WO2007013411A1 - 生物由来のアンチセンス核酸 - Google Patents

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WO2007013411A1
WO2007013411A1 PCT/JP2006/314597 JP2006314597W WO2007013411A1 WO 2007013411 A1 WO2007013411 A1 WO 2007013411A1 JP 2006314597 W JP2006314597 W JP 2006314597W WO 2007013411 A1 WO2007013411 A1 WO 2007013411A1
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antisense nucleic
antisense
probe
gene
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Jun Tomono
Souichi Morikawa
Takahisa Nakai
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Kaneka Corporation
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to an antisense nucleic acid using a biological nucleic acid as a raw material and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a cosmetic composition, an external preparation for skin or a pharmaceutical composition containing antisense nucleic acids derived from these organisms.
  • the technology is designed to artificially synthesize an antisense nucleic acid for a specific target gene based on the base sequence information of the gene, and then artificially synthesize it. It is what suppresses. Therefore, it can be used to examine the function of a certain gene or to inhibit the production of a specific protein that causes disease. Needless to say, this technology is used in biochemistry and molecular biology research, and the latter leads to drug development.
  • antisense nucleic acid drugs are expected to be a new type of medicine in the 21st century along with gene therapy drugs.
  • Patent Document 1 there has been a movement to use these antisense nucleic acids in whitening cosmetics.
  • an antisense nucleic acid as its active ingredient must be chemically synthesized in a large amount by a nucleic acid synthesizer, and in order to obtain an amount to be added to a product. A huge cost is required.
  • the obtained synthetic antisense nucleic acid is chemically synthesized, there is little knowledge of safety! / ⁇ has been an obstacle to use in humans.
  • this antisense nucleic acid has an effect (antisense effect) of hybridizing to the target gene or its transcription RNA and inhibiting the expression of that gene.
  • an effect antisense effect
  • a method for preparing a nucleic acid having such an antisense effect is it necessary to select a more effective one using a number of synthesized antisense nucleic acids (Non-patent Document 1)? 2), or a method of predicting and synthesizing a base sequence having an antisense effect without performing an experiment according to a certain algorithm (Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 1 Special Table 2003-521929
  • Non-Patent Document 1 K. R. Blake et al., Biochemistry 24 ⁇ 6132-6138 1985
  • Non-patent document 2 E. Uhlmann, A. Peyman, Chemical Reviews 90 ⁇ 543-584 1990
  • Non-patent document 3 R. A. Stull et al., Nucleic Acids Research 20 ⁇ 3501-3508 1992 Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a method for producing an antisense nucleic acid having an excellent antisense effect (antisense property) having abundant base sequence variations, mass production, and inexpensive, and a method for producing them.
  • An object of the present invention is to provide a cosmetic composition, an external preparation for skin, or a pharmaceutical composition.
  • the present inventors have conducted extensive research to enable a simple method for producing an antisense nucleic acid having excellent antisense properties that can be mass-produced at low cost. We have found a method for obtaining low-molecular-weight nucleic acids exhibiting antisense properties in high yield from raw materials by a simple operation.
  • the present invention is as follows.
  • a nucleic acid derived from a living organism is shredded into a single strand and adhered to a probe nucleic acid having at least a part of the base sequence of the target gene.
  • Steps (b) to (d) are repeatedly performed using a probe nucleic acid having a molecular weight larger than the molecular weight excluded from the ultrafiltration membrane used in the separation and recovery step [6] ] The manufacturing method of antisense nucleic acid.
  • the antisense nucleic acid is a nucleic acid that hybridizes to a melanin synthesis pathway-related gene, wing formation-related gene, aging-related gene, hair-growth-related gene, or cancer-related gene [8] to [11].
  • Sense nucleic acid is a nucleic acid that hybridizes to a melanin synthesis pathway-related gene, wing formation-related gene, aging-related gene, hair-growth-related gene, or cancer-related gene [8] to [11].
  • the antisense nucleic acid according to [12] which is a nucleic acid that hybridizes to a human tyrosinase gene or a human MMP-1 gene.
  • [14] [8] to [13 A cosmetic composition or an external preparation for skin containing any one of antisense nucleic acids as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising any one of antisense nucleic acids as an active ingredient.
  • an antisense nucleic acid having excellent antisense characteristics can be produced by a simple method using a nucleic acid derived from an organism having abundant base sequence variations, mass-produced and inexpensive.
  • the resulting antisense nucleic acid derived from a living organism can be used as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • FIG. 1 MMP-1 inhibitory effect of antisense nucleic acid of the present invention (western blotting result)
  • FIG. 2 HPLC chromatography pattern of the antisense nucleic acid of the present invention
  • the antisense nucleic acid referred to in the present invention is a group of nucleic acids containing 5 to: single-stranded DNA or RNA having a length of about LOO base, and the expression of a specific gene related to beauty, disease, etc.
  • artificially synthesized nucleic acids have been used, but in the present invention, the main purpose is to produce the desired antisense nucleic acids using biological nucleic acids as raw materials.
  • the obtained antisense nucleic acid derived from an organism is 5 to: LOO base, preferably 10 to 50 bases in length.
  • the production method of an antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it is obtained from a biological nucleic acid as a raw material, but it is preferably produced through the following steps:
  • the antisense nucleic acid of the present invention uses a biological nucleic acid as a raw material.
  • organisms include microorganisms and animals and plants.
  • eukaryotes include, for example, flagellate fungi, zygomycetes, incomplete fungi (for example, molds), basidiomycetes (for example, mushrooms), yeasts, etc., and prokaryotes, for example, aerobic bacteria
  • bacteria such as anaerobic bacteria, actinomycetes, archaea, and cyanobacteria.
  • animals and plants include mammals, reptiles, amphibians, birds, and fish.
  • plants include modified fungal plants, fungal plants, red algae plants, brown algae plants, moss plants, ferns. Plants, gymnosperms, angiosperms are listed.
  • the organisms derived from these may be, for example, artificially genetically modified, but can be obtained in a relatively large amount even though it is preferable to be a natural organism. Those who are friendly to the human body are preferred. As such, there is no particular limitation, but it corresponds to a nucleic acid (DNA) derived from a salmon egg of a fish.
  • DNA nucleic acid
  • Extranuclear DNA such as biologically derived plasmid DNA, phage DNA, and viral DNA can also be used as a raw material for nuclear acid.
  • the plasmid DNA is not particularly limited, and examples thereof include pUC and pBR systems that can replicate in E. coli.
  • Phage DNA includes, but not limited to, lambda phage and ⁇ 174.
  • the nucleic acid used as the raw material may be single-stranded or double-stranded. Furthermore, it is possible to select a species containing many sequences that are likely to exhibit the desired antisense effect by using the nucleic acid sequence information in the database.
  • the above-described nucleic acid derived from the organism is preferably 2 to 200 bases, more preferably 5 to: LOO base, more preferably 10 to 50 bases from the viewpoint of the effect as an antisense. Shred so that a large number of nucleic acid populations in the front and back length are included.
  • the cleavage may be physical cleavage, enzymatic cleavage, or chemical cleavage.
  • the physical cutting is not particularly limited, and examples include physical cutting such as water, air and friction, ice and ultrasonic waves.
  • the enzymatic cleavage is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of cleaving nucleic acids, but examples include Deoxyribonucleas I (DNase I) and restriction enzymes derived from various organisms such as E. coli. It is also possible to chop up a combination of these physical, enzymatic and chemical cleavages.
  • DNase I Deoxyribonucleas I
  • restriction enzymes derived from various organisms such as E. coli. It is also possible to chop up a combination of these physical, enzymatic and chemical cleavages.
  • the size of the nucleic acid fragments may be made uniform by fractionating the chopped nucleic acid.
  • the fractionation method is not particularly limited, a method using an ultrafiltration membrane or the like is preferable from the viewpoint of operability and throughput.
  • a method using an ultrafiltration membrane or the like is preferable from the viewpoint of operability and throughput.
  • the ultrafiltration membrane includes a so-called dialysis membrane that is not limited to a normal ultrafiltration filter.
  • these chopped nucleic acids are dissociated into single strands using a known method such as heat or alkali treatment.
  • the step of dissociating into single strands may be performed before or after fractionation by ultrafiltration or simultaneously with fractionation.
  • adhesion may be performed simultaneously with dissociation into single strands.
  • the double-stranded nucleic acid fragment population is contacted and mixed with the probe nucleic acid, and then the dissociation and adhesion to the single strand are subsequently performed in the reaction system, which is also the production method of the present invention.
  • a probe nucleic acid is used from the obtained population of nucleic acid fragments.
  • the “probe nucleic acid” in the present invention is a single-stranded nucleic acid having a base sequence of at least a part of a sense strand of a target gene (a gene whose action is inhibited).
  • the action of the target gene from the population of nucleic acid fragments obtained in (1) can be achieved by utilizing the property that only the target antisense nucleic acid is annealed (adhered) to the probe nucleic acid.
  • Antisense nucleic acids for suppression can be isolated.
  • the gene (target gene) that is the target of the antisense nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as it relates to beauty, illness, etc., and can be appropriately selected according to the purpose. Specific examples include melanin synthesis / transport related genes (melanin synthesis pathway related genes), wing formation related genes, aging related genes, hair growth, hair loss related genes, cancer related genes, etc. Such genes. It is also possible to select a combination of two or more of the above-mentioned genes as target genes.
  • the melanin synthesis pathway-related genes include, for example, genes related to the generation and differentiation of tyrosinase, trp-l, trp-2 and melanocytes, for example, master genes for separating neural crest cells into melanocytes. Pax3, soxl0, MITF, etc. can also be targets. Targets can be targeted directly to those genes, genes targeted to the expression of those genes, and further maturation of those gene products, such as addition or cleavage of sugar chains. The gene involved may be targeted.
  • MITF-M is known to bind to and enhance the upstream M-box for the regulation of tyrosinase gene, trp-1 gene, trp-2 gene expression. It is expected that the expression of these three genes can be controlled by using antisense nucleic acids specific for. It is also possible to inhibit the expression system of regulatory factors that control individual gene expression. For example, it is known that meta-mouthonein is involved in the regulation of tyrosinase expression (plus it is maintained), but it regulates the expression of proteins involved in this expression inhibition or degradation. By doing so, it is possible to obtain an effect.
  • a signal transduction pathway involved in melanin production For example, a signal a-MSH binds to the MC1R receptor on the melanocyte surface, thereby It is known that nin synthesis is enhanced, and that the ET-1 signal binds to the ETRA receptor and the SCF signal binds to the c-kit receptor.
  • the expression system of a-MSH and ET-1 It may be possible to limit with antisense nucleic acids.
  • genes involved in melanin transport can be targeted. Melanin is produced in melanocytes, and is transferred to keratinocytes and distributed to the skin. For example, by inhibiting PAR2, which is involved in this transport, melanin deposition on the skin surface can be expected to be suppressed.
  • the wrinkle formation-related genes include, for example, genes encoding proteins that degrade the collagen, hyaluronic acid, or elastin that constitutes the dermis that supports the skin and maintains the elasticity of the beam.
  • genes such as collagenase such as matrix meta-oral proteinase (MMP), hyal-oral-tase, and elastase.
  • MMP matrix meta-oral proteinase
  • Collagen that forms collagen fibers in particular, accounts for approximately 90% of the dermis and functions as a stand bone that supports the skin.Collagen is known to decrease with age. Seems to be promising.
  • Examples of the aging-related gene group include a telomerase regulatory gene group. Extending the terminal force of the chromosome, telomeres a series of nucleic acids that serve to protect the chromosomes and at the same time shorten each time the cell repeats division, thus determining the life of the cell. It is thought that he will speak. It is expected that the regenerative enzyme, telomerase, will repair telomeres. If this activity can be maintained at a normal level, cell aging can be fundamentally prevented. In other words, it is expected to control aging by controlling the activity of telomerase and inhibiting the expression of the telomerase regulatory gene group with an antisense nucleic acid. Moreover, it is known that this telomerase activity is abnormally enhanced in cancer lesions, and if telomerase enzyme activity can be inhibited with the antisense nucleic acid of the present invention, it is expected to be useful for cancer treatment.
