ES2262172T3 - Proteinas de reserva de plantas enriquecidas en aminoacidos, fundamentalmente y-ceina de maiz enriquecida en lisina. plantas que expresan esas proteinas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN OLIGONUCLEOTIDO QUE COMPRENDE AL MENOS UNA CADENA QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO QUE RESPONDE A LA FORMULA (P - K) N , EN LA CUAL: N ES UN ENTERO SUPERIOR O IGUAL A 2, P REPRESENTA UN RESIDUO DE AMINOACIDOS PROLINA, K REPRESENTA UN RESIDUO DE AMINOACIDOS LISINA, EL SIGNO "-" SIMBOLIZA UN ENLACE ENTRE LOS DOS RESIDUOS DE AMINOACIDOS Y, EN PARTICULAR, UN ENLACE DE TIPO PEPTIDICO; TAMBIEN LAS N UNIDADES (P - K) ESTAN UNIDAS ENTRE SI POR ESOS ENLACES, POR EJEMPLO DE TIPO PEPTIDICO.

Description

Proteínas de reserva de plantas enriquecidas en aminoácidos, fundamentalmente \gamma-zeína de maíz enriquecida en lisina. Plantas que expresan esas proteínas.

La presente solicitud tiene por objeto nuevos medios que permitan la preparación de plantas que expresen proteínas de reserva enriquecidas en aminoácidos deficitarios en las proteínas de reserva normales, y en particular proteínas de reserva enriquecidas en lisina. La invención también tiene por objeto las proteínas de reserva modificadas de esta manera, así como plantas que expresen esas proteínas de reserva modificadas. Entre esas proteínas de reserva, la invención se refiere a proteínas de reserva de la familia de las zeínas.

Numerosas plantas son, llegado el caso, después de la transformación por etapas fisicoquímicas, de mayor importancia económica en la alimentación humana o animal, y el problema del mejoramiento de su cualidad nutricional ya ha dado lugar a diferentes tipos de investigaciones. En particular, para remediar la insuficiente presencia de ciertos aminoácidos en las proteínas de reserva de las plantas, se han puesto a punto variedades seleccionadas que presentan cualidades nutricionales superiores, o se han propuesto diferentes modificaciones que recurren a la utilización de técnicas de ingeniería genética para favorecer o aumentar la producción en esas plantas fundamentalmente de ciertos aminoácidos deficitarios, y no obstante importantes para las cualidades nutricionales de la planta. Esos aminoácidos deficitarios son por ejemplo la lisina y la metionina.

En el marco de la presente solicitud, los inventores se han propuesto aportar una solución original al problema del mejoramiento de las plantas, fundamentalmente del mejoramiento de sus cualidades nutricionales y a estos efectos han trabajado en primer lugar a partir de una planta de una importancia económica considerable, el maíz. Más precisamente, se han interesado en las proteínas de reserva del endosperma de las semillas de maíz, proteínas que comprenden fundamentalmente las zeínas y, en particular, la \gamma-zeína.

En el transcurso del desarrollo de las semillas de maíz, las células del endosperma sintetizan grandes cantidades de proteínas de reserva, y fundamentalmente de \alpha-, \beta-, y \gamma-zeínas. Esas zeínas se acumulan en los cuerpos proteicos derivados del retículo endoplasmático (ER).

De manera general, las zeínas representan un grupo complejo de proteínas, repartidas en varios grupos, \alpha-, \beta-, \gamma-, y \delta-zeínas (Larkins et al, 1989), codificadas por una familia multigénica (Hagen y Rubenstein, 1980, Gene 13, 239-249). Aunque presentan una estructura variable, esas proteínas tienen características comunes: la presencia en su estructura primaria de repeticiones en tándem ricas en residuos de aminoácidos de tipo prolina, la presencia de numerosos residuos hidrófobos que confieren su insolubilidad a esas proteínas en un medio acuoso, y la ausencia de residuos de lisina, aminoácidos esenciales para el hombre y los animales monogástricos. La ausencia de lisina en todas las proteínas mayoritarias (detectadas en gran cantidad en el endosperma) de origen natural de la familia de las zeínas da lugar a una composición en aminoácidos desequilibrada en las semillas de maíz.

Entre esas proteínas, la \gamma-zeína de maíz es una proteína que tiene un peso molecular de 28 kDa, cuya secuencia codificante fue descrita bajo la forma del ADNc por Prat et al (Nucleic Acids Research, vol. 13, Nº 5, 1985, p. 1.494-1.504). La secuencia completa del gen que codifica la \gamma-zeína, comprendidas allí las secuencias no codificantes secuencia arriba y secuencia abajo que contienen los elementos de regulación de la expresión, fue descrita por Reina, M. et al (Nucleic Acids Research, vol. 18, Nº 21, 1990, p. 6.426).

Hasta el presente, se han considerado diferentes enfoques para aumentar el contenido de lisina en las proteínas de la familia de las zeínas. A este respecto, se han puesto en práctica enfoques genéticos y moleculares. Por ejemplo, también se han propuesto mutantes que permitan la obtención de maíz rico en lisina, como el mutante opaco-2 (o2) y el mutante floury-2 (fl-2) (Mertz et al, 1964, Science 145, 279-280, Nelson et al, 1965, Science 150, 1.469-1.470) y se han hecho intentos de poner remedio a los efectos nefastos de la ausencia de ciertas clases de zeínas, fundamentalmente las \alpha-zeínas, sobre las características fenotípicas, por selección de maíz que contiene genes modificadores o2 (Paez et al, 1969, Plant Sci. 9, 251-252, Geetha et al, 1991, Plant Cell 3, 1.207-1.219).

Otro enfoque consistió en realizar una acción indirecta sobre la producción de lisina libre, en particular en las plantas dicotiledóneas. Esta técnica se puso en práctica actuando sobre la desregulación de las enzimas clave (DHTPS y AK) implicadas en el ciclo de la biosíntesis de la lisina a través del aspartato. Se obtuvo un sensible crecimiento en los niveles de lisina libre en las hojas, pero no en las semillas, en experiencias de transformación de plantas de tabaco con bacterias E. coli que contenían los genes dapA y bacterias E. coli que contenían el gen lysC (Shaul et Galili, 1992, Plant J. 2, 203-209 et 1.993, Plant Mol. Biol. 23, 759-768; Perl, A., Schaul O., Galili, G., 1992, Plant Molecular Biology, 19, p. 815-823). Recientemente, se utilizaron los mismos genes dapA de Corynebacterium y lysC de E. coli y se expresaron bajo el control de un promotor específico de las semillas en las plantas de soja. La expresión de esas dos enzimas en la soja dio lugar a un aumento en cinco veces del contenido de lisina en las semillas (Falco et al, 1995, BIO-Technology 13, 577-582).

Otros autores (Wallace et al, 1988, Science 240, 662-664) intentaron aumentar la lisina en la \alpha-zeína (19 kDa) de las semillas de maíz incorporando de manera puntual residuos de lisina en diferentes posiciones en la molécula de \alpha-zeína. La expresión de esas construcciones en oocitos de Xenopus condujo al correcto ensamblaje de las zeínas ricas en lisina en las vesículas análogas de los cuerpos proteicos. Sin embargo, la \alpha-zeína normal y la forma modificada enriquecida en lisina eran degradadas cuando eran expresadas en las semillas de tabaco (Othani et al, 1991, Plant Mol. Biol. 16:117).

No se disponía por tanto en ese momento de los conocimientos en cuanto a los medios que podían permitir la expresión de una zeína enriquecida en lisina en las células que la producían naturalmente en el maíz, es decir en las células del endosperma. Con mayor razón no se dominaba la expresión en otras células vegetales de zeínas enriquecidas en lisina.

Uno de los fines de la invención es por lo tanto proponer medios que permitan obtener una zeína enriquecida en lisina, en particular una \gamma-zeína de maíz enriquecida en lisina, siendo esta proteína expresada fundamentalmente en las células de las semillas de maíz y en particular en las células del endosperma, siendo además dicha proteína modificada expresada de manera tal que sus propiedades en cuanto a la localización y la acumulación a nivel del retículo endoplasmático y de los cuerpos proteicos derivados sean preservadas.

La expresión "enriquecida en lisina" significa, en el contexto de la presente solicitud, que la proteína comprende un mayor número de residuos de lisina con relación a la proteína natural de la cual deriva, por ejemplo a continuación de una modificación de la secuencia de nucleótidos que la expresa.

La invención propone también medios para obtener la expresión de proteínas, preferentemente \gamma-zeínas enriquecidas en lisina, en células vegetales de diferentes tejidos, por ejemplo tejidos de hojas o de raíces, y llegado el caso en células vegetales de plantas que no expresan naturalmente la proteína, en particular la \gamma-zeína cuya producción se busca.

Por otro lado, según un modo de realización particular de la invención, otras proteínas de reserva pueden ser enriquecidas en lisina según modalidades análogas, y más particularmente proteínas de reserva de la familia de las zeínas.

Los inventores se propusieron en una primera instancia, para realizar la invención, introducir en el gen que codifica la \gamma-zeína u otras proteínas de reserva del maíz o de otras plantas, o en la secuencia codificante de ese gen, secuencias que codifican polipéptidos enriquecidos en lisina, para obtener la producción de \gamma-zeínas u otras proteínas enriquecidas en lisina y por lo tanto, semillas enriquecidas en lisina. Se identificaron diferentes sitios de la secuencia codificante del gen de la \gamma-zeína como sitios permisivos, (denominados también "sitios neutros") para preparar secuencias de nucleótidos modificadas de esa manera.

La presente solicitud propone por lo tanto medios para transformar el gen que codifica la \gamma-zeína de maíz o para transformar toda secuencia de nucleótidos que codifique la \gamma-zeína y que derive de ese gen, de manera de obtener a partir de la expresión del gen modificado o más generalmente de la secuencia de nucleótidos modificada, una proteína enriquecida en lisina; esos medios comprenden en particular oligonucleótidos sintéticos que codifican una secuencia de aminoácidos que incluye residuos de lisina.

La invención tiene asimismo por objeto secuencias de nucleótidos recombinantes o secuencias quimera susceptibles de codificar una \gamma-zeína enriquecida en lisina.

Están comprendidas asimismo en el marco de la invención células huésped transformadas por tales secuencias, y en particular células vegetales, por ejemplo células que permiten la regeneración de plantas, así como plantas o partes de plantas (tejidos, órganos,...) que contienen tales células y que producen de manera estable proteínas de reserva modificadas, y en particular \gamma-zeínas enriquecidas en lisina.

La invención tiene igualmente por objeto dichas proteínas modificadas, por ejemplo enriquecidas en lisina, así como anticuerpos dirigidos contra esas proteínas, y más particularmente proteínas de reserva de la familia de las zeínas, enriquecidas en lisina.

Un oligonucleótido apropiado para la realización de la invención, utilizable para la preparación de secuencias de nucleótidos recombinantes, se caracteriza por comprender al menos una cadena que codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n}, en la cual:

- n es un entero superior o igual a 2,

- P representa un residuo del aminoácido prolina

- K representa un residuo del aminoácido lisina

- el signo "-" simboliza una unión entre los dos residuos de aminoácidos y fundamentalmente una unión de tipo peptídico, las n unidades (P-K) están ligadas entre sí de la misma manera por uniones como esas por ejemplo de tipo peptídico.

Un oligonucleótido de acuerdo con la invención se caracteriza por lo tanto según un primer modo de realización, por comprender una secuencia que codifica una serie de motivos repetidos que incluyen dos aminoácidos.

Los codones del oligonucleótido pueden ser idénticos para todos los residuos de prolina y/o para todos los residuos de lisina. También pueden ser diferentes para un mismo residuo de aminoácido, teniendo en cuenta la variación la degeneración del código genético.

Preferentemente, ese oligonucleótido está formado por una secuencia que codifica más de 2 unidades (P-K). Preferentemente n es inferior o igual a 30, en particular inferior a 20 y de manera ventajosa n es igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ó 15.

Los "oligonucleótidos" de acuerdo con la invención se pueden sintetizar químicamente mediante cualquier técnica disponible.

El término "polipéptido" con referencia a la cadena (P-K)_{n} designa, en el marco de la presente solicitud, una secuencia de aminoácidos que incluye más de 2 residuos de aminoácidos y puede incluir hasta 60 residuos de aminoácidos.

De acuerdo con la primera variante de realización de la invención, el oligonucleótido comprende varias cadenas que codifican un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n}, idénticas o diferentes, asociadas en tándem.

Esos oligonucleótidos son o bien repeticiones de una misma cadena, o bien asociaciones de cadenas diferentes. El número de cadenas asociadas es variable, pudiendo estar comprendido por ejemplo entre 2 y 10 cadenas.

Según otra variante de realización de la invención, el oligonucleótido definido precedentemente se caracteriza por comprender al menos una cadena que codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n}, en la cual la secuencia de las unidades (P-K) está interrumpida por uno o varios residuos de aminoácidos distintos de los residuos P o K.

