WO2006030492A1 - Ｇｌｐ−１誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法 - Google Patents

Ｇｌｐ−１誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法 Download PDF

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derivative
dna
plant
storage organ
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PCT/JP2004/013370
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Koichi Sugita
Saori Kasahara
Hiroyasu Ebinuma
Humio Takaiwa
Hiroshi Yasuda
Takahito Jomori
Yuji Hayashi
Akira Tashita
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Nippon Paper Industries Co.,Ltd.
Sanwa Kagaku Kenkyusho Co.,Ltd.
National Institute Of Agrobiological Sciences
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon

Definitions

  • Plants and plant storage organs with accumulated GLP-1 derivatives and their production methods Plants and plant storage organs with accumulated GLP-1 derivatives and their production methods
  • the present invention extends over the field of foods in the field of pharmaceuticals, and is a transformed plant in which GLP-1 derivatives are accumulated, a plant storage organ obtained therefrom, a production method thereof, and the plant or plant storage
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, a food or drink material, or a food or drink for the treatment or prevention of diabetes using an organ.
  • GLP-1 Glucagon like peptide-1
  • GLP-1 is secreted from the gastrointestinal tract by ingestion of food, and is known as a hormone that acts on the spleen and stimulates glucose concentration-dependent insulin secretion.
  • GLP-1 Glucagon like peptide-1
  • the development of GLP-1 preparations is expected to make up for the deficiency of GLP-1 and to be applied to antidiabetic drugs as insulin secretagogues.
  • GLP-1 the active body of GLP-1 is a polypeptide of GLP-1 (7-36) amide or GLP-1 (7-37), and by simple ingestion of GLP-1, it is caused by digestive enzymes in the digestive tract. Digested 'degraded and does not function well. For this reason, in the present situation, intravenous injection or subcutaneous injection by infusion is being attempted. Moreover, GLP-1 is degraded by dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) present in the blood and tissues, and its active half-life is as short as 1 to 12 minutes. It has been reported that blood half-life is easily within 5 minutes, which has become a bottleneck for clinical application. Therefore, GLP-1 derivatives with a long half-life have been developed.
  • DPP-IV dipeptidyl peptidase IV
  • an object of the present invention is to express a large amount of GLP-1 derivative in a plant that can be ingested and to ingest it.
  • the ultimate object of the present invention is to develop a method that allows GLP-1 derivatives to be taken orally at a low cost, and to use it for the treatment of diabetes.
  • the GLP-1 derivative expressed and accumulated while the plant or plant storage organ in which the GLP-1 derivative is expressed and eaten and undergoes digestion and absorption has an endogenous trypsin or trypsin-like activity.
  • Each GLP-1 derivative has an arginine (Arg) residue or lysine (Lys) residue that serves as a recognition site for trypsin and trypsin-like enzymes so that it can be cleaved by an enzyme to become a single GLP-1 derivative. Put the residue!
  • the invention of this application was completed by such a process of thinking.
  • GLP-1 (7-36) or GLP-1 (7-36) amino acid sequence or one or several amino acids are deleted, substituted and Z or added.
  • N-DNA (G is an integer of 3 or more) in series which encodes GLP-1 derivatives, which is composed of Arg or Lys at the C-terminus and also has the power of an amino acid sequence having GLP-1 activity !,
  • the GLP-1 derivative which is incorporated into a vector by incorporating the DNA into a vector and introduced into a plant cell and redifferentiated, is accumulated in such a way that it can be cleaved by a digestive enzyme. It will be a method for producing transformed plants or their plant storage organs.
  • the linked GLP-1 DNA can be located downstream of the DNA encoding the plant storage organ-specific promoter DNA and the plant storage protein signal peptide sequence and can be incorporated into the vector. Furthermore, the linked GLP-1 DNA can also be incorporated into the vector in the form of insertion or base substitution into the DNA region encoding the variable region of the plant storage protein DNA.
  • the linked GLP-1 DNA has a cytokinin-related gene, a drug resistance gene, and a DNA factor having a detachment ability, as well as a Inine-related genes and drug resistance genes are located in a position where they have the same behavior as a DNA factor that has detachment ability, and linked GLP-1 DNA is located in a position that does not have the same behavior as a DNA factor that has detachment ability It can also be incorporated into a vector.
  • plant cells introduced with the recombinant vector are cultured in a drug-added medium and a non-drug-added medium, and the transformant is redifferentiated, so that the ligated GLP- 1- Transformation from which a selection marker gene used as an index for introducing DNA has been removed A plant or its plant storage organ can be finally obtained, which is preferable.
  • These ligated GLP-1 DNAs may be used in combination with the method of incorporating them into the vector!
  • the GLP-1 derivative used is a GLP-1 derivative in which the 26th position of the GLP-1 amino acid sequence is substituted with glutamine and the 34th position is substituted with asparagine or aspartic acid, or the 8th position of the amino acid sequence is serine or GLP-1 derivatives substituted with glycine are preferred.
  • the number of linkages n of DNA encoding the GLP-1 derivative is preferably 4 to 8, and 5 is optimal.
  • the plant to be used is not particularly limited, and examples thereof include rice plants preferred by monocotyledonous plants.
  • the present invention further relates to a transformed plant obtained by carrying out these methods and to which GLP-1 derivatives are accumulated, or a plant storage organ thereof. Plants or plant storage organs in which these GLP-1 derivatives are accumulated are used as pharmaceutical compositions, food and drink materials, or food and drink for the treatment or prevention of diabetes.
  • FIG. 1 is a view showing a gene structure constructed for expressing a GLP-1 derivative.
  • Constructl is the gene structure for expressing the GLP-1 derivative 5-linked peptide alone (Test Example 1A), and Construct is the gene structure for expressing the unlinked GLP-1 derivative peptide alone (Test Example 1).
  • B) Construct inserts GLP-1 derivative 5-linked peptide into the variable region of the acidic subunit of glutelin (GluA-2), the major storage protein of rice, The gene structure for expression as part of glutelin (Test Example 1C) is shown (see Test Example 1).
  • Fig. 2 shows the independent transformations obtained by introducing Constructl (Test Example 1A). It is a figure which shows the analysis result of the GLP-1 derivative 5 connection peptide according to the rice system
  • FIG. 3 is a view showing the analysis results of rices derived from each independent transformant obtained by introducing Construct 2 (Test Example 1-B) by strain. Northern blotting, Western plotting, and SDS-PAGE electrophoresis showed no GLP-1 derivative signal detected in all strains. (See Test Example 2).
  • Fig. 4 shows the results of SDS-PAGE electrophoresis and Western blotting analysis for each rice strain derived from each independent transformant obtained by introducing Construct 3 (Test Example 1-C). It is a figure shown by comparison with Constructl (Test Example 1 A). In the transformant expressed as part of glutelin, the expression of GLP-1 derivative was observed, but the expression level was lower than that of Constructl (see Test Example 2).
  • FIG. 5 shows the results of analysis of rice-derived GLP-1 derivative 5-linked peptides by rice line obtained by introducing and expressing pTL7GluB- (mGLP-1x5) -GluBT-130Hm (Test Example 3)
  • FIG. The upper row shows the electrophoresis pattern, and the lower row shows the result of detecting the GLP-1 derivative by Western blotting.
  • Fig. 6 shows the power of rice transformed with pTL7GluB-PREE99 (mGLP-1x5) -GluBT-130Hm (Test Example 3). Analysis of GLP-1 derivative 5-linked peptides by rice line obtained The results are shown. The upper part is an electrophoretic pattern, and the lower part is a diagram showing the results of detecting a GLP-1 derivative by Western plotting.
  • FIG. 7 shows the content of GLP-1 derivative 5-linked peptide in rice obtained from rice plants obtained by introducing Constructl (Test Example 1 A), and radioimmunoassay (RIA). It is a figure which shows what was measured by cAMP production activity (refer test example 4).
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining the thermal stability of GLP-1 derivative 5-linked peptide in rice obtained from rice plants obtained by introducing Constructl (Test Example 1A). Yes (see Test Example 5).
  • Fig. 9 shows the effect of lowering blood glucose in normal mice using rice obtained by introducing Constructl (Test Example 1A) and expressing rice (GLP-1 derivative 5-linked peptide expression). It is a figure which shows the result of examination (refer test example 6).
  • FIG. 10 shows a type 2 diabetes model mouse using rice (GLP-1 derivative 5-linked peptide expression) obtained from rice plants obtained by introducing and expressing Constructl (Test Example 1-A).
  • FIG. 6 shows the results of examining the blood glucose lowering effect of KK-A y (see Test Example 7).
  • the GLP-1 derivative used in the practice of the present invention comprises GLP-1 (7-36) or a sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are deleted, substituted, Z, or added, and the C-terminal is It is a GLP-1 derivative consisting of Arg or Lys and having GLP-1 activity.
  • GLP-1 precursors, analogs, or their C-terminal amides are those in which the C-terminal amino acid also has Arg or Lys power.
  • Such GLP-1 derivatives are preferably those that are resistant to trypsin and Z or dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) by amino acid substitution because they are taken orally.
  • trypsin resistant GLP-1 derivatives in which the 26th position of the GLP-1 amino acid sequence is substituted with glutamine and the 34th position is substituted with asparagine or aspartic acid, or the DPPIV resistant GLP-1 with the 8th position of amino acid sequence replaced with serine or glycine.
  • One derivative is preferred.
  • trypsin and DPPIV-resistant GLP-1 derivatives having both of these substitutions are optimal (GLP-1 derivative: SEQ ID NO: 1 in the sequence listing: [Ser 8 , Gln 26 , Asn 34 ]-GLP-1 ).
