JP2013256452A

JP2013256452A - メラニン産生抑制剤とその組成物

Info

Publication number: JP2013256452A
Application number: JP2012132259A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Aoki; 強青木
Original assignee: Kawaken Fine Chemicals Co Ltd
Current assignee: Kawaken Fine Chemicals Co Ltd
Priority date: 2012-06-11
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2013-12-26

Abstract

【課題】安全性に優れ、効果が実用上において満足のゆくメラニン産生抑制剤を提供する。
【解決手段】（Ａ１）配列番号１〜配列番号１１に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるチロシナーゼのｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび
（Ａ２）配列番号１２〜配列番号１５に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるＴＲＰ−１のｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド
からなるチロシナーゼおよび/又はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドから選ばれる１種以上の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりなるメラニン産生抑制剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１をコードするｍＲＮＡの特定部位にハブリダイズする特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるメラニン産生抑制剤及びそれを配合することを特徴とするチロシナーゼ及び／または発現抑制機能を有する美白化粧料に関する。

メラニンの生成機構は複雑で多岐にわたるが、概略としては、チロシンがチロシナーゼに酸化されることにより生成したドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）が、さらにチロシナーゼにより酸化されることによりドーパキノンが生成した後、数段階の反応を経てメラニンが生成するという経路が明らかになりつつある。

この経路において、チロシナーゼはメラニン生成の重要な役割を果たしていることから、皮膚のシミ、ソバカス等の予防または治療を目的として、チロシナーゼの活性を阻害することにより、メラニン生成を抑制する物質が種々提案されている。

具体的には、アスコルビン酸およびその誘導体（特許文献１）、ハイドロキノン誘導体（特許文献２）、コウジ酸類（特許文献３）、プラセンターエキス等の胎盤抽出物（特許文献４）、アセチルカルニチン（特許文献５）、マンゴスチン果皮抽出物（特許文献６）等を配合した化粧料が提案されている。しかしながら、これらの技術は効果が不十分であった。

メラニンの生成機構にかかわる反応シリーズに含まれることが知られる酵素は、本質的にチロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）である。

これらの酵素は、チロシンのドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換の反応およびドーパのドーパキノンへの変換の反応を特に触媒し、メラニン色素形成を導く。これらの必須酵素の産出に関与するチロシナーゼ、ＴＲＰ−１をコードするmRNAの発現を調節するために、該mRNAに対し向けられたオリゴヌクレオチドを美白化粧料に使用する技術も公開されている（特許文献７）。

しかしながら、効果が不十分でその改善を求められていた。

また、安定で優れたアンチセンス若しくはアンチジーン活性、又は、特定遺伝子の検出薬（プローブ）若しくは増幅開始の為のプライマーとして優れた活性を有する、新規オリゴヌクレオチド類縁体及びその製造中間体である新規ヌクレオシド類縁体の技術も開示されている（特許文献８）。

しかしながら、各種非天然型のオリゴヌクレオチド類縁体による化粧料、美白化粧料に関する検討は行われていなかった。

特開２００６−０５２１７６号公報特開２００５−３０６７９７号公報特開２００５−１２００２３号公報特開２００５−３３６１２７号公報特開２０００−１７８１６６号公報特開平４−２４４００４号公報特表２００３−５２１９２９号公報特許第３４２０９８４号公報

従来のチロシナーゼの活性障害を利用するメラニン産出抑制は、ハイドロキノンの様に安全性に問題のあるものや、効果が実用上において満足できないものであった。

従来の酵素障害作用ではなく、酵素そのものを細胞内で生成できないよう酵素製造をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する技術も紹介されているが、チロシナーゼ産出抑制を実施できるがその効果は十分なものではなかった。

本発明者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用したメラニン産出抑制を鋭意検討の結果。特定の配列を有する非天然型オリゴヌクレオチド鎖がチロシナーゼ及びＴＲＰ-1のｍＲＮＡにアンチセンスとして作用することを見出し、当該非天然型オリゴヌクレオチドがヒト由来メラノーマ細胞であるHMV-II細胞を使ったチロシナーゼ発現量に十分な抑制効果があることを確認して本発明を完成させた。

