MXPA04007327A

MXPA04007327A - Nuevo gen de enlogasa y metodo para producir acidos grasos poliinsaturados.

Info

Publication number: MXPA04007327A
Application number: MXPA04007327A
Authority: MX
Inventors: Zank Thorsten
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2003-01-13
Publication date: 2004-11-26
Also published as: ATE452198T1; BR0306883A; EP1472357A2; WO2003064638A3; US20050214761A1; AU2003206714B2; NO20043592L; ES2337564T3; WO2003064638A2; CA2474163C; CA2474163A1; JP2005526496A; CN1625597A; US7179647B2; IL162794A0; DE50312241D1; EP1472357B1

Abstract

La invencion se refiere a un nuevo gen de elongasa con la SEC. ID NO: 1 o sus homologos, derivados o analogos, a una estructura o construccion de gen que comprende este gen o sus homologos, derivados y analogos, y a su uso. La invencion tambien se refiere a vectores u organismos que comprenden un gen de elongasa con la secuencia SEC. ID NO: 1 o sus homologos, derivados o analogos.Ademas, la invencion se refiere a un proceso para la preparacion de acidos grasos poliinsaturados y a un proceso para introducir ADN en organismos que producen grandes cantidades de aceites y, en particular, aceites con un alto contenido de acidos grasos insaturados. Ademas, la invencion se refiere a un aceite y/o una preparacion de acido graso con un elevado contenido de acidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles y/o una preparacion de triacilglicerol con un elevado contenido de acidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles.

Description

VO-eENH&E-^QNGA ft^g— ETODO^PARA-PRODUCXR ACIDOS GRASOi POLIINSATURADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un nuevo gen de elongasa con la SEC. ID NO: 1 ó sus homólogos, derivados o análogos, a una estructura o construcción genética que comprende este gen o sus homólogos, derivados y análogos, y a su uso. La invención también se refiere a vectores u organismos que comprenden un gen de elongasa con la secuencia SEC. ID NO: 1 ó sus homólogos, derivados o análogos. Además, la invención se refiere a un proceso para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados y a un proceso para introducir ADN en organismos que producen grandes cantidades de aceites y, en particular, aceites con un alto contenido de ácidos grasos insaturados . Además, la invención se refiere a un aceite y/o una preparación de ácido graso con un elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles y/o una preparación de triacilglicerol con un elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados con al menos dos enlaces dobles. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ciertos productos y subproductos de procesos metabólicos presentes de manera natural en células microbianas o en las células—de—animales—y-,—-pntr) aamente , las plantas se pueden utilizar para un amplio espectro de industrias, que incluyen la industria de alimentos para animales, industria alimenticia, industria de cosméticos y la industria de sustancias farmacéuticas. Estas moléculas, las cuales se denominan conjuntamente "sustancias químicas finas", también incluyen lípidos y ácidos grasos, entre los cuales los ácidos grasos poliinsaturados constituyen un ejemplo de una clase. Se agregan ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) , por ejemplo, al alimento para niños para incrementar el valor nutricional de estos alimentos. Por ejemplo, los PUFAs tienen un efecto positivo en el nivel de colesterol en la sangre de los humanos y por lo tanto son adecuados para la protección contra padecimientos cardiacos. Las sustancias químicas finas tales como ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) se pueden aislar de fuentes animales, por ejemplo pescado o producir a gran escala utilizando microorganismos por medio del cultivo de microorganismos los cuales se han desarrollado de tal manera que los mismos produzcan y acumulen o secreten, grandes cantidades de una o más moléculas deseadas. Los microorganismos que son especialmente adecuados para preparar PUFAs son microorganismos tales como algas tales como la especie Phaeodactylum tricornutum o Crypthecodinium, Ciliata tales como Stylonichia o Colpidium, hongos tales como Mortierella, Entomophthora o Mucor. Un cierto número de cepas mutantes de los microorganismos en cuestión que producen una serie de compuestos deseables, que incluyen los PUFAs, se han desarrollado mediante la sección de cepas. La selección de cepas con una producción mejorada de cierta molécula, sin embargo, es un procedimiento que consume tiempo y es difícil. Como una alternativa, las sustancias químicas finas se pueden producir adecuadamente a gran escala por medio de la producción de plantas las cuales se hayan desarrollado de tal manera que las mismas produzcan los PUFAs antes mencionados. Las plantas que son particularmente muy adecuadas para este propósito son los cultivos de aceite los cuales contienen grandes cantidades de compuestos de lípidos, tales como de semillas oleaginosas de colza, cañóla, linaza, soya, girasoles, cardos, borraja y hierba del asno u onagra. Sin embargo, otros cultivos que contienen aceites o lípidos y ácidos grasos son muy adecuados, como se mencionó en la descripción detallada de la presente invención. La reproducción de plantas convencionales por medio de la selección de plantas adecuadas, ha conducido al desarrollo de una serie de plantas mutantes las cuales producen un espectro de lípidos y ácidos grasos, cofactores y enzimas deseables. Sin embargo, la selección de nuevas variedades de plantas con una producción mejorada de una cierta molécula es un procedimiento que consume tiempo y difícil o incluso imposible si el compuesto no está presente de manera natural en la planta en cuestión, tal como en el caso de los ácidos grasos con C2o poliinsaturados y aquellos con cadenas de carbono largas . Debido a las características positivas de los ácidos grasos insaturados, no ha existido falta de intentos en el pasado para elaborar genes disponibles los cuales se involucren en la síntesis de ácidos grasos o triglicéridos para la producción, en varios organismos, de aceites con un contenido modificado de ácidos grasos insaturados. Por consiguiente, la WO 91/13972 y su equivalente norteamericana describen una ?-9 desaturasa. La 93/11245 reivindica una ?-15 desaturasa, y la WO 94/11516 una ?-12 desaturasa. Las ?-6 desaturasas se describen en la WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 y WO 99/27111. Se describen las desaturasas adicionales, por ejemplo, en la EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem. , 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 ó Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659. La WO 96/13591 describe y reivindica la ?-6-palmitoil-ACP desaturasa. Sin embargo, hasta ahora las diversas desaturasas se han caracterizado insuficientemente en térftinos—de su hi nq ími a puesto que las enzimas, que son proteínas unidas a la membrana, solamente se pueden aislar y caracterizar con gran dificultad (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol . Biochem., 26, 1988: 777-792). Tanto un cambio o desviación en el espectro del ácido graso con el objeto de hacer ácidos grasos insaturados como un incremento en la productividad, se han identificado en las levaduras (ver Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier et al., Biochem. J. , Vol . 330, 1998: 611-614). Sin embargo, la expresión de las diversas desaturasas en plantas transgénicas , no fue tan exitosa como se deseaba. No se ha encontrado un cambio del espectro del ácido graso para los ácidos grasos insaturados, mientras que al mismo se ha encontrado que se reduce en gran medida la productividad de la síntesis de las plantas transgénicas, es decir solamente se aislaron pequeñas cantidades de aceites en comparación con las plantas de partida . La clonación y expresión de las elongasas que alargan los ácidos grasos insaturados como un substrato de la reacción de la enzima mediante al menos dos átomos C, hasta ahora no se han descrito ni para las levaduras ni para las plantas. Esto significa que ni las levaduras ni las plantas de cultivo producen de manera natural ácidos grasos con C2o y/o (¾¾-,— o.1 _-Ltig3J --raioa , con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, tal como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenóico (EPA) y/o ácido docosahexaenóico (DHA) . Por lo tanto aún existe una gran necesidad de nuevos genes que codifiquen enzimas las cuales se involucren en la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y las cuales hagan posible la producción de lo último en una escala industrial. Particularmente existe una gran necesidad de elongasas que alarguen los ácidos grasos insaturados mediante al menos dos átomos C. Ninguno de los métodos biotecnologicos de la técnica previa para la producción de ácidos grasos poliinsaturados produce los ácidos grasos antes mencionados en cantidades utilizables económicamente. Una y otra vez, la expresión de genes en plantas implica problemas, es decir que la expresión no proporciona el incremento esperado en la producción del producto deseado de valor. Por lo tanto es un objetivo identificar, clonar y expresar nuevos genes de elongasa y por consiguiente proporcionarlos para la síntesis de ácidos grasos insaturados, tales como ácidos grasos con C2o y/o C22, poliinsaturados , con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, tal e-omo—ácido—arajpjiidóriico (AR¾J y/o ácido eicosapentaenóico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA) . Este objetivo se logró mediante el ácido nucleico aislado de conformidad con la invención, el cual codifica un polipéptido el cual alarga los ácidos grasos con Cíe ó Cía con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso mediante al menos dos átomos de carbono, los ácidos grasos C1B:3,5t'9,12 , 2o:348,11,14, C2o: A5'8,11'14 y C20:50A5,8,ii,i4,i7 que no están alargados.

El objetivo se logró ventajosamente mediante un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido el cual alarga los ácidos grasos con Ci6 ó Cis con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, seleccionada del grupo que consiste de a) una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC. ID NO: 1, b) una secuencia de ácido nucleico la cual, de conformidad con la degeneración del código genético, se deriva de la -secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 2, c) derivados de la secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 1 la cual codifica los polipéptidos con al menos 50% de homología con la secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2, la secuencia que actúa como una ^longasa_con_ CJL^Ó_CI ^ seleccionada del grupo anterior, alarga los ácidos grasos con C3.6 ó Cía con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso mediante al menos dos átomos de carbono, con los siguientes ácidos grasos, que sin embargo, no son alargados Ci8:3A5t'9,12 , C2o:3A8, 11,14 / C2o:4A5'8'11,14 Y C20:50?5 , 8, íi, 14, 17 · Los ácidos grasos con Ci6 ó Cíe con dos, tres o cuatro enlaces dobles en la molécula de ácido graso preferiblemente son alargados. Aunque los ácidos grasos tales como C„i A5t,9,12 8:3 , C2o ?8,11,14 / C ?5,8,11,14 ,, -.3 20:4 y C2o:5A5'8'i:1"14'17 no son alargados, los ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste dje„ ?9,12 Ci8:3?4,7,10 , Ci ?5,8,11 Ci8;2 , 8:3 , n ?6,9,12 ?7,10,13 ?8,11,14 ?9,12,15 ?6, 9,12,15 ^18:3 / ^1B:3 ^-18: 3 / <-18:3 / VL8:4 / Ci8:3A5c'9'12 ó Ci6:3A7,10'13, son alargados . Las elongasas de conformidad con la invención muestran una preferencia por los ácidos grasos Ci8:3?6,9,12 , Ci ?6, 9,12, 15 , 8: y, Ci ?7,10,13 6:3 , la cual excede aquélla para ácidos grasos insaturados tales como los aciaos ?7,10,13 Ci8:3A9'12'15 ó Ci8:3A5,c9'12 provechosamente por al menos un factor de 1,5, preferiblemente al menos por el factor 1.6, en especial preferiblemente al menos por el factor 1.7, ó en especial muy preferiblemente por al menos el factor 1.8.

Las secuencias de ácido nucleico de conformidad con la invención, las cuales alargan los ácidos grasos con Cí6 ó Ci8, en principio se originan provechosamente a partir de hongos, preferiblemente de hongos tales como el Oomycetes, por ejemplo Oomycetes tales como aquellos del género Phytophthora, en especial preferiblemente de Oomycetes del género y especie Phytophthora infestans . Los ácidos nucleicos de conformidad con la invención se pueden utilizar para la modificación de aceites, ácidos grasos, lípidos, compuestos derivados de lípidos y más preferiblemente para la producción de ácidos grasos poliinsaturados . Los organismos hospederos los cuales son venta osamente adecuados para los ácidos nucleicos de conformidad con la invención, son microorganismos tales como Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthor , Mucor, Crypthecodinium y otras algas y hongos, y plantas, en particular cultivos de aceite, los cuales se utilizan a gran escala en la industria para la producción de una multiplicidad de sustancias químicas finas. Utilizando los vectores de clonación y técnicas para la manipulación genética de los microorganismos antes mencionados y los ciliados descritos en, por ejemplo, WO 98/01572 o los métodos y vectores descritos en Falciatore et al., 1999, 1 Marine Biotechnology 1(3): 239-251, y Dunahay et al . , 1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol . 31:10004-1012 y las referencias citadas en las mismas para las algas y los organismos relacionados, tales como Phaeodactylum tricornutum, se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la invención para la modificación recombinante de estos organismos de tal modo que las mismas lleguen a ser mejores productoras o más eficientes de una o más sustancias químicas finas. Esta producción mejorada, o eficiencia de producción, de una sustancia química fina puede ser causada por un efecto directo de la manipulación de un ácido nucleico de conformidad con la invención, ventajosamente en la forma del gen entero, o mediante una acción indirecta de esta manipulación . Los mohos y las algas son los únicos sistemas de plantas conocidas que producen cantidades considerables de ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenóico (EPA) y/o ácido docosahexaenóico (DHA) . Los sistemas fúngicos, tales como Oomycetes (Eucaryota/Stramenopiles/Oomycetes/Phythiales/Pythiaceaea) también producen los ácidos grasos antes mencionados. Esto es porque las moléculas de ácido nucleico que se originan de un Oomycete tal como Phytophtohora infestans son particularmente adecuados para modificar el sistema de producción de lípidos y PtTFA e¾n un hospedero, en particular en microorganismos tales como los microorganismos antes mencionados, y en plantas tales como cultivos de aceites, por ejemplo semillas oleaginosas de colza, cañóla, linaza, soya, girasoles, borraja. Además, se pueden utilizar los ácidos nucleicos de un Oomycete tal como Phytophtohora infestans para identificar tales secuencias y enzimas de ADN en otras especies las cuales son adecuadas para modificar la biosíntesis de las moléculas precursoras de PUFA en los organismos en cuestión. El hongo Phytophtohora infestans pertenece a los Oomycetes. El mismo está relacionado con otros hongos que pueden crecer en la ausencia de luz. Los hongos tales como el Phytophtohora tienen un alto grado de homología entre sí en la secuencia de ADN y el nivel de polipéptido, lo cual hace posible someter las moléculas de ADN objetivo a una selección heteróloga con sondas derivadas de otros hongos u organismos, de modo, que, si secuencias de ácido nucleico adicionales están presentes además de la secuencia de conformidad con la invención, se puede derivar una secuencia de consenso la cual es adecuada para la selección heteróloga o para la observación funcional y la predicción de funciones del gen en la tercera especie. Sin embargo, la predicción de la función de las proteínas o enzimas codificadas por las secuencias no es posible por ahora. Por lo tanto la capacidad de identificar estas—funcioae-s-,—por—ejpmpl o La predicción de la especificad del substrato de enzimas, puede ser de significativa importancia. Además, estas moléculas de ácido nucleico pueden actuar como secuencias de referencia para formar mapas de otros hongos o para obtener cebadores PCR. Además, se ha aislado por primera vez un gen PSE activo funcionalmente de los Oomycetes Phytophtohora infestans (Eucaryota/Stramenopiles, Oomycetes/Phythiales/Pythiaceaea) . El gen es adecuado ventajosamente para la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, preferiblemente aquéllos que tienen más de dieciséis o dieciocho átomos de carbono en la estructura principal de carbono del ácido graso y/o al menos dos enlaces dobles en la cadena de carbono, las enzimas codificadas por la secuencia de conformidad con la invención que tienen preferencia por los ácidos grasos antes mencionados durante el proceso de alargamiento. Las nuevas moléculas de ácido nucleico codifican una proteína llamada en el presente contexto elongasa específica de PUFA (= PSEs, o PSE en singular) . Estas PSEs por ejemplo, pueden ejercer una función la cual esté involucrada en el metabolismo (por ejemplo en la biosíntesis o en la ruptura) de compuestos requeridos para la síntesis del lípido o de ácido graso, tal como los PUFAs, o los cuales participen en el transporte de las transmembranas de uno o más compuestos ¾p-iáe/?cido—gras^—ya—sea-dentx_o de la célula o fuera de la célula . Esta nueva solicitud muestra la función de la secuencia con más detalle. Por primera vez, se ha aislado un gen de Oomycete activo funcionalmente el cual es adecuado para producir ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, que tienen preferiblemente más de dieciséis ó dieciocho átomos de carbono en la estructura de carbono de ácido graso y/o al menos dos enlaces dobles en la cadena de carbono, las enzimas codificadas por la secuencia de la invención muestra preferencia por los ácidos grasos antes mencionados durante los pasos de alargamiento. Esto significa un gen PSE o proteina PSE. Otras publicaciones y patentes no describen, o muestran, genes PSE activos funcionalmente , aún cuando existen diversas solicitudes de patente conocidas las cuales muestran el alargamiento de los ácidos grasos saturados de longitud de cadena corta o mediana ( O 98/46776 y US 5,475,099) o el alargamiento o producción de ácidos grasos de cadena larga, pero los cuales no tienen más de un enlace doble o conducen a ésteres de cera de ácido graso de cadena larga (ver WO 98/54954, WO 96/13582, WO 95/15387) . Aunque las WO 99/64616, WO 98/46763, WO 98/46764, WO 98/46765 describen la producción de PUFAs en plantas transgénicas y demuestran la clonación y expresión funcional 1 de las correspondientes actividades de la desaturasa, en particular de hongos, las mismas demuestran un gen que codifica las PSE no indispensable y una actividad PSE no funcional . La producción de un ácido trienóico con una cadena de carbono C1S se ha demostrado y reivindicado con referencia al ácido gamma-linolénico, aunque sin embargo la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga (con una cadena de carbono con C2o y más larga de ácidos trienóicos y tipos insaturados superiores) y la especificidad del substrato de la elongasa, no se han enseñado hasta la fecha. Para preparar los PUFAs de cadena larga, se deben alargar los ácidos grasos poliinsaturados con Ci6 y/o Ci8 mediante al menos dos átomos de carbono mediante la actividad enzimática de una elongasa. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención codifica la primer elongasa fúngica la cual es capaz de alargar los ácidos grasos con Ci6 ó Cíe con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso mediante al menos dos átomos de carbono. Después de un ciclo de alargamiento, esta actividad enzimática conduce a ácidos grasos con C20, Y después a dos, tres y cuatro ciclos de alargamiento para los ácidos grasos con C22, C24 ó C26 · Una ventaja de la actividad enzimática de conformidad con la invención es que no todos los ácidos grasos con C2o se alargan.

Esto hace posible la síntesis específica de ácidos grasos insaturados, deseables, individuales, o mezclas de ácidos grasos. Los PUFAs largos también se pueden sintetizar utilizando la elongasa de conformidad con la invención. La actividad de las elongasas de conformidad con la invención preferiblemente conduce a ácidos grasos con C2o y/o C22 con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferiblemente con tres o cuatro enlaces dobles, se prefieren especialmente los ácidos grasos con un enlace doble en la posición ?6. Después de que ha tenido lugar el alargamiento mediante las enzimas de conformidad con la invención, se pueden llevar a cabo pasos adicionales de desaturación. Los productos de la actividad de la elongasa y de la desaturación adicional la cual es una posibilidad que conduce por lo tanto a PUFAs preferidos con un grado superior de desaturación, tal como ácido docosadienóico, ácido araquidónico, ácido co6-eicosatriendihomo-?—linolénico, ácido eicosapentenóico, ácido co3-eicosatrienóico , ácido ü)3-eicosatetraenóico, ácido docosapentaenóico ó ácido docosahexaenóico . Los substratos de la actividad enzimática de conformidad con la invención, por ejemplo, son ácido de taxol; ácido 6 , 9-octadecadienóico, ácido linoleico, ácido ?-linolénico, ácido pinolénico, ácido a-linolénico o ácido estearidónico . Los substratos preferidos son acido I ó ico", á'cilo^Y^n oIemrcc^^ dobles en el ácido graso se pueden alargar mediante la actividad enzimática de conformidad con la invención en la forma del ácido graso libre o en la forma de los esteres, tales como fosfolípidos , glicolípidos, esfingolípidos , fosfoglicéridos, monoacilglicerol , diacilglicerol o triacilglicerol . Utilizando vectores de clonación los cuales sean adecuados para su uso en plantas y en la transformación de plantas, tales como aquellos que se publicaron en Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Ratón, Florida), capítulo 6/7, pp . 71-119 (1993) ; F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, Ed. : Kung y R. u, Academic Press, 1993, 15-38;. B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed. : Kung y R. Wu, Academic Press (1993) , 128- 143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Molec. Biol . 42 (1991) , 205-225) ) y en las referencias citadas en estas publicaciones, los ácidos nucleicos de conformidad con la invención se pueden utilizar para la modificación recombinante de un amplio espectro de plantas de modo que las mismas se vuelvan un mejor productor o un productor más eficiente de uno o más productos derivados de lípidos, tales como los PUFAs .

Esta producción mejorada o eficiencia de producción de un producto derivado de lípidos, tales como los PUFAs, se pueden provocar mediante el efecto directo de la manipulación o mediante une efecto indirecto de esta manipulación. Existe una serie de mecanismos mediante los cuales la modificación de una proteína PSE de conformidad con la invención puede afectar directamente el rendimiento, la producción y/o eficiencia en la producción de una sustancia química fina de un cultivo de aceite o un microorganismo, debido a una proteína modificada. El número o actividad de la proteína PSE, ácido nucleico PSE o gen PSE se puede incrementar de tal manera que se produzcan mayores cantidades de estos compuestos de novo ya que los organismos carecen de esta actividad y capacidad de biosíntesis antes de la introducción del gen de ácido nucleico en cuestión. La introducción de un ácido nucleico de conformidad con la invención y/o un gen PSE en un organismo o una célula no solamente puede incrementar el flujo de la biosíntesis hacia el producto terminado, sino que también incrementa, o crea de novo, la correspondiente composición de triacilglicerol . De igual modo, el número o actividad de otros genes que están involucrados en la importación de nutrientes requeridos para la biosíntesis de una o mas sustancias químicas finas (por ejemplo ácidos grasos, lípidos polares y neutrales) se puede increment-ar-, de modo que la concentración de estos precursores, cofactores o intermediarios se incremente dentro de las células o dentro del compartimiento de almacenamiento, incrementado así además la capacidad de las células para producir los PUFAs, como se describe aquí posteriormente. Los ácidos grasos y los lipidos en sí mismos son deseables como sustancias químicas finas; la optimización de la actividad, o incrementando el número, de uno o más PSEs los cuales están involucrados en la biosíntesis de estos compuestos, o destruyendo la actividad de uno o más PSEs los cuales están involucrados en la rotura de estos compuestos, puede hacer posible un incremento en el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de moléculas de ácido graso y moléculas de lipidos de las plantas y los microorganismos. La mutagénesis del gen PSE de conformidad con la invención o del ácido nucleico, también puede conducir a una proteína PSE con actividades modificadas las cuales afectan directa o indirectamente la producción de una o más sustancias químicas finas. Por ejemplo, se puede incrementar el número o actividad del gen PSE de conformidad con la invención o del ácido nucleico, de modo que los productos de desecho metabólicos normales o subproductos de la célula (cuya cantidad se podría incrementar debido a la sobreproducción de la sustancia química fina deseada) , se exporten de manera procesos dentro de la célula (lo cual podría reducir la viabilidad celular) o podría interferir con las rutas biosintéticas de los químicos finos (reduciendo así el rendimiento, producción o eficiencia en la producción de la sustancia química fina) . Además, las cantidades intracelulares relativamente grandes de la sustancia química fina en sí mismas pueden ser tóxicas para la célula o pueden interferir con mecanismos de retroalimentación enzimática, tal como la regulación alostérica; por ejemplo, las mismas podrían incrementar la asignación del PUFA en la fracción de triacilglicerol debido a una actividad incrementada o número de otras enzimas o enzimas desintoxicantes de la ruta de PUFA la cual continúa corriente abajo; la viabilidad de células de semillas podría incrementar lo cual, a su vez, conduce a un mejor desarrollo de células en el cultivo o a semillas las cuales producen la sustancia química fina deseada. Alternativamente, se puede manipular el gen PSE o ácidos nucleicos de conformidad con la invención de tal manera que se produzcan las cantidades correspondientes de las diversas moléculas de lípidos y de moléculas de ácido graso. Esto puede tener un efecto decisivo en la composición de lípidos de la membrana celular y genera nuevos aceites además de la presencia de los PUFAs los cuales se han sintetizado de novo.