  • DNA encoding the above GLP-1 derivative can be prepared from genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA based on the amino acid sequence information of the peptide.
  • CDNA can be prepared using conventional methods of those skilled in the art. Can be done.
  • DNA synthesis can be appropriately performed using a commercially available DNA synthesizer or the like.
  • the DNA can be modified to the target DNA in consideration of the degeneracy of amino acids, etc. with reference to codons frequently used in plant storage protein genes.
  • a DNA sequence encoding the peptide should be created following the codons frequently used for rice seed storage protein genes so that they can be translated efficiently in rice seeds. Can do.
  • the GLP-1 derivative DNA obtained above is ligated in series by conventional means.
  • three or more GLP-1 derivatives are linked and expressed.
  • stable expression of GLP-1 derivative can be expected in the plant body, and a plant or plant storage organ containing GLP-1 derivative at a high concentration can be obtained.
  • the number of linkages n of the DNA encoding the GL P-1 derivative is preferably 4 to 8, with 5 being optimal.
  • Linked GLP-1 derivative DNA ie, linked GLP-1-DNA
  • A expressed alone or (B) inserted into the variable region of a plant storage protein gene and fused. It can be expressed as a protein.
  • B inserted into the variable region of a plant storage protein gene and fused. It can be expressed as a protein.
  • the method (A) it is expected to be absorbed directly from the oral cavity without being digested when eaten by incorporating it as it is and expressing and accumulating the GLP-1 derivative alone.
  • the method (B) for example, it is expected that the small intestinal force is also absorbed by inserting into the variable region of glutelin, which is a plant storage protein, and expressing and accumulating it as part of the glutelin storage protein.
  • the ligated GLP-1 DNA can be expressed under the control of a plant storage organ-specific promoter by adding DNA encoding a plant storage protein signal peptide sequence to the 5 ′ end.
  • the plant storage organ-specific promoter and the DNA are expressed so that the DNA can be expressed. It can be carried out by introducing a DNA to which is bound to a plant. Arrangement of the desired DNA to be expressed downstream of the promoter so as to be controlled by the promoter can be performed using general genetic engineering techniques.
  • the plant storage organ-specific promoter can be used by appropriately selecting or modifying a known promoter according to the type of expressed! / ⁇ gene or the type of cell to be introduced.
  • a promoter that can be suitably used includes a plant storage protein darterin GluB-1 promoter.
  • Other examples include the glutelin GluB-4 promoter, 26 kD globulin promoter, 10 kD prolamin promoter, and 16 kD prolamin promoter.
  • the length of these promoters is usually 0.8 kb or more, and preferably 2.3 kb or more, but this length is particularly limited as long as it has a function. ⁇ ⁇ .
  • the promoter used for controlling the linked GLP-1 DNA is not limited to the above-mentioned plant storage organ-specific promoter, but may be a promoter derived from a plant virus, such as a first-class promoter. — 1 derivative ⁇ It can be selected as appropriate according to the plant or plant storage organ to be loaded.
  • plant storage protein signal peptide sequence various known plant storage protein signal peptide sequences can be used as appropriate. Information relating to the amino acid sequence of the plant storage protein signal peptide sequence can be easily obtained from known literature.
  • a signal peptide sequence of glutelin (GluB-1) protein can be preferably used. That is, the MASSVF SRFSIYFCVLLLCHGSMA sequence.
  • MASINRPIVFFTVCLFLLCDGSLA which is a signal peptide sequence of other glutelin (GluA-2), or MASKWFFAAALMAAMVAISGAQ, which is a signal peptide sequence of 26 kD globulin, can also be used.
  • DNA encoding these plant storage protein signal peptide sequences For the preparation of DNA encoding these plant storage protein signal peptide sequences, a commercially available DNA synthesizer or the like can be appropriately used for IJ in consideration of the degeneracy of amino acid sequences.
  • attaching the DNA encoding the plant storage protein signal sequence to the 5 ′ end of the linked GLP-1 DNA can be performed using known genetic engineering techniques.
  • ligated GLP-1—DNA certain! / ⁇ adds a terminator to the 3 ′ end of the ligated GLP-1—DNA insertion storage protein DN A.
  • a terminator for example, 0.6 kb GluB-1,3, a sequence terminator of plant storage protein glutelin and a 0.3 kb 10 kD prolamin terminator can be used in rice.
  • various terminators of plant genes registered in the DNA database can be selected and used.
  • variable region When using the above-mentioned method (B) in which ligated GLP-1 DNA is inserted into the variable region of a plant storage protein gene and expressed as a fusion protein, such a variable region includes: For example, three locations of the rice storage protein glutelin acidic subunit GluB-1 (regions of amino acids 140, 210, 270-310 from the N-terminus) and the C-terminal region of the basic subunit can be listed. Linked GLP-1 DNA can be inserted into the gene position encoding these variable regions. It is also possible to insert one linked GLP-1 DNA into the gene position encoding each of the above variable regions.
  • Gluterin belongs to the 11S globulin family (same as the glycine of soybean glycinin embatta), and even proteins other than glutelin belonging to this family are linked to the gene position encoding the variable region exemplified above.
  • GLP-1 DNA can be inserted.
  • rice globulin a member different from empaglobulin
  • ligated GLP-1 DNA is inserted into the gene region corresponding to amino acid residue No. 275 of glutelin GluA-2 and 305 ⁇ by base substitution to form part of glutelin.
  • Insertion of linked GLP-1 DNA into the DNA encoding the variable region of plant storage proteins can be performed using common genetic engineering techniques.
  • the linked GLP-1—DNA or linked GLP-1—DNA insertion storage protein DNA is combined with a plant storage organ-specific promoter DNA, a plant storage protein signal peptide sequence DNA, a terminator, and an appropriate vector. Insert into.
  • the vector is not particularly limited as long as it appropriately retains the ligated GLP 1 DNA by appropriately selecting various known vector forces in consideration of the type of plant to be expressed. Ligation into a vector GLP-1 DNA can be inserted by a ligase reaction using a restriction enzyme site according to a conventional method.
  • the vector into which the ligated GLP-1 DNA has been inserted is introduced into plant cells, and transformed plant cells obtained thereby are grown (redifferentiated).
  • methods for transformation by introducing a vector into plant cells include, for example, a method of introducing a vector into protoplasts using polyethylene glycol, a method of introducing a vector into protoplasts using electric pulses, and a vector using a particle gun method.
  • Some technologies have already been established, such as a method for directly introducing a vector and a method for introducing a vector via agrobacterium. Widely used.
  • the growth (redifferentiation) of the plant body from the plant cell into which the vector has been introduced and transformed in this manner can be performed by a known method according to the kind of the plant cell. In the present invention, these methods can be appropriately used.
  • the agrobacterium method for example, the method of Nagel et al. (Microbiol. Lett., 1990, 67, 325.) is used.
  • a vector is introduced into a bacterium and then the transformed bacterium is infected with a plant cell by a known method such as a leaf disk method. This plant cell is transformed. After acclimatization, the plant body regenerated from the transformed cell matures by cultivating under normal cultivation conditions, and it is possible to obtain a plant storage organ such as a seed.
  • the inserted vector is introduced into the plant cells together with an appropriate selection marker gene or a plasmid vector containing the selection marker gene.
  • selection marker genes include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene that confers resistance to the antibiotic neugromycin, the neomycin phosphotransferase gene that imparts metamorphosis to kanamycin or gentamicin, and the weeding.
  • a acetyltransferase gene that confers resistance to the agent phosphinothricin.
  • Plant cells into which the ligated GLP-1 DNA insertion vector has been introduced are placed on a known selection medium containing an appropriate selection agent according to the type of selection marker gene introduced together with the vector and cultured.
  • a drug resistance gene remains in the obtained plant or plant storage organ, resulting in a safety problem when eating the plant or plant storage organ containing the gene.
  • MAT vector registered in Bioscience and Industry Vol.55 No.3 (97) 210-212”
  • Trademark includes cytokinin-related genes, drug resistance genes, and DNA factors that have detachment ability.
  • cytokinin-related genes and drug resistance genes are located in a position where they have the same behavior as the DNA factor that has detachment ability.
  • Ligation GLP 1 Incorporates DNA with promoter and signal peptide sequence-enhanced DNA into the position, with the same behavior as the DNA factor with detachability It is preferable to use a paste. After introducing this recombinant vector into plant cells, culturing is carried out in a drug-added medium and non-drug-added medium, so that the cytokinin-related gene and drug-resistant gene are released, and the GLP-1 derivative without the drug-resistant gene is released. Accumulated transformants or plant storage organs can be obtained.
  • the plant cells into which the vector into which the ligated GLP-1 DNA has been inserted include all types of plant cells that can be regenerated into a plant body. Examples include plant cells such as scutellum in leaves, roots, stems, flowers, and seeds, callus, suspension culture cells, and the like, but these are not restrictive.
  • the host cell of the present invention is not necessarily a plant-derived cell, for example, E. coli, yeast or animal cell.
  • the present invention there is no particular limitation on the plant in which the vector into which the linked GLP-1 DNA is inserted and the GLP-1 derivative is accumulated, and the present invention is applicable to many types of plants.
  • it is an angiosperm, preferably a monocotyledonous plant, more preferably a grass plant.
  • examples of gramineous plants include cereals such as rice, wheat, barley, corn and the like, most preferably rice.
  • the GLP-1 derivative can be accumulated in various storage organs of these plants, particularly in the edible part.
  • the edible portion varies depending on the type of plant and is not necessarily limited. Examples thereof include seeds, leaves, roots and the like.