Preferentemente, los aminoácidos suplementarios incorporados en la secuencia formada por las unidades (P-K) se eligen de manera de no modificar la organización del polipéptido codificado por el oligonucleótido, o al menos para no provocar interacción con aminoácidos de una proteína en la cual se incorporaría dicho polipéptido, en condiciones que afectarían la estructura y/o la función y/o la localización de esta proteína.

Este puede ser en particular el caso cuando el número de unidades (P-K) es importante o cuando varias cadenas formadas de secuencias que codifican motivos (P-K)_{n} se asocian en tándem y la preparación del oligonucleótido correspondiente necesita que sean sintetizadas varias secuencias nucleotídicas que a continuación se asocian por ejemplo mediante secuencias ligadoras (linkers).

Según otro modo de realización de la invención, el oligonucleótido es tal que la cadena que codifica el polipéptido que comprende las n unidades (P-K) es completado en su extremo 5' y/o en su extremo 3', por uno o varios codones, que codifican por ejemplo al menos un residuo de lisina en el extremo N-terminal del polipéptido.

A título de ejemplo, un oligonucleótido preferido de acuerdo con la invención se caracteriza porque codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n} a la fórmula K-(P-K)_{4}, o a la fórmula 2K(P-K)_{4}.

De acuerdo con un modo de realización particular, la composición de ese oligonucleótido corresponde a una de las secuencias descritas en las páginas siguientes e identificadas por las designaciones SEC. Nº de ID: 1 y SEC. Nº de ID: 2.

Los oligonucleótidos descritos precedentemente constituyen medios de base para realizar secuencias de nucleótidos recombinantes capaces de expresar proteínas o polipéptidos de reserva de plantas enriquecidos en lisina.

La invención tiene por lo tanto por objeto una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una cadena de nucleótidos que codifica una proteína de reserva de una planta, que se caracteriza por comprender además un oligonucleótido de acuerdo con la invención, insertado en un sitio de la cadena de nucleótidos elegido de manera tal que:

- la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal determinada permite obtener una proteína de reserva modificada localizada de manera idéntica o similar en esta célula a la proteína de reserva normal que sería expresada en la misma célula, en las mismas condiciones por la cadena de nucleótidos codificante normal correspondiente, y/o

- la proteína de reserva modificada codificada por la secuencia de nucleótidos es reconocida inmunológicamente por anticuerpos producidos contra la proteína de reserva normal correspondiente.

En particular, los anticuerpos antes mencionados están constituidos por un suero policlonal o son obtenidos contra epitopos de la proteína de reserva normal que son conservados en la proteína de reserva modificada.

Las células vegetales a las que se hace referencia antes comprenden todas las células vegetales, cualquiera sea su origen tisular o su naturaleza. En particular en el marco de la invención lo que interesa son las células de los órganos de reserva, pero también las células de las hojas, los tallos, los tubérculos...

Por la expresión "proteína de reserva" de una planta, se entiende en el marco de la presente solicitud una proteína sintetizada durante la maduración de las semillas y que se utiliza durante la fase de germinación como reserva principal de nutrición.

De manera general, se trata de un polipéptido susceptible de ser sintetizado en un tejido de reserva cualquiera sea la localización en la planta; las proteínas de reserva empleadas en el marco de la presente solicitud son en particular las producidas en los granos o las semillas de las plantas de la familia de los cereales, de las crucíferas o de las leguminosas, y son por ejemplo las prolaminas y las zeínas.

La elección del o de los sitios de inserción del oligonucleótido en la cadena que codifica la proteína de reserva de la planta se determina por el respeto de las condiciones enunciadas antes. Según el caso, la inserción puede tener lugar en un dominio repetitivo (en términos de secuencia de aminoácidos) de la proteína o a nivel de un extremo C o N-terminal.

La condición establecida antes según la cual la expresión de la secuencia de nucleótidos recombinante de la invención en una célula vegetal permite obtener una proteína de reserva modificada, localizada idénticamente o similarmente a la proteína de reserva normal que sería expresada en las mismas condiciones en la misma célula vegetal, incluye por ejemplo para las \gamma-zeínas sintetizadas, la posibilidad de ser acumuladas en el retículo endoplasmático de las células vegetales que las expresan, y en particular en los cuerpos proteicos formados a partir de ese retículo endoplasmático, cuando la proteína es expresada en las células del endosperma.

Para obtener ese resultado mediante secuencias de nucleótidos recombinantes de la invención, se eligen sistemas de expresión adaptados al huésped celular en el cual se expresa la secuencia de nucleótidos seleccionada, y fundamentalmente los elementos de regulación, por ejemplo los promotores, por su carácter funcional en el tejido que contiene las células transformadas. Se pueden realizar pruebas para efectuar esa elección apoyándose en las diferentes construcciones descritas en los ejemplos.

Para verificar que las propiedades inmunológicas de la proteína de reserva modificada expresada por la secuencia de nucleótidos de la invención no se modificaron consecuentemente, se utilizaron por ejemplo antisueros como el antisuero \alphaG2, descrito precisamente en la parte experimental siguiente.

De acuerdo con un primer modo de realización de la invención, la secuencia de nucleótidos recombinante se caracteriza porque se obtiene a partir de una cadena codificante de nucleótidos que conduce a la expresión de una proteína de reserva naturalmente pobre en lisina.

De manera general, esta secuencia de nucleótidos recombinante codifica una proteína de reserva modificada derivada de una proteína de reserva producida naturalmente por una planta utilizable en alimentación animal o humana.

De este modo, las proteínas de reserva a las que se les modifica el contenido de lisina en el marco de la presente invención son de manera ventajosa proteínas de reserva de plantas de la familia de los cereales, de las leguminosas o de las crucíferas. Proteínas de reserva particularmente importantes son las del maíz, en particular las zeínas, y más especialmente la \gamma-zeína del maíz, cuyo contenido de lisina se busca aumentar.

Una secuencia de nucleótidos recombinante particular de acuerdo con la invención se caracteriza porque la cadena codificante de nucleótidos que codifica la \gamma-zeína del maíz que ella contiene, responde a la secuencia presentada en la Figura 9.

Otras secuencias de nucleótidos recombinantes de la invención se caracterizan porque la cadena codificante de nucleótidos que ellas comprenden, codifica una proteína de reserva de una planta elegida entre las siguientes: la soja, el girasol, el tabaco, el trigo, la avena, la alfalfa, el arroz, la colza, el sorgo, Arabidopsis.

De acuerdo con un modo de realización preferido de la invención, en la secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una cadena que codifica la \gamma-zeína del maíz, el oligonucleótido de la invención es insertado en el lugar de la cadena que codifica el dominio Pro-X presente naturalmente en la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína del maíz o a continuación de esta cadena. El dominio Pro-X de la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína del maíz está constituida por los aminoácidos situados entre las posiciones 70 y 91 de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 9, correspondiente a los nucleótidos 265 a 330 de la secuencia representada en la Figura 9.

De manera preferida en la secuencia de nucleótidos de la invención, el oligonucleótido está en el lugar o a continuación del dominio Pro-X presente entre los nucleótidos 276 y 357 de la secuencia representada en la Figura 9.

De acuerdo con otro modo de realización de la invención, en la secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una cadena que codifica la \gamma-zeína de maíz, el oligonucleótido de la invención es insertado a continuación del dominio Pro-X conservado en la secuencia de la \gamma-zeína del maíz.

De acuerdo con otra variante de realización, en la secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una cadena que codifica la \gamma-zeína de maíz, el oligonucleótido de la invención es insertado en el dominio Pro-X conservado en la secuencia de la \gamma-zeína.

Las inserciones de las que se habla antes se pueden realizar mediante las técnicas disponibles, por ejemplo por recombinación de las secuencias que hayan sufrido una o varias etapas de digestión enzimática.

En un modo de realización particular de la invención, una proteína de reserva elegida enriquecida en un aminoácido determinado se expresa en las células vegetales heterólogas. En otras palabras una proteína de reserva presente naturalmente en una planta dada, se expresa bajo la forma enriquecida en aminoácidos, en otra planta, o en otra célula que la que la produce naturalmente.

Además de la cadena que codifica una proteína de reserva de una planta y del oligonucleótido de la invención, las secuencias de nucleótidos recombinantes de la invención pueden asimismo comprender un promotor de expresión y, por ejemplo, un promotor elegido por su carácter específico para la expresión en ciertas partes o en ciertos tejidos de las plantas, o al contrario un promotor elegido por su carácter constitutivo. A título de ejemplo, cuando son específicos, los promotores pueden ser específicos de las semillas y/o de órganos o de tejidos determinados de plantas. Pueden alternativamente o igualmente ser específicos de una fase de crecimiento, por ejemplo de un estadio determinado de la germinación.

A la inversa la utilización de promotores constitutivos permite la expresión constante y general de la proteína de reserva, acarreando una competencia entre la expresión de la proteína de reserva nativa cuando ésta está presente y la proteína de reserva modificada.

A título de ejemplo, promotores ventajosos para la realización de la invención son el promotor de la \gamma-zeína del maíz contenido en la secuencia de 1,7 kb que se encuentra secuencia arriba de la secuencia codificante representada en la Figura 7, el promotor del virus del mosaico de la coliflor, a saber el promotor CaMV35S (EP-B-0131623), el promotor constitutivo del gen de actina 1 del arroz (PCT/US 9100073) o el promotor específico de semilla "High Molecular weight gluthenine" del trigo (Colot V. et al, 1987, EMBO Journal, vol. 6, p. 3.559-3.564).

Llegado el caso, esos promotores son completados por otras secuencias de regulación, y en particular por activadores de la expresión.

A título de ejemplo, otros promotores que se pueden utilizar para la realización de la invención son por ejemplo el promotor del gen que codifica la proteína de reserva 2S de las semillas de Arabidopsis thaliana, o incluso los promotores de la lectina de habichuela o de la \beta-faseolina de habichuela.

La introducción suplementaria de activadores de expresión en las secuencias de regulación de las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención permite asimismo aumentar el nivel de la transcripción primaria de la secuencia de nucleótidos y, llegado el caso, aumentar la cantidad de proteínas de reserva modificadas producidas. Son activadores por ejemplo intrones de monocotiledóneas como el intrón 1 del gen de actina de arroz.

La invención tiene asimismo por objeto un vector de clonación y/o de expresión, caracterizado por comprender, en un sitio no esencial para su replicación, una secuencia de nucleótidos que responde a una de las definiciones dadas precedentemente. Vectores particulares interesantes en el marco de la realización de la invención son por ejemplo los plásmidos pP20\gammaZ, pH30\gammaZ o pH45\gammaZ. El plásmido pP20\gammaZ se depositó en la CNCM (París, FRANCIA) el 31 de octubre de 1995 con el número I-1640. El plásmido pH45\gammaZ se depositó en la CNCM el 31 de octubre de 1995 con el número I-1639.

Está comprendido asimismo en el marco de la invención un polipéptido como el expresado por una secuencia de nucleótidos recombinante que responde a las definiciones precedentes.

La expresión "polipéptido" no introduce en el marco de la presente invención una limitación particular en cuanto al número de aminoácidos que forman el polipéptido. Puede tratarse por lo tanto de secuencias que comprendan algunos aminoácidos, habitualmente designadas por la expresión "péptidos", o incluso de secuencias mucho más largas tales como las de las proteínas.

La invención se refiere a este respecto a la \gamma-zeína de maíz modificada rica en lisina, que se caracteriza por estar codificada por una secuencia de nucleótidos recombinante descrita precedentemente.

De acuerdo con un modo de realización preferido de la invención, la \gamma-zeína de maíz modificada enriquecida en lisina se caracteriza porque su secuencia de aminoácidos está modificada por al menos un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n} en la cual:

- n es un entero superior o igual a 2,

- P representa un residuo del aminoácido prolina,

- K representa un residuo del aminoácido lisina,

- el signo "-" simboliza una unión entre los dos residuos de aminoácidos y fundamentalmente una unión de tipo peptídico, las n unidades (P-K) están ligadas por uniones fundamentalmente de tipo peptídico.

De acuerdo con una variante de realización de la invención el polipéptido integrado en la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína responde a la fórmula K-(P-K)_{n}.

Los polipéptidos de la invención que responden a una de las fórmulas (P-K)_{n}, K-(P-K)_{n} o a variantes son sustituidos en una secuencia naturalmente presente en la \gamma-zeína de maíz normal o insertados con supresión de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína de maíz normal, o agregados en la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína normal, siendo seleccionado el sitio de inserción del polipéptido de manera tal que:

- cuando la \gamma-zeína modificada rica en lisina es producida en una célula huésped, fundamentalmente una célula vegetal, se localiza de manera idéntica o similar en esta célula a la \gamma-zeína de maíz normal que sería producida en las mismas condiciones, en la misma célula huésped y/o,

- la \gamma-zeína de maíz modificada es reconocida por anticuerpos dirigidos contra la \gamma-zeína normal de maíz.