-Puesto— ue—e-ad —tipo—da—Lípido tiene diferentes propiedades físicas, un cambio en la composición de lípidos de una membrana puede modificar sustancialmente la fluidez de la membrana. Los cambios en la fluidez de la membrana pueden tener un efecto en el transporte de moléculas a través de la membrana y en la integridad de las células, ambos tienen un efecto decisivo en la producción de sustancias químicas finas. Además, en las plantas, estos cambios también pueden tener un efecto en otras características tales como la tolerancia a las situaciones de tensión abiótica y biótica. La tolerancia a las situaciones de tensión abiótica y biótica es una característica general la cual es deseable impartir a un amplio espectro de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, soya, cacahuate, abrojo, algodón, semillas oleaginosas de colza, cañóla, yuca, pimienta, girasol y tagetes, las plantas solanáceas tales como papa, tabaco, berenjena y tomate, especie Vicia, guisante, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, té) , especie Salix, árboles (palma de aceite, coco) y pastos perennes y cultivos de forraje. Como una modalidad adicional de conformidad con la invención, estos cultivos también son plantas objetivo preferidas para ingeniería genética. Las plantas muy especialmente preferidas de conformidad con la invención, son los cultivos de aceite tales como—soy-a-,—cacahuate, semillas oleaginosas de colza, cañóla, girasol, yuca, árboles (palma de aceite, coco) o cultivos tales como maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, alfalfa, o plantas de arbusto (café, cacao, té) . De conformidad con esto, un aspecto de la invención se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico (por ejemplo ADNcs) que comprenden una secuencia de nucleótidos la cual codifica una PSE o partes biológicamente activas de la misma, o fragmentos de ácido nucleico los cuales son adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección o amplificación de ácidos nucleicos que codifican la PSE (por ejemplo ADN o ARNm) . En una modalidad especialmente preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una de las secuencias de nucleótidos mostrada en la SEC. ID NO: 1, ó la región de codificación o un complemento de una de estas secuencias de nucleótidos. En otras modalidades especialmente preferidas, la molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la invención comprende una secuencia de nucleótidos la cual se hibridiza con una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC. ID NO:.1, ó una parte de la misma o que tiene al menos aproximadamente 50%, de manera preferible al menos aproximadamente 60%, de manera más preferible al menos aproximadamente 70%, 80%, ó 90% y aún de manera más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó más homología con la misma, homología significa la identidad para los propósitos de la presente invención. En otras modalidades preferidas, la molécula aislada de ácido nucleico codifica una de las secuencias de aminoácidos mostrada en la secuencia SEC. ID NO: 2. Preferiblemente, el gen PSE preferido de conformidad con la invención y la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención también tiene al menos una de las actividades de PSE descritas aquí. En una modalidad adicional, la molécula aislada de ácido nucleico codifica una proteína o parte de la misma, la proteína o parte de la misma que comprende una secuencia de aminoácidos tiene suficiente homología con una secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC. ID NO: 2 que la proteína o parte de la misma retiene una actividad PSE, homología significa la identidad para los propósitos de la presente invención. Preferiblemente, la proteína o parte de la misma la cual se codifica mediante la molécula de ácido nucleico retiene la capacidad de participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares de las plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. En una modalidad, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente 50%, de manera preferible al menos aproximadamente 60%, de manera más preferible al menos al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó más homología con una secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC. ID NO: 2. En una modalidad preferida, la proteína es una proteína de longitud completa de Phytophthora infestans la cual es esencialmente homologa con una secuencia de aminoácidos completa de la SEC. ID NO: 2 (la cual se debe a la estructura de lectura abierta mostrada en la SEC. ID NO: 1) . En otra modalidad preferida, la molécula aislada de ácido nucleico se origina de la Phytophthora infestans y codifica una proteína (por ejemplo una proteína de fusión PSE) que comprende un dominio activo biológicamente el cual tiene al menos aproximadamente 50% o más homología (identidad) con una secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC. ID NO: 2 y retiene la capacidad de participar en el metabolismo fúngico de los compuestos requeridos para la síntesis de ácidos grasos insaturados o en el transporte de moléculas a través de membranas o la cual tiene al menos una de las actividades listadas en la Tabla I, y también comprende secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican un polipéptido heterólogo o proteínas reguladoras. Los ácidos nucleicos de conformidad con la invención codifican las proteínas que alargan los ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste de Ci8:2A9'12/ Ci8:3A4'7'10, r, ?·^ H, ? „ ?6.9.12 ^ ?7,10,13 ?8,11,14 ,-, ?9, 12,15 ^-1?:2 ? CT8T3 1 trTBT3 , <~±8-3 1 S-18^3 L_ r-i ?6,9,12,15 r-> A5c,9,12 o C ?is : 3?7,10,13 , m „ientras que 1los a ~.^ci-i ^ar :4 / Ci8:3 oa Ci8 s „^„„ A5t,9,12 ,-, ?8,11,14 ?5 , 8 , 11 , 14 , grasos tales como Ci8:3 , C2o:3 , C2o:4 Y ^20:5?5,8,??,?4,?7 no son alargados . El gen PSE se expresa heterologamente en la levadura, y los diversos ácidos grasos poliinsaturados se alimentan individualmente y se convierten mediante las levaduras transformadas. Los perfiles de ácido graso de la levadura transgenética se analizan por medio de GLC. El porcentaje de ácidos grasos alimentados y convertidos se calculó como sigue: mol% (producto) xlOO/ [mol% (material de partida) + mol% (producto) ] . La Tabla I muestra ácidos grasos los cuales se alargan mediante la enzima de conformidad con la invención. 6 En otra -mo lidd-,—la m l ¿mil a aig"|?¾da de ácido nucleico es al menos de 15 nucleótidos de longitud y se hibridiza bajo condiciones severas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 1. La molécula aislada de ácido nucleico corresponde preferiblemente a un molécula de ácido nucleico de origen natural. Más preferiblemente, la molécula aislada de ácido nucleico codifica la PSE de Phytophthora infestans de origen natural o una parte activa biológicamente de la misma. Un aspecto adicional de la invención se refiere a vectores, por ejemplo vectores de expresión recombinante, que comprenden al menos una molécula de nucleótido de conformidad con la invención y células hospederas en las cuales se han introducido estos vectores, en particular microorganismos, células de plantas, tejidos de plantas, órganos de plantas o plantas intactas. También se pueden utilizar ventajosamente células hospederas no-humanas, tales como, por ejemplo, Caenorhabditis elegans. En una modalidad, tal célula hospedera puede almacenar sustancias químicas finas, en particular los PUFAs; para aislar el compuesto deseado, se cosechan las células. El compuesto (aceites, lípidos, triacilglicéridos , ácidos grasos) o el PSE se puede aislar entonces del medio o de la célula hospedera la cual, en el caso de las plantas, son células que comprenden o almacenan sustancias químicas finas, más ?t-pfp-r-i hl célul s de tejidos de almacenamiento tales como revestimientos de semillas, tubérculos, células de la ¦ epidermis y células de semillas. Aún otro aspecto de la invención se refiere a una planta modificada genéticamente (= planta transgénica) , preferiblemente un cultivo de aceite como se mencionó anteriormente, o un hongo modificado genéticamente (= hongo transgénico) , en especial preferiblemente un hongo del género Phytophthora o una planta en la cual se ha introducido un gen PSE, preferiblemente de un Oomycete tal como, ventajosamente, la Phytophthora infestans, o en la cual se ha modificado un gen PSE. En una modalidad, el genoma de la Phytophthora infestans se ha modificado introduciendo, como transgen, una molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención que codifica una secuencia PSE de tipo silvestre o mutada. En otra modalidad, se ha modificado un gen PSE endógeno en el genoma del Oomycete Phytophthora infestans, es decir destruido funcionalmente, mediante su recombinación homologa con un gen PSE modificado. En una modalidad preferida, el organismo de la planta pertenece al género Physcomitrella , Ceratodon o Funaria, siendo preferida la Physcomitrella. En una modalidad preferida, también se utiliza la planta de Physcomitrella para producir un compuesto deseado tales como lípidos o ácidos grasos, siendo especialmente preferidos los PUFAs.

En—aún—otra—modalidad ?t-pfp-H da f ¡g puede utilizar el Oomycete Phytophthora infestans para demostrar una función de un gen de moho utilizando recombinación homologa en base a los ácidos nucleicos descritos en la invención de la patente. Aún otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislado, un gen o parte de PSE, por ejemplo una parte activa biológicamente, del mismo. En una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico aislado, la PSE, o parte de la misma puede participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas células en un microorganismo o una célula de planta o en el transporte de moléculas a través de sus membranas. En una modalidad preferida adicional, la secuencia de ácido nucleico aislado, la PSE o parte del mismo tiene suficiente homología con una secuencia de aminoácidos de la SEC . ID NO: 2, para esta proteína o parte de la misma, retiene la capacidad de participar en el metabolismo de compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en microorganismos o células de plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas . La invención también proporciona una preparación aislada de una PSE (proteína PSE) . En las modalidades preferidas, la secuencia de ácido nucleico de la invención o el gen PSE comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2. En una—modalidad proferida-,—adicional-, La invención se refiere a una proteína aislada de longitud completa la cual es esencialmente homologa con una secuencia de aminoácidos completa de la SEC. ID NO: 2 (la cual se codifica mediante la estructura de lectura abierta mostrada en la SEC. ID NO: 1) . En una modalidad adicional, la proteína tiene al menos aproximadamente 50%, de manera preferible al menos 60%, de manera más preferible al menos aproximadamente 70%, 80% ó 90% y de manera más preferible al menos aproximadamente del 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homología (= identidad) con una secuencia de aminoácidos de la secuencia SEC. ID NO: 2. En otras modalidades, la secuencia de ácido nucleico aislado y la PSE comprenden una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos aproximadamente 50% de homología con una de las secuencias de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 y la cual puede participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de los ácidos grasos en un microorganismo o una célula de planta o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o tiene una o más actividades para el alargamiento del PUFA, el alargamiento se refiere ventajosamente a cadenas de carbono no saturadas con Ci6 y/o Cíe con enlaces dobles en al menos dos posiciones. Como una alternativa, la proteína PSE aislada puede comprender una secuencia de aminoácidos la cual se codifica median e» una—s&Gi&nn,ij¾_¾-p micleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO : 1, por ejemplo bajo condiciones severas, o la cual tiene al menos aproximadamente 50%, de manera preferible al menos 60%, de manera más preferible al menos aproximadamente 70%, 80% ó 90% y de manera aún más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homología con la misma. También se prefieren las formas PSE preferidas por tener una de las actividades PSE descritas aquí. El polipéptido PSE o una parte activa biológicamente del mismo por lo tanto se puede enlazar funcionalmente a un polipéptido que no es de PSE para formar una proteína de fusión. En modalidades preferidas, esta proteína de fusión tiene una actividad la cual difiere de aquélla del PSE solo. En otras modalidades preferidas, esta proteína de fusión participa en el metabolismo de los compuestos que se requieren ventajosamente para la síntesis de los lípidos y ácidos grasos, cof ctores y enzimas en microorganismos o plantas, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. En modalidades especialmente preferidas, la introducción de esta proteína de fusión en una célula hospedera, modula la producción de un compuesto deseado, tal como, ventajosamente, la síntesis de los PUFAs mediante la célula. En una modalidad preferida, estas proteínas de fusión también contienen actividades de—?-4—¿ ?-5-- é—A- - eeaturasa-, sol as o en combinación . Otro aspecto de la invención se refiere a un proceso para la producción de una sustancia química fina ventajosamente de ácidos grasos insaturados y/o ácidos grasos insaturados de lípidos.- Este proceso comprende ya sea cultivar un microorganismo adecuado o cultivar células de plantas, tejidos de plantas, órganos de plantas o plantas intactas que comprenden la secuencia de nucleótidos de conformidad con la invención de la SEC. ID NO: 1 ó sus homólogos, derivados o análogos o una estructura genética que comprende la SEC. ID NO: 1 ó sus homólogos, derivados o análogos, o un vector que comprende estas secuencias o la estructura genética la cual produce la expresión de una molécula de ácido nucleico de PSE de conformidad con la invención de modo que se produzca una sustancia química fina. En una modalidad preferida, el proceso comprende además el paso de obtener una célula que comprende tal secuencia de ácido nucleico de la elongasa de conformidad con la invención, en la cual se transforma una célula con una secuencia de ácido nucleico de elongasa, una estructura genética o un vector el cual produce la expresión de un ácido nucleico de PSE de conformidad con la invención. En una modalidad preferida adicional, este proceso comprende además la etapa de obtener la sustancia química fina del cultivo. En una modalidad especialmente preferida, la célula pertenece a la clase de la Ciliata, a microorganismos tales como hongos, o al reino vegetal, en particular a cultivos de aceite, con microorganismos o cultivos de aceite que son especialmente preferidos . Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para modular la producción de una molécula mediante un microorganismo. Estos métodos comprenden combinar la célula con una sustancia la cual modula la actividad del PSE o la expresión del ácido nucleico de PSE de modo que se modifique una actividad asociada con las células con relación a la misma actividad en la ausencia de la sustancia. En una modalidad preferida, una ruta metabólica, o dos rutas metabólicas, (e) , de la célula para lípidos y ácidos grasos, cofactores y enzimas, se o son, modulados o el transporte de los compuestos a través de estas membranas se modula de modo que el rendimiento o se mejora la relación de producción de una sustancia química fina deseada mediante este microorganismo. La sustancia que modula la actividad del PSE puede ser una sustancia que estimule la actividad del PSE o la expresión del ácido nucleico de PSE o que se pueda utilizar como intermediario en la biosíntesis del ácido graso. Los ejemplos de sustancias que estimulen la actividad del PSE o la expresión de los ácidos nucleicos del PSE son, entre otros, moléculas pequeñas, PSEs activos y ácidos nucleicos que codifican los PSEs que se han introducido en la célula. Los ejemplos de sustancias que exhiban la actividad del PSE o la expresión del PSE son, entre otros, moléculas pequeñas y moléculas de ácido nucleico del PSE antisentido. Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para modular los rendimientos de un compuesto deseado de una célula, la cual comprende introducir, en una célula, un gen PSE mutante o de tipo silvestre o un ácido nucleico mutante o de tipo silvestre de la invención el cual se mantiene ya sea en un plásmido separado o integrado en el genoma de la célula hospedera. En el caso de la integración en el genoma, la integración puede ser al azar o tener lugar mediante la recombinación de tal manera que la secuencia de ácido nucleico nativo o el gen nativo se reemplaza por la copia que se introdujo, modulando así la producción del compuesto deseado mediante la célula, o utilizando un gen en trans, de modo que el gen se enlace funcionalmente a una unidad de expresión funcional que comprende al menos una secuencia la cual facilite la expresión de un gen y al menos una secuencia que facilite la poliadenilación de un gen transcrito funcionalmente o del ácido nucleico.

En una modalidad preferida, se modifican los rendimientos. En una modalidad adicional, se incrementa la sustancia química deseada, lo cual hace posible reducir los compuestos indeseados que tiene un efecto negativo. En una modalidad especialmente preferida, la sustancia química fina deseada es un lípido o ácido graso, un cofactor o una enzima. En una modalidad especialmente preferida, esta sustancia química es un ácido graso poliinsaturado. Más preferiblemente, la misma se selecciona de entre ácido araquidónico (ARA) , ácido eicosapentaenóico (EPA) o ácido docosahexaenóico (DHA) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un ácido nucleico de PSE y una molécula de proteína la cual participa en el metabolismo de los lipidos y ácidos grasos, cofactores de PUFA y enzimas en el Oomycete Phytophthora infestans o en el transporte de compuestos lipofílicos a través de membranas. Los compuestos de conformidad con la invención se pueden utilizar para modular la producción de sustancias químicas finas de organismos, por ejemplo microorganismos, tales como ciliados, hongos, levaduras, bacterias, algas, y/o plantas tales como el maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, abrojo, especie Brassica, tales como semillas oleaginosas de colza, abrojo, cañóla y 3 nabina —pimienta-,—girasol-,—barraj a , hisrha del asno u onagra y tagetes, plantas solanáceas tales como papa, tabaco, berenjena y tomate, especie Vicia, guisante, yuca, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, té) , especie Salix, árboles (palma de aceite, coco) y pastos perennes y cultivos de forraje, ya sea directamente (por ejemplo cuando la sobre-expresión u optimización de una proteína para la biosíntesis del ácido graso tiene una influencia directa en el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción del ácido graso de organismos modificados) o los mismos pueden tener un efecto indirecto el cual no obstante conduce a un rendimiento incrementado, producción y/o eficiencia en la producción de un compuesto deseado o a una disminución en los compuestos indeseados (por ejemplo cuando la modulación del metabolismo del lípido y ácido graso, cofactor y enzima conduce a cambios en el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción o en la composición de los compuestos deseados dentro de las células, lo cual, a su vez, puede afectar la producción de una o más sustancias químicas finas) . Los aspectos de la invención se ilustran con mayor detalle aquí posteriormente.

I . Sustancias químicas finas y PUFAs El término "sustancias químicas finas" es conocido en la técnica y comprende moléculas las cuales se han producido med-iaafee ^u organismo -las iia1ññ_s.e utilizan en una variedad de industrias tales como, a manera de ejemplo pero no a manera de limitación, la industria de fármacos, la agroindustria, la industria alimenticia y la industria de cosméticos. Estos compuestos comprenden lípidos, ácidos grasos, cofactores y enzimas y similares (como se describe, por ejemplo, en Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp . 561-612, en Biotechnology Vol . 6, Rehm et al., Ed. , VCH: y las referencias citadas en las mismas) , lípidos, ácidos grasos saturados e insaturados (por ejemplo ácido araquidónico) , vitaminas y cofactores (como se describe en Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, Vitamins, pp. 443-613 (1996) : VCH einheim y las referencias citadas en las mismas; y Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health. and Disease Proceedings of the U ESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, llevada a cabo del 1-3 de Sep. de 1994 en Penang, Malasia, AOCS Press (1995)), las enzimas y las restantes sustancias químicas descritas en Gutcho (1983) en Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086, y las referencias citadas en las mismas. El metabolismo y los usos de ciertas sustancias químicas finas se ilustran con mayor detalle aquí posteriormente.

La combinación de varias moléculas precursoras y enzimas biosintéticas conduce a la producción de diversas moléculas de ácido graso, lo cual tiene un efecto decisivo en la composición de la membrana. Se puede asumir que los PUFAs no solamente se acaban de incorporar en el triacilglicerol , sino que también en los lipidos de la membrana. La síntesis de la membrana es un proceso bien caracterizado en el cual se involucra cierto número de componentes, inclusive de lipidos como parte de la membrana de dos capas. La producción de nuevos ácidos grasos tales como los PUFAs por lo tanto genera nuevas propiedades de funciones de la membrana dentro de una célula o un organismo. Las membranas celulares prestan una multiplicidad de funciones en una célula. Por encima de todo, una membrana delimita el contenido de una célula del medio ambiente, impartiendo así integridad a la célula. Las membranas también pueden actuar como barreras contra el influjo de compuestos peligrosos y no deseados o bien contra la emanación de compuestos deseados . Para descripciones más detalladas e implicaciones de las membranas y los mecanismos involucrados, ver Bamberg, E., et al. (1993) Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26:1-25; Gennis, R.B. (1989) Pores, Channels and Transporters , in: Biomembranes , Molecular Structure and Function, Sprinqer: Heidelberq, pp. 270-322; y Nikaido, H . , y Saier, H. (1992) Transport proteins in bacteria: common themes in their design, Science 258:936-942, y las citas bibliográficas en cada una de estas referencias. La síntesis de lípidos se puede dividir en dos partes: la síntesis de ácidos grasos y su enlace al sn-glicerol -3 -fosfato, y la adición o modificación de un grupo de cabeza polar. Los lípidos habituales utilizados en las membranas comprenden fosfolípidos , glicolípidos , esfingolípidos y fosfoglicéridos . La síntesis el ácido graso comienza con la conversión del acetil-CoA ya sea en malonil-CoA por acetil-CoA carboxilasa o en acetil-ACP por acetil transacilasa . Después de una reacción de condensación, estas dos moléculas productoras conjuntamente forman acetoacetil-ACP, la cual se convierte a través de una serie de reacciones de condensación, reducción y deshidratación para dar una molécula de . cido graso con la longitud de cadena deseada. La producción de los ácidos grasos insaturados de estas moléculas, se cataliza mediante desaturasas específicas, ya sea aeróbicamente por medio de oxígeno molecular o anaeróbicamente (con respecto a la síntesis del ácido graso en microorganismos, ver F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., pp. 612-636 y las referencias contenidas en las mismas; Lengeler et al. (Ed.) (1999) Biology of Precariotes-.—Thieme :—Stttttga-rt-,—Ne —York,— —Las r ferencia.s_ contenidas en las mismas, y Magnuson, K. , et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 y las referencias contenidas en las mismas) . Los ejemplos de precursores para la biosíntesis de PUFA, son ácido palmitoleico, linólico y linolénico. Estos ácidos grasos con Ci6 y/o Ci8 se deben alargar a C2o y C22 para dar ácidos grasos del tipo de cadena eicosa y docosa. Este alargamiento preferiblemente se efectúa con la ayuda de los ácidos nucleicos de conformidad con la invención, de las proteínas codificadas por estos ácidos nucleicos. Varias desaturasas tales como las enzimas que tienen ?-6-desaturasa, actividad de ?-5- y ?-4 -desaturasa, pueden conducir al ácido araquidónico, ácido eicosapentenóico y ácido docosahexaenóico y algunos otros PUFAs de cadena larga que se pueden extraer y utilizar para diversos propósitos en forraje y alimentos, aplicaciones cosméticas o farmacéuticas. Para producir PUFAs de cadena larga, los ácidos grasos poliinsaturados con C16 y/o Ci8, se deben alargar como se menciona anteriormente, mediante al menos dos átomos de carbono mediante la actividad enzimática de una elongasa. Las secuencias de ácido nucleico de conformidad con la invención codifican primero las elongasas de las plantas las cuales son eapaees—de—aiarga —los—ácidos—grasos—con— —y o C18 con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso mediante al menos dos átomos de carbono. Después de un ciclo de alargamiento, esta actividad enzimática conduce a ácidos grasos con Ci6 ó Cíe, y después dos, tres y cuatro o cinco ciclos de alargamiento a ácidos grasos con C22, C24 ó C26- Los PUFAs más largos también se pueden sintetizar con las elongasas de conformidad con la invención. La actividad de las elongasas de conformidad con la invención preferiblemente conduce a ácidos grasos con C2o ó C22 con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferiblemente con tres o cuatro enlaces dobles, en especial preferiblemente tres enlaces dobles, en la molécula de ácido graso. Después del alargamiento con las enzimas de conformidad con la invención, se pueden llevar a cabo pasos adicionales de desaturación. Por consiguiente, es posible que los productos de las actividades de elongasa y de la desaturación adicional, conduzcan a PUFAs preferidos con un grado superior de desaturación, tal como ácido docosadienóico, ácido araquidónico, ácido co6-eicosatriendihomo-?—linolénico, ácido eicosapentenóico, ácido a>3-eicosatrienóico, ácido o3 -eicosatetraenóico, ácido docosapentaenóico ó ácido docosahexaenóico . Los ejemplos de substratos—de- esta—ac-t-i-vidad -enzi.má.tica_de_ conformidad con 1 q ácido linoleico, ácido ?-linolénico, ácido pinolénico, ácido a-linolénico o ácido estearidónico . Los substratos preferidos son ácido linólico, ácido ?-linolénico y/o ácido a-linolénico . Los ácidos grasos con C16 y/o Ci8 con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso, se pueden alargar mediante la actividad enzimática de conformidad con la invención en la forma del ácido graso libre o en la forma de los esteres, tales como fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, fosfoglicéridos, monoacilglicerol , diacilglicerol o triacilglicerol . Además, los ácidos grasos se deben transportar subsecuentemente a diversas modificaciones e incorporar en el lípido para el almacenamiento de triacilglicerol. Otro paso importante en la síntesis de lípidos es la transferencia de ácidos grasos a los grupos de cabeza polar, por ejemplo mediante el ácido graso de glicerol aciltransferasa (ver Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5) : 161-166) . Además, la expresión de los ácidos nucleicos de conformidad con la invención en los diversos organismos hospederos no solamente provoca un cambio en la composición de los lípidos de la membrana, sino que también modifica la -composición, de todos -Los- compues os_en__l_a_ __c_élula Jios edera_la cual comprende ácidos grasos insaturados, por encima de las células hospederas originales las cuales no comprenden los ácidos nucleicos, o las cuales no comprenden los mismos en tales cantidades. Estas modificaciones son más pronunciadas en organismos hospederos, por ejemplo células de plantas, las cuales no comprenden de manera natural las proteínas, o enzimas, codificadas por los ácidos nucleicos. La expresión de los ácidos nucleicos por consiguiente da lugar a nuevas composiciones líquidas, las cuales son un aspecto adicional de la invención. Para publicaciones acerca de la biosíntesis del ácido graso de las plantas, la desaturación, el metabolismo de lípidos y el transporte de las membranas de compuestos grasos, la beta-oxidación, la modificación y cofactores de ácidos grasos, el almacenamiento y ensamble del triacilglicerol inclusive de las referencias citadas en las mismas, ver los siguientes artículos: Kinney, 1997, Genetic Engineering, Ed. : JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge y Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin y Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol. Biol . 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engineering, Ed. : JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt , 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Gühnemann-Sch fer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, en: Biochemistry and Molecular Biology of embrane and Storage Lipids of Plants, Ed. : Murata y Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists , 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13 (1) :1-16. Las vitaminas, cofactores y "nutracéticos" , tales como los PUFAs, comprenden un grupo de moléculas las cuales los animales superiores ya no pueden sintetizar y por lo tanto tienen que absorberlas, o las cuales los animales superiores ya no pueden sintetizar por sí mismos a un grado suficiente y por lo tanto las deben absorber adicionalmente , aún cuando las mismas se sintetizan fácilmente por otros organismos tales como las bacterias. La biosíntesis de estas moléculas en organismos las cuales sean capaces de producir las mismas, tal como en las bacterias, ha sido más o menos caracterizada (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp. 443-613, VCH einheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the U ESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, llevada a cabo del 1-3 de Sep. de 1994, en Penang, Malasia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 pp) . _Las molácul as antes mencionadas son ya sea moléculas activas biológicamente en sí mismas o precursores de sustancias activas biológicamente las cuales actúan ya sea como portadores de electrones o como intermediarios en una multiplicidad de rutas metabólicas. Además de su valor nutricional, estos compuestos también tienen un valor industrial significativo como colorantes, antioxidantes y catalizadores u otros auxiliares de procesamiento. (Para una revisión de estructura, actividad y aplicaciones industriales de estos compuestos, ver, por ejemplo, Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" , Vol . A27, pp. 443-613, VCH Weinheim, 1996) . Los ácidos grasos poliinsaturados tienen una variedad de funciones y efectos promotores de la salud, por ejemplo en el caso de un padecimiento coronario cardiaco, los mecanismos inflamatorios, la nutrición de niños y similares. Para publicaciones y referencias que incluyen las referencias citadas en las mismas, ver: Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70 (3rd. Suppl . ) : 560-569, Takahata et al., Biosc. Biotechnol . Biochem. 1998, 62 (11) : 2079-2085, Willich y Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120(7) :229 et seq. Los mismos además son importantes materiales de partida para la síntesis de los compuestos que controlan los procesos biológicos importantes dentro del organismo. Los alimentos dietéticos o en medicamentos.