即ち本発明は、
（Ａ１）配列番号１〜配列番号１１に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるチロシナーゼのｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび
（Ａ２）配列番号１２〜配列番号１５に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるＴＲＰ−１のｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるチロシナーゼおよび/又はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドから選ばれる１種以上の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりなるメラニン産生抑制剤に関するものである。

特に配列番号１〜１５の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドが一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを含有する非天然型オリゴヌクレオチドであるメラニン産生抑制剤に関するものである。

［式中、Ｒ^１及びＲ^２は、同一又は異なって、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基又は
−Ｐ（Ｒ^３）Ｒ^４
［式中、Ｒ^３及びＲ^４は、同一又は異なって、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、炭素数１乃至５個のシアノアルコキシ基又は炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基を示す］を示し、Ａは、炭素数１乃至４個のアルキレン基を示し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基又は下記α群から選択される置換基を有する置換プリン−９−イル基若しくは置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基を示す。］で表わされる化合物及びその塩。
（α群）
水酸基、保護された水酸基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基、及び、ハロゲン原子。

また、本発明メラニン産生抑制剤は、窒素含有化合物と同時に作用させることにより効果が最大化する。

本発明によるメラニン産生抑制するオリゴヌクレオチド提供することにより、メラニン生成メカニズムの研究に有用な手段を与える。さらに日光性色素斑、肝斑、雀卵斑等の色素沈着症の症状緩和や予防方法の研究に供することができる。

以下、本発明の実施形態について説明する。

本発明の非天然オリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子もしくはmRNA、またはチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）をコードするmRNAとハイブリダイズできる。

本明細書において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、二重ヘリックスの形態で二本鎖を形成するように、通常核酸の２つの鎖上の相補的塩基の間で、ワトソン−クリック塩基対としても知られる、水素結合の形成を示すように使用される。

本発明は、
（１）チロシナーゼをコードする遺伝子もしくはmRNAまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子もしくはmRNAと特異的にハイブリダイズできる
（２）非天然型オリゴヌクレオチド
を構成要件とするメラニン産生抑制剤である。

チロシナーゼもしくはＴＲＰ−１をコードする遺伝子もしくはmRNAと特異的にハイブリダイズできる塩基配列は、本発明者の検討により
（Ａ１）チロシナーゼ用の配列番号１〜配列番号１１に記載された塩基配列および
（Ａ２）ＴＲＰ−１用の配列番号１２〜配列番号１５に記載された塩基配列
からなるからなることが実験的に確認された。

特にチロシナーゼ用コードである配列番号３、８、１０、１１
及びＴＲＰ−１用コードである配列番号１４、１５
からなるコードによるチロシナーゼおよび/又はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドから選ばれる１種以上の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりなるメラニン産生抑制剤に関する。

本発明の重要点は、チロシナーゼもしくはＴＲＰ−１をコードする遺伝子もしくはmRNAと特異的にハイブリダイズできる塩基配列の少なくも一部が非天然型オリゴヌクレオチドで構成されることである。

本明細書において、非天然型オリゴヌクレオチドとは、化学修飾されたヌクレオシド（非天然型ヌクレオシド）をリン酸ジエステル結合により２乃至５０個結合した単位を含有する非天然型オリゴヌクレオチドを構造に含有する天然には存在しないオリゴヌクレオチドを示す。

そのような非天然型オリゴヌクレオチドとしては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル結合部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体を挙げることができ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体及びリン酸ジエステル結合部分がチオエート化されたチオエート誘導体を挙げる事が出来る。

糖部分が修飾された非天然型ヌクレオシドとしては、２’−ＯＭｅ型修飾リボースを含有する物などがあげられるが、好ましくは、一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドである。

より好ましくは、一般式（１）においてＢが配列記号Ａに対応するアデニン、配列記号Ｇに対応するグアニン、配列記号Ｃに対応する5-メチルシトシン、配列記号Ｔに対応するチミンからなる塩基であり、Ａがメチレン基であり、Ｒ１は、水酸基の保護基（特に、メトキシ基で置換されていてもよいトリチル基）を示し、Ｒ２は、ホスホニル基、後述するモノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類又はジ置換−アルコキシホスフィン類を反応することにより形成される基を示す非天然型ヌクレオシドが好ましい。