La proteína P20\gammaZ representada en la Figura 11 o H30\gammaZ o H45\gammaZ representadas en la Figura 10, son ejemplos preferidos de la realización de la invención y representan \gamma-zeínas de maíz modificadas enriquecidas en lisina.

La invención tiene asimismo por objeto una célula huésped recombinante, que se caracteriza por comprender una secuencia de nucleótidos descrita antes.

Células huéspedes interesantes son por ejemplo las células de bacterias, tales como las de E coli o de Agrobacterium tumefaciens. Preferentemente, en el marco de la invención, y para la expresión estable de la proteína de reserva modificada buscada, se recurrirá a células huésped de origen vegetal.

A título de ejemplo, esas células de origen vegetal son células de semillas, de planta, y por ejemplo, a título preferido, células de endosperma de semillas de maíz.

La secuencia de nucleótidos de la invención se introduce preferentemente en el genoma de la célula huésped de manera estable y en condiciones tales que la proteína de reserva expresada enriquecida en aminoácidos y en particular en lisina se localiza como lo estaría la proteína normal correspondiente en la misma célula huésped.

Se dispone de técnicas variadas para transformar las células huésped. A título de ejemplo, y con vistas a transformar de manera estable o de manera transitoria las células huésped, se utilizarán las técnicas de electroporación, de bombardeo de microproyectiles que llevan el ADN, mediante cañón de partículas, a través del cultivo de explantes con Agrobacterium tumefaciens y por penetración de microfibras.

Además las células de endosperma de semillas de maíz, células de soja, de girasol, de tabaco, de trigo, de avena, de alfalfa, de arroz, de colza, de sorgo o de Arabidopsis se pueden emplear para expresar las secuencias de nucleótidos de la invención.

La presente solicitud se refiere también a las semillas que producen un polipéptido como el descrito antes y a las plantas que producen ese mismo polipéptido. Preferentemente, esas plantas son de maíz.

La invención también tiene por objeto semillas obtenidas a partir de las plantas transformadas que expresan el polipéptido de la invención, en otras palabras el polipéptido de reserva modificado enriquecido en determinados aminoácidos.

De acuerdo con un modo de realización particularmente interesante de la invención, las proteínas \gamma-zeínas modificadas enriquecidas en lisina, se expresan en los mutantes opaco-2 de maíz. Esos mutantes o2 descritos por Emerson R.A. et al. (1935, Cornell Univ. Agric. Exp. Stn. Mem, 180) y caracterizados por Mertz E.T. et al (1964, Science 145: 279-280) ven su contenido en lisina fuertemente aumentado mejorando así en gran medida las cualidades nutritivas del maíz (compensación de su bajo nivel en ese aminoácido esencial). Los maíces clásicos tienen un contenido de lisina de aproximadamente 0,24% del producto bruto (peso del grano total), los maíces opaco-2 se avecinan en cambio al 0,5% de lisina. Sin embargo presentan características agronómicas insuficientes porque su endosperma es mucho menos vidrioso y se manifiesta muy friable (fenotipo "starchy (almidonado)"). Esto tiene por efecto volverlos extremadamente sensibles a los organismos patógenos y a las etapas de tratamientos post cosecha. Ese fenotipo es de hecho debido a la disminución importante de ciertas proteínas de reserva en particular las alfa zeínas. De hecho Opaco-2 codifica un factor de transcripción necesario para la expresión de ciertos genes zeínas (Schmidt R. J. et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 46-50).

Se desarrollaron derivados de opaco-2 por mejoramiento genético clásico que no tienen más los inconvenientes precitados, se trata de los maíces QPM (Quality Protein Maize o maíz de alta calidad de proteína). El análisis genético reciente de esos maíces (Lopes M.A. et al, 1995, Theor. Appl. Genet. 19, 274-281) demostró que sólo 2 ó 3 loci son clave en esas modificaciones favorables. Análisis genéticos y bioquímicos más profundos permiten postular que uno de los 3 loci responsables es el locus \gamma-zeína: los genotipos de maíz que incluyen una duplicación de ese gen situado en la región centrométrica del cromosoma 7, demuestran todos ser modificadores de opaco-2 (Lopes M.A. et al, 1995, Mol. Gen. Genet 19: 247: 603-613).

La presente invención permite preparar maíces mutantes opaco-2 a partir de maíz que no tiene más que un gen de \gamma-zeína a nivel del cromosoma 7, que se complementan por agregado de una secuencia recombinante que codifica una \gamma-zeína de maíz enriquecida en lisina. Además del hecho de adquirir las propiedades de dureza similar a la de un maíz opaco-2 no mutante, tiene la ventaja de aumentar significativamente el contenido de lisina, superando así el de los maíces QPM.

La presente invención permite obtener mutantes opaco-2 de maíz modificados, en los cuales se insertó una secuencia de nucleótidos recombinante que codifica una \gamma-zeína de maíz enriquecida en lisina.

La invención también tiene por objeto un procedimiento para la obtención de plantas o de semillas que expresen una proteína de reserva modificada, caracterizado por comprender las etapas de:

a) transformación de una célula vegetal, con una secuencia de nucleótidos o un vector descritos antes, en condiciones que permitan la expresión de manera estable y funcional de la proteína de reserva modificada codificada por la secuencia de nucleótidos;

b) regeneración de plantas a partir de la célula de planta transformada de la etapa a), para obtener plantas que expresen la proteína de reserva modificada,

c) llegado el caso, obtención de semillas a partir de las plantas modificadas obtenidas en la etapa b).

De acuerdo con un modo de realización ventajoso de la invención, la planta transformada es el maíz y la proteína de reserva modificada enriquecida es la \gamma-zeína, enriquecida en lisina.

La invención se refiere también a las plantas obtenidas por puesta en práctica de un procedimiento como ese.

A fin de evaluar el contenido de un aminoácido dado de las plantas de acuerdo con la invención, es posible utilizar un protocolo de dosificación tal como el mencionado en Zarkadas et al, 1995, J. Agri. Food. Chem. Vol. 43: páginas 84-93.

Otras características y ventajas de la invención aparecen en los ejemplos y en las figuras que siguen.

Figura 1

- Mapa de restricción del plásmido pP20\gammaZ

Figura 2

- Mapa de restricción del plásmido pH45\gammaZ

Figura 3

- Representación esquemática de las proteínas codificadas por los genes modificados y no modificados de la \gamma-zeína: \gamma-zeína silvestre (\gammaZ), \gamma-zeínas ricas en lisina (P20\gammaZ, H30\gammaZ, H45\gammaZ y N13\gammaZ) que resultan de la inserción de los oligonucleótidos que codifican secuencias ricas en lisina. La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos insertados se indica utilizando el código de una letra de la representación de los aminoácidos. Se utilizan las abreviaturas siguientes:

Term: terminal;

DOMINIO ProX: dominio ligador prolina-Xaa.

Figura 4

- Análisis in vitro de las \gamma-zeínas ricas en lisina. (A) Traducción in vitro y translocación de los transcritos correspondientes a las \gamma-zeínas modificadas ricas en lisina; líneas 1, 5, 9 y 13: productos completos de traducción; líneas 2, 6, 10 y 14: productos completos de traducción después de la translocación en los microsomas caninos (CM); líneas 3, 7, 11 y 15: productos de translocación resistentes a la acción de la proteinasa K (PK); líneas 4, 8, 12 y 16: totalidad de productos de traducción después del tratamiento con la proteinasa K en presencia de 0,5% de Nonidet P40(NP40). (B) Inmunoprecipitación de los productos de traducción in vitro correspondientes a las proteínas \gamma-zeína y \gamma-zeínas modificadas ricas en lisina, utilizando el antisuero \alphaPL. Línea 1: \gamma-zeína; línea 2: P20\gammaZ; línea 3: H30\gammaZ; línea 4: H45\gammaZ y línea 5: N13\gammaZ. (C) Misma leyenda que para (B) pero utilizando el antisuero \alphaG2. Los marcadores de peso molecular (en kilodaltons) se indican sobre la izquierda.

Figura 5

- Actividad específica de tejido del promotor de la \gamma-zeína. Se cotransformaron endospermas de maíz, embriones y hojas de maíz por bombardeo de partículas utilizando las construcciones representadas en la figura (en la parte de la derecha). Las actividades relativas de la luciferasa (LUC, colonias en gris) y de la \beta-glucuronidasa (GUS, colonias sombreadas) se expresaron bajo la forma de un multiplicador de los valores obtenidos con proyectiles desnudos \pm la desviación estándar de las diferentes relaciones.

Figura 6

- Expresión de las \gamma-zeínas ricas en lisina en el endosperma subaleurónico de las células. (A) Inmunotransferencia con un antisuero \alphaPL, de proteínas extraídas de endospermas transformados por pN13\gammaZ (línea 2), pH45\gammaZ (línea 3), pH30\gammaZ (línea 4) y pP20\gammaZ (línea 5). El testigo (línea 1) corresponde a endospermas no transformados. Los marcadores de peso molecular (en kilodaltons) se indican a la izquierda. (B) expresión de los transcritos H45\gammaZ y N13\gammaZ en endospermas transformados de manera transitoria. Los ADNc obtenidos a partir de los tejidos transformados con pH45\gammaZ (línea 2), pN13\gammaZ (línea 3) y el testigo (línea 1) fueron amplificados por RCP y analizados utilizando un oligonucleótido sintético que codifica una secuencia rica en lisina como sonda.

Figura 7

- Acumulación de \gamma-zeínas ricas en lisina en los cuerpos proteicos del endosperma. (A) Análisis en inmunotransferencia utilizando el antisuero \alphaPL, de los cuerpos proteicos aislados a partir de los endospermas transformados con pP20\gammaZ (línea 1), pH30\gammaZ (línea 2), pH45\gammaZ (línea 3), pN13\gammaZ (línea 4) y ningún ADN (línea 5). (B) Análisis en inmunotransferencia utilizando el antisuero \alphaPL, de los cuerpos proteicos aislados a partir de los endospermas transformados con pP20\gammaZ, pH30\gammaZ y pH45\gammaZ y digeridos con la proteinasa K en presencia de un tampón isotónico (Sucr., líneas 1, 3 y 5) o un tampón hipotónico (H_{2}O, líneas 2, 4 y 6). Los marcadores de peso molecular (en kilodaltons) se indican sobre la izquierda.

Figura 8

- Colocalización de las proteínas P20\gammaZ con las \alpha- y las \gamma-zeínas en los cuerpos proteicos del endosperma del maíz. Se realizó un análisis inmunocitoquímico sobre cortes ultrafinos utilizando anticuerpos \alphaPL (marcados con partículas de oro de diámetro 15 nm) y anticuerpos \alphaZ y \alphaG2 (marcados con partículas de oro de 5 nm). (A) Cuerpos proteicos del endosperma transformado con pP20\gammaZ, inmunomarcados con el anticuerpo \alphaPL. (B) Inmunolocalización de P20\gammaZ (marcado con partículas de oro de 15 nm) y de la \alpha-zeína (marcada con las partículas de oro de 5 nm) en los cuerpos proteicos aislados a partir de los endospermas transformados con pP20\gammaZ. (C) y (D) Inmunolocalización de P20\gammaZ (marcado con las partículas de oro de 15 nm) y de las \gamma-zeínas (marcadas con las partículas de oro de 5 nm) en los cuerpos proteicos aislados a partir de los endospermas transformados con pP20\gammaZ. Las flechas indican los cortes tangenciales de los cuerpos proteicos.

Figura 9

- Secuencia codificante del ADNc de la \gamma-zeína de maíz y la secuencia de aminoácidos correspondien-
te.

Figura 10

- Secuencia codificante del ADNc de la H45\gammaZ-zeína de maíz y la secuencia de aminoácidos correspondiente.

La secuencia rica en lisina (28 aminoácidos) se introduce entre los residuos de aminoácidos 92 y 119 de la secuencia representada en la Figura 10.

Figura 11

- Secuencia codificante del ADNc de la P20\gammaZ-zeína de maíz y la secuencia de aminoácidos correspondien-
te.

La secuencia rica en lisina (14 aminoácidos) se introduce entre los residuos de aminoácidos 92 y 119 de la secuencia representada en la Figura 11.

Figura 12

- Mapas de restricción de los plásmidos pBin 19P20\gammaZ y pBin 19H30\gammaZ.