II. Elementos y proceso de la invención La presente invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de nuevas moléculas llamadas aquí moléculas de ácido nucleico PSE y proteína PSE, las cuales ejercen un efecto en la producción de membranas celulares o ácidos grasos como en la Physcomitrella patens, Ceratodon purpureus y/o Phytophthora infestans y, por ejemplo, tienen un efecto en el movimiento de moléculas a través de estas membranas." En una modalidad, las moléculas PSE participan en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares y/o ácidos grasos en organismos tales como microorganismos y plantas o afectan indirectamente el transporte de moléculas a través de estas membranas. En una modalidad preferida, la actividad de las moléculas PSE de conformidad con la invención que regula la producción de los componentes de membrana y el transporte de membranas, tiene un efecto en la producción de la sustancia química fina deseada por este organismo. En una modalidad especialmente preferida, la actividad de las moléculas PSE de conformidad con la invención, se modula de tal manera que el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de las rutas meta-bótáreas de ios—mióroorgan-ismos o—plantas las cuales regulan los PSEs de conformidad con la invención, se modulan y la eficiencia en el transporte de compuestos a través de las membranas se modifica, la cual modula ya sea directa o indirectamente el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de una sustancia química fina deseada por los microorganismos y plantas. El término PSE o polipéptido PSE comprende proteínas las cuales participan en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en organismos tales como los microorganismos y plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. Los ejemplos de PSEs descritos en la SEC. ID NO: 1 ó sus homólogos, derivados o análogos. Los términos PSE o secuencia (s) de ácido nucleico PSE comprenden secuencias de ácido nucleico las cuales codifican un PSE y parte de la misma es una región de codificación y también regiones correspondientes de una secuencia no traducida de 5' y 3'. Los ejemplos de genes PSE son las secuencias mostradas en la SEC. ID NO: 1. Los términos producción y productividad son conocidos en la técnica y comprenden la concentración del producto de fermentación (por ejemplo de la sustancia química fina deseada) la cual se forma dentro de un cierto periodo y en un cierto volumen de fermentación (por ejemplo kg de producto/carbono es conocido en la técnica y comprende la eficiencia con la cual la fuente de carbono se convierte en el producto (es decir la sustancia química fina) . Esto se expresa usualmente como, por e emplo, kg de producto por kg de fuente de carbono. Incrementado el rendimiento o producción del compuesto se incrementa la cantidad de las moléculas obtenidas o de las moléculas adecuadas de este compuesto obtenido en una cantidad específica de cultivo durante un periodo definido. Los términos biosíntesis o ruta biosintética son conocidos en la técnica y comprenden la síntesis de un compuesto, preferiblemente de un compuesto orgánico, mediante una célula de los intermediarios, por ejemplo en un proceso de pasos múltiples el cual se somete a una fuerte regulación. El término catabolismo o ruta catabólica son conocidos en la técnica y comprenden la escisión de un compuesto, preferiblemente de un compuesto orgánico, mediante una célula en los catabolitos (en general moléculas más pequeñas o menos complejas) , por ejemplo en un proceso de pasos múltiples el cual se somete a una fuerte regulación. El téi-m no metabolismo es conocido en la técnica y comprende la totalidad de las reacciones bioquímicas las cuales tienen lugar en un organismo. El metabolismo de cierto compuesto (por ejemplo el metabolismo de un ácido graso) por consiguiente comprende la totalidad de las rutas biosintéticas , de modificación y catabólicas de este compuesto en la célula, las cuales son importantes para este compuesto. En otra modalidad, las moléculas PSE de conformidad con la invención, pueden modular la producción de una molécula deseada, tal como una sustancia química fina, en un microorganismo o en plantas. Existe una serie de mecanismos mediante los cuales la modificación de un PSR de conformidad con la invención, pueden afectar directamente el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de una sustancia química fina a partir de una cepa de un microorganismo o la cepa de una planta que comprenda esta proteína modificada. El número o actividad de PSEs que participan en el transporte de moléculas de sustancias químicas finas dentro, o fuera de, la célula se puede incrementar, de modo que se transporten cantidades mayores de estos compuestos a . través de las membranas, a partir de las cuales las mismas se pueden obtener y convertir entre sí con mayor facilidad. Además, los ácidos grasos, triacilgliceroles y/o lípidos son en sí mismos sustancias químicas finas deseables; que optimizan la actividad o incrementan el número de uno o más PSEs de conformidad con la invención, que participan en la biosíntesis de estos compuéstos, o interfieren con la actividad de uno más PSEs los cuales participan en el catabolismo de estos compuestos que hace posible incrementar el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de molécula de ácido graso y moléculas de lípidos de organismos tales como microorganismos o plantas. La mutagénesis de los ácidos nucleicos o genes PSE de conformidad con la invención también puede dar lugar a PSEs con actividades modificadas las cuales afectan indirectamente la producción de una o más sustancias químicas finas deseadas de los microorganismos o plantas. Por ejemplo, los PSEs de conformidad con la invención los cuales participan en la exportación de productos residuales, pueden exhibir un mayor número de actividad superior, de modo que los productos residuales, metabólicos, normales, de la célula (cuya cantidad se podría incrementar debido a la sobreproducción de la sustancia química fina deseada) , se exporten eficientemente antes de que los mismos dañen las moléculas en la célula (lo cual podría reducir la viabilidad de las células) o interferir con las rutas biosintéticas de las sustancias químicas finas (lo cual podría reducir el rendimiento, producción o eficiencia—en—1a—r^duc-ci n—de—una—sust.an.c a química fina deseada) . Las cantidades intracelulares relativamente grandes de la sustancia química fina deseada, en sí mismas además pueden ser tóxicas para la célula, de modo que el incremento la actividad o número de transportadores capaces de exportar estos compuestos de la célula, da como resultado una viabilidad incrementada de la célula en el cultivo, lo cual, a su vez, conduce a un número superior de células en el cultivo lo cual produce la sustancia química fina deseada. Los PSEs de conformidad con la invención también se pueden manipular de tal manera que se produzcan las correspondientes cantidades de diferentes moléculas de lípidos y molécula de ácido graso. Esto puede tener un efecto sustancial en la composición de los lípidos de la membrana celular. Puesto que cada tipo de lípido tiene diferentes propiedades físicas, una modificación de la composición de lípidos de una membrana puede modificar significativamente la fluidez de la membrana. Las modificaciones de la fluidez de la membrana puede afectar el transporte de moléculas a través de la membrana y la integridad de las células, cada una de las cuales tiene un efecto sustancial en la producción de sustancias químicas finas de microorganismos y plantas en un cultivo de fermentación a gran escala. Las membranas de las plantas imparten propiedades específicas tales como tolerancia a las bempea attHras—altas—y—baj as-,—si,—sequedad—y—nl ^rancia con respecto a patógenos tales como las bacterias y hongos. La modulación de los componentes de la membrana por lo tanto puede tener un efecto crítico en la capacidad de las plantas para sobrevivir bajo los parámetros de tensión antes mencionados. Esto puede tener lugar a través de los cambios en las cascadas de señales o directamente a través de la composición de la membrana modificada (ver, por ejemplo, Chapman, 1998, Trends in Plant Science, 3 (11) :419-426) y las cascadas de señales (ver Wang 1999, Plant Physiology, 120:645-651) ó afectar la tolerancia de temperaturas bajas, como se describe en O 95/18222. Las secuencias de ácido nucleico aislado de conformidad con la invención, están presentes en el genoma de una cepa de Phytophthora infestans la cual está disponible, por ejemplo, a través de las colecciones ATCC ó DSM. La secuencia de nucleótidos del ADNc aislado de Physcomitrella patens y las secuencias de aminoácidos derivadas de las PSEs de Phytophthora infestans se muestran en la SEC. ID NO : 1 y 2, respectivamente. Se llevan a cabo análisis por computadora los cuales clasifican y/o identifican estas secuencias de nucleótidos como secuencias que codifican las proteínas que participan en el metabolismo de los componentes de la membrana celular o que participan en el transporte de compuestos a través de las membranas celulares o ácidos grasos. Una F.ñT con el No. acceso de la base de datos 08_ckl9_b07 del inventor es parte de la secuencia mostrada en la SEC. ID NO : 1. Mientras tanto estas ESTs se renombran, lo cual lleva al nombre enmendado: pp001019019f . De manera similar, el polipéptido parcial se nombró pp001019019f . El fragmento- inserto completo de la EST pp001019019f se secuenció y dio como resultado la SEC. ID NO: 1, la cual muestra la secuencia completa de pp001019019f . Esta comprende un clon completo, activo funcionalmente, el cual surge, después de la expresión específica en una levadura, que tiene la especificidad del substrato deseado como se muestra en la sección de ejemplos. Las levaduras también son organismos adecuados de conformidad con la invención, por ejemplo como células hospederas para los genes, estructuras de genes o vectores de conformidad con la invención. La presente invención también se refiere a proteínas con una secuencia de aminoácidos la cual es esencialmente homologa con (idéntica a) una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2. Como se utiliza en el presente contexto, una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es esencialmente homologa con una secuencia de aminoácidos seleccionada, tiene al menos aproximadamente 50% de homología con la secuencia de aminoácidos seleccionada, por ejemplo la secuencia de aminoácidos completa. seleccionada. Una rnfpfna con una_ secuencia de aminoácidos la cual es esencialmente homologa con una secuencia de aminoácidos seleccionada, también puede tener al menos aproximadamente 50 a 60%, de manera preferible al menos aproximadamente 60 a 70%, de manera más preferible al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90% ó 90 a 95%, y de manera más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% ó más homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada . La PSE de conformidad con la invención o la parte activa biológicamente o el fragmento de la misma puede participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o tiene una o más de las actividades requeridas para el alargamiento de los PUFAs con Ci8 de modo que se obtengan PUFAs con C22 ó C24 y PUFAs relacionados. Varios aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las sub-secciones que siguen.

A. Moléculas aisladas de ácido nucleico Una modalidad de la invención comprende un ácido nucleico aislado derivado de una cepa de Oomycete y que codifica un polipéptido que alarga un ácido graso con C16 y/o al menos dos átomos de carbono. Una modalidad adicional de conformidad con la invención es un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido el cual alarga los ácidos grasos con Ci6 y/o Ci8 con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso, seleccionado del grupo que consiste de a) una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC. ID NO: 1, b) una secuencia de ácido nucleico la cual, de conformidad con la degeneración del código genético, se deriva de la secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 1, c) derivados de la secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 1 la cual codifica los polipéptidos con al menos 50% de homología con la secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2, la secuencia que actúa como elongasa con Ci6 ó Ci8. El ácido nucleico antes mencionado se deriva de organismos tales como ciliados, hongos, algas o dinoflagelados los cuales son capaces de sintetizar los PUFAs, preferiblemente de las plantas u hongos, en especial particularmente del género Phytophthora, y más preferiblemente de Phytophthora infestans .

Un— spe &e—de—ia—ia-veación—se—retiere a mo_Lé.culas_ aisladas de ácido nucleico las cuales codifican los polipéptidos PSE o partes biológicamente activas de los mismos, y a fragmentos de ácido nucleico los cuales son suficientes para su uso como sondas o cebadores de hibridación para identificar o amplificar un ácido nucleico que codifica el PSE (por ejemplo el ADN de PSE) . Se pretende que el término "molécula de ácido nucleico" como se utiliza en el presente contexto comprenda moléculas de ADN de doble hebra o de una sola hebra (por ejemplo ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo ARNm) y análogos de ADN o ARN los cuales se generan por medio de análogos de nucleótidos, o híbridos de ADN/ARN. Este término comprende adicionalmente la secuencia no traducida en el extremo 3' y 5' de la región de codificación del gen: al menos aproximadamente 100 nucleótidos de la secuencia corriente arriba del extremo 5' de la región de codificación y al menos aproximadamente 20 nucleótidos de la secuencia corriente abajo del extremo 3' de la región de codificación del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es de ADN de doble hebra. Una molécula "aislada" de ácido nucleico se separa de otras moléculas de ácido nucleico las cuales están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un ácido nucleico "aislado" preferiblemente no tiene secuencias que—flanqueen—por —naturaleza— l—ácido—nucleico—en el ADJtL genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) . En las diversas modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico PSE puede contener, por ejemplo, secuencias de nucleotidos de aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ó 0.1 kb las cuales flanquean de por naturaleza la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo una célula de Physcomitrella patens) . Una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, además puede estar esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo si la misma se genera mediante técnicas recombinantes , o de precursores químicos u otras sustancias químicas si la misma se sintetiza químicamente . Una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la invención, por ejemplo una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleotidos de la SEC. ID NO: 1 ó una parte de la misma, se puede aislar utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en la misma. Por ejemplo, se puede aislar un ADNc de Phytophthora infestans a partir de una genoteca de P. infestans utilizando la SEC. ID NO: 1 completa o parte de la misma como sonda de hibridación y técirLcas de hibr dación. estándar (tal como, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Además, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia completa de la SEC. ID NO: 1 ó una parte de la misma, se puede aislar mediante una reacción en cadena de polimerasa, cuando los cebadores de oligonucleótidos que se generan en base a esta secuencia o partes de la misma, en particular se pueden utilizar las regiones alrededor de las porciones His-Box, ver Shanklin et al. (1994) Biochemistry 33, 12787-12794 (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia completa de la SEC. ID NO: 1 ó una parte de la misma se puede utilizar aislada mediante la reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos los cuales se han generado en base a esta misma secuencia de la SEC. ID NO: 1) . Por ejemplo, se puede aislar el ARNm de las células de Oomycete (por ejemplo mediante el método de extracción con guanidio-tioacianato de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299), y se puede generar el ADNc por medio de transcriptasa inversa (por ejemplo transcriptasa inversa de Moloney MLV, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o transcriptasa inversa, disponible de Seikagaku America, Inc., St . Petersburg, FL) . Loa csharinrps p ni -i gnnnrl pór i dos sintéticos para amplificación por medio de la reacción en cadena de polimerasa, se pueden generar en base a una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC. ID NO: 1. Un ácido nucleico de conformidad con la invención se puede amplificar utilizando ADNc o, de manera alternativa, utilizando el ADN genómico como plantilla y cebadores de oligonucleótidos adecuados, de conformidad con las técnicas estándar de amplificación con PCR. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector adecuado y caracterizar por medio de un análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos PSE, se pueden generar mediante métodos de síntesis estándar, por ejemplo con un sintetizador de ADN automático. El ADNc mostrado en la SEC . ID NO : 1 comprende secuencias que codifican los PSEs (es decir la "región de codificación") y también secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender solamente la región de codificación de una de las secuencias en la SEC. ID NO: 1 ó puede comprender fragmentos genómicos, completos, aislados del ADN genómico .