「非天然型ヌクレオチド」は、異なるまたは同一の一般式（１）の非天然型ヌクレオシド類をリン酸ジエステル結合で２乃至５０個結合した非天然型ヌクレオチド構造からなるヌクレオチド及び、非天然型ヌクレオチド構造を一部含有するヌクレオチドを示す。

一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドは糖部分の2’位と4’位を架橋した構造を有する特徴を有しておりフラノース環の構造が安定化し、一般式（１）で示されるヌクレオシド類縁体からなる非天然型オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチドはｍＲＮＡとの安定な相補鎖形成能が高い性能を有する。

非天然型ヌクレオシドからなる非天然型オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチドとは、特定配列のヌクレオチドを構成するすべてのヌクレオシドを非天然型ヌクレオシドで構成しても良いし、その一部を構成しても良い。より好ましくは、特定配列のヌクレオチドの3’末端から２〜４個及び、5’末端から２〜４個のヌクレオシドを非天然型ヌクレオシドで置換した非天然型オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチドである。

所望のヌクレオチド配列の非天然型オリゴヌクレオチドは、必要な市販のホスホロアミダイト試薬等を使用して、通常の方法により、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Nucleic AcidsResearch, 12, 4539(1984)）記載の方法に準じて合成することが出来る。

本発明のチロシナーゼおよび/又はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドから選ばれる１種以上の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりなるメラニン産生抑制剤は、美白化粧料組成物の総重量の０．００００１％〜３％、好ましくは０．０００３％〜１％の範囲の量で配合することが好ましい。

本発明メラニン産生抑制剤の配合量が０．００００１％を下回るとメラニン産出抑制効果が発現せず好ましくなく、３％を超える量のメラニン産生抑制剤を配合してもその効果の上昇を望めないばかりか、美白化粧料組成物の安定性、使用感の悪化につながるので好ましくない。

本発明の効果を充分に達成するために、本発明オリゴヌクレオチドに窒素含有化合物を同時に作用させることが好ましい。

窒素含有化合物としてはカチオン性物質、含Ｎ界面活性剤を同時に配合することが好ましい。

カチオン性物質としては、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTIN等の市販トランスフェクション剤、カチオン性高分子が挙げられる。LIPOFECTAMINEは、−[２−({２,５−ビス(３−アミノプロピル)アミノ］−１−オキシペンチル}アミノ)エチル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(９−オクタデセニルオキシ)−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）の３：１リポソーム調合物である。

LIPOFECTINは、−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＴＭＡ」）およびＤＯＰＥのリポソーム調合物である。（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．84，p．7413（1987）参照）。

カチオン性高分子としては、INCIによるpolyquaterniumの指定の37のポリマーが例示される。特に好ましいのはカチオン化キトサン、カチオン化セルロース、カチオン化グァーガムが好ましい。

また、カチオン性を有するポリペプチドを併用することも有用で、ポリリジン、等が例示される。

これらのカチオン性物質を併用するときは、細胞膜融合促進剤を併用することがより好ましい。

細胞膜融合促進剤は、カチオン性脂質化合物を脂質と細胞膜との融合を促進させうる物質であり、そのような物質はカチオン性脂質組成物が生体活性剤を細胞内に伝達させる能力を強める。そのような物質の一部は遺伝子発現を促進させうる。これらの後者の物質は遺伝物質のトランスフェクションにおける使用に特に適する。カチオン性脂質組成物と細胞膜との融合を促進させうる物質の例には、例えば、硫酸アンモニウム、サイトカラシンＢ、クロロキン、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリ(エチレングリコール)が包含される。

含Ｎ界面活性剤としては、ＰＯＡ脂肪酸アルカノールアミド、ＰＯＡアルキルアミン、アミンオキシド、カルボベタイン、スルホベタインが好ましく、例えば下記の一般式(2)〜一般式(3)のものが特に好適なものとして挙げられる。

