ES2268688T3 - Genes quimericos y metodos para aumentar el contenido de lisina en las semillas de plantas de maiz, de soja y de colza. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A TRES GENES QUIMERICOS EL PRIMERO DE LOS CUALES CODIFICA SINTASA DE ACIDO DIHIDRODIPICOLINICO (SDHDP), QUE ES SENSIBLE A LA INHIBICION POR LISINA Y ESTA OPERABLEMENTE UNIDO A UNA SECUENCIA DE TRANSITO DEL CLOROPLASTO DE LA PLANTA, EL SEGUNDO DE LOS CUALES CODIFICA UNA PROTEINA RICA EN LISINA, Y EL TERCERO DE LOS CUALES CODIFICA UNA REDUCTASA DEL CETOGLUTARATO DE LISINA DE LA PLANTA, TODOS OPERABLEMENTE UNIDOS A SECUENCIAS REGULADORAS ESPECIFICAS DE LAS SEMILLAS DE LA PLANTA. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA SU USO PARA PRODUCIR NIVELES INCREMENTADOS DE LISINA EN LAS SEMILLAS DE PLANTAS TRANSFORMADAS. TAMBIEN SE SUMINISTRAN PLANTAS DEL MAIZ, LA SOJA Y LA COLZA EN LAS QUE LAS SEMILLAS ACUMULAN LISINA HASTA NIVELES MAYORES QUE LAS PLANTAS NO TRANSFORMADAS.
Description
Genes quiméricos y métodos para aumentar el
contenido de lisina en las semillas de plantas de maíz, de soja y de
colza.
La invención está relacionada con tres genes
quiméricos, el primero codifica la enzima ácido dihidrodipicolínico
sintasa (DHDPS), que es insensible a la inhibición por lisina y está
unida a una secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta, un
segundo codifica una proteína rica en lisina, y un tercero codifica
una enzima lisina cetoglutarato reductasa de la planta, todas ellas
unidas a las secuencias reguladoras específicas de las semillas de
la planta. Se proporcionan los métodos para que su uso produzca
niveles crecientes de lisina en las semillas de plantas
transformadas. También se proporcionan las plantas transformadas del
maíz, de la colza y de la soja donde las semillas acumulan la
lisina a niveles más altos que las plantas sin transformar.
La comida humana y el pienso animal derivado de
algunos granos es deficiente en alguno de los diez aminoácidos
esenciales, que se requieren en la dieta animal. En el maíz (Zea
mays L.), la lisina es el aminoácido más limitante para los
requerimientos en la dieta de muchos animales. La comida derivada de
otras plantas cultivadas, por ejemplo, la soja (Glicina max
L.) o la canola (Brassica napus), se utiliza como aditivo
a los piensos animales del maíz para suplir esta deficiencia de
lisina. Un incremento en el contenido de la lisina de la comida
derivada de fuentes de la planta, podría reducir o eliminar la
necesidad de suplementar las mezclas de piensos de grano con lisina
producida de forma microbiana.
Se determina el contenido del aminoácido en las
semillas de forma preliminar (90-99%) por la
composición de aminoácido en las proteínas de la semilla y en
menor grado (1-10%) por las mezclas de aminoácidos
libres. La cantidad total de la proteína en las semillas varía
desde el 10% del peso en seco de los cereales al
20-40% del peso en seco de las legumbres. Las
proteínas de almacenaje de la semilla contienen muchos de los
aminoácidos ligados a una proteína que se sintetizan durante el
desarrollo de la semilla y que sirven como mayor reserva de
nutriente después de la germinación. En muchas semillas el
almacenaje de las proteínas es igual o superior al 50% del total de
proteínas.
Se usa la tecnología de ingeniería genética de
las semillas para aislar, y expresar genes de proteínas de
almacenamiento en plantas transgénicas y mejorar así la composición
del aminoácido. Por ejemplo, se ha aislado un gen de una nuez
procedente de Brasil para una semilla 2S albúmina compuesta por un
26% de aminoácidos que contienen azufre [Altenbach y otros (1987)
Planta Mol. Biol. 8:239 - 250] y se ha expresado en las semillas de
tabaco transformadas bajo el control de secuencias reguladoras de un
gen de la proteína de almacenaje faseolina de la judía. La
acumulación de la proteína rica en azufre en las semillas del tabaco
dio lugar a un aumento del 30% en el nivel de metionina en las
semillas [Altenbach y otros (1989) Planta Mol. Biol. 13:513 - 522].
Sin embargo, hasta la fecha no se han identificado proteínas de
almacenaje en la semilla de la planta enriquecida de forma similar
en lisina, en relación al contenido medio de lisina en las proteínas
de la planta, así se evita que se utilice este acercamiento para
aumentar la lisina.
Un acercamiento alternativo es aumentar la
producción y la acumulación de la lisina por vía de la tecnología
de la ingeniería genética. La lisina, junto con la treonina, la
metionina y la isoleucina, son aminoácidos derivados del aspartato,
y la regulación de la biosíntesis de cada miembro de esta familia es
compleja, interconectada, y no muy entendida, especialmente en las
plantas. La regulación del flujo metabólico en el camino parece ser
sobre todo por vía de los productos finales en las plantas. El
camino de la familia del aspartato también se regula en el punto de
bifurcación de las reacciones. Para la lisina ésta es la
condensación del aspartil \beta-semialdehído con
el piruvato catalizado por la enzima ácido dihidrodipicolínico
sintasa (DHDPS).
El gen dapA de E. Coli codifica
una enzima DHDPS que es aproximadamente 20 veces menos sensible a la
inhibición por la lisina que una enzima DHDPS típica de la planta,
por ejemplo, el germen DHDPS del trigo. El gen dapA de
E. Coli se ha ligado al promotor 35S del virus mosaico de la
coliflor y a una secuencia de tránsito del cloroplasto de la
planta. Se introdujo el gen quimérico en las células del tabaco por
vía de la transformación y esto mostró un incremento sustancial en
los niveles de lisina libre en las hojas [Glassman y otros (1989)
PCT patent Appl. PCT/US89/01309, Shaul y otros (1992) Plant Jour.
2:203-209, Galili y otros (1992) EPO patent Appl.
91119328.2, Falco, PCT/US93/02480 (Publicación internacional número
WO 93/19190). Sin embargo, el contenido en lisina de las semillas
no aumentó en ninguna de las plantas transformadas descritas en
estos estudios. Se introdujo el mismo gen quimérico en células de
patata y condujo a pequeños aumentos de lisina en las hojas, las
raíces y los tubérculos de las plantas regeneradas [Galili y otros
(1992) EPO Patent Appl. 91119328.2, Perl et al. (1992) Plant.
Mol. Biol. 19:815-823].
Falco, PCT/US93/02480 (publicación internacional
número WO 93/19190), ligó el gen dapA de E. Coli al
promotor de la faseolina del haba y a una secuencia de tránsito del
cloroplasto de la planta para aumentar la expresión en las
semillas, pero todavía no observó ningún aumento en el nivel de
lisina de las semillas. Según lo observado arriba, la
aspartoquinasa (AK) cataliza el primer paso de la ruta biosintética
de la lisina, y se ha encontrado que esta enzima puede ser un
blanco importante para la regulación en muchos organismos. Falco
aisló un mutante del gen lysC de E. coli, que
codifica una AK lisina insensible al regenerador, y lo ligó al
promotor de la faseolina del haba y a una secuencia de tránsito del
cloroplasto de la planta. La expresión de este gen quimérico en las
semillas del tabaco transformado conduce a un aumento sustancial del
nivel de la treonina, pero no de la lisina. Galili y otros (1992)
EPO patente Appl. 91119328.2 sugieren que las plantas transformadas
con los genes quiméricos que unen los promotores específicos de la
semilla a una secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta /
gen dapA de E. Coli y el promotor de la faseolina
del haba / una secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta /
gen mutante lysC de E. Coli conducirán a un
incremento de los niveles de la lisina en las semillas. Falco,
PCT/US93/02480 (publicación intenacional número WO 93/19190) realizó
este experimento transformando el tabaco con una construcción que
contenía ambos genes quiméricos, el promotor de la faseolina del
haba / la secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta / el
gen dapA de E. Coli del promotor de la faseolina de
la judia / una secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta /
gen mutante lysC de E. Coli. La expresión simultánea
de ambos genes no tiene ningún efecto significativo en el contenido
de lisina de las semillas. Sin embargo, se observó un producto de
descomposición de la lisina, el ácido \alpha-amino
adípico, acumulado en las semillas. Esto sugiere que el catabolismo
de la lisina previene la acumulación de lisina libre en semillas.
En un esfuerzo por incrementar la relación de biosíntesis de la
lisina, Falco, PCT/US93/02480 (publicación internacional número WO
93/19190), aisló el gen dapA Corynebacterim glutamicum
que codifica una enzima DHDPS totalmente insensible a la lisina.
Falco transformó el tabaco con una construcción que contenía el gen
quimérico, el promotor de la faseolina del haba / la secuencia de
tránsito del cloroplasto de la planta / el gen dapA
Corynebacterim glutamicum unido al promotor de la faseolina
del haba / la secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta /
gen mutante lysC de E. Coli. La expresión simultánea
de estas enzimas insensibles a la lisina no tiene todavía ningún
efecto significativo en el contenido de lisina de las semillas.
Así, está claro que la comprensión limitada de
los detalles de la regulación de la ruta biosintética de la lisina
en las plantas, particularmente en las semillas, aumenta la
incertidumbre en el contenido de lisina en las aplicaciones de la
tecnología de ingeniería genética. No se sabe, para la mayoría de
las plantas, si la lisina se sintetiza en las semillas o se
transporta a las semillas desde las hojas. Además, se conoce poco
sobre el almacenaje o el catabolismo de la lisina en las semillas.
Puesto que los aminoácidos libres componen solamente una pequeña
fracción del contenido total de aminoácidos en las semillas, la
sobreacumulación debe estar replegada para afectar
perceptiblemente a la composición total de aminoácidos de las
semillas. Además, no se conocen los efectos de la sobreacumulación
de un aminoácido libre tal como la lisina en el desarrollo y la
viabilidad de la semilla.
Antes de la invención descrita aquí, no se
conocía ningún método para aumentar el contenido de lisina en las
semillas por vía de la ingeniería genética ni tampoco se conocía
ningún ejemplo de semilla obtenida por vía de la ingeniería
genética que hubiera aumentado los niveles de lisina.
Esta invención se refiere a un gen quimérico
novel, y a las plantas transformadas con dicho gen novel, donde un
fragmento de ácido nucleico que codifica la enzima ácido
dihidropicolínico sintasa, que es insensible a la inhibición por la
lisina, se une a una secuencia de tránsito del cloroplasto de la
planta monocot y a una secuencia reguladora específica de la
semilla de la planta monocot. En una realización preferida, el
fragmento del ácido nucleico que codifica la enzima ácido
dihidropicolínico sintasa abarca la secuencia del nucleótido
mostrada en la SEQ ID NO:3: Corynebacterium glutamicum. En
especial las realizaciones preferidas, la secuencia de tránsito del
cloroplasto de la planta deriva de un gen que codifica la subunidad
pequeña de la ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa, y
la secuencia reguladora específica de la semilla deriva del gen que
codifica la subunidad \beta de la proteína de almacenaje
faseolina de la semilla del haba Phaseolus vulgaris, el gen
del inhibidor 3 de la tripsina Kunitz de la Glicine max, o un
promotor embrioespecífico del monocot, preferiblemente del gen de
la globulina 1 del Zea maize.
Se pueden utilizar los genes descritos, por
ejemplo, para las plantas que se transforman, preferiblemente
plantas de maíz. También se reivindican las semillas obtenidas de
las plantas transformadas. La invención puede producir plantas
transformadas en donde las semillas de las plantas acumulan la
lisina a un nivel por lo menos del diez por ciento mayor que en
semillas de las plantas no transformadas, preferiblemente del diez
al cuatrocientos por ciento mayor que las plantas no
transformadas.
La invención mas allá de concernir un método
para obtener una planta, preferiblemente de maíz, de la colza o de
soja en donde las semillas de las plantas acumulan la lisina a un
nivel desde el diez al cuatrocientos por ciento más alto que las
semillas de plantas no transformadas abarca:
(a) las células de la planta que se transforman,
preferiblemente el maíz, la colza o las células de la soja, con un
gen quimérico que comprende un fragmento de ácido nucleico que
codifica la enzima ácido dihidropicolínico sintasa que es
insensible a la inhibición por la lisina, unida a la secuencia de
tránsito del cloroplasto de la planta y a la secuencia reguladora
específica de la semilla de la planta;
(b) regenerar las plantas adultas fértiles de
las células de las plantas transformadas obtenidas en el paso (a)
bajo condiciones convenientes para obtener las semillas;
(c) investigar la progenie de la semilla del
paso (b) para el contenido de lisina; y
(d) seleccionar las líneas en las que las
semillas contienen elevados niveles de lisina. Las plantas
transformadas obtenidas de este método también se reivindican.
La invención además de concernir a un fragmento
de ácido nucleico abarca:
(a) un primer gen quimérico donde un fragmento
de ácido nucleico codifica la enzima ácido dihidropicolínico
sintasa que es insensible a la inhibición por la lisina unida a la
secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta y a la secuencia
reguladora específica de la semilla de la planta y
(b) un segundo gen quimérico donde un fragmento
de ácido nucleico codifica una proteína rica en lisina, donde el
tanto por ciento en peso de lisina es al menos del 15%, se une a la
secuencia reguladora específica de la semilla de la planta.
También se describe un fragmento de ácido
nucleico que abarca:
(a) un primer gen quimérico donde un fragmento
de ácido nucleico codifica la enzima ácido dihidropicolínico
sintasa que es insensible a la inhibición por la lisina unida a la
secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta y a la secuencia
reguladora específica de la semilla de la planta y
(b) un segundo gen quimérico en donde un
fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína rica en lisina
abarca una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
que contiene n unidades hepatadas (d e f g a b c), cada heptada
es igual o diferente, donde:
- n es por lo menos 4;
- a y d se seleccionan independientemente de un grupo compuesto por Met, Leu, Val, Ile y Thr;
- e y g se seleccionan independientemente del grupo compuesto por pares ácido/base Glu/Lys, Lys/Glu, Arg/Glu, Arg/Asp, Lys/Asp, Glu/Arg, Asp/Arg y Asp/Lys; y
- b, c y f son independientemente cualquier aminoácido excepto Gly o Pro y se seleccionan al menos dos aminoácidos de b,c y f en cada heptada del grupo compuesto por Glu, Lys, Asp, Arg, His, Thr, Ser, Asn, Ala, Gln y Cys,
dicho fragmento del ácido nucleico
se une a la secuencia reguladora específica de la semilla de la
planta.
Además se describe un fragmento de ácido
nucleico que abarca
(a) un primer gen quimérico, donde un fragmento
de ácido nucleico codifica la enzima ácido dihidropicolínico
sintasa que es insensible a la inhibición por la lisina unida a la
secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta y a la secuencia
reguladora específica de la semilla de la planta; y
(b) un segundo gen quimérico en donde un
fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína rica en lisina
abarca una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
con una secuencia de aminoácido
(MEEKLKA)_{6}(MEEKMKA)_{2} que está unida
a la secuencia reguladora específica de la semilla de la planta.
También se reivindican aquí las plantas que
contienen varias realizaciones de los primeros genes quiméricos y
los segundos genes quiméricos descritos y los fragmentos de ácidos
nucleicos descritos y las semillas obtenidas de tales plantas.
La invención más allá de concernir un fragmento
de ácido nucleico abarca
(a) un primer gen quimérico, donde un fragmento
de ácido nucleico codifica l enzima ácido dihidropicolínico sintasa
que es insensible a la inhibición por la lisina unida a la
secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta y a la secuencia
reguladora específica de la semilla de la planta; y
(b) un segundo gen quimérico donde un fragmento
de ácido nucleico que codifica la lisina cetoglutarasa reductasa se
une con la orientación en sentido o en antisentido a la secuencia
reguladora específica de la semilla de la planta. También se
reivindica la planta que comprende en su genoma este fragmento de
ácido nucleico y la semilla que se obtiene de dicha planta.
La invención se puede entender de forma más
completa con la siguiente descripción detallada y los
correspondientes dibujos y las descripciones de secuencia de la
siguiente descripción detallada y los dibujos de acompañamiento y
las descripciones de la secuencia que forman una parte de esta
aplicación.
La Figura 1 muestra una hélice alfa con vistas
lateral y superior.
La Figura 2 muestra las vistas final (Figura
2a) y lateral (Figura 2b) de una estructura helicoidal alfa de
bobinas en espiral.
La Figura 3 muestra la estructura química de la
leucina y de la metionina que acentúan sus formas similares.
La Figura 4 muestra una representación
esquemática de un casete de expresión de un gen específico de la
semilla.
La Figura 5A muestra un mapa del vector binario
pZS199 del plásmido; La Figura 5B muestra un mapa del vector
binario pFS926 del plásmido.
La Figura 6A muestra un mapa del vector pBT603
del plásmido; La Figura 6B muestra un mapa del vector pBT614 del
plásmido.
La Figura 7 representa la estrategia para crear
un vector (pSK5) para su uso en la construcción y la expresión de
las secuencias del gen de SSP.
La Figura 8 muestra la estrategia de inserción
de secuencias de oligonucleótidos en el único sitio Ear I de la
secuencia base del gen.
La Figura 9 muestra la inserción de los
oligonucleótidos del gen base en los sitios Nco I/EcoR I del pSK5
para crear el plásmido pSK6. Se utiliza esta secuencia base del gen
como en la Figura 8 para insertar varias regiones de codificación
SSP en el único sitio Ear I para crear los segmentos clonados
enumerados.
La Figura 10 muestra la inserción del
"segmento" de oligonucleótidos 63 bp, que se usa para crear las
secuencias no repetitivas del gen para el esquema de duplicación en
la Figura 11.
La Figura 11 (A y B) muestra la estrategia de
"segmentos" no repetitivos del gen utilizando fusiones en
marco.
La Figura 12 muestra los vectores que contienen
el promotor específico de la semilla y secuencias de casete 3'. Se
insertaron las secuencias SSP en estos vectores usando los sitios
Nco I y Asp718.
La Figura 13 muestra un mapa del vector binario
pZS97 del plásmido.
La Figura 14 muestra un mapa del vector pML63
del plásmido.
La Figura 15 muestra un mapa del vector pML102
del plásmido que contiene un gen quimérico donde las secuencias
reguladoras específicas de la semilla (del gen del inhibidor 3 de
la tripsina Kunitz de la soja) se unen a una secuencia de tránsito
del cloroplasto (de la subunidad pequeña de la ribulosa
bis-fosfato carboxilasa de la soja) y a la secuencia
de codificación para la enzima ácido dihidrodipicolínico sintasa
insensible a la lisina (el gen dapA de Corynebacterium
glutamicum).
Las SEQ IDNOS:1 y 2 se usan en el Ejemplo 1 como
cebadores de PCR para el aislamiento del gen dapA de
Corynebacterium.
La SEQ ID NO:3 muestra la secuencia del
nucleótido y del amino de la región de codificación de un gen
dapA de Corynebacterium de tipo salvaje, el cuál
codifica la DHDPS insensible a la lisina, descrito en el Ejemplo
1.
La SEQ ID NO:4 muestra un oligonucleótido usado
en el Ejemplo 2 para crear un sitio Nco I en el codón de inicio de
la traducción del gen dapA de E. Coli.
La SEQ ID NO:5 muestra la secuencia del
nucleótido y del amino de la región de codificación de un gen
lysC de E. Coli de tipo salvaje, el cual codifica la
AKIII, descrita en el Ejemplo 3.
Las SEQ ID NOS: 6 y 7 se usan en el Ejemplo 3
para crear un sitio Nco I en el codón de inicio de la traducción
del gen lysC de E. coli.
Las SEQ ID NOS: 8, 9,10 y 11 se usan en el
ejemplo 4 para crear una secuencia de transito del cloroplasto y
unir la secuencia al lysC-M4 de E. coli, al
dapA de E. Coli y a los genes dapA de
Corynebacteria.
Las SEQ ID NOS: 12 y 13 se usan en el Ejemplo 4
para crear un sitio Kpn I inmediatamente después del codón de
parada de la traducción del gen dapA de E. coli.
Las SEQ ID NOS: 14 y 15 se usan en el Ejemplo 4
como cebadores para PCR para crear la secuencia de tránsito del
cloroplasto de la soja y unir la secuencia al gen dapA de
Corynebacteria.
Las SEQ ID NOS: 16-92
representan los fragmentos de los ácidos nucleicos y de los
polipéptidos que codifican y se usan para crear genes quiméricos
para proteínas de almacenaje de semillas ricas en lisina
convenientes para la expresión en las semillas de las plantas.
Las SEQ ID NOS: 93-98 se usan en
el Ejemplo 12 para crear una secuencia de tránsito del cloroplasto
de maíz.
Las SEQ ID NOS: 99 y 100 se usan en el Ejemplo
12 como cebadores de PCR para crear secuencias de tránsito del
cloroplasto de maíz y unir la secuencia al gen dapA de E.
Coli.
Las descripciones de las secuencias contienen
un código de una letra para la secuencia de carateres de nucleótidos
y un código de tres letras para los aminoácidos, tal y como se
define de acuerdo con los estándares de la
IUPAC-IYUB descritos en Nucleic Acids Research
13:3021-3030 (1985) en el Biochemical Journal 219
(No. 2):345-373(1984), los cuales se
incorporan aquí como una referencia.
Las enseñanzas que se describen a continuación
describen los fragmentos del ácido nucleico y los procedimientos
útiles para incrementar la acumulación de la lisina en las semillas
de las plantas transformadas, con respecto a los niveles de lisina
en las plantas no transformadas. Para aumentar la acumulación de la
lisina libre en las semillas de las plantas por vía de la
ingeniería genética, se hizo una determinación de las enzimas de
esta ruta que controlan la ruta en las semillas de plantas. Para
lograr esto, se aislaron de las bacterias los genes que codificaban
las enzimas en la ruta. Se unieron las secuencias de localización
intracelulares y las secuencias reguladoras adecuadas para la
expresión en las semillas de las plantas, para crear genes
quiméricos. Entonces se introdujeron los genes quiméricos en las
plantas por vía de la transformación y se determinaron por su
capacidad de acumular la lisina en las semillas. La expresión de la
enzima ácido dihidrodipicolínico sintasa insensible a la lisina
(DHDPS), bajo el control de un fuerte promotor específico de la
semilla, se traduce en un aumento de los niveles de lisina libre
del 10 al 100 en las semillas del maíz, de la colza y de la
soja.
Se ha descubierto que se reduce el potencial
máximo de acumulación del exceso de la lisina libre en las semillas
por el catabolismo de la lisina. Aquí se describen dos rutas
alternativas para prevenir la pérdida del exceso debido al
catabolismo. En el primer acercamiento, se previene el catabolismo
de la lisina con la reducción en la actividad de la enzima lisina
cetoglutarato reductasa (LKR), que cataliza el primer paso en la
interrupción de la lisina. Se proporciona un procedimiento para
aislar los genes de la LKR de la planta. Se crean los genes
quiméricos para la expresión del ARN antisentido de LKR o para la
cosupresión de la LKR en las semillas de las plantas. El gen
quimérico se une entonces simultáneamente al gen DHDPS quimérico y
ambos se introducen simultaneamente en las plantas por vía de la
transformación, o se reúnen los genes cruzando las plantas
transformadas de forma independiente con cada uno de los genes
quiméricos.
En el segundo acercamiento, se incorpora el
exceso de la lisina libre en una forma que sea insensible a la
interrupción, por ejemplo, mediante su incorporación en un di-, tri
u oligopeptido, o en una proteína de almacenaje rica en lisina. Se
detalla el diseño de los polipéptidos que se pueden expresar in
vivo para servir de proteínas de almacenamiento ricas en lisina
de las semillas. Se sintetizan los genes que codifican las proteínas
sintéticas de almacenamiento ricas en lisina (SSP) y los genes
quiméricos en donde los genes de SSP se unen a las SECUENCIAS
reguladoras adecuadas para la expresión en las semillas de las
plantas creadas. Entonces se une el gen SSP quimérico al gen DHDPS
quimérico y ambos se introducen simultáneamente en las plantas por
vía de la transformación, o se reúnen los genes cruzando las
plantas transformadas de forma independiente con cada uno de los
genes quiméricos.
Se adjunta un método para transformar las
plantas, preferiblemente las plantas del maíz, de la colza y de la
soja en donde las semillas que resultan de las plantas tienen por lo
menos una cantidad de lisina del diez por ciento, preferiblemente
del diez por ciento al 400 por ciento, mayor que las semillas de las
plantas no transformadas. Tal y como se muestra en los ejemplos, se
transforman las plantas de la colza con niveles de lisina en las
semillas incrementados un 100% sobre los niveles de las plantas no
transformadas, las plantas de la soja incrementan los niveles de
lisina por encima del 400% con respecto a las plantas no
transformadas, y los niveles de lisina en las semillas de las
plantas transformadas de maíz tienen un incremento del 130% con
respecto a las plantas no transformadas.
Se utiliza en el contexto de esta invención un
número de términos. Según lo utilizado aquí, el término "ácido
nucleico" se refiere a una molécula grande que pueda ser trenzada
de forma simple o doble, compuesta por los monómeros (nucleótidos)
que contienen un azúcar, un fosfato y una purina o pirimidina. Un
"fragmento del ácido nucleico" es una fracción de una molécula
dada del ácido nucleico. En las plantas superiores, el material
genético es el ácido deoxiribonucleico (ADN) mientras que el ácido
ribonucleico (ARN) está implicado en la transferencia de la
información del ADN a las proteínas. Un "genoma" es el cuerpo
entero del material genético contenido en cada célula de un
organismo. El término "secuencia del nucleótido" se refiere a
un polímero del ADN o del ARN que pueda ser trenzado de forma
simple o doble, opcionalmente contiene bases de nucleótidos
sintéticos, no naturales o alterados capaces de incorporarse en los
polímeros del ADN o del ARN.