En una modalidad pr-pf?-? aiii ci nnalment-e-, La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la invención, comprende una molécula . de ácido nucleico la cual es un complemento de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC . ID NO: 1 6 de una parte de la misma. Una molécula de ácido nucleico la cual es complementaria para una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC. ID NO: 1 es una molécula de ácido nucleico la cual es suficientemente complementaria para una de las secuencias de nucleótidos mostrada en la SEC. ID NO: 1 con el fin de hibridizarse con una de las secuencias establecidas en la SEC. ID NO: 1, formando de éste modo un dúplex estable. Homólogos de las nuevas secuencias del ácido nucleico de la elongasa con la secuencia SEC. ID NO: 1 significa, por ejemplo, variantes alélicas con al menos aproximadamente 50 a 60%, de manera preferible al menos aproximadamente 60 a 70%, de manera más preferible al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90% ó 90 a 95%, y de manera aún más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más homología con una de las secuencias de nucleótidos mostrada en la SEC. ID NO: l o sus homólogos, derivados o análogos partes de los mismos, homología significa identidad en el contexto de la invención. En una modalidad preferida adicionalmente, una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la invención—eemprende—ima—secuencia—de—nucleó-tidos—La cual se_ hibridiza con una de las secuencias de nucleotidos mostrada en la SEC. ID NO: 1 6 una parte de la misma, por ejemplo bajo condiciones severas. Las variantes alélicas comprenden, en particular, variantes funcionales las cuales se pueden obtener mediante la eliminación, inserción o sustitución de nucleotidos de/en la secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 1, siendo la misma, sin embargo, deseada para la actividad enzimática de las proteínas resultantes las cuales se sintetizan para que sean ventajosamente retenidas para la inserción de uno o más genes. Proteínas que retienen la actividad enzimática de la elongasa significa proteínas con al menos 10%, preferiblemente 20%, en especial preferiblemente 30%, de manera muy especial preferiblemente 40% de la actividad enzimática original comparada con la proteína codificada por la SEC. ID NO: 2. Homólogos de la SEC. ID NO: 1 significa también, por ejemplo, homólogos de bacterias, hongos y plantas, secuencias truncadas, ADN o ARN de una sola hebra de la secuencia de ADN de codificación y no-codificación. Homólogos de la SEC. ID NO: 1 significa también derivados tales como, por ejemplo, variantes de promotores. Los promotores corriente arriba de las secuencias de nucleotidos se pueden modificar mediante una o más de las sustituciones de nucleótidos mediante inse ci-ón-Ces.) yo-eliminación (es) , por el contrario, sin interferir con la funcionalidad o actividad de los promotores. Además es posible que la actividad de los promotores se incremente mediante la modificación de su secuencia o que los mismos sean reemplazados completamente por más promotores activos, inclusive de organismos heterólogos. Además, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención puede comprender solamente parte de la región de codificación de una de las secuencias en la SEC . ID NO: 1, por ejemplo un fragmento que se puede utilizar como sonda o cebador o un f agmento que codifique un segmento activo biológicamente de un PSE. Las secuencias de nucleótidos identificadas clonando el gen PSE de la P. infestans, permiten la generación de sondas y cebadores los cuales estén diseñados para identificar y/o clonar homólogos de PSE en otros tipos de células y organismos y homólogos de PSE de otros Oomycetes o especies relacionadas. La sonda/cebador normalmente comprende de manera esencial oligonucleótidos purificados. El oligonucleótido normalmente comprende una región de la secuencia de nucleótidos la cual se hibridiza bajo condiciones severas con al menos aproximadamente 12, de manera preferible aproximadamente 16, de manera más preferible aproximadamente 25, 40, 50 ó 75 nucleótidos sucesivos de una hebra sentido de las secuejicxas—es£able i-da-s—en la—SEC—IB—???-:—-,—de una hebra antisentido de una de las secuencias establecidas en la SEC. ID NO : 1, o sus homólogos, derivados y análogos o mutantes de origen natural de los mismos. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 1, se pueden utilizar en las reacciones PCR para clonar homólogos de PSE. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de PSE se pueden utilizar para detectar transcriptos o secuencias genómicas las cuales codifican las proteínas idénticas u homologas. En las modalidades preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo de etiquetado unido a la misma, por ejemplo un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Estas sondas" se pueden utilizar como parte de un equipo de prueba para marcadores genómicos para identificar células que expresen erróneamente un PSE, por ejemplo al medir una cantidad de ácido nucleico que codifica un PSE en una muestra celular, por ejemplo al medir el nivel de ARNm del PSE, o para determinar si se muta o elimina un gen de PSE genómica. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención codifica una proteína o parte de la misma la cual comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene suficiente homología con una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 para la proteína o parte de la misma que retenga la capacidad de participar en el m abolismo_ de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en microorganismos o plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o en la síntesis de ácidos grasos. Como se utiliza en el presente contexto, el término "suficiente homología" se refiere a proteínas o partes de las mismas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un número mínimo de residuos de aminoácidos (por ejemplo un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar, tal como un residuo de aminoácido en una de las secuencias de la SEC. ID NO: 2) los cuales son idénticos con o equivalentes a una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 de modo que la proteína o parte de la misma puedan participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en microorganismos o plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. Como se describe aquí, los componentes de proteínas de estas rutas metabólicas para los componentes de la membrana o sistemas de transporte de la membrana, pueden jugar un papel en la producción y secreción de una o más sustancias químicas finas. Los ejemplos de estas actividades también se describen aquí. Por consiguiente, la "función de un PSE" contribuye ya sea directa o indirectamente al rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de una o más sustancias químicas finas. Los ejemplos de eepe-cifieldades de-1 substato de ESE de La actividad catalítica, se establecen en la Tabla I. En una modalidad adicional, los derivados de la molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención, codifican las proteínas con al menos aproximadamente 50 a 60%, preferiblemente al menos aproximadamente 60 a 70% y de manera más preferible al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90% ó 90 a 95%, y de manera más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% ó más homología con una secuencia de aminoácidos completa de la SEC. ID NO: 2. La homología de la secuencia de aminoácidos, se determinó sobre la región de secuencia entera utilizando el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5, 1989.151-153) . Las partes de las proteínas codificadas mediante las moléculas de ácido nucleico de PSE de conformidad con la invención, de manera preferible son partes activas biológicamente de uno de los PSEs . Como se utilizó aquí, se pretende que el término parte activa biológicamente de un PSE" comprenda un segmento, por ejemplo un dominio/porción, de un PSE el cual pueda participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o la cual se involucre en la s i¾fce-sirs—de—á-eidoa—grasos —o—la— G«a-1—tenga—un achí vi dad establecida en la Tabla I. Se puede llevar a cabo un ensayo de la actividad enzimática con el fin de determinar si un PSE o una parte activa biológicamente de la misma pueden participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en microorganismos o plantas o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. Estos métodos de ensayo como se -describe con detalle en el Ejemplo 8 de la sección de ejemplos, son conocidos para un experto en la técnica. Los fragmentos adicionales de ácido nucleico los cuales codifican los segmentos activos biológicamente de un PSE, se pueden generar aislando parte de una de las secuencias en la SEC. ID NO: 2, expresando el segmento codificado del PSE o del péptido (por ejemplo mediante la expresión recombinante in vitro) y determinando la actividad de la parte codificada del PSE o del péptido. Además, la invención comprende moléculas de ácido nucleico las cuales difieren de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC. ID NO: 1 (y partes de la misma) debido a la degeneración del código genético y la cual por consiguiente codifica el mismo PSE como el único codificado por las. secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC. ID NO: 1. En otra modalidad, una molécula aislada de '©—nucleico—de—e-enformidad—e&R—íst—in-e-Reior-T—t-i@»e—una-secuencia de nucleotidos la cual codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC . ID NO: 2. En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico de conformidad con la invención, codifica una proteína de longitud completa de Phytophthora infestans la cual es esencialmente homologa con una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 (la cual se codifica mediante una estructura de lectura abierta mostrada en la SEC. ID NO: 1) . Además de la Phytophthora infestans, las secuencias de nucleotidos PSE mostradas en la SEC. ID NO: 1, el trabajador experto reconoce que pueden existir polimorfismos en la secuencia de ADN lo cual conduce a cambios en las secuencias de aminoácidos de los PSEs dentro de una población (por ejemplo la población de Phytophthora infestans) . Estos polimorfismos genéticos en el gen PSE pueden existir entre los individuos dentro una población debido a su variación natural . Como se utiliza en el presente contexto, el término "gen" y "gen recombinante" se refiere a moléculas de ácido nucleico con una estructura de lectura abierta la cual codifica un PSE, preferiblemente un PSE de Phytophthora infestans. Estas variantes naturales usualmente provocan una varianza del 1 al 5% en la secuencia de nucleotidos del gen PSE. Todas estas variaciones del nucleótido y polimorfismos resultantes del aminoácido en el PSE Ion nualps snn P1 fs l arln de £U_ variación natural y se pretende que no alteren la actividad funcional de los PSEs que están dentro del alcance de la invención . Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a las variantes naturales y no a los homólogos, derivados y análogos de la Phytophthora infestans del ADNc del PSE de la Phytophthora infestans de conformidad con la invención, se pueden aislar de conformidad con las técnicas de hibridación estándar bajo condiciones severas de hibridación debido a su homología con el ácido nucleico del PSE de la Phytophthora infestans descrito aquí utilizando el ADNc de la Phytophthora infestans o una parte del mismo como sondas de hibridación. En otra modalidad, una molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la invención, tiene un mínimo de 15 nucleótidos y se hibridiza bajo condiciones severas con la molécula de ácido nucleico la cual comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO : 1. En otras modalidades, el ácido nucleico tiene un mínimo de longitud de 25, 50, 100, 250 ó más nucleótidos. Se pretende que el término "se hibridiza bajo condiciones severas" como se utiliza en el presente contexto, describa las condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que tienen al menos 60% de homología entre sí, usualmente permanecen hibridizadas entre ai , T.as mnHi t-i nnss preferiblemente—son tales que las secuencias que tienen al menos aproximadamente 65%, de manera más preferible al menos aproximadamente 70% y aún de manera más preferible al menos aproximadamente 75% ó más homología entre sí, usualmente permanecen hibridizadas entre sí. Estas condiciones severas son conocidas para el trabajador experto y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitativo y preferido de condiciones severas de hibridación son hibridaciones en 6x de cloruro de sodio/citrato de sodio (cloruro de sodio/citrato de sodio = SSC) en aproximadamente 45°C seguido por uno o más de los pasos de lavado en 0.2x de SSC, SDS al 0.1% de 50 a 65°C. Es sabido para un trabajador experto que estas condiciones de hibridación difieren dependiendo del tipo del ácido nucleico y, por ejemplo cuando están presentes solventes orgánicos, con respecto a la temperatura de amortiguación y concentración. Por ejemplo, la temperatura difiere bajo "condiciones de hibridación estándar" dependiendo del tipo del ácido nucleico entre 42 °C y 58 °C en amortiguador acuoso con una concentración de 0.1 a 5x de SSC (pH de 7.2). Si está presente un solvente orgánico en el amortiguador antes mencionado, por ejemplo formamida al 50%, la temperatura bajo condiciones estándar es aproximadamente 42 °C. Das condiciones de hibridación í s—híbridos—de—A&IkABN prcforiblemen e—son— or—ejemplo—de_ O.lx de SSC y 20°C a 45°C, preferiblemente entre 30°C y 45°C. Las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ARN preferiblemente son por ejemplo de O.lx de SSC y de 30°C a 55°C, preferiblemente entre 45° y 55°C. Las temperaturas de hibridación antes mencionadas se determinaron por ejemplo para un ácido nucleico de aproximadamente 100 bp (= pares de base) de longitud y el contenido de G + C en la ausencia de formamida . El trabajador experto sabe cómo se pueden determinar las condiciones de hibridación requeridas con referencia a los libros de texto, tales como alguno de los mencionados anteriormente o de los siguientes libros de texto: Sambrook et al., "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Haraes y Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization : A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach*, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. El trabajador experto sabe que el tipo de desarrollo y el tiempo de los resultados de hibridación tienen influencia en el resultado de la hibridación. Él mismo es capaz de optimizar, con simples experimentos, las condiciones de desarrollo de tal manera que la hibridación antes mencionada de resultados inequívocos y confiables .

Preferiblemente7—una - olécuia—aisl-aáa—de—ácido—nucleico-de conformidad con la invención, la cual se hibridiza bajo condiciones severas con una secuencia de la SEC. ID NO : 1 corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Como se utiliza en el presente contexto, una molécula de ácido nucleico "de origen natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN con una secuencia de nucleótidos la cual está presente de manera natural (por ejemplo que codifica una proteína natural) . En una modalidad, el ácido nucleico codifica un PSE de la Phytophthora infestans de origen natural . Además de las variantes de origen natural de la secuencia de PSE la cual puede existir en la población, el trabajador experto además reconoce que los cambios por medio de mutación también se pueden introducir en una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 1, la cual conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos del PSE codificado sin afectar adversamente la funcionalidad de la proteína PSE. Por ejemplo, se pueden generar sustituciones de nucleótidos las cuales conducen a las sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de la SEC. ID NO: 1. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar en una secuencia de tipo silvestre de uno de los PSEs (SEC. ID NO: 2) sin alterar la actividad del PSE, mientras que s nprasi a un residuo—de—aminoácido -^esenci l^— para la actividad del PSE . Otros residuos de aminoácidos (por ejemplo aquellos que no se conservaron, o solamente se semi-conservaron, en el dominio con la actividad del PSE) , sin embargo, pueden no ser esenciales para la actividad y por lo tanto se pueden alterar probablemente sin alterar la actividad del PSE. De conformidad con esto, un aspecto adicional de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico las cuales codifican los PSEs que comprenden residuos de aminoácidos alterados los cuales no son esenciales para la actividad del PSE. Estos PSEs difieren de una secuencia en la SEC. ID NO: 2 con respecto a la secuencia de aminoácidos mientras que aún retienen al menos una de las actividades del PSE descritas aquí. En una modalidad, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, la proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente el 50% de homología con una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 y es capaz de participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de membranas celulares en la Phytophthora infestans o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o se involucra en el metabolismo de los ácidos grasos o tiene una o más de las actividades listadas en la Tabla I . La proteína codificada por la mo.1 pmil a de ác±do_ nucleico preferiblemente tiene al menos aproximadamente 50 a 60% de homología con una de las secuencias en la SEC. ID NO: 2, de manera más preferible al menos aproximadamente 60 a 70% de homología con una de las secuencias en la SEC. ID NO: 2, de manera aún más preferible al menos aproximadamente de 70 a 80%, 80 a 90%, 90 a 95% de homología con una de las secuencias en la SEC. ID NO : 2, y de manera más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ó 99% de homología con una de las secuencias en la SEC. ID NO: 2. Para determinar el porcentaje de la homología de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo una de las secuencias de la SEC. ID NO: 2 y una forma mutada de las mismas) o de dos ácidos nucleicos, las secuencias están escritas una debajo de la otra para permitir una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir orificios o espacios en la secuencia de una proteína o de un ácido nucleico con el fin de generar un alineamiento óptimo con la otra proteína o el otro ácido nucleico) . Entonces, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Si una posición en una secuencia (por ejemplo una de las secuencias de la SEC. ID NO: 2) se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o el mismo nucleótido como la correspondiente posición en la otra secuencia (por ej cm le—una—f- rrma—mutada—de—l —secuencia—se e^- aiada—de la_ SEC. ID NO: 2), entonces las moléculas son homologas en esta posición (es decir la "homología" del aminoácido o ácido nucleico como se utiliza en el presente contexto, corresponde a la "identidad" del aminoácido o áci'do nucleico) . El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas las cuales comparten la secuencia (es decir el % de homología = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100) . Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un PSE el cual es homólogo con una secuencia de proteínas de la SEC. ID NO : 2, se puede generar introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 1 de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones en una de las secuencias de la SEC. ID NO: 1 mediante técnicas estándar, tal como mutagénesis dirigida a un sitio y mutagénesis mediada con PCR. Preferiblemente, se generan sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más de los residuos de aminoácidos no esenciales, previstos. En una "sustitución de aminoácido conservativa" , se intercambia el residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. Se han definido frantir-rra-s—de—residuos—de—arttinoáeides con—ea-áenas—larte-raies-similares en el campo especializado. Estas familias comprenden aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares, no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Un residuo de aminoácido no esencial, previsto, en un PSE por consiguiente es preferiblemente intercambiado por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Como una alternativa, en otra modalidad, se pueden introducir las mutaciones al azar sobre la totalidad o parte de la secuencia que codifica el PSE, por ejemplo mediante la mutagénesis por saturación, y se pueden seleccionar los mutantes resultantes para la actividad del PSE descrita aquí con el fin de identificar los mutantes que retengan la actividad del PSE. Después de la mutagénesis de una de las secuencias de la SEC. ID NO: 1, se puede expresar la proteína codificada recombinantemente , y se puede determinar la actividad de la pxoLeiiid,— or—ejemplo utilirrartdo—el—ensayo—áe-scrito—a í—(ves-la sección de ejemplos) . Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los PSEs antes descritos, un aspecto adicional de la invención se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico las cuales son "antisentido" con respecto a las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos la cual es complementaria de un ácido nucleico "sentido" el cual codifica una proteína, por ejemplo complementaria de la hebra de codificación de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria de una secuencia de AR m. De conformidad con esto, un ácido nucleico antisentido se puede unir a un ácido nucleico sentido a través de enlaces de hidrógeno. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario de una hebra para la codificación del PSE completa o solamente con parte de la misma. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es "antisentido" con respecto a una "región de codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un PSE. El término "región de codificación" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos la cual comprende los codones que se traducen en residuos de aminoácidos (por ejemplo la región de codificación entera que empieza y termina con el codón de terminación, es decir el último codón antes del codón de terminación) . En una es "antisentido" con respecto a una "región de no- codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un PSE. El término "región de no- codificación" se refiere a secuencias 5' y 3' las cuales flanquean la región de codificación y no se traducen en aminoácidos (es decir las cuales también se llaman regiones 5' y 3 ' no traducidas) . Tomando en consideración las secuencias de codificación del PSE descritas aquí de la hebra de codificación (por ejemplo las secuencias mostradas en la SEC. ID NO: 1) , los ácidos nucleicos antisentido de conformidad con la invención se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de atson-Crick . La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria de la totalidad de la región de codificación del ARNm del PSE, pero es más preferiblemente un oligonucleótido que es "antisentido" respecto a solamente parte de la región de codificación o no- codificación del ARNm del PSE. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario de la región alrededor de la posición de inicio de la traducción del ARNm del PSE. Un oligonucleótido antisentido puede tener una longitud de, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 y más nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido de conformidad con T a ????? ? ?? SJS ede corustrui —mediante procesos conocidos en la técnica utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente, haciendo uso de nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de modos diversos los cuales son tales que los mismos incrementan la estabilidad biológica de · las moléculas o incrementan la estabilidad física del dúplex formado entre el ácido nucleico antisentido y sentido; por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fósforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina . Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico antisentido son, entre otros, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil ) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2 -tiouridina, 5-carboximetilaminómetil-uracilo, dihidrouracilo , beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1 -metilguanina, 1 -metilinosina , 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, -metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2 -metiltio-N6-isopentiladenina, ácido uracil-5-oxi ar.ét i co (v) , wibutoxo-si-na-, pseudouracilo, que sina^ -tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, -tiouracilo, 5-metilüracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2 , 6 -diaminopurina .

Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede generar biológicamente utilizando un vector de expresión al cual se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (es decir el ARN que se transcribe mediante el ácido nucleico introducido, está en orientación antisentido con relación a un ácido nucleico objetivo de interés, el cual se describe con mayor detalle en la sub- sección que sigue) . Las moléculas de ácido nucleico antisentido de conformidad con la invención, se administran usualmente a una célula o se generan in situ de modo que las mismas se hibridicen con, o se enlacen a, el AR m celular y/o el ADN genómico que codifica un PSE, inhibiendo así la expresión de la proteína, por ejemplo inhibiendo la trascripción y/o traducción. La hibridación se puede efectuar mediante una complementariedad convencional de nucleotidos con la formación de un dúplex estable o, por ejemplo en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido la cual se enlaza a los dúplex del ADN, mediante interacciones específicas en la gran hendidura del hélice doble. La molécula antisentido se puede a un receptor o a un antígeno expresado en una superficie celular, seleccionada, por ejemplo enlazando la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo, cada uno de los cuales se enlaza a un receptor de la superficie celular o un antígeno. Las células también se pueden proporcionar con la molécula de ácido nucleico antisentido utilizando los vectores descritos aquí. Las estructuras de los vectores en las cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está bajo el control de un fuerte promotor procariótico, viral o eucariótico, inclusive de un promotor de la planta, se prefieren para lograr suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido. En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido de conformidad con la invención, es una molécula de ácido nucleico -anomérica. Una molécula de ácido nucleico -anomérica forma híbridos de doble hebra, específicos, con ARN complementario, las hebras corren paralelas entre sí, en contraste con las unidades ß [Gaultier et al. ( 1987) Nucleic Acids Res. 15 : 6625-6641] . Además, la molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender un 2 ' - o-metil-ribonucleótido (Inoue et al. ( 1987 ) Nucleic Acids Res. -3r5-:-6-l 3-1—6l-4r8 ] —o -uñ- análogo de ^RN^ADN—quimé co—(Inoue et al . (1987) FF!RR T,Pff . 21 · ^ 7 - ^?].. En una modalidad adicional, un ácido nucleico antisentido de conformidad con la invención, es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN con actividad de ribonucleasa la cual puede escindir un ácido nucleico de una sola hebra, tal como un AR m, en el cual las mismas tienen una región complementaria. Por consiguiente, las ribozimas, por ejemplo se pueden utilizar ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591), para la escisión catalítica de los transcriptos del ARN del PSE con el fin de inhibir la traducción del ARNm del PSE. Una ribozima con especificidad para un ácido nucleico que codifica un PSE se puede diseñar en base a la secuencia de nucleotidos de un ADNc de PSE descrito aquí (es decir 38_Ck21_g07fwd en la SEC. ID NO: 1) o en base a una secuencia heteróloga que se aisla de conformidad con los procesos enseñados en la presente invención. Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de Tetrahymena-L-19-IVS, en la cual la secuencia de nucleotidos del sitio activo es complementaria de la secuencia de nucleotidos que se escinde en el ARNm para la codificación del PSE. Ver, por ejemplo, Cech et al., Patente Norteamericana No. 4,987,071 y Cech et al., Patente Norteamericana No. 5,116,742. Como una alternativa, se puede utilizar el ARNm del PSE para seleccionar un ARN catalítico con una actividad de ribonucleasa específica de entre un c ngointo—de—moléculas—de- ARN (ver, por ejemplo, Bartel, D., y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418). Como una alternativa, la expresión del gen PSE se puede inhibir dirigiendo las secuencias de nucleótidos que son complementarias de la región reguladora de una secuencia de nucleótidos del PSE (por ejemplo un promotor y/o intensificador) de tal manera que se formen estructuras de triple hélice, las cuales inhiban la trascripción de un gen PSE en las células objetivo (ver en general Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-84; Helene, C, et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher. L.J. (1992) Bioassays 14 (12 ): 807-815. Como una alternativa adicional, la expresión del gen PSE se puede inhibir mediante co-supresión; también es ventajosamente posible una expresión simultánea de una hebra antisentido/sentido, combinada (técnica RNAi) .

B. Estructura genética Una modalidad adicional de la invención es una nueva estructura genética, lo cual significa un ácido nucleico aislado derivado de una planta o un hongo y codificar un polipéptido que alarga ácidos grasos con Ci6 y/o Ci8 con al menos dos enlaces dobles en el ácido graso mediante al menos NO: 1, sus homólogos, derivados o análogos que se enlazan funcionalmente a una o más señales reguladoras, para incrementar ventajosamente la expresión genética. Los ejemplos de estas secuencias reguladoras son secuencias que se enlazan a inductores o represores, y de esta manera regulan la expresión del ácido nucleico. Además de estas nuevas secuencias reguladoras, aún puede estar presente la regulación natural de estas secuencias antes de los genes estructurales actuales y, si es apropiado, se modifica genéticamente, de modo que se interrumpa la regulación natural y la expresión de los genes se mejore. Sin embargo, la estructura genética también puede tener una estructura simple, es decir que no se han insertado señales reguladoras adicionales antes de la secuencia SEC . ID NO: l o sus homólogos y no se ha eliminado el promotor natural con su regulación. En vez de esto, la secuencia reguladora, natural, se ha mutado de tal manera que la regulación ya no tenga lugar y se mejoró la expresión genética. La estructura genética además puede comprender ventajosamente una o más de las así llamadas secuencias mejoradas las cuales se enlazan funcionalmente al promotor y las cuales permiten incrementar la expresión de la secuencia de ácido nucleico. También es posible insertar adicionalmente secuencias ventajosas en el extremo 3' de las secuencias de ABN-¡—Los-gcnc3 de clongas pueden-catar preoenteo en una—G—má-s-copias en la estructura genética. Es ventajoso para la inserción de genes adicionales en organismos si están presentes genes adicionales en la estructura genética. Existen secuencias de regulación ventajosas para el nuevo procesos, por ejemplo, en promotores tales como el promotor eos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3 , gal, tre, ara, SP6 , ?-?? ó -PL y se utilizan ventajosamente en las bacterias gram-negativas . Además existen secuencias reguladoras ventajosas, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SP02, en los promotores de levaduras u hongos ADC1, MFcc, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH ó en los promotores de plantas CaMV 35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [ ard et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o en el promotor de ubiquitina o faseolina. También son ventajosos en este contexto los promotores inducibles, tales como los promotores descritos en la EP-A-0 388 186 (inducibles con bencilsulfonamida) , Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al., inducibles con tetraciclina) , EP-A-0 335 528 (inducibles con ácido abscísico) ó O 93/21334 (inducibles etanol o ciclohexenol) . Otros promotores adecuados de las plantas son la FBPasa citosólica o el promotor ST-LSI de la papa expresión en los tejidos que están involucrados en la biosíntesis de los ácidos grasos. Son especialmente ventajosos los promotores de semillas específicas, tales como el promotor usp, el LEB4, la faseolina o la napina. Además los promotores especialmente ventajosos son promotores de semillas especificas los cuales se pueden utilizar para las monocotiledóneas o dicotiledóneas, se describen en la US 5,608,152 (promotor napina de las semillas oleaginosas de colza) , WO 98/45461 (promotor faseolina de la Arobidopsis) , US 5,504,200 (promotor faseolina de Phaseolus vulgaris) , WO 91/13980 (promotor Bce4 de Brassica) , Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (promotor LEB4 de las leguminosas), estos promotores son adecuados para las dicotiledóneas. Los siguientes promotores son adecuados, por ejemplo, para las monocotiledóneas: el promotor lpt-2 ó lpt-1 de la cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) , el promotor hordeina, y otros promotores adecuados se describen en la WO 99/16890. En teoría, es posibles utilizar todos los promotores naturales son sus secuencias reguladoras, tales como aquellos mñnci on^ ns para—el—nuevo—roceso. También—es—posible—y-adicionalmente ventajoso utilizar promotores sintéticos. Como se describe anteriormente, la estructura genética también puede comprender genes adicionales los cuales se introducirán en los organismos. Es posible y ventajoso introducir en los organismos hospederos y expresar en los mismos, genes reguladores tales como genes para inductores, represores o enzimas los cuales, debido a su actividad enzimática, participan en la regulación de uno o más genes de una ruta biosintética . Estos genes pueden ser de origen heterólogo u homólogo . Los genes insertados pueden tener su propio promotor o bien pueden estar bajo el control del promotor de la secuencia SEC. ID NO: l o sus homólogos. Para expresar los demás genes que están presentes, la estructura genética comprende ventajosamente además secuencias reguladoras con 3' y/o 5' -terminal para mejorar la expresión, y estas se seleccionan por su expresión óptima como una función del organismo hospedero elegido y el (los) gen(es) . Como se mencionó anteriormente, se pretende que estas secuencias reguladoras hagan posible la expresión específica de la expresión de los genes y las proteínas. Dependiendo del organismo hospedero, esto puede significar, por ejemplo, que el gen se expresa o sobre-expresa solamente después de la -induce ón , o que el mismo se—expresa—y-o sobre-e resa-inmediatamenté . Además, las secuencias reguladoras o factores reguladores preferiblemente pueden tener un efecto ventajoso en la expresión de los genes que se han introducido, mejorándolos por consiguiente. De esta manera, es posible que los elementos reguladores se mejoren ventajosamente en el nivel de trascripción, utilizando fuertes señales de trascripción, tales como promotores y/o intensificadores . Sin embargo, además también es posible mejorar la traducción, por ejemplo al mejorar la estabilidad del ARNm.

