tabelle 3). Es wurde ein Größenunterschied
von 51 bp zwischen den Fragmenten, die ausgehend von den B1-Hordein-uidA-Transformaten mit oder ohne Signalsequenz
amplifiziert wurden, beobachtet, was auf das Vorhandensein der Signalsequenz
in den Linien GPdBhGN-1, -2 und -16 zurückzuführen ist.
-
Expression von Hordein-uidA
in transgenen Pflanzen
-
T1-Samen wurden in Bezug auf die histochemische
GUS-Aktivität
untersucht. Eine starke GUS-Expression wurde in Endospermgeweben
beobachtet, die mit beiden B1-Hordein-Promotoren
mit und ohne Signalsequenz transformiert worden waren, jedoch nicht
im Embryo. Die GUS-Expression, die von den beiden B1-Hordein-uidA-Konstrukten ausging,
war im sich entwickelnden Endosperm besonders auffällig, insbesondere
in peripheren Zellen des Endospermgewebes und in Endospermgewebe
nahe der Scutellumstelle. Der B1-Hordein-Promotor
mit der Signalsequenz zeigte sogar eine noch stärkere Expression im Endosperm
als derjenige ohne Signalsequenz. Es wurde keine GUS-Expression
in den nicht transformierten Kontrollgeweben beobachtet.
-
Die
relativen Aktivitäten
der B1-Hordein-uidA-Konstrukte wurde durch
fluorimetrische Analyse von GUS in Extrakten von sich entwickelnden
und reifen Samen von homozygoten Linien bestimmt. Die spezifischen
Aktivitäten
von GUS, das durch den B1-Hordein-Promotor
mit der Signalsequenz gesteuert wurde, waren sowohl im sich entwickelnden
als auch im reifen Samen höher
als im Falle ohne Signalsequenz (6 und 7).
-
Insbesondere
im sich entwickelnden Endospermgeweben, die mit dem B1-Hordein-Promotor
mit der Signalsequenz transformiert worden waren, wurden im Vergleich
zum B1-Hordein-Promotor ohne Signalsequenz
eine mehr als 30-fach höhere
GUS-Aktivität
nachgewiesen.
-
Analyse von T0-
bis T2-Nachkommen
-
Die
Enzymaktivität
von Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT, Produkt von bar) und
GUS wurde in T0-Pflanzen und ihren Nachkommen
durch Färbung
der Blätter
mit Basta für
PAT und durch einen histochemischen Assay auf GUS untersucht. Blattgewebe
von T0-Pflanzen aller 6 unabhängigen Linien
zeigten eine Basta-Resistenz (Tabelle 1). Bei den T1-Nachkommen
zeigten alle 6 Linien, die auf uidA getestet worden waren, ein 3
: 1-Segregationsmuster
für die
Expression von GUS. Das bar-Gen wurde ebenfalls stabil auf die T1-Nachkommen von 5 Linien übertragen,
mit Ausnahme von GPdBhssGN-10; die Linie GPdBhssGN-10 exprimierte PAT
nicht. Homozygote transgene Linien, die uidA stabil exprimieren,
wurden in 4 Fällen
erhalten, GPdBhGN-1, GPdBhssGN-7, -10 und -23.
-
Elektronenmikroskopie
und Immunogold-Markierung
-
Das
Immunsignal, das bei der Elektronenmikroskopie beobachtet wurde,
war spezifisch für
Proteinkörper
in GUS-exprimierendem, unreifem Endosperm der Linie, die mit dem
B1-Hordein-μidA-DNA-Konstrukt transformiert worden war,
welches die N-terminale Signalpeptidsequenz von 19 Aminosäuren enthielt
(7).
-
Diskussion
-
Die
obige Untersuchung richtete sich auf die Funktionalität der B1-Hordein-Promotoren der Gerste mit und ohne
N-terminale Signalpeptidsequenz von 19 Aminosäuren, wobei sowohl transiente
als auch stabile Expressionsassay in der Gerste verwendet wurden.
-
Im
Einklang mit früheren
Untersuchungen (Müller
und Knudsen 1993; Sorensen et al., 1996) wurde die transiente Expression
von GUS unter Kontrolle der B1-Hordein-Promotor-uidA-Fusion
ohne Signalsequenz in sich entwickelndem Endosperm, jedoch nicht
in Embryonen beobachtet. Der B1-Hordein-Promotor
mit Signalsequenz zeigte das gleiche Expressionsmuster, jedoch eine
stärkere
Expression. Die PCR-Analyse bestätigte
das Vorhandensein von uidA und bar in genomischer DNA von T0-Pflanzen von 6 verschiedenen Linien, die
stabil mit B1-Hordein-Promotoren mit und
ohne Signalsequenz transformiert worden waren.