El término "gen" se refiere a un fragmento
de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo
las secuencias reguladoras precedentes (5' no codificante) y las
siguientes (3' no codificante) de la región de codificación. El gen
"nativo" se refiere al gen que tiene sus propias secuencias
reguladoras tal y como se encuentra en la naturaleza. El gen
"quimérico" se refiere a un gen que comprende secuencias
reguladoras y de codificación heterogéneas. El gen "endógeno"
se refiere a un gen nativo encontrado normalmente en su
localización natural en el genoma. Un gen "extranjero" se
refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo
receptor pero se introduce por transferencia del gen.
\newpage
La "secuencia de codificación" se refiere a
una secuencia del ADN que codifica para una proteína específica y
excluye las secuencias de no codificación.
El "codón de iniciación" y el "codón de
terminación" se refieren a una unidad de tres nucleótidos
adyacentes en una secuencia de codificación que especifique
respectivamente la iniciación y la terminación de la cadena de la
síntesis de la proteína (traducción del ARNm). El "marco de
lectura abierto" se refiere a la secuencia del aminoácido
codificada entre los codones de inicio de la traducción y de
terminación de una secuencia de codificación.
Según lo utilizado aquí, las "secuencias
reguladoras" convenientes se refieren a las secuencias de
nucleótidos situadas secuencia superior (5'), dentro, y/o secuencia
inferior (3') en una secuencia de codificación, que controlan la
transcripción y/o la expresión de las secuencias de codificación,
potencialmente en conjunto con el aparato biosintético de la
proteína de la célula. Estas secuencias reguladoras incluyen los
promotores, las secuencias líderes de traducción, las secuencias de
terminación de la transcripción, y las secuencias de
poliadenilación.
El "promotor" se refiere a una secuencia
del ADN en un gen, generalmente una secuencia superior (5') a la
secuencia de codificación, que controla la expresión de la secuencia
de codificación proporcionando el reconocimiento para la ARN
polimerasa y otras factores requeridos para una apropiada
transcripción. Un promotor puede también contener las secuencias
del ADN que están implicadas en la unión de los factores de la
proteína que controlan la eficacia de la iniciación de la
transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de
desarrollo. Esto puede contener también elementos
potenciadores.
Un "potenciador" es una secuencia del ADN
que puede estimular la actividad del promotor. Puede ser un elemento
natural del promotor o un elemento externo insertado para potenciar
el nivel y/o la especificidad del tejido de un promotor.
Los "promotores constitutivos" se refieren
a aquellos que dirigen la expresión del gen en todos los tejidos y
en todo momento.
Según lo referido aquí, el
"órgano-específico" o los promotores de
"desarrollo-específico" son los que dirigen la
expresión del gen casi exclusivamente en órganos específicos, tales
como las hojas o las semillas, o en las etapas de desarrollo
específicas en un órgano, como en la embriogénesis temprana o
tardía, respectivamente.
El término "unión efectiva" se refiere a
las secuencias de ácido nucleico en una molécula simple del ácido
nucleico que se asocian de tal forma que la función de una sea
afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor se liga de forma
efectiva a un gen de la estructura cuando es capaz de afectar la
expresión de ese gen estructural (es decir, que el gen estructural
está bajo control transcripcional del promotor).
El término "expresión", según lo utilizado
aquí, se utiliza para expresar la producción del producto de la
proteína codificado por un gen. Concretamente, la "expresión"
se refiere a la transcripción y la acumulación estable del ARN
efector (ARNm) o antisentido derivado de los fragmentos de ácido
nucleico de la invención que, en conjunción con el aparato de la
proteína de la célula, da lugar a niveles alterados del producto de
la proteína. La "inhibición antisentido" se refiere a la
producción del ARN transcrito antisentido capaz de prevenir la
expresión de la proteína objetivo. La "sobreexpresión" se
refiere a la producción de un producto del gen en organismos
transgénicos que excedan los niveles de producción en organismos
normales o no transformados. La "cosupresión" se refiere a la
expresión de un gen extranjero con una sustancial homología con un
gen endógeno dando por resultado la supresión de la expresión del
gen extranjero y del gen endógeno. Los "niveles alterados" se
refieren a la producción de producto(s) del gen en organismos
transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las de
los organismos normales o no transformados.
Las "secuencias no codificantes 3'" se
refieren a la porción de la secuencia del ADN de un gen que contiene
una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora
capaz de afectar el proceso del ARNm o la expresión del gen.
La señal de poliadenilación generalmente se
caracteriza por afectar la adición del ácido poliadenílico al
extremo 3' del precursor del ARNm.
La "secuencia líder de la traducción" se
refiere a esa porción de la SECUENCIA del ADN de un gen entre el
promotor y la secuencia de codificación que se transcribe en el ARN
y está presente en el ARNm de secuencia superior (5') del codón de
inicio de la traducción. La secuencia líder de la traducción puede
afectar el proceso de la transcripción primaria al ARNm, a la
estabilidad del ARNm o a la eficacia de la traducción.
La proteína "madura" se refiere a un
polipéptido procesado post-translacionalmente sin
señal objetivo. La proteína "precursor" se refiere al producto
primario de la traducción del ARNm. Una "señal objetivo del
cloroplasto" es una secuencia del aminoácido que se traduce
conjuntamente con una proteína y la dirige al cloroplasto. La
"secuencia de tránsito del cloroplasto" se refiere a una
secuencia del nucleótido que codifica una señal objetivo del
cloroplasto.
La "transformación" aquí se refiere a la
transferencia de un gen extranjero en el genoma de un organismo
receptor y su herencia genética estable. Los ejemplos de los
métodos de transformación de la planta incluyen la transformación
mediada por Agrobacterium y la tecnología de transformación
de partícula acelerada o "gen arma".
Los "aminoácidos" adjuntos se refieren a
aminoácidos naturales L (Alanina, Arginina, ácido Aspartico,
Asparagina, Cistidina, ácido Glutámico, Glutamina, Glicina,
Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Prolina,
Fenilalanina, Serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina). Los
"aminoácidos esenciales" son aquellos aminoácidos que no
pueden ser sintetizados por los animales. Un "polipéptido" o
"proteína" según lo utilizado aquí se refiere a una molécula
compuesta por monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por
enlaces amida (también conocidos como los enlaces peptídicos).
La "proteína sintética" se refiere a la
proteína que contiene secuencias de aminoácido que no existen en la
naturaleza. La secuencia del aminoácido se puede derivar de un
consenso de proteínas naturales o puede ser totalmente nueva.
La "secuencia primaria" se refiere al orden
de conectividad de los aminoácidos en la cadena del polipéptido sin
consideración alguna hacia la conformación de la molécula. Las
secuencias primarias se escriben por convenio desde el extremo
amino terminal al extremo carboxilo terminal de la cadena del
polipéptido.
La "estructura secundaria" se refiere a los
arreglos fisicoquímicos regulares favorecidos de la espina dorsal
de una cadena polipeptídica sin consideración alguna hacia las
variaciones o conformaciones de la cadena lateral. Las "hélices
alfa" según lo utilizado aquí se refieren a hélices de lado
derecho con aproximadamente 3,6 residuos por cada vuelta de la
hélice. Una "hélice anfipática" se refiere a un polipéptido en
conformación helicoidal donde un lado de la hélice es
predominantemente hidrofóbico y el otro lado es predominante
hidrofílico.
"Enrollarse en espiral" se refiere a un
agregado de dos hélices alfa de lado derecho paralelas que se
enrollan una alrededor de la otra para formar una superhélice de
lado izquierdo.
Los "puentes salinos" como se discuten
aquí, se refieren a los pares ácido-base de las
cadenas laterales de los aminoácidos cargados, que dispuestos en el
espacio mantienen una interacción electrostática atractiva entre
dos partes de la cadena polipeptídica o entre una cadena y la
otra.
La "célula huésped" significa la célula que
se transforma con el material genético introducido.
Se obtuvo el gen dapA de E.coli
(ecodapA) como un clon del bacteriófago lambda de una
biblioteca de 3400 segmentos solapantes del ADN de E. Coli
construida por Kohara, Akiyame e Isono [Kohara y otros (1987) Cell
50:595 - 508]. En el Ejemplo 1 se muestran los detalles del
aislamiento y la modificación del ecodapA. El gen ecodapA
codifica una enzima de la DHDPS que es al menos 20 veces menos
sensible a la inhibición por lisina que una enzima típica de la
planta, ejemplo, la DHDPS del trigo. Para fines de la presente
invención, se llama insensible a lisina a todos aquellos 20 veces
menos sensibles a la inhibición por lisina.
El gen dapA de Corynebacteria
(cordapA) se aisló del ADN genómico de la ATCC de la cepa 13032
usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ha
publicado la secuencia del nucleótido del gen dapA de
Corynebacteria [Bonnassie y otros (1990) Nucleic Acids Res.
18:6421]. Se han diseñado los cebadores del oligonucleótido a
partir de la secuencia para la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) que permitiría la amplificación de un fragmento del ADN que
contiene el gen, y al mismo tiempo se agrega el único sitio de
restricción de la endonucleasa al codón de inicio y justo más allá
del codón de la parada del gen para facilitar otras construcciones
involucradas en el gen. En el Ejemplo 1 se presentan los detalles
del aislamiento del gen dapA de Corynebacteria
(cordapA). El gen cordapA codifica una enzima DHDPS insensible a la
lisina que no se afecta por la presencia de 70 mM de lisina en la
mezcla de reacción enzimática.
Se ha descrito en la literatura el aislamiento
de otros genes que codifican la DHDPS. Un ADNc que codifica la
DHDPS del trigo [Kaneko y otros (1990) J.Biol. Chem. 265:17451 -
17455], y un ADNc que codifica la DHDPS del maíz [Frisch y otros
(1991) Mol. Gen. Gent. 228:287 - 293] son dos ejemplos de los genes
DHDPS de la planta que se han aislado y secuenciado. Los genes de
la planta codifican la enzima DHDPS de tipo salvaje sensible a la
lisina. Sin embargo, Negrutui y otros [(1984) Theor. Appl. Gent.
68:11 - 20], obtuvieron dos mutantes del tabaco resistentes a AEC
en los cuales, la actividad de la DHDPS era menos sensible a la
inhibición de la lisina que la enzima de tipo salvaje. Esto indica
que estos mutantes del tabaco contienen los genes de la DHDPS que
codifican la enzima resistente a la lisina. Estos genes se podrían
aislar fácilmente de los mutantes del tabaco usando los métodos ya
descritos para aislar los genes del trigo o del maíz o,
alternativamente, usando los genes del trigo o del maíz como
pruebas de hibridación heteróloga.
Todavía se pueden aislar otros genes que
codifican la DHDPS usando cualquier gen dapA de
E.coli, el gen cordapA, o cualquiera de los genes de la
DHDPS como pruebas de hibridación del ADN. Alternativamente, se
pueden aislar otros genes que codifican la DHDPS con la
complementación funcional del un dapA de E.coli
mutante, como se hizo para aislar el gen del cordapA [Yeh y otros
(1988) Mol. Gen. Gent. 212:105 - 111] y el gen DHDPS del maíz.
\newpage
Está establecida la expresión de genes
extranjeros en plantas [De Blaere y otros (1987) Meth. Enzymol.
143:277 - 291]. El nivel apropiado de la expresión del ARNm del
dapA puede requerir el uso de diversos genes quiméricos que
utilizan a diversos promotores. Se pueden transferir tales genes
quiméricos a las plantas del receptor en un solo vector de
expresión o se puede usar secuencialmente más de un vector. Los
anfitriones eucarióticos son la clase preferida de los anfitriones
heterogéneos para la expresión de la secuencia de codificación de
los genes del dapA, particularmente las células de plantas
superiores. Particularmente se prefieren la colza (Brassica
napus, B. campestris) y la soja (Glycinemax) entre las
plantas superiores y las semillas derivadas de ellas.
El origen del promotor elegido para conducir la
expresión de la secuencia de codificación no es crítico, mientras
tenga la suficiente actividad transcripcional para lograr la
invención expresando el ARNm traducible para los genes dapA
en el tejido receptor deseado. Los promotores preferidos son
aquellos que permiten la expresión de la proteína específicamente
en las semillas. Esto puede ser especialmente útil, puesto que las
semillas son la fuente primaria de los aminoácidos vegetales y
también puesto que la expresión específica de la semilla evitará
cualquier efecto que deteriore el potencial en órganos de la
no-semilla.
Los ejemplos de promotores específicos de la
semilla incluyen, pero no se limitan a, los promotores de las
proteínas de almacenaje de la semilla. Las proteínas de almacenaje
de la semilla se regulan estrictamente, expresándose casi
exclusivamente en las semillas de una manera altamente
organoespecífica y específica de la etapa [Higgins y otros (1984)
Ann. Rev. Plant Physiol. 35:191 - 221; Goldberg y otros (1989) Cell
56:149 - 160; Thompson y otros (1989) BioEssays 10:108 - 113]. Por
otra parte, se pueden expresar las diversas proteínas de almacenaje
de la semilla en diversas etapas del desarrollo de la semilla.
Actualmente hay numerosos ejemplos para la
expresión de los genes de la proteína de almacenaje de la semilla
en plantas dicotiledóneas transgénicas. Éstos incluyen genes de las
plantas dicotiledóneas, la \beta-faseolina del
haba [Sengupta-Goplalan y otros (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:3320 - 3324; Hoffman y otros (1988) Plant. Mol.
Biol. 11:717 - 729], la lecitina del haba [Voelker y otros (1987)
EMBO J. 6:3571 - 3577], la lectina de la soja [Okamuro y otros
(1986) Proc Natl. Acad. Sci. USA. 83:8240 - 8244], el inhibidor de
la tripsina kunitz de la soja [Perez-Grau y otros
(1989) Plant. cell 1:095 - 1109], la
\beta-conglicinina de la soja [Beachy y otros
(1985) EMBO J. 4: 3047-3053; Barker y otros (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:458-462; Chen y otros
(1988) EMBO J. 7: 297-302; Chen y otros (1989) Dev.
Gent. 10:112-122; Naito y otros (1988) Plant Mol.
Biol. 11:109-123], la vicilina del guisante
[Higgins y otros (1988) Plant Mol. Biol.
11:683-695], la convicilina del guisante [Newbigin
y otros (1990) Planta 180:461], la legumina del guisante [Shirsat y
otros (1989) Mol. Gen. Gentics 215: 326]; el napin de la colza
[Radke y otros (1988) Theor. Appl. Gent. 75:
685-694] así como los genes de las plantas
monocotiledóneas como por ejemplo el zein 15 kD del maíz [Hoffman y
otros (1987) EMBO J. 6:3213-3221; Schernthaner y
otros (1988) EMBO J. 7:1249-1253; Williamson y otros
(1988) Plant Physiol. 88: 1002-1007], la
\beta-hordeína de la cebada [Marris y otros (1988)
Plant Mol. Biol. 10:359-366] y la glutenina del
trigo [Colot y otros (1987) EMBO J. 6:3559-3564].
Por otra parte, los promotores de genes específicos de la semilla,
unidos de forma efectiva a las secuencias de codificación
heterólogas en construcciones de genes quiméricos, también
mantienen su patrón temporal y espacial de expresión en las plantas
transgénicas. Tales ejemplos incluyen al promotor del gen de la
proteína de almacenaje de la semilla Arabidopsis thaliana 2S
para expresar los peptidos de la encefalina en las semillas
Arabidopsis y B. napus [Vandekerckhove y otros (1989)
Bio/Technology 7:929 - 932], la lectina del haba y los promotores de
\beta-faseolina para expresar la luciferasa
[Riggs y otros (1989) Plant. Sci. 63:47 - 57], y los promotores de
la glutenina del trigo para expresar el cloranfenicol acetil
transferasa [Colot y otros (1987) EMBO J. 6:3559 - 3564].
Son de particular uso en la expresión del
fragmento del ácido nucléico los promotores de varios genes de la
proteína de almacenaje de la semilla extensivamente caracterizados
tales como la faseolina del haba [Sengupta-Goplalan
y otros (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
3320-3324; Hoffman y otros (1988) Plant Mol. Biol.
11:717-729], el inhibidor de la tripsina Kunitz de
la soja [Jofuku y otros (1989) Plant Cell 1:
1079-1093; Perez-Grau y
otros(1989) Plant Cell 1:1095-1109], la
conglicina de la soja [Harada y otros (1989) Plant Cell
1:415-425], y el napin de la colza [Radke y otros
(1988) Theor. Appl. Gent. 75:685-694] utilizan la
expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención. Los
promotores de los genes de las proteínas de almacenaje de la
faseolina del haba y la \beta-conglicina de la
soja serán particularmente útiles en la expresión del ARNm del
dapA en los cotiledones de las etapas media y tardía en el
desarrollo de la semilla.
También son de particular uso en la expresión de
los fragmentos del ácido nucléico los promotores heterogéneos de
varios genes de proteínas de almacenaje de las semillas del maíz
extensamente caracterizados, tales como los promotores específicos
del endospermo del zein de 10 kD [Kirihara y otros (1988) Gen 71:
359-370], el zein de 27 kD [Prat y otros (1987) Gen
52: 51-49; Gallardo y otros (1988) Plant Sci. 54:
211-281; Reina y otros (1990) Nucleic Acids Res.
18:6426-6426], y el zein de 19 kD [Marks y otros
(1985) J. Biol. Chem. 260:16451-16459]. Se han
divulgado las actividades transcripcionales relativas de estos
promotores en el maíz [Kodrzyck y otros (1989) Plant Cell
1:105-114] que proporcionan unas bases para elegir
un promotor para el uso en las construcciones de genes quiméricos
para el maíz. Se puede usar para la expresión en embriones del maíz
el promotor fuertemente específico del embrión del gen de la
globulina 1 (GLB1) [Kriz (1989) Biochemical Gentics 27:
239-251, Wallace y otros (1991) Plant Physiol. 95:
973-975].
Se tiene previsto que la introducción de
reforzadores o elementos como reforzadores en otras construcciones
del promotor, proporcionará niveles crecientes de la transcripción
primaria de los genes dapA para lograr la invención. Éstos
incluirían reforzadores virales como el encontrado en el promotor
35S [Odell y otros (1988) Plant Mol. Biol. 10:
263-272], reforzadores de los genes del opin [Fromm
y otros (1989) Plant Cell 1:977-984], o los
reforzadores de cualquier otra fuente que de lugar al incremento de
la transcripción cuando están colocados en un promotor unido al
fragmento del ácido nucleico de la invención.
De particular importancia es el elemento de la
secuencia del ADN aislado del gen para la subunidad \alpha' de
la \beta-conglicinina que puede conferir un
incremento específico de 40 veces de semilla a un promotor
constitutivo [Chen y otros (1988) EMBO J. 7:
297-302; Chen y otros (1989) Dev. Gent.
10:112-122]. Un experto en la técnica puede aislar
fácilmente este elemento e insertarlo dentro de la región del
promotor de cualquier gen para obtener un aumento específico en la
expresión de la semilla con el promotor en las plantas transgénicas.
La inserción de tal elemento en cualquier gen específico de la
semilla que se exprese a diferentes tiempos que la
\beta-conglicinina, dará lugar a la expresión en
las plantas transgénicas durante un período más largo en el
desarrollo de la semilla.
Se puede utilizar para la invención cualquier
región no codificante 3' capaz de proporcionar una señal de
poliadenilación y otras secuencias reguladoras que se puedan
requerir para la expresión de las regiones codificantes de
dapA. Esto incluiría el extremo 3' de cualquier proteína de
almacenaje tal como el extremo 3' del gen de la faseolina del haba,
el extremo 3' del gen de la \beta-conglicina de la
soja, el extremo 3' de genes virales tales como el extremo 3' del
35S o las transcripciones del virus mosaico de la coliflor 19S, el
extremo 3' de los genes de síntesis del opin, los extremos 3' de la
ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa o la proteína de
unión a/b de la clorofila, o las secuencias del extremo 3' de
cualquier fuente tal que la secuencia empleada proporcione la
información reguladora necesaria dentro de la secuencia del ácido
nucleico para dar lugar a la expresión apropiada de la combinación
del promotor/región de codificación a la cual está unido. Hay
numerosos ejemplos en la técnica que muestran la utilidad de las
diversas regiones no codificantes 3' [por ejemplo, ver Ingelbrecht
y otros (1989) Plant Cell 1:671 - 680].
Si se requiere para la expresión apropiada de
las proteínas descritas en la invención, se pueden agregar a la
secuencia de codificación del dapA las secuencias del ADN que
codifican para las secuencias de localización intramolecular. Se
sabe que las enzimas biosintéticas del aminoácido de la planta están
localizadas en los cloroplastos y por lo tanto se sintetizan con
una señal objetivo del cloroplasto. Las proteínas bacterianas tales
como la DHDPS de Corynebacterium no tienen tal señal. Por
lo tanto se podría fundir una secuencia de tránsito del cloroplasto
a la secuencia de codificación del dapA. Las secuencias de
tránsito del cloroplasto preferidas son aquellas de la subunidad
pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa,
por ejemplo, de la soja [Berry-Lowe y otros (1982)
J. Mol. Appl. Gent.1:483-498] para el uso en plantas
dicotiledóneas y del maíz [Lebrun y otros (1987) Nucleic Acids Res.
15: 4360] para el uso en plantas monocotiledóneas.
Están disponibles los diversos métodos para
introducir una secuencia del ADN (es decir, de transformar) en las
células eucarióticas de plantas superiores (véanse las publicaciones
del EPO 0 295 959 A2 y 0 138 341A1). Tales métodos incluyen
aquellos basados en los vectores de transformación basados en los
plásmidos Ti y Ri del spp Agrobacterium. Se prefiere
utilizar particularmente el tipo binario de estos vectores. Los
vectores derivados de Ti transforman una amplia variedad de plantas
superiores, incluyendo las plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas, tales como la soja, el algodón y la colza [Pacciotti
y otros (1985) Bio/Technology 3: 241; Byrne y otros (1987) Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 8: 3; Sukhapinda y otros (1987) Plant
Mol. Biol. 8: 209-216; Lorz y otros (1985) Mol.
Gen. Gent. 199: 178; Potrykus (1985) Mol. Gen.Gent. 199:183].
Para la introducción en las plantas los genes
quiméricos de la invención pueden insertarse en vectores binarios
tal y como se describe en los Ejemplos 6-12. Los
vectores son parte de un sistema binario del vector del plámido de
Ti [Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711-8720]
del Agrobacterium tumefaciens.
Un experto en la especialidad dispone de otros
métodos de transformación, como la captación directa de
construcciones de ADN extranjeras [ver publicación EPO 0 295 959
A2], técnicas de electroporación [Ver Fromm y otros (1986) Nature
(Londres) 319:791] o el bombardeo balístico a alta velocidad con
partículas metálicas recubiertas con las construcciones de ácido
nucleico [ver Kline y otros (1987) Nature (Londres) 327:70, y ver
patente USA No. 4.945.050] Una vez realizada la transformación, las
células pueden ser regeneradas por aquellos expertós en la
especialidad.
Los métodos descritos recientemente tienen gran
importancia en la transformación de genes extranjeros en cosechas
de importancia comercial, tales como la colza [ver a De Block y
otros(1989) Plant Physiol. 91: 694-701], el
girasol [Everett y otros (1987) Bio/Technology 5:1201], la soja
[McCabe y otros (1988) Bio/Technology 6: 923; Hinchee y
otros(1988) Bio/Technology 6: 915; Chee y otros (1989) Plant
Physiol. 91: 1212-1218; Christou y otros (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 7500-7504; EPO
Publication 0 301 749 A2], y el maíz [Gordon-Kamm
y otros (1990) Plant Cell 2: 603-618; Fromm y otros
(1990) Biotechnology 8:833-839].
Para la introducción en las plantas mediante
bombardeo balístico de alta velocidad, se insertan los genes
quiméricos de la invención en convenientes vectores según lo
descrito en el Ejemplo 6.
Se prepara una comida de semilla para analizar
la expresión de los genes quiméricos dapA en las semillas y las
consecuencias de la expresión del contenido del aminoácido en las
semillas tal y como se describe en los Ejemplos 5 y 6 o por
cualquier otro método apropiado. Si se desea, se puede desengrasar
parcial o completamente la comida de la semilla, por ejemplo por
extracción con hexano. Los extractos de la proteína se pueden
preparar de la comida y analizar para la actividad enzimática de la
DHDPS.
Se puede testar la presencia de la proteína
DHDPS alternativamente para inmunológia mediante métodos muy
conocidos por los expertos en la técnica. Casi todos los
transformados expresaron la proteína extranjera DHDPS (véase los
Ejemplos 5.6 y 13). Para medir la composición del aminoácido libre
de las semillas, se pueden extraer de la comida los aminoácidos
libres y analizarlos por los métodos conocidos por los expertos en
la técnica (para los procedimientos convenientes véase los Ejemplos
5 y 6).
Los genes transformados de la colza que
expresaban la proteína DHDPS mostraron un aumento cien veces mayor
en el nivel de la lisina libre en sus semillas. Había una buena
correlación entre los transformados que expresaban niveles más
altos de la proteína DHDPS y aquellos que tenían los niveles más
altos de lisina libre. Entre los transformados, no ha habido una
acumulación mayor de lisina libre debido a la expresión de una
enzima AK insensible a la lisina junto con una DHDPS insensible a
la lisina, comparada con la expresión de la DHDPS insensible a la
lisina. Así, en la colza, la expresión de la DHDPS insensible a la
lisina en semillas es necesaria y suficiente para causar un gran
incremento de lisina libre. Se observó un alto nivel del ácido
\alpha-aminoadípico, indicativo de catabolismo de
la lisina, en todas las líneas transformadas con niveles crecientes
de lisina.