  • offspring can be obtained by sexual reproduction or asexual reproduction using the plant. It is also possible to obtain the plant body, its progeny or clonal force propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) and mass-produce the plant body based on them. Is possible.
  • progeny or clonal force propagation material for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.
  • a plant in which GLP-1 derivatives obtained as described above are accumulated or a plant reservoir thereof The government can easily incorporate the GLP-1 derivative into the body by human consumption of the site, and is useful as a crop for treating diabetes.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing diabetes including a site (leaves, stems, roots, seeds, etc.) where GLP-1 derivatives are accumulated.
  • the site can be provided as a food composition or a food or drink characterized by having a preventive and therapeutic action for diabetes.
  • a pharmaceutical composition or food composition for the treatment or prevention of diabetes comprising rice accumulated with GLP-1 derivatives obtained by the method of the present invention, or a component extracted therefrom. Or food and drink can be illustrated.
  • a food composition or food and drink When it is used as a food composition or food and drink, it can be subjected to cooking methods such as calorie heat, and further mixed with a food hygiene-acceptable formulation to produce health food, functional food, food for specified health use, It can be processed into nutritional supplements.
  • a stabilizer, a preservative, a colorant, a fragrance, a vitamin, and the like are added to and mixed with the above-described food composition as appropriate, and tablet, granule, granule, powder, capsule, cream, and cream are prepared by a conventional method. Or in liquid form.
  • GLP-1 derivative gene was incorporated alone, 2.3 kb dartellin GluB-1 promoter, glutelin signal peptide sequence, GLP-1 derivative peptide gene, 6 X His tag gene Endoplasmic reticulum tethering signal KDEL sequence and 0.6K GluB-1 3 'sequence terminator
  • the GLP-1 derivative 5-linked peptide gene sequence is inserted into the DNA encoding the variable region of the acidic subunit of glutelin (GluA-2), the major storage protein of C. rice, and the GLP —
  • An expression plasmid was prepared to express one derivative as part of glutelin. In other words, it consists of a 2.3kb glutelin GluB-1 promoter, a glutelin signal peptide sequence, a glutelin GluA-2 gene PREE99 with a GLP-1 derivative 5-linked peptide gene inserted, and a 0.6k GluB-1 3 'sequence terminator.
  • Expression plasmid 2 2.
  • 3k pGluB-PREE99 (mGLP-1x5) -GluB3 (Fig. 1 construct 3) was constructed. These plasmids were introduced into rice oysters by the agrobacterium method, and transformants were selected using hygromycin resistance as an index.
  • the inventors succeeded in accumulating a large amount of GLP-1 derivative in rice by expressing five linked GLP-1 derivative genes. Since GLP-1 derivatives did not express by themselves, it is highly useful to use linked GLP-1 DNA for the expression of GLP-1 derivatives. In addition, the accumulated amount of the 5-linked GLP-1 derivative was expressed at a higher concentration when expressed alone than when it was inserted into a storage protein and expressed as a fusion protein. This may be due to the fact that expression alone is less likely to be quantitatively limited as a storage protein.
  • the R gene site-specific recombination system desorption enzyme gene
  • ipt gene site-specific recombination system desorption enzyme gene
  • hygro The “MAT vector (registered trademark)” in which construct 1 shown in Test Example 1 A or construct 3 shown in Test Example 1 C was placed outside the region sandwiched by this RS sequence while arranging the mycin phosphotransferase gene ”And create the former pTL7GluB- (mGLP-lx5) -GluBT-130Hm [Independent Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (address: 1-chome, 1-chome, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan)] International accession number: FERM BP—10020], the latter
  • pTL7GluB-PREE99 (mGLP-1x5) -GluBT-130Hm [International accession number based on the Budapest Treaty at the same biological deposit center: FERM BP-10021].
  • each of these vectors was introduced into rice Nipponbare using the agrobaterum method, and transformants were selected using hygromycin resistance as an index! ⁇ , and the selected transformants were analyzed! went.
  • the transformant obtained from either pTL7GluB- (mGLP-1x5) -GluBT-130Hm or pTL7GluB-PREE99 (mGLP-1x5) -GluBT-130Hm was obtained from the transformant.
  • a signal presumed to be a GLP-1 derivative 5-linked peptide was detected by Western plotting of the ripened seed extract, and the accumulation of GLP-1 derivative 5-linked peptide was confirmed. ( Figures 5 and 6).
  • Test Example 1-A Strength The obtained GLP-1 derivative-integrated rice was used to measure the content of GLP-1. That is, 1 grain of rice (with outer skin) was put into a micro tube with 2nd packing, and powdered at 2500 rpm, lOsec using a bead shocker (manufactured by Yasui Instruments Co., Ltd.). Thereafter, 1 ml of extraction buffer (50 mM Tris-HC1 buffer (pH 6.8) containing 4% sodium dodecyl sulfate, 8M urea, 0.5% 2-mercaptoethanol) was added and stirred until dissolved. This dissolved solution was dialyzed against purified water at 4 ° C overnight (1 L x 3 times). Centrifugation was performed at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected to obtain a GLP-1 derivative extract.
  • extraction buffer 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 6.8) containing 4% sodium dodecyl sulfate, 8M
  • GLP-1 derivative extract 8 / zl, 50 mM ammonium bicarbonate (pH 7.8) 112 ⁇ 1, 83 ⁇ g Zml trypsin solution (Promega: Cat. No. V5113) 6 ⁇ 1 was added.
  • the GLP-1 derivative-linked peptide was converted into a simple GLP-1 derivative by reacting at 37 ° C. for 2 hours.
  • 9 5% ethanol 462 1 was added to stop the reaction, and the supernatant was collected by centrifugation at 15, OOOrpm for 5 minutes at 4 ° C, and dried to dryness by centrifugal evaporation. The dried product was dissolved, and the content was measured with a RIA kit (manufactured by LINCO, GLP-1 (total) RIAkit).
  • GLP-1 derivatives The thermal stability of GLP-1 derivatives obtained from 5-linked peptide-expressing rice was compared with that of natural GLP-1 and GLP-1 derivatives obtained by synthesis of V varieties. Distilled water was added to GLP-1 derivative 5-linked peptide-expressing rice (Test Example 1-A above), heat-treated at 100 ° C for 15 minutes, extracted as in Test Example 4, and further treated with trypsin to give GLP-1 A derivative simple substance was obtained. On the other hand, synthetic natural GLP-1 and synthetic GLP-1 derivative peptides are 10 ⁇ l in 0.2% BSA solution. Heat treated at 100 ° C for 15 minutes.
  • the hypoglycemic effect of GLP-1 derivative 5-linked peptide-expressing rice was examined.
  • the control rice used was the same non-transformed rice bamboo as the rice used for GLP-1 gene transfer. After each rice was polished and soaked, it was cooked at 100 ° C for 15 minutes with 3.8 times the water of rice weight. Then, it was crushed and made uniform in a paste form.
  • the control rice and the GLP-1 derivative 5-linked peptide-expressing rice were fed to normal mice (Crj: ICR, 8w, o 71 ), each of which contained the same amount of lOOmg equivalent to the glucose level.
  • the dose of GLP-1 derivative was determined by measuring cAMP production activity of cooked rice in the same manner as in Test Example 4, and was calculated to be about 1.
  • GLP-1 peptide 50-150 / zg was required to obtain a blood glucose lowering effect.
  • the human body weight is 60 kg
  • the amount of GLP-1 peptide required to induce hypoglycemia in humans is 150 mg to 450 mg.
  • the rice of the present invention can be used to reduce blood sugar in a cup of rice for humans. Can be ingested.
  • the present inventors have succeeded in developing a plant in which the GLP-1 derivative is highly accumulated in a plant and the peptide having a therapeutic effect is accumulated, thereby completing the present invention.
  • the present invention can provide a transformed plant in which GLP-1 derivatives are accumulated and Z or a plant reservoir thereof.
  • a transformed plant in which GLP-1 derivatives are accumulated and Z or a plant reservoir thereof.
  • rice or the like on which GLP-1 derivatives are accumulated is provided.
  • blood sugar can be lowered, which is useful for the treatment of diabetes.