  • the hair growth / hair loss related gene group includes, for example, those encoding hair shaft regulatory proteins and Z or structural proteins.
  • hair shaft regulatory proteins or structural proteins include proteins involved in the cell cycle; proteins related to anti-growth such as IGF receptor, T4 thyroid receptor; IL1, IL6, TNF o ;, MCP1 Proteins related to anti-damage such as ins, MMP, urokinase, lipoxygenase; P Proteins involved in regrowth, such as proteins involved in the degradation of GF2 ⁇ , 5 ⁇ reductase; ⁇ 3 ⁇ 1 integrin, betacatenin, laminin 10, LEF-1, and other related proteins; focusing on morphogenesis; hair shaft formation (Such as curling or anchoring), proteins involved in hair shaft separation (such as acidic or basic hair keratin); enzymes related to hair shaft protein cross-linking (thiol acid reductase, transdaltaminase) 3, proteins associated with hair shaft formation such as
  • 5a reductase is known to reduce testosterone and its product suppresses cell division of hair matrix cells, and inhibits gene expression of this enzyme with antisense nucleic acid.
  • the hair growth effect can be aimed at.
  • by inhibiting the expression of specific genes with antisense nucleic acids the cellular activity of cells related to hair production such as hair follicle cells, hair matrix cells, and dermal papilla cells is increased and the cell cycle is adjusted.
  • it can also be used to bring about effects such as shortening the rest period and preventing cell suicide (apoptosis) (inhibiting the action of the suicide enzyme caspase).
  • hair loss may be suppressed by, for example, inactivating the receptor gene of Bone Morphogenetic Protein (BMP) involved in cell proliferation and differentiation regulation.
  • BMP Bone Morphogenetic Protein
  • the cancer-related gene group is not particularly limited, and examples thereof include an oncogene such as ras and a gene such as c-fos and c-myc that are considered to act on cancer activity.
  • Antisense nucleic acids targeting genes involved in viral infection, replication, etc. can also be used as antiviral agents.
  • genes involved in cell sorting or proliferation are also considered as targets for the antisense nucleic acid of the present invention, and specifically include genes encoding the following proteins. :
  • Growth factors such as EGF, TNF- ⁇ , TGF, endothelin, NGF, HGF, IGF, VEGF;
  • S100A8, S100A9, S100A7, etc. S100 protein family calcium binding proteins; transglutaminase 1, 3 or 5; Enzymes involved in post-translational modification of proteins, such as protein phosphatases or protein phosphatases that ensure z-binding between cells such as otaldin, laminin, strength veolin, desmoglein, desmocollin, corneodesmosin, placoglobin, desmoplakin;
  • Calci-urine phosphorylase, protein kinase (eg, PKC), darcosyltransferase, peptidinoreareginine diminase;
  • protein kinase eg, PKC
  • darcosyltransferase peptidinoreareginine diminase
  • MMP 1-, 2-, 3- or 9-elastase, aspartic protease (such as cathebsin E and cathebsin D), cathepsin L, B or H type cysteine protease, cathepsin L2, SCCL, chymotrypsin equivalent, SCCE ( Kallikrein 7) trypsin-like protease, SCTE (kallikrein 5) -type urokinase, SASPase, caspase (especially force spase 14), calpain, subtilisin-like protein compactase protease involved in hydrolysis of filaggrin (furin) , PACE4, PC5 / 6 and PC7 / 8), proteases such as proteases of the transmembrane serine protease family (such as matriptase);
  • Exoglycosidase or endglycosidase such as heparanase hyaluronanidase, chondroitinase, aspartyldarcosaminidase, B-glycosidase, glycosidase;
  • Lipid-metabolizing enzymes such as HMG-CoA reductase, cholesterol sulfatase, sulfotransferase, sphingomyelinase, ceramidase;
  • Eicosanoid metabolizing enzymes such as cycloxygenase, lipoxygenase, phospholipase, 15-PGDH;
  • Hormone metabolizing enzymes such as type I or type II 5a reductase
  • Types of matrix proteins such as elastin and collagen
  • Proteins involved in skin hydration such as cytokeratin-type keratinocyte protein, filaggrin, water channels;
  • proteins involved in antibacterial defense of skin such as hBD2, hBD3, dermiscidin, ribonuclease 7; Proteins involved in dermal maturation such as lysyloxidase and lysyl hydroxylase
  • the antisense nucleic acid of the present invention can also target genes of the following proteins.
  • proteins involved in sebum synthesis HMG-CoA reductase, squalene synthase, etc.
  • bacterial lipase as an application to suppress dandruff formation
  • 1 ⁇ 12 and / or cox2 and / or IL1 and / or TGF ⁇ 1 for the purpose of suppressing expression, abnormal proteins and / or oligopeptides (especially for viral activity such as HPV or cancer cells)
  • certain cytodynamic ins eg IL1, TNF a -308 and TNF j8 +252
  • receptor proteins eg Toll-like receptors
  • TLR phosphatidylinositol 3 kinase
  • cell adhesion molecules eg CDw60
  • a target gene related to a subject whose activity is to be inhibited is determined from the gene group described above according to the intended use, and the target gene is determined based on the base sequence information.
  • a probe nucleic acid having all or part of the base sequence of the gene is prepared.
  • the target gene usually the sense strand sequence upstream of the translation start point of the target gene or its periphery is used.
  • the probe nucleic acid is artificially produced by a DNA synthesizer or the like.
  • the target gene may be separated from the living body, and if necessary, it may be subjected to a treatment such as cutting out only the necessary portion or amplifying it to make a single strand.
  • the length of the base sequence when using a partial base sequence of the target gene is not particularly limited, but is preferably 2 to 300 bases, more preferably 5 to 200 bases, and even more preferably. 10 ⁇ : LOO base.
  • the method for preparing the probe nucleic acid is, for example, a phosphoramidite method (ABI Co., Ltd.) using a DNA synthesizer or DNAZRNA synthesizer manufactured by ABKApplied Biosystems In) or a nucleic acid automatic synthesizer manufactured by Perceptive. Tegagawa, N. or Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, 1991).
  • nucleic acid of a desired length by PCR (polymerase chain reaction) using these synthetic DNAs as primers. It is also possible to use this probe nucleic acid that has been treated to prevent degradation by single-stranded DNA degrading enzymes.
  • the phosphate binding site can be used for thioesters and then for IJs.
  • the obtained probe nucleic acid crude product is obtained by a conventional purification method, for example, high-speed liquid chromatography (HPLC), supercritical chromatography based on the principle of reverse phase chromatography, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. It is purified using various chromatographies such as chromatography, ethanol precipitation and electrophoresis.
  • the cartridge can be purified using a cartridge manufactured based on the principle of reversed-phase chromatography (for example, Seppak Plus (long body / ENV) using tC18 as a filler; manufactured by Perceptive). The purity can be examined by analysis using HPLC or capillary electrophoresis.
  • the probe nucleic acid is annealed (adhered) to the target single-stranded nucleic acid (antisense nucleic acid) contained in the group of nucleic acid fragments obtained in (1).
  • the method for annealing the probe nucleic acid and the single-stranded nucleic acid fragment is not particularly limited, and a known physical method or chemical method can be used.
  • a method is generally used in which a probe nucleic acid and a single-stranded nucleic acid fragment are mixed and then annealed at a temperature near or below the Tm value of the probe nucleic acid. It is also possible to adjust the degree of sequence specificity of the resulting antisense nucleic acid by adjusting the temperature at the time of annealing. For example, if annealing is performed at a higher temperature, i.e., at a temperature close to the Tm value of the probe nucleic acid, the antisense nucleic acid with higher homology according to the base sequence of the probe nucleic acid is more likely to anneal.
  • Annealing at a lower temperature that is, below the Tm value of the probe nucleic acid If they are used, those with base sequences that are less homologous to the base sequence of the probe nucleic acid are also screened.
  • the antisense nucleic acid obtained may have a low antisense effect, but the yield is easy to obtain because the number of fragments that anneal is increased. It is also possible to obtain both specificity and yield easily by changing the annealing temperature in the same reaction system stepwise.
  • a double-stranded nucleic acid fragment population is prepared in (1), and dissociation into single strands and annealing with probe nucleic acids are continuously performed in the reaction system of this step. It is preferable. Specifically, heat treatment (for example, 90 ° C or higher, preferably 94 ° C or higher, more preferably 100 ° C or higher) dissociates the double strands into single strands, and then the probe nucleic acid Tm value. Annealing is performed by reacting with the probe nucleic acid at the following temperature. In that case, the mixing of the nucleic acid fragment and the probe nucleic acid does not work before or after the step of dissociating the nucleic acid fragment into single strands.
  • heat treatment for example, 90 ° C or higher, preferably 94 ° C or higher, more preferably 100 ° C or higher
  • Annealing is performed by reacting with the probe nucleic acid at the following temperature. In that case, the mixing of the nucleic acid fragment and the probe nucleic
  • a probe is used as a chemical method.
  • the probe nucleic acid and the target antisense nucleic acid can be annealed by using neutral or acidic conditions.
  • nucleic acid fragment that does not anneal to a certain probe nucleic acid can be used again in separation with another probe nucleic acid.
  • the probe nucleic acid and the target antisense nucleic acid adhered thereto are separated from the nucleic acid population after the annealing reaction.
  • A carrier immobilization method
  • B ultrafiltration membrane method
  • the probe nucleic acid is immobilized on a carrier capable of immobilizing it before or after the adhesion step of the single-stranded nucleic acid fragment and probe nucleic acid in (2).
  • the method for immobilizing the probe nucleic acid to the carrier is not particularly limited, but a special label is placed at the 5 'or 3' end in advance during the probe nucleic acid synthesis step, and attached to the carrier via the label. Is possible.
  • the carrier may be epoxidized, carboxylated, cyanogen bromide, and the probe nucleic acid can be bound.
  • the probe nucleic acid may be directly synthesized on a specific carrier at the synthesis stage.
  • the carrier used here is not particularly limited as long as it is a commonly used carrier that can immobilize a nucleic acid.
  • a magnetic carrier for example, a magnetic carrier, a glass carrier, Toyopearl (Tosoh Pearl) And a chemically synthesized carrier such as silica gel, preferably a magnetic carrier or a carrier having anion adsorption property.
  • the probe nucleic acid immobilized on the magnetic carrier and the single-stranded nucleic acid fragment adhered thereto can be easily separated from the non-adhered nucleic acid fragment by utilizing magnetic force.
  • the carrier, the probe nucleic acid immobilized on the carrier, the bonded single-stranded nucleic acid fragment, and the unadhered Nucleic acid fragments can be separated. In these separation steps, unadhered nucleic acid fragments can be completely removed by repeating the washing operation as appropriate.
  • the probe nucleic acid and the target single-stranded nucleic acid adhered to the probe nucleic acid and the non-adhered single-stranded nucleic acid fragment are utilized by utilizing the properties of an ultrafiltration membrane that can be separated by the difference in molecular weight. And isolate. Examples of the detailed method include the method described below.
  • a population of nucleic acid fragments is obtained.
  • the molecular weight of the nucleic acid fragment is set using an ultrafiltration membrane.
  • an ultrafiltration membrane having an elimination molecular weight of X is used to prepare a nucleic acid population that passes through the membrane, that is, has an upper limit of molecular weight of X.
  • the ability to prepare the probe nucleic acid The probe nucleic acid is adjusted so that its molecular weight is greater than X by adjusting the length of the base sequence to be cut out in the target gene or repeating a specific base sequence. Keep it.