La comida desgrasada se analiza tal y como se
describe en el Ejemplo 5 para medir la composición total de
aminoácido en las semillas maduras de la colza. Los niveles
relativos de aminoácidos en las semillas se comparan como
porcentajes de lisina en el total del aminoácido. Las líneas de
expression mas altas muestran un incremento de cerca del doble del
nivel de lisina en las semillas, de modo que la lisina compone cerca
del 12% del total de aminoácidos de la semilla.
Veintiuno de los veintitrés genes transformados
de la soja expresaron la proteína DHDPS. El análisis de las
semillas de estos genes transformados demostró la excelente
correlación entre la expresión del gen marcador de la
transformación GUS y la DHDPS en semillas individuales. Por lo
tanto, los genes de GUS y de DHDPS se integran en el mismo sitio en
el genoma de la soja.
Había una excelente correlación entre los
transformados que expresaban la proteína DHDPS de Corynebacteria y
aquellos que tenían niveles más altos de lisina libre. El nivel de
lisina libre incrementó desde 20 a 120 veces en las semillas que
expresaban DHDPS de Corynebacteria.
Los ánálisis de lisina libre en semillas
individuales de los genes transformados en los que los transgenes se
segregaron como un locus simple, mostraron que el incremento del
nivel de lisina libre era significativamente más alto en cerca de un
cuarto de las semillas. Puesto que se esperaba que un cuarto de las
semillas fuera homocigoto para el transgen, es probable que las
semillas con mayor cantidad de lisina sean los homocigotos. Además,
esto indica que el nivel de incremento de la lisina libre es
dependiente sobre el número de la copia del gen de DHDPS. Por lo
tanto, se podrían incrementar los niveles de lisina haciendo los
híbridos de dos transformados diferentes, y obteniendo progenie que
son homocigotos en ambos locis de los transgenes, incrementando así
el número de copia del gen de DHDPS de dos a cuatro.
Se observó un alto nivel de saccharopina,
indicativo del catabolismo de la lisina, en las semillas que
contenían niveles altos de lisina. Así, se puede prevenir el
catabolismo de la lisina por la inactivación de la cetoglutarato
reductasa de la lisina si existe el incremento posterior de
acumulación de lisina libre en las semillas. Altenativamente, la
incorporación de la lisina en un péptido o en una proteína rica en
lisina podría prevenir el catabolismo y conducir a un incremento en
la acumulación de lisina en las semillas.
Se incrementaron significativamente los niveles
totales de lisina de las semillas que expresaban la proteína DHDPS
de Corynebacteria. Se observaron semillas con un incremento del
10-260% en el nivel de lisina comparado con un
control no transformado. La expresión de DHDPS junto con una enzima
aspartoquinasa insensible a la lisina dio lugar a incrementos de
lisina de más del 400%. Así, estas semillas contienen mucha más
lisina que cualquier semilla de soja anterior.
En las semillas de maíz se observó la expresión
de la proteína DHDPS de Corynebacterium, conducida por el
promotor de la globulina 1 del maíz para la expresión en el embrión
o por el promotor de la glutelina 2 del maíz para la expresión en
el endospermo. Los niveles de lisina libre en las semillas se
incrementaron desde el 1,4% de aminoácidos libres en semillas del
control al 15-27% de aminoácidos libres en las
semillas que expresaban la DHDPS de Corynebacterium del
promotor de la globulina 1. Se observó un incremento más pequeño en
la lisina libre en las semillas que expresaban la DHDPS de
Corynebacterium del promotor del glutelina 2. Así para
incrementar la lisina, puede ser mejor expresar esta enzima en el
embrión que en el endospermo. Se observó un alto nivel de la
saccharopina, indicativo de catabolismo de la lisina, en las
semillas que contenían altos niveles del lisina. La acumulación
creciente de lisina libre en las semillas que expresaban la DHDPS
de Corynebacterium del promotor de la globulina 1, resultó
suficiente para dar lugar a incrementos substanciales (35%-130%) en
el contenido total de la lisina de las
semillas.
semillas.
Se puede pretender prevenir el catabolismo de la
lisina para acumular niveles más altos de lisina libre. Las
evidencias indican que la lisina se cataboliza en las plantas por la
ruta de la saccharopina. La primera evidencia enzimática para la
existencia de esta ruta fué la detección de la actividad de la
lisina cetoglutarato reductasa (LKR) en el endospermo no maduro de
las semillas del maíz en desarrollo [Arruda y otros (1982) Plant
Physiol. 69:988-989]. La LKR cataliza el primer
paso en el catabolismo de la lisina, la condensación de la
L-lisina con el
\alpha-cetoglutarato en la saccharopina usando el
NADPH como cofactor. La actividad de la LKR se agudiza desde el
inicio del desarrollo del endospermo en el maíz, y alcanza un pico
de nivel máximo aproximadamente 20 días después de la polinización,
y entonces declina [Arruda y otros (1983) Phytochemistry
22:2687-2689]. Para prevenir el catabolismo de la
lisina sería conveniente reducir o eliminar la expresión o la
actividad de la LKR. Esto podría lograrse clonando el gen de la
LKR, preparando un gen quimérico para la cosupresión de la LKR o
preparando un gen quimérico para expresar ARN de secuencia superior
para la LKR, e introduciendo el gen quimérico en las plantas por la
vía de la transformación.
Están disponibles varios métodos para reproducir
un gen LKR de la planta para una persona experta en la técnica. Se
puede purificar la proteína del endospermo del maíz, según lo
descrito en [BrochettoBraga y otros [(1992) Plant Physiol.
98:1139-1147] y usarla para aumentar los
anticuerpos. Se pueden utilizar los anticuerpos para revisar una
librería de expresión del ADNc para clones de la LKR. Se puede
utilizar la proteína purificada altenativamente para determinar la
secuencia del aminoácido en el extremo amino terminal de la proteína
o de proteasas derivadas de fragmentos peptídicos internos. Se
pueden preparar pruebas de oligonucleótidos degenerados basadas
sobre la secuencia del aminoácido y utilizarlo para explorar un ADNc
de la planta o una librería genómica de ADN por vía de la
hibridación. Otro método utiliza una torsión de E. Coli que
no pueda crecer en un medio sintético que contiene 20 \mug/mL de
L-lisina. La expresión del ADNc integral de la LKR
en esta torsión invertirá la inhibición del crecimiento reduciendo
la concentración de lisina. Se describe en el Ejemplo 7 la
construcción de una conveniente trosión de E. Coli y su uso
para seleccionar clones de una librería de ADNc de la planta que
conduzca al crecimiento de lisina resistente.
Para bloquear la expresión del gen de la LKR en
las plantas transformadas, se puede construir un gen quimérico
diseñado para la cosupresión de la LKR uniendo el gen de la LKR o el
fragmento del gen a las secuencias del promotor de la planta
descritas arriba (U. S. Patent No. 5,231,020). Se puede construir
alternativamente un gen quimérico diseñado para expresar el ARN
antisentido para el total o una parte del gen de la LKR uniendo el
gen de la LKR o el fragmento del gen en la orientación inversa a las
secuencias del promotor de la planta descritas arriba (Eur. Patent
Applic. No. 84112647.7). Se podría introducir la cosupresión o el
gen quimérico antisentido en las plantas por vía de la
transformación. Se seleccionan los transformados en donde se reduce
o se elimina la expresión del gen endógeno de la LKR.
Los promotores preferidos para los genes
quiméricos podrían ser promotores específicos de la semilla. Se
prefieren para la soja, la colza y otras plantas dicotiledoneas,
promotores fuertemente específicos de la semilla de un gen de la
faseolina del haba, de un gen \beta-conglicina de
la soja, del gen de la glicinina, del gen del inhibidor de la
tripsina Kunitz, o del gen napin de la colza. Se prefiere para el
maíz y otras plantas monocotiledoneas un promotor fuertemente
específico del endospermo, por ejemplo, el promotor zein de 10 kD o
de 27 kD.
Se pueden obtener las plantas transformadas que
contienen genes quiméricos de la LKR por los métodos descritos
arriba. Para obtener las plantas transformadas que expresan un gen
quimérico para la cosupresión de la LKR o de la LKR antisentido,
así como un gen quimérico que codificaba la DHDPS insensible a la
lisina, se podría unir el gen de la cosupresión o de la LKR
antisentido al gen quimérico que codifica la DHDPS insensible a la
lisina y los dos genes se podrían introducir en las plantas por vía
de la transformación.
Se podría introducir alternativamente, el gen
quimérico para la cosupresión de la LKR o de la LKR antisentido
en las plantas previamente transformadas que expresan la DHDPS
insensible a la lisina, o se podría introducir el gen de la
cosupresión o de la LKR antisentido en las plantas normales y se
podrían cruzar los transformados obtenidos con las plantas que
expresan la DHDPS insensible a la lisina.
Se puede desear convertir los altos niveles de
lisina producidos en una forma que sea insensible a la interrupción,
por ejemplo, mediante su incorporación en un di-, tri u
oligopeptido, o en una proteína de almacenaje rica en lisina. No se
conocen proteínas naturales ricas en lisina.
Un aspecto de esta invención es el diseño de
polipéptidos que se puedan expresar in vivo para servir como
proteínas de almacenaje de la semilla ricas en lisina. Los
polipéptidos son polímeros lineales de aminoácidos donde el grupo
\alpha-carboxilo de un aminoácido está enlazado
covalentemente con el grupo \alpha-amino del
aminoácido siguiente en la cadena. Las interacciones no covalentes
entre los residuos en la cadena y con el disolvente circulante
determinan la conformación final de la molécula. Los expertos en la
técnica deben considerar las fuerzas electrostáticas, los puentes
de hidrógeno, las fuerzas de Van der Waals, las interacciones
hidrofóbicas, y las preferencias conformacionales de los residuos
individuales del aminoácido en el diseño de una cadena
polipeptídica doblada estable [ver por ejemplo: Creighton, (1984)
Proteins, Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman and
Company, New York, pp. 133-197, or Schulz y otros,
(1979) Principles of Protein Structure, Springer Verlag, New York,
pp. 27-45]. El número de interacciones y su
complejidad sugieren que se puede ayudar en lo posible al proceso
del diseño con el uso de modelos naturales de la proteína.
Las proteínas de almacenaje sintéticas (SSPs)
incorporadas en esta invención se eligen por ser polipéptidos con
potencial para enriquecer los niveles medios de la lisina relativa
de las proteínas en las semillas de la planta. La lisina es un
aminoácido cargado a pH fisiológico y por lo tanto se encuentra a
menudo en la superficie de las moléculas de la proteína [Chotia,
(1976) Journal of Molecular Biology 105:1-14]. Para
maximizar el contenido de lisina, los solicitantes eligieron una
forma molecular con una alta relación de superficie a volumen para
las proteínas de almacenaje sintéticas incorporadas a esta
invención.
Las alternativas eran estirar la forma globular
común de la mayoría de las proteínas para formar una estructura
extendida de barra o aplanar la forma globular y dar una estructura
de disco. Los solicitantes eligieron la configuración como las que
hay en varios modelos naturales para proteínas con forma de barra en
la clase de las proteínas fibrosas [[Creighton, (1984) Proteins,
Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman and Company, New
York, p. 191].
Los enrollados en espiral constituyen un
subconjunto muy estudiado de la clase de proteínas fibrosas [ver a
Cohen y otros, (1986) Trends Biochem. Sci.
11:245-248]. Los ejemplos naturales se encuentran
en las \alpha-queratinas, la paramiosina, la
meromiosina ligera y la tropomiosina. Estas moléculas de la
proteína consisten en dos hélices alfa paralelas torcidas sobre si
en un supercoloide de lado izquierdo. La distancia de repetición de
este supercoloide es de 140 \ring{A} (comparada en una distancia
de repetición de 5,4 \ring{A} para una vuelta de las hélices
individuales). El supercoloide causa una posición oblicua leve
(10º) entre los ejes de las dos hélices alfa individuales.
En una bobina en espiral hay 3,5 residuos por
cada vuelta de las hélices individuales dando por resultado una
periodicidad exacta del residuo 7 con respecto al eje de la
superhélice (ver Figura 1). Cada séptimo aminoácido en la cadena
polipéptidica ocupa una posición equivalente con respecto al eje de
la hélice. Los solicitantes se refieren a las siete posiciones en
esta unidad de la heptada de la invención como (d e f g a b c) según
se muestra en las Figuras 1 y 2a. Esto concuerda con las
convenciones usadas en el enrollado en espiral de la
literatura.
Los aminoácidos a y d de la heptada siguen un
patrón de repetición de 4,3 en la secuencia primaria y caen en un
lado de la hélice alfa individual (ver Figura 1). Si los aminoácidos
en un lado de la hélice alfa son todos no polares, esa cara de la
hélice es hidrofóbica y se asociará a otras superficies hidrofóbicas
como, por ejemplo, la cara no polar de otra hélice similar. Un
enrollado en espiral resulta cuando dimerizan dos hélices tales que
sus caras hidrofóbicas están alineadas la una con la otra (ver
Figura 2a).
Los aminoácidos en las caras externas de los
componentes de las hélices alfa (b, c, e, f, g) son generalmente
polares en los enrollados en espiral naturales de acuerdo con el
patrón previsto y los tipos de residuo de dentro de las proteínas
globulares [Schulz, y otros, (1979) Principles of Protein Structure.
Springer Verlag, New York, p. 12; Talbot, et al, (1982) Acc.
Chem. Res. 15:224-230; Hodges y otros, (1981)
Journal of Biological Chemistry 256:1214-1224]. Los
aminoácidos cargados se encuentran en ocasiones formando puentes
salinos entre las posiciones e y g' o entre las posiciones g y e'
en la cadena opuesta (ver la Figura 2a).
Así, dos hélices anfipáticas como la que se
muestra en la Figura 1 se ligan por una combinación de interacciones
hidrofóbicas entre los residuos a, a', d, y d' y por los puentes
salinos entre los residuos e y g' y/o los residuos g y e'. El
empaquetamiento de los residuos hidrofóbicos en el supercoloide
mantiene las cadenas "en registro". Para los polipéptidos
cortos que contienen solamente algunas vueltas de componentes de
cadenas helicoidales alfa, se puede ignorar el giro de 10º entre
los ejes de la hélice y las dos cadenas se pueden tratar como en
paralelo (como se muestra en la Figura 2a).
En la literatura existe un número de enrollados
en espiral sintéticos [(Lau y otros, (1984) Journal of Biological
Chemistry 259: 13253-13261; Hodges y otros, (1988)
Peptide Research 1: 19-30; DeGrado y otros, (1989)
Science 243:622-628; O'Neil y otros, (1990) Science
250:646-651]. Aunque estos polipéptidos varían de
tamaño, Lau y colaboradores encontraron que 29 aminoácidos eran
suficientes para que la dimerización forme la estructura de
enrollados en espiral [Lau y otros, (1984) Journal of Biological
Chemistry 259:13253-13261]. Los solicitantes
construyeron los polipéptidos en esta invención con 28 residuos y
cadenas más largas por razones de estabilidad conformacional.
Los polipéptidos de esta invención se diseñan
para dimerizar con un enrollado en espiral en ambientes acuosos.
Los solicitantes han utilizado una combinación de interacciones
hidrofóbicas y de interacciones electrostáticas para estabilizar la
conformación del enrollado en espiral. La mayoría de los residuos no
polares se restringen a las posiciones a y d que crean una raya
hidrofóbica paralela al eje de la hélice. Ésta es la cara de la
dimerización. Los solicitantes evitaron los aminoácidos grandes y
voluminosos a lo largo de esta cara para minimizar el impedimento
estérico con la dimerización y para facilitar la formación de una
estructura estable de enrollado en espiral.
A pesar de aparecer informes recientes en la
literatura que sugieren que la metionina en las posiciones a y d
desestabiliza los enrollados en espiral en el subgrupo cremallera
de la leucina [Landschulz y otros, (1989) Science 243:
1681-1688 and Hu y otros, (1990) Science 250:
1400-1403], los solicitantes eligieron substituir
los residuos de la metionina por la leucina en la cara hidrofóbica
de los polipéptidos de SSP. La Metionina y la leucina son similares
en la forma molecular (Figura 3). Los solicitantes demostraron que
cualquier desestabilización del enrollado en espiral que pueda
causar la metionina en la base hidrofóbica aparece compensada en
las secuencias donde se produce la formación de puentes salinos
(e-g' y g-e') en todas las
posiciones posibles en la hélice (es decir, dos veces por
heptada).
Hasta el punto que sea compatible con el
objetivo de crear un polipéptido enriquecido en lisina, los
solicitantes minimizaron las cargas desequilibradas en el
polipéptido. Esto puede ayudar a prevenir interacciones no deseadas
entre las proteínas de almacenaje sintéticas y otras proteínas de la
planta cuando los polipéptidos se expresan in vivo.
Se diseñan los polipéptidos de esta invención
para doblar espontáneamente en una estructura definida,
conformacionalmente estable, la hélice alfa enrollada en espiral,
con unas restricciones mínimas en la secuencia primaria. Esto
permite que las proteínas de almacenaje sintéticas sean
confeccionadas a medida para los requisitos específicos del usuario
final. Se puede incorporar cualquier aminoácido en una frecuencia de
uno de cada siete residuos usando las posiciones b, c, y f en la
unidad repetida de la heptada. Los solicitantes observan que se
pueden incorporar hasta el 43% de un aminoácido esencial del grupo
de la isoleucina, la leucina, la lisina, la metionina, la treonina,
y la valina y que se puede incorporar en las proteínas de almacenaje
sintéticas de esta invención hasta el 14% de los aminoácidos
esenciales del grupo de la fenilalanina, el triptófano y la
tirosina.
En la SSPs solo se sitúan en la base hidrofóbica
Met, Leu, Ile, Val o Thr. Además, se restringen las posiciones e,
g, e' y g' en la SSPs de modo que ocurra siempre una interacción
electrostática atractiva en estas posiciones entre las dos cadenas
del polipéptido en un dímero de SSP. Esto hace que los polipéptidos
de SSP sean más estables como dímeros.
Así, las proteínas de almacenaje sintéticas
noveles descritas en esta invención representan un subconjunto
particular de posibles polipéptidos enrollados en espiral. No todos
los polipéptidos que adoptan una conformación helicoidal alfa
anfipática en solución acuosa son convenientes para los usos
descritos aquí.
Las reglas siguientes derivadas del trabajo de
los solicitantes definen los polipéptidos de SSP que los
solicitantes utilizan en su invención:
El polipéptido sintético comprende n unidades de
la heptada (d e f g a b c), cada heptada que es el igual o
diferente, donde:
- n es al menos 4;
- a y d se seleccionan independientemente del grupo formado por Met, Leu, Val, Ile y Thr;
- e y g se seleccionan independientemente del grupo formado por los pares ácido/base Glu/Lys, Lys/Glu, Arg/Glu, Arg/ASP, Lys/ASP, Glu/Arg,Asp//Arg y ASP/Lys; y
- b, c y f son independientemente cualquier aminoácido excepto Gly o Pro y al menos se seleccionan dos aminoácidos de b, de c y de f en cada heptada del grupo constituido por Glu, Lys, ASP, Arg, His, Thr, Ser, Asn, Gln, Cys y Ala.
Se pueden diseñar las secuencias del ADN que
codifican los polipéptidos descritos arriba en base al código
genético. Donde existen los codones múltiples para los aminoácidos
particulares, se deben elegir los codones preferibles para la
traducción en las plantas. Se pueden sintetizar los oligonucleótidos
que corresponden a estas secuencias de ADN usando un sintetizador
ABI de ADN, se templan con los oligonucleótidos que corresponden
al filamento complementario y se insertan en un vector del plásmido
por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden
alargar las secuencias codificadas del polipéptido insertando los
oligonucleótidos adicionales templados en los sitios de restricción
de la endonucleasa dirigida en el gen sintético. En el Ejemplo 8 se
proporcionan algunas estrategias representativas para construir los
genes que codifican los polipéptidos ricos en lisina de la
invención, así como secuencias del ADN y del aminoácido de las
realizaciones preferidas.
Se puede construir un gen quimérico diseñado
para expresar ARN para un gen de la proteína de almacenaje sintética
que codifica un polipéptido rico en lisina ligando el gen a las
secuencias de uno de los promotores de las plantas descritas
arriba. Los promotores preferidos serán los promotores específicos
de la semilla. Se prefiere para la soja, la colza y otros
promotores fuertemente específicos de la semilla de las plantas
dicotiledóneas de un gen de la faseolina del haba, el gen de la
conglicina de la soja, del gen de la glicinina, el gen del
inhibidor de la tripsina Kunitz, o el gen del napin de la rabina. Se
prefiere para el maíz u otras plantas monocotiledoneas, un promotor
específico del endospermo, por ejemplo, el promotor zein de 10 kD o
27 kD, o un promotor embirospecífico fuerte, por ejemplo, el
promotor de la globulina 1 del maíz.
Para obtener las plantas que expresen un gen
quimérico para un gen de proteína de almacenaje sintética que
codifica un polipéptido rico en lisina, las plantas se pueden
transformar por los métodos descritos arriba. Para obtener las
plantas que expresan un gen quimérico de SSP y un gen quimérico que
codifica la DHDPS insensible a la lisina, el gen de SSP se podría
unir al gen quimérico que codifica la DHDPS insensible a la lisina
y los dos genes se podrían introducir en las plantas por vía de la
transformación. Se podría introducir alternativamente el gen
quimérico de SSP en las plantas previamente transformadas que
expresan la DHDPS insensible a la lisina, o se podría introducir el
gen de SSP en las plantas normales y se podrían cruzar los
transformados obtenidos con las plantas que expresan la DHDPS
insensible a la lisina.
Los resultados de los cruces genéticos de las
plantas transformadas que contienen genes de la biosíntesis de la
lisina con las plantas transformadas que contienen genes de
proteínas ricas en lisina (ver Ejemplo 10) demuestran que se pueden
incrementar los niveles de la lisina total en las semillas mediante
la expresión coordinada de estos genes. Este resultado fue
especialmente llamativo porque se redujo el número de copia del gen
de todos los transgenes en el híbrido. Se espera que el nivel de la
lisina aumente más si los genes de biosíntesis y los genes de las
proteínas ricas en lisina son homocigotos.
La presente invención se define en los ejemplos
siguientes, en los cuales todas las partes y los porcentajes se dan
en peso y los grados son celsius, a menos que se indique de forma
diferente.
Se ha clonado el gen dapA de E.
Coli (ecodapA), la endonucleasa de restricción está mapeada y
secuenciada previamente [Richaud y otros (1986) J. Bacteriol. 166:
297-300]. Se obtuvo para la invención actual el gen
dapA en un clon del bacteriófago lambda de una biblioteca de 3400
segmentos traslapados de clones del ADN de E. Coli
construida por Kohara, Akiyama e Isono[Kohara y otros (1987)
Cell 50:595-508]. A partir del conocimiento de la
posición en el mapa del dapA a 53 minutos en el mapa genético de
E. Coli [Bachman (1983) Microbiol. Rev. 47:
180-230], el mapa de la endonucleasa de restricción
del gen clonado [Richaud y otros (1986) J. Bacteriol.
166:297-300], y el mapa de la endonucleasa de
restricción de los fragmentos clonados del ADN en la librería de
E. Coli [Kohara y otros (1987) Cell 50:
595-508], fué posible elegir los fagos lambda 4C11 y
5A8 [Kohara y otros (1987) Cell 50: 595-508] como
candidatos probables para llevar el gen de dapA. Los fagos
crecieron en líquido de cultivo en placas individuales según lo
descrito [ver los protocolos actuales en Molecular Biology (1987)
Ausubel y otros eds., John Wiley & Sons New York] que usa LE392
como receptor [Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. El ADN
fágico se preparó por la extracción con fenol según lo descrito
[ver Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel y otros
eds., John Wiley & Sons, New York]. Ambos fagos contienen un
fragmento Pst I de ADN de aproximadamente 2,8 kb esperado para el
gen del dapA [Richaud y otros (1986) J. Bacteriol. 166:
297-300]. El fragmento se aisló de la digestión de
los fagos 5A8 y se insertó en el vector pBR322 del plásmido
pBT427.
El gen dapA de Corynebacterium
(cordapA) se aisló del ADN genómico de la tensión ATCC usando la
reacción de polimerización en cadena (PCR). Se ha publicado la
secuencia del nucleótido del gen dapA de
Corynebacterium (cordapA) [Bonnassie y otros (1990) Nucleic
Acids Res. 18: 6421]. Fue posible diseñar de la secuencia los
cebadores del oligonucleótido para la PCR que permitirían la
amplificación de un fragmento del ADN que contiene el gen y al
mismo tiempo agregar la endonucleasa de restricción en el codón de
inicio (Nco I) y justo después del codón de parada (EcoR I) del
gen. Los cebadores del oligonucleótido usados fueron:
SEQ ID NO:1:
- CCCGGGCCAT GGCTACAGGT TTAACAGCTA AGACCGGAGT AGAGCACT
SEQ ID NO:2:
- GATATCGAAT TCTCATTATA GAACTCCAGC TTTTTTC
Se realizó la PCR usando un kit de
Perkin-Elmer Cetus de acuerdo con las instrucciones
del vendedor en un termociclador fabricado por la misma compañía.
El producto de la reacción, migró en un gel de agarosa y se tiñó
con bromuro de etidio, mostrando una banda de ADN de gran tamaño
esperada para el gen dapA de Corynebacterium, sobre
900 bp. El fragmento de PCR generado se digirió con las
endonucleasas de restricción Nco I y EcoR I y se insertó en el
vector de expresión digerido pBT430 (ver el Ejemplo 2) con las
mismas enzimas. Además de introducir un sitio Nco I en el codón de
inicio de la traducción, los cebadores de PCR también sufren un
cambio en el segundo codón desde la codificación AGC para la
serina a la codificación GCT para la alanina. Se aislaron varios
clones que expresan la DHDPS insensible a la lisina (ver Ejemplo 2),
indicando que la substitución del aminoácido en el segundo codón no
afectó la actividad; Un clon se designó FS766.