Figura 13

- Endospermas de las plantas de maíz transgénicas que acumulan la \gamma-zeína enriquecida en lisina

A y B: SDS-page e inmunotransferencia utilizando el antisuero \alphaPL

\newpage

A) 10 \mug de proteína por pista (transformantes con el constructo H45\gammaZ)

pista C: extracto proteico de los endospermas de híbridos B73xA188 (control)

pista 1: A1

pista 2: B1

pista 3: B2

pista 4: C1

pista 5: D1

pista 6: D2

\vskip1.000000\baselineskip

B) 1 \mug de proteína por pista (transformantes con el constructo P20\gammaZ)

pista C: control

pista 1: A1

pista 2: A2

pista 3: B1

pista 4: C1

pista 5: D1

pista 6: E1

\vskip1.000000\baselineskip

C) SDS-page y coloración con plata (3 transformantes P20\gammaZ y 3 transformantes H45\gammaZ)

\vskip1.000000\baselineskip

1

Figura 14

- Contenido de \gamma-zeína enriquecida en lisina por grano (transformantes 45\gammaZB1 y C1)

A: coloración con plata; 10 \mug de proteína por pista

\newpage

B: inmunotransferencia utilizando el antisuero \alphaPL; 1 \mug de proteína por pista

Pistas 1 a 5: extractos proteicos de diferentes endospermas del transformante 45\gammaZ B1.

Pistas 6 a 10: extractos proteicos de diferentes endospermas del transformante 45\gammaZ C1.

Figura 15

A) Contenido de \gamma-zeína enriquecida en lisina de 10 granos (transformante 45\gammaZ C1) utilizando el antisuero \alphaPL 1 \mug de proteína por pista

Pistas 1 a 10: extracto de endospermas de 10 descendientes

B) Inmunotransferencia de los extractos proteicos de los endospermas 1 a 5 presentes en A) y marcados con el antisuero \alphaG2; 2 \mug de proteína por pista.

Ejemplos A) Preparación de \gamma-zeínas modificadas enriquecidas en lisina y expresión de esas proteínas modificadas seguida de la acumulación en los cuerpos proteicos de las células del endosperma de maíz

La \gamma-zeína es una proteína de reserva del maíz, que tiene un peso molecular de 28 kD, rica en azufre, que se acumula en las células del endosperma con las \alpha- y \beta-zeínas, en los cuerpos proteicos derivados del retículo endoplasmático granular (ER) (Ludevid et al., 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234; Lending et al., 1984, Plant Cell 1, 1.011-1.023). La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia nucleotídica del ADNc (Prat et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13, 1493-1504) y de los clones genómicos (Boronat et al., 1986, Plant Sci. 47, 95-102) muestra que la \gamma-zeína no tiene homología con los polipéptidos de tipo \alpha-zeína. Aunque la \gamma-zeína sea codificada por 1 a 2 genes por genoma haploide (Boronat et al., 1986, Plant Sci. 47, 95-102) representa 10 a 15% de la totalidad de las proteínas de los endospermas de maíz. La expresión del gen de la \gamma-zeína en sistemas heterólogos tales como los oocitos de Xenopus (Torrent et al., 1994, Planta 192, 512-518) y en Arabidopsis thaliana (Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1911-1922), indica que los polipéptidos de \gamma-zeína permanecen estables y son capaces como tales de formar cuerpos proteicos derivados del retículo endoplasmático, en el interior de las células. Además, análisis por supresión de diferentes dominios estructurales de la \gamma-zeína mostraron que la secuencia N-terminal que incluía el dominio repetido rico en prolina, era responsable de la retención de la \gamma-zeína en el retículo endoplasmático y que el dominio C-terminal rico en cisteína era responsable de la formación de los cuerpos proteicos. El dominio Pro-X no parecía relacionado con la estabilidad de la proteína ni con su localización selectiva (Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1.911-
1.922).

Material y métodos Material vegetal

Después de una esterilización en superficie (1) los granos de estadio 17 DAP ("días después de la polinización, por sus siglas en inglés") del maíz de selección W64A se disecaron manualmente y la capa de pericarpo y de aleurona se separó de los endospermas. Se realizaron cortes tangenciales de manera de exponer una gran parte de la superficie subaleurónica. Cuando fue necesario, se aislaron embriones y se disecaron hojas de plantas de 7 días para retirar el tejido epidérmico. Después de la disección, las muestras se depositaron en placas de Petri sobre papeles de filtro humedecidos con medio MS (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497).

Construcciones plamídicas

Se obtuvo un primer conjunto de plásmidos, pKSG2, pHbP2, pPbP4 y pNaN1 para permitir la introducción de sitios de restricción en el gen que codifica la \gamma-zeína. Se construyeron pKSG2 y pHbP2 según la descripción de la publicación de Torrent M. et al. (Planta (1994) 192: 512-518). El plásmido pKSG2 contiene la secuencia codificante de la \gamma-zeína.

El plásmido pHbP2 se obtiene a partir de pKSG2 y contiene una secuencia que codifica una \gamma-zeína mutada en la cual se suprimió el dominio Pro-X de la proteína.

El plásmido pPbP4 se obtuvo a continuación de dos etapas de clonación: (i) el fragmento de restricción SaII-PvuII de 350 bp de pKSG2 se clonó en un plásmido Bluescript (pBSKS, Stratagene, La Jolla, California EE.UU.) restringido con SaII y EcoRV (pKSC4) y (ii) el fragmento de restricción PvuII-XbaI de 600 bp de pKSG2 se clonó en los sitios de restricción SmaI-XbaI de pKSC4. La nueva construcción pPbP4 contiene un sitio de restricción útil EcoRI justo delante del dominio P-X de la secuencia codificante de la \gamma-zeína.

El plásmido pNaN1 se obtuvo de la misma manera mediante dos etapas de clonación: (i) el fragmento NaeI-XbaI de 250 bp de pKSG2 se clonó en el plásmido pBSKS restringido con EcoRV-XbaI (pKSC8) y (ii) el fragmento de restricción NaeI-HindIII de 700 bp (con extremos romos) de pKSG2 se clonó en el sitio de restricción HindIII de pKSC8. La nueva construcción, pNaN1, contiene sitios de restricción ClaI y HindIII en una posición situada 15 nucleótidos por delante del codón de parada de la \gamma-zeína.

Dos oligonucleótidos sintéticos que responden a las secuencias siguientes; SEC. Nº de ID 1: 5'CGATGAATT
CAAACCAAAGCCAAAGCCGAAGCCAAAAGAATTCA3', y su secuencia inversa denominada SEC. Nº de ID 2, cuya secuencia en la siguiente: 5'AGCTTGAATTCTTTTGGCTTCGGCTTTGGCTTTGGTTTGAATTCAT3' que codifican secuencias ricas en lisina designadas K(P-K)_{4}, se hibridaron, se digirieron con EcoRI y se clonaron en un sitio EcoRI de pHbP2 y pPbP4. Se seleccionaron tres clones: pPo2 y pHo3 que contenían la secuencia que codifica K(P-K)_{4} y pHo4 que comprende la forma truncada de la secuencia que codifica la \gamma-zeína que contiene un tándem 2K(P-K)_{4} (bajo forma de una secuencia K(P-K)_{4} EF K(P-K)_{4}) de la secuencia codificante rica en lisina. Los mismos oligonucleótidos hibridados se digirieron con enzimas ClaI-HindIII y se clonaron en el plásmido pNaN1 restringido con ayuda de las mismas enzimas. El clon seleccionado, pNo1, contenía la secuencia que codifica la secuencia rica en lisina K(P-K)_{4} en el extremo N-terminal de la \gamma-zeína modificada correspondiente.

Para la transformación transitoria del endosperma, las secuencias que codifican la \gamma-zeína modificada de pPo2 y pHo3 se insertaron bajo la forma de fragmentos HincII-NheI en sitios SmaI-XbaI de pDH51 (Pietrzah et al., 1986, Nucl. Acid Res. 14, 5.857-5.868) que contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). La construcción pP20\gammaZ obtenida mediante la inserción descrita antes de los fragmentos HincII-NheI en el plásmido pDH51 contiene la secuencia codificante de la \gamma-zeína enriquecida en lisina (Figura 8) así como las señales de la secuencia 35S del virus CaMV para la formación del extremo 3' y la poliadenilación. La secuencia codificante quimera P20\gammaZ se construyó a partir de la región codificante de la \gamma-zeína contenida en el plásmido pKSG2 después de diferentes etapas de clonación. El promotor de 1,7 kb de la \gamma-zeína (Reina et al. 1990, Nucl. Acids Res. 18, 6.426) se insertó en los extremos romos de un fragmento HindII-PvuI en pHo4 y pNo1 restringidos con Xho1 y obtenidos con extremos romos. Se obtuvieron las construcciones pH45\gammaZ y pN13\gammaZ respectivamente.

Las nuevas construcciones, denominadas respectivamente pP20\gamma-Z, pH30\gammaZ, pH45\gammaZ y pN13\gammaZ se utilizaron en experiencias de bombardeo biolístico.

Para estudiar la especificidad de diferentes promotores en lo que concierne a tejidos vegetales, se utilizaron dos construcciones p1.7\gammaZGUS y pCaMV35SLUC. Se obtuvo p1.7\gammaZGUS por inserción del promotor de la \gamma-zeína de 1,7 kb (HindIII-PvuI) en un plásmido derivado de pPuC18 que contiene el gen GUS y las señales NOS de poliadenilación en 3' de pBI 101.1 (Jefferson et al., 1987, Embo. J. 6, 3.901-3.907). Se obtuvo pCaMV35SLUC por inserción del gen que codifica la luciferasa (LUC) de pAHC18 (Bruce et al., 1989, P. H, 86, 9.692-9.696) en el poliligador de pDH51 (Pietrzak et al., 1986, Nucl. Acids Res, 18, 6.426).

Análisis in vitro

Los plásmidos derivados de pBSKS que contenían las secuencias codificantes de la \gamma-zeína (pKSG2) y de la \gamma-zeína rica en lisina (pPo2, pHo3, pHo4 y pNo1) se transcribieron in vitro siguiendo los protocolos estándar (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York). Se realizaron una traducción in vitro y una translocación de los transcritos sintéticos según la técnica de Torrent et al., (1994, Planta 192, 512-518), con excepción de los microsomas caninos (CM) utilizados que provenían de Promega (Madison, Wis., EE.UU.). La inmunoprecipitación de los productos traducidos se efectuó esencialmente según el método de Borgese y Gaetani (1980) utilizando un suero de conejo anti-\gamma-zeína\alpha-G2, (Ludevid et al., 1985, Plant Sci. 41, 41-48) y un antisuero \alphaPL. \alphaPL es un antisuero policlonal de conejo obtenido contra el péptido sintético EFK(P-K)_{8}EF. Ese péptido se sintetizó utilizando la técnica de síntesis en fase sólida descrita por Celma et al., 1992.

Bombardeo de microproyectiles

El ADN plasmídico se absorbió sobre partículas de oro (1,0 \mum, Bio-Rad, Lab., Richmond, CA, EE.UU.) según un protocolo descrito por Kikkert (Plant Cell, 33:221-226, 1993). Se bombardearon todos los blancos dos veces, utilizando el dispositivo BioRad Biolistic PDS-1000/He. Los blancos se posicionaron 8 cm por detrás de una pantalla que paraba los macroportadores que estaban posicionados 1 cm por debajo del disco de ruptura 900 PSI. Después del bombardeo, las muestras se incubaron durante 24 horas a 26ºC en la oscuridad. Los testigos estaban constituidos por los blancos bombardeados con microproyectiles desprovistos de ADN.

Pruebas enzimáticas

Los tejidos bombardeados con los plásmidos p1.7\gammaZGUS y pCaMV35SLUC se homogeneizaron sobre vidrio en un tampón que contenía Tris 25 mM a pH 7,8, DTT 2 mM, 10% de glicerol y 1% de Triton X-100. Después de la centrifugación a 12.000 xg durante 5 minutos, se decantaron los sobrenadantes y se cuantificó la proteína soluble total en los extractos utilizando la prueba de Bradford (Bio-Rad). Se analizó la actividad de GUS por análisis fluorimétrico según la descripción de Jefferson (1987) utilizando la 4-metil-umbeliferil-\beta-D-glucuronida (MUG) como sustrato. La actividad de LUC se determinó utilizando el sistema de prueba de luciferasa (Luciferase Assay System Kit) difundido por Promega, según las instrucciones del fabricante.

Extracción de las proteínas de reserva y análisis en gel de las proteínas

Se redujeron al estado de harina endospermas transformados con pP20\gammaZ, pH20\gammaZ, pH45\gammaZ y pN13\gammaZ y las \alpha-zeínas se extrajeron con ayuda de tres series de solventes que contenían 70% de etanol. La harina residual se secó al aire, y se extrajeron las proteínas totales con un tampón que contenía Tris-HCl 0,25 M de pH 6,8, dodecilsulfato de sodio al 4% (SDS) y 2-mercaptoetanol al 5%, durante 1 hora a temperatura ambiente. Se analizaron los extractos de proteínas por SDS-PAGE e inmunotransferencia según la descripción de Ludevid et al., 1985. Se incubaron hojas de nitrocelulosa con el antisuero \alphaPL (dilución 1:500) y se utilizó peroxidasa de Raifort conjugada con un anticuerpo secundario (ECL Western Blotting System, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) para la detección de la proteína.