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Abstract

　安価にＧＬＰ−１誘導体が経口摂取できる方法を開発し、糖尿病治療に役立てるために、ＧＬＰ−１誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法を提供するものである。ＧＬＰ−１（７−３６）、又はそのアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列でＣ末端がArg又はLysからなり、かつＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１誘導体をコードするＤＮＡをｎ個（ｎは３以上の整数）直列に繋いだ連結ＧＬＰ−１−ＤＮＡをベクター中に組み込んで植物細胞中に導入し、得られた形質転換体を再分化させることにより、ＧＬＰ−１誘導体が消化酵素で分断可能に集積された形質転換植物又はその植物貯蔵器官を生産する。該形質転換植物及び植物貯蔵器官は、糖尿病の治療又は予防用の医薬組成物或いは飲食品として有効である。

Description

明 細 書
GLP— 1誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法 技術分野
[0001] 本発明は、医薬品分野力 食品分野にまたがるもので、 GLP— 1誘導体が集積され た形質転換植物及びそこから得られる植物貯蔵器官と、その生産方法、更には、該 植物或いは植物貯蔵器官を用いた糖尿病の治療若しくは予防のための、医薬組成 物、又は飲食品材料或いは飲食品に関する。
背景技術
[0002] GLP-1 (Glucagon like peptide- 1)は食物摂取により消化管より分泌され、脾臓に 働 、て糖濃度依存的なインスリン分泌を刺激するホルモンとして知られて 、る。 2型 糖尿病患者では、この GLP— 1に対する応答性は維持されている力 量的な不足が いわれている。 GLP— 1製剤の開発は、 GLP— 1の不足分を補い、インスリン分泌促 進剤としての糖尿病治療薬への応用に期待が持たれて ヽる。
[0003] しかしながら、 GLP— 1の活性本体は GLP— 1 (7—36) amide或いは GLP—1 (7—37 )のポリペプチドであり、単なる GLP— 1の経口摂取では消化管内で消化酵素により 消化'分解され、十分に機能しない。このため臨床では、点滴による静脈内注射や皮 下注射が試みられているのが現状である。しかも、 GLP— 1は、血中や組織に存在す るジぺプチジルぺプチダーゼ IV(DPP-IV)によって分解を受け、活性半減期が 1一 2 分と非常に短いことや、腎臓力 排泄され易く血中半減期が 5分以内であることが報 告されており、これらが臨床応用へのネックになっている。そこで、分解されに《半 減期の長い GLP-1誘導体の開発が行われている。例えば、 8位アミノ酸置換誘導体 (Diabetologia 41: 271-278 (1998), Biochem 40: 2860-2869 (2001))、 N末端および C 末端アミノ酸の修飾体 (WO9808871など）、 34位を Argに置換し 26位 Lysに疎水性 基を導入した誘導体 (WO0007617)、及び配列全般に渡るアミノ酸置換による誘導 体 (WO9943705、 W09111457)である。また、皮下からの吸収が遅い徐放型注 射剤の開発等が行われている。しかし、これらは注射剤であり、患者の負担を考慮す ると、注射以外の経路で投与される GLP— 1が望まれる。 [0004] 一方、遺伝子工学技術を利用した医薬品、臨床検査薬や工業原料の生産は、既 に実産業において多大の貢献をなしており、中でも微生物又は哺乳類培養細胞を 宿主とした物質生産系は広く利用されている。し力しながら、これらの細胞を培養する には、無菌環境が整った培養設備や培地等の設備が必要であり、その培養はコスト 高となっている。また、哺乳類細胞を宿主として用いた場合には、人体に有害なウイ ルスの混入リスクが避けられない。そのため、微生物や哺乳類細胞の培養による物質 生産にかわる、安価で安全な形質転鎌物を用いた物質生産システムの開発が行 われている。例えば、生分解性ポリエステル等の高分子化合物（例えば、特開 2002 —262886号公報）、ワクチン（例えば、 G. Jaeger et al, Eur. J. Biochem. 259, 426,
1999)やラタトフエリン（D. Chong et al., Transgenic. Res. 9, 71, 2000)等のタンパク 質、エンケフアリン (特開 2000-106890号公報)等のペプチドを生産する形質転換 植物の作製が現在までに報告されて 、る。
[0005] 形質転換植物の場合、その植物の可食部、例えば、ダイズゃイネの種子、野菜の 葉などで人体に有益な機能性物質を生産させれば、目的物質の抽出工程を経ること なぐ直接人体に経口摂取することが可能である。更に、種子の場合には、冷蔵装置 の完備した設備で保存や輸送を行う必要がなぐ室温での安定的な長期保存が可能 である。また、目的の物質を抽出する場合にも、種子は葉と異なり、フエノール性物質 の混入がほとんどないため、容易に精製することができる。したがって、種子は目的 の遺伝子産物を生産させる器官として理想的と考えられ、これまでに、例えば、グリシ ニン (T. Katsube et al., Plant. Physiol. 120, 1063, 1999)等のタンパク質、（1, 3—1, 4 )— j8—グルカナーゼ (H. Horvath et al., Proc. Nathl. Acad. Sci. USA., 97, 1914,
2000)等の酵素、エンケフアリン（D. Chong et al., Transgenic. Res., 9, 71, 2000)等の ペプチドを産生する種子の作製が報告されて 、る。
発明の開示
[0006] GLP— 1は糖尿病治療に有用なことが認められている力 ポリペプチドであるがため に、現状では注射以外に有効な投与方法がない。経口投与では GLP— 1が効果を 発揮するには多量に投与する必要があり、高価なものになっている。そこで本発明の 課題は、経口摂取できる植物に GLP— 1誘導体を大量発現させて、それを経口摂取 することにより、 GLP— 1誘導体を十分に経口摂取できる方法、即ち、 GLP— 1誘導体 が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法を提供することにある。更に、 本発明の究極の目的は、安価に GLP— 1誘導体が経口摂取できる方法を開発し、糖 尿病治療に役立てることにある。
[0007] GLP— 1は、植物にその発現を確認した例はない。また、たとえ遺伝子組換えにより 遺伝子を導入し、植物体あるいは植物貯蔵器官内で発現を試みても、アミノ酸数 30 個からなる低分子ペプチドであるため異物として認識されやすぐ蓄積しない可能性 があった。そこで、本発明者らは、適度な分子量を確保しつつ高発現を実現するた めに、 GLP— 1誘導体を数個連結したペプチドをコードする人工遺伝子を調製し、植 物に導入することにした。また、 GLP— 1誘導体が発現'蓄積した植物もしくは植物貯 蔵器官が摂食され消化吸収を受ける間に、連結して発現した GLP— 1誘導体が、内 因性のトリプシンもしくはトリプシン様活性を持つ酵素による切断を受けて単体の GL P— 1誘導体になるように、各 GLP— 1誘導体の C末端には、トリプシンおよびトリプシン 様酵素の認識部位となるアルギニン (Arg)残基又はリジン (Lys)残基を置!、た。この ような思考の経緯で、本願発明は完成された。
[0008] 即ち、本願発明は、 GLP-1 (7-36)、又は GLP—1 (7—36)のアミノ酸配列の 1若し くは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列で C末端が Arg又は Lys からなり、かつ GLP— 1活性を有するアミノ酸配列の力もなる、 GLP— 1誘導体をコー ドする DNAを n個（nは 3以上の整数）直列に繋!、だ連結 GLP— 1 DNAをベクター 中に組込んで植物細胞中に導入し、得られた形質転換体を再分化させることを特徴 とする、 GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可能に集積された形質転換植物又はその 植物貯蔵器官を生産する方法力 なる。
[0009] ここで、前記連結 GLP— 1 DNAは、植物貯蔵器官特異的プロモーター DNA及び 植物貯蔵タンパク質シグナルペプチド配列をコードする DNAの下流に位置させて、 ベクター中に組込むことができる。また更に、前記連結 GLP— 1 DNAは、植物の貯 蔵タンパク質 DNAの可変領域をコードする DNA領域へ挿入又は塩基置換した形で ベクター中に組み込むこともできる。他にも、前記連結 GLP— 1 DNAは、サイトカイ ニン関連遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有する DNA因子とともに、サイト力 ィニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子が脱離能を有する DNA因子と挙動を一にする 位置に、また、連結 GLP— 1 DNAが脱離能を有する DNA因子とは挙動を一にしな い位置に位置するようにベクター中に組込むこともできる。この 3つ目の方法では、該 組み換えベクターが導入された植物細胞を、薬剤添加培地及び薬剤非添加培地に て培養を行って形質転換体を再分化させることにより、宿主細胞中に連結 GLP - 1 - DNAを導入する際の指標として用いる選抜マーカー遺伝子が除去された形質転換 植物又はその植物貯蔵器官を最終的に得ることができるので、好ましい。尚、これら の連結 GLP— 1 DNAをベクター中に組み込む方法を組み合わせて使用してもよ!ヽ
[0010] また、使用する GLP— 1誘導体としては、 GLP— 1アミノ酸配列の 26位をグルタミン に、 34位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換した GLP— 1誘導体や、アミノ酸 配列の 8位をセリン又はグリシンに置換した GLP— 1誘導体が好適である。 GLP— 1誘 導体をコードする DNAの連結数 nは、好ましくは 4一 8であり、 5が最適である。使用 する植物としては、特に限定されることはないが、単子葉植物が好ましぐイネ等を例 示することができる。