Fue subclonado el fragmento de Nco I a EcoR I
que lleva el gen dapA de Corynebacterium generado por
PCR en un vector fagémido pGEM-9Zf de Promega, se
preparó y secuenció un ADN de hélice sencilla. Esta secuencia se
muestra en NO. SEQ ID NO:3.
Aparte de las diferencias en el segundo codón
mencionado anteriormente, la secuencia coincidía con la secuencia
publicada excepto en dos posiciones, los nucleótidos 798 y 799. En
la secuencia publicada éstos son TC, mientras que en el gen
mostrado en la SEQ ID NO:3 estos son CT. Este cambio da lugar a una
substitución del aminoácido leucina por la serina. No se sabe la
razón de esta diferencia. Se puede deber a un error en la secuencia
publicada, la diferencia en las tensiones usadas para aislar el
gen, o a un error generado de la PCR. El último parece inverosímil
puesto que se observó el mismo cambio en al menos 3 genes
dapA generados por PCR y aislados de forma independiente. La
diferencia no parece tener un efecto aparente en la actividad
enzimática de DHDPS (ver el Ejemplo 2).
Se insertó un sitio del Nco I (CCATGG) en el
codón de inicio de la traducción del gen dapA de E.
Coli por mutagénesis dirigida por un oligonucleótido. Se
insertó el fragmento del ADN Pst I de 2,8 kb que lleva el gen
dapA en el plásmido pBT427 (ver el Ejemplo 1) en el sitio de
Pst I del vector fagémido pTZ18R (Pharmacia) que daba el pBT431. La
orientación del gen dapA era tal que el filamento de la
codificación podría estar presente en la cadena simple de ADN
fagémido. Se realiza la mutagénesis dirigida por un oligonucleótido
usando un kit del Muta-Gen de
Bio-Rad siguiendo el protocolo del fabricante con el
cebador mutágeno mostrado abajo:
SEQ ID NO:4:
- CTTCCCGTGA CCATGGGCCA TC
Se exploraron los supuestos mutantes para la
presencia de un sitio Nco I y un plásmido, designado pBT437, que
mostró tener la secuencia apropiada alrededor de la mutación
secuenciando el ADN. La adición de un sitio del Nco I en el codón
de inicio de la traducción también proporcionaba un cambio del
segundo codón de la codificación desde la codificación TTC para la
fenilalanina a la codificación GTC para la valina.
Para alcanzar el nivel más alto de la expresión
de los genes dapA de E. Coli en el vector pBT430 de
expresión bacteriana. Este vector de expresión es un derivado del
pET-3a [Rosenberg y otros (1987) Gen 56:
125-135] el cuál emplea el sistema bacteriofago T7
ARN polimerasa/promotor T7. Se construyó el plásmido pBT430 al
destruir en primer lugar los sitios EcoR I y Hind III en
pET-3a en sus posiciones originales. Un adaptador
del oligonucleótido que contenía los sitios EcoR I y Hind III se
insertó en el sitio BamH I de pET-3a. Esto creó a
pET-3aM con sitios únicos de clonación adicionales
para la inserción de genes en el vector de la expresión. Entonces se
convirtió el sitio de Nde I en la posición de la iniciación de la
traducción a un sitio de NCO I usando mutagénesis dirigida por un
oligonucleótido. La secuencia del ADN del pET-3aM en
esta región, 5'-CATATGG, se convirtió a 5'-CCCATGG en
el pBT430.
Se cortó el gen dapA de E.coli del
plásmido pBT437 como un fragmento Nco I-Hind III de
1150 bp y se insertó en el vector de expresión pBT430 digerido con
las mismas enzimas, dando el plásmido pBT442. Se utilizaron para la
expresión del gen dapA de Corynebacterium los
fragmentos de Nco I a EcoR de 917 bp de la SEQ ID NO:3 insertado
en el pBT430 (pFS766, ver el Ejemplo 1).
Para los niveles altos de expresión de cada uno
de los plásmidos se transformó en la torsión BL21 (DE3) [Studier y
otros (1986) J. Mol. Biol. 189:113-130]. Los
cultivos crecieron en un medio que contenía media libra (100 mg/l)
de ampicilina a 25ºC. En una densidad óptica de aproximadamente 1 a
600 nm, se agregró el IPTG (el inductor,
isopropiltio-\beta-galactosidasa)
a una concentración final de 0,4 mM y se incubó durante 3 h a 25ºC.
Las células fueron recogidas mediante centrifugación y
resuspendidas de nuevo en 1/20th (o 1/100th) del volumen original
del cultivo en 50 mM de NaCl; 50 mM de Tris-Cl, pH
7.5; 1 mM de EDTA, y se congelaron a -20ºC. Se descongelaron las
alícuotas congeladas de 1 mL a 37ºC y se sonicaron, en un baño
agua-hielo, para lisar las células. Se centrifugó
el lisado a 4ºC durante 5 min a 15,000 rpm. Se retiró el
sobrenadante y se resuspendió el precipitado en un 1 mL del buffer
anteriormente mencionado.
Se analizaron las fracciones del sobrenadante y
del precipitado de los cultivos no inducidos y de los inducidos por
IPTG de BL21 (DE3) / pBT442 o de BL21 (DE3) / pFS766 mediante
electroforesis en la poliacrilamida SDS. La principal proteína
visible por la tinción con azul de Coomassie en las fracciones del
sobrenadante y del precipitado de ambos cultivos inducidos tenía
un peso molecular de 32-34 kd, el tamaño esperado
para la DHDPS. Incluso en el cultivo no inducido, esta proteína
fue la proteína que se produjo en mayor cantidad.
En el BL21 (DE3) / pBT442 del cultivo inducido
por IPTG cerca del 80% de la proteína DHDPS estaba en el
sobrenadante y la DHDPS representó el 10-20% de la
proteína total en extracto. En el BL21 (DE3) / pFS766 del cultivo
inducido por IPTG más del 50% de la proteína DHDPS estaba en la
fracción del precipitado. Las fracciones del precipitado en ambos
casos eran de una pureza del 90-95% de DHDPS, sin
otra proteína sencilla presente en cantidades significativas. Así,
estas fracciones eran lo suficientemente puras para el uso en la
generación de anticuerpos. Se solubilizó la fracción del
precipitado que contenía de 2-4 miligramos de DHDPS
de E. Coli o de DHDPS de Corynebacterium en 50 mM de
NaCl; 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM de EDTA, 0,2 mM
de ditiotreitol, 0,2% de SDS y se envió a Hazelton Research
Facility (310 Swampridge Road, Denver, PA 17517) para tener
anticuerpos de conejo incrementados contra las proteínas.
Se probó la actividad enzimática de la DHDPS
como sigue:
\newpage
Mezcla del análisis (para tubos del análisis de
10 x 1,0 ml o de 40 x 0,.25 ml para disco del microtitulación);
fresco,hecho justo antes de usarse:
| 2,5 mL | H_{2}O |
| 0,5 mL | 1,0 MTris-HC1 pH 8.0 |
| 0,5 mL | 0,1 M Na Piruvato |
| 0,5 mL | o-Aminobenzaldehido (10 mg/mL en etanol) |
| 25 \muL | 1-0 M DL-Aspártico-\beta-semialdehido (ASA) en 1,0 N HCl |
| Análisis (1,0 mL): | Microanálisis (0,25 mL): | |
| Mezcla de análisis de DHDPS | 0,40 mL | 0,10 mL |
| Extracto de enzima + H_{2}O | 0,10 mL | ,025 mL |
| 10 mM L-lisina | 5 \muL o 20 \muL | 1 \muL o 5 \muL |
Se incuba el tiempo deseado a 30ºC. Se detiene
mediante la adición de:
| 1,0 N HCl | 0,50 mL | 0,125 mL |
Se deja desarrollar el color durante
30-60 min. El precipitado se queda abajo en el
eppendorf centrifugado. Se leyó el OD_{540} vs 0 min como blanco.
Se introducen para el microensayo alícuotas de 0,2 ml en el
microtitulación y se leen a OD_{540}.
La actividad específica de la DHDPS de E.
Coli en la fracción sobrenadante de los extractos inducidos fue
de cerca de 50 unidades OD_{540} por minuto por miligramo de
proteína en un ensayo de 1,0 ml. La DHDPS de E. Coli fue
sensible a la presencia de L-lisina en el ensayo. Se
encontró el cincuenta por ciento de inhibición en una concentración
de cerca de 0,5 mM. Se midió para la DHDPS de Corynebacterium
la actividad en la fracción sobrenadante de los extractos no
inducidos, más que los extractos inducidos. La actividad enzimática
fué de cerca de 4 unidades OD_{530} por minuto por miligramo de
la proteína en un ensayo de 0,25 mL. En contraste con la DHDPS de
E. Coli, la DHDPS de Corynebacterium no se inhibió
completamente por L-lisina, incluso a una
concentración de 70 mM.
Se ha clonado el gen lysC de E. Coli se
ha mapeado y secuenciado la endonucleasa de restricción previamente
[Cassan y otros (1986) J. Biol. Chem. 261:
1052-1057]. Para la presente invención el gen lysC
se obtuvo de un clon del bacteriófago lambda de una biblioteca de
3400 segmentos translapados del clon del ADN de E. Coli
construida por Kohara, Akiyama e Isono [Kohara y otros (1987) Cell
50: 595-508]. Esta biblioteca proporciona un mapa
físico del cromosoma entero de E. Coli y une el mapa físico
al mapa genético. A partir de conocer la posición de lysC en el
mapa genético de E. Coli a 90 min. [Theze y otros (1974) J.
Bacteriol. 117:133-143]], el mapa de la
endonucleasa de restricción del gen clonado [Cassan y otros (1986)
J. Biol. Chem. 261: 1052-1057], y el mapa de la
endonucleasa de restricción de los fragmentos reproducidos de ADN
en la librería de E. Coli [Kohara y otros (1987) Cell 50:
595-508], fue posible elegir los fagos lambda 4E5 y
7A4 [Kohara y otros (1987) Cell 50:595-508] como
candidatos probables a llevar el gen lysC. Los fagos crecieron en
líquido de cultivo en placas individuales según lo descrito [ver
Current Protocols in Molecular Biology (1987) Ausubel y otros eds.
John Wiley & Sons New York] que usa LE392 como receptor [ver see
Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press]]. Se preparó el ADN fago por la
extracción con fenol según lo descrito [ver Current Protocols in
Molecular Biology (1987) Ausubel y otros eds. John Wiley & Sons,
New York].
Se predijeron a partir de la secuencia del gen
varios fragmentos de diagnóstico de la endonucleasa de restricción
para el gen lysC, incluyendo un fragmento EcoR I-Nhe
I de 1860 bp, un fragmento EcoR I-Xmn I de 2140 bp y
un fragmento EcoR I-BamH I de 1600 bp. Se
detectaron cada uno de estos fragmentos en ambos ADNs fagos
confirmando que éstos llevaban el gen lysC. Se aisló y subclonó el
fragmento EcoR I-Nhe I en el plásmido pBR322
digerido con las mismas enzimas, resultando un transformado de
E. Coli resistente a la ampicilina, sensible a la
tetraciclina. El plásmido se designó pBT436.
Para establecer que el gen clonado de la lysC
era funcional, se transformó el plásmido pBT436 en la tensión
Gifl06Ml de E. Coli (tensión central común genética
CGSC-5074 del E. coli) que tiene mutaciones
en cada uno de los tres genes AK de E. Coli [Theze y otros
(1974) J. Bacteriol. 117:133-143]. Esta tensión
carece de toda la actividad de AK y por lo tanto requiere el
diaminopimelato (un precursor para lisina que es también esencial
para la biosíntesis de la pared celular), la treonina y la
metionina. En la tensión transformada se relevaron todos estos
requisitos nutricionales que demostraban que el gen de la lysC
clonado codificó la AKIII funcional.
\newpage
La adición de la lisina (o del diaminopimelato
que se convierte fácilmente en lisina en vivo) en una concentración
de aproximadamente 0,2 mM al medio del crecimiento, inhibe el
crecimiento del Gif106M1 transformado con pBT436. Se utilizaron
medios M9 [ver Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]
suplementados con la arginina y la isoleucina, requeridos para el
crecimiento de Gifl06Ml, y la ampicilina, para mantener la
selección para el plásmido pBT436. Se invierte esta inhibición por
la adición de la treonina más la metionina a los medios del
crecimiento. Estos resultados indican que se podría inhibir la
AKIII por la adición exógena de la lisina que conduciría a la
inanición para otros aminoácidos derivados del aspartato. Se
utilizó esta Gifl06Ml característica transformada con pBT436 para
seleccionar las mutaciones en la lysC que codifica la AKIII
insensible a lisina.
Se escogieron colonias individuales de Gifl06Ml
transformado con pBT436 y se suspendieron en 200 \muL de una
mezcla de 100 \muL de lisina del 1% más 100 \muL del medio M9.
La suspensión de células enteras contenía
10^{7}-10^{8} células que fueron separadas en
una placa petri que contenía el medio M9 suplementado con la
arginina, la isoleucina y la ampicilina. Así se prepararon dieciséis
placas petri. Aparecieron de 1 a 20 colonias en 11 de las 16 placas
petri. Se escogieron una o dos (según la disponibilidad) colonias y
se reexaminaron para la resistencia a la lisina y se obtuvieron
nueve clones resistentes a la lisina. Se preparó el ADN del
plásmido a partir de ocho de éstos y se retransformaron en Gifl06Ml
para determinar si el determinante de la resistencia a la lisina
era el plásmido terminal. Seis de los ocho ADNs plásmidos dieron
colonias resistentes a la lisina. Tres de estos seis genes lysC
codifican la AKIII que no era inhibida por la lisina 15 mM,
mientras que se inhibe el tipo salvaje de la AKIII al 50% por
0,3-0,4 mM de lisina y el > 90% se inhibe por 1
mM de lisina (véase el Ejemplo 2 para los detalles).
Para determinar la base molecular de la
resistencia a la lisina se determinaron las secuencias de genes de
tipo salvaje de la lysC y de tres genes mutantes. Se utilizó un
método para "usar el ADN del plásmido mini-prep
para secuenciar las plantillas de doble cadena con el
sequenase^{TM}" [Kraft y otros (1988) BioTechniques 6:
544-545]. Se sintetizaron los cebadores del
oligonucleótido, basados en la secuencia publicada de la lysC y
espaciados aproximadamente cada 200 bp, para facilitar la
secuenciación. La secuencia del gen de tipo salvaje de la lysC
clonada en pBT436 (SEQ ID NO:5) difiere de la secuencia publicada de
la lysC en la región de codificación en 5 posiciones. Cuatro de
estas diferencias del nucleótido estaban en la tercera posición en
un codón y no darían lugar a un cambio en la secuencia del
aminoácido de la proteína AKIII. Una de las diferencias daría lugar
a una substitución de la cisteina por la glicina en el aminoácido 58
de AKIII. Estas diferencias son probablemente debidas a las
diversas tensiones de los genes de la lysC clonados.
Las secuencias de los tres genes mutantes de la
lysC que codificaron la AK insensible a lisina difieren de la
secuencia de tipo salvaje por un solo nucleótido, dando una única
substitución del aminoácido en la proteína. El mutante M2 tenía una
A substituida por una G en el nucleótido 954 de la SEQ ID NO:5
resultando en una substitución de una isoleucina por una metionina
en el aminoácido 318 y los mutantes M3 y M4 tenían idénticas
substituciones de T por C en el nucleótido 1055 de la SEQ ID NO:5
dando por resultado un substitución de una isoleucina por una
treonina en el aminoácido 352. Así, es suficiente cualquiera de
estas substituciones individuales de aminoácido para hacer la
enzima de AKIII insensible a la inhibición de lisina.
Se insertó un sitio Nco I (CCATGG) en el codón
de inicio de la traducción del gen de la lysC usando los siguiente
oligonucleótidos:
SEQ ID NO:6:
- GATCCATGGC TGAAATTGTT GTCTCCAAAT TTGGCG
SEQ ID NO:7:
- GTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG
Cuando se templan estos oligonucleótidos tienen
los extremos "pegajosos" BamH I y ASP 718. Se digirió el
plásmido pBT436 con BamH I, que corta hacia arriba de la secuencia
de codificación de lysC y el ASP 718 que corta 31
nucleótidos de secuencia inferior del codón de iniciación. Se
ligaron los oligonucleótidos templados al vector del plásmido y se
obtuvieron los transformados de E. coli. Se preparó el ADN
del plásmido y se analizó para la inserción de los oligonucleótidos
basados en la presencia de un sitio del Nco I. Se secuenció un
plásmido que contenía el sitio para asegurar que la inserción era
correcta, y se denominó pBT457. Además de crear un sitio del NCO I
en el codón de iniciación de lysC, esta inserción del
oligonucleótido cambió el segundo codón desde TCT, codificando para
la serina, a GCT, codificando para la alanina. Esta substitución del
aminoácido no tiene ningún efecto aparente en la actividad
enzimática de la AKIII.
Se cortó el gen de la lysC del plásmido
pBT457 como un fragmento Nco I-EcoR I de 1560 bp y
se insertó en el vector de expresión pBT430 digerido con las mismas
enzimas, resultando el plásmido pBT461. Para la expresión del gen
mutante de lysC-M4 pBT461 se digirió con Kpn
I-EcoR I, que quita el gen de tipo salvaje de la
lysC desde 30 nucleótidos de secuencia inferior del comienzo del
codón de inicio de la traducción, e inserción de los fragmentos
análogos de Kpn I-EcoR I de los genes mutantes
resultando en el plásmido pBT492.
Un casete de expresión específico de la semilla
(Figura 4) se compone del promotor y del exterminador de la
transcripción del gen codificante de la subunidad \beta de la
proteína de almacenaje de la semilla faseolina de la Phaseolus
vulgaris de la judia [Doyle y otros (1986) J. Biol. Chem. 261:
9228-9238]. El casete de la faseolina incluye cerca
de 500 nucleótidos de secuencia superior (5') del codón de
iniciación de la traducción y cerca de 1650 nucleótidos de
secuencia inferior (3') del codón de parada de la traducción de la
faseolina. Entre las regiones 5' y 3' están los únicos sitios de
la endonucleasa de restricción Nco I (que incluye el codón de
inicio de la traducción ATG), Sma I, Kpn I y Xba I. El casete entero
es flanqueado por los sitios Hind III.
Se conocen las enzimas biosintéticas del
aminoácido de la planta para localizarlas en los cloroplastos y por
lo tanto se sintetizan con la señal objetivo del cloroplasto. Las
proteínas bacterianas tales como la DHDPS y la AKIII no tienen tal
señal. Se fundió una secuencia de tránsito del cloroplasto (cts) con
la secuencia de codificación de la dapA y lysC-M4
en los genes quiméricos. Los cts usados se basan en los cts de la
subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato
carboxilasa de la soja [Berry-Lowe y otros (1982) J.
Mol. Appl. Gent. 1: 483-498]. Se sintetizaron las
secuencias SEQ ID NOS: 8-11 y se usaron como se
describe debajo.
Se crean tres genes quiméricos:
- No. 1) La region 5'de la faseolina/cts/lysC-M4/ región 3' de la faseolina
- No. 2) La region 5'de la faseolina/cts/ecodapA/ región 3' de la faseolina
- No. 3) La region 5'de la faseolina/cts/cordapA/ región 3' de la faseolina
Se templaron las secuencias de oligonucleótidos
SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9, que codifican la parte carboxi terminal
de la señal objetivo del cloroplasto, produciendo extremos
compatibles Nco I, se purificaron por electroforesis en un gel de
poliacrilamida, y se insertaron en el Nco I digerido con pBT461. Se
verificó la inserción de la secuencia correcta en la orientación
correcta por secuenciación del ADN produciendo pBT496. Se templaron
las secuencias de oligonucleótidos SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11, que
codifican la parte amino terminal de la señal objetivo del
cloroplasto, produciendo extremos compatibles Nco I, se purificaron
por electroforesis en un gel de poliacrilamida, y se insertaron en
el Nco I digerido con pBT496. Se verificó la inserción de la
secuencia correcta en la orientación correcta por secuenciación del
ADN produciendo pBT521. Así se unieron los cts al gen lysC.
Para unir los cts al gen lysC-M4, se
digirió el pBT521 con Sal I, y se aisló un fragmento de ADN de
aproximadamente 900 bp que incluye los cts y la región de
codificación amino terminal de la lysC. Se insertó este
fragmento en la Sal I que digiere el pBT492, substituyendo con
eficacia la región de codificación amino terminal de
lysC-M4 con los cts unidos y la región de
codificación amino terminal de la lysC. Puesto que la
mutación que dio lugar a insensibilidad a la lisina no estaba en el
fragmento substituido, el nuevo plásmido, pBT523, unió los cts a
lysC-M4.
Se aisló el fragmento Nco I-Hpa
I de 1600 bp que contenía los cts unidos a la
lysC-M4 más la secuencia no codificante 3'
de 90 bp y se insertó en el casete de expresión específico de la
semilla digerido con Nco I y Sma I (gen quimérico No. 1), dando el
plásmido pBT544.
Antes de la inserción en el casete de expresión,
se modificó el gen ecodapA para insertar un sitio de la
endonucleasa de restricción, Kpn I, justo después del codón de
parada de la traducción. Se sintetizó la secuencia de los
oligonucleótidos SEQ ID NOS: 12-13 para este
propósito:
SEQ ID NO:12:
- CCGGTTTGCT GTAATAGGTA CCA
SEQ ID NO:13:
- AGCTTGGTAC CTATTACAGC AAACCGGCAT G
Se templaron las secuencias de oligonucleótidos
SEQ ID NOS: 12 y SEQ ID NOS: 13, dando como resultado un extremo
compatible de Sph I en un extremo y un extremo compatible Hind III
en el otro y se inserta en el Sph I mas el Hind III digerido con el
pBT437. La inserción de la secuencia correcta fue verificada por la
secuenciación del ADN dando pBT443.
Se aisló un fragmento Nco I-Kpn
I de 800 bp del pBT443 que contenía la región de codificación del
ecodapA entero en un gel de agarosa seguido de
electroforesis e insertado en el casete de expresión específico de
la semilla digerido con Nco I y Kpn I, dando el plásmido pBT494. Se
utilizaron las secuencias de oligonucleótidos SEQ ID
NO:8-11 como se describe anteriormente para añadir
cts a la región de la codificación del ecodapA en el casete
de expresión específico de la semilla, dando el gen quimérico No. 2
en el pBT520.
Se aisló un fragmento Nco I-Kpn
I de 870 bp del pFS766 que contenía la región de codificación del
cordapA entero en un gel de agarosa seguido de
electroforesis e insertado en el casete de expresión de la hoja
digerido con Nco I y Kpn I, dando el plásmido pFS789. Para unir los
cts al gen del cordapA se preparó un fragmento del ADN que
contenía los cts enteros PCR. El ADN templado era del pBT544 y los
cebadores del oligonucleótido usados eran:
SEQ ID NO:14:
- GCTTCCTCAA TGATCTCCTC CCCAGCT
SEQ ID NO:15:
- CATTGTACTC TTCCACCGTT GCTAGCAA
Se realizó la PCR usando un kit de
Perkin-Elmer Cetus según las instrucciones del
vendedor en un termocicldor er fabricado por la misma compañía. Se
trataron los fragmentos de 160 bp generados por PCR con la ADN
polimerasa T4 en presencia de 4 deoxiribonucleótidos trifosfato para
obtener un fragmento terminal abrupto. Se insertó el fragmento de
los cts en el Nco I que contenía el codón de inicio del gen
CordapA que había sido digerido y tratado con el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa para completar las proyecciones de 5'.
Se determinaron el fragmento insertado y los cruces vector/insertado
mediante secuenciación del ADN.
Se aisló un fragmento Nco I-Kpn
I de 1030 bp que contenía los cts unidos a la región de
codificación del cordapA, de un gel de agarosa seguido de
electroforesis e insertado en el casete de expresión de la semilla
faseolina digerido Nco I y Kpn I, dando el plásmido pFS889 que
contenía el gen quimérico No. 3.
Se aislaron los casetes del gen quimérico,
región 5' de la faseolina/ cts/ cordapA/ región 3' de la
faseolina, región 5' de la faseolina / cts/ lysC-M4/
faseolina 3', y región 5' de la faseolina/ cts/ cordapA/
región 3' de la faseolina más la región 5' de la faseolina / cts/
lysC-M4/ faseolina 3' (Ejemplo 4) en el vector binario
pZS199 (Figura 5A). En pZS199 el promotor 35S del virus mosaico de
la coliflor conduce la expresión del NPT II.
Se modificó el casete del gen quimérico de
región 5' de la faseolina/ cts/ cordapA/ región 3' de la
faseolina usando los adaptadores del oligonucleótido para convertir
los sitios Hind III en cada extremo a los sitios BamH I. Se aisló
entonces el casete del gen como un fragmento BamH I de 2,7 kb y se
insertó en BamH I digerido por pZS199, dando el plásmido pFS926
(Figura 5B). Este vector binario tiene el gen quimérico, región 5'
de la faseolina/ cts/ cordapA/ región 3' de la faseolina
insertado en la misma orientación que el gen marcador 35S/NPT
II/nos 3'.
Para insertar la región 5' de la faseolina /
cts/ lysC-M4/ región 3' de la faseolina, se aisló el casete
del gen como un fragmento EcoR I a Spe I de 3,3 kb y se insertó en
EcoR I más Xba I digerido por pZS199, dando el plásmido pBT593.
Este vector binario tiene el gen quimérico, región 5' de la
faseolina / cts/ lysC-M4/ región 3' de la faseolina
insertado en la misma orientación que el gen marcador 35S/NPT el
II/nos 3'.