次の一般式（2）

〔式中、Ｒ³は直鎖又は分岐鎖の炭素数7〜18のアルキル基を示し、
Ａ^１及びＡ^２は
同一か又は異なって炭素数１〜３のアルキレン基を示し、
ｓは０又は１の整数を示し、
ｘ，ｙは互いに独立に０〜１０の数で、ｘ，ｙが同時に０であることはない。〕
で表わされるアミン及びアミド型界面活性剤。

次の一般式（３）

〔式中、Ｒ^４は直鎖又は分岐鎖の炭素数８〜18のアルキル基を示し、
Ａ^１及びＡ^２は同一か又は異なって炭素数１〜３のアルキレン基を示し、
ｓは０又は１の整数を示し、
ｏ，ｐは互いに独立に０〜１０の整数であり、
Ｒ^５およびＲ^６は互いに独立にメチル基、エチル基を示し
、ｍは１〜３の整数を示す〕
で表わされるアミンオキシド。

次の一般式（4）

〔式中、Ｒ^４は直鎖又は分岐鎖の炭素数８〜18のアルキル基を示し、
Ａ^１及びＡ^２は同一か又は異なって炭素数１〜３のアルキレン基を示し、
ｓは０又は１の整数を示し、
ｏ，ｐは互いに独立に０〜１０の整数であり、
Ｒ^５およびＲ^６は互いに独立にメチル基、エチル基を示し、
Ｒ^７は水酸基を含んでよい炭素数１〜３のアルキレン基を示し、
ｍは１〜３の整数を示す〕
で表わされるスルホベタイン。

次の一般式（5）

〔式中、Ｒ^４は直鎖又は分岐鎖の炭素数８〜18のアルキル基を示し、
Ａ^１及びＡ^２は同一か又は異なって炭素数１〜３のアルキレン基を示し、
ｓは０又は１の整数を示し、
ｏ，ｐは互いに独立に０〜１０の整数であり、
Ｒ^５およびＲ^６は互いに独立にメチル基、エチル基を示し、
Ｒ^７は水酸基を含んでよい炭素数１〜３のアルキレン基を示し、
ｍは１〜３の整数を示す〕
で表わされるカルボベタイン。

次の一般式（６−１）および式（６−２）

［式中Ｒ^５は炭素数１０〜１８のアルキル基又はアルケニル基を示し、
ｍは１〜３の整数、
ｖ、ｗは互いに独立に１〜３の整数、
Ｍ^１はアルカリ金属、アルカリ土類金属、アルカノールアミンを示し、
ｑは１又は２の整数を表す。］
からなるアミドアミン型両性界面活性剤。

アミドアミン型両性界面活性剤は、通常イミダゾリニウムベタイン類と称される界面活性剤群を包含する。イミダゾリニウムベタイン型界面活性剤は、その合成経路の中間段階でイミダゾリン環が加水分解を起こし、上記一般式（６−１）乃至は（６−２）の構造を持つことが明らかにされている（例えば特公昭５９−５１５３２、特公昭３５−４７６２、Cosmet Toiletries,Vol95,No11,p45-48,1980）。

これらのアミドアミン型両性界面活性剤の好適例は、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル-N'−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム、Ｎ−ヤシ脂肪酸アシル-N'−カルボキシエチル-N'−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が用いられる。

次の一般式（７−１）および式（６−２）

〔式中、Ｒ^６は直鎖又は分岐鎖の炭素数８〜18のアルキル基を示し、
Ｒ７及びＲ８は互いに独立に炭素数０〜４のアルキレン基を示し、
Ｘ及びＹは、同一か又は異なつて、水素、−ＣＯＯＭ^２、−ＳＯ_３Ｍ^３
（Ｍ^２Ｍ^３は水素、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルカノールアミンを示す）但しＸ及びＹは同時に水素原子にはならないを示す。〕
で表わされるアルキルアミド型アニオン界面活性剤。