Análisis de la expresión del ARN

Se extrajo el ARN total según la descripción de Logemas et al., 1987. Se preparó el ADN complementario (ADNc) utilizando la transcriptasa inversa y el oligo dT de Gibco BRL (Gaithersburg, MD, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante y ese ARN se amplificó por una reacción de RCP. Los oligonucleótidos cebadores utilizados para la RCP eran secuencias de 20-mer correspondientes a los extremos 5' y 3' del gen estructural de la \gamma-zeína. Se utilizaron protocolos estándar para la preparación de sondas marcadas con ^{32}P, y para el análisis en gel del ADN (Sambrook et al. Molecular Cloning; A laboratory manual, 2da, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York) utilizando un oligonucleótido sintético que codifica una secuencia rica en lisina (vea antes) como sonda.

Aislamiento de los cuerpos proteicos y tratamiento con la proteasa

Esos protocolos se describieron anteriormente (Torrent et al., Planta, 180: 90-95, 1989).

Microscopía electrónica

Los cuerpos proteicos de los endospermas de tipo silvestre y endospermas transformados por pP20\gammaZ se fijaron con 2,5% de paraformaldehído en tampón de fosfato 20 mM a pH 7,2, durante 1 hora a temperatura ambiente, y se transformaron según la descripción de Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1911-1922) utilizando sin embargo un antisuero \alpha-PL y un coloide de oro y de proteína A que tenía un diámetro de 15 nm. Para el doble marcado, se incubaron primero cortes ultra finos con \alpha-PL y se utilizó el coloide de oro y de proteína A (15 nm de diámetro) para la detección del anticuerpo. Después del lavado, se incubaron cortes con 0,15 mg/mL de proteínas A durante 20 minutos para saturar las inmunoglobulinas y finalmente se incubaron las rejillas con sueros \alpha-G2 o \alpha-Z1 y se utilizó el coloide o/la proteína A (diámetro 5 nm) para la detección de los anticuerpos. \alpha-Z1 es un antisuero policlonal de conejo dirigido contra la \alpha-zeína obtenido según la descripción de Ludevid et al., 1985, Plant Sci. 41, 41-48).

Resultados Construcción de las \gamma-zeínas ricas en lisina

Los inventores habían demostrado la importancia del dominio repetido rico en prolina ("proline-rich repeat") y el dominio C-terminal rico en cisteína para la retención en el retículo endoplasmático de la \gamma-zeína y la formación de los cuerpos proteicos que contienen esas proteínas en las células de hojas de Arabidopsis (Geli et al., 1994, Plant Cell 6, 1.911-1.922). Sobre la base de esos resultados preliminares, se investigó la posibilidad de insertar secuencias ricas en lisina en diferentes dominios de la \gamma-zeína, de manera de crear una \gamma-zeína modificada correctamente dirigida y acumulada en las células del endosperma a fin de mejorar las cualidades nutritivas del maíz.

Los inventores construyeron ahora genes modificados de la \gamma-zeína por introducción de oligonucleótidos sintéticos que codifican secuencias ricas en lisina en diferentes sitios de la secuencia codificante de la \gamma-zeína. Se crearon construcciones de \gamma-zeína modificada de manera de evitar la colocación de las secuencias codificantes ricas en lisina en los dominios constituidos por el dominio repetido en tándem y el dominio rico en cisteína. Se efectuaron modificaciones de la secuencia codificante de la \gamma-zeína en la secuencia correspondiente al dominio Pro-X. Además para minimizar una alteración del repliegue de la proteína, se definieron las secuencias ricas en lisina (P-K)_{n} para imitar la secuencia del dominio Pro-X. Como se ve en la Figura 3, en la proteína P20\gammaZ, se introdujo una secuencia K(P-K)_{4}, después de la región Pro-X y en la proteína H30\gammaZ y en la proteína H45\gammaZ, secuencias de aminoácidos que comprendían K(P-K)_{4}
y 2K(P-K)_{4} respectivamente reemplazan el dominio Pro-X de la \gamma-zeína (\gammaZ, Fig. 3). Para explorar si el extremo C-terminal era un sitio permisivo para la introducción de las secuencias ricas en lisina, se creó una proteína suplementaria N13\gammaZ, mediante la inserción de una secuencia que contenía K(P-K)_{4} cinco aminoácidos secuencia arriba del extremo C-terminal (Fig.3).

Actividad del promotor de la \gamma-zeína en el endosperma de maíz transformado

Para determinar si se podían expresar \gamma-zeínas ricas en lisina en las células del endosperma, se buscaron primero un promotor eficaz y un sistema de transformación. Se analizaron un promotor de la \gamma-zeína, que contenía una secuencia secuencia arriba de 1,7 Kb (Reina et al., 1990, Nucleic Acid Research, vol. 18, p. 6.426) y el promotor CaMV que contenía 625 bp de la secuencia secuencia arriba de la proteína 35S del virus del mosaico de la coliflor CaMV. Hasta el presente no se disponía de ninguna información sobre el análisis funcional de las fusiones de genes con el promotor de la \gamma-zeína en las plantas monocotiledóneas transgénicas. Para analizar la actividad y la especificidad tisular del promotor de la \gamma-zeína, se construyeron dos genes quimera (vea la Fig. 5). Se utilizó la expresión transitoria por bombardeo biolístico (Klein et al., 1988 PNAS 85:4.305) como procedimiento de transformación del maíz para el análisis del promotor así como para experiencias de expresión de las \gamma-zeínas ricas en lisina. Se bombardearon endospermas de maíz de estadio 17 DAP (17 días después de la polinización) (el pericarpo y las células de la capa aleurónica se habían retirado), embriones (17 DAP) y hojas jóvenes (de 10 días de edad) con proyectiles de oro recubiertos con el ADN plasmídico que contenía las dos construcciones. La Figura 5 muestra las actividades de \beta-glucuronidasa (GUS) y de luciferasa (LUC) presentes en los tres tejidos analizados: el endosperma, el embrión y la hoja, con relación a la experiencia testigo. Se debe notar que los resultados corresponden a la media de al menos 3 experiencias independientes realizadas. Toda la actividad de GUS bajo el control del promotor de la \gamma-zeína estaba restringida al endosperma, puesto que no se detectó ninguna expresión de GUS en el embrión ni en las hojas. Además, los endospermas bombardeados se colorearon histoquímicamente para determinar el número de agrupaciones celulares que expresan la proteína GUS. El perfil de coloración corroboraba los resultados precedentes, GUS era fuertemente expresada en los endospermas (el número promedio de agrupaciones celulares coloreadas para GUS por endospermas era de 150) y no se detectaron manchas azules en el embrión ni en las hojas. Al contrario el promotor CaMV 35S confería una actividad de LUC en todos los tejidos analizados (Fig. 5), pero existían sin embargo diferencias cuantitativas entre la actividad relativa de la enzima en las hojas y los embriones con relación al endosperma. Esas diferencias se podían atribuir a una variabilidad intrínseca de la actividad constitutiva del promotor CaMV entre los diferentes tejidos del maíz o a una penetración débil de las partículas recubiertas por el ADN en las células mesófilas que contenían un sistema vacuolar importante. Existen en el estado de la técnica pruebas según las cuales el promotor CaMV tendría habitualmente una actividad débil en células de plantas monocotiledóneas (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82, 5.824-5.828); sin embargo los inventores mostraron aquí una actividad fuerte del promotor CaMV en células de endospermas. Esto permitió concluir que la actividad del promotor de la \gamma-zeína y del promotor CaMV 35S era muy fuerte en los endospermas de maíz y también que los dos promotores podían probar ser útiles para controlar la expresión de la proteína en ese tejido.

Para determinar si las proteínas mutantes codificadas por las construcciones eran competentes para la función de translocación de la membrana, se efectuaron experiencias de transcripción-traducción in vitro en presencia de microsomas pancreáticos de perro. Se tradujeron los transcritos sintéticos de cada construcción y se analizó la translocación a través de las membranas de microsomas por búsqueda de la protección frente a la digestión por la proteinasa K. Esos resultados informados en la Figura 4A indican que los pesos moleculares aparentes de los polipéptidos sintetizados in vitro reflejan las mutaciones introducidas (Fig. 4A, líneas 1, 5, 9 y 13). En presencia de los microsomas y de la proteinasa K, no se observaron péptidos de bajo peso molecular, lo que indica que las cadenas polipeptídicas completas de las \gamma-zeínas modificadas eran transportadas a través de las membranas microsomales (Fig. 4A, líneas 3, 7, 11 y 15). Comparando el resultado de la translocación de las cuatro \gamma-zeínas modificadas, se observó que la proteína H45\gammaZ (Fig., 4A, línea 11), que contenía la inserción de 10 aminoácidos de tipo lisina, sufrió una translocación inferior a las otras proteínas. Parece que los residuos cargados negativamente podrían interferir en una cierta proporción, sobre la eficacia de la translocación. Al no poder utilizarse el anticuerpo policlonal \alphaG2, dirigido contra la \gamma-zéina (Ludevid et al., 1985, Plant Sci. 41, 41-48) para distinguir entre la \gamma-zeína de tipo silvestre y las \gamma-zéinas modificadas, se preparó un anticuerpo \alphaPL dirigido contra un péptido sintético que contenía la secuencia de aminoácidos rica en lisina. A continuación se analizó si las proteínas modificadas sintetizadas in vitro eran reconocidas a la vez por los anticuerpos \alphaG2 y los anticuerpos \alphaPL. Esta experiencia se ilustró en la Figura 4B y la Figura 4C donde los transcritos sintéticos de la \gamma-zeína, P20\gammaZ, H30\gammaZ, H45\gammaZ y N13\gammaZ eran traducidos in vitro y en los cuales los productos de traducción eran inmunoprecipitados con \alphaPL (Fig. 4B) y con \alphaG2 (Fig. 4C). Esos resultados indican que las \gamma-zéinas ricas en lisina eran reconocidas por los dos anticuerpos (ver Fig. 4B y C, líneas 2 a 5) y que la \gamma-zeína era reconocida solamente por el suero \alphaG2 (Fig. 4B y C, línea 1). De este modo la especificidad de los anticuerpos \alphaPL para las proteínas modificadas permitió distinguir la \gamma-zeína rica en lisina de la \gamma-zeína endógena cuando los genes modificados eran expresados en células de endosperma. Tomadas en conjunto estas experiencias mostraron que la presencia de secuencias ricas en lisina no perturbaba la función de translocación a través de la membrana ni el comportamiento inmunológico de la \gamma-zeína.

Análisis de la expresión de las \gamma-zeínas enriquecidas en lisina en los endospermas de maíz

Para explorar si la \gamma-zeína modificada rica en lisina era expresada y acumulada en las células del endosperma, se bombardearon granos de estadio 17 DAP con el ADN que contenía las secuencias que codifican la proteína de las cuatro construcciones (Fig. 3) bajo el control del promotor CaMV (P20\gammaZ y H20\gammaZ) y del promotor de la \gamma-zeína (H45\gammaZ y N13\gammaZ). Se utilizaron construcciones que comprendían promotores antisentido o desprovistas de promotores como testigos. Después de 24 horas de transformación de los endospermas, se extrajeron las proteínas totales y se ensayó la expresión de las \gamma-zeínas modificadas por inmunotransferencia utilizando anticuerpos \alphaPL. La Figura 6A muestra que los genes quimera de \gamma-zeína que contenían la inserción (Pro-Lys)_{n} después del dominio Pro-X (P20\gammaZ) o lo reemplazaban (H45\gammaZ y H30\gammaZ) eran fuertemente expresados y los productos de traducción eran acumulados eficazmente en las células del endosperma (Fig. 6A, línea 3, 4 y 5). Para cada línea, los extractos de proteína correspondían aproximadamente a 1/3 de un endosperma bombardeado, lo que permite estimar que la cantidad de proteínas modificadas P20\gammaZ, H30\gammaZ y H45\gammaZ por endosperma alcanzaba el nivel del nanogramo. Además, no se observó ninguna diferencia cuantitativa entre los niveles de expresión de los genes quimera bajo el control del promotor CaMV y del promotor de la \gamma-zeína, lo que confirma los resultados antes descritos obtenidos con las proteínas marcadores GUS y LUC (Fig. 5). Se observó que el anticuerpo \alphaPL reconocía una proteína de aproximadamente 30 kD presente en los extractos de proteína total, incluso en los endospermas sin transformar (ver la banda débil presente en las cuatro líneas de la Figura 6A). Un procedimiento de extracción secuencial de proteína permitió constatar que esta proteína no era una proteína de reserva soluble en un medio acuoso.