Para combinar los dos casetes, se convirtió el
sitio EcoR I del pBT593 en un sitio BamH I usando adaptadores de
oligonucleótidos, se cortó el vector resultante con BamH I y se
aisló el casete del gen quimérico de la región 5' de la faseolina/
cts/ cordapA/ región 3' de la faseolina como un fragmento
BamH I de 2,7 kb y se insertó, dando pBT597. Este vector binario
tiene ambos genes quiméricos, región 5' de la faseolina/ cts/
cordapA/ región 3' de la faseolina y región 5' de la
faseolina / cts/ lysC-M4/ región 3' de la faseolina que se
insertaron en la misma orientación que el gen marcador 35S/NPT
II/nos 3'.
Se transformó el cultivo "Westar" del
Brassica napus mediante la co-cultivación de
piezas del semillero con la tensión desarmada LBA4404 de los
Agrobacterium tumefaciens que llevaba el vector binario
apropiado.
Se esterilizaron las semillas del B.
napus mezclando en Chlorox 10%, 0.1% de SDS durante treinta
minutos, y después se aclararon a fondo con agua destilada estéril.
Se germinaron las semillas en medio estéril que contenía 30 mM de
CaCl_{2} y 1,5% de agar, y crecieron durante 6 d en la oscuridad a
24ºC.
Los cultivos líquidos Agrobacterium para
la transformación de la planta crecieron durante la noche a 28ºC en
el mínimo medio A que contenía 100 mg/l de kanamicina. Las células
bacterianas fueron precipitadas por centrifugación y resuspendidas
de nuevo en una concentración de 10^{8} células/mL en líquido
Murashige y el mínimo medio orgánico Skoog que contenía 100 \muM
de acetosiringona.
Se cortaron los hipocótilos del semillero del
B. napus en segmentos de 5 mm que fueron puestos
inmediatamente en la suspensión bacteriana. Después de 30 minutos,
se quitaron las piezas del hipocótilo de la suspensión bacteriana y
se pusieron en el medio callus BC-35 que contenía
100 \muM de acetosiringona. Se co-cultivaron el
tejido de planta y la Agrobacterium durante 3 días a 24ºC
con luz débil.
Se terminó la co-cultivación
transfiriendo los pedazos del hipocótilo al medio callus
BC-35 que contenía 200 mg/L de carbenicilina para
matar la Agrobacterium, y 25 mg/l de kanamicina para
seleccionar el crecimiento transformado de la célula de la planta.
Se incubaron las piezas del semillero en este medio durante tres
semanas a 24ºC bajo luz continua.
Se transfirieron, después de tres semanas, los
segmentos al medio de regeneración BS-48 que
contenía 200 mg/L de carbenicilina y 25 mg/L del kanamicina. Se
subcultivó el tejido de la planta cada dos semanas sobre el medio
selectivo fresco de regeneración, bajo las mismas condiciones de
cultivo descritas para el medio callus. El callo supuestamente
transformado creció rápidamente en el medio de regeneración; como
callo alcanzó un diámetro de cerca de 2 mm, se quitaron las piezas
del hipocótilo y se colocaron en el mismo medio que carecía de la
kanamicina.
Los brotes comenzaron a aparecer varias semanas
después de la transferencia al medio de la regeneración
BS-48. Tan pronto como los brotes formaran tallos,
se eliminaron del calli, y se transfirieron al medio de elongación
toMSV-1A, y se movieron en un fotoperiodo de 16: 8
horas a 24ºC.
Un brote había alargado varios entrenudos, se
cortaron sobre la superficie del agar y los extremos del corte
fueron sumergidos en Rootone. Se plantaron los brotes tratados
directamente en medio Metro-Mix 350 soiless de
cobertizo. Se cubrieron los potes con bolsas de plástico que se
retiraron cuando las plantas crecían claramente, después de cerca
de diez días. Los resultados de la transformación se muestran en la
tabla 1.
Se obtuvieron las plantas transformadas con cada
uno de los vectores binarios.
\vskip1.000000\baselineskip
Disuelto en agua destilada:
- 10,5 g fosfato potásico, dibásico
- 4,5 g fosfato potásico, monobásico
- 1,0 g sulfato amónico
- 0,5 g citrato de sodio, dihidrato
Disolverlo en 979 mL con agua destilada
- Autoclave
- Añadir 20 mL de sucrosa 10% filtrada y esterilizada
- Añadir 1 mL de un disolución 1 M de MgSO_{4} filtrada y esterilizada
\vskip1.000000\baselineskip
Por litro:
- Medio orgánico Minimal Murashige y Skoog
- (sales MS, 100 mg/L i-inositol, 0,4 mg/L tiamina; GIBCO & 510-3118)
- 30 g sucrosa
- 18 g manitol
- 0,5 mg/L 2,4-D
- 0,3 mg/L kinetin
- 0,6% agarosa
- pH 5,8
\newpage
- Medio orgánico Minimal Murashige y Skoog
- Vitaminas Gamborg B5 (SIGMA & 1019)
- 10 g glucosa
- 250 mg xilosa
- 600 mg MES
- 0,4% agarosa
- pH 5,7
Filtrar, esterilizar y añadir después de
autoclave:
- 2,0 mg/L zeatin
- 0,1 mg/L IAA
\vskip1.000000\baselineskip
- Medio orgánico Minimal Murashige y Skoog
- Vitaminas Gamborg B5
- 10 g sucrosa
- 0,6% agarosa
- pH 5,8
| Vector | Número de | Número de | Número de brotes | Número de |
| binario | extremos cortados | callo kan^{R} | callo | plantas |
| pZS199 | 120 | 41 | 5 | 2 |
| pFS926 | 600 | 278 | 52 | 28 |
| pBT593 | 600 | 70 | 10 | 3 |
| pBT597 | 600 | 223 | 40 | 23 |
Las plantas crecieron debajo de un fotoperiodo
de 16:8 horas, con una temperatura de 23ºC por el día y una
temperatura de 17ºC por la noche. Cuando el tallo floreciente
primario comenzó a elongar, se cubrió con una bolsa de malla de
contención del polen para evitar el autocruzamiento. Se facilitó la
auto-polinización sacudiendo las plantas varias
veces cada día. Se cosecharon las semillas maduras derivadas de la
auto-polinización cerca de tres meses después de
plantar.
Se preparó una comida parcialmente desengrasada
de la semilla como se explica a continuación: se molieron 40
miligramos de la semilla madura seca con un mortero y una maja bajo
nitrógeno líquido dando un polvo fino. Se agregó un mililitro de
hexano y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 15 Min.
Se peleteó la comida en un eppendorf de centrífuga, se quitó el
hexano y se repitió la extracción con hexano. Entonces se secó la
comida a 65ºC durante 10 minutos hasta que el hexano se evaporó
totalmente y se obtuvo un polvo seco. Se extrajeron las proteínas
totales de las semillas maduras como se explica a continuación. Se
pusieron aproximadamente 30-40 mg de semillas en un
tubo plástico de micrófuga de 1,5 mL y se molió en 0,25 mL de 50 mM
Tris-HCl pH 6,8, 2 mM EDTA, 1% SDS, 1%
\beta-mercaptoetanol. Se molió usando un molinillo
motorizado con los ejes de plástico diseñados para caber en el tubo
de micrófuga. Se centrifugaron las suspensiones resultantes durante
5 minutos a temperatura ambiente en una micrófuga para quitar
particulas. Se mezclaron tres volúmenes del extracto con 1 volumen
del buffer de la muestra del 4 x SDS-gel
(0,17MTris-HCl pH 6,8, 6,7% SDS, 16,7%
\beta-mercaptoetanol, 33% de glicerol) y se
corrieron 5 \muL de cada extracto por carril en un gel de
polyacrilamida de SDS, con la porción bacteriana producida por la
DHDPS o por la AKIII que servía de estándar de tamaño y una
proteína extraída de semillas no transformadas del tabaco que servía
como control negativo. Se transfirieron las proteínas
electroforeticamente sobre una membrana de nitrocelulosa. Se
expusieron las membranas a los anticuerpos de la DHDPS o de la
AKIII en una dilución 1:5000 del suero de conejo usando el protocolo
estándar proporcionado por BioRad de su Immun-Blot
Kit. Después de lavar para quitar el anticuerpo primario no unido,
se expusieron las membranas a un anticuerpo secundario donkey
anti-rabbit Ig conjugado con una peroxidasa
(Amersham) en una dilución 1:3000. A continuación se aclaró para
quitar el anticuerpo secundario no unido, se expusieron las
membranas al reactivo de quimioluminescencia de Amersham y a la
película de rayos-x.
Ocho de los ocho transformados FS926 y siete de
los siete transformados BT597 expresan la proteína DHDPS. El
transformado simple BT593 y cinco de los siete Transformados BT597
expresan la proteína AKIII-M4 (Tabla 2).
Se extrajeron, para medir la composición del
aminoácido libre en las semillas, los aminoácidos libres de 40
miligramos de la comida desengrasada en 0,6 mL de una mezcla
metanol/ cloroformo/agua en una relación de 12v/5v/3v (MCW) a
temperatura ambiente. Se vorteó y después se centrifugó la mezcla en
una microcentrífuga de eppendorf durante unos 3 Min. Se decantaron
aproximadamente 0,6 mL del sobrenadante y se agregaron 0,2 mL
adicionales de MCW al precipitado que después se vorteó y se
centrifugó como arriba. El segundo sobrenadante, cerca de 0.2 mL,
se agregó al primero. A esto, se le agregaron 0,2 mL de cloroformo
y 0,3 mL de agua. La mezcla se vorteó y después se centrifugó en
una microcentrífuga de eppendorfs durante unos 3 Min, la fase acuosa
superior, aproximadamente 1,0 mL, se quitó, y se secó en un
concentrador Speed Vac de Savant. Se hidrolizaron las muestras en
ácido hidroclórico 6 N, 0,4% de mercaptoetanol bajo nitrógeno
durante 24 h a 110-120ºC; se corrió 1/4 de la
muestra en un analizador de aminoácidos Beckman Modelo 6300 usando
la detección con ninhidrina en la post-columna. Se
compararon los niveles relativos del aminoácido libre en las
semillas como relaciones de la lisina o de la treonina a la
leucina, usando así la leucina como estándar interno.
Había una buena correlación entre los
transformados que expresaban los niveles más altos de la proteína
DHDPS y aquellos que tenían los niveles más altos de lisina libre.
Las líneas que más expresaban mostraron un incremento cien veces
mayor en nivel de lisina libre en las semillas. No ha habido mayor
acumulación de lisina libre debida a la expresión de
AKIII-M4 con la DHDPS de Corynebacteria
comparado con la expresión de la DHDPS de Corynebacteria por
si sola. El transformado que expresó la AKIII-M4
en ausencia de la DHDPS de Corynebacteria mostró un
incremento de cinco veces en el nivel de treonina libre en las
semillas. Se observó un alto nivel del ácido
\alpha-aminoadípico, indicativo de catabolismo de
la lisina, en muchas de las líneas transformadas. Así, la
prevención del catabolismo de la lisina por la inactivación de la
cetoglutarato reductasa de la lisina si hay aumento posterior de la
acumulación de lisina libre en las semillas. Alternativamente, la
incorporación de la lisina en un péptido o en una proteína rica en
lisina prevendría el catabolismo y conduciría a un aumento en la
acumulación de la lisina en las
semillas.
semillas.
Para medir la composición del aminoácido total
de las semillas maduras, se hidrolizaron 2 miligramos de la comida
desengrasada con ácido hidroclórico 6N, 0.4%
\beta-mercaptoetanol bajo nitrógeno durante 24 h a
110-120ºC; se corrió un 1/100 de la muestra en un
analizador de aminoácidos Beckman Modelo 6300 usando ninhidrina
para la detección en la post-columna. Se
compararon los niveles relativos de aminoácido en las semillas como
porcentajes de lisina, de treonina o del ácido
\alpha-aminoadípico para el total de los
aminoácidos. Había una buena correlación entre los transformados
que expresaban la proteína DHDPS y aquellos que tenían altos
niveles de lisina. Se observaron semillas con un incremento del
5-100% en el nivel de lisina, comparado con el
control no transformado. En las semillas con los niveles más altos,
la lisina compone del 11-13% de los aminoácidos
totales de la semilla, considerablemente más alto que cualquier
semilla conocida previamente en la colza.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se insertaron los casetes del gen quimérico
región 5' de la faseolina/cts/cordapA/faseolina 3' más región
5' de la faseolina /cts/lysC-M4/ faselonina 3', (Ejemplo 4)
en el vector pBT603 de transformación de la soja (Figura 6A). Este
vector tiene un gen marcador de la transformación de la soja que
consiste en el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor que
conduce a la expresión del gen \beta-glucuronidasa
(GUS) de E. Coli [Jefferson y otros (1986) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83: 8447-8451] con la región No. 3'
en un plásmido modificado pGEM9Z.
Para insertar la región 5' de la faseolina
/cts/lysC-M4/ faselonina 3', ese aisló el gen casete como un
fragmento Hind III de 3,3 kb y se insertó en el Hind III digerido
por pBT603, dando el plásmido pBT609. Este vector tiene el gen
quimérico, región 5' de la faseolina /cts/lysC-M4/ faselonina
3' insertado en la orientación opuesta del gen marcador
35S/GUS/Nos 3'.
Se modificó el casete del gen quimérico región
5' de la faseolina/cts/cordapA/región 3' faseolina 3' usando
adaptadores de oligonucleótidos para convertir los sitios Hind III
en sitios BamH I terminales. Se aisló el casete del gen entonces
como un fragmento BamH I de 2.7 kb y se insertó en BamH I digerido
por pBT609, dando el plásmido pBT614 (Figura 6B). Este vector tiene
ambos genes quiméricos, región 5' de la
faseolina/cts/cordapA/faseolina 3' más región 5' de la
faseolina /cts/lysC-M4/ faselonina 3' insertados en la misma
orientación, y ambos en la orientación opuesta al gen marcador del
35S/GUS/Nos 3'.
Se introdujo el Plásmido pBT614 en la soja por
vía de la transformación por la compañía Agracetus (Middleton, WI),
según el procedimiento descrito en la patente número 5,015,580 de
Estados Unidos. Se obtuvieron y analizaron las semillas de cinco
líneas transformadas.
Se esperaba que los transgenes segregaran en las
semillas de las plantas transformadas. Para identificar las
semillas que llevaron a cabo el gen del marcador de la
transformación, se cortó un pequeño trozo de la semilla con una
maquinilla de afeitar y y se puso una placa de plástico válida para
microtitulación. Se preparó una mezcla de ensayo GUS que consistía
en 100 mM de NaH_{2}P0_{4}, 10 mM deEDTA, 0.5 mM de
K_{4}Fe(CN)_{6,} 0,1% de tritón
X-100, 0,5 mg/mL de ácido
5-Bromo-4-cloro-3-indolil
\beta-D-glucurónico y se
añadieron 0,15 mL a cada pozo del microtitulación. La placa del
microtitulación se incubó a 37ºC durante 45 minutos. El desarrollo
del color azul indicó la expresión de GUS en la semilla.
Cuatro de las cinco líneas transformadas
mostraron aproximadamente la segregación de 3:1 para la expresión
de GUS (Tabla 3). Esto indica que el gen de GUS se insertó en un
solo sitio del genoma de la soja. El otro transformado muestra la
otra segregación de 9:1, sugiriendo que el gen GUS se insertó en dos
sitios.
Se preparó una comida de un fragmento de
semillas individuales moliendo en un polvo fino. Se extrajeron las
proteínas totales de la comida agregando 1 mg a 0,1 mL de 43 mM
Tris-HCl pH 6,8, 1,7% de SDS, 4,2% de
\beta-mercaptoethanol, 8% de glicerol, se vorteó
la suspensión, hirviéndola durante 2-3 minutos y
vorteando otra vez. Se centrifugaron las suspensiones resultantes
durante 5 minutos a temperatura ambiente en un microfuga para
quitar partículas y se corrieron 10 \muL de cada extracto por
carril en un gel de poliacrilamida SDS, sirviendo la porción
bacteriana producida de la DHDPS o de la AKIII como estándar de
tamaño. Se transfirieron las proteínas electroforeticamente sobre
una membrana de nitrocelulosa. Se expusieron las membranas a
anticuerpos de la DHDPS o de la AKIII, en una dilución de 1:5000 o
de 1:1000, respectivamente, del suero de conejo que usa el
protocolo estándar proporcionado por BioRad en su
Immun-Blot Kit. Seguidamente se aclaró para quitar
el anticuerpo primario no unido y a continuación se expusieron las
membranas al anticuerpo secundario, garanón
anti-conejo Ig conjugado con peroxidasas de rábano
rusticano (Amersham) en una dilución de 1:3000. Seguidamente se
aclaró para quitar el anticuerpo secundario no unido, se expusieron
las membranas al reactivo de quimioluminescencia de Amersham y se
revelaron por
rayos-X.
rayos-X.
Cuatro de los cinco transformados expresaron la
proteína DHDPS. En los cuatro transformados que expresaron la
DHDPS, había una excelente correlación entre la expresión de GUS y
de DHDPS en las semillas individuales (Tabla 3). Por lo tanto, los
genes GUS y DHDPS se integran en el mismo sitio en el genoma de la
soja. Dos de los cinco transformados expresaron la proteína de la
AKIII, y de nuevo había una excelente correlación entre la
expresión de AKIII, GUS y DHDPS en las semillas individuales (Tabla
3). Así, en estos dos transformados se integran los genes GUS,
AKIII y DHDPS en el mismo sitio en el genoma de la soja. Un
transformado expresó solamente GUS en sus semillas.
Para medir la composición de aminoácido libre de
las semillas, se extrajeron los aminoácidos libres de
8-10 miligramos de la comida en 1,0 mL de una mezcla
metanol/cloroformo/agua en una relación de 12v/5v/3v (MCW) a
temperatura ambiente. Se vorteó la mezcla y después se centrifugó en
una microcentrífuga de eppendorfs durante 3 minutos; se decantaron
aproximadamente 0,8 mL del sobrenadante. Se agregaron 0,2 mL de
cloroformo a este sobrenadante, seguidos de 0,3 mL de agua. Se
vorteó y se centrifugó la mezcla en un microcentrifuga durante 3
minutos, se quitó la fase acuosa superior, aproximadamente 1,0 mL
del eppendorf, y se secó en un concentrador Savant Speed Vac. Se
hidrolizaron las muestras en ácido hidroclórico 6 N, 0,4% de
\beta-mercaptoetanol bajo nitrógeno durante 24 h a
110-120ºC; se corrió 1/10 de la muestra en un
analizador de aminoácido Beckman Modelo 6300 usando detección con
ninhidrina en la post-columna. Se compararon los
niveles relativos del aminoácido libre en las semillas como
relaciones de la lisina a la leucina, usando así la leucina como
estándar
interno.
interno.
Se encontró una excelente correlación entre los
transformados que expresaban la proteína DHDPS de
Corinebacteria y aquellos que tenían los niveles más altos
de lisina libre. Se observaron incrementos de 20 a 120 veces en el
nivel de lisina libre en las semillas que expresaban la DHDPS de
Corinebacteria. Se observó un alto nivel de la saccharopina,
indicativo del catabolismo de lisina, en semillas que contenían
altos niveles de lisina.
Se hidrolizaron, para medir la composición de
aminoácido total en las semillas maduras, de 1-1,4
miligramos de la comida de la semilla con ácido hidroclórico 6N,
0,4% de \beta-mercaptoetanol bajo corriente de
nitrógeno durante 24 h a 110-120ºC; se corrió
un1/50 de la muestra en un analizador de aminoácido Beckman Modelo
6300 usando detección con ninhidrina en la
post-columna. Se compararon los niveles de lisina (y
otro aminoácido) en las semillas como porcentajes de los
aminoácidos totales.
Se encontró una excelente correlación entre las
semillas que expresaban la proteína DHDPS de Corinebacteria y
aquellos que tenían altos niveles de lisina libre. Se encontraron
semillas con un incremento del 5-35% en el nivel de
lisina, comparado con el control no transformado. En estas semillas
la lisina compone entre el 7,5-7,7% de los
aminoácidos totales de la semilla, considerablemente más alto que
cualquier semilla de la soja previamente
conocida.
conocida.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron dieciocho líneas adicionales
transformadas de la soja. Se analizaron las semillas simples de las
líneas para la actividad de GUS como se describe anteriormente, y
todas las líneas exhibieron semillas positivas a GUS. Se preparó la
comida de semillas simples, o en algunos casos de una mezcla de
varias semillas, y se hicieron los ensayos para la expresión de las
proteínas DHDPS y AKIII vía western blot. Diecisiete de las
dieciocho líneas expresaron la DHDPS, y quince de los dieciocho
expresaron la AKIII. De nuevo había una excelente correlación entre
las semillas que expresaban GUS, DHDPS y AKIII, indicando que los
genes están unidos en las líneas
transformadas.
transformadas.
Se determinó la composición de aminoácido de las
semillas de estas líneas. De nuevo las semillas que expresaban la
proteína DHDPS de Corinebacteria mostraron otra vez niveles
crecientes de lisina. La expresión de la DHDPS por sí sola dio
lugar a incrementos del 5% al 40% en la lisina total de la semilla.
La expresión de la DHDPS junto con la AKIII-M4
produjo incrementos de más del 400%. En la Tabla 3A se muestra un
resumen de las diferentes líneas transformadas.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se ha observado la actividad enzimática de la
Cetoglutarato Reductasa de la lisina (LKR) en el endospermo
inmaduro de las semillas del maíz en desarrollo [Arruda y otros
(1982) Plant Physiol. 69: 988-989]. La actividad de
la LKR aumenta agudamente desde el inicio del desarrollo del
endospermo, alcanza un nivel máximo cerca de los 20 días después de
la polinización, y después disminuye [Arruda y otros (1983)
Phytochemistry 22:2687-2689].
Para clonar el gen LKR del maíz, se aisló el ARN
de las semillas en desarrollo 19 d después de la polinización. Se
envió este ARN a los Laboratorios Clontech, Inc., (Palo Alto, CA)
para la síntesis a medida de una librería del ADNc en el vector
lambda Zap II. La conversión de la librería lambda Zap II en una
librería del fagémido, después se logró en una librería del
plásmido siguiendo el protocolo proporcionado por Clontech. Una vez
convertido en una librería del plásmido los clones obtenidos
resistentes a la ampicilina contienen el inserto del ADNc en el
vector pBluescript SK(-). La expresión del ADNc está bajo control
del promotor lacZ en el vector.
Se generaron dos bibliotecas del fagémido usando
las mezclas del fago lambda Zap II y el fago ayudante filamentoso
de 100 \muL a 1 \muL. Se generaron dos bibliotecas adicionales
usando mezclas de 100 \muL de lambda Zap II a 10 \muL del fago
ayudante y 20 \muL de lambda Zap II a 10 \muL de fago
ayudante. Las titulaciones de las preparaciones del fagémido eran
similares sin importar la mezcla usada y eran de cerca de 2 x
10^{3} transfectados resistentes a la ampicilina por mL con
tensión XL1-azul de E. Coli como receptor y
cerca de 1 x 10^{3} con DE126 (ver abajo) como receptor.
Para seleccionar los clones que llevaban el gen
LKR se construyó DE126, un gen receptor especialmente diseñado de
E. coli.
(1) Se produjo una reserva generalizada de
transducción del colifago Plvir mediante la infección de un cultivo
de TST1 [F^{-}, araD139,
delta(argF-lac)205, flb5301,
ptsF25, relA1, rpsL150, malE52::Tn10,
deoC1, \lambda^{-}] (Centro de almacenamiento Genético
de E. Coli #-6137) usando un método estándar (para el método
ver J. Miller, Experimentos en genética molecular).
(2) Se utilizó ese almacenamiento de fago como
donante en un cruce transduccional (para el método ver J. Miller,
experimentos en genéticas moleculares) con la tensión GIF106Ml
[F^{-}, arg-, ilvA296. lysC1001, thrA1101,
metL1000, \lambda^{-}, rpsL9, malT1,
xyl-7, mtl-2, thil (?), supE44 (?)]
(Centro de almacenamiento Genético de E. Coli #-5074) como
destinatario. Se seleccionaron los recombinantes en el medio rico
[L suplementado con DAP] que contenía el antibiótico tetraciclina.
Se inserta el transposón Tn10, que confiere resistencia de la
tetraciclina, en el gen malE de la tensión TST1. Los
transductados resistentes a la tetraciclina que derivaron de este
cruce pueden contener hasta 2 minutos del cromosoma de E.
Coli en las inmediaciones de malE. Se separan los genes
malE yl lysC durante menos de 0,5 minutos, en
conformidad con la distancia de cotransducción.
\newpage
(3) Se fenotiparon a fondo 200 transductados
resistentes a la tetraciclina; se anotaron la fermentación apropiada
y los rasgos alimenticios. La tensión GIF106Ml destinataria está
totalmente desprovista de los isozimas aspartoquinasa debido a las
mutaciones en la thrA, la metL y la lysC, y por
lo tanto que requiere la presencia de la treonina, la metionina, la
lisina y el ácido meso-diaminopimélico (DAP) para el
crecimiento. Se esperaba que los transductados que habían heredado
lysC^{+} con malE::Tn10 de TST1 crecieran en un
medio mínimo que contiene la vitamina B1, la
L-arginina, la L-isoleucina y la
L-valina además de la glucosa que sirve como fuente
de carbón y de energía. Por otra parte las tensiones que tienen la
constitución genética de lysC^{+}, de metL^{-} y
de thrA^{-} expresarán solamente la aspartoquinasa
sensible a la lisina. Por lo tanto la adición de la lisina al medio
mínimo debe prevenir el crecimiento de lysC^{+}
recombinante conduciendo a la ausencia para la treonina, la
metionina y el DAP. De los 200 transductados resistentes a la
tetraciclina examinados, 49 crecieron en el medio mínimo
desprovisto de treonina, de metionina y de DAP. Por otra parte, los
49 se inhibieron por la adición de L-lisina al
medio mínimo. Se denominó a uno de estos transductados DE125. DE125
tiene el fenotipo de resistencia a la tetraciclina, los requisitos
del crecimiento para la arginina, la isoleucina y la valina, y
sensibilidad a la lisina. El genotipo de esta tensión es F^{-}
malE52::Tn10 arg^{-} ilvA296 thrA1101
metL1000 lambda-rpsL9 malT1 xyl-7
mt-2 thil (¿) supE44 (?).