C. Vectores de expresión recombinantes y células hospederas Un aspecto adicional de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico el cual codifica un PSE (o parte del mismo) . Como se utiliza en el presente contexto, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual el mismo está unido. Un tipo de vector es un "plásmido" , el cual representa un bucle de ADN de doble hebra, circular, al cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Un tipo de vector adicional es un vector viral, hace posible que se liguen segmentos adicionales de ADN en el genoma viral . Ciertos vectores son ca atres~tie-^rta---re Í ^a^^^^ una célula hospedera— n~ la cual los mismos se han introducido (por ejemplo vectores bacteriales con origen bacterial de replicación y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo los vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedera durante la introducción en la célula hospedera y se replican así conjuntamente con el genoma hospedero. Además, ciertos vectores pueden regir la expresión de genes a los cuales los mismos se enlazan funcionalmente . Estos vectores se mencionan aquí como "vectores de expresión" . Usualmente, los vectores de expresión que son adecuados para las técnicas de ADN recombinante toman la forma de plásmidos. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar intercambiablemente puesto que el plásmido es la forma más frecuentemente utilizada de un vector. Sin embargo, se pretende que la invención comprenda estas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo retrovirus de replicación deficiente, adenovirus y virus adeno-relacionados) los cuales ejercen funciones similares. Además, también se pretende que el término vector comprenda otros vectores conocidos para el trabajador experto, tales como fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposones o genes móviles, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular. &os—vectores—de—expresió —rec mbinanfe s—de—eonformidad-con la invención comprenden un ácido nucleico de conformidad con la invención o una estructura genética de conformidad con la invención en una forma la cual sea adecuada para expresar el ácido nucleico en una célula hospedera, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes comprenden una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospederas que se utilizan para la expresión, las cuales se enlaza (n) funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. En un vector de expresión recombinante, "enlazado funcionalmente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de tal manera que la expresión de la secuencia de nucleótidos es posible y que las mismas están enlazadas entre sí de modo que ambas secuencias cumplan la función prevista que se ha atribuido a la secuencia (por ejemplo en un sistema in vitro de trascripción/traducción o en una célula hospedera, cuando se introduce el vector en la célula hospedera) . Se pretende que el término "secuencia reguladora" comprenda promotores, me oradores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo señales de poliadenilación) . Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel : Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o ver: Gruber y Croñhy, en-: Methods—in—PXant—Molacul-ar—BdoXogy-and Biotechnolog , CRC Press, Boca Ratón, Florida, Ed. : Glick y Thompson, Capítulo 7, 89-108, que incluyen las referencias citadas en las mismas. Las secuencias reguladoras comprenden aquéllas que controlan la expresión constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de células hospederas y aquéllas que controlan la expresión directa de la secuencia de nucleotidos solamente en ciertas células hospederas bajo ciertas condiciones. El trabajador experto sabe que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que se va a transformar, el grado al cual se expresa la proteína deseada, y similares. Los vectores de expresión de conformidad con la invención se pueden introducir en células hospederas con el fin de producir proteínas o péptidos, que incluyan proteínas de fusión o péptidos de fusión, los cuales se codifican mediante los .ácidos nucleicos como se describe aquí (por ejemplo PSEs, formas mutantes de PSEs, proteínas de fusión y similares) . Los vectores de expresión recombinantes de conformidad con la invención se pueden diseñar para expresar los PSEs en células procarióticas o eucarióticas . Por ejemplo, los genes PSE se pueden expresar en células bacteriales, tales como C. glutamicum, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , células de levaduras y otros hongos (ver Romanos, M . A . , et al . (19-92-)—!LEoeiga—ge¾e—expression i&-yeast: a revie " , Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungí", in: More Gene Manipulations in Fungí, J. . Bennet & L.L. Lasure, Ed. , pp. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Ed. , pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology . 1, 3:239-251), ciliados de los siguientes tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus , Euplotes, Engelmaniella y Stylonychia, en particular del género Stylonychia lemnae, utilizando vectores y siguiendo un método de transformación como se describe en la WO 98/01572, y células de plantas multicelulares (ver Schmidt, R. y illmitzer, L. . (1988) "High efficiency Agrobacteríum tumefaciens-mediated transíormation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants "Plant Cell Rep . : 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, Capítulo 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, Ed. : Kung y R. u, Acctdemi-e—Press (1993) , 12-8—43-; Poferykuo,—Annu ,—Rev-. P-lant- Physiol. Plant Molec. Biol . 42 (1991), 205-225 (y las referencias citadas en las mismas) o células que no son mamíferos humanos. Las células hospederas adecuadas se describen además en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Como una alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando las secuencias reguladoras del promotor T7 y la polimerasa T7. En los procariotes, las proteínas usualmente se expresan con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que controlan la expresión de las proteínas de fusión o proteínas de no-fusión. Los vectores de fusión agregan una serie de aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, usualmente en el amino terminal de la proteína recombinante, aunque también en el C terminal o se fusionan dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Estos vectores de fusión usualmente tienen tres tareas: 1) mejorar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante y 3) apoyar la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. En el caso de los vectores de expresión de fusión se introduce frecuentemente un sitio de escisión proteolítica en el—sitio—donde—s —enlazan—la unidad de fusión y la proteína recombinante, de modo que la proteína recombinante se pueda separar de la unidad de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas y sus correspondientes secuencias de reconocimiento comprenden el factor Xa, la trombina y las enterocinasas . Los vectores típicos de la expresión de fusión son, entre otros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. , y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , donde la glutationa S-transferasa (GST) , la proteína de enlace E de maltosa o la proteína A se fusiona a la proteína objetivo recombinante. En una modalidad, la secuencia de codificación del PSE se clona en un vector de expresión pGEX para generar un vector que codifique una proteína de fusión la cual comprende, desde el N terminal hasta el C terminal, la proteína X del sitio de escisión de GST-trombina . La proteína de fusión se puede purificar mediante la cromatografía por afinidad utilizando resina de glutationa-agarosa . El PSE recombinante que no se fusiona con GST se puede obtener escindiendo la proteína de fusión con trombina. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados, inducibles, que no son de fusión, de la E. coli son, entre otros, pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) y pET lid (Studier et al . , Gene Exp ess-ion—lechnol-ogy-s Methods in- Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89) . La expresión genética objetivo del vector pTrc se basa en la trascripción mediante la . polimerasa de ARN hospedera de un promotor de fusión híbrido, trp-lac. La expresión genética objetivo del vector pET lid se basa en la trascripción de un promotor de fusión T7-(|>10-lac el cual está mediado por una polimerasa de ARN viral co-expresada (T7 gnl) . La polimerasa viral se proporciona mediante las cepas hospederas BL21(DE3) ó HMS174 (DE3) por un prófago ? residente el cual hospeda un gen T7 f? bajo el control de trascripción del promotor lacUV 5. Otros vectores que son adecuados para su uso en organismos procarióticos son conocidos para el trabajador experto; estos vectores están, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, la serie pBR tal como pBR322, la serie pUC tal como pUC18 ó pUCl9, la serie M113mp, pKC30, pRep4 , pHSl, pHS2 , pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN- 111113-Bl , ?gtll ó pBdCI, en Streptomyces pIJIOl, pIJ364, pIJ702 ó pIJ361, en Bacillus pUBUO, pC194 ó pBD214, en Corynebacterium pSA77 ó pAJ667. Una estrategia para maximizar la expresión de la proteína recombinante es expresar la proteína en una bacteria hospedera cuya capacidad de escindir la proteína recombinante proteolíticamente se_ deteriora (.Gottesman, _S^-, Gene—Expre-ssion Technology :— et ods—is—Enzymology—185,—Academic—Preso ,—San Diego, California (1990) 119-128) . Una estrategia adicional es modificar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión, de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean aquellos que se utilizan preferentemente en una bacteria seleccionada para la expresión, tal como la C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Las modificaciones de estas secuencias de ácido nucleico de conformidad con la invención, se lleva a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN. En una modalidad adicional, el vector de expresión del PSE es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. ¦ cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Los vectores y métodos para la construcción de vectores que sean adecuados para su uso en otros hongos, tales como el hongo filamentoso, incluyen aquellos que se describen con detalle en: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Ed. , pp. l-2-8t—Gamb ^g«—Univcr-oity—Pres-s-;—Cambridge-,—©r—ÍÍH—More—Gene- Manipulations in Fungí [J. . Bennet & L.L. Lasure, Ed., p . 396-428.: Academic Press : San Diego] . Los vectores de levaduras adecuadas, adicionales, por ejemplo, son 2ocm, pAG-1, YEp6 , YEpl3 ó pEMBLYe23. Como una alternativa, los PSEs de conformidad con la invención se pueden expresar en células de insectos utilizando los vectores de expresión del baculovirus. Los vectores del baculovirus que están disponibles para expresar las proteínas en las células de insecto cultivadas (por ejemplo células Sf9) , incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol . 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170 : 31-39) . Los vectores antes mencionados son sólo una breve revisión de los vectores adecuados que son posibles. Los plásmidos adicionales son conocidos por el trabajador experto y se describen, por ejemplo, en: Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) . En aún una modalidad adicional, se expresa un ácido nucleico de conformidad con la invención, en células de mamíferos utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (-See ,— (1907)—Naturc—3-2-9-÷-&4-?-)—y pMT2^C -Kaufman—e^al-.- (1987) EMBO j. 6:187-195). Cuando se utilizan en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión, frecuentemente se proporcionan mediante elementos de regulación, virales. Los promotores que normalmente se utilizan se derivan, por ejemplo, de polioma, adenovirus2, citomegalovirus y virus 40 de simio. Otros sistemas de expresión adecuados para las células procarióticas o eucarióticas , se pueden encontrar en los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. En otra modalidad, el vector de expresión mamífero, recombinante , puede controlar la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo específico de célula (por ejemplo, se utilizan elementos reguladores de tejido específico para expresar el ácido nucleico) . Los elementos de regulación de tejido específico se conocen en la técnica. Los ejemplos no limitativos de promotores adecuados, específicamente de tejido son, entre otros, el promotor de albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfomas (Caíame y Eaton (1988) Adv. Immunol . 43:235-275), en particular promotores de receptores 7 de células T (Winoto y RalMmoxe—(OS-8-9- —EMBO— -.—8-: 729-733-)—e-inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo el promotor de neurofilamento ; Byrne y Ruddle (1989) ???? 86:5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al., (1985) Science 230:912-916) y promotores específicos de las glándulas mamarias (por ejemplo promotor de suero de leche; Patente Norteamericana No. 4,873,316 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264 166) . También se incluyen promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo promotores hox de ratón (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546). En una modalidad adicional, los PSEs de conformidad con la invención se pueden expresar en células de plantas unicelulares (tales como las algas); ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3) :239-251 y las referencias citadas en la misma, y en células de plantas de plantas superiores (por ejemplo espermatofitos tales como cultivos) . Los ejemplos de vectores de expresión de las plantas incluyen aquellos que se describen con detalle en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., y Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol . 20:1195-1197; y Bevan, M. . (1984) "fíinary AgrohacJ^er-ium vectors—for plant tranaformation" ,—Nucí .

Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, Ed. : Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp . 15-38. Un cásete de expresión de las plantas preferiblemente comprende secuencias reguladoras las cuales pueden controlar la expresión genética en las células de plantas y las cuales se enlazan funcionalmente , de modo que cada secuencia pueda cumplir su función, tal como la terminación de la trascripción, por ejemplo las señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquéllas derivadas del t-ADN de Agrobacterium tumefaciens, tal como el gen 3 del plásmido Ti pTiACH5, el cual es conocido como octopina sintasa (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 et seq.) o equivalentes funcionales del mismo, aunque también son adecuados todos los demás terminadores que son funcionalmente activos en las plantas . Puesto que la expresión genética de las plantas frecuentemente no es muy limitada al nivel de trascripción, el cásete de expresión de las plantas preferiblemente comprende otras secuencias enlazadas funcionalmente, tal como los me oradores de traducción, por ejemplo la secuencia de sobremultiplicación, la cual contiene la secuencia líder del incrementa la relación proteína/AR (Gallie et al., 1987, Nucí. Acids Research 15:8693-8711). La expresión genética de las plantas se debe enlazar funcionalmente a un promotor adecuado el cual efectúa la expresión genética de manera específica en una célula o tejido con la sincronización correcta. Los promotores preferidos son aquéllos que conducen a una expresión constitutiva (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tales como aquéllos que se derivan de los virus de las plantas tales como el 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (ver también la US 5352605 y WO 84/02913) o los promotores de plantas tales como el promotor de la subunidad pequeña Rubisco, descrito en la US 4, 962, 028. Otras secuencias que se prefieren para su uso en enlaces funcionales en los casetes de expresión genética de las plantas, son secuencias objetivo, las cuales se requieren para localizar o dirigir el objetivo al producto genético en su correspondiente compartimiento celular (para una revisión, ver Kermode, Crit. Rev. Plant Sci . 15, 4 (1996) 285-423 y las referencias citadas en la misma) , por ejemplo en la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plastidos tales como amilopastos, cloroplastos , cromoplastos , el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplásmico, elaioplasLos , peroxirsomas—y -otros eomp¾rtimicntoe de las células de plantas. La expresión genética de las plantas también se puede facilitar a través de un promotor inducible químicamente (para una revisión, ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol. Biol . , 48:89-108). Los promotores inducibles químicamente en particular son adecuados cuando se desea que una expresión genética tenga lugar de manera específica con respecto a la sincronización. Los ejemplos de tales promotores son un promotor inducible con ácido salicílico ( O 95/19443), un promotor inducible con tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) y un promotor inducible con etanol . Otros promotores adecuados son promotores que responden a condiciones de tensión biótica y abiótica, por ejemplo el promotor del gen PRP1 inducido con patógenos (Ward et al . , Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor hsp80 del tomate, inducible con calor (US 5,187,267), el promotor alfa-amilasa de la papa, inducible a baja temperatura (WO 96/12814) o el promotor pinll inducible por laceraciones (EP-A-0 375 091) . Los promotores que son particularmente preferidos son aquellos que conducen a una expresión genética en tejidos y órganos en los cuales tiene lugar la biosíntesis de lípidos y aceites, en células de semillas tales como células de 1 que son adecuados son el promotor del gen napina de la semilla oleaginosa de colza (US 5,608,152) , el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3) :459-67), el promotor oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461) , el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5,504,200) , el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2) :233-9), y promotores que conduzcan a la expresión específica de las semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Los promotores notables que son adecuados son el promotor del gen lpt2 ó lptl de la cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) , o los promotores descritos en la WO 99/16890 (promotores del gen hordeina de la cebada, el gen glutelina del arroz, gen orizina del arroz, el gen prolamina del arroz, el gen gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen zeina del maíz, el gen glutelina de la avena, el gen kasirina del sorgo, y el gen secalina del centeno) . Los promotores que también son particularmente adecuados son aquellos que conducen a la expresión específica con plastidas, puesto que las plastidas son el compartimiento en la cual se sintetizan los precursores y algunos productos terminados de la biosíntesis de lípidos. Los promotores adecuados tales como el promotor de la polimerasa de AR viral,—se—des r-iben—en—La—WO—95/16783—y WO—97/06250 ,—y—ei-promotor clpP de Arabidopsis, se describe en la WO.99/46394. La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de conformidad con la invención la cual se clona en el vector de expresión en orientación antisentido, es decir la molécula de ADN se enlaza funcionalmente a una secuencia reguladora de tal manera que la misma permita la expresión (transcribiendo la molécula de ADN) de una molécula de ARN la cual es "antisentido" con respecto al ARNm del PSE. Se. pueden seleccionar secuencias reguladoras que se enlacen funcionalmente a un ácido nucleico clonado en orientación antisentido y que controlen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una multiplicidad de tipos celulares, por ejemplo, promotores y/o mej oradores virales o se pueden seleccionar secuencias reguladoras las cuales controlen la expresión constitutiva, de tipo específico de célula o de tejido específico del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar presente en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el cual se producen los ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora altamente efectiva cuya actividad se puede determinar mediante el tipo celular en el cual se ha introducido el vector. Para una explicación de la regulación de la expresión genética por medio de genes molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol . 1(1) 1986. Un aspecto adicional de la invención se refiere a células hospederas en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de conformidad con la invención. Los términos "célula hospedera" , "célula hospedera recombinante" y "célula hospedera transgénica" se utilizan intercambiablemente en el presente contexto. Naturalmente, estos términos no solamente se refieren a la célula objetivo en particular, sino también a la progenie o progenie potencial de esta célula. Puesto que pueden ocurrir modificaciones específicas en las subsecuentes generaciones debido a la mutación o efectos ambientales, esta progenie no necesariamente es idéntica a la célula parental , aunque todavía está comprendida por el alcance del término como se utiliza aquí. Una célula hospedera puede ser una célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, se puede expresar un PSE en células bacteriales tales como C. glutamicum, células de insectos, células fúngicas o células mamíferas (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS) , algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos, tales como el C. glutamicum. Otras células hospederas adecuadas son conocidas para el trabajador experto. 1 4 Se— uede—introdttc-Hr—el— BN—del—vetor—es—células-procarióticas o eucarióticas a través de técnicas convencionales de transformación o transfección . Se pretende que los términos "transformación" y "transfección" , conjugación y transducción como se utilizan en el presente contexto, comprendan una multiplicidad de métodos conocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo ADN) en una célula hospedera, que incluye fosfato de calcio o cloruro de calcio, co-precipitación, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia modificada químicamente, electroporación o bombardeo de partículas. Los métodos adecuados para la transformación o transfección de las células hospederas, que incluyen células de plantas, se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio, tales como Methods Molecular Biology, 1995, Vol . 44, Agrobacterium protocols, Ed. : Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Se sabe sobre la transfección estable de células de mamíferos que solamente una minoría de las células integran el ADN extraño en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y la técnica de transfección utilizada. Para identificar—y—oeloccionar—cotoo integrantes , \ .—gen—que-codifica un marcador seleccionable (por ejemplo resistencia a los antibióticos) , usualmente se introduce en las células hospederas junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables, preferidos, comprenden aquellos que imparten resistencia a los fármacos tales como G418, higromicina y metotrexato, o, en plantas, aquellos que imparten resistencia a un herbicida tal como glifosfato o glufosinato. Los marcadores adecuados, adicionales, por ejemplo, son marcadores los cuales codifican genes que están involucrados en la rutas de la biosíntesis de, por ejemplo, azúcares o aminoácidos, tales como ß-galactosidasa, ura3 ó ilv2. También son adecuados marcadores los cuales que codifican genes tales como la luciferasa, gfp u otros genes de fluorescencia. Estos marcadores se pueden utilizar en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales puesto que los mismos se han eliminado por ejemplo por medio de métodos convencionales. Además, se pueden introducir marcadores que codifiquen un ácido nucleico el cual codifique un marcador seleccionable en una célula hospedera en el mismo vector como el único que codifica un PSE, o se puede introducir en un vector separado. Se puede identificar células que se hayan transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido por ejemplo mediante selección—de—fármacos—(por—e em l -,—ia-s—célul s—que-tienen el marcador seleccionable integrado sobreviven, mientras que otras células mueren) . Para generar un microorganismo recombinante homólogamente , se genera un vector que contenga al menos un segmento de un gen PSE en el cual se ha introducido una eliminación, adición o sustitución con el fin de modificar el gen PSE mediante el mismo, por ejemplo para deteriorarlo funcionalmente . Este gen PSE preferiblemente es un gen PSE de Physcomitrella patens ó Phytophthora infestans, aunque se puede utilizar un homólogo o análogo de otros organismos, inclusive de origen mamífero, fúngico o de insectos. En una modalidad preferida, el vector se diseña de tal manera que el gen PSE endógeno se deteriore funcionalmente (es decir, que ya no codifica una proteína funcional, también llamado vector agénico) en la recombinación homologa. Como una alternativa, el vector se puede diseñar de tal manera que el gen PSE endógeno mute o se modifique de otra manera durante la recombinación homologa mientras que todavía codifica una proteína funcional (por ejemplo, la región reguladora corriente arriba se puede modificar de tal manera que esta conduzca a una modificación de la expresión del PSE endógeno) . Para generar una mutación puntal a través de recombinación homologa, también se pueden utilizar híbridos de ADN-AR , lo euai—tam ién—sen—eenoee—eerao—quimcroplastia—y—tes—cuales—se-conocen de Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27 (5) : 1323-1330 y Kmiec, Gene therapy, 19999, American Scientist, 87 (3) : 240-247. En el vector para la recombinación homologa, el segmento modificado del gen PSE se flanquea en su extremo 5' y 3' mediante el ácido nucleico adicional del gen PSE, de modo que sea posible una recombinación homologa entre el gen PSE exógeno el cual está presente en el vector y un gen PSE endógeno en un microorganismo o una planta. El ácido nucleico del PSE flanqueante, adicional, es lo suficientemente largo para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Usualmente, varios cientos de pares base de hasta kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como en el 3') están presentes en el vector (para una descripción de vectores para la recombinación homologa, ver, por ejemplo, Thomas, K.R., y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 ó para la recombinación en la Physcomitrella patens en la base de ADNc, ver Strepp et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95 (8) :4368-4373) . El vector se introduce en un microorganismo o célula de planta (por ejemplo por medio de un ADN mediado con polietilenglicol) , y se seleccionan las células en las cuales el gen PSE introducido ha padecido una recombinación homologa con el gen—PSE—cndógefie-Hdti1izanáe-^en^re s conoci-dae-en el arte. En otra modalidad, se pueden generar organismos recombinantes tales como microorganismos que contengan sistemas seleccionados los cuales permitan regular la expresión del gen introducido. La inclusión del gen PSE en un vector, cuando el mismo se coloca bajo el control del lac-operon, permite, por ejemplo, la expresión del gen PSE solamente en la presencia de IPTG. Estos sistemas reguladores son conocidos en la técnica. Una célula hospedera de conformidad con la invención, tal como células hospederas procarioticas o eucarióticas, que crecen ya sea en un cultivo o en un campo, se pueden utilizar para producir (es decir expresar) un PSE. En las plantas, se puede utilizar adicionalmente un método alternativo transfiriendo directamente el ADN a las flores en crecimiento a través de electroporación o transferencia genética mediada con Agrobacterium. De conformidad con esto, la invención proporciona además métodos para producir PSEs utilizando las células hospederas de conformidad con la invención. En una modalidad, el método comprende hacer crecer la célula hospedera de conformidad con la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un PSE o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un—PSE—mo iíiread©—o—de—fc-ipe—silvestre-)—en—tm—medio—adecuado-hasta que se haya producido el PSE. En una modalidad adicional, el método comprende aislar los PSEs del medio o de la célula hospedera. Las células hospederas son adecuadas en teoría para absorber el ácido nucleico de conformidad con la invención, los nuevos productos genéticos de conformidad con la invención, o el vector de conformidad con la invención, son todos organismos procarióticos o eucarióticos . Los organismos hospederos que se utilizan ventajosamente son organismos tales como bacterias, hongos, levaduras, células animales no-humanas o células de plantas. Los organismos ventajosos adicionales son animales no-humanos o, preferiblemente, plantas o partes de las mismas. Se utilizan preferiblemente hongos, levaduras o plantas, en especial preferiblemente hongos o plantas, en especial muy preferiblemente plantas tales como cultivos de aceite los cuales contienen grandes cantidades de compuestos de lípidos, tales como semillas oleaginosas de colza, onagra o hierba del asno, cañóla, cacahuate, linaza, soya, abrojo, girasol, borraja o plantas tales como el maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, tagetes, plantas solanáceas tales como papa, tabaco, berenjena y tomate, especie Vicia, guisante, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, té), especie Salix, árboles (palma de aceite, coco)—y— astos—perennes— y—cultivos—de—forraj e . —Era —plantas especialmente preferidas de conformidad con la invención, son cultivos de aceite tales como soya, cacahuate, semillas oleaginosas de colza, cañóla, girasol, flor de alazor, árboles (palma de aceite, coco) . Con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un cásete de expresión (= estructura genética) o un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, cásete o vector de expresión de conformidad con la invención, "transgénico" se refiere a todas aquellas estructuras la cual se ha suscitado mediante métodos recombinantes en los cuales ya sea a) la secuencia de ácido nucleico de la invención, o b) una secuencia de control genético en enlace operable con la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención, por ejemplo un promotor, o c) (a) y (b) no están en su ambiente genético natural o se han modificado mediante métodos recombinantes, por ejemplo de una modificación la cual hace posible sustituciones, adiciones, eliminaciones, inversiones o inserciones de uno o más residuos de nucleótidos.