  • the probe nucleic acid and the probe nucleic acid adhered to it. Since the molecular weight of a single-stranded nucleic acid fragment is not less than X, it can be separated from non-adherent nucleic acid fragments having a molecular weight of X or less by using an ultrafiltration membrane with an excluded molecular weight of X.
  • the exclusion molecular weight X of the ultrafiltration membrane selected here is a force that can be appropriately selected according to the length of the antisense nucleic acid to be obtained, and can be set in the range of 15000 to 30000.
  • the ultrafiltration membrane method may be another method that applies the difference in molecular weight between the probe nucleic acid or the nucleic acid fragment adhered thereto and the non-adhered nucleic acid fragment. I do not care.
  • Either the carrier immobilization method or the ultrafiltration membrane method may be selected appropriately depending on the purpose.
  • the carrier fixation method is less in terms of the number of steps and work time (the molecular weight of the nucleic acid fragments need to be equalized! If a magnetic carrier is used, the separation operation takes about 5 minutes).
  • the ultrafiltration membrane method is superior in terms of recovery and industrially inexpensive production.
  • a known physical method or chemistry method can be used.
  • the heat treatment and the chemical method are not limited to these forces including, for example, changing pH by using a sodium hydroxide sodium solution.
  • the single-stranded nucleic acid peeled off (dissociated) from the probe nucleic acid can be recovered by the same method as the method for separating the carrier and the non-adhered nucleic acid fragment.
  • the magnetic carrier and the probe nucleic acid immobilized thereon can be separated and removed by magnetic force, and only the target antisense nucleic acid can be recovered.
  • a non-magnetic carrier it can be separated by filtration or using a column.
  • the non-adherent nucleic acid fragment is washed and removed in the separation step (3), and then the above-described physical or chemical treatment is performed in the column to fix the antisense nucleic acid to the carrier. It is possible to recover only the target antisense nucleic acid by removing the probe from the trapped nucleic acid and allowing it to flow out of the column.
  • the probe nucleic acid and the single-stranded nucleic acid fragment adhered to the probe nucleic acid are subjected to the above physical or chemical treatment, and then the target antisense nucleic acid dissociated is known. It can be recovered by this method.
  • an ultrafiltration membrane may be used in the recovery step.
  • the probe nucleic acid and the target antisense nucleic acid can be separated and recovered by using an ultrafiltration membrane with an ultraexcluded molecular weight of X. Is possible.
  • the probe nucleic acid in the ultrafiltration membrane device and the single-stranded nucleic acid fragment adhering thereto are subjected to physical treatment or chemical treatment as they are.
  • the antisense nucleic acid is peeled off from the probe nucleic acid, the dissociated antisense nucleic acid flows out of the ultrafiltration membrane and can be recovered as it is.
  • the probe nucleic acid after the anti-sense nucleic acid has been removed and recovered can be used as it is in (2) to (4).
  • the probe nucleic acid after the anti-sense nucleic acid has been removed and recovered can be used as it is in (2) to (4).
  • the antisense nucleic acid obtained in this way has the property of allowing not only the RNA at the transcription stage of the target gene having the base sequence used for the probe nucleic acid, but also the gene itself to hybridize.
  • the hybridization conditions in that case are not particularly limited, and the optimal hybridization conditions for the antisense nucleic acid and the target gene vary depending on the selection of the base sequence used for the probe nucleic acid and the conditions for the adhesion process. However, it is a matter of course that it has excellent antisense nuclear acidity and antisense ability to hybridize even under stringent conditions with the target gene.
  • the antisense nucleic acid of the present invention using a nucleic acid derived from a living organism as a raw material unlike an antisense nucleic acid obtained by chemical synthesis, has a variety of nucleic acid fragment strengths having a base sequence ability, and thus the antisense of the present invention.
  • nucleic acid is analyzed using ion exchange columns, gel filtration columns, etc. under conditions that can be fractionated by various properties such as ionic strength and molecular weight, it shows a band pattern representing the presence of multiple consecutively sized nucleic acids. It can be seen that there is a distribution range for each type.
  • Examples of ion exchange columns at this time include cation exchange columns such as jetylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE), and quaternary ammonia (Q) for anion exchange columns.
  • Examples of the gel filtration column such as chill sulfonate (s) include those using a carrier such as cefadettas, cefacryl, and superrose.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can exhibit a desired inhibitory effect to a greater or lesser extent in all fractions. However, a more effective antisense nucleic acid fraction can be obtained by using a column as described above. It is also possible to increase the purity by separating the water.
  • the antisense nucleic acid of the present invention prepared as described above can be used as a gene inhibitor as it is, but it can be dissolved or suspended in a polar solvent such as water or ethanol, an emulsion, cream, gel, It can also be dispersed in a base such as an ointment to make a gene inhibitor.
  • a polar solvent such as water or ethanol, an emulsion, cream, gel
  • a base such as an ointment to make a gene inhibitor.
  • the above-described gene inhibitors include active oxygen scavengers, anti-inflammatory agents, pile cancer agents, whitening agents, skin cell activators, bactericides, and other physiologically active ingredients, as well as oils and surfactants.
  • General pharmaceuticals such as humectants, ultraviolet absorbers, powders, fragrances, and preservatives, and cosmetic raw materials can also be included.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is composed of nucleic acid, it can be expected to have ultraviolet absorption and moisturizing effects originally possessed by the nucleic acid.
  • the antisense nucleic acid obtained as described above can be contained in an external preparation base to prepare a skin external preparation or cosmetic composition.
  • External preparations for skin and cosmetic compositions can be provided in the form of lotions, emulsions, gels, creams, ointments, sprays and the like.
  • skin makeup such as lotion, milky lotion, cream, knocks, makeup base lotion, makeup base cream, emulsion, cream or ointment foundation, makeup makeup such as eye color and cheek color. It can also be provided as a cosmetic for skin, hand cream, red cream, body lotion and other skin external preparations.
  • raw materials for general pharmaceuticals and cosmetics such as oils, surfactants, moisturizers, UV absorbers, pigments, fragrances, preservatives, active oxygen scavengers, anti-inflammatory agents, whitening agents, wrinkle improving agents
  • physiologically active ingredients such as a skin cell activator can also be contained.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can also be used as a pharmaceutical composition containing it as a main component.
  • the antisense nucleic acid alone is not particularly limited as long as it is a preparation that can be incorporated into the cells of the affected area or the cells of the target tissue.
  • it may be mixed with a conventional carrier and administered in a form for external use such as the above-mentioned external preparation for skin, other parenteral administration, or oral administration.
  • compositions may be in liquid dosage forms such as solutions, suspensions, syrups, ribosome formulations, emulsions, and solid dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, etc. It may be in a form.
  • the above preparations contain various carriers, auxiliaries, stabilizers, lubricants, and other commonly used additives such as lactose, citrate, tartaric acid, stearic acid, magnesium stearate, white clay, sucrose, Corn starch, talc, gelatin, agar, pectin, falling raw oil, olive oil, cocoa butter, ethylene glycol, etc. can be added.
  • a form used in a general gene transfer method for example, a membrane fusion liposomal preparation using Sendai virus or the like, or endocytosis is used.
  • Use ribosome preparations such as ribosome preparations, preparations containing cationic lipids such as ribohetamine (Lifetech Oriental), preparations combining calcium phosphate and polyethylene glycol, retrovirus vectors, adenovirus vectors, etc. It is advantageous to use the virus preparation to be used, particularly in the form of a membrane fusion ribosome preparation.
  • the formulation technology that is used by ordinary drug delivery systems can also be applied to the antisense nucleic acid of the present invention.
  • DDS drug delivery systems
  • PLA lactic acid polymer
  • PLGA lactic acid glycolic acid copolymer
  • Targeting and sustained release technology using this DDS technology can also be used.
  • a ribosome preparation in the case of a ribosome preparation, it may be a single membrane ribosome (LUV), a multilayer ribosome (MLV) or a small single membrane ribosome (SUV).
  • the size is also 200 to 1000 nm for LUV, 400 to 3500 nm for MLV, and 20 to 50 nm for SUV.
  • MLV membrane ribosome
  • SUV small single membrane ribosome
  • the method for producing the ribosome is not particularly limited as long as the antisense nucleic acid of the present invention is retained.
  • a reverse phase evaporation method (Szoka, F. et al .: Biochim.
  • lipid for forming a ribosome structure phospholipids, cholesterols, nitrogen lipids and the like are generally used. Phospholipids are generally preferred, and phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol.
  • Phosphatidylethanolamine phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, lysolecithin and other natural phospholipids, or those hydrogenated by conventional methods, dicetyl phosphate, Distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylserine, elestearoylphosphatidylcholine, elestearoyl Synthetic phospholipids such as phosphatidylethanolamine and eleostaroylphosphatidylserine can be used.
  • Lipids containing these phospholipids can be used alone or in combination of two or more.
  • the binding rate of an electrically negative antisense nucleic acid can also be increased by using a substance having an atomic group having a positive group in the molecule, such as ethanolamine or choline.
  • additives such as cholesterols, stearylamine, and atocopherol, which are generally known as additives for ribosome formation, can also be used.
  • the ribosome thus obtained is purified from a membrane fusion promoter such as Sendai virus, inactivated Sendai virus, or Sendai virus in order to promote uptake into the affected cells or cells of the target tissue.
  • a membrane fusion promoter such as Sendai virus, inactivated Sendai virus, or Sendai virus in order to promote uptake into the affected cells or cells of the target tissue.
  • Membrane fusion-promoting protein polyethylene glycol, and the like.
  • a method for producing a ribosome preparation will be specifically described.
  • the ribosome-forming substance described above, together with cholesterol and the like, tetrahydrofuran, chloroform, ethanol, etc. This is dissolved in an organic solvent, placed in a suitable container, and the solvent is distilled off under reduced pressure to form a ribosome-forming substance film on the inner surface of the container.
  • a buffer containing an antisense nucleic acid is added and stirred, and the obtained ribosome is further covered with the above-mentioned membrane fusion promoting substance, if desired, and then the ribosome is isolated.
  • the ribosome containing the antisense nucleic acid thus obtained can be used for treatment by suspending it in an appropriate solvent, or by redispersing the lyophilized product in an appropriate solvent.
  • Membrane fusion promoters may be added after ribosome isolation and before use.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be used as a research material for microorganisms, plants, animals, and the like, in the same manner as ordinary chemically synthesized antisense nucleic acids.
  • antisense DNA is used as an antisense nucleic acid
  • antisense RNA can be produced in the same manner.
  • a decoy nucleic acid is a nucleic acid that prevents transcription factors from binding to a target gene and is intended for inhibition at the transcriptional stage.
  • single-stranded DNA on the antisense side is produced from a nucleic acid derived from a living organism, and the single-stranded DNA on the sense side (sense DNA) is further prepared according to the present invention.
  • a decoy nucleic acid can be produced by applying a production method (using a nucleic acid having a base sequence on the antisense side of a target gene as a probe nucleic acid) and annealing them.
  • Tyrosinase gene a gene that constitutes the mouse melanin synthesis pathway, trp-1
  • SEQ ID NO: 1 is the 48-base upstream force of 51 bases upstream of the translation start point of the sense sequence of the mouse tyrosinase mRNA sequence (Genbank accession number: NM # 011661), and the 5 'end of this is piotin
  • the probe nucleic acid synthesized with the label was named bio-mTyr.
  • SEQ ID NO: 2 is 48 bases from the 50 base upstream to the 3 base upstream of the sense sequence of the Trp-1 mRNA sequence derived from mouse (Genbank registration number: NM # 031202), and its 5 ′ end
  • the probe nucleic acid synthesized with the addition of piotin was named bio-m-Trp.