-
Stabil
transformierte, sich entwickelnde und reife Gerstensamen wurden
im Hinblick auf die Gewebespezifität und das Timing der vom Hordein-Promotor
gesteuerten GUS-Expression untersucht. GUS, das sowohl von dem B1-Hordein-Promotor mit als auch von dem ohne
Signalsequenz gesteuert wurde, wurde ausschließlich im Endospermgewebe exprimiert,
nicht jedoch in anderen Geweben. Darüber hinaus verstärkte das Vorhandensein
der Signalsequenz bei dem B1-Hordein-Promotor
die GUS-Expression in sich entwickelndem, transgenem Endosperm erheblich.
Dies stimmt mit den Ergebnissen von Fiedler und Conrad (1995) überein, wonach
ein antigenbindendes, einzelkettiges Fv (scFv)-Protein lediglich in Samen von Tabakpflanzen
nachweisbar war, die mit Konstrukten transformiert worden waren,
welche eine Signalpeptidsequenz enthielten. Nach Lagerung der reifen
Tabaksamen für
1 Jahr bei Raumtemperatur gab es keinen Verlust an scFv-Protein oder
seiner antigenbindenden Aktivität,
wohingegen in Pflanzen, die mit einem Konstrukt ohne Signalpeptid transformiert
worden waren, keine nachweisbare Anreicherung von scFv in reifen
oder sich entwickelnden Samen auftrat. Es wurde angenommen, dass
das Fehlen der GUS-Proteinexpression im Cytosol das Ergebnis einer
translationalen oder posttranslationalen Regulation durch cytosolische
Proteasen ist, die das scFv-Protein abbauen, wenn es nicht in den
sekretorischen Weg eintritt.
-
Im
Gegensatz dazu waren die Mengen von GUS-mRNAs in sich entwickelnden
Samen und die GUS-Aktivität
in reifen Samen in Tabaklinien, welche die N-terminale Aminosäuresequenz
des Sojabohnenembryo-spezifischen Lektin-Gens aus 32 Aminosäuren aufwiesen,
im Vergleich zu solchen, die diese Sequenz nicht aufwiesen, übereinstimmend
höher (Phillip
et al., unveröffentlichte
Beobachtung). Die GUS-Expression, die von den zwei B1-Hordein-uidA-Konstrukten
ausging, war insbesondere in peripheren Zellen des sich entwickelnden
Endospermgewebes und im Endospermgewebe nahe der Scutellumstelle
in transformierter Gerste besonders auffällig.
-
Man
würde erwarten,
dass transgene Pflanzen, die eine einzelne Stelle aufweisen, an
der es zu einer Integration des Transgens gekommen ist, ein Segregationsverhältnis für das Transgen
(und seine Expression) von 3 : 1 aufweisen. Alle 6 Linien ergaben
ein solches Verhältnis
für die
GUS-Expression. Homozygote transgene Linien, die stabil GUS exprimierten,
wurden von 4 Linien erhalten. Die Expression des vom Ubiquitin-Promotor
aus Mais gesteuerten PAT wurde ebenfalls stabil auf die T1-Nachkommen von 5 transgenen Linien vererbt;
eine Linie (GPdBhssGN-10) zeigte jedoch keine PAT-Expression bei
den T2-Nachkommen.
-
Die
vorliegend dargestellten Ergebnisse zeigen dass der D-Hordein-Promotor
oder der B1-Hordein-Promotoren verwendet
werden können,
um ein System zu entwickeln, mit dem die Expression von Fremdgenen
auf das Endosperm eines Gerstensamens beschränkt werden kann. Darüber hinaus
zeigen die Ergebnisse, dass die Verwendung von Pflanzen, die mit
einem samenspezifischen Promotor mit Signalsequenz transformiert
worden waren, die Expression des Transgens erheblich verstärkte. Dies
ermöglicht
die Erzeugung von neuen Getreidesorten für ernährungstechnische und pharmazeutische
Zwecke unter Verwendung von Strategien des Vakuolen-Targetings.
-
Beispiel 5: Embryospezifische
Expression
-
Dieses
Beispiel verwendet den Glb1-Promotor aus Mais mit oder ohne Deletion
einer 5'-flankierenden Sequenz,
fusioniert mit dem bakteriellen Reportergen, dem β-Glucuronidase-Gen
(uidA; gus), um die Funktionalität
des Glb1-Promotors aus Mais für
die embryospezifische Expression in transgener Gerste zu zeigen.
-
Eine
zweizeilige Frühjahrsgerstensorte
wurde wie zuvor beschrieben in Wachstumskammern angezüchtet (Wan
und Lemaux 1994; Lemaux et al. 1996).