Ei—"medio ambiente genético nafe¾ga-P-'—s —refiere—al—sitio-cromosómico natural en el organismo fuente o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el medio ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico preferiblemente se retiene al menos en parte. El medio ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos unilateralmente y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferiblemente de al menos 500 bp, en especial preferiblemente de al menos 1000 bp, en especial muy preferiblemente de al menos 5000 bp. Un cásete de expresión de origen natural - por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención con el gen PSE en cuestión - vuelve un cásete de expresión transgénica cuando el último se modifica mediante métodos sintéticos, no-naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Tales métodos se han descrito por ejemplo en la 5,565, 350 ó WO 00/15815. La invención se refiere además a organismos transgénicos transformados con al menos una secuencia de ácido nucleico, el cásete o vector de expresión de conformidad con la invención, y a las células, cultivos celulares, tejidos partes - tales como, por ejemplo, en el caso de hojas de organismos de plartfca-s- —raíees—y—s-imirlr -es—-—e—el—material—de—propagación derivado de tales organismos. D. PSE Aislado Un aspecto adicional de la invención se refiere a PSEs aislados y partes activas biológicamente de los mismos. Una proteína "aislada" o "purificada" o parte activa biológicamente de la misma, está esencialmente libre de material celular cuando la misma se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando la misma se sintetiza químicamente. El término "esencialmente libre de material celular" comprende preparaciones de PSE en los cuales se separa la proteína de componentes celulares de la célula en la cual la misma se produce de manera natural o recombinantemente . En una modalidad, el término "esencialmente libre de material celular" comprende preparaciones PSE con menos de aproximadamente 30% (en base al peso seco) de una proteína que no es de PSE (también mencionada aquí como "proteína contaminante"), de manera más preferible de aproximadamente 20% de una proteína que no es PSE, de aún más manera preferible de menos de aproximadamente 10% de una proteína que no es PSE, y de manera más preferible menos de aproximadamente 5% de una proteína que no es PSE. Cuando la PSE o una parte biológicamente activa del mismo se ha produc-ide—mcdianfe —tecnología—recombénantc,—1a—misma —tambiréa-está esencialmente libre de un medio de cultivo, es decir las cantidades del medio de cultivo de menos de aproximadamente 20%, de manera más preferible de aproximadamente 10% y de manera más preferible de menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la proteína. El término "esencialmente libre de precursores químicos otras sustancias químicas" comprende preparaciones en las cuales la proteína se separa de precursores químicos otras sustancias químicas las cuales están involucradas en la síntesis de la proteína. En una modalidad, el término "esencialmente libre de precursores químicos otras sustancias químicas" comprende preparaciones de PSE con menos de aproximadamente 30% (en base al peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas que no son de PSE, de manera más preferible de menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o sustancias químicas que no son de PSE, de manera aún más preferible de menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o sustancias químicas que no son de PSE, y de manera más preferible de menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o sustancias químicas que no son de PSE. En modalidades preferidas, las proteínas aisladas o partes biológicamente activas de las mismas por lo tanto exhiben proteínas no-contaminantes del mismo organismo a partir del cual se origina el PSE. Estas proteínas usualmente se producen meHian s axpxesión—recom iríante-,— or—e^-empi —de-una PSE de Phytophthora infestans en otros hongos, plantas u microorganismos por ejemplo bacterias tales como C. glutamicum, hongos tales como ortierella, levaduras tales como Saccharomyces , o ciliados, algas tales como Phycomitrella patens, o cultivos de aceite. Una PSE aislada de conformidad con la invención o parte de la misma, también puede participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en la Phytophthora infestans o en el transporte de moléculas a través de estas membranas, o se puede involucrar en el metabolismo de ácidos grasos, o tiene una o más de las actividades establecidas en la Tabla I. En modalidades preferidas, la proteína o parte de la misma comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene suficiente homología con una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 para la proteína o parte de la misma que retiene la capacidad de participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en la Phytophthora infestans o en el transporte de moléculas a través de estas membranas o en el metabolismo de los ácidos grasos. La parte de la proteína de manera preferible es una parte activa biológicamente como se describe aquí. En una modalidad preferida adicional, una PSE de conformidad con la invención ? ß¾ß—una—de—ías secuencias de amin ácidos mostrada en la SEG^-ID NO: 2. En una modalidad preferida adicional, la PSE tiene una secuencia de aminoácidos la cual se codifica mediante una secuencia de nucleótidos la cual se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 1, por ejemplo bajo condiciones severas. En aún otra modalidad preferida, la PSE tiene una secuencia de aminoácidos se codifica mediante una secuencia de nucleótidos la cual tiene al menos aproximadamente 50 a 60%, de manera preferible al menos aproximadamente 60 a 70%, de manera preferible al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90%, 90 a 95% y de manera aún más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% ó más homología con una de las secuencias de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2. La PSE preferida de conformidad con la invención preferiblemente también tiene al menos una de las actividades de la PSE descritas aquí. Por ejemplo, una PSE preferida de conformidad con la invención comprende una secuencia de aminoácidos codificada mediante una secuencia de nucleótidos la cual se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de la SEC. ID NO: 1, por ejemplo bajo condiciones astringentes, y la cual participar en el metabolismo de los compuestos requeridos para la síntesis de las membranas celulares en la Phytophthora infestans o en el transporte de moléculas a través de estas membranas, o se puede involucrar en el me-abojdrsmo—de—los—ácidos gra&os-;—o—tiene—una o más—de-las actividades establecidas en la Tabla I. En otras modalidades, la PSE es esencialmente homóloga con una secuencia de aminoácidos de la SEC . ID NO: 2 y retiene la actividad funcional de la proteína de una de las secuencias de la SEC. ID NO: 2, aunque su secuencia de aminoácidos difiere, debido a su variación natural o mutagénesis como se describe con detalle en la sub-sección I anterior. En una modalidad adicional, la PSE es, de conformidad con esto, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos aproximadamente 50 a 60%, de manera preferible al menos aproximadamente 60 a 70%, y de manera más preferible al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90%, 90 a 95% y de manera aún más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% ó más homología con una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 y tiene al menos una de las actividades de la PSE descritas aquí. En otra modalidad, la invención se refiere a una proteína completa de Phytophthora infestans la cual es esencialmente homóloga con una secuencia de aminoácidos completa de la SEC. ID NO: 2. Las partes activas biológicamente de una PSE comprenden péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una PSE, por ejemplo una secuencia—de— minoácidos—mosteada—en—1-a—SEC .—£B—NO-s—2-,—o—La-secuencia de aminoácidos de una proteína la cual es homologa con una PSE, cuyos péptidos tienen menos aminoácidos que la PSE de longitud completa la cual es homologa con una PSE y tiene al menos una actividad de PSE. Las partes activas biológicamente (péptidos, por ejemplo péptidos con una longitud de, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ó más aminoácidos) usualmente comprenden un dominio o una porción con al menos una actividad de una PSE. Además, otras partes activas biológicamente en las cuales se eliminan otras regiones de la proteína se pueden generar mediante técnicas recombinantes y se pueden estudiar con respecto a una o más de las actividades descritas aquí. Las partes activas biológicamente de un PSE preferiblemente comprenden uno o más dominios/porciones o partes de los mismos con activa biológicamente. Los PSEs preferiblemente se producen mediante técnicas de ADN recombinante . Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en un vector de expresión (como se describe anteriormente) , el vector de expresión se introduce en una célula hospedera (como se describe anteriormente) , y la PSE se expresa en la célula hospedera. La PSE se puede aislar entonces de las células mediante un esquema de purificación adecuado utilizando técnicas estándar—de— u^-f-cac-iós—de—profeeínaa .— eme—iffia-alternativa para la expresión recombinante , una PSE, un polipéptido PSE o un péptido PSE se puede sintetizar químicamente mediante técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, se puede aislar una PSE nativa a partir de células (por ejemplo células endoteliales) , por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-PSE el cual se puede cultivar mediante técnicas estándar, utilizando una PSE de conformidad con la invención o un fragmento de la misma. La invención también proporciona proteínas PSE quiméricas o proteínas de fusión PSE. Como se utiliza en el presente contexto, una "proteína PSE quimérica" o "proteína de fusión PSE" comprende un polipéptido PSE el cual se une operablemente a un polipéptido que no es PSE. Un "polipéptido PSE" se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos la cual corresponde a un PSE, mientras que un "polipéptido que no es PSE" se refiere a un polipéptido con una secuencia de aminoácidos la cual corresponde a una proteína la cual no es esencialmente homologa con una PSE, por ejemplo una proteína la cual difiere de la PSE y la cual se origina del mismo organismo u otro organismo. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operablemente" se entiende que significa que el polipéptido PSE y el polipéptido que no es PSE, se fusionan entre sí de tal manera que ambas 11 secuencias—cumplan la función prevista la cual—ac ha atribuido a la secuencia utilizada. El polipéptido que no es de PSE se puede fusionar con el N terminal o el C terminal del polipéptido PSE. En una modalidad la proteína de fusión es, por ejemplo, una proteína de fusión de GST-PSE en el cual se fusionan las secuencias de PSE a la C terminal de las secuencias de GST. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de las PSEs recombinantes . En una modalidad adicional, la proteína de fusión es una PSE el cual tiene una secuencia de señal heterologa en su N terminal. En ciertas células hospederas (por ejemplo células hospederas de mamíferos) , la expresión y/o secreción de una PSE se puede incrementar utilizando una secuencia de señal heterologa. Una proteína PSE quimérica o proteína de fusión PSE de conformidad con la invención se produce mediante técnicas estándar de ADN recombi ante . Por ejemplo, se ligan fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos entre sí en la estructura de lectura correcta utilizando técnicas convencionales, por ejemplo empleando extremos despuntados o extremos alabeados para ligación, escisión por enzimas de restricción para proporcionar extremos adecuados, llenando extremos cohesivos, como se requiera, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar enlaces indeseados, y ligación enzimática. En una modalidad adicional, se puede sintetizar el gen—de—fusión—mediante—tccnieas—eonvcne-ional- s—que—incluyen-sintetizadores de ADN. Como una alternativa, se puede llevar a cabo una amplificación PCR de fragmentos genéticos utilizando cebadores de anclaje que generan salientes complementarias entre fragmentos genéticos sucesivos los cuales substancialmente se pueden hibridizar mutuamente y reamplificar para dar lugar a una secuencia genética quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., John iley & Sons: 1992). Además, un gran número de vectores de expresión que ya se codificaron una unidad de fusión (por ejemplo un polipéptido GST) están disponibles comercialmente . El ácido nucleico que codifica un PSE se puede clonar de tal vector de expresión de modo que la unidad de fusión se enlace en la estructura de lectura correcta a la proteína PSE. Los homólogos de PSE se pueden generar mediante mutagénesis, por ejemplo mediante mutación puntual específica o truncando la PSE. El término "homólogo" como se utiliza en el presente contexto se refiere a una forma variante de PSE que actúa como agonista o antagonista de la actividad de PSE. Un agonista de PSE puede retener esencialmente la misma actividad como PSE, o alguna de las actividades biológicas. Un antagonista de PSE puede inhibir una o más actividades de la forma de PSE de origen natural, por ejemplo enlazándose de manera—competitiva—a—an—eiemento—corríesfee— rriba—o—corriente-abaj o de la cascada metabólica para los componentes de la membrana celular los cuales comprenden la PSE, o enlazándose a una PSE la cual media el transporte de compuestos a través de las membranas celulares, inhibiendo así la translocación. En una modalidad alternativa, los homólogos de PSE se pueden identificar seleccionando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes truncados, o una PSE con respecto al agonista de PSE o actividad antagonista de PSE. En una modalidad, se genera una biblioteca abigarrada de variantes PSE en el nivel de ácido nucleico mediante mutagénesis combinatoria y se codifica mediante una biblioteca genética. Una biblioteca abigarrada de variantes PSE se puede generar por ejemplo mediante la ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias genéticas de modo que un conjunto degenerado de secuencias de PSE potenciales se pueda expresar como polipéptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de grandes proteínas de fusión (por ejemplo para un despliegue de fagos) que comprende este conjunto de secuencias de PSE. Existe una multiplicidad de métodos que se pueden utilizar para generar bibliotecas de homólogos de PSE potenciales de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. La síntesis química de una secuencia de genes degenerados se puede llevar a cabo en un sóntja-ti z do —de—ADN-, y—e-1—ge«—sintét-i-ee—s-e—puede—ligar entonces en un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite que todas las secuencias codifiquen el conjunto deseado de secuencias PSE potenciales que se van a suministra en una mezcla. Los métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados, son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477). Además, se pueden utilizar biblioteca de fragmentos de PSE para generar una población abigarrada de fragmentos de PSE para seleccionar y para la selección subsecuente de homólogos de una PSE. En una modalidad, se puede generar una biblioteca de fragmentos de la secuencia de codificación tratando un fragmento PCR de doble hebra de una secuencia de PSE de codificación con una nucleasa bajo condiciones bajo las cuales las rupturas de doble hebra ocurren solamente ácidos grasos poliinsaturados una vez por molécula, desnaturalizar el ADN de doble hebra, re-naturalizar el ADN con la formación de ADN de doble hebra el cual puede comprender pares sentido/antisentido de diversos productos con rupturas de doble hebra, la remoción de secciones de una sola hebra de dúplex formados recientemente mediante el tratamiento con nucleasa SI, y ligar la biblioteca d fragmentos—result-aa-ee—en — ÜH — ector—deexpresión. Este método permite una biblioteca de expresión que se va a derivar la cual codifica fragmentos N-terminales , C-terminales e internos de PSES de tamaños variados. Un número de técnicas para seleccionar productos genéticos en bibliotecas combinatorias las cuales se hayan generado mediante mutaciones puntuales o truncamiento y para seleccionar bibliotecas de ADNc para productos genéticos con una propiedad seleccionada son conocidas en la técnica. Estas técnicas se pueden adaptar a una selección rápida de bibliotecas genéticas las cuales se hayan generado mediante mutagénesis combinatoria de los homólogos PSE . Las técnicas más frecuentemente utilizadas para seleccionar grandes bibliotecas genéticas las cuales se pueden someter a un análisis de alto rendimiento, usualmente comprenden clonar la biblioteca genética en vectores de expresión replicables, transformar células adecuadas con la biblioteca del vector resultante, y expresar los genes combinatorios bajo condiciones bajo las cuales detectar la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha eliminado. La mutagénesis de ensamble recursiva (REM) , puede utilizar una nueva técnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de selección para identificar los homéi ges—de—PSE—(A-ekin—y—Yourv¾R—(1992)—i&e^—Nat1-.—Acad— Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6 (3) : 327-331) . En una modalidad adicional, se puede hacer uso de ensayos basados en células para analizar una biblioteca abigarrada de PSE utilizando procesos conocidos en la técnica. E. Usos y procesos/métodos de conformidad con la invención Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, proteínas de fusión, cebadores, vectores y células hospederas descritas aquí se pueden utilizar en uno o más de los métodos que sigue: identificación de Phytophthora infestans y organismos relacionados, correlación de genomas de organismos los cuales están relacionados con la Phytophthora infestans, identificación y localización de secuencias de Phytophthora infestans de interés, estudios evolutivos, determinación de regiones de la proteína PSE requerida para la función, modulación de una actividad PSE; modulación del metabolismo de uno o más componentes de la membrana celular; modulación del transporte de transmembranas de uno o más compuestos, y la modulación de la producción celular de un compuestos deseado tal como una sustancia química fina. Las moléculas de ácido nucleico de PSE de conformidad con la invención, tienen, una multiplicidad de usos. Primeramente, las mismas se pueden utilizar para identificar organismos como Piiy.ophiJao-ra—infestañe—o un par-iente—cercano—-de—la—mi-sma-^—Las-raismas también se pueden utilizar para identificar la presencia de la Phytophthora infestans o un pariente de la misma en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico de una serie de genes de Phytophthora infestans; la presencia o ausencia de este organismo se puede determinar seleccionando el ADN genómico de un cultivo de una población mixta o uniforme de microorganismos bajo condiciones severas con una sonda que cubre la región de un gen de Phytophthora infestans el cual es el único para este organismo, o de partes de este gen. Mientras que la Phytophthora infestans en sí misma no se utiliza para la producción comercial de ácidos poliinsaturados , los Oomycete son adecuados en teoría para la producción de PUFAs . Esto es porque las secuencias de ADN relacionadas con la PSE son particularmente adecuadas para su uso en la producción de PUFA en otros organismos. Además, las moléculas de ácido nucleico y proteínas de conformidad con la invención, pueden actuar como marcadores para regiones específicas del genoma. Los mismos no solamente son adecuados para trazar el genoma, sino también para estudios funcionales de proteínas de Phytophthora infestans. Para identificar la región del genoma a la cual se enlaza una cierta proteína de enlace de ADN de Phytophthora infestans, se podría fragmentar el gsnnniri d^.—-Ebyfc<¾pb l=tfy>^—-M^f^H-^r ;—peor ejemplo, y los fragmentos se incuban con las proteínas de enlace de ADN. Aquéllas que enlazan la proteína se pueden seleccionar adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la invención, de manera preferible con marcadores fácilmente detectables ; el enlace de tal molécula de ácido nucleico al fragmento del genoma hace posible la localización del fragmento en el mapa del genoma de Phytophthora infestans y, si esto se lleva a cabo repetidamente con diferentes enzimas, facilita una rápida determinación de la secuencia de ácido nucleico a la cual se enlaza la proteína. Además, las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la invención, pueden tener suficiente homología con las secuencias de las especies relacionadas para que estas moléculas de ácido nucleico sean capaces de actuar como marcadores para la construcción de un mapa genómico en los hongos relacionados . Las moléculas de ácido nucleico de PSE de conformidad con la invención, también son adecuadas para estudios evolutivos y estudios de la estructura de la proteína. Los procesos metabolicos y de transporte en los cuales se utilizan las moléculas de conformidad con la invención están involucrados mediante un gran número de células procarióticas y eucarióticas ; el grado evolutivo de relación de los organismos se puede—defce»»i»a--=—com arando—Has—s-ee¾enei¾s—de-las moléculas de ácido nucleico de conformidad con la invención con aquéllas que codifican enzimas similares de otros organismos. De conformidad con esto, tal comparación permite la determinación de regiones de secuencia las cuales se conservan y las cuales no se conservan, las cuales pueden ser útiles cuando se determinan las regiones de la proteína que son esenciales para la función enzimática. Este tipo de determinación es valioso para los estudios en ingeniería de proteínas y puede proporcionar una pista de cuántos mutagénesis puede tolerar la proteína sin perder su función. La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de PSE de conformidad con la invención, puede conducir a la producción de PSEs con diferencias funcionales con respecto a « los PSEs de tipo silvestre. Se puede mejorar la eficacia o actividad de estas proteínas; las mismas pueden estar presentes en la célula en cifras más grandes de lo usual; o su eficacia o actividad se puede reducir. Una eficiencia o actividad mejorada significa, por ejemplo, que la enzima tiene una selectividad y/o actividad superior, preferiblemente una actividad la cual es al menos 10% superior, muy en especial una actividad la cual es al menos 20% superior, muy en especial preferiblemente una actividad la cual es al menos 30% superior, que la enzima original.

Exis a—una—serie—de—mecanismos—modia-nfce—les—cuales—ana-modificación de una PSE de conformidad con la invención, puede afectar directamente el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de una sustancia química fina que comprende tal proteína modificada. La obtención de compuestos de sustancias químicas finas a partir de cultivos o ciliados, algas, plantas u hongos a gran escala, se mejora significativamente cuando la célula secreta los compuestos deseados, puesto que estos compuestos se pueden aislar fácilmente del medio de cultivo (en contraste con la extracción de la biomasa de las células cultivadas) . De otra manera, se puede mejorar la purificación cuando la célula almacena compuestos in vivo en un compartimiento especializado con una especie de mecanismo de concentración. En las plantas que expresan los PSEs, un transporte incrementado puede conducir a una mejor distribución dentro del tejido de la planta y los órganos de la planta. Incrementado el número o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan las sustancias químicas finas de la célula, se puede permitir una cantidad de la sustancia química fina producida, la cual está presente en el medio extracelular , que se va a incrementar, facilitando así la cosecha y purificación o, en el caso de plantas, una distribución más eficiente. En contraste, se requieren cantidades incrementadas de cof ctores, moléculas pr-&e¾t-?soras e intermediarios—par¾—-í¾s— ttt-as biosintéticas-para-una producción eficiente de una o más sustancias químicas finas. Incrementado el número y/o la actividad de proteínas transportadoras involucradas en la importación de nutrientes tales como fuentes de carbono (es decir azúcares) , fuentes de nitrógeno (es decir sales de amonio) , fosfato y azufre, se puede mejorar la producción de una sustancia química fina debido a la eliminación de todas las limitaciones de los nutrientes disponibles en el proceso biosintético . Los ácidos grasos tales como los PUFAs y lípidos que comprenden PUFAs son sustancias químicas finas deseables en sí mismas; que optimizan la actividad o incrementan el número de uno o más PSEs de conformidad con la invención, mejoran en la biosíntesis de estos compuestos, o deterioran la actividad de uno o más PSEs involucrados en la ruptura de estos compuestos, puede incrementarse así el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de las molécula de ácidos grasos y lípidos en los ciliados, algas, plantas, hongos, levaduras u otros microorganismos. La manipulación de uno o más genes PSE de conformidad con la invención, puede asimismo conducir a PSEs con actividades modificadas la cual afecta indirectamente la producción de una o más sustancias químicas finas de algas, plantas, ciliados u hongos. Los procesos metabólicos, bioquímicos, normales, conducen— or-—©5-empio-í—a—3ra—-rodtcc-ón-de una multiplicidad de productos de desecho (por ejemplo peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno) lo cual puede deteriorar estos procesos metabólicos (por ejemplo, el peroxinitrito es conocido para las cadenas laterales de tirosina de nitrato, inactivando así algunas enzimas con tirosina en el centro activo (Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol . 3 (2) ; 226-235) . Mientras que estos productos de desecho se excretan normalmente, se optimizan las células utilizadas para la producción fermentativa a gran escala para la sobreproducción de una o más sustancias químicas finas y por lo tanto se producen más productos de desecho lo cual es habitual para una célula de tipo silvestre. Optimizando la actividad de uno o más PSEs de conformidad con la invención la cual se involucran en la exportación de moléculas de desecho, se permite la mejora de la viabilidad de la célula y el mantenimiento de una actividad metabólica, eficiente. También, la presencia de elevadas cantidades intracelulares de la sustancia química fina, pueden de hecho ser tóxicas para la célula, de modo que la viabilidad de la célula se puede mejorar incrementado la capacidad de la célula de secretar estos compuestos. Además, los PSEs de conformidad con la invención se pueden manipular de tal manera que se modifiquen las Cantidades relativas p> ri i v . g a c! mnl ám l n n fin lí id S y á i- i rtrip grasos. Esto puede tener un efecto decisivo en la composición de los lipidos de la membrana celular. Puesto que cada tipo de lípido tiene diferentes propiedades físicas, la modificación de la composición de lipidos de una membrana puede modificar significativamente la fluidez de la membrana. Los cambios en la fluidez de la membrana pueden afectar el transporte de las moléculas a través de la membrana lo cual, como se explicó anteriormente pueden modificar la exportación de los nutrientes que se requieren. Estos compuestos en la fluidez de la membrana también pueden tener un efecto decisivo en la integridad celular; las células con membranas débiles comparativamente son más susceptibles a condiciones de tensión abiótica y biótica las cuales pueden dañar o matar la célula. La manipulación de los PSEs que se involucran en la producción de ácidos grasos y lipidos para la síntesis de la membrana de modo que la membrana resultante tenga una composición de membrana la cual sea más susceptible a las condiciones ambientales que prevalecen en los cultivos utilizados para la producción de sustancias químicas finas, debe permitir que más células sobrevivan y se multipliquen. Las grandes cantidades de células productoras se deben manifestar en sí mismas en mayores rendimientos, una producción superior o una eficiencia super-i r—en—La— roducción—de—i —s¾staneia—qtmtrirca—f-rrta—dei-cultivo . Se pretende que las estrategias de mutagénesis antes mencionadas para los PSEs, que conducen a rendimientos elevados de una sustancia química fina, no se interpreten como limitantes; las variaciones de estas estrategias son fácilmente obvias para el trabajador experto. Utilizando estos mecanismos, y con la ayuda de los mecanismos descritos aquí, las moléculas de ácido nucleico y proteínas de conformidad · con la invención, se pueden utilizar para generar algas recombinantes o transgénicas , ciliados, plantas, animales no-humanos, hongos u otros microorganismos tales como el C. glutamicum el cual expresa moléculas mutadas de ácido nucleico y proteínas PSE de modo que se mejora el rendimiento, producción y/o eficiencia en la producción de un compuesto deseado. Este compuesto deseado puede ser cualquier producto natural de algas, ciliados, plantas, animales, hongos o C. glutamicum, el cual comprende el producto terminado de rutas biosintéticas y los intermediarios de rutas metabólicas de origen natural, y también moléculas las cuales no están presentes de manera natural en el metabolismo de estas células, aunque las cuales se producen mediante las células de conformidad con la invención.