  • a probe nucleic acid in which the 5 ′ end of a nucleic acid having a base sequence (SEQ ID NO: 3) in which the base sequence of SEQ ID NO: 1 is randomly rearranged with the same A, T, G, C content is also used.
  • Sh-bio-m-Tyr Synthesized and named Sh-bio-m-Tyr.
  • anti-synthetic antisense nucleic acid which is estimated to exhibit an antisense action on the mouse tyrosinase gene and trp-1 gene, was prepared and used as m-Tyr. -oligo (SEQ ID NO: 4) and m-Trp-oligo (SEQ ID NO: 5). These genes have a translation starting point of 20 bases from 47 bases upstream to 28 bases upstream and 38 bases upstream to 19 bases upstream.
  • the nucleic acid fragment solution prepared in (1) prepared to ImM is 100 1 min, and the three probe nucleic acids synthesized in Example 1 (bio-m-Tyr, bio-m-Trp, Sh- bio-m-Tyr) in each 0.5ml PCR tube and set in PCR thermal cycler (GeneAmp PCR System, Applied Biosystems), 95 ° C, 5 minutes ⁇ 85 ° C, 2 minutes ⁇ 75 ° C, 1 minute ⁇ 65 ° C, 1 minute ⁇ 55 ° C, 1 minute ⁇ 45 ° C, 1 minute, then hold at 4 ° C to obtain single strand of nucleic acid fragment At the same time as the dissociation, the probe nucleic acid was hybridized.
  • a 500 ⁇ l minute magnetic carrier (MegaceU—Streptavidin® CORTEX BIOSYSTEM) was washed with IX BZW buffer 500 ⁇ l, and only the magnetic carrier was recovered with a recovery magnet (Promega). A cleaning operation). After repeating this washing operation three times, suspend in 500 1 1XBZW buffer solution, add the above-mentioned 110 1 hybridized DNA solution to this, add the probe nucleic acid while stirring (10 rpm) at room temperature for 10 minutes. was bound to a magnetic carrier.
  • the magnetic carrier to which the probe nucleic acid (and the single-stranded nucleic acid adhered to it) was bound was collected with a magnet, and the washing operation was repeated three times to remove non-adherent nucleic acid fragments.
  • To the magnetic carrier to which the collected probe nucleic acid (and the single-stranded nucleic acid attached to it) is bound add 100 1 0.1N sodium hydroxide and mix gently, then leave it for about 5 minutes. Then, the magnetic carrier to which the probe nucleic acid was bound was recovered and discarded with a magnet, and about 1001 supernatant was recovered as an antisense fraction.
  • the antisense fraction was neutralized by adding approximately 100 ⁇ l of 0.1N hydrogen chloride, and then 400 ⁇ l of 100% ethanol and 100 / zl of 2.5 M sodium chloride were added. Well, it was incubated at 20 ° C. Subsequently, the antisense nucleic acid was recovered by centrifugation at 14,000 rpm for 15 minutes, washed with 70 o / o ethanol, and then dried under reduced pressure. Thereafter, the suspension was suspended in 151 TE buffer, and its concentration was determined with an absorptiometer to obtain about 8 g of antisense nucleic acid.
  • the antisense nucleic acid obtained using bio-m-Tyr as the probe nucleic acid is m-Tyr-antiDNA
  • the antisense nucleic acid obtained using bio-m-Trp as the probe nucleic acid is m-Trp-antiDNA
  • an antisense nucleic acid obtained using Sh-bio-m-Tyr as a probe nucleic acid was referred to as Sh-m-Tyr-DNA.
  • JCRB0202 After amplification with DME M medium (Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum, manufactured by Invitrogen), add it to a 96-well plate so that there are 10 4 per well. Using a DMEM medium containing m-Tyr-antiDNA and m-Trp-antiDNA prepared in Example 2 (2) to a final concentration of 100 ⁇ M and 1 M, in a CO incubator at 37 ° C.
  • DME M medium Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum, manufactured by Invitrogen
  • nucleic acid fragment (unfractionated nucleic acid) prepared in Example 2 (1), which is a double-stranded DNA, was added to the same concentration.
  • Stranded nucleic acids m-Tyr-oligo and m-Trp-oligo were added to the same concentration.
  • the medium was changed daily with 200 ⁇ l of DMEM medium containing these nucleic acids! And cultured for 7 days. Thereafter, the medium was removed, the cells adhered with PBS were gently washed, a PBS solution containing 50 1 of Triton X-100 at a concentration of 0.1% was added, and the mixture was incubated at 4 ° C for 1 hour. Thereafter, 50 ⁇ l of 10 mM L DOPA solution was added and incubated at 37 ° C. for about 1 hour.
  • m-Tyr-antiDNA, Sh-m-Tyr-DNA, m-Tyr-oligo and unfractionated nucleic acid of Example 2 (1) were added to a final concentration of 50 ⁇ and ⁇ , and examined in the same manner. The results are shown in Table 2. The In this case as well, the residual activity is shown when the activity when TE is added instead of the sample is taken as 100%.
  • SAINT-MIX (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for about 5 minutes, and this was mixed with 20 ⁇ 1 of SAINT—MIX and 80 ⁇ 1 of HBS.
  • SEQ ID NO: 6 is a 48-base sequence from 48 bases upstream to 1 base upstream of the translation start of the sense sequence of human Tyr-1 mRNA sequence (Genbank accession number: NM # 000372). 'The probe nucleic acid synthesized with biotin attached at the end was named bio-h-Tyr.
  • h-Tyr-oligo SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 7 a synthetic single-stranded nucleic acid presumed to exhibit an antisense effect on the human tyrosinase gene
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, by using bio-h-Tyr as a probe nucleic acid and binding to a carrier, an antisense nucleic acid was separated from a salmon egg white DNA fragment, and this was named h-Tyr-antiDNA. The degree of inhibition of blackening when the antisense nucleic acid was given to normal human melanoma cells (Kurabo) was verified.
  • Example 5 The h-Tyr-oligo synthesized in Example 5 was also used as a control for nucleic acid, and the unfractionated nucleic acid of Example 2 (1) was added to the same concentration as a negative control.
  • the medium was changed daily with 200 ⁇ l of Medium 254 medium containing these nucleic acids! And cultured for 7 days. Thereafter, the medium was removed, the cells adhered with PBS were gently washed, a PBS solution containing 50 1 of Triton X-100 at a concentration of 0.1% was added, and the mixture was incubated at 4 ° C for 1 hour. Thereafter, 50 1 of 10 mM 1 ⁇ 00? 8 solution was added and incubated at 37 ° C for about 1 hour.
  • SEQ ID NO: 8 is 48 bases from the 48 base upstream to the 1 base upstream of the translation start point of the sense sequence of the human ⁇ 1 mRNA sequence (Genbank accession number: N W002421).
  • the probe nucleic acid synthesized by synthesized with was named bio-h-MMPl.
  • h-MMPl-oligo SEQ ID NO: 9. This has a length of 20 bases from 20 bases upstream to 1 base upstream from the translation start point of the human chitinase gene.
  • Example 8 Human Matrix Meta Mouth Proteinase-1 (MMP-1) V. Harm
  • MMP-1 Human Matrix Meta Mouth Proteinase-1
  • h-MMPl-antiDNA The degree of inhibition of matrix meta-proteinase 1 (MMP-1) when the antisense nucleic acid was given to normal human fibroblasts (Kurabo) was verified.
  • the protein mass of the sample is quantified with MicroBCA assay kit (manufactured by PIRCE) using ushi serum albumin as a standard, and the protein mass to be applied is the same.
  • electrophoresis it is used for Western blotting.
  • the same amount of sample was applied with two gels for CBB staining confirmation. Specifically, electrophoresis sample buffer was added to 5 ⁇ g of sample, heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, applied to 10% polyacrylamide gel, and subjected to electrophoresis.
  • PVDF membrane after transfer was soaked in a blocking solution (0.3% skim milk ZPBST (Phosphate Buffered Saline with 0.1% Tween20)) for 3 hours at room temperature, and then the membrane was thoroughly washed with PB ST. .
  • a blocking solution (0.3% skim milk ZPBST (Phosphate Buffered Saline with 0.1% Tween20)
  • the membrane was immersed in a solution of goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody peroxidase labeled (manufactured by DAKO) diluted 1000-fold with 0.3% skim milk ZPBS and allowed to react at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the membrane was washed thoroughly with PBST.
  • Fig. 1 shows the results of the MMP-1 detection band of the exposed film. From FIG. 1, it became clear that the expression of MMP-1 protein was inhibited in cells supplemented with the antisense nucleic acid of the present invention.
  • the culture supernatant used in (1) was used to measure MMP-1 activity, and the degree of inhibition was confirmed.
  • the type I matrix meta-protease activity in the culture supernatant was determined by adding trypsin at a final concentration of 0.05 mg ZmL and incubating for 15 minutes at 37 ° C, followed by a composition for inhibiting soybean trypsin at a final concentration of 0.25 mg This was measured using a type I collagen labeled with fluorescein sothiocyanate (FITC) as a substrate.
  • FITC fluorescein sothiocyanate
  • mice tyrosinase-inhibiting antisense nucleic acid m-Tyr-antiDNA prepared in Example 2 (2) was used.
  • m-Tyr-antiDNA was fractionated using high performance liquid chromatography. Specifically, 0.1 ml of m-Tyr-antiDNA solution (concentration ImM) was injected into HPLC, and fractionation using an anion exchange column (COSMOSIL DEAE, manufactured by Nacalai) was performed. After injection, wash with buffer (20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.2), and then perform elution with a sodium chloride concentration gradient (0 to LM). So, it was put together into one. The chromatographic pattern at that time is shown in FIG. 2 (the horizontal axis indicates the passage of time, and the vertical axis indicates the absorption at 254 nm).
  • concentration ImM concentration ImM
  • COSMOSIL DEAE anion exchange column
  • the antisense nucleic acid of the present invention exhibited an elution pattern having a distribution width, and was confirmed to be an aggregate of nucleic acids of many kinds of continuous sizes.
  • Mouse melanoma cells (B16) amplified by DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum, manufactured by Invitrogen) (distributed by HS Foundation. Distribution strain No. JCRB0202) was added in a concentration of 10 4 cells per well in 96-well plates, which on Symbol a suspension of fractions (a) ⁇ (f), DMEM medium final concentration each having free to be ⁇ In addition, the cells were cultured in a CO incubator at 37 ° C. Control
  • m-Tyr-antiDNA was added to the same concentration.
  • the medium was changed daily with 200 ⁇ l of DMEM medium containing these antisense nucleic acids! And cultured for 7 days. Thereafter, the medium was removed, and the cells adhered with PBS were gently washed.
  • a PBS solution containing 50 1 of Triton X-100 at a concentration of 0.1% was added and incubated at 4 ° C for 1 hour. Thereafter, 50 mM of 10 mM-00-8 solution was added and incubated at 37 ° C for about 1 hour.
  • an antisense nucleic acid targeting the tyrosinase gene which is a gene constituting the mouse melanin synthesis pathway
  • the nucleic acids of SEQ ID NOs: 10, 11, 12, and 13 can be synthesized by PCR from the transcription start point of the mouse tyrosinase sequence (Genbank accession number: NM # 011661) to the 70th base downstream of it. These were designed and named PCR-m-Tyr-1, PCR-m-Tyr-2, PCR-m-Tyr-3 and PCR-m-Tyr-4. Using these nucleic acids, double-stranded DNA from the transcription start point to the 70th downstream is synthesized by PCR. The cage probe nucleic acid was used for PCR synthesis.
  • Salmon Shirako-derived DNA—Na (-Chiguchi) 10% (wZv) solution 20ml was treated with an ultrasonic crusher (SMT) for 20 minutes to shred the DNA and remove the solution to remove molecular weight 2 , 000 ultrafiltration dialysis membrane manufactured by Rai Co., Ltd.) and left overnight in sterile water at room temperature.