これらの含Ｎ界面活性剤は単独で又は２種以上混合して用いることができる。

本発明メラニン産生抑制剤乃至はメラニン産生抑制剤組成物を含有する美白化粧料を処方する際は、経皮吸収促進剤を配合することが好ましい。

経皮吸収促進剤としては、一般に経皮吸収を促進させるために使用されるものであれば特に制限されず、例えばリン脂質、シクロデキストリン、オレイルアルコール、エチル−２−ヒドロキシプロパノエート、アセトン、プロパン−１−オール、ブチルラウレート、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドン、尿素、ブタン−１，４−ジオール、オクチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチン酸、プロパン−２−オール、２−メチルプロパン−２−オール、ヘキサン−２，５−ジオール、ペンタン−２，４−ジオール、ポリオキシエチレン（２）メチルエーテル、ポリオキシエチレン（２）エチルエーテル、ポリオキシプロピレン（１５）ステアリルエーテル、ジ（２−ヒドロキシプロピル）エーテル、２−ヒドロキシプロピオン酸、２−ヒドロキシオクタン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、１，４−ジオキシン、テトラヒドロフラン、プロピレングリコールジペラルゴネート、２−エチル−ヘキシルペラルゴネート、ジオクチルアジペート、ジカプリルアジペート、ジイソプロピルアジペート、ジイソプロピルセバケート、ジブチルセバケート、ジエチルセバケート、ジメチルセバケート、ジオクチルセバケート、ジベンジルセバケート、ジブチルスベレート、ジメチルアゼレート、ジオクチルアゼレート、ジブチルアゼレート、ジブチルフタレート、ジデシルフタレート、エチルミリステート、ブチルミリステート、ジブチルスクシネート、デシルオレエート、エチルカプロエート、エチルラウレート、エチルサチレート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、イソプロピルイソステアレート、ブチルステアレート、ベンジルベンゾエート、ブチルベンゾエート、ヘキシルラウレート、エチルカプレート、エチルカプリレート、ベンジルサリチレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリドン、５−メチル−２−ピロリドン、１，５−ジメチル−２−ピロリドン、１−エチル−２−ピロリドン、ホスフィンオキシド、糖エステル、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジエチル−ｍ−トルアミド、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン等が挙げられる。また、経皮吸収促進効果を有する成分を含有する植物エキスでもよく、例えばハッカ、センキュウ等の植物エキス等を使用することもできる。

本発明の効果に関して以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
オリゴヌクレオチドの準備
製造例および比較製造例
合成したオリゴヌクレオチド／非天然オリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。

本実験群においては、非天然型ヌクレオシドとして一般式（１）のＡがメチレンで、Ｂがアデニニル、グアニニル、5-メチルシトシニル、チミニルである2'-O,4'-C-エチレン架橋ヌクレオシドを使用した。

表１のコードに対して使用したヌクレオシドの構造別に表示してあり、○印のついた組み合わせに関してシグマ・ジェノシス(sigma genosys)と日本バイオサービスに依頼して合成した。

合成したオリゴヌクレオチド／非天然オリゴヌクレオチドに対して、後述方法によりターゲットｍＲＮＡの発現量をコントロールに対する発現量比率を測定した。
配列１〜９はラットチロシナーゼのｍＲＮＡにハイブリダイズする様に設計されたもので、配列１０および配列１１は、配列１〜９のスクリーニングで最も効果的だった配列８をヒトチロシナーゼに最適化したものである。配列１２〜１５はＴＲＰ−１のｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計されたものである。

比較配列１および２はチロシナーゼおよびＴＲＰ−１にハイブリダイズするよう設計されたが、スクリーニングによりその効果が認められなかった配列である。

比較配列３は非天然型で効果のあった配列８の天然型オリゴヌクレオチドである。

表中の「リン酸ジエステル」はヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合であることを示し、「Ｓ−オリゴ」は、非天然型ヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合の酸素原子1つをイオウに置換（ホスホロチエート）したもので、脂溶性が増加し、細胞膜透過性に優れている。

非天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドは5’末端および3’末端から4塩基ずつが非天然型ヌクレオシド、他は天然型のヌクレオチドを含む。 Control群は各使用細胞においてトランスフェクトされた際、細胞の遺伝子発現に影響を与えない配列を選択した。

試験例１配列１〜１7までのｍＲＮＡ発現量の抑制効果の検証
マウスメラノーマ由来細胞（B16F0細胞）を用いたオリゴヌクレオチドのチロシナーゼmRNA発現量の抑制効果
製造例の表１にある、本発明のメラニン産生抑制剤の作用について、皮膚においてメラニン色素産生に関与するマウスメラノーマ由来細胞（B16F0細胞）の細胞を用いてテストした。