(4) Este paso implica la producción de un
derivado masculino de la tensión DE125. Se acopló la tensión DE125
con la tensión masculina AB1528 [F'16/delta
(gpt-proA) 62, lacYl o lacZ4,
glnV44, galK2 rac^{-}(?), hisG4,
rfbdl, mgl-51, kdgK51 (?), ilvC7,
argE3, thi-1] (Centro de almacenamiento Genético de
E. Coli #-1528) por el método de conjugación. F'16 contiene
el gen de agrupación ilvGMEDAYC. Se cruzaron las dos tensiones en
medio permisivo rico para el crecimiento de cada tensión. Después de
la incubación, la placa tenía una réplica de un medio sintético que
contenía tetraciclina, arginina, vitamina B1 y glucosa. DE125 no
puede crecer en este medio porque no puede sintetizar la
isoleucina. Se previene el crecimiento de AB1528 por la inclusión
del antibiótico tetraciclina y la omisión de la prolina y la
histidina del medio sintético. Una parte de células creció en este
medio selectivo.
Estas células recombinantes experimentaron el
aislamiento individual de la colonia en el mismo medio. El fenotipo
de un clon se determinó Ilv^{+}, Arg^{-}, TetR, sensible a
lisina, sensible al fago específico masculino (MS2), que consiste
en la transferencia simple de F'16 de AB1528 a DE125. Este clon se
denominó DE126 y tiene el genotipo
F'16/malE52::Tn10, arg^{-}, ilvA296, thrA1101, metL100, lysC^{+}, \Box^{-}, rpsL9,malT1, xyl-7, mtl-2, thi-1?, supE44?. Se inhibe por 20 g/ml de L-lisina en un medio sintético.
F'16/malE52::Tn10, arg^{-}, ilvA296, thrA1101, metL100, lysC^{+}, \Box^{-}, rpsL9,malT1, xyl-7, mtl-2, thi-1?, supE44?. Se inhibe por 20 g/ml de L-lisina en un medio sintético.
Se mezclaron, para seleccionar clones de una
librería de ADNc de maíz que contiene el gen LKR, 100 \muL de la
librería del fagémido con 100 \muL de un cultivo de noche de
DE126 crecida en un caldo L y se sembraron las células en medios
sintéticos que contenían la vitamina B1, la
L-arginina, la glucosa como fuente de carbón y de
energía, 100 \mug/ml de ampicilina y L-lisina en
20, 30 o 40 \mug/ml. Se prepararon cuatro placas con cada una de
las tres concentraciones de lisina. Se esperaba que la cantidad de
fagémido y de las células DE126 diera cerca de 1 x 10^{5}
transfectados resistentes a la ampicilina por placa. Crecieron de
diez a treinta colonias resistentes a la lisina por placa (cerca de
1 colonia resistente a lisina por 5000 colonias resistentes a
ampicilina).
Se aisló el ADN del plásmido de 10 clones
independientes y se retransformaron en DE126. Siete de los diez
ADNs dieron clones resistentes a la lisina demostrando que el rasgo
de resistencia a la lisina continuaba en el plásmido. Se
secuenciaron y caracterizaron bioquimicamente varios ADNs clonados.
Se encontraron los fragmentos de ADN insertados para ser derivados
del genoma de E. coli, más bien de un ADNc de maíz que
indicaba que la libreria del ADNc proporcionada por Clontech estaba
contaminada. Se preparará y explorará una nueva librería del ADNc
como se describe anteriormente.
Para facilitar la construcción y la expresión de
los genes sintéticos descritos más abajo, era necesario construir
un plásmido vector con las siguientes características:
1. Los sitios de la endonucleasa de restricción
tales que la inserción de las secuencias produciría un sitio
único.
2. Contener un gen de resistencia a la
tetraciclina para evitar pérdida del plásmido durante el crecimiento
y la expresión de proteínas tóxicas.
3. Contener aproximadamente el plásmido pBT430
de 290 bp incluyendo el segmento promotor y terminador T7 para la
expresión de secuencias insertadas en E. coli.
4. Contener los únicos sitios de reconocimiento
de la endonucleasa de restricción EcoR I y Nco I en la localización
apropiada detrás del promotor T7 para permitir la inserción de las
secuencias del oligonucleótido.
Para obtener las características 1 y 2 los
solicitantes usaron el plásmido pSK1 que era un mutante espontáneo
de pBR322 donde se habían suprimido el gen de la ampicilina y el
sitio Ear I cerca de ese gen. El plásmido pSK1 conservó el gen de
resistencia de la tetraciclina, los sitios únicos de restricción
EcoR I en la base 1 y un solo sitio Ear I en la base 2353. Para
quitar el sitio Ear I de la base 2353 de pSK1 se realizó una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando pSK1 como
plantilla. Se mezclaron aproximadamente 10 femtomoles de pSK1 con 1
\mug de cada uno de los oligonucleótidos SM70 y SM71 que habían
sido sintetizados en un sintetizador de la ADN ABI1306B usando los
procedimientos del fabricante.
| SM70 | 5'-CTGACTCGCTGCGCTCGGTC 3' | SEQ ID NO:16 | |
| SM71 | 5'-TATTTTCTCCTTACGCATCTGTGC-3' | SEQ ID NO:17 |
Los principales sitios de estos oligonucleótidos
en la plantilla pSK1 se representan en la Figura 7. Se realizó la
PCR usando un kit Cetus de Perkin-Elmer (Emeryville,
CA) según las instrucciones del vendedor en un termociclador
fabricado por la misma compañía. Los 25 ciclos eran de 1 minuto a
95ºC, 2 minutos a 42ºC y 12 minutos a 72ºC. Se diseñaron los
oligonucleótidos para preparar la réplica del plásmido pSK1 entero
excluyendo un fragmento de 30 b alrededor del sitio Ear I (ver
Figura 7). Se corrieron diez microlitros de los 100 \muL del
producto de la reacción en un gel de agarosa del 1% y se tiñeron
con bromuro de etidio para revelar una banda de cerca de 3.0 kb que
correspondía al tamaño predicho del plásmido replegado.
Se mezcló el resto de la mezcla de reacción de
la PCR (90 \muL) con 20 \muL de los trifosfatos del
deoxinucleótido 2.5 mM (dATP, dTTP, dGTP, y dCTP), se añadieron 30
unidades de la enzima Klenow y se incubó la mezcla a 37ºC durante
30 minutos seguidos por 65ºC durante 10 minutos. Se utilizó la
enzima Klenow para rellenar los extremos desiguales generados por
la PCR. se precipitó el ADN con etanol, se lavó con etanol del 70%,
se secó bajo vacío y se resuspendió en agua. Se trató el ADN
entonces con la ADN quinasa T4 en presencia de ATP 1 mM en el
buffer quinasa. Se incubó esta mezcla durante 30 minutos a 37ºC
seguido por 10 minutos a 65ºC. A 10 \muL de la preparación
quinasa, se añadieron 2 \muL del buffer de ligadura 5X y 10
unidades de la ligasa del ADN T4. Se realizó la ligadura a 15ºC
durante 16 h. Después de la ligadura, se dividió el ADN en la mitad
y una mitad digerida con la enzima Ear I. Se realizaron las
reacciones de Klenow, de la quinasa, de la ligadura y de la
restricción de la endonucleasa según lo descrito en Sambrook y
otros, [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold
Spring Harbor Laboratory Press]. Se compraron de BRL la klenow, la
quinasa, la ligasa y la mayoría de las endonucleasas de restricción.
Algunas endonucleasas de restricción se compraron de NEN Biolabs
(Beverly, MA) o Boehringer Mannheim (Inobjetivopolis, IN). Se
transformaron ambas muestras de ADN ligado por separado en JM103
competentes [supE thi del (lac-proAB) F' [traD36
porAB, lacIq lacZ del M15] menos restricción] células usando el
método del CaCl_{2} según lo descrito en Sambrook y otros,
[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press] y se sembraron sobre los medios que
contenían 12,5 ug/mL tetraciclina. Con o sin la digestión del Ear I
se recuperó el mismo número de transformados lo que sugería que el
sitio Ear I se había quitado de estas construcciones. Se exploraron
los clones mediante la preparación del ADN por el procedimiento de
miniprep de lisis alcalina según lo descrito en Sambrook y otros,
[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press] seguida por el análisis de digestión de la
endonucleasa de restricción. Se eligió un solo clon que era
resistente a la tetraciclina y no contenía ningún sitio Ear I. Este
vector se designó pSK2. Se destruyó el sitio restante de EcoR I de
pSK2 digiriendo el plásmido con EcoR I hasta la terminación,
completando los extremos con Klenow y ligando. Un clon que no
contuvo el sitio de EcoR I se designó pSK3.
Para obtener las características 3 y 4 de
arriba, la PCR amplificó al promotor de la polimerasa del ARN del
bacteriófago T7/el segmento terminador de plásmido pBT430 (ver el
Ejemplo 2). Se diseñaron los cebadores del oligonucleótido SM78
(SEQ ID NO:18) y SM79 (SEQ ID NO:19) para preparar un fragmento de
300b de pBT430 que atravesaba las secuencias del promotor
T7/terminador (ver Figura 7).
| SM78 | 5'-TTCATCGATAGGCGACCACACCCGTCC-3' | SEQ ID NO:18 | |
| SM79 | 5'-AATATCGATGCCACGATGCGTCCGGCG-3' | SEQ ID NO:19 |
Se realizó la reacción de PCR según lo descrito
previamente usando pBT430 como una plantilla y se generó un
fragmento de 300 bp. Los extremos del fragmento se llenaron usando
la enzima Klenow y quinasa como se describe anteriormente. Se
digirió el ADN del plásmido pSK3 para completar con la enzima de
PvuII y después se trató con la fosfatasa alcalina intestinal de
becerro (Boehringer Mannheim) para quitar el fosfato 5'. El
procedimiento se hizo según lo descrito en Sambrook y otros,
[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press]. Se purificó el ADN cortado y fosfatado
pSK3 por precipitación en etanol y se usó una porción en una
reacción de la ligadura con el fragmento generado en la PCR que
contenía la secuencia del promotor T7. Se transformó la mezcla de
la ligadura en JM103 [supE thi del (lac-proAB) F'
[traD36 porAB, lacIq lacZ del M15] restriction minus] y se
exploraron las colonias resistentes a la tetraciclina. Se preparó el
plásmido del ADN por vía del mini método de preparación de la lisis
alcalina y se realizó el análisis de la endonucleasa de restricción
para detectar la inserción y la orientación del producto de PCR. Se
eligieron dos clones para el análisis de la secuencia: el plásmido
pSK5 tenía el fragmento en la orientación mostrada en la Figura 7.
El análisis de la secuencia se realizó en ADN
doble-enlazado desnaturalizado alcalino usando
polimerasa ADN T7 Sequenase®; y el protocolo sugerido por el
fabricante reveló que pSK5 no tenía errores de replicación de la PCR
dentro de la secuencia del promotor T7/terminador.
Se representa en la Figura 8 la estrategia para
la construcción de las secuencias del gen sintéticas repetidas en
el sitio Ear I. El primer paso era la inserción de una secuencia del
oligonucleótido que codificaba una base genética de 14 aminoácidos.
Este inserto del oligonucleótido tenía un sitio único de restricción
Ear I para la subsecuente inserción de los oligonucleótidos que
codificaban unas o más heptanos repetidos y se agregó un único
sitio de restricción del ASP 718 para el uso en transferencia de
secuencias de gen a los vectores de la planta. Los extremos
sobresalientes del oligonucleótido permitieron la inserción en los
sitios únicos NCO I y EcoR I del vector pSK5.
Se digirió el ADN del plásmido pSK5 para
completar con las endonucleasas de restricción Nco I y EcoR I y se
purificaron por electroforesis en un gel de agarosa. Se mezcló el
ADN purificado (0,1 ug) con 1 \mug de cada oligonucleótido SM80
(SEQ ID NO:14) y SM81 (SEQ ID NO:13) y se ligó. Se transformó la
mezcla de la ligadura en la tensión JM103 de E. Coli [supE
thi del (lac-proAB) F' [traD36 porAB, lacIq lacZ del
M15] restriction minus] y se exploraron los transformados
resistentes a la tetraciclina por la preparación rápida del plásmido
de ADN seguido por el análisis de digestión de la restricción. Se
eligió un clon que tenía uno por cada uno de sitios Ear I, NCO I,
l ASP 718 y EcoR I indicando la inserción apropiada de los
oligonucleótidos. Se designó este clon pSK6 (Figura 9). La
secuenciación del ADN seguída del promotor T7 confirmó la inserción
de los oligonucleótidos de la secuencia prevista.
Se agregaron las secuencias de codificación
repetidas de la heptada a la construcción base del gen descrito
arriba generando pares del oligonucleótido que se podrían ligar
directamente en el sitio único del Ear I del gen base. Los
oligonucleótidos SM84 (SEQ ID NO:23) y SM85 (SEQ ID NO:24) codifican
para las repeticiones de la heptada SSP5. Los oligonucleótidos SM82
(SEQ ID NO:25) y SM83 (SEQ ID NO:26) codifican para las repeticiones
de la heptada SSP7.
Se ligaron y purificaron los sistemas del
oligonucleótido para obtener los fragmentos de ADN que codificaban
las repeticiones múltiples de la heptada para la inserción en el
vector de expresión. Los oligonucleótidos de cada sistema cerca de
2 \mug de quinasa, y se ligan durante 2 h a temperatura ambiente.
Se separaron los multímeros ligados de los sistemas del
oligonucleótido en el gel de poliacrilamida de 20 x 20 x 0,015
centímetros un 18% no desnaturalizada (acrilamida:
bis-acrilamida = 19:1). Se separaron las formas
multiméricas en el gel como 168 bp (8n) o más grande se purificaron
cortando un pedazo pequeño de la poliacrilamida que contenía la
banda en finas piezas, agregando 1,0 ml de acetato del amonio 0,5 M,
1 mM de EDTA (pH 7,5) y rotando el tubo a 37ºC durante la noche
noche. La poliacrilamida se quedó abajo por la centrifugación, se
agregó 1 \mug del ARNt al sobrenadante, se precipitaron los
fragmentos del ADN con 2 volúmenes de etanol a -70ºC, y se lavaron
con etanol del 70%, se secaron, y se resuspendieron en 10 \muL de
agua.
Se digirieron diez microgramos del ADN de pSK6
para completar con la enzima Ear I y se trataron con la fosfatasa
alcalina intestinal de becerro. Se aislaron el corte y la fosfatasa
del ADN del vector después de la electroforesis en un gel de
agarosa de bajo punto de fusión cortando la banda del ADN licuando
la agarosa a 55ºC, y purificando sobre columnas NACS PREPACTM (BRL)
siguiendo los procedimientos sugeridos por el fabricante.
Se mezclaron aproximadamente 0.1 \mug del Ear
purificado digerido y la ADN pSK6 fosfatasa tratada con 5 \muL
del oligonucleótido multimérico purificado en gel y se ligaron.
Se transformó la mezcla ligada en la tensión
JM103 de E. Coli [supE thi del (lac-proAB)
F' [traD36 porAB, lacIq lacZ del M15] restriction minus] y las
colonias resistentes a la tetraciclina seleccionadas. Se exploraron
los clones mediante digeridos de restricción del ADN prep. Del
plásmido rápido preparado para determinar la longitud del ADN
insertado. Se realizaron los análisis de la endonucleasa de
restricción generalmente digiriendo los plásmidos de ADNs con la
ASP 718 y la Bgl II, seguido por la separación de los fragmentos en
los geles de poliacrilamida no desnaturalizada del 18%. La
visualización de fragmentos con el bromuro de etidio demostró que
un fragmento de 150 bp se generó solamente cuando el segmento base
del gen estaba presente. Los insertos de los fragmentos del
oligonucleótido incrementaron este tamaño en múltiplos de 21 bases.
Se eligieron de esta exploración varios clones para el análisis de
la secuencia del ADN y la expresión de secuencias codificadas en
E. coli. Las primeras y últimas heptadas SSP5 que flanquean
la secuencia de cada construcción son del gen base descrito arriba.
Se señalan los insertos mediante el subrayado (tabla 4).
Puesto que la purificación en gel de las formas
oligomericas de los oligonucleotidos no produjo el enriquecimiento
previsto de los insertos más largos (es decir, > 8n), los
solicitantes utilizaron un procedimiento diferente para una serie
de construcciones de la inserción. Para esta serie de construcciones
se generan cuatro series más de oligonucleótidos que codifican para
las secuencias de los aminoácido SSP 8, 9,10 y 11
respectivamente:
\newpage
Se utilizó el siguiente procedimiento para
purificar las formas multiméricas de los sistemas de
oligonucleótidos después de quinar y de ligar los oligonucleótidos
como se describe anteriormente. Se realizó la cromatografía en un
instrumento de cromatografía líquida de
Hewlett-Packard, modelo 1090M. Se monitorizó la
absorbancia efluente a 260 nm. Se centrifugaron los
oligonucleótidos ligados a 12,000xg durante 5 minutos y se
inyectaron sobre una columna de intercambio ionico de 2,5 \mu TSK
DEAE-NPR (35 cm x 4.6 mm I.D.) acoplada con un
flitro de 5 \mu en (Supelco). Se separaron los oligonucleótidos en
base a la longitud usando un gradiente de elución y dos buffers de
fase móvil [Buffer A: 25 mM de Tris-Cl, pH 9,0, y
Buffer B: Buffer A + 1M NaCl]. Se pasan los dos buffers A y B a
través de dos filtros de 0,2 \mu antes de utilizarlos.
Se uilizó el siguiente programa de gradiente con
un flujo de 1 ml por minuto a 30ºC:
Se recogieron fracciones (500 \muL) entre los
3 minutos y los 9 minutos. Se reunieron las fracciones que
correspondían a las longitudes entre 120 bp y 2000 bp según lo
determinado por las separaciones control de las digestiones de
restricción del plásmido ADNs.
Se precipitaron los 4,5 ml de las fracciones
reunidas para cada sistema del oligonucleótido agregando 10 \mug
de ARNt y 9,0 ml de etanol, se aclararon dos veces con etanol del
70% y se resuspendieron en 50 \muL de agua. Se agregaron diez
microlitros de los oligonucleótidos purificados por HPLC nuevos a
0,1 \mug del corte Ear I, la ADN pSK6 fosfatasa descrita arriba y
ligada durante la noche a 15ºC. Se utilizaron los seis sistemas del
oligonucleótido descritos sobre los que se habían quinado y auto
ligado, pero no purificado por gel o por HPLC en reacciones
separadas de ligadura con el vector pSK6. Las mezclas de ligadura se
transformaron en la tensión DH5\alpha de E. Coli (phi 80
lacZ del M15) hsdRl7 recA1 endA1 gyr196 thil relA1] y las colonias
seleccionadas resistentes a tetraciclina. Los solicitantes eligieron
utilizar la tensión de DH5\alpha [supE44 del lacU169 (phi 80 lacZ
del M15) hsdRl7 recA1 endA1 gyr196 thil relA1] para todo el trabajo
porque esta tensión tiene un índice de transformación muy alto y
es recA-. El fenotipo recA elimina las preocupaciones
que estas estructuras del ADN repetitivas pueden ser substratos para
la recombinación homóloga que elimina las secuencias
multiméricas.
Se exploraron los clones como se describe
anteriormente. Se eligen varios clones para representar inserciones
de cada uno de los seis sistemas de oligonucleótidos. Los cebadoros
y las últimas heptadas SSP5 que flanquean la secuencia representan
la secuencia base del gen. Se subrayan las secuencias insertadas.
Los números de clones que incluyen la letra "H" señalan que
son oligonucleótidos purificados por HPLC (Tabla 5).
La pérdida de la primera repetición del gen
base en el clon 82-4 pudo haber resultado de la
recombinación homóloga entre las repeticiones del gen base 5,5
antes de que el vector pSK6 fuera transferido a la tensión
recA-. El procedimiento del HPLC no realzó la inserción de
las formas multiméricas más largas de los sistemas de los
oligonucleótidos en el gen base pero sirvió como una eficiente
purificación de los oligonucleótidos ligados.
Se diseñaron los oligonucleótidos para
codificar las mezclas de las secuencias SSP y variaron el uso del
codón todo lo posible. Esto se hizo para reducir la posibilidad de
pérdida de los insertos repetitivos por la recombinación una vez
que los genes sintéticos fueran transformados en las plantas y para
ampliar la longitud de los segmentos construidos del gen. Estos
oligonucleótidos codifican cuatro repeticiones de las unidades de
codificación de la heptada (28 residuos del aminoácido) y se pueden
insertar en el sitio único Ear I en cualquiera de los clones
construidos previamente. SM96 y SM97 codifican para
SSP(5)4, SM98 y SM99 codifican para
SSP(7)4 y SM100 más SM101 codifican para SSP
8.9.8.9.
Se digirió el ADN de los clones
82-4 y 84-H3 a la terminación con la
enzima Ear I, se trató con la fosfatasa y se purificó en gel. Cerca
de 0,2 \mug de este ADN se mezcló con 1,0 \mug de cada uno de
los sistemas del oligonucleótido SM96 y SM97, SM98 y SM99 o SM100
y SM101 que habían estado previamente quinado. Se ligaron el ADN y
los oligonucleótidos durante la noche y después las mezclas de la
ligadura se transformaron en la tensión DH5a del E. coli. Se
exploraron las colonias resistentes como se describe anteriormente
para la presencia de los insertos del oligonucleótido. Se eligen
los clones de las secuencias de análisis basados en sus patrones de
la digestión de la endonucleasa de restricción (Tabla 6).
Los segmentos de oligonucleótidos insertados
están subrayados
Se derivó el clon 2-9 de los
oligonucleótidos SM100 (SEQ ID NO:71) y SM101 (SEQ ID NO:72) ligados
en el sitio Ear I del clon 82-4 (véase arriba). El
clon 3-5 (SEQ ID NO:78) se derivó de la inserción de
las primeras 22 bases del oligonucleótido SM96 (SEQ ID NO:65) y
SM97 (SEQ ID NO:66) en el sitio Ear I del clon 82-4
(SEQ ID NO:53). Esta inserción parcial puede reflejar el templado
incorrecto de estos oligos altamente repetitivos. El clon
5-1 (SEQ ID NO:76) se derivó de los oligonucleótidos
SM98 (SEQ ID NO:68) y SM99 (SEQ ID NO:69) ligados en el sitio Ear I
del clon 84-H3 (SEQ ID NO:55) (ver la sección).
Se implementó una segunda estrategia para la
construcción de las secuencias sintéticas del gen para permitir más
flexibilidad en el ADN y en la secuencia del aminoácido. Se
representa esta estrategia en la Figura 10 y en la Figura 11. El
primer paso fué la inserción de una secuencia del oligonucleótido
que codificaba una base genética de 16 aminoácidos en el vector
original pSK5. Esta inserción del oligonucleótido contenía un único
sitio Ear I como en la construcción de la base genética anterior del
gen para el uso en la inserción de los oligonucleótidos que
codificaban una o más repeticiones de la heptada. La base genética
también incluyó un sitio del BspH I en el extremo 3'. Se diseñan
los extremos sobresalientes de este sitio cortado para permitir
fusiones de la proteína "en marco" usando extremos
sobresalientes Nco I. Por lo tanto, se pueden multiplicar los
segmentos del gen usando el esquema de la duplicación descrito en la
Figura 11. Los extremos sobresalientes del oligonucleótido permiten
la inserción en los unicos sitios NCO I y EcoR I del vector
pSK5.
Se insertó el sistema del oligonucleótido en el
vector pSK5 como se describe arriba en la estrategia I. El plásmido
resultante se denominó pSK34.
Se ligaron los sistemas del oligonucleótido que
codificaban los segmentos del aminoácido 35 en el único sitio Ear I
del gen base pSK34 usando los procedimientos descritos
anteriormente. En este caso, no se purificaron los oligonucleótidos
en el gel o HPLC sino que simplemente se recocieron y utilizaron en
las reacciones de la ligadura. Se utilizaron los siguentes sistemas
de oligonucleótidos:
Se exploraron los clones para la presencia de
los segmentos insertados por la digestión de la restricción seguida
por la separación de los fragmentos en geles de acrilamida del 6%.Se
confirmó la inserción correcta de los oligonucleótidos por análisis
de la secuencia del ADN. Los clones que contienen los segmentos 3,4
y 5 respectivamente se designaron pSKseg3, pSKseg4, y pSKseg5.
Éstos "segmentos" clones se utilizaron en
el esquema de duplicación mostrado en la Figura 11. Se digirieron
diez \mug del plásmido pSKseg3 completándose con Nhe I y BspH I y
se aisló el fragmento de 1503 bp de un gel de agarosa usando la
técnica de papel Whatmann. Se digirieron diez \mug del plásmido
pSKseg4 completándose con Nhe I y Nco I y se aisló la banda del
gel de 2109 bp. Se ligaron cantidades iguales de estos fragmentos y
se seleccionan los recombinados en la tetraciclina. Se exploraron
los clones mediante digestiones de restricicón y se confirmaron sus
secuencias. Los plásmido resultantes se denominaron pSKseg34.