[0011] 本願発明は更に、これらの方法を実施することにより得られた、 GLP— 1誘導体が集 積される形質転換植物又はその植物貯蔵器官にも係る。これらの GLP - 1誘導体が 集積される植物又は植物貯蔵器官は、糖尿病の治療若しくは予防のための医薬組 成物、飲食品材料、或いは飲食品として利用される。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]第 1図は、 GLP— 1誘導体を発現させるために構築した遺伝子構造を示す図で ある。 Constructlは GLP— 1誘導体 5連結ペプチドを単独で発現させるための遺伝子 構造 (試験例 1 A)であり、 Constructは連結なしの GLP— 1誘導体ペプチドを単独で 発現させるための遺伝子構造 (試験例 1 B)、 Constructはイネの主要な貯蔵タンパ ク質であるグルテリン (GluA-2)の酸性サブユニットの可変領域に GLP— 1誘導体 5連 結ペプチドを挿入して、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドをグルテリンの一部として発現 させるための遺伝子構造 (試験例 1 C)を示している (試験例 1参照)。
[図 2]第 2図は、 Constructl (試験例 1 A)を導入して得られた独立した各形質転換ィ ネ由来のコメの系統別 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの解析結果を示す図である。 各系統 4粒を用いて実施し、上段が電気泳動パターンで、その下段にウェスタンプロ ティングにより GLP-1誘導体を検出した結果を示している。 No.2, 3, 5, 6, 14, 21, 23, 26, 30, 15, 24に GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの発現が認められている (試 験例 2参照)。
[図 3]第 3図は、 Construct2 (試験例 1-B)を導入して得られた独立した各形質転 ネ由来のコメの系統別の解析結果を示す図である。ノーザンブロットティング、ウェス タンプロットティング、 SDS— PAGE電気泳動で、すべての系統において GLP— 1誘 導体のシグナルは検出されな力つた。 （試験例 2参照)。
[図 4]第 4図は、 Construct3 (試験例 1-C)を導入して得られた独立した各形質転 ネ由来のコメの系統別の SDS— PAGE電気泳動とウェスタンブロティング解析結果を 、 Constructl (試験例 1 A)との比較で示す図である。グルテリンの一部として発現さ せる形質転換体では、 GLP— 1誘導体の発現が認められたが、その発現量は Constructlに比べて低かった (試験例 2参照)。
[図 5]第 5図は、 pTL7GluB- (mGLP- 1x5)- GluBT- 130Hm (試験例 3)を導入し発現させ たイネ力 得られたコメの系統別 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの解析結果を示す図 である。上段が電気泳動パターンで、その下段にウェスタンブロティングにより GLP— 1誘導体を検出した結果を示して 、る。
[図 6]第 6図は、 pTL7GluB- PREE99(mGLP- 1x5)- GluBT- 130Hm (試験例 3)を導入し 発現させたイネ力 得られたコメの系統別 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの解析結果 を示している。上段が電気泳動パターンで、その下段にウェスタンプロティングにより GLP— 1誘導体を検出した結果を示す図である。
[図 7]第 7図は、 Constructl (試験例 1 A)を導入し発現させたイネカゝら得られたコメ 中の GLP—1誘導体 5連結ペプチドの含量を、ラジオィムノアッセィ（RIA)と cAMP 産生活性で測定したもの示す図である (試験例 4参照)。
[図 8]第 8図は、 Constructl (試験例 1 A)を導入し発現させたイネカゝら得られたコメ 中の GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの熱安定性を調べた結果を示す図である（試験 例 5参照)。 [図 9]第 9図は、 Constructl (試験例 1 A)を導入し発現させたイネ力 得られたコメ（ GLP - 1誘導体 5連結ペプチド発現)を用いて、正常マウスでの血糖低下作用を調べ た結果を示す図である (試験例 6参照)。
[図 10]第 10図は、 Constructl (試験例 1—A)を導入し発現させたイネカゝら得られたコ メ (GLP— 1誘導体 5連結ペプチド発現)を用いて、 2型糖尿病モデルマウス KK-Ayで の血糖低下作用を調べた結果を示す図である (試験例 7参照)。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の実施に用いる GLP— 1誘導体は、 GLP— 1 (7— 36)又はそのアミノ酸配列 の 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列で C末端が Arg 又は Lysからなり、かつ GLP— 1活性を有する GLP— 1誘導体である。言い換えれば、 GLP— 1の前駆体、類縁体、又はこれらの C末端アミド体で、 C末端のアミノ酸が Arg 又は Lys力もなるものである。このような GLP— 1誘導体としては、経口摂取されること から、アミノ酸置換によりトリプシン及び Z又はジぺプチジルぺプチダーゼ IV (DPPIV )に耐性型のものが好ましい。即ち、 GLP—1アミノ酸配列の 26位をグルタミンに、 34 位をァスパラギン又はァスパラギン酸に置換したトリプシン耐性 GLP— 1誘導体や、ァ ミノ酸配列の 8位をセリン又はグリシンに置換した DPPIV耐性 GLP— 1誘導体が好適 である。中でも、これらの両者の置換を有するトリプシン及び DPPIVに耐性の GLP— 1誘導体が最適である (GLP - 1誘導体：配列表の配列番号 1： [Ser8,Gln26,Asn34] - GLP- 1)。
[0014] 上記 GLP— 1誘導体をコードする DNAは、ゲノム DNA、 cDNA、及び当該べプチ ドのアミノ酸配列情報を基に化学合成 DNAから調製でき cDNAの調製は、当業者 の常套手段を利用して行うことが可能である。また、 DNAの合成は、市販の DNA合 成機等を利用して、適宜実施することができる。その際、植物の貯蔵タンパク質遺伝 子でよく使用されるコドンを参考に、アミノ酸の縮重等を考慮して目的の DNAに改変 することができる。イネ種子の場合には、イネ種子で効率良く翻訳されるように、当該 ペプチドをコードする DNA配列を、イネ種子貯蔵タンパク質遺伝子にお!ヽて高頻度 に使用されるコドンに倣って作製することができる。
[0015] 上記で得られた GLP— 1誘導体の DNAを、常套手段によって直列に結合させる。 本発明では、 GLP— 1誘導体を 3個以上連結させて発現させることを特徴とする。 3個 以上連結させることにより、植物体中で安定した GLP— 1誘導体の発現が期待でき、 GLP— 1誘導体を高濃度に含有した植物又は植物貯蔵器官を得ることができる。 GL P— 1誘導体をコードする DNAの連結数 nは、好ましくは 4一 8であり、 5が最適である
[0016] 連結させた GLP—1誘導体の DNA、すなわち連結 GLP—1—DNAは、（A)単独で 発現させるか、もしくは、（B)植物貯蔵タンパク質遺伝子の可変領域の中に挿入して 融合タンパクとして発現させることができる。（A)の方法においては、そのまま組み込 み、 GLP— 1誘導体を単独で発現'集積させることによって、食べた時に消化を受け ないで直接口腔内から吸収されることが期待される。一方、（B)の方法においては、 例えば、植物貯蔵タンパク質であるグルテリンの可変領域の中に挿入し、グルテリン 貯蔵タンパク質の一部として発現'集積させることによって、小腸力も吸収されること が期待される。どちらの方法においても、連結 GLP— 1 DNAは、その 5'末端に植物 貯蔵タンパク質シグナルペプチド配列をコードする DNAを付加し、植物貯蔵器官特 異的プロモーターの制御下で発現させることができる。
[0017] 連結 GLP— 1 DNAを植物体内において植物貯蔵器官特異的プロモーターの制 御下で発現させるためには、通常、当該 DNAの発現が可能なように植物貯蔵器官 特異的プロモーターと当該 DNAとを結合させた DNAを、植物へ導入することによつ て実施することができる。プロモーターの制御を受けるように該プロモーターの下流に 発現させたい所望の DNAを配置させることは、一般的な遺伝子工学技術を用いて 実施することができる。
[0018] 植物貯蔵器官特異的プロモーターは、発現させた!/ヽ遺伝子の種類や導入する細 胞の種類に応じて、公知のプロモーターを適宜選択又は改変して使用することがで きる。例えば、好適に使用可能なプロモーターとしては、植物貯蔵タンパク質ダルテリ ン GluB-1プロモーターが挙げられる。その他にも、グルテリン GluB- 4プロモーター、 26kDグロブリンプロモーター、 10 kDプロラミンプロモーター、および 16 kDプロラミン プロモーター等を挙げることができる。これらのプロモーターの長さは通常 0. 8kb以 上であり、好ましくは 2. 3kb以上であるが、機能を有する限り、この長さに特に制限さ れるものでな ヽ。連結 GLP— 1 DNAを植物貯蔵タンパク質をコードする DNAに揷 入する場合には、通常、植物貯蔵タンパク質をコードする DNAの上流に本来備わつ ているプロモーターを、上記のプロモーターとして利用することができる。もっとも、本 発明にお 、て連結 GLP— 1 DNAの制御に用いるプロモーターは、上記植物貯蔵 器官特異的プロモーターに限定されるものではなぐ植物ウィルス由来のプロモータ 一等のプロモーターであってもよぐ GLP— 1誘導体^^積させようとする植物又は植 物貯蔵器官に応じて適宜選択することができる。
[0019] 植物貯蔵タンパク質シグナルペプチド配列としては、公知の種々の植物貯蔵タンパ ク質シグナルペプチド配列を、適宜、使用することができる。植物貯蔵タンパク質シグ ナルペプチド配列のアミノ酸配列に関する情報は、公知の文献等により容易に入手 できる。植物貯蔵タンパク質シグナルペプチド配列としては、好ましくは、グルテリン (GluB-1)タンパク質のシグナルペプチド配列を用いることができる。即ち、 MASSVF SRFSIYFCVLLLCHGSMAの配列である。また、他のグルテリン（GluA-2)のシグ ナルペプチド配列である MASINRPIVFFTVCLFLLCDGSLA、又は 26kDのグ ロブリンのシグナルペプチド配列である MASKWFFAAALMAAMVAISGAQを 用いることもできる。これらの植物貯蔵タンパク質シグナルペプチド配列をコードする DNAの調製は、アミノ酸配列の縮重等を考慮して、適宜、市販の DNA合成機等を 禾 IJ用することができる。尚、連結 GLP— 1 DNAの 5'末端への植物貯蔵タンパク質シ グナル配列をコードする DNAの付カ卩は、公知の遺伝子工学技術を利用して行うこと ができる。
[0020] 更に、連結 GLP—1— DNA、ある!/ヽは連結 GLP—1— DNA挿入貯蔵タンパク質 DN Aの 3'末端に、ターミネータ一を付加する。ターミネータ一としては、例えば、イネで は植物貯蔵タンパク質グルテリンの 0. 6kb GluB- 1,3，配列ターミネータ一や、 0. 3k b 10kDプロラミンターミネータ一が使用できる。その他にも、ノパリン合成酵素のター ミネ一ター、ォクトピン合成酵素のターミネータ一を始め、 DNAデーターベースに登 録されて!/、る植物遺伝子のターミネータ一を種々選択して使用することができる。