  • the contents (nucleic acid with a molecular weight of 2,000 or more) are then added to an ultrafiltration membrane with a molecular weight of 15,000 (Nacalai) and shaken overnight in 40 ml of sterile water at room temperature. I left it while adding.
  • the DNA fragment (molecular weight 2,000-15, 000) contained in the external sterilized water was recovered by ethanol precipitation and suspended in 4 ml of sterilized water. This was used as a fractionated nucleic acid fragment solution.
  • the effect of the antisense nucleic acid recovered in (2) was verified by inhibiting blackening of mouse melanoma cells (B 16) in the same manner as in Example 3.
  • the added antisense nucleic acid was fm-Tyr-antiDNA of (2), m-Tyr-antiDNA prepared in Example 2 (2), and synthetic antisense nucleic acid m-Tyr-oligo as a control.
  • the final addition concentration when applying to was all set to 1 M.
  • the results are shown in Table 7.
  • the numerical values in the table represent the residual activity when the activity when TE buffer is added instead of the sample is 100%, that is, the lower the value, the higher the inhibition rate.
  • the inhibitory activity is almost the same as that of the method using a magnetic carrier in cells added with antisense DNA prepared using an ultrafiltration membrane. It became clear to show.
  • Purified water 88.8 Production method (1) to (4) are added to (5) sequentially and dissolved uniformly.
  • Manufacturing method Mix and heat the oil phase components (1) to (6), dissolve uniformly, and keep at 70 ° C.
  • the water phase components of) to (10) are mixed and heated to make it uniform to 70 ° C.
  • the oil phase component is gradually added to the aqueous phase component while stirring to emulsify, and after cooling, (11) is added and mixed at 40 ° C.
  • Manufacturing method Mix and dissolve the oil phase components of (1) to) and heat to 75 ° C.
  • the water phase components (8) to (10) are mixed, dissolved and heated to 75 ° C.
  • the oil phase component is added to the water phase component and pre-emulsified, and then uniformly emulsified with a homomixer. After cooling, (11) is added and mixed at 40 ° C.
  • Manufacturing method Mix and dissolve the oil phase components (1) to (4) until uniform, and heat to 75 ° C. On the other hand, (5) is dissolved in (6) and heated to 75 ° C, and the oil phase component is added thereto to emulsify, and after cooling, (7) is added and mixed at 40 ° C.
  • Production method Add (1) to (4) to (5) in order and mix and dissolve uniformly.
  • Manufacturing method Dissolve (6) and (7) in (5), add this to (8) together with (1) to (4), and mix and dissolve uniformly.
  • Emollient cream water-in-oil type
  • Production method Dissolve (5) and (6) in a part of (9) to 50 ° C and heat to 50 ° C. Add each time. This was mixed and heated and dissolved at 70 ° C. Dispersed uniformly in (1) to (3), and (7) and (8) were dissolved in the remainder of (9) and 70 ° C. Add the mixture with stirring and emulsify with a homomixer. After cooling, add (10) and (11) at 40 ° C and mix.
  • the oil phase components (1) to (4) are mixed and heated to 75 ° C to be uniform.
  • the aqueous phase components (5) to (7) are mixed, heated and dissolved at 75 ° C to make it uniform, and the pigments (8) to (10) are added to this and dispersed uniformly with a homomixer.
  • the oil phase component is added to the water phase component, emulsified with a homomixer, cooled, and (11) and (12) are added and mixed at 40 ° C.
  • the oil phase components (1) to (5) are mixed and heated to 75 ° C to be uniform.
  • the aqueous phase components (6) to (9) are mixed, heated to 75 ° C and dissolved to make it uniform, and then the pigments (10) to (14) are added and dispersed uniformly with a homomixer. Let Add the oil phase component to this water phase component, uniformly emulsify with a homomixer, cool, add (15) and (16) at 40 ° C and mix.
  • the oil phase components (1) to (6) are mixed, dissolved, and heated to 75 ° C.
  • the water phase components of) to (9) are mixed, dissolved and heated to 75 ° C.
  • the oil phase component is added to the water phase component and pre-emulsified, and then uniformly emulsified with a homomixer and cooled, and (10) is added and mixed at 40 ° C.

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Abstract

　本発明は、豊富な塩基配列バリエーションをもち、大量生産可能で安価な優れたアンチセンス特性をもつアンチセンス核酸を簡単な方法で製造する方法、及びそれらの化粧用組成物または医薬用組成物を提供することを目的とする。 　生物由来の核酸原料から、ターゲット遺伝子の少なくとも１部の塩基配列を有するプローブ核酸を使用することにより、アンチセンス特性を示す低分子核酸を高収率で得る方法が見出された。すなわち、本発明は、生物由来の核酸を原料とすることを特徴とするアンチセンス核酸及びその製造方法である。                                                                                 

Description

明 細 書
生物由来のアンチセンス核酸
技術分野
[0001] 本発明は、生物由来の核酸を原料とするアンチセンス核酸とその製造方法に関す る。また本発明は、これらの生物由来のアンチセンス核酸を含有する化粧用組成物、 皮膚外用剤または医薬用組成物にも関する。
背景技術
[0002] ヒトゲノムプロジェクトにより、ヒトゲノム DNAを構成する塩基配列が明らかにされた 現在、遺伝子の効果的なノックアウト法の開発は多くの難治性疾患の治療、健康や 美容などのより身近な分野での利用につながることが期待される。その中、アンチセ ンス核酸は、遺伝子の働きを阻害する物質として、生物学や医学の分野でその有用 性が注目されている。
[0003] その技術は、ある特定のターゲット遺伝子に対し、その遺伝子の塩基配列情報を基 にアンチセンス核酸を設計、人工的に合成し、そしてこれを生体内に入れ、その遺伝 子の作用のみを抑えるものである。それ故、ある遺伝子の機能を調べたり、病気の原 因となる特定タンパク質の生産を阻害するのに利用できる。いうまでもなぐこの技術 は生化学や分子生物学の研究に利用され、後者では医薬開発などへとつながって いく。
[0004] 特にアンチセンス核酸医薬は遺伝子治療薬などとともに、 21世紀の新しいタイプの 医薬として期待されており、近年では、このアンチセンス核酸を美白化粧品に利用す る動きがある（特許文献 1)。し力しながら、このように医薬、化粧品に利用するために は、その有効成分であるアンチセンス核酸を核酸合成機で多量に化学合成せねば ならず、製品に添加する量を得るためには膨大なコストを要するものである。また得ら れた合成アンチセンス核酸は、化学合成であるため安全性にっ ヽての知見が少な!/ヽ ことがヒトに利用する場合の障害となっていた。
[0005] また、このアンチセンス核酸においては、目的の遺伝子またはその転写 RNAにハイ ブリダィズしてその遺伝子の発現を阻害する効果 (アンチセンス効果)を有することが まず必要であるが、そのようなアンチセンス効果を有する核酸を調製するための手法 としては、数多くの合成したアンチセンス核酸を用いて実験的により効果の高いもの を選択するか (非特許文献 1, 2)、もしくはある一定のアルゴリズムに従い、実験を行 わずにアンチセンス効果のある塩基配列を予測し合成する方法が挙げられる (非特 許文献 3)。