Como muestra la Figura 6A (línea 2) no se detectó ninguna traza de la proteína N13\gammaZ, lo que indica que el gen quimera correspondiente no se había expresado en las células del endosperma o que la proteína N13\gammaZ se había degradado. Se analizaron los ARN de los endospermas transformados con los ADN que codifican las proteínas H45\gammaZ y N13\gammaZ así como los ARN de los endospermas sin transformar. A partir de los ARN totales, se prepararon y amplificaron los ADNc por RCP utilizando cebadores específicos. La Fig. 6B muestra el análisis en transferencia de tipo Southern de tres muestras de ADNc híbridas con un oligonucleótido que codifica una secuencia K(Pro-Lys)_{4} utilizada como sonda. Los resultados indican que el gen N13\gammaZ era expresado correctamente (Fig. 6B, línea 3). La presencia de bandas en las muestras H45\gammaZ y N13\gammaZ, pero no en los endospermas sin transformar, sugirió que la proteína N13\gammaZ era degradada durante las 24 horas de la incubación. A partir de esas observaciones, los inventores concluyeron que el sitio de inserción de las secuencias ricas en lisina era crítico para la estabilidad de la \gamma-zeína modificada.

La \gamma-zeína enriquecida en lisina se acumula en los cuerpos proteicos

Aparte del contenido de lisina de las secuencias Pro-X, las proteínas P20\gammaZ, H30\gammaZ y H45\gammaZ tenían características comunes con la \gamma-zeína de tipo silvestre: el péptido señal, el dominio repetido en tándem N-terminal y la región rica en cisteína C-terminal estaban emparentados. Pareció importante determinar si esos dominios permanecían totalmente funcionales conservando el reconocimiento y la formación de los cuerpos proteicos o si las secuencias ricas en lisina creaban un ambiente especial en el cual esas propiedades podían ser perturbadas. Para probar esto, se investigó si las \gamma-zeínas modificadas eran capaces de acumularse en los cuerpos proteicos. Se realizó un fraccionamiento subcelular con los endospermas transformados. Los homogeneizados de endospermas bombardeados se cargaron sobre gradientes de sacarosa discontinuos (20%, 50% y 70% de sacarosa) y todas las fracciones recogidas se analizaron por inmunotransferencia. No se detectaron P20\gammaZ, H30\gammaZ ni H45\gammaZ sedimentadas sobre la fracción de los cuerpos proteicos ni ninguna cantidad significativa de esas proteínas, ni en el sobrenadante ni en la fracción microsomal (Fig. 7A, líneas 2, 2 y 3). Aunque las experiencias hechas preliminarmente in vitro (Fig. 4A) hubieran permitido constatar que las \gamma-zeínas modificadas recientemente sintetizadas sufrían una translocación en los microsomas caninos, aquí se probó si las proteínas modificadas expresadas in vivo en células de endosperma, sufrían una translocación en la membrana del retículo endoplasmático y permanecían en el interior de los cuerpos proteicos derivados del retículo endoplasmático. Por esta razón, se sometieron cuerpos proteicos aislados a una digestión por la proteinasa K en tampones isotónicos (que contenían 20% de sacarosa) o después de un choque osmótico en el agua (Fig. 7B). Las proteínas protegidas por enzimas contra la degradación proteolítica pueden estar rodeadas por una membrana y un tratamiento con soluciones detergentes o hipotónicas dio como resultado la digestión de las proteínas (Walter et Blobel, 1983, Method Enzymol. 96, 84-93). Una comparación de las intensidades de las bandas, después de la digestión por la proteinasa K en medios que contenían sacarosa o agua, permitió revelar que las proteínas P20\gammaZ, H30\gammaZ y H45\gammaZ estaban protegidas de la digestión en tampones isotónicos (líneas 1, 3 y 5) pero eran parcialmente digeridas en el agua (líneas 2, 4 y 6).

La expresión de los genes modificados de la \gamma-zeína en las células de la capa de la subaleurona del endosperma por bombardeo biolístico permitió observar que había gran acumulación de \gamma-zeínas ricas en lisina con excepción del caso donde las secuencias ricas en lisina estaban posicionadas 5 residuos secuencia arriba del extremo C-terminal del polipéptido de la \gamma-zeína. A partir de esta expresión y de estudios inmunocitoquímicos sobre cuerpos proteicos aislados, los inventores demostraron que se acumulan correctamente \gamma-zeínas ricas en lisina en esos organelos y que se localizan junto con las proteínas endógenas \gamma-zeína y \alpha-zeína.

Se examinaron cuerpos proteicos aislados a partir de los endospermas P20\gammaZ por marcado de tipo inmunogold (inmunocitoquímica con oro coloidal) y microscopía electrónica. En cortes ultra finos incubados con el anticuerpo \alphaP-L (Fig. 8A), se detectó el marcado con oro en el interior de los cuerpos proteicos, lo que indica que la proteína P20\gammaZ rica en lisina se acumulaba en el interior de esos organelos. En cortes incubados solamente con el anticuerpo \alphaP-L, el inmunomarcado tenía lugar únicamente sobre algunos cuerpos proteicos (que contenían la \gamma-zeína rica en lisina), la parte más grande de los cuerpos proteicos aislados no estaba inmunomarcada con anticuerpo \alphaP-L porque éstos correspondían a células de endosperma sin transformar. Para determinar si la \gamma-zeína rica en lisina se colocalizaba con los polipéptidos \alpha-zeínas y \gamma-zeínas, se realizó un doble marcado en inmunoelectromicroscopía sobre cuerpos proteicos aislados utilizando los anticuerpos \alphaZ y \alphaP-L (Fig. 8B) y \alphaG2 y \alphaP-L (Fig. 8C y D). La Figura 8B muestra una micrografía del corte transversal de dos cuerpos proteicos marcados con el anticuerpo \alphaP-L (partícula de oro de 15 nm) y con el anticuerpo \alphaZ (partícula de oro de 5 nm). El resultado de la inmunocoloración mostró que la proteína P20\gammaZ se acumula en los cuerpos proteicos y se colocaliza con la \alpha-zeína (ver la extensión del marcado de la \alpha-zeína sobre toda la superficie del cuerpo proteico). Por otra parte, se incubaron cortes tangenciales (Fig. 8B, ver las flechas) y transversales (Fig. 8D) de los cuerpos proteicos con el anticuerpo \alphaP-L (partícula de oro de 15 nm) y con el anticuerpo \alphaG2 (partícula de oro de 5 nm). En los dos casos, la proteína P20\gammaZ estaba colocalizada con los polipéptidos \gamma-zeínas. Se pudo notar que los cortes tangenciales del cuerpo proteico (Fig. 8A, C, ver las flechas) eran fácilmente distinguibles de los cortes transversales del cuerpo proteico en la medida en que los primeros presentaban una densidad electrónica mayor y que el marcado de la \gamma-zeína estaba extendido sobre todo el corte. Al contrario los cortes transversales presentaban una densidad inferior y el marcado de la \gamma-zeína estaba localizado sobre la membrana que rodea el cuerpo proteico. En los dos casos, la localización del marcado de la \gamma-zeína rica en lisina seguía la de la \gamma-zeína endógena.

B) Preparación de plantas genéticamente modificadas, que expresan \gamma-zeínas ricas en lisina 1) Obtención y utilización de callo de maíz como blanco para la transformación genética

La transformación genética del maíz, cualquiera sea el método empleado (electroporación; Agrobacterium, microfibras, cañón de partículas) requiere generalmente la utilización de células sin diferenciar en divisiones rápidas que hayan conservado una aptitud para la regeneración de plantas enteras. Ese tipo de células compone el callo friable embriógeno (denominado de tipo II) de maíz.

Esos callos se obtienen a partir de embriones inmaduros de genotipo Hi II o (A188 x B73) según el método y en los medios descritos por Armstrong (Maize Handbook; (1994) M. Freeling, V. Walbot Eds; pp. 665-671). Los callos obtenidos de esa manera se multiplican y mantienen por repiques sucesivos cada quince días en el medio de iniciación.

A continuación las plántulas se regeneran a partir de esos callos modificando el equilibrio hormonal y osmótico de las células según el método descrito por Vain et al. (Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989 18: 143-151). A continuación esas plantas se aclimatan en invernadero en donde se pueden cruzar o autofecundar.

2) Utilización del cañón de partículas para la transformación genética del maíz

El párrafo precedente describe la obtención y la regeneración de las líneas celulares necesarias para la transformación; acá se describe un método de transformación genética que conduce a la integración estable de los genes modificados en el genoma de la planta. Este método se basa en la utilización de un cañón de partículas idéntico al descrito por J. Finer (Plant Cell Report (1992) 11: 323-328); las células diana son fragmentos de los callos descritos en el párrafo 1. Esos fragmentos de una superficie de 10 a 20 mm^{2} se dispusieron, 4 h antes del bombardeo, a razón de 16 fragmentos por placa en el centro de una placa de petri que contenía un medio de cultivo idéntico al medio de iniciación, con agregado de manitol 0,2 M + sorbitol 0,2 M. Los plásmidos que incluyen los genes que se van a introducir se purifican en columna Qiagen® siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación se precipitan sobre partículas de tungsteno (M10) siguiendo el protocolo descrito por Klein (Nature (1987) 327: 70-73). Las partículas recubiertas de esa manera se proyectan hacia las células diana con ayuda del cañón y según el protocolo descrito por J. Finer (Plant Cell Report (1992) 11: 323-328).

Las placas de callos bombardeadas de esa manera se sellan a continuación con ayuda de Scellofrais® y después se cultivan en la oscuridad a 27ºC. El primer repique tiene lugar 24 h después, y después cada quince días durante 3 meses en el medio idéntico al medio de iniciación con agregado de un agente selectivo cuya naturaleza y concentración pueden variar según el gen utilizado (ver párrafo 3). Los agentes selectivos que se pueden utilizar consisten generalmente en compuestos activos de ciertos herbicidas (Basta®, Round up®) o ciertos antibióticos (Higromicina, Kanamicina...).

Se obtienen después de 3 meses o a veces antes, callos cuyo crecimiento no fue inhibido por el agente selectivo, habitualmente y mayoritariamente compuestos de células resultantes de la división de una célula que haya integrado en su patrimonio genético una o varias copias del gen de selección. La frecuencia de obtención de dichos callos es de aproximadamente 0,8 callo por placa bombardeada.

Esos callos se identifican, individualizan, amplifican y después cultivan de manera de regenerar plántulas (cf. párrafo 1). A fin de evitar toda interferencia con células sin transformar todas esas operaciones se llevan a cabo en medios de cultivo que contienen el agente selectivo.

Las plantas así regeneradas se aclimatan y después se cultivan en invernadero donde se pueden cruzar o autofecundar.

3) Utilización del gen Bar para la producción de plantas de maíz genéticamente modificadas que hayan incorporado y que expresen el gen H45\gammaZ

El gen Bar de Streptomyces hygroscopicus codifica una fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) que inactiva por acetilación la molécula activa de fosfinotricina del herbicida Basta®. Las células que incluyen ese gen se vuelven por lo tanto resistentes a ese herbicida y pueden ser seleccionadas por su intermediario. Para la transformación de los cereales la secuencia codificante del gen Bar está bajo el control de una región reguladora que permite una expresión fuerte y constitutiva en las células vegetales. Una región como esa está ventajosamente constituida por el promotor y el primer intrón del gen Actina del arroz como los descritos por Mc Elroy (Mol. Gen. Genet, (1991)231: 150-160).

Ese gen quimérico se clona en un plásmido que permite su amplificación por Escherichia coli. Ese plásmido (pDM 302 Cao (Plant Cell Report (1992) 11:586-591) después de la amplificación y posterior purificación en columna Qiagen® se puede utilizar en transformación genética del maíz utilizando por ejemplo el método descrito en el ejemplo precedente. En esos casos a los medios de cultivo destinados a la selección de las células transformadas se les agrega 2 mg/L de fosfinotricina.

Para la introducción del gen H45\gammaZ se utilizó de manera ventajosa una técnica denominada de cotransformación: los genes de selección (Bar) y de interés (H45\gammaZ) son transportados por plásmidos independientes. En los casos de utilización del cañón de partículas se procede a una coprecipitación de los plásmidos sobre las partículas de tungsteno, quedando la cantidad total de ADN precipitado sobre las partículas idéntica a la que figura en el protocolo estándar (5 \mug de ADN para 2,5 mg de partículas) representando cada plásmido aproximadamente la mitad del peso total del ADN utilizado.

La experiencia muestra que con ese método, la cointegración de los plásmidos en las células vegetales es el hecho más frecuente (del orden del 90%) es decir que prácticamente cada planta seleccionada por su intermediario y que haya integrado el gen Bar llevará también el gen H45\gammaZ. El nivel de coexpresión (porcentaje de plantas seleccionadas que expresan el gen H45\gammaZ) es habitualmente del orden del 70%.

Los genes introducidos de esa manera en general están ligados en el sentido genético, el gen H45\gammaZ puede así de manera ventajosa ser seguido en los descendientes gracias a la resistencia al herbicida que le está estrechamente asociada.