[0021] 連結 GLP— 1 DNAを植物貯蔵タンパク質遺伝子の可変領域に挿入して融合タン パクとして発現させる前記 (B)の方法を使用する場合、このような可変領域としては、 例えばイネの貯蔵タンパク質グルテリン酸性サブユニット GluB-1の 3ケ所 (N末端から アミノ酸 140、 210、 270— 310の領域）、及び塩基性サブユニットの C末端領域を挙 げることができる。これらの可変領域をコードする遺伝子位置へ連結 GLP— 1 DNA を挿入することができる。また、上記のそれぞれの可変領域をコードする遺伝子位置 に、連結 GLP— 1 DNAを 1個ずつ挿入することも可能である。尚、グルテリンは 11S グロブリンファミリー（ダイズのグリシニンゃェンバタのグロブリンが仲間）に属し、この ファミリーに属するグルテリン以外のタンパク質であっても、上記で例示した可変領域 をコードする遺伝子位置へ連結 GLP— 1 DNAを挿入することができる。また、イネグ ロブリン (ェンパクグロブリンとは異なる仲間）の場合には、 N末端から 110くらいの可 変領域をコードする遺伝子位置へ連結 GLP— 1 DNAを挿入することが可能である 。本法の 1例を示せば、グルテリン GluA-2のアミノ酸残基 No. 275力ら 305〖こ相当す る遺伝子領域に連結 GLP— 1 DNAを塩基置換により挿入して、グルテリンの一部と して発現させる方法が挙げられる。連結 GLP— 1 DNAを植物貯蔵タンパク質の可 変領域をコードする DNAへ挿入することは、一般的な遺伝子工学技術を用いて実 施できる。
[0022] 次に連結 GLP—1—DNA、あるいは連結 GLP— 1— DNA挿入貯蔵タンパク質 DNA は、植物貯蔵器官特異的プロモーター DNA及び植物貯蔵タンパク質シグナルぺプ チド配列 DNA、ターミネータ一とともに、適当なベクターに挿入する。ベクターは、発 現させたい植物の種類を適宜考慮して公知の種々のベクター力 選択し、連結 GLP 1 DNAを安定に保持するものであれば特に制限されな 、。ベクターへの連結 GL P— 1 DNAの挿入は、常法に従って、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行 うことができる。
[0023] 連結 GLP— 1 DNAを挿入されたベクターは、植物細胞に導入し、これより得られ た形質転換植物細胞を生育 (再分化)させる。植物細胞にベクターを導入して形質転 換を行う手法については、例えば、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへベタ ターを導入する方法、電気パルスによりプロトプラストへベクターを導入する方法、パ 一ティクルガン法により細胞へベクターを直接導入する方法、およびァグロバクテリウ ムを介してベクターを導入する方法など、いくつかの技術が既に確立し、当技術分野 において広く用いられている。また、こうしてベクターが導入され、形質転換された植 物細胞からの植物体の生育 (再分化）は、植物細胞の種類に応じて公知の方法で行 うことが可能である。本発明においては、これらの方法を適宜利用することができる。 上記ァグロバタテリゥム法を用いる場合、例えば Nagelらの方法 (Microbiol. Lett., 1990, 67, 325.)が用いられる。この方法によれば、ベクターをァグロバタテリゥム細菌 中に導入して、次いで形質転換されたァグロバタテリゥムを、リーフディスク法等の公 知の方法により植物細胞に感染させることで、この植物細胞を形質転換する。形質転 換細胞から再分化させた植物体は、順化後、通常の栽培条件で栽培することで成熟 し、結実して種子等の植物貯蔵器官を得ることも可能となる。
[0024] その際、形質転換された植物細胞を効率的に選択するために、挿入されるべクタ 一は、適当な選抜マーカー遺伝子又は選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクタ 一と共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺 伝子としては、例えば抗生物質ノヽィグロマイシンへの耐性を付与するハイグロマイシ ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンへの而'性を付 与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシン への耐性を付与するァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
[0025] 連結 GLP— 1 DNA挿入ベクターを導入した植物細胞は、該ベクターと共に導入さ れた選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用 培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる 。しかし、得られる植物あるいは植物貯蔵器官には薬剤耐性遺伝子が残ることになり 、それを含む植物あるいは植物貯蔵器官を食する際の安全性の問題が生じる。この 問題点の解決のためには、連結 GLP— 1 DNAの導入用ベクターとして、例えば、 バイオサイエンスとインダストリ一 Vol.55 No.3(97)210- 212等に記載の「MATベクター (登録商標）」を使用することができる。ここでは、サイトカイニン関連遺伝子、薬剤耐 性遺伝子及び脱離能を有する DNA因子を含み、このうちサイトカイニン関連遺伝子 と薬剤耐性遺伝子は脱離能を有する DNA因子と挙動を一にする位置に存在し、連 結 GLP— 1 DNAにプロモーターおよびシグナルペプチド配列をコードする DNAを 付加した DNAを、脱離能を有する DNA因子とは挙動を一にしな 、位置に組込み込 んだものを使用するのが好適である。この組み換えベクターを植物細胞に導入した 後、薬剤添加培地及び薬剤非添加培地にて培養を行うことにより、サイトカイニン関 連遺伝子と薬剤耐性遺伝子が離脱し、薬剤耐性遺伝子のない、 GLP-1誘導体が集 積された形質転 物又は植物貯蔵器官を得ることができる。
[0026] 連結 GLP— 1 DNAを挿入されたベクターを導入する植物細胞としては、植物体に 再生可能なあらゆる種類の形態の植物細胞が含まれる。例えば、葉、根、茎、花およ び種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられるが、これら〖こ 制限されるものではない。本ベクターの保存、複製等が目的の場合には、本発明の 宿主細胞は、必ずしも植物由来の細胞である必要はなぐ例えば、大腸菌、酵母また は動物細胞等であってもよ 、。
[0027] 尚、本発明にお 、て連結 GLP— 1— DNAが挿入されたベクターを導入し、 GLP— 1 誘導体を集積させる植物には特に制限はなく、本発明は多くの種類の植物に適用で きる。例えば、被子植物であり、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植 物である。イネ科植物の例としては、イネ、コムギ、ォォムギ、トウモロコシ等の穀類を 挙げることができるが、最も好ましくはイネである。また使用するプロモーターを適宜 選択することにより、 GLP— 1誘導体をこれらの植物の様々な貯蔵器官、特に可食部 位に集積させることができる。可食部位は、植物の種類によって異なるため、必ずしも 限定されるものではないが、例えば、種子、葉、根等を挙げることができる。より具体 的には、イネ、コムギ、トウモロコシ等の場合は胚乳、ダイズなどのマメ類の場合は子 葉ゃ胚、ジャガイモ等の塊茎、にんじんの根、トマトやバナナ等の果実を挙げることが できる。双子葉植物であっても、例えば、双子葉植物の種子プロモーター、例えば、 子葉ゃ胚特異的プロモーターを利用することにより、マメ等の植物へも GLP— 1誘導 体を集積させることが可能である。
[0028] ー且本発明の形質転換植物体が得られれば、該植物体力ゝら有性生殖または無性 生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローン 力 繁殖材料 (例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等 )を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
[0029] 以上のようにして得られる GLP— 1誘導体を集積させた植物又はその植物貯蔵器 官は、当該部位をヒトが食することにより、 GLP— 1誘導体を容易に体内に取り入れる ことができ、糖尿病治療用作物として有用である。例えば、 GLP-1誘導体が集積し た部位 (葉、茎、根、種子等)を含む、糖尿病の治療または予防のための医薬組成物 を提供することができる。さらに当該部位は、糖尿病の予防、治療作用を有することを 特徴とする食品組成物又は飲食品としても提供することができる。より具体的には、 本発明の方法によって得られる GLP— 1誘導体が集積したコメであり、またはこれらか ら抽出される成分を含む、糖尿病の治療または予防のための医薬組成物、食品組成 物又は飲食品を例示することができる。食品組成物又は飲食品とする場合には、カロ 熱等の調理法に供することができ、さらに食品衛生上許容される配合物を混合して、 健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品等に加工して利用すること ができる。例えば、安定化剤、保存剤、着色料、香料、ビタミン等の配合物を上記食 品組成物に適宜添加混合し、常法により、錠剤状、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル 状、クリーム状、又は液状の形態とすることができる。
実施例
[0030] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[0031] [試験例 1]GLP— 1誘導体 5連結ペプチド発現プラスミドの作製とイネキタァケへの 導入
GLP - 1誘導体 (配列表の配列番号 1： [Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-l)の 5連結ペプチド をコードする DNAを得るために、始めに、平滑末端を持つ GLP— 1誘導体をコードす る cDNAを 3，→5，exonuclease活'性を持つ DNA polymerase (KOD— Plus— ,