-
Plasmide
-
ppGlb1GUS
(Liu und Kriz, 1996), ein Plasmid, welches das uidA-Reportergen unter
Kontrolle des embryospezifischen Globulin (Glb1)-Promotors aus Mais
enthält
und von nos terminiert wird, wurde von DEKALB Plant Genetics, Mystic,
CT erhalten. Das ppGlb1GUS wurde mit EcoRI verdaut, um eine das
Globulin 5'-flankierende Region
von 1,04 kb zu entfernen. Das 2,58 kb-EcoRI-Fragment, das den 0,36 kb-Globulin-Promotor, die
kodierende Sequenz uidA und der nos-3'-Terminator enthielt, wurde in EcoRI-verdautem
pUC19 ligiert, wobei pdGlbGUS-6 entstand. Die das Globulin 5'-flankierende Region
von 1,04 kb war folglich in pgGlbGUS-6 deletiert. Die beiden oben
genannten chimären
DNA-Konstrukte wurden unter Verwendung von Mikroprojektil-Bombardement in unreifes
Endospermgewebe der Gerste eingebracht, um Assays für die transiente
und die stabile Genexpression durchzuführen.
-
Transiente Genexpression
der uidA-Gene, die von Globulin-Promotoren
gesteuert wird
-
Ähren wurden
etwa 20 bis 25 Tage nach der Bestäubung für 10 bis 15 Minuten in 20 %
(v/v) Bleichmittel (5.25 % Natriumhypochlorit) oberflächensterilisiert,
und anschließend
dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Unreife Embryonen und Endospermgewebe
wurden aseptisch getrennt und mit oder ohne Osmotikumbehandlung
(Cho et al., 1998b) mit der Scutellumseite nach oben auf MS-Medium
aufgebracht (Murashige und Skoog 1962), das mit 3,5 g/l Phytagel
(Sigma, St. Louis, MO) supplementiert war. Die Gewebe wurden unter Verwendung
einer Biolistic PDS-1000 He-Gun (Bio-Rad, Hercules, CA) bei 1100
psi nach dem Protokoll von Lemaux et al. (1996) mit 1,0 μm Goldpartikeln
beschossen, die entweder mit ppGlb1GUS oder pdG1bGUS-6 beschichtet
waren. Die osmotische Behandlung umfasste 0,2 M Mannitol und 0,2
M Sorbitol, wobei eine Endkonzentration von 0,4 M erhalten wurde,
mit einer Vorbehandlung von 4 h und einer Nachbehandlung von 1 oder
2 h.
-
Stabile Gerstentransformationen
-
Stabile
transgene GP-Linien wurden mittels Mikropartikel-Bombardement erhalten, wie es im Wesentlichen
von Wan und Lemaux 1994; Lemaux et al. 1996; und Cho et al. 1998a,
beschrieben wurde. Goldpartikel (1,0 μm) wurden mit 25 μg eines molaren
Verhältnisses
von 1 : 1 aus pAHC20 und ppG1b1GUS oder pdG1bGUS-6 beschichtet und
wie beschrieben in den Bombardement-Experimenten verwendet. Das
Plasmid pAHC20 (Christensen und Quail, 1996) enthält das Herbizid-Resistenzgen
bar aus Streptomyces hygroscopicus unter Kontrolle des Ubiquitin-Ubil-Promotors aus Mais,
sowie das erste Intron des nos-3'-Terminators.
-
Bialaphos-resistente
Kalli wurden auf FHG-Medium (Hunter 1988) regeneriert, das 1 mg/l
6-Benzylaminopurin (BAP) und 3 mg/l Bialaphos enthielt. Regenerierte
Sprößlinge wurden
in Magentaboxen überführt, die
Wurzelmedium (Kallus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) enthielten,
welches 3 mg/l Bialaphos enthielt. Wenn die Sprößlinge den Deckel der Box erreichten,
wurden die Pflänzchen
auf Erde überführt und
bis zur Reife in einem Gewächshaus
angezüchtet.
-
Histochemische
und quantitative Assays der GUS-Aktivität
-
Die
histochemische Färbung
in Bezug auf GUS wurde unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc)
(Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO) durchgeführt. Die
Proben wurden über
Nacht bei 37 °C
in GUS-Assaypuffer inkubiert.
-
Herbizid-Verwendung
-
Um
die Herbizid-Sensitivität
von T0-Pflanzen und ihrer Nachkommen zu
bestimmen, wurde ein Teil der Blattspreite im Blattstadium 4 bis
5 unter Verwendung eines Baumwolltupfers mit einer 0,25 %igen Lösung (v/v) von
BastaTM-Lösung (Startkonzentration 200
g/l Phosphinothricin, Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) plus 0,1
% Tween 20 angefärbt.
Die Pflanzen wurden 1 Woche nach der Herbizid-Verwendung bewertet.
-
Isolierung genomischer
DNA, Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Blot-Hybridisierung
-
Die
gesamte genomische DNA von unabhängigen
Kalli oder Blattgeweben wurde wie beschrieben gereinigt (Dellaporta,
1993).