La cantidad de proteína modificada se determina por los métodos descritos en el ejemplo A, fundamentalmente por inmunotransferencia en los extractos proteicos de granos de maíz inmaduros o maduros, muestreados en conjunto de plantas resistentes al BASTA.

4) Ejemplo que explicita la etapa de introducción de los transgenes y fundamentalmente del gen que codifica la H45\gammaZ, para la modificación del fenotipo opaco-2 del maíz

Mejoramiento de maíz opaco-2 por introgresión del gen de \gamma-zeína enriquecida en lisina.

Se utilizan las plantas transformadas descritas en el ejemplo precedente, que presentan a la vez, una resistencia al Basta y la expresión de una \gamma-zeína enriquecida en lisina. Su polen se utiliza para fecundar las plantas de maíz opaco-2 de la línea W64Ao2 que no contiene más que un solo gen \gamma-zeína. Esta línea se obtuvo del Maize Stock Center. Las plantas de esas descendencias F1 se seleccionan por su resistencia al Basta y a continuación se autofecundan. Los granos F2 producidos de esta manera se analizan con respecto al fenotipo opaco sobre una mesa luminosa y los granos opacos o los granos vidriosos se siembran y evalúan con respecto a la resistencia al Basta. En el caso en que todos los granos opacos sean sensibles al Basta, queda demostrado que la introducción del gen \gamma-zeína enriquecida en lisina en la planta considerada, complementa el fenotipo opaco-2.

En una segunda instancia, en esas plantas resistentes al Basta, se seleccionan individuos de genotipo o2/o2 y que no poseen más que un solo gen \gamma-zeína en el cromosoma 7 con ayuda de sondas moleculares que codifican el gen Opaco-2 y la \gamma-zeína. Se retienen esos últimos que revelan fragmentos de restricción polimorfos y sólo los individuos que presentan el patrón tipo de la línea W64o2 (Lopes M.A. et al, 1995, Mol. Gen, Genet. 19: 247, 603-613).

Esos individuos tienen un contenido de lisina que es en promedio equivalente al del maíz o2, incluso superior. A partir de esos individuos, toda introgresión en variedades ELITE, del carácter "fuerte contenido de lisina" se observa mediante la determinación de la resistencia al BASTA y de la presencia del alelo o2 detectado por RFLP (polimorfismo de restricción).

5) Expresión de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina en Arabidopsis thaliana

Para obtener una transformación estable, se insertaron las construcciones plasmídicas P20\gammaZ y pH30\gammaZ clonadas en el plásmido Bluescript KS (-) bajo forma de fragmentos HincII/XbaI en el vector binario pBin19 (Bevan, M. Nucl. Acids Res. 12: 8.711-8.721 (1984)), que contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y las señales de formación del extremo 3' y de poliadenilación del gen de la octopina sintasa (ocs). Los nuevos plásmidos se denominaron p19P20\gammaZ y p19H30\gammaZ (Figura 12).

Los vectores binarios que contenían las secuencias que codifican las proteínas P20\gammaZ y H30\gammaZ (p19P20\gammaZ y p19H30\gammaZ) se transfirieron a la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Se transformaron plantas de Arabidopsis ecotipo RLD según el método descrito por Valvekens, D., Van Montagu, M. y Van Lijsebettens, M. ((1988) Proc. Natl.Acad.Sci, EE.UU. 85: 5.536-5.540). Para cada construcción, se cribaron 10 plantas transgénicas por análisis de inmunotransferencia utilizando un antisuero obtenido contra la \gamma-zeína (\alphaG2, Ludevid et al. 1985). Las plantas que contenían las tasas más elevadas (correspondiente aproximadamente al 0,1% de la cantidad total de proteínas presentes en las hojas de Arabidopsis) de productos transgénicos en la generación F1, se eligieron para obtener la generación F2. Esas plantas se eligieron también por la expresión de la proteína buscada.

Se homogeneizaron en nitrógeno líquido plantas transgénicas enteras, seleccionadas en un medio que contenía kanamicina. Las proteínas transgénicas se extrajeron selectivamente con una solución que contenía etanol/ácido clorhídrico HCl 0,125 N en una proporción de 3:1 (v/v), con 5% de mercaptoetanol e inhibidores de proteasa. Las proteínas extraídas con esta solución se precipitaron en 5 volúmenes de acetona y se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia. Los extractos proteicos de las plantas no transgénicas se utilizaron como controles. Las proteínas resultantes de la inserción de las secuencias K(P-K)_{4} en la \gamma-zeína se expresaron correctamente en las plantas de Arabidopsis thaliana utilizando el promotor constitutivo 35 S del CaMV. En las inmunotransferencias, los anticuerpos \alphaG2 y \alphaPL reconocían bandas de electroforesis correspondientes a las proteínas P20\gammaZ y H30\gammaZ. Esas bandas migraban con masas moleculares aparentes conformes a las que se habían observado preliminarmente en las experiencias de traducción/translocación in vitro (30 kD y 26 kD respectivamente). Como se observó en las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaban la \gamma-zeína (Geli et al. Plant Cell 6: 1.911-1.922 (1994)), las proteínas P20\gammaZ y H30\gammaZ migraban bajo la forma de dos bandas de electroforesis a saber las bandas correspondientes a 36 y 30 kD para P20\gammaZ y las bandas correspondientes a 32 y 26 kD para H30\gammaZ. Las bandas superiores podrían corresponder a productos que hubieran sufrido modificaciones post traduccionales. No se detectó una modificación post traduccional de ese tipo en los endospermas de maíz transformados. Ese resultado sugiere que la modificación aparecería cuando esas proteínas se expresan en un sistema heterólogo como Arabidopsis thaliana.

6) Expresión de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina recombinantes en el maíz Método

Después de la obtención de las plantas transgénicas, se las cruza con una línea macho sin transformar. En consecuencia, 50% de los granos cosechados en ese caso de inserción unilocus serán transgénicos. Con el fin de analizar las \gamma-zeínas enriquecidas en lisina en las plantas transgénicas, las proteínas se extraen a partir de 6 granos por transformante.

Los endospermas se disecan retirando de los granos los embriones y los pericarpos. Los endospermas se muelen y se utilizan 50 mg de harina para la extracción selectiva. Previamente se extraen las \alpha-zeínas mediante 3 tratamientos con etanol al 70%. Después de la centrifugación, el etanol se evapora al vacío. Las proteínas insolubles en etanol (principalmente las \gamma-zeínas y las \gamma-zeínas enriquecidas en lisina) se extraen del fondo con un tampón de Laemli que contiene 10% de mercaptoetanol (100 \mul de tampón para 10 mg de harina). Las proteínas totales se analizan a continuación mediante coloración con plata (Morrissey J.H. 1981, Ann. Biochem. vol. 117, p. 307-310). Las \gamma-zeínas y las \gamma-zeínas enriquecidas en lisina se analizan por inmunotransferencia utilizando respectivamente los anticuerpos \alphaG2 (dilución 1/2000) y \alphaPL (dilución 1/500). Un anticuerpo anti-anticuerpo de conejo conjugado con fosfatasa alcalina se utiliza como anticuerpo secundario en la inmunotransferencia. Los extractos se diluyen para poder ser cargados en SDS-page según el método analítico utilizado.

Resultados Acumulación de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina en las plantas 20\gammaZ y 45\gammaZ de maíz transgénico

La Figura 13 muestra la inmunotransferencia de los extractos de proteínas revelados con el antisuero \alphaPL (A,B) y las proteínas totales después de la coloración con plata (C). Como se puede ver en la Fig. 13A, se analizaron 6 plantas transgénicas 20\gammaZ con el antisuero \alphaPL y la \gamma-zeína enriquecida en lisina se expresa en las plantas transgénicas A1 y D2 (pistas 1 y 6 respectivamente). En la planta C1 (pista 4), sólo se observan trazas de \gamma-zeína enriquecida en lisina. Cuando los extractos de las 6 plantas transgénicas 45\gammaZ se cargan en el gel y se marcan con el antisuero \alphaPL (Fig. 13B), se observa una fuerte reacción con el anticuerpo para los transformantes B1 y C1 (pistas 3 y 4 respectivamente).

Hay que notar que la reacción con el anticuerpo en los extractos de los endospermas de las plantas 45\gammaZ B1 y C1 es más fuerte que en los extractos de las plantas 20\gammaZ A1 y D2. Ese resultado se confirma después de la coloración con plata de los geles (Fig. 13C) donde los 2 tipos de \gamma-zeína: endógena y enriquecida en lisina, se colorean. La \gamma-zeína enriquecida en lisina tiene un peso molecular aparente de 30 kDa y la \gamma-zeína endógena de 28 kDa. La expresión de \gamma-zeína enriquecida en lisina es más débil en la planta 45\gammaZ B1 que en C1 (pistas 2 y 3 respectivamente). En las pistas 1 a 6 de la Fig. 13C, se había depositado en el gel una dilución idéntica de las proteínas de los extractos de endospermas de las plantas 45\gammaZ y 20\gammaZ. A esta dilución, la expresión de la \gamma-zeína enriquecida en lisina se detecta solamente en los endospermas de las plantas 45\gammaZ B1 y C1. Sin embargo, cuando se carga un extracto más importante (40 \mug de proteínas por pista) de proteínas 20\gammaZ en el gel, se detecta una ligera banda (ver flecha), correspondiente a la \gamma-zeína enriquecida en lisina en los endospermas 20\gammaZ A1 y D2. Ese resultado indica que las plantas 45\gammaZ acumulan mucho más proteínas de acuerdo con la invención que las plantas 20\gammaZ. Esto es probablemente debido a las diferentes actividades de los promotores. Las plantas 45\gammaZ se transformaron con un constructo que contenía la \gamma-zeína de acuerdo con la invención bajo el control del promotor \gamma-zeína (1,7 kb) en tanto que las plantas 20\gammaZ se transformaron con la misma secuencia codificante pero bajo el control del promotor 35S del CaMV. La coloración con plata es una técnica general de coloración de las proteínas, pero el fuerte color marrón se observa sobre todo en presencia de proteínas básicas. Como las \alpha-zeínas se extrajeron de la harina, como se describió antes, están ausentes en el momento del análisis en SDS-page de la Fig. 13C.

Segregación

Puesto que hay una segregación del 50% en todas las plantas transgénicas en el caso de un locus único, se realizó un análisis grano por grano para cuantificar la tasa de \gamma-zeína enriquecida en lisina en cada transformante. El análisis se realizó únicamente con los transformantes 45\gammaZ que presentaban la tasa de expresión más fuerte. La Figura 14 muestra la coloración con plata (A) y la inmunotransferencia con \alphaPL (B) de 5 endospermas diferentes de 45\gammaZ B1 y C1. La débil banda electroforética presente en todas las pistas (ver A, pistas 1 a 10) corresponde a la \gamma-zeína endógena. Como se puede ver en la Fig. 14A, 2 de los 5 endospermas acumulan \gamma-zeína enriquecida en lisina (ver pistas 3,4 y 6,7). En consecuencia, aproximadamente la mitad de los granos acumulan cantidades significativas de proteínas enriquecidas en lisina. Si se tiene en cuenta el hecho de que se depositaron cantidades idénticas de proteínas sobre el gel, se observa que el transformante 45\gammaZ C1 acumuló más \gamma-zeína enriquecida en lisina que B1. De hecho ese resultado está de acuerdo con lo que se observa en el momento de la coloración con plata de los extractos de endosperma mezclados (Fig. 13C, pista 3). La prueba de la presencia de \gamma-zeína enriquecida en lisina en esos endospermas está subrayada en la Fig. 14B. La inmunotransferencia utilizando el antisuero \alphaPL muestra que 2 extractos de endosperma de 45\gammaZ B1 (pistas 3 y 4) y de 45\gammaZ C1 (pistas 4 y 6) acumulan \gamma-zeína enriquecida en lisina. Para confirmar el porcentaje de granos transgénicos, se analizaron 10 nuevos granos de transformante 45\gammaZ C1 por inmunotransferencia y utilización del antisuero \alphaPL (Fig. 15 A). Como se esperaba, se detectan cerca de la mitad de los granos transgénicos. Se observó una banda inmunoreactiva en los extractos de endosperma (pistas 1, 2, 9 y 10).

Estimación de la cantidad de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina en los endospermas de los transformantes 45\gammaZ

\alphaG2 es un antisuero policlonal que reconoce las \gamma-zeínas endógenas y las \gamma-zeínas enriquecidas en lisina. La reactividad de ese antisuero con los extractos de endospermas 45\gammaZ C1 se utilizó para cuantificar la cantidad de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina de acuerdo con la invención en los endospermas de las plantas transformadas.