TOYOBO)を用いた PCRにより増幅させた。その増幅産物を T4 DNA ligase (ligation high, TOYOBO)により self- ligationした後、制限酵素処理（EcoRV)により平 滑末端にしたプラスミド (pBS SK+)に導入した。得られたプラスミドを大腸菌に形質転 換し培養した後、 PCRにより最も長い導入遺伝子を含むプラスミドを選択した。その 後、プラスミドの単離および塩基配列の決定を行い、連結した GLP— 1の cDNAの向 きを確認し、それぞれの cDNAが同一方向に並んで導入されているプラスミドを選択 することにより、 GLP—1誘導体 5連結ペプチドをコードする 5連結 GLP—1— DNAを 得た。
[0032] A.上記 DNAを用いて、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドをイネ種子中で発現させる ための発現プラスミドを作製した。すなわち、イネ種子主要タンパク質である 2. 3kbグ ルテリン GluB-1のプロモーター、グルテリンシグナルペプチド配列、 GLP— 1誘導体 5 連結ペプチド遺伝子、および 0. 6k GluB-1 3'配列ターミネータ一力 なる発現プラ スミド 2. 3kpGluB-SP(GluB)-mGLP-lx5-GluB-3' (図 1 construct 1)を構築した。 Constructlの DNA配列は配列表の配列番号 2で示され、該 DNAによってコードさ れる GLP— 1誘導体 5連結ペプチドを含むアミノ酸配列を配列表の配列番号 3に示し た。
[0033] B.比較として、前記 GLP— 1誘導体遺伝子を単体で組み込んだ、 2. 3kbダルテリ ン GluB-1のプロモーター、グルテリンシグナルペプチド配列、 GLP— 1誘導体べプチ ド遺伝子、 6 X Hisタグ遺伝子、小胞体係留シグナル KDEL配列および 0. 6K GluB-1 3'配列ターミネータ一力 なる発現プラスミド 2. 3k
pGluB-SP-mGLP-l(6xHis- KDEL)- GluB- terminator (図 lconstruct 2)を構築した。
[0034] C.イネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリン（GluA- 2)の酸性サブユニットの可 変領域をコードする DNAに前記 GLP— 1誘導体 5連結ペプチド遺伝子の配列を挿 入して、 GLP— 1誘導体をグルテリンの一部として発現させるための発現プラスミドを 作成した。すなわち、 2. 3kbグルテリン GluB-1のプロモーター、グルテリンシグナル ペプチド配列、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチド遺伝子を挿入したグルテリン GluA-2遺 伝子 PREE99および 0. 6k GluB- 1 3'配列ターミネータ一からなる発現プラスミド 2. 3k pGluB- PREE99(mGLP- 1x5)- GluB3，（図 1 construct 3)を構築した。これらのプラスミド をァグロバタテリゥム法によりイネキタァケに導入して、ハイグロマイシン耐性を指標と して形質転換体の選抜を行った。
[0035] [試験例 2]ハイグロマイシン耐性遺伝子により選抜された形質転換体種子における GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの検出
試験例 1の A, B, Cで得られた形質転換体について、その種子を用いて解析を行つ た。
まず、 GLP— 1誘導体遺伝子を 5つ組み込んだ前記試験例 1-Aの 2. 3k PGluB-SP(GluB)-mGLP-lx5-GluB-3 'による形質転換体の解析を行った。上記形質 転換体より得られた登熟種子の抽出液のウェスタンプロティングにより、 23系統のう ち 11系統で GLP— 1誘導体 5連結ペプチドと推定されるシグナルが検出され、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの発現を確認した。（図 2)。
[0036] 一方、 GLP— 1誘導体遺伝子を 1つだけ組み込んだ前記試験例 1-Bの 2. 3k
pGluB-SP- mGLP- l(6xHis-KDEL)- GluB- terminatorプラスミドベクターによる形質転 換体 24系統の解析では、ノーザンブロットティング、ウェスタンブロットティングで GLP 1誘導体は検出されなかった。 （図 3)。
[0037] また、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドをグルテリンの一部として発現させる前記試験 例 1- Cの 2. 3k pGluB- PREE99(mGLP- 1x5)- GluB3，による形質転換体では、 22系 統のうち 10系統で GLP— 1誘導体の発現が認められた。しかし、その発現量をウェス タンプロティングでのシグナル比で比較した場合、同じ GLP-1誘導体 5連結ペプチド を単独で発現させた 2.3k pGluB- SP(GluB)- mGLP- 1x5- GluB- 3，（試験例 1- A)の場 合に比べて 1Z15以下であった（図 4)。
[0038] 以上の結果から、 GLP— 1誘導体遺伝子を 5連結させて発現させることにより、はじ めてコメ中に GLP— 1誘導体を多量に集積させることに成功した。 GLP— 1誘導体は 単独では発現しな力つたことから、 GLP— 1誘導体の発現に連結 GLP— 1 DNAを用 いることの有用性は高い。また、 5連結 GLP— 1誘導体の集積量は、貯蔵タンパク質 に挿入し融合タンパク質として発現させるより、単独で発現させた方がより高濃度に 発現させることができた。これは、単独での発現の方が、貯蔵タンパク質としての量的 な制限を受けにくいことがーつの要因と考えられる。
[0039] [試験例 3]「MATベクター (登録商標）」により作成されたイネ日本晴の形質転換体 種子における GLP— 1誘導体 5連結ペプチドの検出
同一方向を向いた 2つの RS配列（部位特異的組換え系の組換え配列）〖こ挟まれた 領域に、 R遺伝子 (部位特異的組換え系の脱離酵素遺伝子)、 ipt遺伝子及びハイグ ロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を配すると共に、この RS配列に挟まれた 領域の外側に、試験例 1 Aで示した construct 1又は試験例 1 Cで示した construct 3を配した「MATベクター（登録商標）」を作成し、前者を pTL7GluB-(mGLP-lx5)-GluBT-130Hm [独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センター (宛名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)におけ るブタペスト条約に基く国際受託番号: FERM BP— 10020]、後者を
pTL7GluB- PREE99(mGLP- 1x5)- GluBT- 130Hm [同特許生物寄託センターにおける ブタペスト条約に基く国際受託番号: FERM BP— 10021]とした。次いで、これらの ベクターをそれぞれァグロバタテリゥム法によりイネ日本晴に導入し、ハイグロマイシ ン耐性を指標として形質転換体の選抜を行!ヽ、選抜された形質転換体につ!ヽて解 析を行った。 その結果、 pTL7GluB- (mGLP- 1x5)- GluBT- 130Hmによる形質転換体 及び pTL7GluB- PREE99(mGLP- 1x5)- GluBT- 130Hmによる形質転換体のいずれに ぉ 、ても、その形質転換体より得られた登熟種子の抽出液のウェスタンプロティング により、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチドと推定されるシグナルが検出され、 GLP— 1誘 導体 5連結ペプチドの集積を確認した。（図 5、 6)。
[0040] [試験例 4]GLP— 1誘導体発現米中の GLP— 1含有量の測定
前記試験例 1-A力 得られた GLP— 1誘導体集積米にっ 、て、 GLP— 1含有量の測 定を行った。すなわち、コメ 1粒 (外皮付き）を 2ndパッキン付きマイクロチューブに入 れ、ビーズショッカー（安井器械株式会社製）により 2500rpm、 lOsecで粉末にした。 その後、抽出バッファー（4%ドデシル硫酸ナトリウム、 8M尿素、 0. 5% 2-メルカ プトエタノールを含む 50mM Tris— HC1緩衝液（pH6. 8) ) lmlをカ卩え、溶解するま で攪拌した。この溶解液を精製水に 4°Cで一昼夜透析（1L X 3回）を行った。 15, 00 0rpm、 5分間の遠心を行い、上清を回収し GLP— 1誘導体抽出液とした。
[0041] GLP— 1誘導体抽出液 8 /z l、 50mM炭酸水素アンモ-ゥム（pH7. 8) 112 ^ 1, 83 μ gZmlトリプシン溶液（Promega社製： Cat.No. V5113) 6 μ 1を加え、 37°Cで 2時間 反応させることにより、 GLP - 1誘導体連結ペプチドを GLP - 1誘導体単体化した。 9 5%エタノール 462 1を加えて反応を停止し、 4°Cで 5分間の 15, OOOrpmによる遠 心により上清を回収し、遠心エバポレーシヨンにより乾固した。その乾固物を溶解し、 RIAキット（LINCO社製、 GLP-l(total)RIAkit)により含量を測定した。
[0042] その結果、最も含量の高かった GLP - 1誘導体 5連ペプチド発現米 (前記試験例 1- A)中の GLP— 1誘導体含量は、コメ粒 20mgあたり 180 μ gを示した（図 7)。 [0043] [試験例 5]イネ種子で発現する GLP— 1誘導体 5連結ペプチド産物の熱安定性
GLP - 1誘導体 5連結ペプチド発現米から得た GLP - 1誘導体と、 Vゝずれも合成で得 た天然型 GLP - 1及び GLP - 1誘導体との熱安定性を比較した。 GLP - 1誘導体 5連 結ペプチド発現米 (前記試験例 1-A)に蒸留水を加え、 100°Cで 15分間熱処理後試 験例 4と同様にして抽出し、更にトリプシン処理により GLP— 1誘導体単体を得た。一 方、合成天然型 GLP— 1および合成 GLP— 1誘導体ペプチドは、 0. 2%BSA溶液で 10 μ
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100°Cで 15分間熱処理した。これらの熱処理物に対し、比較対照 として非熱処理物を同様に調製し、これらについて、マウス isletを用いた cAMP産生 による活性測定を行った。その結果、合成天然型 GLP— 1および合成 GLP— 1誘導 体そのものは熱処理に対して安定であった。発現米より得た GLP - 1誘導体の活性 は、熱処理しな力つた発現米に比べて約 33. 3%活性が低力つた (図 8)。このことから 、本発明の GLP— 1誘導体発現米は炊飯しても活性はある程度保持され、血糖低下 作用を発揮できることが推測された。一方、合成ペプチドは熱に安定であったことか ら、コメで発現させた 5連結ペプチドは、熱変性によりトリプシン消化を受けにくい立 体構造に変化したことが推察された。
[0044] [試験例 6]GLP— 1誘導体集積米のマウスにおける血糖低下作用