メラニン産生細胞の培養及び本発明のメラニン産生抑制剤の導入処理

マウスメラノーマ由来のB16F0細胞(DSファーマバイオメディカル)は、DMEM培地(Gibco)に10%(v/v)のウシ胎仔血清（SIGMA）及びペニシリン 100 単位/ml（終濃度）、ストレプトマイシン 100μg/ml（終濃度）を添加した培地中に撒種した。培養は、湿度を飽和した条件下で5%の二酸化炭素を含む大気中、37℃で行なった。

培養細胞をトリプシン(Gibco)で処理して培養容器から剥離、培養培地への懸濁、遠心分離し、上清を取り除いた細胞ペレットを低血清培地であるOpti-MEM I (GIBCO)に再懸濁した。この細胞懸濁液中の細胞をウェルあたり100,000細胞の割合で12ウェルマイクロプレートに撒種した。

試験するオリゴヌクレオチドをそれぞれ200 p molと窒素含有化合物としてLipofectamine 2000(Invitrogen)を1 μlを100μlの低血清培地Opti-MEM I中で混合した。これを１ウェルあたり900μlの Opti-MEM Iを加えてあるB16F0細胞に添加した。このときのオリゴヌクレオチドの最終濃度は、各表に記載してある。

オリゴヌクレオチドを培地中に添加した３〜６時間後にオリゴヌクレオチドを含む培地を取り除き、あらたなDMEM培地を添加した。更に12〜48時間の培養の後に培地を取り除き細胞をリン酸緩衝性生理食塩水で洗浄した。

更に細胞をセルスクレーパーを用いて培養容器から剥がし取り、1.5mlマイクロチューブに移した。2000rpmにて１０分間遠心分離した後に上清を取り除いた。この細胞ペレットは、タンパク質の発現量の解析やmRNA発現量の解析に用いるまで-80℃にて保存した。

試験例２ RT-PCRによる遺伝子発現解析
回収した細胞にフェノール及びグアニジンイソチオシアネートを含むTrizol試薬（invitrogen社製）を500ul加え、ボルテックスミキサーで撹拌、溶解させた。室温で５分インキュベートした後に100ulのクロロホルムを添加、ボルテックスミキサーで混合、室温で５分インキュベートした。これを４℃で20400 xgにて20分間遠心分離した。上層を新しいチューブに移し、250ulのイソプロパノールを添加、混合した後に氷上で30分間冷却した。その後４℃で20400 xgにて20分間遠心分離した。上清を除去した後に75%エタノール水溶液(v/v)を500ul加えてペレットを洗浄した。４℃で20400 xgにて20分間遠心分離し、上清を除去した。このペレット洗浄を２回行った。上清を取り除き、チューブをデシケーター内で減圧下にて乾燥させた。RNAペレットをDEPC処理水（RNase-free-water）を30-50ul加えて、65℃、10分間加熱して溶解させた。 RNAの収量は、260nmの吸光度から算出した。

RNA 1ugをとりこれに300pmolのrandom primerと混合、DEPC処理水で全量を10ulに調整した。70℃にて５分加熱したあとに氷上で急冷した。これにPrimeScript 1^st strand cDNA合成キット（TaKaRa製）に付属の5xbuffer 4ul , RNase Inhibitior 0.5ul, PrimeScript RTase 1ulを添加、DEPC処理水で全量20ulに調整した。30℃で２０分反応させてcDNA合成を行なった。その後、95℃にて２分間加熱してRTaseを失活させた。cDNA に滅菌水80ulを加えて全量を100ulとした。

このcDNAにつきEx Taq-Hot start version（TaKaRa bio製）を用いて下記の条件でPCRを行い、電気泳動した。泳動結果をデジタルカメラで撮影し、Image Jによるデンシトメーター解析からmRNAの発現量変化を確認した。