La figura 15B presenta la inmunotransferencia de 5 extractos proteicos correspondientes a 5 endospermas 45\gammaZ C1 (pistas 1 a 5). Como se esperaba, sólo 2 endospermas presentaron un perfil de inmunoreacción característico de los granos transgénicos. La banda superior de 30 kDa corresponde a la \gamma-zeína enriquecida en lisina (flechas sobre pistas 1 y 2) y la banda inferior a la \gamma-zeína endógena. Se puede notar que en los endospermas de las plantas no transgénicas la banda superior está ausente (pistas 3, 4 y 5). De manera sorprendente, parece que el contenido de \gamma-zeína endógena es más débil en los extractos de las plantas transgénicas que en las plantas no transgénicas (ver flechas sobre pistas 1 y 5).

A primera vista se observó que:

i) en los endospermas transgénicos 45\gammaZ C1, la relación \gamma-zeína enriquecida en lisina/\gamma-zeína endógena es de 7/3. Por lo tanto la cantidad de proteína modificada de acuerdo con la invención es al menos 2 veces más importante que la de la proteína endógena,

ii) la cantidad de \gamma-zeína endógena en los endospermas no transgénicos (ver pistas 3, 4 y 5) era equivalente a la de la \gamma-zeína enriquecida en lisina en los endospermas transgénicos (ver pistas 1 y 2).

7) Expresión de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina recombinantes en el trigo

Como en el ejemplo 6), es posible mostrar la presencia de \gamma-zeínas enriquecidas en lisina de acuerdo con la invención en el trigo. La transformación del trigo puede efectuarse fundamentalmente según el método descrito en Weeks et al., 1993, Plant Physiol., vol. 102: páginas 1.077-1.084 o según el método descrito en la patente europea EP709462.

(1) INFORMACIONES GENERALES:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

DEPOSITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BIOCEM

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Campus Universitaire del Cezeaux - 24 avenue des Landais

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: AUBIERE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 63170

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE RESERVA DE PLANTAS ENRIQUECIDAS EN AMINOÁCIDOS, FUNDAMENTALMENTE GAMA-ZEÍNA DE MAÍZ ENRIQUECIDA EN LISINA. PLANTAS QUE EXPRESAN ESAS PROTEÍNAS.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DESCIFRABLE POR COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (OEB)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TEMAS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

NÚMERO DE LA SOLICITUD: PCT/FR 97/00167

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº DE ID.: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATGAATTC AAACCAAAGC CAAAGCCGAA GCCAAAAGAA TTCA

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEC. Nº DE ID.: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTGAATT CTTTTGGCTT CGGCTTTGGC TTTGGTTTGA ATTCAT

\hfill

46

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº DE ID: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Phe Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Glu Phe Leu Gln}

\sac{Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº DE ID: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Phe Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Glu Phe Lys Pro}

\sac{Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Glu Phe Leu Gln Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº DE ID: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Gly Ile Asp Glu Phe Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Glu}

\sac{Phe Lys Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEC. Nº DE ID: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 672 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 1..669

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: /nota = "SECUENCIA CODIFICANTE DEL ADNc DE LA GAMMA ZEÍNA Y SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS CORRESPONDIENTE".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA Nº DE ID: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 223 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA Nº DE ID: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 693 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 1..690

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: /nota = "SECUENCIA CODIFICANTE DEL ADNc DE LA H45GAMMA-Z ZEÍNA DE MAÍZ Y SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS CORRESPONDIENTE".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 8:

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA Nº DE ID: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 230 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 9:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA Nº DE ID: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 723 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 1..720

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRAS INFORMACIONES: /nota = "SECUENCIA CODIFICANTE DEL ADNc DE LA P20GAMMAZ ZEÍNA Y SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS CORRESPONDIENTE".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

7

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA Nº DE ID: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 240 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº DE ID: 11:

9

Claims (36)

1. Secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una cadena de nucleótidos que codifica una proteína de reserva de la familia de las zeínas, que se caracteriza por comprender además un oligonucleótido elegido
entre:

a) un oligonucleótido que comprende al menos una cadena que codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n,} en la cual:

- n es un entero superior o igual a 2,

- P representa un residuo del aminoácido prolina,

- K representa un residuo del aminoácido lisina

- el signo "-" simboliza una unión entre los dos residuos de aminoácidos y fundamentalmente una unión de tipo peptídico, las n unidades (P-K) están ligadas entre sí de la misma manera por uniones como esas por ejemplo de tipo peptídico,

b) un oligonucleótido según a) en el cual n es un entero superior o igual a 3, preferentemente n es igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 15,

c) un oligonucleótido según a) o b) en el cual la secuencia de las n unidades (PK) está interrumpida por uno o varios residuos de aminoácidos distintos de los residuos P o K,

d) un oligonucleótido según a), b) o c) completado en su extremo 5' y/o en su extremo 3' por uno o varios codones,

e) un oligonucleótido según a), b), c) o d) completado en su extremo 5' y/o en su extremo 3', por un residuo de lisina en el extremo N-terminal del polipéptido formado,

f) un oligonucleótido según e) que codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n}, a la fórmula K(P-K)_{4} o a la fórmula 2K(P-K)_{4};

siendo insertado dicho oligonucleótido en un sitio de la cadena de nucleótidos elegido de manera tal que:

- la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal determinada permite obtener una proteína de reserva de la familia de las zeínas modificada localizada de manera idéntica o similar a la proteína de reserva normal que sería expresada en las mismas condiciones en la misma célula por la cadena de nucleótidos codificante correspondiente, y/o

- la proteína de reserva de la familia de las zeínas modificada codificada por la secuencia de nucleótidos recombinante es reconocida inmunológicamente por anticuerpos producidos contra la proteína de reserva normal correspondiente.

2. Secuencia de nucleótidos recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el oligonucleótido es insertado a nivel del extremo N o C-terminal de la cadena de nucleótidos.

3. Secuencia de nucleótidos recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el oligonucleótido es insertado a nivel de repeticiones en tándem ricas en prolina de la cadena de nucleótidos.

4. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque la cadena de nucleótidos codifica la \gamma-zeína del maíz.

5. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4, que se caracteriza porque la cadena de nucleótidos que codifica la \gamma-zeína de maíz responde a la secuencia presentada en la Figura 9.

6. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, que se caracteriza porque el oligonucleótido es insertado en el lugar o a continuación del dominio Pro-X o en el dominio Pro-X naturalmente presente en la \gamma-zeína del maíz.

7. Secuencia de nucleótidos recombinante, que se caracteriza por comprender una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 bajo el control de un promotor de expresión.

8. Secuencia de nucleótidos recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, que se caracteriza porque el promotor es un promotor específico de un tejido celular determinado, por ejemplo un promotor específico para la expresión en los granos, y/o en las hojas de plantas.

9. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 8, que se caracteriza porque el promotor de expresión es el de la \gamma-zeína del maíz.

10. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 7 que se caracteriza porque el promotor de expresión es el promotor CaMV35S.

11. Secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que se caracteriza por codificar uno de los polipéptidos P20\gammaZ o H45\gammaZ que responden respectivamente a las secuencias representadas en las Figuras 11 y 10.

12. Vector de clonación y/o de expresión, que se caracteriza por comprender, en un sitio no esencial para su replicación, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Vector de clonación y/o de expresión, que se caracteriza por tratarse de uno de los plásmidos pP20\gammaZ (CNCMN I-1640) o pH45\gammaZ (CNCMN I-1639), o por comprender un oligonucleótido que codifica el polipéptido H30\gammaZ representado en la Figura 3.

14. Polipéptido codificado por una secuencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

15. \gamma-zeína de maíz modificada rica en lisina, que se caracteriza por ser codificada por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5.

16. \gamma-zeína de maíz modificada enriquecida en lisina, que se caracteriza porque su secuencia de aminoácidos es modificada por al menos un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n} o a la fórmula K-(P-K)_{n}, en la cual:

- n es un entero superior o igual a 2,

- P representa un residuo del aminoácido prolina,

- K representa un residuo del aminoácido lisina

- el signo "-" simboliza una unión entre los dos residuos de aminoácidos y fundamentalmente una unión de tipo peptídico, las n unidades (P-K) están ligadas por uniones fundamentalmente de tipo peptídico.

dicho polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n} o K-(P-K)_{n} es insertado en la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína de maíz normal de manera que;

- cuando la \gamma-zeína modificada rica en lisina es producida en una célula huésped, fundamentalmente una célula vegetal, se localiza de manera idéntica o similar en esta célula a la \gamma-zeína de maíz normal que sería producida en las mismas condiciones, en la misma célula huésped, y/o,

- la \gamma-zeína de maíz modificada es reconocida por anticuerpos dirigidos contra la \gamma-zeína normal de maíz.

17. \gamma-zeína de maíz modificada enriquecida en lisina, de acuerdo con la reivindicación 16 que se caracteriza porque dicho polipéptido es sustituido en una secuencia de repeticiones en tándem ricas en prolina naturalmente presente en la \gamma-zeína de maíz normal.

18. \gamma-zeína de maíz modificada enriquecida en lisina, de acuerdo con la reivindicación 16 que se caracteriza porque dicho polipéptido es insertado con supresión de uno o varios aminoácidos de una secuencia de repeticiones en tándem ricas en prolina de la \gamma-zeína normal.

19. \gamma-zeína de maíz modificada enriquecida en lisina, de acuerdo con la reivindicación 16 que se caracteriza porque dicho polipéptido es sustituido en una secuencia de repeticiones en tándem ricas en prolina naturalmente presente en la \gamma-zeína de maíz normal.

20. \gamma-zeína de maíz modificada enriquecida en lisina, de acuerdo con la reivindicación 16, que se caracteriza porque dicho polipéptido es insertado en la parte N o C-terminal de la secuencia de aminoácidos de la \gamma-zeína de maíz normal.

21. \gamma-zeína de maíz modificada de acuerdo con la reivindicación 14, que se caracteriza por tratarse de la proteína P20\gammaZ, Figura 11, o de la proteína H30\gammaZ, Figura 3, o de la proteína H45\gammaZ, Figura 10.

22. Célula huésped recombinante, que se caracteriza por comprender una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

23. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 22, que se caracteriza por tratarse de una bacteria, por ejemplo de E. coli o Agrobacterium tumefaciens.

24. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 22, que se caracteriza por tratarse de una célula vegetal.

25. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 24, que se caracteriza por tratarse de una célula semillas de planta.

26. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 25, que se caracteriza por tratarse de una célula de endosperma de semillas de maíz.

27. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26, que se caracteriza por contener, integrada de manera estable en su genoma, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 5.

28. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26, que se caracteriza por producir una \gamma-zeína de maíz modificada rica en lisina de acuerdo con una de las reivindicaciones 16 a 21.

29. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 24, que se caracteriza por tratarse de una célula de soja, de girasol, de tabaco, de trigo, de avena, de alfalfa, de arroz, de colza, de Arabidopsis o del maíz.

30. Semillas que producen un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21.

31. Planta que produce un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21.

32. Planta de acuerdo con la reivindicación 31, que se caracteriza por tratarse del maíz.

33. Semillas que expresan un polipéptido modificado, obtenidas a partir de las plantas de acuerdo con la reivindicación 31 o 32.

34. Utilización de un oligonucleótido elegido entre:

a) un oligonucleótido que comprende al menos una cadena que codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)n, en la cual:

- n es un entero superior o igual a 2,

- P representa un residuo del aminoácido prolina,

- K representa un residuo del aminoácido lisina

- el signo "-" simboliza una unión entre los dos residuos de aminoácidos y fundamentalmente una unión de tipo peptídico, las n unidades (P-K) están ligadas entre sí de la misma manera por uniones por ejemplo de tipo
peptídico,

b) un oligonucleótido según a) en el cual n es un entero superior o igual a 3, preferentemente n es igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 15,

c) un oligonucleótido según a) o b) en el cual la secuencia de las n unidades (PK) está interrumpida por uno o varios residuos de aminoácidos diferentes de los residuos P o K,

d) un oligonucleótido según a), b) o c) completado en su extremo 5' y/o en su extremo 3' por uno o varios codones,

e) un oligonucleótido según a), b), c) o d) completado en su extremo 5' y/o en su extremo 3', por un residuo de lisina en el extremo N-terminal del polipéptido formado,

f) un oligonucleótido según e) que codifica un polipéptido que responde a la fórmula (P-K)_{n}, a la fórmula K(P-K)_{4} o a la fórmula 2K(P-K)_{4}

para la obtención de una proteína de reserva de la familia de las zeínas enriquecida en lisina.

35. Procedimiento de producción de plantas o de semillas que expresan una proteína de reserva de la familia de las zeínas modificada, que se caracteriza por comprender las etapas de:

a) transformación de una célula vegetal, con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en condiciones que permitan la expresión de manera estable y funcional de la proteína de reserva modificada codificada por la secuencia de nucleótidos;

b) regeneración de plantas a partir de la célula de planta transformada de la etapa a), para obtener plantas que expresen la proteína de reserva modificada,

c) llegado el caso, obtención de semillas a partir de las plantas modificadas obtenidas en la etapa b).

36. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35, que se caracteriza porque la planta es el maíz, y la proteína de reserva es la \gamma-zeína