GLP - 1誘導体 5連結ペプチド発現米 (前記試験例 1-A)の血糖低下作用を調べた 。コントロール米には、 GLP— 1遺伝子導入に用いた米と同じ非形質転換米のキタァ ケを用いた。それぞれの米を精白'浸漬後、コメ重量の 3. 8倍の水をカ卩えて 100°C、 15分間炊飯した。その後、押しつぶしてペースト状に均一にした。コントロール米と G LP— 1誘導体 5連結ペプチド発現米は、グルコース量として同じ lOOmg相当を含む 各々の米を、ー晚絶食した正常マウス (Crj:ICR, 8w, o71)に摂食させた。尚、 GLP— 1 誘導体の投与量は、試験例 4と同様に炊飯米の cAMP産生活性の測定により求め、 約 1. OmgZマウスと算出された。陽性対照群にはコントロール米を給与し、その直 前に GLP— 1誘導体ペプチド 20 gZkgを背部皮下に投与した。これに対応し、コン トロール米給与群および GLP - 1誘導体 5連結ペプチド発現米給与群には、背部皮 下に生理食塩水 5mlZkgを投与した。炊飯米給与前ならびに給与後 3時間後まで 2 0分間隔で、尾部先端より採血しダルテストセンサーにて血糖値測定を行った。 [0045] その結果、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチド発現米のマウスへの給与により、血糖値 は 40— 80分に力けて、血糖値曲線下面積は 0— 120分値において、コントロール米 給与群に比べて有意な抑制作用が認められた (図 9)。このように、動物試験において GLP - 1誘導体 5連結ペプチド発現米の血糖低下作用が確認された。
[0046] 本発明の当事者が別途行った、マウスに GLP— 1ペプチドそのものを口腔内投与し た実験において、血糖低下効果を得るためには、 GLP-1ペプチド 50— 150 /z gを 必要とした。これは、ヒトの体重として 60kgを想定したとき、ヒトにおいて血糖低下を 誘導するために必要な GLP— 1ペプチドの量は 150mg— 450mgになる。この量を 1 粒あたり 180 g集積したコメで摂取するには、 830— 2490粒を食べる必要がある。 ヒトが食べるお茶碗 1杯のごはん粒数は 3000粒力も 4000粒であることから、本発明 のコメであれば、ヒトの場合はお茶碗 1杯のごはんで、血糖低下に必要 GLP— 1量を 摂取することができる。
[0047] [試験例 7]GLP— 1誘導体発現米の KK-Ayマウスにおける血糖低下作用
試験例 6と同様の試験を 2型糖尿病モデル動物 KK-Ayマウスで行った。試験例 5の正 常マウスの場合と同様の給与量で行った力 この KK-Ayマウスでは、試験例 5の正常 マウスに比べて高い血糖値を示した。しかし、 GLP— 1誘導体 5連結ペプチド発現米 給与群で、コントロール米給与群に比べて有意な抑制作用が認められ、 GLP— 1誘 導体 5連結ペプチド発現米の血糖低下作用が確認された (図 10)。このことから、 2型 糖尿病患者においても GLP - 1誘導体 5連結ペプチド発現米の効果が期待できる。
[0048] 上記の如く本発明者らは、 GLP— 1誘導体を高度に植物へ集積させ、治療効果のあ る当該ペプチドを集積した植物の開発に成功し、本発明を完成させた。
産業上の利用可能性
[0049] 本発明は、 GLP - 1誘導体が集積される形質転換植物及び Z又はその植物貯蔵器 官を提供することができる。例えば、 GLP— 1誘導体が集積される米などが提供される 。このような GLP— 1誘導体が集積される植物もしくは植物貯蔵器官、又はこれらの抽 出成分を食することにより、血糖を低下させることができ、糖尿病治療に有用である。

Claims

請求の範囲
[1] GLP-1 (7-36)、又は GLP—l (7—36)のアミノ酸配列の 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、置換及び Z又は付加された配列で C末端が Arg又は Lysカゝらなり、かつ GLP 1活性を有する GLP— 1誘導体をコードする DNAを n個（nは 3以上の整数)直列に 繋、だ連結 GLP— 1 DNAをベクター中に組込んで植物細胞中に導入し、得られた 形質転換体を再分化させることを特徴とする、 GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可 能に集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[2] 連結 GLP— 1 DNAを、植物貯蔵器官特異的プロモーター DNA及び植物貯蔵タ ンパク質シグナルペプチド配列をコードする DNAの下流に位置させて、ベクター中 に組み込むことを特徴とする、請求項 1記載の GLP— 1誘導体が消化酵素で分断可 能に集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[3] 連結 GLP— 1— DNAを、植物の貯蔵タンパク質 DNAの可変領域をコードする DN A領域へ挿入した形でベクター中に組み込むことを特徴とする、請求項 1記載の GL P - 1誘導体が消化酵素で分断可能に集積された形質転換植物又はその植物貯蔵 器官を生産する方法。
[4] サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子が脱離能を有する DNA因子と挙動を 一にする位置に、及び、連結 GLP— 1 DNAが脱離能を有する DNA因子とは挙動 を一にしない位置に位置するように、連結 GLP— 1 DNAを、サイトカイニン関連遺 伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有する DNA因子とともにベクター中に組込み 、該組換えベクターを植物細胞中に導入し、組み換えベクターが導入された植物細 胞を、薬剤添加培地及び薬剤非添加培地: 2培養を行うことにより形質転換体を再分 ィ匕させることを特徴とする、請求項 1記載の GLP-1誘導体が消化酵素で分断可能に 集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[5] GLP— 1誘導体が、アミノ酸配列の 26位をグルタミンに、 34位をァスパラギン又はァ スパラギン酸に置換した GLP— 1誘導体であることを特徴とする、請求項 1記載の GL P - 1誘導体が消化酵素で分断可能に集積された形質転換植物又はその植物貯蔵 器官を生産する方法。
[6] GLP— 1誘導体が、更にアミノ酸配列の 8位をセリン又はグリシンで置換した GLP— 1誘導体であることを特徴とする請求項 5記載の GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可 能に集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[7] GLP— 1誘導体をコードする DNAの連結数 n力 一 8であることを特徴とする請求項
1記載の GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可能に集積された形質転換植物又はそ の植物貯蔵器官を生産する方法。
[8] GLP— 1誘導体をコードする DNAの連結数 nが 5であることを特徴とする請求項 7記 載の GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可能に集積された形質転換植物又はその植 物貯蔵器官を生産する方法。
[9] 植物が単子葉植物である、請求項 1記載の GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可能 に集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[10] 単子葉植物力イネである、請求項 9記載の GLP 1誘導体が消化酵素で分断可能 に集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[11] 植物貯蔵器官が種子である、請求項 1記載の GLP - 1誘導体が消化酵素で分断可 能に集積された形質転 ^«物又はその植物貯蔵器官を生産する方法。
[12] 請求項 1一 11のいずれかに記載の方法により生産された GLP— 1誘導体が消化酵 素で分断可能に集積される形質転換植物又はその植物貯蔵器官。
[13] GLP-1 (7-36)、及び Z又は GLP—1 (7—36)のアミノ酸配列の 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加された配列で C末端が Arg又は Lysカゝらなり、か つ GLP— 1活性を有する GLP— 1誘導体をコードする DNAを n個（nは 3以上の整数） 直列に繋いだ連結 GLP— 1 DNAをベクター中に組込んだ、 GLP— 1誘導体が消化 酵素で分断可能に集積された形質転 物又はその植物貯蔵器官を生産するため の組換え発現ベクター。
[14] 連結 GLP— 1 DNAを、植物貯蔵器官特異的プロモーター DNA及び植物貯蔵タ ンパク質シグナルペプチド配列をコードする DNAの下流に位置させて、ベクター中 に組込んだことを特徴とする、請求項 13記載の組換え発現ベクター。
[15] 連結 GLP—1— DNAを、植物の貯蔵タンパク質 DNAの可変領域をコードする DN
A領域へ挿入した形でベクター中に組込んだことを特徴とする、請求項 13記載の組 換え発現ベクター。 サイトカイニン関連遺伝子と薬剤耐性遺伝子が脱離能を有する DNA因子と挙動を 一にする位置に、及び、連結 GLP— 1 DNAが脱離能を有する DNA因子とは挙動 を一にしない位置に位置するように、連結 GLP— 1 DNAを、サイトカイニン関連遺 伝子、薬剤耐性遺伝子及び脱離能を有する DNA因子とともにベクター中に組込ん だ、請求項 13記載の組換え発現ベクター。
GLP— 1誘導体が、アミノ酸配列の 26位をグルタミンに、 34位をァスパラギン又はァ スパラギン酸に置換した GLP— 1誘導体である、請求項 13記載の組換え発現べクタ
GLP— 1誘導体が、更にアミノ酸配列の 8位をセリン又はグリシンに置換した GLP— 1誘導体である、請求項 17記載の組換え発現ベクター。
GLP— 1誘導体をコードする DNAの連結数 n力 一 8である、請求項 13記載の組換 え発現ベクター。
GLP— 1誘導体をコードする DNAの連結数 nが 5である、請求項 19記載の組換え 発現ベクター。
請求項 1一 11のいずれかに記載の方法により生産された GLP - 1誘導体が消化酵 素で分断可能に集積され、かつ高生産された形質転 ^¾物又はその植物貯蔵器官 を用いた糖尿病の治療若しくは予防のための、医薬組成物、飲食品材料、又は飲食
PCT/JP2004/013370 2004-09-14 2004-09-14 Ｇｌｐ−１誘導体が集積された植物及び植物貯蔵器官とその生産方法 WO2006030492A1 (ja)

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