[0006] しかし、前者では、対象となる遺伝子に相補的な部分配列を調製し、その配列がァ ンチセンス効果を有するか否かを、目的の遺伝子について実際に実験を行って調べ なければならず、時間、費用および手間がかかり、また後者ではあらゆる場面に見合 つた万能型の法則が発見されていないのが事実である。そこで、安全、安価、より確 実に遺伝子発現を抑えることのできるアンチセンス核酸を生産する方法が求められて いた。
特許文献 1：特表 2003 - 521929
非特許文献 1 : K. R. Blake等， Biochemistry 24卷 6132- 6138頁 1985年
非特許文献 2 : E. Uhlmann, A. Peyman, Chemical Reviews 90卷 543-584頁 1990年 非特許文献 3 : R. A. Stull等， Nucleic Acids Research 20卷 3501-3508 1992年 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、豊富な塩基配列バリエーションをもち、大量生産可能で安価な優れたァ ンチセンス効果 (アンチセンス特性)をもつアンチセンス核酸を簡単な方法で製造す る方法、及びそれらを含有する化粧用組成物、皮膚外用剤または医薬用組成物を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、大量生産可能で安価な、優れたアンチセンス特性をもつアンチセン ス核酸を簡単な方法で製造する方法を可能にすべく鋭意研究を重ねた結果、生物 由来の核酸原料から、簡便な操作で、アンチセンス特性を示す低分子核酸を高収率 で得る方法を見出した。
[0009] すなわち、本発明は、以下のとおりである。
[1] 生物由来の核酸原料を処理することを特徴とするアンチセンス核酸の製造方 法。
[2] 由来となる生物が、微生物又は動植物である [1]のアンチセンス核酸の製造方 法。
[3] 生物由来の核酸を細断して 1本鎖化したものを、ターゲット遺伝子の少なくとも 一部の塩基配列を有するプローブ核酸と接着させ、該接着核酸を未接着核酸と分離 した後、プローブ核酸より接着した 1本鎖核酸をはがして回収することを特徴とする [1 ]又は [2]のアンチセンス核酸の製造方法。
[4] 少なくとも上記接着核酸を分離する工程において、プローブ核酸が担体に固 定化されて ヽることを特徴とする [3]のアンチセンス核酸の製造方法。
[5] 分離および Zまたは回収する工程において、限外ろ過膜を使用することを特徴 とする [3]のアンチセンス核酸の製造方法。
[6] 下記の（a)〜（d)の工程力もなる [5]のアンチセンス核酸の製造方法：
(a)生物由来の核酸を細断して、分画する工程、
(b)分画核酸断片を、 1本鎖化してプローブ核酸と接着させる工程、
(c)限外ろ過膜を用いて未接着核酸を分離除去する工程、
(d)プローブ核酸より 1本鎖核酸断片をはがし、限外ろ過膜を用いて回収する工程。
[7] 分離および回収する工程において使用する限外ろ過膜の排除分子量より大き な分子量を有するプローブ核酸を利用して、工程 (b)〜（d)を繰り返し実施することを 特徴とする [6]のアンチセンス核酸の製造方法。
[8] 生物由来であることを特徴とするアンチセンス核酸。
[9] 由来となる生物力 微生物または動植物である [8]のアンチセンス核酸。
[10] 核酸の種類に分布幅を有するアンチセンス核酸。
[11] [3]の製造方法によって得られるアンチセンス核酸。
[12] アンチセンス核酸が、メラニン合成経路関連遺伝子、皺形成関連遺伝子、加 齢関連遺伝子、育毛関連遺伝子、又はガン関連遺伝子にハイブリダィズする核酸で ある [8]〜 [ 11] 、ずれかのアンチセンス核酸。
[13] ヒトチロシナーゼ遺伝子又はヒト MMP— 1遺伝子にハイブリダィズする核酸で ある [ 12]のアンチセンス核酸。 [14] [8]〜[13 ゝずれかのアンチセンス核酸を有効成分として含有する化粧用組 成物又は皮膚外用剤。
[15] [8]〜[13 、ずれかのアンチセンス核酸を有効成分として含有する医薬用組 成物。
発明の効果
[0010] 本発明によれば、豊富な塩基配列バリエーションをもち、大量生産可能で安価な生 物由来の核酸を用いて、優れたアンチセンス特性をもつアンチセンス核酸を簡単な 方法で製造することができ、得られた生物由来のアンチセンス核酸の化粧用組成物 または医薬用組成物としての利用が可能となる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]本発明のアンチセンス核酸の MMP-1阻害効果（ウェスタンブロッテイング結果 )
[図 2]本発明のアンチセンス核酸の HPLCクロマトパターン
符号の説明
[0012] 1 :陰性コントロール
2 :h-MMPl-antiDNA
3 :h-MMPl-oligo
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、本発明について詳細に説明する。
本発明でいうアンチセンス核酸とは、 5〜： LOO塩基程度の長さの 1本鎖 DNAまたは R NAを含む核酸の集団のことで、美容、病気等に関係するある特定遺伝子の発現を 、選択的に、その転写段階の RNAにァニール (接着)するなどして、タンパク質の翻 訳段階を阻害することを目的とする核酸のことである。従来、アンチセンス核酸は、人 ェ的に合成したものが使用されていたが、本発明では、生物由来の核酸を原料とし て、 目的とするアンチセンス核酸を製造することを主眼とする。本発明において、得ら れる生物由来のアンチセンス核酸は、 5〜： LOO塩基、好ましくは 10〜50塩基の長さ である。 [0014] 本発明において、アンチセンス核酸は生物由来の核酸を原料として得られるもので あればその製造方法は特に限定されないが、好ましくは以下の段階を経て製造され る：
(1)生物由来の核酸原料を細断し、必要に応じて 1本鎖化する工程、
(2) 1本鎖化核酸断片とプローブ核酸とを接着させる工程、
(3)プローブ核酸と接着した 1本鎖核酸断片を分離する工程、
(4)分離したアンチセンス核酸を回収する工程。
[0015] 以下それらの工程について詳細に説明するが、本発明は下記方法に限定されるも のではない。
[0016] (1)生物由来の核酸原料の細断し、必要に応じて 1本鎖化する工程
本発明のアンチセンス核酸は、生物由来の核酸を原料とする。生物としては、微生 物又は動植物が例示される。微生物のうち、真核生物としては、例えば、鞭毛菌類、 接合菌類、不完全菌類 (例えばカビ類)、担子菌類 (例えばキノコ類)、酵母などが、 原核生物としては、例えば、好気性細菌、嫌気性細菌などの細菌類、放線菌、古細 菌類、ラン藻類などが挙げられる。動植物としては、例えば、動物としては哺乳類、爬 虫類、両性類、鳥類、魚類が挙げられ、植物としては、例えば、変形菌植物、真菌植 物、紅藻植物、褐藻植物、コケ植物、シダ植物、裸子植物、被子植物が挙げられる。
[0017] これら由来となる生物は、例えば人工的に遺伝子組み換えされたものであっても構 わないが、安全性の観点力 天然生物であるのが好ましぐ中でも比較的大量に入 手でき、食経験があるなど人体にやさしいものがより好まれる。そのようなものとして、 特に限定はな 、が、魚類のサケ白子由来の核酸 (DNA)が相当する。
[0018] また生物由来のプラスミド DNA、ファージ DNA、ウィルス DNAなど核外 DNAも核 酸原料として利用可能である。プラスミド DNAとしては、特に限定はないが、大腸菌 で複製可能な pUC系、 pBR系などが挙げられ、ファージ DNAとしては、特に限定は ないが、ラムダファージ、 Φ Χ174などが挙げられる。また、これら原料となる核酸は 1 本鎖であっても、 2本鎖であっても構わない。さらには、データベース上の核酸配列 情報を利用し、目的のアンチセンス効果を示すと思われる配列が多く含まれる生物 種を選び出すことも可能である。 [0019] 本発明においては、上述したような生物由来の核酸を、アンチセンスとしての効果 の点から、好ましくは 2〜200塩基、より好ましくは 5〜： LOO塩基、さらに好ましくは 10 〜50塩基前後の長さの核酸集団が多く含まれるように細断する。切断は物理的切断 でも、酵素による切断でも、化学的切断でも構わない。物理的切断としては、特に制 限はないが、水、空気、摩擦など物理的な圧力によるもの、氷、超音波によるものなど が挙げられる。酵素による切断としては、核酸を切断できる酵素であれば、特に制限 はないが、大腸菌など様々な生物由来の Deoxyribonucleas I (DNase I)や制限酵素 などが挙げられる。また、これらの物理的、酵素学的、化学的切断を組み合わせて細 断することも可能である。
[0020] さらに、上記細断した核酸を分画することによって、核酸断片の大きさをそろえても よい。分画方法は特に制限されないが、操作性や処理量の観点から、限外ろ過膜等 で処理する方法が好ま 、。排除分子量 2000程度の限外ろ過膜で処理することに よって、 5塩基未満の短い核酸を除去し、また、排除分子量 15000〜30000程度の 限外ろ過膜を使用することで、数 100塩基以上の長い不要な核酸を除去することが できる。これらを糸且み合わせることで、 ί列えば、、分子量力 2000〜15000、 2000〜2 0000、または 2000〜30000などと! /、つた、長さのある程度摘った、好まし ヽ核酸集 団に分画することができる。なお本明細書でいう限外ろ過膜としては、通常の限外ろ 過用フィルターだけでなぐいわゆる透析膜のようなものも含まれる。
[0021] 次に、原料である生物由来核酸が 2本鎖の場合、これら細断した核酸を、熱やアル カリ処理などの公知の方法を用いて 1本鎖に解離させる。限外ろ過膜で核酸断片の 大きさを揃える場合、 1本鎖への解離工程は、限外ろ過による分画の前でも後でも、 また分画と同時に行ってもよい。あるいは、後述するプローブ核酸との接着工程にお いて、 1本鎖に解離させると同時に接着を行ってもよい。その場合、 2本鎖の核酸断 片集団をプローブ核酸と接触 Ζ混合させ、その反応系で、 1本鎖への解離と接着を 引き続いて実施することになるが、それも本発明の製造方法の好ましい一態様である
[0022] (2) 1本鎖化核酸断片とプローブ核酸とを接着させる工程
本発明においては、上記得られた核酸断片の集団より、プローブ核酸を利用するこ とで、目的となるアンチセンス核酸を配列特異的に分離するのが好ましい。本発明に おける「プローブ核酸」とは、ターゲットとなる遺伝子 (作用を阻害した 、遺伝子）のセ ンス鎖の少なくとも一部の塩基配列を有する 1本鎖核酸である。該プローブ核酸を用 いることで、目的のアンチセンス核酸だけがプローブ核酸とアニーリング (接着)すると いう性質を利用して、（1)で得られた核酸断片の集団からターゲットとなる遺伝子の 作用を抑えるためのアンチセンス核酸を分離できる。
[0023] 本発明のアンチセンス核酸のターゲットとなる遺伝子 (ターゲット遺伝子）は、美容、 病気等に関するものであれば、特に制限されず、その目的に応じて適宜選択するこ とができる。具体例としては、メラニン合成 ·輸送関連遺伝子群 (メラニン合成経路関 連遺伝子群)、皺形成関連遺伝子群、加齢関連遺伝子群、育毛，脱毛関連遺伝子 群、ガン関連遺伝子群等やその他後述するような遺伝子が挙げられる。またターゲッ ト遺伝子として上述したような遺伝子のうち 2種以上の遺伝子を組み合わせて選択す ることち可會である。
[0024] メラニン合成経路関連遺伝子群としては、例えば、チロシナーゼ、 trp-l、 trp-2ゃメ ラノサイトの発生や分化に関わる遺伝子、例えば、神経堤細胞からメラノサイトに分ィ匕 する際のマスター遺伝子である pax3、 soxl0、 MITFなどもターゲットとなりうる。またタ 一ゲットとしては、それらの遺伝子を直接ターゲットとしても、それらの遺伝子の発現 を制御している遺伝子をターゲットとしても、さらにはそれらの遺伝子産物の成熟、例 えば糖鎖の付加や切断に関与する遺伝子をターゲットとしてもよい。
[0025] 例えば、チロシナーゼ遺伝子、 trp-1遺伝子、 trp-2遺伝子の発現調節には、 MITF- Mが上流の M-boxに結合して亢進することが知られている力 MITF-Mの配列に特異 的なアンチセンス核酸を利用することでこれら 3つの遺伝子の発現を制御できること が予想される。また個々の遺伝子発現を制御する調節因子の発現系を阻害すること も考えられる。例えば、チロシナーゼの発現調節にはメタ口チォネインが関与 (維持 することがプラス）して ヽることが知られて!/ヽるが、この発現阻害または分解に関与し ているタンパク質の発現を制御することにより、効果を得ることも可能である。
[0026] また、メラニン生産に関与するシグナル伝達経路を遮断することも考えられる。例え ば、メラノサイト表面の MC1Rレセプターにシグナル a -MSHが結合することでユーメラ ニン合成が亢進すること、さらには ETRAレセプターに ET-1シグナル、 c-kitレセプタ 一に SCFシグナルが結合することが知られており、例えば、この a - MSH、 ET-1の発 現系をアンチセンス核酸で制限することも可能であると考えられる。更に、メラニン輸 送に関与する遺伝子群もターゲットとなりうる。メラニンはメラノサイトで産生され、ケラ チノサイトへ移行し皮膚へ分配される力 例えば、この輸送に関与している PAR2を阻 害することにより、メラニンの皮膚表面での沈着が抑制されることが期待できる。