Una modal i.dad— diei-oaal—de—conformirdad--eon—ta—inven iórr es un proceso para la producción de PUFAs, lo cual comprende cultivar un organismo que comprende un ácido nucleico de conformidad con la invención, una estructura genética de conformidad con la invención o un vector de conformidad con la invención, el cual codifica un polipéptido que alarga los ácidos grasos con Ci6 ó Ci8 con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso mediante al menos dos átomos de carbono bajo condiciones en las cuales se producen los PUFAs en los organismos. Los PUFAs preparados mediante este proceso se pueden aislar cosechando los organismos ya sea del cultivo en el cual los mismos crecen o del campo, y deteriorando y/o extrayendo el material cosechado con un solvente orgánico. El aceite, que contiene lípidos, fosfolípidos , esfingolípidos , glicolípidos , triacilgliceroles y/o ácidos grasos libres con un contenido superior de PUFA, se puede aislar de este solvente. Los ácidos grasos con un contenido superior de PUFAs se pueden aislar mediante la hidrólisis básica o ácida de los lípidos, fosfolípidos , esfingolípidos , glicolípidos y triacilgliceroles. Un contenido superior de PUFAs significa al menos 5%, de manera preferible 10%, en especial preferiblemente 20%, en especial muy preferiblemente 40% más de los PUFAs que el organismo original, por ejemplo un Oomycete tal como Phytophthora o una planta tal como una planta de cultivo de aceite , L —cuaL—ae—tie e- ???—ácido-nucleico adicional que codifique la elongasa de conformidad con la invención. Además, los aceites, lípidos, fosfolípidos , esfingolípidos , glicolípidos, triacilgliceroles y/o ácidos grasos libres antes mencionados con un contenido superior de PUFA, tienen una composición diferente a la composición de los organismos de partida. Esto aplica en particular a las plantas que no comprenden de manera natural ácidos grasos poliinsaturados con C20 C22 de cadena larga, tales como DHA, EPA o ARA. Los PUFAs producidos mediante este proceso preferiblemente son moléculas de ácido graso con C2o ó C22 con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferiblemente tres o cuatro enlaces dobles, en especial preferiblemente tres enlaces dobles. Estas moléculas de ácido graso con C20 ó C22 se pueden aislar del organismo en la forma de un aceite, lípido o un ácido graso libre. Los ejemplos de organismos adecuados son aqullos mencionados anteriormente. Los organismos preferidos son las plantas transgénicas . Una modalidad de conformidad con la invención son aceites, lípidos o ácidos grasos o fracciones de los mismos los cuales se han preparado mediante el proceso descrito anteriormente, en especial preferiblemente aceite, lípido o una composición de ácido grasn qn comrende—les—P-UFAs—y—que-se originan de plantas transgénicas. Una modalidad adicional de conformidad con la invención es el uso del aceite, lípido o la composición de ácido graso en materiales para alimentación, comestibles, cosméticos o f rmacos . Esta invención se ilustra con mayor detalle por los ejemplos que siguen, los cuales no se interpretarán como limitantes. El contenido de todas las referencias, solicitudes de patente, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en esta solicitud de patente, se incorpora aquí como referencia . Ej emplos Ejemplo 1: Métodos generales a) Métodos de clonación generales: Los métodos de clonación, tales como, por ejemplo, las escisiones de restricción, la electroforesis con gel de agarosa, la purificación de fragmentos de ADN, la transferencia de ácidos nucleicos a membranas de nitrocelulosa y nylon, el enlace de fragmentos de ADN, la transformación de las células de Escherichia coli y levadura, el cultivo de bacterias y el análisis de secuencia del ADN recombinante, se llevan a cabo como se describe en Sambrook et al. ((1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) ó Genetics" , Cold Spring Harbor Laboratory Press : ISBN 0-87969-451-3) . b) Sustancias químicas A menos que se especifique de otra manera en el texto, las sustancias químicas utilizadas se obtienen en una calidad de grado analítico de Fluka (Neu-Ulm) , Merck (Darmstadt) , Roth (Karlsruhe) , Serva (Heidelberg) y Sigma (Deisenhofen) . Las soluciones se prepararon utilizando agua pura, libre de pirógenos, mencionadas en el siguiente texto como H20, de una unidad de purifica de agua del sistema de agua Milli-Q (Millipore, Eschborn) . Las endonucleasas de restricción, las enzimas para la modificación del ADN y equipos de biología molecular se obtienen de AGS (Heidelberg) , Amersham (Brunswick) , Biometra (Góttingen) , Boehringer (Mannheim) , Genomed (Bad Oeynhausen) , New England Biolabs (Schwalbach/Taunus) , Novagen (Madison, Wisconsin, USA) , Perkin-Elmer (Weiterstadt) , Pharmacia (Freiburg) , Qiagen (Hilden) y Stratagene (Ámsterdam, Países Bajos) . Ejemplo 2: Construcción de la biblioteca de ADNc Para construir la biblioteca de ADNc, se llevó a cabo la síntesis de la primera hebra utilizando transcriptasa inversa del virus de la leucemia en los ratones (Roche, Mannheim, Alemania) y cebadores de oligo-d(T), mientras que se lleva a cabo—La—síntesis—de—La—segunda—hebra—mediante—Lneubación con polimerasa I de ADN, enzima Klenow y escisión con ARNasa H a 12°C (2 horas) , 16°C (1 hora) y 22°C (1 hora) . La reacción apago mediante incubación a 65°C (10 minutos) y subsecuentemente se transfiere al hielo. Se elaboraron moléculas de ADN de doble hebra con extremos despuntados, con polimerasa de ADN T4 (Roche, Mannheim) a 37 °C (30 minutos) . Los nucleótidos se . remueven mediante extracción con fenol/cloroformo y columnas de centrifugación Sephadex G50. Los adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) , se removieron a los extremos del ADNc por medio de la ligasa de ADN T4 (Roche, 12 °C, toda la noche) y se fosforilaron mediante incubación con el polinucleótido cinasa (Roche, 37°C, 30 minutos) . Esta mezcla se somete a separación en un gel de agarosa a baja fusión. Las moléculas de ADN de más de 300 pares base, se eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron en las columnas Elutip D (Schleicher y Schüll, Dassel , Alemania) , se ligaron a los brazos del vector y se empacaron en los fagos lambda-ZAPII o fagos lambda-ZAP-express utilizando el equipo Gigapack Gold (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos) , utilizando el material del fabricante y siguiendo sus instrucciones. Ejemplo 3: Secuenciación y análisis por computadora del ADN Se_LL i, ? i 7,ñron—laibliofcec s—de—ADNe—eetne—s-e—deseribe—en el Ejemplo 4 para secuenciar el ADN mediante métodos estándar, en particular el método de terminación de cadenas utilizando el equipo de reacción listo para secuenciación ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). Después de la preparación de plásmidos de las bibliotecas de ADNc, los clones se secuenciaron al azar a través de una escisión y transformación in vivo de la masa del DH10B en las placas de agar (detalles sobre los materiales y el protocolo: Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos) . Se preparó el ADN del plásmido a partir de los cultivos de E. coli que crecen durante la noche en caldo de Luria suplementado con ampicilina (ver Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)) utilizando un robot para la preparación de ADN de Qiagen (Qiagen, Hilden) siguiendo los protocolos del fabricante. Se utilizaron cebadores de secuenciación con las siguientes secuencias de nucleótidos: 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3 ' 5 ' -CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3 ' 5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' Las secuencias se procesaron y comentaron utilizando el paquete de computación estándar EST-MAX el cual está disponible comercialícente de Bio-Max (Munich, Alemania) . Se aracteri ??—con—mayor—detalle—un—clon—ees—homologías—dcbilca con elongasas conocidas . Ejemplo 4: Identificación del gen PSE1 de P. infestans, y análisis del clon PiPSEl del ADNc Una secuencia EST (acceso de la base de datos: PI001002014r) se consideró como un gen objetivo, entre otros genes candidatos, debido a su débil homología con las elongasas conocidas. El programa BESTFIT, es decir las matrices de sustitución de aminoácidos BLOSU , se utilizó para la alineación de secuencias, se hace referencia a Henikoff, S., y Henikoff. J.G. (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. La secuencia del clon con el No. de la base de datos PI001002014r se utilizó para la alineación con la secuencia del péptido elol de la levadura. Puesto que el nuevo clon de P. infestans no está completo, se aisló el correspondiente clon de longitud completa (PiPSEl) , partiendo de la biblioteca de ADNc de P. infestans. Para este fin, se generó una sonda etiquetada con digoxigenina mediante PCR por medio del equipo de síntesis PCR DIG (Roche) , con PI001002014 que se utilizó como la plantilla. Se utilizaron los siguientes cebadores para la PCR: PI-DIGf : cacaccatcatgtacacttactac 1 P£--BiGr-: eaaettcttcttcga-fctcctccac La sonda etiquetada, aislada, se utilizó para seleccionar la biblioteca de ADNc de la P. infestans (de conformidad con el fabricante, Stratagene) . Se aisló un fragmento de 1046 bp y se nombró PiPSEl. La estructura de lectura abierta es de 837 bp de longitud y codifica una proteína de 278 aminoácidos con su masa molecular calculada de 32.1 kDa. Las alineaciones de secuencia revelaron las siguientes identidades de secuencia y similitudes de secuencia, respectivamente: 26%/43% con el PSElp de la Physcomitrella patens, 23%/37% con el HELOp humano, 21%/41% con el GLELOp de Mortierella alpina y 17/36% con la elongasa de C . elegans . Ejemplo 5: Identificación de genes por medio de hibridación Se pueden utilizar secuencias de genes para identificar genes homólogo o heterólogos de las bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas. Los genes homólogos (es decir clones de ADNc de longitud completa que son homólogos, u homólogos) se pueden aislar a través de hibridación utilizando, por ejemplo, bibliotecas de ADNc. Dependiendo de la frecuencia del gen de interés, bacteriófagos recombinantes se plantan y transfieren 100,000 hasta 1,000.000 a una membrana de nylon. Después de la desaturación con álcali, el ADN se inmoviliza en la membrana, por—ej emplo—mediante—reticulación—e©ñ—HV^—La—hibridación—se-realiza bajo condiciones fuertemente severas. La hibridación y los pasos de lavado se llevan a cabo en solución acuosa a una concentración iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68 °C. Se generan sondas de hibridación por ejemplo etiquetando con trascripción con mella radioactiva (32P-) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania) . Las señales se detectan mediante auto-radiografía . Los genes parcialmente homólogos u heterólogos que se relacionan pero que no son idénticos, se pueden identificar análogamente con el proceso descrito anteriormente utilizando hibridación de severidad baja y condiciones de lavado. Para la hibridación acuosa, la concentración iónica usualmente se mantiene a NaCl 1 M, y la temperatura se disminuye gradualmente de 68 a 42°C. El aislamiento de secuencias de genes que solamente exhiben homologías con un dominio individual de, por ejemplo, 10 a 20 aminoácidos, se puede llevar a cabo utilizando sondas de oligonucleotidos radioetiquetadas , sintéticas. Los oligonucleotidos radioetiquetados se generan fosforilando el extremo 5' de dos oligonucleotidos complementarios con el polinucleótido cinasa T4. Los oligonucleotidos complementarios se hibridizaron y ligaron entre sí para dar lugar a concatémeros . Los concatémeros de doble hebra se rarii oe. i qnetaron por- ej emplo mediante traocripción con mellado. La hibridación usualmente se lleva a cabo bajo condiciones de baja severidad utilizando concentraciones elevadas de oligonucleótidos. Solución de hibridación de oligonucleótidos: SSC 6x Fosfato de sodio 0.01 M 1 mM de EDTA (pH 8) SDS al 0.5% 100 og/ml del ADN de esperma de salmón desnaturalizado Lecha seca baja en grasa al 0.1% Durante la hibridación, la temperatura se- disminuyó en etapas de 5 a 10 °C por debajo de la temperatura calculada del oligonucleótido o a temperatura ambiente (a menos que se especifique de otra manera, RT= -23 °C en todos los experimentos) , seguido por etapas de lavado y auto-radiografía. Se llevo a cabo el lavado a una severidad extremadamente baja, por ejemplo 3 etapas de lavado utilizando SSC 4x. Se describen detalles adicionales por Sambrook, J. , et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ó Ausubel, F.M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley & Sons.

La preparación de anticuerpos—espec-í-f-ie e-7—per—ej-empio-según el Ejemplo 6: Hibridación Northern Para la hibridación de ARN, se separaron 20 ^g de ARN total ó 1 µ? de poli(A)+-ARN mediante electroforesis con gel en geles de agarosa concentrado al 1.25% utilizando formaldehído como se describe por Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) , se transfieren a membranas de nylon cargadas positivamente (Hybond N+, Amersham, Brunswick) mediante atracción capilar utilizando SSC lOx, se inmovilizan mediante luz UV y se pre-hibridizan durante 3 horas a 68°C utilizando hibridación (sulfato de dextrano al 10% p/v, NaCl 1 M SDS al 1%, 100 mg de ADN de esperma de arenque) . La sonda de ADN se ha etiquetado con el equipo de etiquetado de ADN Highprime (Roche, annheim, Alemania) durante la etapa de pre-hibridación utilizando alfa-32P-dCTP (Amersham, Brunswick, Alemania) . La hibridación se lleva a cabo después de agregar la sonda de ADN etiquetada en el mismo amortiguador a 68 °C durante la noche. Los pasos de lavado se llevaron a cabo dos veces durante 15 minutos utilizando SSC 2x y dos veces durante 30 minutos utilizando SSC lx SDS al 1%, a 68°C. Los filtros sellados se expusieron a -70 °C durante un periodo de 1 a 14 días . Ejemplo 7: Plásmidos para la transformación de plantas Se—pueden—utilizar—vectores—binarios—taie-s—como—ei-peinar para la transformación de plantas (Hofgen y Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230) . Los vectores binarios se pueden construir ligando el ADNc en orientación sentido y antisentido en el T-ADN. En el 5' del ADNc, un promotor de planta activa la trascripción de ADNc. La secuencia de poliadenilación se localiza en 3' del ADNc. La expresión del tejido específico se puede lograr utilizando un promotor de tejido específico. Por ejemplo, la expresión específica de semillas se puede lograr clonando en el promotor 5' napina o LeB4 ó USP del ADNc. También se puede utilizar cualquier elemento promotor de semillas específicas. El promotor CaMV 35S se puede utilizar para una expresión constitutiva en todas las plantas. La proteína expresada puede ser localizada en un compartimiento celular utilizando un péptido de señal, por ejemplo para las plastidas, mitocondria o retículo endoplásmico (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423) . El péptido de señal se clona 5' en la estructura de lectura correcta con el ADNc con el fin de lograr una localización subcelular de la proteína de fusión. Ejemplo 8: Transformación del Agrobacterium La transformación de plantas mediada con Agrobacterium se puede llevar a cabo utilizando la cepa GV3101 de la Agrobacterium—tumcfaciono—(pMP90) (Koncz—y—Schell ,—Mol .—Gen .

Genet. 204 (1986) 383-396) ó LBA4404 (Clontech) . La transformación se lleva a cabo mediante técnicas estándar de transformación (Deblaere et al. , Nucí. Acids . Tes. 13 (1984), 4777-4788) . Ejemplo 9: Transformación de plantas La transformación de plantas mediada con Agrobacterium se puede llevar a cabo utilizando técnicas estándar de transformación y regeneración (Gelvin, Stanton B. , Schilperoort , Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2nd Edition, Dordrecht : luwer Academic Publ . , 1995, in Sect . , Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. , Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolog , Boca Ratón: CRC Press, 1993, 360 pp., ISBN 0-8493-5164-2) . Por ejemplo, las semillas oleaginosas de colza se pueden transformar por medio de la transformación de cotiledóneas o hipocotiledóneas (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol . 91 (1989) 694-701) . El uso de antibióticos para la -selección de agrobacterias y plantas, depende del vector binario y la cepa agrobacteriana utilizada para la transformación. La selección de semillas oleaginosas de colza se lleva a cabo utilizando canamicina como marcador de plantas seleccionables .

La transferencia HP g np.q mediada—con—Agrobacter-iu lino se puede llevar a cabo por ejemplo utilizando una técnica descrita por Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13:282-285. La transformación de la soya se puede llevar a cabo por ejemplo utilizando una técnica descrita en la EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) ó en EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (Universidad de Toledo) . La transformación de plantas utilizando bombardeo de partículas, la absorción de ADN mediada con polietilenglicol o a través de la técnica con fibra de carbonato de silicio se describe, por ejemplo, por Freeling y Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York) . Ejemplo 10: Mutagénesis in vivo La mutagénesis o microorganismos in vivo se puede realizar pasando el ADN del plásmido (o cualquier otro ADN del vector) a través de E. coli u otros microorganismos (por ejemplo Bacillus spp. o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) , en los cuales la capacidad de retención, deteriora la integridad de su información genética. Las . cepas de mutación convencionales tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación del ADN (por ejemplo mutHLS, mutD, mutT y similares; como referencia, ver upp, .D. (1996) DNA repair mechan i sma,—ii —Escherichia—coli—and—Salmonclla-;—pp · 2277-2294, ASM: Washington) . Estas cepas son conocidas en el trabajador experto. El uso de estas cepas se ilustra por ejemplo en Greener, A., y Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34. Las moléculas ADN mutadas preferiblemente se transfieren a las plantas después de que los microorganismos se hayan seleccionado y probado. Las plantas transgenéticas se generan de conformidad con los diversos ejemplos en la sección de ejemplos del presente documento. Ejemplo 11: Estudio de la expresión de un producto genético recombinante en un organismo transformado La actividad de un producto genético recombinante en los organismos hospederos transformados, se mide en el nivel de trascripción y/o traducción. Un método adecuado para determinar la cantidad de trascripción del gen (el cual1 indica la cantidad de ARN disponible para la traducción del producto genético) para llevar a cabo un manchado northern (para referencia, ver Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, o la sección de ejemplos antes mencionadas) en el cual un cebador que está diseñado de tal manera que se enlace al ¦ gen de interés, se etiqueta con una etiqueta detectable (usualmente radioactividad o quimioluminiscencia) de modo que, cuando se extraiga el ARN total de un cultivo del organismo,—&e—se are —de—ua—§ l-í—s-e—feraitafier —a—aia—fflajfei?Í¾-estable y se incube con esta sonda, el enlace y el grado de enlace de la sonda indica la presencia así como la cantidad de ARNm para este gen. Esta información indica el grado de trascripción del gen transformado. El ARN total de la célula se puede preparar de células, tejidos u órganos mediante una pluralidad de métodos, todos los cuales son conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, el método de Bormann, E.R., et al. (1992) Mol. Microbiol . 6:317-326. Se pueden utilizar técnicas estándar, tales como manchado Western (ver, por ejemplo, Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) para estudiar la presencia o la cantidad relativa de proteína traducida por este ARNm. En este método, se extraen las proteínas de células totales, se separan por medio de electroforesis con gel , se transfieren a una matriz tal como nitrocelulosa y se incuban con una sonda tal como un anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína deseada. Esta sonda usualmente se proporciona con una etiqueta quimioluminiscente o colorimétrica la cual se puede detectar fácilmente. La presencia y la cantidad de la etiqueta observada indican la presencia y la cantidad de la proteína mutada deseada la cual está presente en la célula. reeombi-nantes- en la producción del producto deseado El efecto de la modificación genética en plantas, hongos, algas, ciliados o en la producción de un compuesto deseado (tal como un ácido graso) se puede determinar desarrollando los microorganismos modificados o la planta modificada bajo condiciones adecuadas (tales como aquéllas descritas anteriormente) y analizando el medio y/o los componentes de la célula para la producción incrementada del producto deseado (es decir de lípidos o de ácido graso) . Estas técnicas analíticas son conocidas para el trabajador experto e incluyen la espectroscopia, cromatografía de capa delgada, varios métodos de teñido, métodos enzimáticos y microbiológicos , y cromatografía analítica tal como cromatografía de líquidos de alta resolución (ver, por ejemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol . A2, pp. 89-90 y pp . 443-613, VCH einheim (1985); Fallón, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol. 3, Capítulo III: "Product recovery and purification" , pp. 469-714, VCH Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations : downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral , J.M.S. (1992) Recovery processes for 1 biological Materials. John Wi ~\ ey an —Rnxxs^—Sh^ieiwitz-, —J-.-A^ , —y- Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in : Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol . B3 Capítulo 11, pp. 1-27, VCH Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications) .