表１で準備した配列１〜９および比較配列１の非天然型ヌクレオチドとcontrol０１の天然型ヌクレオチドを用いてマウスメラノーマ由来細胞（B16F0細胞）を用いたチロシナーゼ及びＴＲＰ−１のｍＲＮＡの発現量を表２及び表３に記載した。
表２はチロシナーゼのｍＲＮＡの発現をターゲットにしたシリーズである。

尚、表中の「リン酸ジエステル」はヌクレオシド類縁体間の結合がリン酸ジエステル結合であることを示し、「Ｓ−オリゴ」は、ヌクレオシド類縁体間の結合がリン酸ジエステル結合の酸素原子1つをイオウに置換（ホスホロチエート）したもので、脂溶性が増加し、細胞膜透過性に優れている。

配列１〜９および比較配列１の非天然型ヌクレオチドとcontrol０１の天然型ヌクレオチドの添加量は200nM乃至800nMであり表に記載されている。

リン酸ジエステルの200nMの実験群はスクリーニング段階で、配列１〜３および比較配列１の混合物によるＲＮＡ発現量の測定結果であり、各配列の単独での評価は800nMで実施している。配列１〜３の非天然型ヌクレオチドには効果があったが、比較配列１単独では効果がなかった。このことは本発明メラニン産生抑制剤が
(1)特定の配列と
(2)非天然型ヌクレオチドである
の両方の条件を満たすことが必要であることを示している。本発明が上記2要件を必須とすることは後述の表４の実験群でも明らかにされている。

結果、配列１〜９にチロシナーゼ産生ｍＲＮＡの発現量を減少させており、特に配列１、配列３、配列７、配列８は優れた性能を示した。表２に示した様に、この一般式（１）に示されるヌクレオシド類縁体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜透過性の低い天然型リン酸ジエステル結合を有するものであっても抑制効果を示している。さらに効果的であった配列に関しては、ヌクレオシド類縁体間の結合がリン酸ジエステル結合の酸素原子1つをイオウに置換（ホスホロチエート）したもので再度確認した。一般にリン酸ジエステル結合の酸素原子1つをイオウに交換することにより脂溶性が増加し、細胞膜透過性が改善される。

もっとも効果的なのは配列８において一般式（１）のヌクレオシド類縁体をホスホロチエートで結合したオリゴヌクレオチド類縁体を含有する非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドであった。

表３はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの発現をターゲットにしたシリーズである。

結果、配列１２〜１５はＴＲＰ−１産生ｍＲＮＡの発現量を減少させており、特に配列１４、配列１５は優れた性能を示した。

もっとも効果的なのは配列１４及び配列１５において一般式（１）のヌクレオシド類縁体をホスホロチエートで結合したオリゴヌクレオチド類縁体であった。

表１、表２の実験例でも、同一コードのオリゴヌクレオチドであっても導入する一般式（１）のオリゴヌクレオシド類縁体の種類（結合様式）を変更することによりｍＲＮＡの発現量に大きな差が出てきたため配列８を各種ヌクレオシド類縁体でのチロシナーゼｍＲＮＡの発現量を測定した。

配列８のリボース／リン酸ジエステル結合は、配列８の天然型ヌクレオチドであることを意味する。このようにチロシナーゼｍＲＮＡにハイブリダイズする可能性が確認された配列でも、本発明メラニン産生抑制剤が
(1) 特定の配列と
(2) 非天然型ヌクレオチドである
の両方の条件を満たすことが必要であることを示している。
非天然型ヌクレオチドの中でも一般式（１）のヌクレオシド類縁体を用いてヌクレオシド類縁体間をホスホロチエートで連結した非天然型オリゴヌクレオチドを含有した構造（配列８-ENA-PS）が最も優れていた。
実施例１ヒト由来メラノーマ細胞であるHMV-II細胞を使った実施例
表５は、ヒト由来のメラノーマ細胞であるHMV-II細胞に対するオリゴヌクレオチドの発現抑制効果を試験した結果である。配列１０及び配列１１は、ヒトのチロシナーゼのｍＲＮＡの発現をターゲットにしたシリーズである。この配列１０及び１１の配列は、マウスチロシナーゼのmRNAの配列中で表２及び表４に結果を示した配列８のハイブリダイズする部位の近傍のうちでヒトのチロシナーゼｍＲＮＡの配列中で相同的な配列をもつ部位を対象として新たに設計した。（配列１０及び配列１１は、配列８とは異なる配列となった。）
尚、表中の実験結果は、ヌクレオシド類縁体間の結合がリン酸ジエステル結合の酸素原子1つをイオウに置換（ホスホロチエート）したもので、脂溶性が増加し、細胞膜透過性に優れている。
細胞は、理化学研究所バイオリソースセンターより入手した。