[0027] 皺形成関連遺伝子群としては、例えば、皮膚を支え、はりと弾力性を保つ役割を担 つている真皮を構成するコラーゲン、ヒアルロン酸、又はエラスチンを分解するタンパ ク質をコードする遺伝子、具体的には、マトリックスメタ口プロティナーゼ (MMP)など のコラゲナーゼ、ヒアル口-ターゼ、及びエラスターゼなどの遺伝子が挙げられる。特 に膠原線維を形成しているコラーゲンは真皮の約 90%を占め、皮膚を支える屋台骨 としての機能を果たしており、コラーゲンは加齢とともに減少することが知られているこ とから、抗皺のターゲットとしては有望であると思われる。
[0028] 加齢関連遺伝子群としては、例えば、テロメラーゼ制御遺伝子群が挙げられる。染 色体の末端力 延びて 、る一連の核酸をテロメァと 、 、、これは染色体を保護する 役目を果たすと同時に、細胞が分裂を繰り返すたびに短くなることから、細胞の寿命 を決定して ヽると考えられて ヽる。この短くなつて!/ヽくテロメァを修復してくれるのが再 生酵素であるテロメラーゼで、この活性を正常なレベルに保つことができれば、細胞 の老化を根本的に防ぐことが予想される。つまりテロメラーゼの活性を制御して 、るテ ロメラーゼ制御遺伝子群の発現を、アンチセンス核酸で阻害することで加齢を制御す ることが期待できる。またガン病巣においては、このテロメラーゼ活性が異常に亢進し ていることが知られており、テロメラーゼ酵素活性を本発明のアンチセンス核酸で阻 害することができれば、ガン治療に役立つことも予想される。
[0029] 育毛 ·脱毛関連遺伝子群としては、例えば、毛幹の調節タンパク質および Zまたは 構造タンパク質をコードするものが挙げられる。毛幹の調節タンパク質又は構造タン パク質の具体的例としては、細胞周期に関与するタンパク質; IGF受容体、 T4甲状腺 受容体などの抗成長に関係するタンパク質; IL1、 IL6、 TNF o;、 MCP1などのサイト力 イン類、 MMP、ゥロキナーゼ、リポキシゲナーゼなど抗損傷に関係するタンパク質; P GF2 α , 5 α還元酵素の分解に関与するタンパク質など再成長に関係するタンパク質 ; α 3 β 1インテグリン、ベータカテニン、ラミニン 10、 LEF-1など形態形成に着目した 関係するタンパク質;毛幹の形成 (カーリングまたはアンカーリングなど)、毛幹の分ィ匕 に関与するタンパク質 (酸性または塩基性毛角質など) ;毛幹タンパク質のクロスリンク に関連する酵素（チオール酸ィ匕還元酵素、トランスダルタミナーゼ 3、トランスダルタミ ナーゼ 5など)などの毛幹の形成に関係するタンパク質;などが挙げられる。
[0030] 中でも 5 a還元酵素はテストステロンを還元し、その生成産物が毛母細胞の細胞分 裂を抑制するということが知られており、この酵素の遺伝子の発現をアンチセンス核 酸で阻害することにより育毛効果が狙える。また、アンチセンス核酸により特定の遺伝 子発現を阻害することで毛包細胞、毛母細胞、毛乳頭細胞などの毛の生成に関連 する細胞の細胞活性を上昇させたり、その細胞周期を調整すること、例えば、休止期 を短くする、細胞の自殺 (アポトーシス)を防ぐ（自殺酵素カスパーゼの働きを阻害す る)などの効果をもたらす場合にも利用することが可能である。また脱毛に関しても、 例えば、細胞増殖や分化調節に関与する Bone Morphogenetic Protein (BMP)のレセ プター遺伝子を不活性ィ匕することにより抑制できる可能性がある。
[0031] ガン関連遺伝子群としては、特に限定はないが、 ras等のオンコジーンと呼ばれる癌 遺伝子やガン活性ィ匕にはたらくとされる c-fos、 c-myc等の遺伝子が挙げられる。また ウィルスの感染、複製等に関与する遺伝子をターゲットとしたアンチセンス核酸は、 抗ウィルス剤としても利用可能である。
[0032] また、細胞分ィ匕または増殖現象に関与している遺伝子も、本発明のアンチセンス核 酸のターゲットとして考えられ、具体的には、以下のタンパク質をコードする遺伝子な どが挙げられる：
EGF、 TNF- α、 TGF、エンドセリン、 NGF、 HGF、 IGF、 VEGFなどの成長因子；
IL1、 IL6、 IL8などの型のサイト力イン； EGFr、 TGFr、 PAR, PPAR、 FXR、 RXR、 CB1R
、 CB2R、 VR1、 CRAB2、 u— PAなどの型の受容体；
カルモジュリン、 CLPまたは CLSP型のカルシウム結合タンパク質；
S100A8、 S100A9、 S100A7など S100タンパク質ファミリーのカルシウム結合タンパク質； トランスグルタミナーゼ 1、 3または 5などのトランスグルタミナーゼ； オタルディン、ラミニン、力べオリン、デスモグレイン、デスモコリン、コルネオデスモシ ン、プラコグロビン、デスモプラキンなどの細胞間合着 z結合を確実にするタンパク質 ホスファターゼまたはプロテインホスファターゼなどタンパク質の翻訳後修飾に関与 する酵素；
カルシ-ユリン、ホスホリラーゼ、プロテインキナーゼ（例えば、 PKC)、ダルコシルトラ ンスフェラーゼ、ぺプチジノレアノレギニンディミナーゼ；
MMP、 1-、 2-、 3-または 9-エラスターゼ、ァスパラギン酸プロテアーゼ（カテブシン E およびカテブシン Dなど）、カテブシン L、 Bまたは H型のシスティンプロテアーゼ、カテ プシン L2、 SCCL、キモトリブシン等価物、 SCCE (カリクレイン 7)型のトリプシン様プロ テアーゼ、 SCTE (カリクレイン 5)型のゥロキナーゼ、 SASPァーゼ、カスパーゼ（特に力 スパーゼ 14)、カルパイン、フィラグリンの加水分解に関与するサブチリシン様プロタ ンパク質コンパターゼ型のプロテアーゼ（フューリン、 PACE4、 PC5/6および PC7/8な ど）、膜内外型セリンプロテアーゼファミリーのプロテアーゼ (マトリプターゼなど）など のプロテアーゼ；
へパラナ一ゼ型ヒアル口ニダーゼ、コンドロイチン分解酵素、ァスパルチルダルコサミ ニダーゼ、 Bグリコシダーゼ、グリコシダーゼなどの、ェキソグリコシダーゼまたはェン ドグリコシダーゼ；
HMG- CoA還元酵素、コレステロールスルファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、スフ インゴミエリナーゼ、セラミダーゼなどの脂質代謝酵素；
シクロォキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ホスホリパーゼ、 15-PGDHなどのエイコサ ノイド代謝酵素；
I型または II型 5 a還元酵素などのホルモン代謝酵素；
エラスチン、コラーゲンなどの型のマトリックスタンパク質；
サイトケラチン型のケラチノサイト分ィ匕タンパク質、フィラグリン、水チャネルなどの皮 膚の水分補給に関与するタンパク質；
hBD2、 hBD3、ダームシディン、リボヌクレアーゼ 7などの皮膚の抗菌防御に関与する タンパク質； リジルォキシダーゼ、リジルヒドロキシラーゼなどの真皮の成熟に関与するタンパク質
[0033] その他、ゥロキナーゼなどセリンプロテアーゼ遺伝子をターゲットとし、これを本発明 のアンチセンス核酸で抑制することができれば、美容的な治療、ならびに乾燥や炎 症をおこした皮膚の外見改善に有効であると考えられる。
[0034] また本発明のアンチセンス核酸では、下記タンパク質の遺伝子をターゲットとするこ とも可能である。例えば、肌質改善領域における適用として皮脂の合成に関与するタ ンパク質 (HMG-CoA還元酵素、およびスクアレンシンターゼなど)；フケ形成の抑制を 目的とする適用として細菌性リパーゼ；毛の喪失を抑制することを目的とする適用とし て 1οχ12および/または cox2および/または IL1および/または TGF β 1；発現抑制目的 として、異常タンパク質および/またはオリゴペプチド (特に HPVなどのウィルス活性ま たは癌細胞に関係するもの、またはある種の疾患において過剰発現されるもの）；ぁ る種のサイト力イン（例えば、 IL1、 TNF a - 308および TNF j8 +252)、受容体タンパク質（ 例えば、 Toll様受容体、 TLR)、ホスファチジルイノシトール 3キナーゼ、細胞接着分子 (例えば CDw60)などの増殖に関係するタンパク質;プロテアーゼ、特にセリンプロテア ーゼ (角質層キモトリブシン酵素、 SCCE)もしくはメタ口プロテアーゼ (特に、乾癬に関 与する MMP-9および MMP-19)；カルシウム結合タンパク質（カルモジユリン様セリン プロテアーゼ、 CLSP)などである。
[0035] 本発明においては、上述したような遺伝子群のなかから、 目的とする用途に応じて 、活性を阻害したい対象に関連するターゲット遺伝子を決定し、その塩基配列情報を もとにしてターゲット遺伝子の塩基配列のすべてまたは一部を有するプローブ核酸を 作製する。ターゲット遺伝子の一部の配列を利用する場合、通常、ターゲット遺伝子 の翻訳開始点上流やその周辺のセンス鎖配列が用いられる。プローブ核酸は、 DN A合成機などにより人工的に作製される。また、生体よりターゲット遺伝子を分離し、 必要に応じて、必要箇所のみ切り出す、増幅するなどの処理を行い、 1本鎖化したも のを使用してもよい。
[0036] ターゲット遺伝子の一部の塩基配列を利用する場合のその塩基配列の長さは特に 限定されないが、好ましくは 2〜300塩基、より好ましくは 5〜200塩基、さらに好まし くは 10〜： LOO塩基である。プローブ核酸を合成する場合の調製方法は、例えば、 A BKApplied Biosystems In )社製の DNA合成機もしくは DNAZRNA合成機、又は パーセプティブ社製核酸自動合成機などを用いて、ホスホロアミダイト法 (ABI社の手 川負鲁又は . Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL P ress, 1991年参照）により行うことができる。またこれらの合成 DNAをプライマーとして 用いて PCR (polymerase chain reaction)により所望の長さの核酸を合成することも可 能である。またこのプローブ核酸は、 1本鎖 DNA分解酵素による劣化を防ぐための 処理を施したものを使うことも可能である。例えば、リン酸結合部位をチォエステルイ匕 したちのち禾 IJ用することちでさる。
[0037] 得られたプローブ核酸の粗製物は、通常の精製方法、例えば、逆相クロマトグラフィ 一、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーの原理に基づく高 速液体クロマトグラフィー (HPLC)、超臨界クロマトグラフィー等種々のクロマトグラフィ 一、エタノール沈澱法及び電気泳動法などを用いて精製される。このほか、逆相クロ マトグラフィ一の原理に基づいて製造されたカートリッジ (例えば、 tC18を充填剤とす るセップパックプラス（ロングボディ/ ENV)；パーセプティブ社製)等を用いても精製さ れる。なお、その純度は、 HPLCやキヤピラリー電気泳動法による分析により調べるこ とがでさる。
[0038] 次に上記プローブ核酸と、 (1)で得られた核酸断片の集団に含まれる目的の 1本鎖 核酸 (アンチセンス核酸)とをァニール (接着)させる。プローブ核酸と 1本鎖核酸断片 とをァニールさせる方法としては、特に制限はなく公知の物理的方法又は化学的方 法を用いることができる。
[0039] 例えば、物理的方法として、プローブ核酸と 1本鎖核酸断片とを混合した上で、プロ ーブ核酸の Tm値付近又はそれ以下の温度条件でアニーリングする方法が一般的 である。またこのアニーリングの際の温度を調整することにより、得られるアンチセンス 核酸の配列特異性の度合いを調整することも可能である。例えば、より高い温度、つ まりプローブ核酸の Tm値付近の温度でアニーリングさせた場合は、よりプローブ核 酸の塩基配列に準じた相同性の高 、塩基配列のアンチセンス核酸がァニールしや すぐまた、より低い温度、つまりプローブ核酸の Tm値よりも低い温度でアニーリング させた場合は、よりプローブ核酸の塩基配列と相同性の低い塩基配列のものもァニ ールしゃすい。その場合、得られるアンチセンス核酸の、アンチセンス効果が低い可 能性が考えられるが、ァニールする断片が多くなるため収量が得やすくなる。また、 同一反応系でァニールする温度を段階的に変化させることで、特異性と収量を共に 得やすくすることも可能である。
[0040] また、前述の通り、（1)で 2本鎖の核酸断片集団を調製しておき、本工程の反応系 中で 1本鎖への解離とプローブ核酸とのアニーリングを連続して行うことが好ましい。 具体的には、加熱処理 (例えば 90°C以上、好ましくは 94°C以上、より好ましくは 100 °C以上)することで 2本鎖を 1本鎖に解離させ、その後、プローブ核酸の Tm値以下の 温度でプローブ核酸と反応させることでアニーリングを実施する。その場合、核酸断 片とプローブ核酸との混合は、核酸断片の 1本鎖への解離工程の前で後でも力まわ ない。