Además de los métodos antes mencionados, se extraen lipidos de planta del material de la planta como se describe por Cahoon et al. (1999) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935-12940, y Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. Se describe un análisis de lípido o ácido graso cualitativo y cuantitativo en Christie, illiam ., Advances in Lipid ethodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W. , Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 p . (Oily Press Lipid Library; 1) ; "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) bajo el título: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN. Además de medir el producto terminado de la fermentación, también es posible analizar otros componentes de rutas metabólicas las cuales se utilizan para producir el compuesto deseado, tal como intermediarios y subproductos, con el fin de determinar la eficiencia en la producción total del compuesto. Los métodos analíticos incluyen mediciones de las cantidades—de—nutrienteo—e¾—ei—medio—(pea?—ejemplo—azúcares-^-carbohidratos, fuentes de nitrógeno, fosfato y otros iones), composición de biomasa y mediciones de crecimiento, análisis de la producción de metabolitos acostumbrados de rutas biosintéticas , y mediciones de gases las cuales se generan durante la fermentación. Los métodos estándar para estas mediciones se describen en Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes y P.F. Stanbury, Ed. , IRL Press, pp. 103-129; 131-163 y 165-192 (ISBN: 0199535773) y las referencias establecidas en las mismas. Un ejemplo es el análisis de ácidos grasos (abreviaturas: FAME, éster metílico de ácido graso; GC-MS, cromatografía de gases-líquidos/espectrometría de masa; TAG, triacilglicerol ; TLC, cromatografía de capa delgada) . La detección inequívoca de la presencia de productos de ácido graso se puede obtener analizando organismos recombinantes mediante métodos estándar analíticos: GC, GC-MS ó TLC, cuando los mismos se describen en varias ocasiones por Christie y las referencias citadas en la misma (1997, en: Advances on Lipid ethodology , Fourth edition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, métodos de cromatografía de gases/espectrometría de masa, Lipide 33:343-353) . El material que se analiza se puede deteriorar mediante sonicación, molido en un molino de vidrio, nitrógeno líquido y molido—o—a—través—de—©tres—métodos—apÍicablc3.—Después—dei-deterioro, se debe centrifugar el material. El sedimento se resuspende en agua destilada, se calienta durante 10 minutos a 100 °C, se congela y se re-centrifuga seguido por extracción en ácido sulfúrico 0.5 M en metanol con dimetoxipropano al 2% durante 1 hora a 90 °C, lo cual conduce a compuestos de aceite y lípido hidrolizado los cuales dan lípidos transmetilados . Estos esteres metílicos de ácido graso se extraen en éter de petróleo y finalmente se someten a análisis GC utilizando una columna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm) a un gradiente de temperatura de entre 170°C y 240 °C durante 20 minutos y 5 minutos a 240 °C. La identidad de los esteres metílicos del ácido graso resultante se deben definir utilizando estándares los cuales estén disponibles comercialmente (es decir Sigma) . En el caso de ácidos grasos para los cuales no estén disponibles los estándares, la identidad se debe demostrar a través de la derivación seguida por el análisis GM-MS. Por ejemplo, la localización de ácidos grasos con triple enlace se debe demostrar a través del GM-MS siguiendo la derivación con derivados de 4 , 4 -dimetoxioxazolina (Christie, 1998 ver anteriormente) . Ejemplo 13: Estructuras genéticas en sistemas microbianos, heterólogos Cepas,—condiciones- de crecimiento y plaamidoa La cepa XL1 Blue MRF' kan de la Escherichia coli (Stratagene) se utiliza para subclonar el nuevo PiPSEl de la elongasa de Phytophthora infestans. Para expresar funcionalmente este gen, se utilizó la cepa INVSc 1 de Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen Co.)- Se cultivó la E. coli a 37°C en caldo Luria-Bertini (LB, Duchefa, Haarlem, Países Bajos) . Si es necesario se agrega ampicilina (100 mg/litros) , y 1.5% de agar (p/v) para el medio LB sólido. Se cultivó la Saccharomyces cerevisiae a 30 °C ya sea en un medio YPG o en un medio mínimo completo sin uracilo (CMdum; ver: Ausubel, F. ., Brent , R. , Kingston, R.E., Moore , D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. , Albright, L.B., Coen, D. ., y Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) junto con 2% (p/v) de ya sea rafinosa o glucosa. Para un medio sólido, se agrega 2% (p/v) de agar Bacto™ (Difco) . Los plásmidos utilizados para la clonación y expresión fueron pUCl8 (Pharmacia) y pYES2 (Invitrogen Co.) . Clonación y expresión de una elongasa específica de PUFA de la Phytophthora infestans Para la expresión en levadura, el clon piPSEl del ADNc de Phytophthora infestans, la cual codifica el gen de elongasa específica de PUFA (PfiF.l , se raodií-icó—prime-r-o—de—tal mane^a-que un sitio de restricción Kpnl y la secuencia de consenso de levadura para una traducción altamente efectiva (Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44,283-292), se obtiene después del codón de inicio y se obtiene un sitio de restricción Xbal el cual, flanquea el codón de terminación. Para amplificar la estructura de lectura abierta, se sintetiza un par cebador que es complementario de sus extremos 5' y 3'. ppexlf : cggaataccacataatgtcgactgagctactgcag ppexlr : cactagtctagattccaacttcttcttcgattcc La reacción se llevó a cabo con un ADN de plásmido como matriz en un formador de ciclos térmicos (Biometra) con polimerasa de ADN Pfu (Stratagene) y el siguiente programa de temperatura: 3 minutos a 96°C seguido por 30 ciclos con 30 segundos a 96 °C, 30 segundos a 55°C y 2 minutos a 72 °C, 1 ciclo con 10 minutos a 72 °C y detención a 4°C. El tamaño correcto de 883 bp del fragmento de ADN amplificado, se confirmó mediante electroforesis con gel TBE de agarosa. El ADN amplificado se extrajo del gel utilizando el equipo de extracción de gel QIAquick (QIAGEN) y se ligó en el sitio de restricción Smal del vector pUC18 desfosforilado utilizando el Equipo Sure Clone Ligation (Pharmacia) para dar lugar al pUCPSEl . Después de La Lt^Jisf-ar-ma-Gión—del—3£L4—Blue- MRF' kan de E. coli, se lleva a cabo una mini -preparación del ADN (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313) de transformantes en 24 clones y resistentes a la ampicilina, y los clones positivos se identificaron por medio del análisis de restricción BamHI . La secuencia del producto PCR clonado se confirmó mediante re-secuenciación utilizando el Equipo de reacción listo para secuenciación ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer , Weiterstadt) . El ADN del plásmido de pUC-PSEl se escindió adicionalmente con Kpnl/Xbal, y el fragmento de 900 bp resultante se ligó en el sitio de restricción Kpnl/Xbal del vector pYES2 del vector transportador de la E. coli de levadura desfosforilada . Después de la transformación de la mini -preparación del ADN y E. coli de los transformantes, la orientación del fragmento de ADN en el vector se verifico mediante la escisión con Hindi . Un clon se hizo crecer con el equipo de extracción del ADN del plásmido Nucleobond® AX 500 ( acherey-Nagel , Düringen) para la maxi -preparación del ADN. El INVScl de Saccharomyces se transformó con pY2PSEl y pYES2 por medio de un protocolo modificado de PEG/acetato de litio (Ausubel et al., 1995) . Después de la sección de las caso se seleccionan cuatro transformantes pY2PSEll (pY2PSEla- d) y un transformante pYES2 para el cultivo adicional y la expresión funcional . Expresión funcional de una actividad de elongasa en la levadura Precultivo : Se inocularon 20 mi del medio líquido de CMdum con rafinosa al 2% (p/v) con los clones de levadura transgénica (pY2PSEla-d, pYES2) y se cultivan durante 3 días a 30 °C, hasta que se haya alcanzado una densidad óptica a 600 nm (OD6oo) de 1.5-2. Cultivo principal: Para la expresión, se suplementaron 20 mi del medio líquido de CMdum con rafinosa al 2% y Tergitol NP-40 al 1% (p/v) con ácido ?-linoleico (?-18:3) a una concentración final de 0.003% (p/v) . El medio se inoculó con los pre-cultivos a una OD600 de 0.05. La expresión se indujo durante 16 horas a una OD60o de 0.2, utilizando galactosa al 2% (p/v), después de lo cual se cosechan los cultivos a una OD60o de 0.8-1.2. Análisis de ácidos grasos Los ácidos grasos totales de cultivos se extrajeron de cultivos de levadura y se analizaron por medio de cromatografía de gases ^ a a est-e fia,—&e—eose-c-haren- células de 5 mi del cultivo mediante centrifugación (1000 x g, 10 minutos, 4°C) y se lavaron una vez con 100 mM de NaHC03, de pH 8.0 para remover el medio residual y los ácidos grasos. Para preparar los esteres metílicos de cido graso (FA Es) , se trataron los sedimentos celulares durante 1 hora a 80 °C con H2S04 metanólico 1 M y dimetoxipropano al 2% (v/v) . Los FAMEs se extrajeron dos veces con 2 mi de éter de petróleo, se lavaron una vez con 100 mM de NaHC03, pH 8.0, y una vez con agua destilada, y se seca sobre Na2S04. El solvente orgánico se evaporó bajo una corriente de argón, y los FAMEs se disolvieron en 50 ocl de éter de petróleo. Las muestras se separaron en una columna capilar ZEBRON-ZB-Wax (30 m, 0.32 mm, 0.25 ocm; Phenomenex) en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 6850 equipado con un detector de ionización de flama. La temperatura del horno se programó de 70 °C (mantenida durante 1 minuto) a 200°C a una velocidad de 20°C/minuto, luego a 250°C (mantenida durante 5 minutos) a una velocidad de 5°C/minuto y finalmente 260°C a una velocidad de 5°C/minuto. Se utilizó nitrógeno como el gas portador (4.5 ml/minuto a 70 °C) . Los ácidos grasos se identificaron mediante comparación con tiempos de retención de los estándares de FAME (SIGMA) .

Los patrones de ácido graso de cinco cepas de levadura transgenética se muestran en la Tabla 1 en mol%. Las relaciones del ácido ?-linolénico que se han agregado y absorbido, se enfatizan mediante números impresos con letra negrita, aquéllos de los productos alargados mediante números en rojo y aquéllos del ácido ?-linolénico mediante números impresos con letra negrita (última línea) . El análisis GC de los FAMEs los cuales son de lípidos totales de las levaduras transformadas con pYES2 (i/control) y pY2PSEl, se muestra en la Figura 1. Para el análisis, se cultivan levaduras transgenéticas en la presencia de ?-18:3. Los resultados demuestran que ?-18:3 se ha incorporado en todas las levaduras transgenéticas en grandes cantidades. Todos los cuatro clones de levadura transgenética la cual se ha transformado con pY2PSEl exhibe un pico adicional en el cromatograma de gases, el cual se identifica como 20 : 3A8'11,14 mediante un comparación de los tiempo de retención. Una cromatografía de gases/espectroscopia de masa puede proporcionar una prueba adicional para confirmar esta identificación . Los productos identificados demuestran que la secuencia de—nuciréótrdos " e PiPSEl codifica unaTeTongasa de ácido graso A6-selectiva de la—Ehy^G^mit-elia—patens—de —moho,—ra—cnar conduce a la formación de nuevos ácidos grasos en levaduras transgenéticas . Se pueden llevar a cabo experimentos de alimentación adicional con un amplio rango de otros ácidos grasos (por ejemplo ácido linoleico (18 : 2A9,12?) , ácido estearidónico (18 :4?6,9,12,15) ) para confirmar la selectividad del substrato de esta elongasa con mayor detalle. Ejemplo 14: Aislamiento del producto deseado de organismos transformados en general El producto deseado se puede obtener del material de plantas o células de hongos, algas, ciliados, animales o del sobrenadante de los cultivos antes descritos mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Si el producto deseado no se secreta de las células, se pueden cosechar las células a partir del cultivo mediante centrifugación lenta, y las células se pueden lisar mediante técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o sonicación. Se pueden separar mecánicamente órganos de las plantas de otro tejido u otros órganos. Después de la homogeneización, el desecho celular se remueve mediante centrifugación, y la fracción del sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, se retiene para aislar adicionalmente el compuesto _desea_do. deseadas, las células RP rpmi ipypn ' a par-t-ir-—áei cultivo-mediante centrifugación lenta, y la fracción del sobrenadante se retiene para el aislamiento adicional . La fracción del sobrenadante de cada paso de aislamiento se somete a cromatografía con una resina adecuada, la molécula deseada se retiene ya sea en la resina de la cromatografía aún cuando que no se retienen muchos contaminantes en la muestra, o mediante contaminantes que permanecen en la resina aún cuando no están en la muestra. Estos pasos de la cromatografía se pueden repetir, si se desea, utilizando ya sea las mismas u otras resinas de la cromatografía. El trabajador experto está familiarizado con la selección de resinas de cromatografía adecuadas y con su uso más efectivo para una molécula en particular que se va a aislar. El producto aislado se puede concentrar mediante filtración o ultrafiltración y se almacena a una temperatura en la cual la estabilidad del producto es mucho mayor . Un amplio espectro de métodos de aislamiento es conocido en la técnica, y no se pretende que el método de aislamiento sea limitante. Estos métodos de aislamiento se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E., & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill : New York ( 1986 ) . Se puede determinar la identidad y pureza de los compuestos aislados mediante técnicas estándar en el arte. Las mismas incluyen cromatografía de -lí uidos—de—alta—r&e ltírei H- (HPLC) , métodos espectroscópicos, métodos de teñido, cromatografía de capa delgada, HIRS, ensayos con enzimas o métodos microbiológicos . Para una revisión de estos métodos analíticos, ver: Patek et al. (1994) Appl . Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32; y Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol . A27, VCH Weinheim, p . 89-90, pp. 521-540, pp . 540-547, pp . 559-566, 575-581 y pp . 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John iley and Sons; Fallón, A., et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17. Equivalentes El trabajador experto sabe, o puede identificar, cierto número de equivalentes de las modalidades especificas de conformidad con la invención, las cuales se han descrito aquí recurriendo simplemente a experimentos de rutina. Se pretende que estos equivalentes se cubran por las reivindicaciones de la patente.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> BASF Plant Science GmbH <120> Nuevo Gen de Elongasa y Método para Producir Ácidos Grasos Poliinsaturados <130> 925_2001 <140 ¦ <141> <160> 2 <170> Patentln Vers. 2.0 <210> 1 <211> 1066 <212> ADM <213> Phytophthora infestans <220> <221> CDS <222> (52) .. (888) <400> 1 gaattcggca cgaggttcgc acgtccatcg tc'tactcacc aacaagaagt c atg tcg 57 Met Ser 1 act gag cta ctg cag age tac tac gcg tgg gcc aac gcc acg gag gcc 105 Thr Glu Leu Leu Gln Ser Tyr Tyr Ala Trp Ala Asn A la Thr Glu Ala 5 10 15 aag ctg ctg gac tgg gtc gac ect gag ggc ggc tgg aag gtg cat ce t 153 Lys Leu Leu Asp Trp Val Asp Pro Glu Gly Gly Trp Lys Val His Pro 20 25 30 atg gca gac tac ecc cta gcc aac ttc tec age gtc tac gcc atc tgc 201 Met Ala Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Phe Ser Ser Val Tyr Ala lie Cys 35 40 45 50 gtc gga tac ttg ctc ttc gta atc ttc ggc acg gcc ctg atg aaa atg 249 Val Gly Tyr Leu Leu Phe Val lie Phe Gly Thr Ala Leu Met Lys Met 55 60 65 gga gtc ecc gcc atc aag acc agt cea tta cag ttt gtg tac aac ecc 297 Gly Val Pro Ala lie Lys Thr Ser Pro Leu Gln Phe Val Tyr Asn Pro 70 75 80 atc caá gtc att gcc tgc tct tat atg tgc gtg ga g gcc gcc atc cag 345 Gln Val lie Ala Cys Ser Tyr Met Cys Val Glu Ala Ala lie Gln 85 90 95 gcc tac cgc aac ggc tac acc gcc gcc ccg tgc aac gcc ttt aag tcc 393 Ala Tyr Arg Asn Gly Tyr Thr Ala Ala Pro Cys Asn Ala Phe Lys Ser 100 105 110 gac gac ccc gtc atg ggc aac gtt ctg tac ctc ttc tat ctc tcc aag 441 Asp Asp Pro Val Met Gly Asn Val Leu Tyr Leu Phe Tyr Leu Ser Lys 115 120 125 130 atg ctc gac ctg tgc gac acá gtc ttc att ate cta gga aag aag tgg 489 Met Leu Asp Leu Cys Asp Thr Val Phe lie lie Leu Gly Lys Lys Trp 135 140 145 aaa cag ctt tcc ate ttg cae gt g tac cae cae ctt acc gtg ctt ttc 537 Lys Gln Leu Ser lie Leu His Val Tyr His His Leu Thr Val Leu Phe 150 155 160 gtc tac tat gtg acg ttc cgc gcc gct cag gac ggg gac tea tat gct 585 Val Tyr Tyr Val Thr Phe Arg Ala Ala Gln Asp Gly Asp Ser Tyr Ala 165 170 175 acc ate gtg ctc aac ggc ttc gtg cae acc ate atg tac act tac tac 633 Thr lie Val Leu Asn Gly Phe Val His Thr lie Met Tyr Thr Tyr Tyr 180 185 190 ttc gtc age gcc cae acg cgc aac att tgg tgg aag aag tac ctc acg 681 Phe Val Ser Ala His Thr Arg Asn lie Trp Trp Lys Lys Tyr Leu Thr 195 200 205 210 cgc att cag ctt ate cag ttc gtg acc atg aac gtg cag ggc tac ctg 729 Arg lie Gln Leu lie Gln Phe Val Thr Met Asn Val Gln Gly Tyr Leu 215 ' 220 225 acc tac tet cga cag tgc cea ggc atg ect ect aag gtg ccg ctc atg 777 Thr Tyr Ser Arg Gln Cys Pro Gly Met Pro Pro Lys Val Pro Leu Met 230 235 240 tac ctt gtg tac gtg cag tea ctc ttc tgg ctc ttc atg aat ttc tac 825 Tyr Leu Val Tyr Val Gln Ser Leu Phe Trp Leu Phe Met A sn Phe Tyr 245 250 255 att cgc gcg tac gtg ttc ggc ccc aag aaa ccg gcc gtg gag gaa tcg 873 lie Arg Ala Tyr Val Phe Gly Pro Lys Lys Pro Ala Val Glu Glu Ser 260 265 270 aag aag aag ttg taa cggcgcttgt taaaaagtct aacctcgctg taacagetta 928 Lys Lys Lys Leu 275 aaacacacac acacacaacg ctttgtagag gaggtaagta gtggcaactc gtgtagaaat 988 gcagcatgcc catcaaatac atcccgtatg attcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1048 aaaaaaaaaa aactcgag 1066 <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Phytophthora infestans <400> 2 Met Ser Thr Glu Leu Leu Gln Ser Tyr Tyr Ala Trp Ala Asn Ala Thr 1 5 10 15 Glu Ala Lys Leu Leu Asp Trp Val Asp Pro Glu Gly Gly Trp Lys Val 20 25 30 His Pro Met Ala Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Phe Ser Ser Val Tyr Ala 35 40 45 lie Cys Val Gly Tyr Leu Leu Phe Val lie Phe Gly Thr Ala Leu Met 50 55 60 Lys Met Gly Val Pro Ala lie Lys Thr Ser Pro Leu Gln Phe Val Tyr 65 70 75 80 Asn Pro lie Gln Val lie Ala Cys Ser Tyr Met Cys Val Glu Ala Ala 85 90 95 lie Gln Ala Tyr Arg Asn Gly Tyr Thr Ala Ala Pro Cys Asn Ala Phe 100 105 110 Lys Ser Asp Asp Pro Val Met Gly Asn Val Leu Tyr Leu Phe Tyr Leu 115 120 125 Ser Lys Met Leu Asp Leu Cys Asp Thr Val Phe lie lie Leu Gly Lys 130 135 140 Lys Trp Lys Gln Leu Ser lie Leu His Val Tyr His His Leu Thr Val 145 150 155 160 Leu Phe Val Tyr Tyr Val Thr Phe Arg Ala Ala Gln Asp Gly Asp Ser 165 170 175 Tyr Ala Thr lie Val Leu Asn Gly Phe Val His Thr lie Met Tyr Thr 180 185 190 Tyr Tyr Phe Val Ser Ala His Thr Arg Asn lie Trp Trp Lys Lys Tyr r95 2m 2XLS Leu Thr Arg lie Gln Leu lie Gln Phe Val Thr Met Asn Val Gln Gly 210 215 220 Tyr Leu Thr Tyr Ser Arg Gln Cys Pro Gly Met Pro Pro Lys Val Pro 225 230 235 240 Leu Met Tyr Leu Val Tyr Val Gln Ser Leu Phe Trp Leu Phe Met Asn 245 250 255 Phe Tyr lie Arg Ala Tyr Val Phe Gly Pro Lys Lys Pro Ala Val Glu 260 265 270 Glu Ser Lys Lys Lys Leu 275

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1. - Un ácido nucleico aislado, caracteriado porque codifica un polipéptido con ácidos grasos Ci6 o Cíe alargados con al menos dos dobles enlaces en el ácido graso por al - ' j i„ A5t.9,12 ?8,11,14 ?5, 8,11, 14 menos dos átomos de carbono Ci8:3 , C2o:3 C20;4 y C2o o:5oA5'8, 11'14'17 que no están alargados. 2. - Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que alarga los ácidos grasos de Ci6 o Ci8 con al menos dos dobles enlaces en la molécula de ácido graso, seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC. ID NO: 1, b) una secuencia de ácido nucleico la cual, de conformidad con la degeneración del código genético, se deriva de la secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 2, c) derivados de la secuencia mostrada en la SEC. ID NO: 1 la cual codifica los polipéptidos con al menos 50% de homología con la secuencia que codifica las secuencias de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2, la secuencia que actúa como una elongasa con Ci6 ó Ci8- 3. - Una secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la —s cüencia s~e~ d¾ irva~de ttn—Oomárceto. 4. - Una secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2 o la 3, caracterizada porque la secuencia se deriva de Phytophthora . 5. - Una secuencia de aminoácido que se deriva de una secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4. 6. - Una construcción de gen, caracterizada porque comprende un ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido nucleico está enlazado funcionalmente a una o más señales reguladoras . 7. - Una construcción de gen de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada proqye su expresión de gen se mejora por las señales reguladoras. 8. - Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2 o una construcción de gen de conformidad con la reivindicación 6. 9. - Un organismo que comprende al menos un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, una construcción de gen de conformidad con la reivindicación 6 o un vector de conformidad con la reivindicación 8. 10. - Un organismo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada poruqe el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta. 11.- Un organismo de conformidad con la reivindicación 9 o la 10, caracterizado porque el organismo es una planta transgénica . TZT^ üñ proceso para la producción de PUFAs, caracterizado prque comprende cultivar un organismo que comprende un- ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, una construcción de gen de conformidad con la reivindicación 6 o un vector de conformidad con la reivindicación 8, que codifica un polipéptido que alarga los ácidos grasos de Ci6 o Cíe con al menos dos enlaces dobles en la molécula de ácido graso por al menos dos átomos de carbono bajo condiciones bajo las cuales se forman los PUFAs en el organismo. 13. - Un proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los PUFAs preparados por el proceso son las moléculas de ácidos grasos de C20 o C22 con al menos dos enlaces dobles en las moléculas de ácido graso. 14. - Un proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las moléculas de ácidos grasos de C2o o C22 se aislan del organismo en la forma de aceites, lipidos o ácidos grasos libres. 15. - Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta. 16. - Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque el organismo es una planta transgénica. 17. - Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque el ácido graso" de C16 o C18 es un ácido graso con tres enlaces dobles en la molécula . 18. - Un aceite, lipido o ácido graso o una fracción de los mismos, preparado por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 o 17. 19. - Una composición de aceite, lipido. o ácido graso, caracterizada porque comprende PUFAs y que se deriva de una planta transgénica. 20. - Una composición de aceite, lipido o ácido graso de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque los PUFAs se derivan de las plantas transgénicas que comprenden una secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 2. 21. - El uso de la composición de aceite, lipido o ácido graso en materiales de alimentación, de alimentos, cosméticos o farmacéuticos.