-
Um
das Vorhandensein von uidA in genomischer DNA von putativ transformierten
Linien zu untersuchen, wurden 250 ng genomische DNA mittels PCR
amplifiziert, wobei das Primerset aus UI-DA1 (5'-agcggccgcaTTACGTCCTGTAGAAACC-3') und UID2R (5'-agagctcTCATTGTTTGCCTCCCTG-3') verwendet wurde; jeder
enthält
eine Restriktionsschnittstelle (klein gedruckte Buchstaben) für die Subklonierung
eines weiteren DNA-Konstrukts, das das uidA-Gen enthält (Cho
et al. 1998a;b). Das Vorhandensein von bar wurde unter Verwendung
des Primersets aus BAR5F (5'-CRTCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3') und BAR1R (5'-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3') durchgeführt (Lemaux
et al. 1996). Die Amplifikationen wurden mit Taq-DNR-Polymerase
(Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt (Cho
et al. 1998a;b). 25 μl
des PCR-Produktes wurden mit Ladepuffer elektrophoretisch auf einem
0,8 %igen Agarosegel mit Ethidiumbromid getrennt und unter Verwendung
von UV-Licht photographiert. Das Vorhandensein eines 1,8 kb-Fragments
bei den UIDA-Primern
stimmte mit einem intakten uidA-Fragment überein; mit den BAR-Primern
wurde ein internes 0,34 kb-Fragment erzeugt.
-
Ergebnisse
-
Transience
Genexpression der Globulin-uidA-Gene
-
Um
die Funktionalität
des embryospezifischen Globulin-Promotors
aus Mais zunächst
zu etablieren, wurden die Plasmide ppG1b1GUS und pdGlb1GUS-6 in
transienten Assays verwendet, die ein Mikroprojektil-Bombardement
eines unreifen Gerstenendosperm bzw. eines Gerstenembryos umfassten.
Zwei Kontrollen wurden eingeschlossen, eine Negativkontrolle, bei
der mit 1 × TE-Puffer
beschossen wurde und eine Positivkontrolle, bei der mit pAHC25 beschossen
wurde, das uidA unter Kontrolle des konstitutiven Ubiquitin-Promotors
aus Mais enthielt.
-
GUS,
das von den embryospezifischen Globulin-Promotoren aus Mais gesteuert
wurde, wurde in Embryogewebe schwach exprimiert, im Endospermgewebe
hingegen überhaupt
nicht. Die GUS-Expression,
die von den zwei Globulinpromotor-uidA-Fusionen gesteuert wurde,
war in unreifen Gerstenembryonen mit osmotischer Behandlung stärker als
ohne osmotische Behandlung. Das Ausmaß der uidA-Genexpression in
Embryonen, die von dem undeletierten Globulin-Promotor (1,4 kb ppG1b1GUS)
gesteuert wurde, schien geringfügig schwächer zu
sein als die Expression, die von dem deletierten Globulin-Promotor
(0,36 kb pdG1bGUS-6) gesteuert wurde. Die ABA-Behandlung verstärkte die
GUS-Expression in
unreifen Embryonen ohne osmotische Behandlung, jedoch nicht in solchen
mit osmotischer Behandlung. Die Negativkontrolle zeigte keine GUS-Expression.
-
Embryospezifische
Expression in transgenen Pflanzen
-
Um
darüber
hinaus die Konstrukte aus Mais-Glb1 und uidA zu untersuchen, wurden
zehn unabhängige,
stabil transformierte Gerstenlinien erhalten; 5 waren mit dem undeletierten
Globulin-Promotor
transformiert, und weitere 5 waren mit einem deletierten Globulin-Promotor
transformiert. Genomische DNA von regenerierbaren Transformanten
wurde isoliert, und es wurde eine PCR-Analyse durchgeführt. Die
Ergebnisse der PCR-Amplifikation von uidA-Gen und bar-Gen mit genomischer
DNA, die aus Kallusgewebe extrahiert worden war, zeigten, dass die
transgenen Gerstenlinien sowohl das intakte uidA-Fragment von 1,8
kb als das interne bar-Fragment von 0,34 kb bildeten.
-
Verschiedene
Gewebe von stabilen Transformanten wurden histochemisch in Bezug
auf die GUS-Aktivität
untersucht. Eine schwache uidA-Genexpression zeigte sich ausschließlich in
Embryogeweben, die mit den Glb1-Promotoren aus Mais transformiert
worden waren, jedoch nicht im Endospermgewebe.
-
Auf
der anderen Seite wurde eine GUS-Expression unter Kontrolle des
Ubiquitin (Ubi1)-Promotors aus Mais in allen Geweben beobachtet;
es wurde keine GUS-Expression bei der Negativkontrolle beobachtet.
Sequenzprotokoll
-
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