結果、配列１０および１１の非天然型オリゴヌクレオチドは、優れたヒト由来のチロシナーゼ発現量低下が確認された。

本発明メラニン産生抑制剤乃至はメラニン産生抑制剤組成物を含有する美白化粧料
（Ａ）油相成分 mg ％
イソプロピルミリステート 100 10.00%
プロピルパラベン 1.5 0.15%
フェノキシエタノール 5 0.50%
グリセロールモノステアレート 100 10.00%
（Ｂ）水相成分
第一リン酸ナトリウム 3 0.30%

第二リン酸ナトリウム 9 0.90%
ＰＯＥ（４０）ステアレート 50 5.00%
ヒドロキシプロピルメチルセルロース 5 0.50%
非天然型オリゴヌクレオチド配列８-ENA-PS 0.2 0.02%
ラウリン酸アミドプロピルアミンオキサイド 100 10.00%
メチルパラベン 3 0.30%
１Ｎ第一リン酸ナトリウム/水酸化ナトリウ pH7.0とする量
精製水 623.3 62.33%

油相成分を加熱溶解し、水相成分も溶解して準備する。次いで油相（Ａ）を水相（Ｂ）に加え、ホモジネートしながらエマルジョンを形成しその後室温に冷まして１ｇの本発明美白化粧料組成物を調整した。

尚、水相成分のラウリン酸アミドプロピルアミンオキサイドが一般式（３）で示される窒素含有化合物に相当する。

本発明を利用することにより、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１の優れた発現抑制機能を有するメラニン産生抑制剤乃至はメラニン産生抑制剤組成物提供する。

本発明のメラニン産生抑制剤乃至はメラニン産生抑制剤組成物を配合することにより優れた美白化粧料組成物。

Claims

（Ａ１）配列番号１〜配列番号１１に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるチロシナーゼのｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび

（Ａ２）配列番号１２〜配列番号１５に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるＴＲＰ−１のｍＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド

からなるチロシナーゼおよび/又はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドから選ばれる１種以上の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりなるメラニン産生抑制剤。
（Ａ１）配列番号３、８、９、１０、１１に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび

（Ａ２）配列番号１４、１５に記載された塩基配列を含有する非天然型オリゴヌクレオチドからなるＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチド

からなるチロシナーゼおよび/又はＴＲＰ−１のｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドから選ばれる１種以上の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりなるメラニン産生抑制剤。
請求項１または２記載の非天然型オリゴヌクレオチドが一般式（１）で示されるヌクレオシド類縁体を含有する非天然型オリゴヌクレオチドであるメラニン産生抑制剤。

［式中、Ｒ^１及びＲ^２は、同一又は異なって、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基又は
−Ｐ（Ｒ^３）Ｒ^４
［式中、Ｒ^３及びＲ^４は、同一又は異なって、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、炭素数１乃至５個のシアノアルコキシ基又は炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基を示す］を示し、Ａは、炭素数１乃至４個のアルキレン基を示し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基又は下記α群から選択される置換基を有する置換プリン−９−イル基若しくは置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基を示す。］で表わされる化合物及びその塩。
（α群）
水酸基、保護された水酸基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基、及び、ハロゲン原子。
請求項１〜３のいずれか１項で示されるラニン産生抑制剤に窒素含有化合物を配合してなるメラニン産生抑制剤組成物。
請求項４記載の窒素含有化合物がカチオン性高分子、カチオン性脂質および含Ｎ界面活性剤から選択されるメラニン産生抑制剤組成物。
請求項１〜５のいずれか１項に記載のメラニン産生抑制剤乃至はメラニン産生抑制剤組成物を含有する美白化粧料組成物。