Se digirieron los plásmido de ADNs pSKseg34 y
pSKseg5, se aislaron y ligaron los fragmentos de manera similar a
la de arriba para crear un plásmido que contienen secuencias de
ADN que codificaban el segmento 5 fusionado a los segmentos 3 y 4.
Esta construcción se denomina pSKseg534 y codifica la siguiente
secuencia del aminoácido:
Para expresar los productos sintéticos del gen
descritos en el Ejemplo 8 en las semillas de la planta, se
transfirieron las secuencias a los vectores CW108, CW109 o ML113
(Figura 12) del promotor de la semilla. Los vectores CW108 y ML113
contienen el promotor de la faseolina del haba (de la base +1 a
base-494), y 1191 bases de las secuencias 3' del
gen de la faseolina del haba. CW109 contiene el promotor de la
conglicina de la soja (de la base +1 a base-619) y
las mismas 1191 bases de las secuencias 3' del gen de la faseolina
del haba. Se diseñaron estos vectores para permitir la clonación
directa de las secuencias de codificación en los sitios únicos Nco
I y del ASP 718. Estos vectores también proporcionan sitios (Hind
III o Sal I) en los extremos 5' y 3' para permitir la transferencia
promotor/ región de codificación/ secuencias 3? directamente a los
apropiados vectores binarios.
Para insertar las secuencias genéticas
sintéticas de la proteína de almacenaje, se digirieron 10 \mug
del vector de ADN a la terminación con las endonucleasas de
restricción ASP 718 y NCO I. Se purificó el vector linearizado vía
electroforesis en una electroforesis en gel de agarosa 1.0% durante
la noche a 15 voltios. El fragmento se recogió cortando la banda
de la agarosa, insertando una pieza de 10 x 5 mm de papel de Whatman
3MM en la agrosa y transpasando el fragmento en el de papel
[Errington, (1990) Nucleic Acids Research, 18: 17]. El fragmento y
el buffer se prolongaron del papel por centrifugación y
precipitación del ADN en 100 \muL añadiendo 10 mg de ARNt, 10
\muL de acetato de sodio 3M y 200 \muL de etanol. Se lavó dos
veces con etanol del 70% el precipitado del ADN y se secó a vacio.
Se resuspendió el fragmento de ADN en 20 \muL de agua y una
porción diluida 10 veces para el uso en reacciones de la
ligadura.
Se digirió a terminación el plásmido de ADN (10
mg) de clones 3-5 y pSK534 con las endonucleasas de
restricción ASP 718 y NCO I. Los productos de la digestión se
separaron en un gel de poliacrilamida del 18% no desnaturalizada
según lo descrito en el Ejemplo 8. Se cortaron del gel las porciones
del gel que contenían los fragmentos deseados y se purificaron
insertando dichas porciones en un gel de agarosa del 1% y con
electroforesis durante 20 minutos a 100 voltios. Se recogieron los
fragmentos del ADN en piezas de 10 x 5 milímetros de papel de
Whatman 3MM, el buffer y se estiraron los fragmentos mediante
centrifugación y se precipitó el ADN con etanol. Se resuspendieron
los fragmentos de nuevo en 6 \muL de agua. Se añadieron un
microlitro del fragmento del vector diluido descrito arriba, 2
\muL del tampón de ligadura 5X y 1 \muL de la ligasa T4 del ADN
T4. Se ligó la mezcla durante la noche a 15ºC.
Se transformaron las mezclas de ligadura en la
tensión DH5a de E.coli [supE44 del lacU169 (phi 80 lacZ del
M15) hsdRl7recAl endAl gyr196 thil relAl] y se seleccionaron las
colonias resistentes a la ampicilina. Se exploraron los clones por
análisis de la digestión de la endonucleasa de restricción del
plásmido ADNs rápido y mediante secuenciación del ADN.
Se usó el vector binario pZS97 para transferir
el gen quimérico SSP3-5 del Ejemplo 9 y los genes
quiméricos dapA y lysC-M4 de E.
Coli del Ejemplo 4 a las plantas del tabaco. El vector binario
pZS97 (Figura 13) es parte de un sistema del vector del plásmido
binario del Ti [Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res.
12:8711-8720] del Agrobacterium tumefaciens.
El vector contiene: (1) el gen quimérico nopalina sintasa:neomicina
fossotransferasa (Nos.: : NPTII) como un marcador seleccionable para
las células de la planta transformada [Bevan y otros, (1983) Nature
304:184-186], (2) los bordes izquierdos y derechos
del T-ADN del plásmido de Ti [Bevan, (1984) Nucl.
Acids. Res. 12:8711-8720], (3) el segmento de
\alpha-complementación del lacZ de E. Coli
[Viering y otros, (1982) Gen19:259-267] con un unico
sitio Sal I (pSK97K) unico sitio Hind III (pZS97) en la región del
poliligador, (4) el origen de la replicación bacteriana del
plásmido pVSl de los Pseudomonas [Itoh y otros, (1984)
Plásmido11:206-220], y (5) el gen bacteriano
\beta-lactamasa como marcador seleccionable para
los A.tumefaciens transformados.
Se digirió el ADN del plásmido pZS97 a la
terminación con la enzima Hind III y se purificó el plásmido
digerido en gel. Se mezcló el Hind III digerido por ADN pZS97 con
el Hind III digerido y se aislaron los fragmentos de genes
quiméricos, se ligaron, se transformaron como arriba y las colonias
seleccionadas en la ampicilina.
\newpage
Se transfirieron los vectores binarios que
contenían los genes quiméricos por las uniones
tri-parentales [Ruvkin y otros, (1981) Nature
289:85-88] a la tensión LBA4404/pAL4404 del
Agrobacterium [Hockema y otros, (1983), Nature 303:
179-180] seleccionando para la resistencia de la
carbenicilina. Se utilizaron los cultivos del Agrobacterium
que contenían el vector binario para transformar los discos de la
hoja del tabaco [Horsch y otros, (1985) Science
227:1229-1231].Se regeneraron las plantas
transgénicas en el medio selectivo que contenía la kanamicina.
Se obtuvieron así las plantas transformadas del
tabaco que contenían el gen quimérico, el promotor de
\betaconglicina/
SSP3-5/región faseolina 3'. Dos líneas transformadas, la pSK44-3A y la pSK44-9A, que llevaban un solo sitio de inserción del gen SSP3-5 se identificaron basadas sobre la segregación de 3:1 del gen marcador para la resistencia de la kanamicina. Se identificó la progenie de los transformados primarios, que eran homocigotos para el transgen, el pSK44-3A-6 y el pSK44-9A-5, entonces basados sobre la segregación de 4:0 de resistencia de la kanamicina en las semillas de estas plantas.
SSP3-5/región faseolina 3'. Dos líneas transformadas, la pSK44-3A y la pSK44-9A, que llevaban un solo sitio de inserción del gen SSP3-5 se identificaron basadas sobre la segregación de 3:1 del gen marcador para la resistencia de la kanamicina. Se identificó la progenie de los transformados primarios, que eran homocigotos para el transgen, el pSK44-3A-6 y el pSK44-9A-5, entonces basados sobre la segregación de 4:0 de resistencia de la kanamicina en las semillas de estas plantas.
Se obtuvieron de forma similar las plantas
transformadas del tabaco con los genes quiméricos región 5' de la
faseolina/cts/lysC-M4/ región 3' de la faseolina y región 5'
de la faseolina /cts/ecodapA/ región 3' de la faseolina. Se
identificó una línea transformada, BT570-45A, que
llevaba una sola inserción de sitio de los genes DHDPS y AK basada
sobre la segregación 3:1 del gen del marcador para la resistencia
de la kanamicina. Identificaron a la progenie del transformado
primario que era homocigoto para el transgen,
BT570-45A-3 y
BT570-45A-4, entonces basada sobre
la segregación 4:0 de la resistencia de kanamicina en las semillas
de estas plantas.
Para generar las plantas que llevaban los tres
cruces genéticos de los genes quiméricos se realizaron usando a los
padres homocigotos. Las plantas crecieron hasta la madurez en
condiciones del invernadero. Las flores que se utilizarán como
macho y hembra se seleccionaron un día antes de la abertura y se
quitaron las flores más viejas en la inflorescencia. Para el cruce,
se eligieron las flores femeninas en el momento justo antes de la
abertura cuando las anteras no eran dehiscentes. Se abrió la corolla
en un lado y se quitaron las anteras. Se eligieron las flores
masculinas como flores que se habían abierto el mismo día y tenían
anteras deshincentes con polen maduro. Se quitaron las anteras y se
utilizaron para polinizar los pistilos de las flores femeninas con
las anteras peladas. Se cubrieron entronces los pistilos con tubería
plástica para prevenir la polinización adicional. Se desarrollaron
y secaron las vainas de la semilla durante 4-6
semanas y se cosecharon. Se recuperaron de dos a tres vainas
separadas de cada cruce. Se realizaron los siguientes cruces:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se abren las vainas de la semilla secadas, se
recogen y se juntan de cada cruce. Se quitaron treinta semillas de
cada cruce y se utilizaron para las semillas control de las flores
de cada padre. Las muestras duplicadas de la semilla se hidrolizaron
y ensayaron para el contenido total de aminoácido según lo descrito
en el Ejemplo 5. La cantidad de incremento en la lisina como
porcentaje del aminoácido total en las semillas sobre las semillas
de tipo salvaje, las cuales contienen 2,56% de lisina, se presentan
en la tabla 7 a lo largo del número de la copia de cada gen en el
endospermo de la semilla.
| * el número de la copia es medio en la población de semillas |
Los resultados de estos cruces demuestran que
los niveles totales de la lisina en las semillas se pueden aumentar
del 10-25 por ciento mediante la expresión
coordinada de los genes de la biosíntesis de la lisina y de la
proteína SSP3-5 de alto contenido en lisina. En las
semillas derivadas de las plantas híbridas, este sinergismo es el
más fuerte cuando los genes de la biosíntesis se derivan del padre
femenino, posiblemente debido a la dosificación del gen en el
endospermo. Se espera que el nivel de lisina se incremente más a
fondo si los genes de la biosíntesis y los genes de proteínas ricas
en lisina eran homocigotos.
Se han descrito en el Ejemplo 6 las plantas de
soja transformadas que expresan el gen quimérico, promotor
faseolina/cts/cordapA / región 3' de faseolina. Las plantas
de la soja transformadas que expresan el gen quimérico, promotor
faseolina/SSP3-5 / región 3' de faseolina se
obtuvieron insertando el gen quimérico como fragmento aislado Hind
III en un plásmido pML63 del vector de transformación de la soja
equivalente (Figura 14 Ejemplo 6) y realizando la transformación
según lo descrito en el Ejemplo 6.
Se muestrearon las semillas de los
transformados primarios cortando fichas pequeñas de los lados de las
semillas lejos del eje embrionario. Se probaron las fichas para la
actividad del GUS según lo descrito en el Ejemplo 6 para determinar
cuál de las semillas de segregación llevaba los transgenes. Se
molieron las medias semillas a la comida y se ensayaron para la
expresión de la proteína SSP3-5 por el análisis
ImmunoSorbent de Enzima Unida (ELISA). Se realizaron los ELISA como
sigue:
Se generó una proteína de fusión de la
glutationa-S-transferasa y el
producto del gen SSP3-5 con el uso del sistema de
la fusión del gen pGEX GST de Pharmacia^{TM} (protocolos actuales
en biología molecular, vol. 2, pp 16.7.1-8, (1989)
John Wiley e hijos). Se purificó la proteína de fusión por
cromatografía de afinidad en agarosa glutationa (sigma) sefarosa
glutationa (Pharmacia), se concentró con los filtros Centricon
10^{TM} (Amicon), y entonces sujeto a la electroforesis de
poliacrilamida SDS (15% Arcilamida, 19:1 Acrilamida: Bisacrilamide)
para la purificación adicional. Se tiñó el gel con azul de
Coomassie durante 30 minutos, se destiñó en metanol del 50%, ácido
acético del 10% y se electroeluyeron las bandas de la proteína con
un Amicon^{TM} Centiluter Microelectroeluter (Paul T. Matsudaira
ed., Una guía práctica para la purificación de proteínas y péptidos
para Microsecuencia, Academic Press, Inc. New York, 1989). Se tiñó
un segundo gel preparado y corrido de la misma forma sin ácido
acético [9 partes 0,1% azul de Coomassie G250
(Bio-Rad) en metanol del 50% y 1 parte de azul
Serva (Serva, Westbury, NY) en agua destilada] durante
1-2 H. Se destiñó el gel brevemente en metanol del
20%, 3% de glicerol durante 0,5-1 h hasta que la
banda GST-SSP3-5 era visible. Se
suprimió esta banda del gel y se envió con el material de
electroelucción a los laboratorios de Hazelton para el uso como
antígeno en la inmunización de un conejo Nueva Zelanda. Se usó un
total de 1 mg de antígeno (0,8 mg gel, 0,2 m en la solución). Los
laboratorios Hazelton proporcionaron la prueba del sangrado cada
tres semanas. Se probó el título aproximado por western blotting de
extractos de E. Coli de células que contenían el gen
SSP-3-5 bajo control del promotor
T7 en diversas diluciones de la proteína y del suero.
Se aisló la IgG del suero usando una columna de
sefarosa de la proteína A. La IgG estaba revestida sobre las placas
de microtitulación en 5 \mug por pozo. Una porción separada de la
IgG era biotinilada.
Se diluyeron los extractos acuosos de las
plantas transgénicas y se cargaron en los pozos generalmente
comenzando con una muestra que contenía 1 \mug de la proteína
total. Se diluyó la muestra varias veces más para asegurar que por
lo menos una de las diluciones diese un resultado que estaba dentro
del rango de una curva estándar genrada en la misma placa. Se
generó la curva estándar usando la proteína SSP3-5
sintetizada químicamente. Se incubaron las muestras durante una
hora a 37º y se lavaron las placas. Se añadió a los pocillos la
fosfatasa alcalina conjugada con streptavidina, se incubó a 37º
durante 1 hora y se lavó. Después se añadió la IgG biotinilada. Se
incubó la placa a 37º durante 1 hora y se lavó. Se agregó la
fosfatasa alcalina conjugada con la streptavidina a los pocillos,
incubado a 37º durante 1 hora y se lavó. Se agregó un substrato que
consistía en 1mg/ml de p-nitrofenilfosfato
dietnolamina 1M a los pocillos y se incubaron las placas a 37º
durante 1 hora. Se agregó a los pocillos una solución de la parada
de EDTA del 5% y se leyó la absorbancia a 405 nm menos la lectura
de 650 nm. Las semillas transgénicas de la soja contenían del 0,5 a
2,0% de la proteína extraíble del agua como
SSP3-5.
Se plantaron las semillas de la otra mitad
positivas para la proteína GUS y SSP3-5 y maduraron
en condiciones de invernadero. Para determinar los homocigotos para
el fenotipo de GUS, se exploraron las semillas de estas plantas Rl
para la segregación de la actividad de GUS como arriba. Se cruzaron
las plantas homocigotos para el gen
faseolina/SSP3-5 con las sojas transgénicas
homocigotos que expresaban el producto del gen dapA de
Corynebacterium.
Se construyó como alternaiva preferida a traer
el gen quimérico SSP y el gen quimérico cordapA junto a la
vía genética un solo vector de transformación de la soja que llevaba
ambos genes. Se cortó el plásmido pML63 que llevaba el gen
quimérico promotor de faseolina/SSP3-5/región 3' de
la faseolina descrita arriba con la enzima de restricción BamH I y
se insertó el fragmento BamH I que llevaba el gen quimérico promotor
de la faseolina/cts/cordapA/la región 3' de la faseolina' (Ejemplo
5). Este vector se puede transformar en la soja según lo descrito
en el Ejemplo 6.
Se hicieron los siguientes genes quiméricos para
la transformación en el maíz:
- Promotor de la globulina 1/mcts/cordapA/region NOS 3
- Promotor de la globulina 2/mcts/cordapA/region NOS 3
- Promotor de la globulina 1/SSP3-5/ region 3' de la globulina 1
- Promotor de la glutelina 2/SSP3-5/ region 3' de 10 kD.
Se clonó el promotor de la glutelina 2 del ADN
genómico del maíz usando la PCR con los cebadores basados en la
secuencia publicada [Reina y otros (1990) Nucleic Acids Res. 18:
6426-6426]. El fragmento del promotor incluye 1020
nucleótidos de secuencia inferior del codón de inicio de la
traducción de ATG. Se introdujo un sitio Nco I por vía de la PCR en
el sitio de inicio del ATG para permitir las fusiones de translación
directas. Se introdujo un sitio BamH I en el extremo 5' del
promotor. Se clonaron los fragmentos promotores de 1.02 KB de BamH
I Nco I en los sitios de BamH I a Nco I del vector de expresión
pML63 de la planta (ver el Ejemplo 11) que substituía al promotor
35S para crear el
vector pML90. Este vector contiene al promotor de la glutelina 2 unido a la región de codificación GUS y los NOS 3'.
vector pML90. Este vector contiene al promotor de la glutelina 2 unido a la región de codificación GUS y los NOS 3'.
Se derivó la región 3' del zein de 10 kD de una
copia del gen zein de 10 kD generada por la PCR del ADN genómico
usando los cebadores del oligonucleótido basados en la secuencia
publicada [Kirihara y otros (1988) Gen 71:
359-370]. La región 3' se extiende 940 nucleótidos
desde el codón de parada. Se agregaron inmediatamente después del
codón de parada TAG los sitios de la endonucleasa de restricción
para los sitios Kpn I, Sma I y Xba I mediante la inserción del
oligonucleótido para facilitar la clonación. Se aisló un segmento
Sma I a Hind III que contenía región 3' de 10 y se ligó en el Sma
I y Hind III digerido por el pML90 para substituir la secuencia 3'
NOS con la región 3' de 10 kD, creando así el plásmido pML103.
pML103 contiene el promotor de glutelina 2, un sitio Nco I en el
codón de inicio del ATG del gen GUS, los sitios Sma I y Xba I
después del codón de parada, y 940 nucleótidos de la secuencia 3'
del zein de 10 kD.
Se aislaron el promotor de la globulina 1 y las
secuencias 3' de una librería de ADN genómico de maíz Clontech
usando las pruebas del oligonucleótido basadas en la secuencia
publicada del gen de la globulina 1 [Kriz y otros (1989) Plant
Physiol. 91:636]. El segmento clonado incluye el fragmento del
promotor que extiende 1078 nucleótidos de secuencia inferior del
codón de inicio de la traducción del ATG, la secuencia de
codificación entera de la globulina incluyendo intrones y la
secuencia 3' que extiende 803 bases de la parada de translación.
Para permitir el remplazo de la secuencia de codificación de la
globulina 1 con otras secuencias de codificación se introdujo un
sitio Nco I en el codón de inicio del ATG, y los sitios Kpn I y Xba
I se introdujeron después del codón de parada translacional por vía
de la PCR para crear el vector pCC50. Hay un segundo sitio Nco I
dentro del fragmento promotor de la globulina. El gen casete de la
globulina 1 es flanqueado por los sitios Hind III.
Se nombran las enzimas biosintéticas del
aminoácido de la planta para ser localizadas en los cloroplastos y
por lo tanto se sintetizan con una señal objetivo del cloroplasto.
Las proteínas bacterianas tales como la DHDPS no tienen ninguna
señal. Se fundió por lo tanto una secuencia de tránsito del
cloroplasto (cts) a la secuencia de codificación cordapA en
los genes quiméricos descritos más abajo. Para el maíz los cts
usados se basaron en el cts de la subunidad pequeña de la ribulosa
1,5-bisfosfato carboxilasa del maíz [Lebrun y otros
(1987) Nucleic Acids Res. 15: 4360] y se designan los actos para
distinguirlo de los cts de la soja. Se sintetizaron las SEQ ID NOS:
93-98 de los oligonucleótidos y se utilizó
esencialmente según lo descrito en el Ejemplo 4.
Se templaron las secuencias SEQ ID NO:93 y SEQ
ID NO:94 de los oligonucleótidos, que codifican la parte carboxi
terminal de la señal objetivo del cloroplasto del maíz, dando por
resultado los extremos compatibles Xba I y Nco I, se purificaron
por vía de la electroforesis en un gel de poliacrilamida, y se
insertaron en Xba I más Nco I digeridos por el pBT492 (ver el
Ejemplo 3). Se verificó la inserción de la secuencia correcta por
el ADN que secuenciaba dando el pBT556. Se templaron las secuencias
SEQ ID NO:95 y SEQ ID NO:96 de los oligonucleótidos, que codifican
la parte media de la señal objetivo del cloroplasto, dando por
resultado los extremos compatibles Bgl II y Xba I, se purificaron
por vía de la electroforesis en un gel de poliacrilamida, y se
insertaron en Bgl II y Xba digerido por pBT556. Se verificó la
inserción de la secuencia correcta por el ADN que secuenciaba dando
el pBT557. Se templaron las secuencias SEQ ID NO:97 y SEQ ID NO:98
de los oligonucleótidos, que codifican la parte amino terminal de
la señal objetivo del cloroplasto, dando por resultado los extremos
compatibles NCO I y Afl II, se purificaron por vía de la
electroforesis en gel de poliacrilamida, y se insertaron en Nco I y
Afl II digerido por el pBT557. Se verificó la inserción de
la secuencia correcta por el ADN que secuenciaba dando el pBT558. Así los mcts se fundieron al gen lysC-M4.
la secuencia correcta por el ADN que secuenciaba dando el pBT558. Así los mcts se fundieron al gen lysC-M4.
Se preparó un fragmento del ADN que contenía los
mcts enteros usando la PCR. El ADN era pBT558 y las cebadores del
oligonucleótido usados eran:
SEQ ID NO:99:
- GCGCCCACCG TGATGA
SEQ ID NO:100:
- CACCGGATTC TTCCGC
Se ligó el fragmento de los mcts al amino
terminal de la proteína DHDPS codificada por el gen ecodapA
mediante la digestión con Nco I y el tratamiento con el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa para rellenar las proyecciones 5'. Se
determinaron el fragmento insertado y las ensambladuras
vector/insertado por la secuenciación del ADN, dando el pBT576.
Para construir el gen quimérico:
Promotor de la globulina
1/mcts/cordapA/región NOS 3
Se aisló un fragmento Nco I y Kpn I que contenía
la secuencia de codificación mcts/ecodapA del plásmido pBT576
(ver el Ejemplo 6) y se insertó en el Nco I más Kpn digerido por el
pCC50 creando el plásmidopBT662. Se sustituyó entonces la
secuencia de codificación ecodapA por la secuencia de
codificación cordapA como sigue. Un fragmento de Afl II a
Kpn I que contenía dos tercios distales de los mcts fundidos a la
secuencia de codificación del cordapA se insertó de Afl II a
Kpn I digerido por pBT662 que creaba el plásmido pBT677.
\vskip1.000000\baselineskip
Para construir el gen quimérico:
Promotor de la glutelina 2/mcts/cordapA/NOS
3'
Se aisló un fragmento Nco I y Kpn I que contenía
la secuencia de codificación mcts/cordapA de plásmidopBT677
y se insertó de Nco I a Kpn I digerido por pML90, creando el
plásmido BT679.
\vskip1.000000\baselineskip
Para construir el gen quimérico:
Promotor de la glutelina
2/SSP3-5/región 3' de 10kD
Se cortó el plásmido pML103 (arriba) que
contenía el promotor de la glutelina 2 y la región 3' del zein de
10kD en los sitios Nco I y Sma I. Se aisló la región de
codificación SSP3-5 (Ejemplo 9) como un Nco I para
el fragmento terminal de extremo romo con Xba seguido por rellenado
en el extremo pegajoso usando el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa, entonces el extremo romo con Nco I. Los 193 pares de
bases NCO I para el extremo romo del fragmento terminal se ligaron
con el Nco I y el Sma I cortando el pML103 para crear el
pLH104.
\vskip1.000000\baselineskip
Para construir el gen quimérico:
Promotor de la globulin
1/SSP3-5/ región 3' de la globulina 1
Se insertaron los 193 pares pares de bases Nco y
el fragmento de Xba I que contenía la región de codificación del
SSP3-5 (Ejemplo 9) en el plásmido pCC50 (arriba) que
había sido liberado con Xba I a la terminación y después cortado
parcialmente con Nco I para abrir el plásmido en el codón de inicio
ATG que creaba pLH105.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó el maíz con los genes
quiméricos:
promotor de la globulina
1/mcts/cordapA/región NOS 3
promotor de la glutelina 2/mcts/cordapA/ región
NOS 3'
Se utilizó uno de dos vectores del plásmido que
contenía los marcadores seleccionables en las transformaciones. Un
plásmido, el pDETRIC, contenía el gen bar Streptomyces
higroscopicos que confiere resistencia al herbicida
glucofosinato [Thompson y otros (1987 The EMBO Journal 6:
2519-2523]. El gen bacteriano tenía su codón de
traducción cambiante de GTG a ATG para la iniciación apropiada de la
traducción en las plantas [De Block y otros (1987) The EMBO Journal
6:2513-2518]. Se condujo el gen bar por el promotor
35S del virus mosaico de la coliflor y utiliza la señal de
terminación y de poliadenilación del gen octopina sintasa del
Agrobacterium tumefaciens. Alternativamente, se usó el
marcador seleccionable 35S/Ac, un gen
fosfinotricina-N-acetiltransferasa
sintética (pat) gen bajo el control del promotor y la señal
terminador 3'/poliadelilación del virus Mosaico de la coliflor
[Eckes et.al., (1989) J Cell Biochem Suppl 13 D].
Se iniciaron los cultivos del callus
embriogénico en los embriones no maduros (cerca de 1.0 a 1.5 mm)
disecados de núcleos de una línea del maíz criada para dar una
respuesta del tejido del cultivo "tipo II callus".Se disecaron
los embriones de 10 a 12 días después de la polinización y se
colocaron con el lado del eje abajo y en contacto con el medio de
azarosa solidificada N6 [Chu y otros (1974) Sci Sin
18:659-668] suplementado con 0.5 mg/L de
2,4-D (N6-0.5). Los embriones se
mantuvieron la oscuridad a 27ºC. El callus embriogénico que
consiste en masas no diferenciadas de células con los proembriones
somáticos y estructuras referidas a los embriones somáticos en
estructuras proliferadas del scutellum de los embriones no
maduros. Se identificó y sub-cultivó El callo
embriogénico clónico aislado de embriones individuales en el medio
N6-0.5 cada 2 a 3 semanas.
Se utilizó el método del bombardeo de la
partícula para transferir genes a las células callus del cultivo.
Se utilizó un biolistico, PDS-1000/He (BioRAD
Laboratories, Hercules, CA) en estos experimentos.
Se precipitó el plásmido circular o el ADN que
había sido linearizado por la digestión con las endonucleasas de
restricción sobre la superficie de las partículas de oro. Se
coprecipitó el ADN de dos o tres diversos plámidos, uno contenía el
marcador seleccionable para la transformación del maíz, y uno o dos
que contenían los genes quiméricos para el incremento creciente de
lisina en las semillas. Para lograr esto se añadió 1,5 \mug de
cada ADN (en agua en una concentración de cerca de 1 mg/ml) a 25 ml
de las partículas de oro (diámetro medio de 1,5 \mum) suspendidas
en agua ( 60 mg de oro por mL). Se agregó entonces el cloruro de
calcio (25 mL de una solución 2,5 M) y espermidina (10 ml de una
solución 1,0 M) a la suspensión oro-ADN mientras
que se vorteaba el tubo. Se centrigugaron las partículas del oro en
una micróguga durante 10 seg y se quitó el sobrenadante. Se
suspendieron las particulas de oro de nuevo en 200 ml de etanol
absoluto, se centrifugaron otra vez y se quitó el sobrenadante.
Finalmente, se resuspendieron las partículas del oro de nuevo en 25
ml de etanol absoluto y se sonicaron dos veces durante un segundo.
Se cargaron cinco \muL de las partículas de ADN revestidas de oro
en cada disco macro portador y el etanol se evaporó dejando las
partículas de ADN cubiertas de oro secas sobre el disco.
Se arregló el callus embriogénico (de la línea
del callus designada #LH132.5.X) en
un área circular de cerca de 6 centímetros de diámetro en el centro
de una placa petri de 100 x 20 mm que contenía el medio
N6-0.5 suplementado con el sorbitol 0,25M y el
manitol 0,25M. Se colocó el tejido fino en este medio durante 2 h
antes del bombardeo como tratamiento previo y permaneció en el
medio durante el procedimiento del bombardeo. Al final del período
de pretratamiento de 2 h, se colocó la placa petri que contenía el
tejido fino en una cámara de PDS-1000/He. Se evacuó
el aire en la cámara a vacío de 28 pulgadas de Hg. Se aceleró el
macroportador con una onda expansiva del helio usando una membrana
de ruptura que estalla cuando la presión del He sobre los alcances
del tubo del choque es de 1100 psi. Se colocó el tejido
aproximadamente a 8 cm de la pantalla de parada. Se bombadearon
cuatro placas de tejido con partículas de ADN revestidas con oro.
Inmediatamente después del bombardeo, se transfirió el tejido callus
al medio N6-0.5 sin suplemento de sorbitol o
manitol.
Dentro de 24 h después del bombardeo se
transfiere el tejido al medio selectivo, el medio
N6-0.5 que contiene 2 mg/L del glufosinato y carece
de la caseína o la prolina. Se transfirió el tejido que continuó
creciendo lentamente en este medio al medio fresco
N6-0,5 suplementado con glufosinato cada 2 semanas.
Después de 6-12 semanas se identificaron los clones
del callus en crecimiento. Entonces se transfirió el callus al medio
que promueve la regeneración de la planta.
Se analizaron las plantas regeneradas del callus
para la presencia de los transgenes intactos vía Southern blot o
PCR. Las plantas eran cruzadas o autocruzadas a una línea élite para
generar las semillas Rl o F1, respectivamente.Se reunieron y se
ensayaron las semillas Rl solas o de seis a ocho semillas F1 para la
expresión de la proteína DHDPS de Corynebacterium por
análisis de western blot. Se determinaron la composición de
aminoácido libre y la composición del aminoácido total de las
semillas según lo descrito en ejemplos anteriores
La expresión de la proteína DHDPS de
Corynebacterium, conducida por el promotor de la globulina o
de la glutelina, se observó en las semillas del maíz (Tabla 8). Los
niveles libres de la lisina en las semillas aumentaron desde cerca
de 1.4% de los aminoácidos libres en las semillas del control a
15-27% en las semillas que expresaban la DHDPS de
Corynebacterium del promotor de la globulina 1. La expresión
más alta de la DHDPS y el nivel más alto de la lisina en la semilla
resulta probablemente del hecho de que se espera que la mitad de
las semillas reunidas en las líneas cruzadas carezcan del transgen
debido a la segregación. Un pequeño incremento en la lisina
libre se observó dentro en las semillas que expresaban la DHDPS de
Corynebacterium del promotor de la glutelina 2. Así para
incrementar la lisina, puede ser mejor expresar esta enzima en el
embrión en lugar de en el endospermo. Se observó un de alto nivel
de sacaropina, indicativo de catabolismo del lisina, en las
semillas con altos niveles contenidos de lisina.
La lisina representa normalmente cerca de 2,3%
del contenido del aminoácido de la semilla. Es por lo tanto evidente
en la tabla 8 que los aumentos substanciales (35%-130%) en la
lisina como un porcentaje de los aminoácidos totales de la semilla
se encontraron en las semillas que expresaban la DHDPS de
Corynebacterium del promotor de la
globulina 1.
globulina 1.
Se crearon un casete de expresión específico de
la semilla integrado por el promotor y el adaptador de la
transcripción del gen inhibidor 3 de tripsina Kunitz de la soja
(KTI3) [Jofuku y otros (1989) Plant Cell 1:
427-435]. El casete KTI3 incluye cerca de 2000
nucleotidos de corriente superior (5') del codón de la iniciación
de la traducción y cerca de 200 nucleótidos de secuencia superior
(5') del codón de inicio de la traducción y cerca de 200
nucleótidos de secuencia inferior (3') del codón de parada de la
traducción del inhibidor 3 de tripsina Kunitz. Entre las regiones
5' y 3' los sitios Nco I de la endonuclesas de restrición (que
incluye el codón de unión de la traducción ATG) y el Kpn I se
crearon para permitir la inserción del gen dapA de
Corynebacterium. El casete entero está flanquedo por los
sitios BamH I y Sal I.
Según lo descrito en el Ejemplo 4 una secuencia
de tránsito del cloroplasto (cts) se fundió a la secuencia de
codificación dapA en el gen quimérico. Los cts usados se basaron en
el cts de la subunidad pequeña de la ribulosa
1,5-bisfosfato carboxilasa de la soja
[Berry-Lowe y otros (1982) J. Mol. Appl. Gent.
1:483-498]. Se aisló un fragmento Nco
I-Kpn I de 1030 bp que contenía los cts unidos a la
región de la codificación del cordapA de un gel de agarosa
seguido de una electroforesis e insertado en un casete de expresión
KTI3 que daba el plásmido pML102 (Figura 15).
Se introdujo el plásmido pML102 en la soja
mediante bombardeo mediado por partícula por la compañía Agracetus
(Middleton, WI), según el procedimiento descrito en la patente no
5.015.580 de Estados Unidos. Para explorar las células
transformadas, el plásmido pML102 se co-bombardeó
con otro plásmido que contenía un gen marcador de la transformación
de la soja que consistía en el promotor 35S del virus mosaico de
la coliflor que conducía la expresión del gen
\beta-glucuronidasa (GUS) del E.coli
[Jefferson y otros (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:8447-8451] con la región No. 3'.
Se esperaba que los transgenes se segregaran en
las semillas Rl de las plantas transformadas. Para identificar las
semillas que llevaron el gen marcador de la transformación, se cortó
una pequeña viruta de la semilla con una maquinilla de afeitar y se
puso en un pocillo en una placa plástica disponible para
microtitulación. Se preparó una mezcla del análisis GUS que
consistía en NaH_{2}PO_{4} 100 mM, EDTA 10 mM,
K_{4}Fe(CN)_{6} 0.5 mM, 0.1% Tritón
X-100, 0.5 mg/mL de ácido
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucurónico
y se agregaron 0.15 ml a cada pozo del micortiter. La placa de la
microtitulación se incubó a 37ºC durante 45 minutos. El desarrollo
del color azul indicó la expresión del GUS en la semilla.
Para medir la composición del aminoácido total
en las semillas maduras, se hidrolizaron 1-1.4
miligramos de la comida de la semilla en ácido hidroclórico 6N,
0.4% \beta-mercaptoetanol bajo nitrógeno durante
24 h a 110-120ºC; se corrió 1/50 de la muestra en
un analizador de aminoácido modelo 6300 de Beckman usando la
detección con ninhidrina en la post-columna. Se
compararon los niveles de lisina (y otro aminoácido) en las
semillas como porcentajes de los aminoácidos totales. Las semillas
de tipo salvaje de la soja contienen 5.7-6.0% de
lisina.
Se analizaron ciento cincuenta semillas
individuales a partir de dieciséis líneas independientes
transformadas (Tabla 9). Diez de las dieciséis líneas tenían
semillas con un contenido de lisina del 7% del total de aminoácidos
en la semilla o mayor, un 16-22% incrementó sobre
las semillas de tipo salvaje. Así, más del 62% de los eventos de
transformación habían co-integrado el plásmido que
contenía el gen cordapA junto con el plásmido relacionado
con el gen marcador GUS. Cerca del 80% de las semillas altas en
lisina eran positivos en GUS, sugiriendo que el plásmido contenía
el gen cordapA integrado generalmente en el mismo sitio
cromosómico que el plásmido que lleva el gen GUS. Sin embargo, en
algunas líneas transformadas, por ejemplo 260-05,
había poca correlación entre el GUS positivo y los altos fenotipos
de la lisina, indicando que los dos plasmidos se integraron en los
sitios no unidos. Ambos tipos de eventos de la transformación se
esperaban basados sobre el procedimiento usado para esta
transformación.
Se obtuvieron las semillas con un contenido en
lisina mayor del 20% del total de los aminoácidos de la semilla.
Esto representa casi un aumento de trescientos por ciento en el
contenido de la lisina de la semilla.
(1) INFORMACIÓN GENRAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1007 MARKET STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: WILMINGTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DELAWARE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19898
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 302-992-4931
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 302-773-0164
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 6717325
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES QUIMÉRICOS Y MÉTODOS PARA INCREMENTAR EL {}\hskip4.8cm CONTENIDO EN LISINA DE LAS SEMILLAS DE PANTAS DE MAÍZ, {}\hskip4.8cm SOJA Y COLZA.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 100
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DISQUETE DE TIPO MEDIO, 3,50 PULGADAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: MACINTOSH
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MACINTOSH, 6,0
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: MICROSOFT WORD, 4,0
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA PRESENTE APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE CLASIFICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CALSIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS PREVIOS DE LA APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE APLICACIÓN: 08/160.117
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE CLASIFICACIÓN: NOVIEMBRE 30.1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BARBARA C. SIEGELL
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.684
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERNCIA/EXPEDIENTE: BB-1055-B
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGGCCAT GGCTACAGGT TTAACAGCTA AGACCGGAGT AGAGCACT
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATATCGAAT TCTCATTATA GAACTCCAGC TTTTTTC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 917 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..911
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCCCGTGA CCATGGGCCA TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1350 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 1..1350
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: acido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTTTGCT GTAATAGGTA CCA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGGTAC CTATTACAGC AAACCGGCAT G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCCTCAA TGATCTCCTC CCCAGCT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATTGTACTC TTCCACCGTT GCTAGCAA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar= "SM 70"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGACTCGCT GCGCTCGGTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..24
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar= "SM 71"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTTTCTCC TTACGCATCT GTGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..27
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto="oligonucleótido sintético"/nombre estándar="SM 78"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCATCGATA GGCGACCACA CCCGTCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..27
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 79"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATATCGATG CCACGATGCG TCCGGCG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..55
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar= "SM 81"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico(
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..55
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 80"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..14
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nivel = nombre/nota= "gen base [(SSP5)2]"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LASEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 84"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGAGGAG AAGATGAAGG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 85"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGCCTTCA TCTTCTCCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "oligonucleótido sintético"/nombre estándar="SM 82"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGAGGAG AAGCTGAAGG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar= "SM 83"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGCCTTCA GCTTCTCCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Leu Lys Ala}
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 160 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: C15
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..151
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética" /producto = {}\hskip3.8cm "proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.7.7.7.7.7.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 160 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: C20
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..151
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética" /producto = {}\hskip3.8cm "proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.7.7.7.7.7.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: C30
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..130
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética" /producto = {}\hskip3.8cm "proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.7.7.7.7.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Leu Lys Ala Met Glu}
\sac{Glu Lys Leu Lys Ala Met Glu Glu Lys Leu
Lys Ala Met Glu Glu Lys}
\sac{Leu Lys Ala Met Glu Glu Lys Met Lys
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: E. coli
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: D16
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..88
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética" /producto = {}\hskip3.8cm "proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.5.5.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino acids
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Ala Met Glu}
\sac{Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Met
Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)TIPO
- DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CLON: D20
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..109
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética" /producto = {}\hskip3.8cm "proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.5.5.5.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: D33
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..88
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética" /producto = {}\hskip3.8cm "proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.5.5.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Ala Met Glu}
\sac{Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Met
Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético"/nombre estándar="SM 86"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGAGGAG AAGCTGAAGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 87"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTTCTTCA GCTTCTCCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 88"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGAGGAG AAGCTGAAGT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 89"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCACTTCA GCTTCTCCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 90"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGAGGAG AAGATGAAGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:46:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 91"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTTCTTCA TCTTCTCCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 92"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGGAGGAG AAGATGAAGT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 93"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCACTTCA TCTTCTCCTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Leu Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Leu Lys Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LASEQ ID NO:52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 160 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 82-4
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..151
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "7.7.7.7.7.7.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 84-H3
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..88
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.5.5.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Ala Met Glu}
\sac{Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Met
Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 86-H23
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..88
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto =" {}\hskip3.8cm "proteína"/gen = "ssp" /nombre estándar = "5.8.8.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Leu Lys Lys Met Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Leu Lys Lys Met Glu Glu Lys Met Lys
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LASEQ ID NO:59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 112 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 88-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..103
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.9.9.9.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Lys Lys Leu Lys
Trp Met Glu Glu Lys}
\sac{Leu Lys Trp Met Glu Glu Lys Leu Lys Trp
Met Glu Glu Lys Met Lys}
\sac{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CLON:90-H8
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..109
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína"/gen = "ssp" /nombre estándar = "5.10.10.10.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Lys Met Glu}
\sac{Glu Lys Met Lys Lys Met Glu Glu Lys Met
Lys Lys Met Glu Glu Lys}
\sac{Met Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 92-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..88
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.11.11.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Trp Met Glu}
\sac{Glu Lys Met Lys Trp Met Glu Glu Lys Met
Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 96"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar= "SM 97"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..28
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nivel = nombre/nota= "(SSP 5)4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys
Met Lys Ala Met Glu}
\sac{Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Met
Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc~CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 98"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 99"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..28
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nivel = nombre/nota= "(SSP 7)4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Leu Lys Ala Met Glu Glu Lys
Leu Lys Ala Met Glu}
\sac{Glu Lys Leu Lys Ala Met Glu Glu Lys Leu
Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 100"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..84
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 101"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Leu Lys Lys Met Glu Glu Lys
Leu Lys Trp Met Glu}
\sac{Glu Lys Leu Lys Lys Met Glu Glu Lys Leu
Lys Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 243 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: E. Coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 2-9
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..235
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "7.7.7.7.7.7.8.9.8.9.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 175 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 5-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..172
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "5.5.5.7.7.7.7.5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 187 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CADENA: E. coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: DH5 alfa
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..173
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteína de almacenamiento sintética /producto = {}\hskip3.8cm proteína" /gen = "ssp" /nombre estándar = "SSP-3-5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..61
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto= "oligonucleótido sintético"/nombre estándar="SM 107"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..61
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 106"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nivel= nombre /nota= "pSK34 gen base"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Glu Glu Lys
Met Lys Val Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..63
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 110"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..63
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 111"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Glu Glu Lys
Met Lys Ala Met Glu}
\sac{Asp Lys Met Lys Trp Leu Glu Glu Lys Met
Lys Lys Leu Glu Glu Lys}
\sac{Met Lys Val Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Glu Glu Lys
Met Lys Ala Met Glu}
\sac{Asp Lys Met Lys Trp Leu Glu Glu Lys Met
Lys Lys Leu Glu Glu Lys}
\sac{Met Lys Val Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..62
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar= "SM 112"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..62
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 113"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Lys Glu Glu
Met Ala Lys Met Lys}
\sac{Asp Glu Met Trp Lys Leu Lys Glu Glu Met
Lys Lys Leu Glu Glu Lys}
\sac{Met Lys Val Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..63
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 114"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..63
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto= "oligonucleótido sintético" /nombre estándar="SM 115"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAAGCCT CGGCAACGTC AGCAACGGCG GAAGAATCCG GTG
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGCACCGG ATTCTTCCGC CGTTGCTGAC GTTGCCGAGG CTT
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCCATGG CGCCCCTTAA GTCCACCGCC AGCCTCCCCG TCGCCCGCCG CTCCT
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAGGAGC GGCGGGCGAC GGGGAGGCTG GCGGTGGACT TAAGGGGCGC CATGG
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGGCGCCC ACCGTGATGA TGGCCTCGTC GGCCACCGCC GTCGCTCCGT TCCAGGGGC
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAAGCCCCT GGAACGGAGC GACGGCGGTG GCCGACGAGG CCATCATCAC GGTGGGCGC
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCCCACCG TGATGA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:100:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCGGATTC TTCCGC
\hfill16
Claims (20)
1. Un gen quimérico en donde un fragmento de
ácido nucleico que codifica la ácido dihidrodipicolínico sintasa
que es insensible a la inhibición por lisina es operable unido a una
secuencia tránsito de cloroplasto de monocotiledónea y a una
secuencia regulatoria específica de semilla de monocotiledónea.
2. El gen quimérico de la reivindicación 1, en
donde la secuencia regulatoria específica de semila monocotiledónea
es un promotor embrio específico de monocotiledóneas.
3. El gen quimérico de la reivindicación 2, en
donde el fragmento del ácido nucleico que codifica la ácido
dihidrodipicolínico sintasa comprende la secuencia nucleótide que se
muestra en SEQ ID NO:3: que codifica la ácido dihidrodipicolínico
sintasa a partir de Corynebacterium glutamicum y en donde la
secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta deriva de un gen
que codifica la pequeña subunidad de la ribulosa
1,5-bifosfato carboxilasa a partir de Zea maize, y
la secuencia regulatoria específica de semilla es a partir del gen 1
globulina de Zea Maize.
4. Un fragmento de ácido nucleico que
comprende:
(a) un primer gen quimérico en donde un
fragmento del ácido nucleico que codifica la sintasa del ácido
dihidrodipicolínico que es insensible a la inhibición por lisina
está operablemente unido a una secuencia de tránsito de cloroplasto
de planta y a una secuencia regulatoria específica de semilla de
planta y
(b) un segundo gen quimérico en donde un
fragmento del ácido nucleico que codifica una proteína rica en
lisina, en donde el porcentaje en peso de lisina es de al menos el
15%, está operablemente unido a una secuencia regulatoria
específica de semilla de planta.
5. El fragmento de ácido nucleico de la
reivindicación 4 en donde el segundo gen quimérico comprende:
un fragmento de ácido nucleico que codifica una
proteína rica en lisina comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica una proteína que contiene n unidades heptadas (d e f g
a b c), cada unidad heptada siendo la misma o diferente, en
donde:
n es al menos 4;
a y d se eligen independientemente del grupo que
consiste de Met, Leu, Val, Ile y Thr;
e y g se eligen independientemente del grupo que
consiste de los pares de ácidos/bases de Glu/Lys, Lys/Glu, Arg/Glu,
Arg/Asp, Lys/Asp, Glu/Arg, Asp/Arg y Asp/Lys; y
b, c y f son independientemente cualquier amino
ácido excepto la Gly o Pro y al menos dos amino ácidos de b, c y f
en cada heptado se eligen del grupo que consiste de Glu, Lys, Asp,
Arg, His, Thr, Ser, Asn, Ala, Gln y Cys, dicho fragmento de ácido
nucleico está operablemente unido a una secuencia regulatoria
específica de semilla de planta.
6. El fragmento de ácido nucleico de la
reivindicación 4 en donde un segundo gen quimérico comprende un
fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína rica en
lisina comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína que tiene la secuencia de amino ácidos
(MEEKLKA)_{6}(MEEKMKA)_{2} está
operablemente unido a una secuencia regulatoria específica de
semilla de planta.
7. Un fragmento de ácido nucleico que
comprende
(a) un primer gen quimérico en donde un
fragmento de ácido nucleico codifica la sintasa del
ácidodihidrodipicolínico que es insensible a la inhibición por
lisina está operablemente unido a una secuencia de tránsito de
cloroplasto de planta y a una secuencia regulatoria específica de
semilla de planta y
(b) un segundo gen quimérico que comprende un
fragmento de ácido nucleico que codifica una reductasa cetoglutarato
de lisina está operablemente unido a una secuencia en el sentido o
en contra sentido a una secuencia regulatoria específica de semilla
de planta.
8. Una planta de maíz que contiene en su genoma
el gen quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Semillas obtenidas a partir de la planta de
maíz de la reivindicación 8 que comprende el gen quimérico de la
reivindicación 1.
10. Un método para obtener una planta de colza,
soja o maíz en donde las semillas de la planta acumulan lisina a un
nivel del diez al cuatro cientos por ciento más elevada que las
semillas de una planta sin transformar que comprende:
(a) transformar las células de la planta de
colza, soja o maíz con un gen quimérico que comprende un fragmento
de ácido nucleico que codifica la sintasa del ácido
dihidrodipicolínico que es insensible a la inhibición por lisina
está operablemente unido a una secuencia de tránsito de cloroplasto
de planta y a una secuencia regulatoria específica de semilla de
planta;
(b) regenerar las plantas maduras fértiles a
partir de las células de plantas transformadas que se obtienen en
el paso (a) bajo condiciones apropiadas para obtener semillas;
(c) monitorear las semillas progenie del paso
(b) por el contenido de lisina; y (d) seleccionar aquellas líneas
cuyas semillas contienen niveles incrementados de lisina alcanzando
del diez al cuatrocientos por ciento más elevado que las semillas
de una planta sin transformar.
11. El método de la reivindicación 10 para
obtener una planta de maíz en donde el incremento en lisina de las
semillas es del diez al ciento treinta por ciento más elevada que en
las semillas de una planta de maíz sin transformar.
12. El método de la reivindicación 10, en donde
el gen quiméric del paso (a) comprende la secuencia nucleótide que
se muestra en SEQ ID NO:3: que codifica la ácido dihidrodipicolínico
sintasa a partir de Corynebacterium glutamicum y en donde la
secuencia de tránsito del cloroplasto de la planta deriva de un gen
que codifica la pequeña subunidad de la ribulosa
1,5-bifosfato carboxilasa a partir de Glycine max, y
en donde la secuencia regulatoria específica de semilla viene del
gen que codifica la subunidad de la proteína de almacenamiento de
semilla faseolina a partir del frijol Phaseolus vulgaris o de
la secuencia regulatoria específica de semilla que viene del gen 3
Kunitz inhibidor de tripsina de Glycine max.
13. El método de la reivindicación 10 o la
reivindicación 11, en donde la secuencia regulatoria específica de
semillas es un promotor embrio-específico de
monocotiledóneas, y en dondela célula de la planta de la
reivindicación 10(a) es a partir de maíz.
14. El método de la reivindicación 10 o la
reivindicación 11, en donde la célula de la planta del paso (a) es
a partir de maíz y en donde el gen quimérico del paso (a) comprende
la secuencia nucleótide que se muestra en SEQ ID NO:3: que codifica
la ácido dihidrodipicolínico sintasa a partir de Corynebacterium
glutamicum y en donde la secuencia de tránsito del cloroplasto
de la planta deriva de un gen que codifica la pequeña subunidad de
la ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa a partir de
Zea maize, y en donde la secuencia regulatoria específica de
semilla viene del gen 1 de globulina de Zea Maize.
15. Una planta de colza, soja o maíz que tiene
en su genoma el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 4,
5, 6 o 7.
16. Las semillas de colza, soja o maíz que
contienen el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 4, 5,
6 o 7.
17. Una planta de maíz transformada con el gen
quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una planta
transformada de colza, soja o maíz con el fragmento de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en donde las
semillas obtenidas de la planta acumulan lisina a un nivel del diez
al cuatrocientos por ciento mas elevado que las semillas de las
plantas sin transformar.
18. Las semillas obtenidas a partir de una
planta de maíz, transformada con el gen quimérico de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, u obtenida a partir de una planta
transformada de colza, soja o maíz con el fragmento de ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en donde las
semillas obtenidas de la planta acumulan lisina a un nivel del
diez al cuatrocientos por ciento mas elevado que las semillas de
las plantas sin transformar.
19. Una célula de una planta de maíz
transformada con el gen quimérico de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, o una célula de planta transformada de
colza, soja o maíz con el fragmento de ácido nucleico de cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 7 en donde las semillas obtenidas de una
planta regenerada a partir de las células de planta transformada
acumulan lisina a un nivel del diez al cuatrocientos por ciento mas
elevado que las semillas obtenidas de una planta regenerada de una
célula de planta sin transformar.
20. Una comida de semillas que deriva de las
semillas de la reivindicación 18.
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