[0041] また、化学的方法として、 (1)において 2本鎖の核酸断片を 0.01N〜1N程度の水酸 化ナトリウム溶液などのアルカリで処理することで 1本鎖にした場合には、プローブ核 酸との混合後、中性または酸性条件にすることでプローブ核酸と目的のアンチセンス 核酸とをアニーリングすることが可能である。
[0042] また、あるプローブ核酸にァニールしない核酸断片については、他のプローブ核酸 での分離の際に再度用いることも可能である。
[0043] (3)プローブ核酸と接着した 1本鎖核酸断片を分離する工程
次にアニーリング反応後の核酸集団より、プローブ核酸とそれに接着した目的のァ ンチセンス核酸を分離する。本発明においては、その方法として、（A)担体固定化法 と (B)限外ろ過膜法の 2通りの方法がある。以下、これらそれぞれの方法について詳 細に説明する。
[0044] (3— A)担体固定ィ匕法による 1本鎖核酸断片の分離
担体固定ィ匕法においては、（2)の 1本鎖核酸断片とプローブ核酸との接着工程の 前かそのあとに、プローブ核酸を、それを固定ィ匕しうる担体に固定する。プローブ核 酸を担体に固定する方法としては、特に制限はないが、プローブ核酸の合成段階で あらかじめ 5 'もしくは 3 '末端に特殊なラベルを入れておき、それを介して担体に付着 させる方法が可能である。例えば、プローブ核酸の 5'末端をピオチンでラベルしてお き、これを担体上のストレプトアビジンに結合させる方法が挙げられる。また、担体を エポキシ化、カルボキシル化、シァノジェンブロマイド化して、プローブ核酸が結合で きる形としてもよい。もしくは合成段階で特定の担体上にプローブ核酸を直接合成し てもよい。
[0045] ここで用いられる担体としては、核酸を固定できる一般的に使用されている担体で あれば、特に限定はないが、例えば、磁性を帯びた磁性担体、ガラス担体、トーョー パール (東ソ一社製)やシリカゲルなどの化学合成担体が挙げられ、好ましくは磁性 担体や陰イオン吸着性を持った担体が使用される。
[0046] 担体として磁性担体を用いた場合、磁性担体に固定化したプローブ核酸とそれに 接着した 1本鎖核酸断片は、磁力を利用することで、容易に未接着の核酸断片より 分離できる。また、担体として磁性担体以外のその他の担体を使用した場合は、例え ば、ろ過やカラムなどを用いて、担体とそれに固定ィ匕したプローブ核酸及び接着した 1本鎖核酸断片と、未接着の核酸断片とを分離できる。これら分離工程においては、 適宜、洗浄操作を繰り返すことで、未接着の核酸断片を完全に取り除くことが可能で ある。
[0047] (3-B)限外ろ過膜法による 1本鎖核酸断片の分離
限外ろ過膜法では、分子量の違いによって分離が可能な限外ろ過膜の性質を利 用して、プローブ核酸およびそれに接着した目的の 1本鎖核酸と、未接着の 1本鎖核 酸断片とを分離する。その詳細な方法としては例えば以下に説明する方法が挙げら れる。
[0048] まず、（1)の工程において核酸断片の集団を得るが、ここで、上述したように限外ろ 過膜を使用して、その核酸断片の分子量、特にその上限を揃えておく。例えば、排 除分子量が Xの限外ろ過膜を使用して、それを通過する、すなわち分子量の上限が Xの核酸集団を調製しておく。次にプローブ核酸を準備する力 ここでプローブ核酸 としては、ターゲット遺伝子中の切り出す塩基配列の長さを調整するか、特定の塩基 配列を繰り返すなどして、その分子量が Xよりも大きくなるようにしておく。このプロ一 ブ核酸と、核酸断片の集団とをアニーリングさせると、プローブ核酸とそれに接着した 1本鎖核酸断片の分子量は力ならず X以上となるため、先の排除分子量が Xの限外 ろ過膜を使用することで、分子量が X以下の非接着核酸断片と分離できる。ここで選 択する限外ろ過膜の排除分子量 Xは、得たいアンチセンス核酸の長さに応じて適宜 選択しうる力 好ましくは 15000〜30000の範囲で設定しうる。
[0049] もちろん上記方法に限定されず、限外ろ過膜法においては、プローブ核酸やそれ に接着した核酸断片と、未接着の核酸断片との分子量の違いを応用した他の方法で あっても構わない。
[0050] 上記担体固定ィ匕法と限外ろ過膜法とは、その目的に応じてどちらをも適宜選択しう る。例えば、工程数や作業時間という点では担体固定ィ匕法の方が少なくてすむが（ 核酸断片の分子量を揃える必要がな!ヽ、磁性担体を使用すれば分離操作は 5分程 度）、回収率の点や工業的に安価に生産できるという点では限外ろ過膜法の方が優 位である。
[0051] (4)分離したアンチセンス核酸を回収する工程
非接着核酸と分離したアンチセンス核酸を、プローブ核酸よりはがして回収するた めには、公知の物理的方法やィ匕学的方法を用いることができる。物理的方法につい ては、例えば熱処理、化学的方法については、水酸ィ匕ナトリウム溶液を用いるなどし て pHを変化させることなどが挙げられる力 これらに限定されない。
[0052] 担体固定化法の場合、上記プローブ核酸よりはがれた (解離した） 1本鎖核酸は、 上述の担体と未接着核酸断片との分離方法と同様の方法で回収できる。例えば、磁 性担体を使用した場合は、磁性担体とそれに固定ィ匕したプローブ核酸は磁力により 分離除去でき、目的のアンチセンス核酸のみを回収することができる。非磁性担体の 場合は、ろ過やカラムを用いることで分離可能である。ここでカラムを使用する場合、 例えば、（3)の分離工程で非接着核酸断片を洗浄除去した後、カラム中で上記物理 的または化学的処理を行うことで、アンチセンス核酸を担体に固定ィ匕されたプローブ 核酸よりはがし、カラムより流出させることで目的のアンチセンス核酸のみを回収する ことちでさる。
[0053] 一方、限外ろ過膜法の場合、プローブ核酸とそれに接着した 1本鎖核酸断片に、上 記物理的または化学的処理を行い、その後解離した目的のアンチセンス核酸を公知 の方法で回収することができる。例えば、該回収工程においても限外ろ過膜を使用し てもよい。好ましくは、（3)において分子量が Xより大きいプローブ核酸を使用した場 合、プローブ核酸と目的のアンチセンス核酸とは、限外排除分子量が Xの限外ろ過 膜を使用することで分離回収が可能である。より好ましくは、（3)で非接着核酸を洗 浄後、限外ろ過膜の装置中のプローブ核酸とそれに接着した 1本鎖核酸断片を、そ のまま、物理的処理または化学的処理を行って、プローブ核酸よりアンチセンス核酸 をはがすと、解離したアンチセンス核酸は限外ろ過膜の外部に流出するためそのま ま回収することができる。
[0054] ここで、アンチセンス核酸をはがして回収した後のプローブ核酸は、そのまま繰り返 し（2)〜(4)において利用することが可能である。つまりは、化学合成して得られる高 価な少量のプローブ核酸を繰り返し利用することで、生物由来の大量の核酸を処理 し、多くのアンチセンス核酸を安価に得ることも可能である。
[0055] このようにして得られるアンチセンス核酸は、プローブ核酸に使用した塩基配列を 有するターゲット遺伝子の転写段階の RNAのみならず、該遺伝子自体ともノ、イブリ ダイズする性質を有する。その場合のハイブリダィズ条件としては特に限定されず、 上記プローブ核酸に使用する塩基配列の選定や、接着工程の条件等によってアン チセンス核酸とターゲット遺伝子との最適ハイブリダィズ条件は変わってくる。但し、タ 一ゲット遺伝子とストリンジェントな条件においてもハイブリダィズするアンチセンス核 酸力 アンチセンス能力に優れて 、るのは 、うまでもな 、。
[0056] 生物由来の核酸を原料とする本発明のアンチセンス核酸は、化学合成して得られ るアンチセンス核酸と異なり、多種多様の塩基配列力 なる核酸断片力 なり、本発 明のアンチセンス核酸を、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムなどを用いてそのイオン 強度や分子量などの諸性質で分画できる条件で分析すると、複数の連続する大きさ の核酸の存在を表すバンドパターンを示し、核酸の種類に分布幅を有することがわ かる。
[0057] このときのイオン交換カラムとしては、例えば、陰イオン交換カラムならジェチルアミ ノエチル（DEAE)、クォータナリーアミノェチル (QAE)、クォータナリーアンモ -ゥム（ Q)などが、陽イオン交換カラムならカルボキシメチル（CM)、スルホプロピル (SP)、メ チルスルホネート（s)など力 ゲルろ過カラムとしては、セフアデッタス、セフアクリル、 スーパーロースなどの担体によるものなどが挙げられる。また、本発明のアンチセンス 核酸は、全ての画分において、多かれ少なかれ所望の阻害効果を発揮することがで きるが、上述したようなカラムを使用して、より効果の高いアンチセンス核酸分画を分 取して純度を上げることも可能である。
[0058] 以上のようにして調製された本発明のアンチセンス核酸は、そのままでも遺伝子阻 害剤として利用できるが、水、エタノール等の極性溶媒に溶解又は懸濁したり、乳剤 、クリーム、ゲル、軟膏等の基剤に分散して遺伝子阻害剤とすることもできる。
[0059] さらに上述した遺伝子阻害剤には、活性酸素消去剤、抗炎症剤、杭がん剤、美白 剤、皮膚細胞賦活剤、殺菌剤等の生理活性成分の他、油類、界面活性剤、保湿剤、 紫外線吸収剤、粉体、香料、防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料をも含 有させることができる。
[0060] なお、本発明のアンチセンス核酸は、核酸より構成されるため、それ単独でも核酸 がもともと有する紫外線吸収、保湿効果も期待される。
[0061] また本発明にお 、ては、上記のようにして得たアンチセンス核酸を外用剤基剤に含 有させて皮膚外用剤や化粧用組成物とすることもできる。皮膚外用剤や化粧用組成 物としては、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、スプレー剤等の剤型で 提供することができ、る。さらに化粧水、乳液、クリーム、ノ ック等の皮膚ィ匕粧料、メイ クアップベースローション、メイクアップベースクリーム、乳液状、クリーム状或いは軟 膏型のファンデーション、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハン ドクリーム、レッダクリーム、ボディローション等の身体用化粧料やその他皮膚外用剤 などとしても提供することができる。また、油類、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤 、顔料、香料、防腐剤等の一般的な医薬品及び化粧料用原料や、活性酸素消去剤 、抗炎症剤、美白剤、しわ改善剤、皮膚細胞賦活剤等の生理活性成分も含有させる ことができる。
[0062] 本発明のアンチセンス核酸は、それを主成分として含有する医薬組成物としても使 用できる。その場合、主薬が患部の細胞または目的とする組織の細胞内に取り込ま れるような製剤であれば特に限定されるものではなぐアンチセンス核酸単独で、もし くは慣用の担体と混合して、上述したような皮膚外用剤などの外用の形やその他非 経口投与、あるいは経口投与の形で投与される。
[0063] 本発明の手法を用いて、特に食経験のある天然の核酸源力 アンチセンス核酸を 製造した場合、経口で摂取する場合にも安全性が高く好ましい。経口摂取した場合、 口腔内、のど、胃、腸 (小腸、大腸など)、肛門の上皮粘膜、もしくはその下部組織で の作用が考えられる。
[0064] これらの医薬組成物は、溶液、懸濁液、シロップ、リボソーム製剤、乳剤等の液体の 投与形態であってもよいし、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などの固形の投与形 態であってもよい。必要に応じ、上記製剤には各種の担体、助剤、安定剤、潤滑剤、 その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クェン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステ アリン酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ぺク チン、落下生油、ォリーブ油、カカオバター、エチレングリコールなどを添加すること ができる。
[0065] 本発明のアンチセンス核酸を用いる場合、その好ましい製剤の一態様として、一般 の遺伝子導入法で用いられる形態、例えばセンダイウィルス等を用いた膜融合リポソ 一ム製剤やエンドサイト一シスを利用するリボソーム製剤等のリボソーム製剤、リボフ エタトァミン (ライフテックオリエンタル社製)等のカチオン性脂質を含有する製剤、リン 酸カルシウムとポリエチレングリコールを組み合わせた製剤またはレトロウイルスべク ター、アデノウイルスベクター等を用いるウィルス製剤を用いるのが有利であり、特に 膜融合リボソーム製剤の形で用いることができる。
[0066] また通常のドラッグデリバリーシステム (DDS)〖こ利用されて ヽる製剤技術も、本発明 のアンチセンス核酸に応用可能である。その場合、例えば、 PLA (乳酸重合体）、 PLG A (乳酸'グリコール酸共重合体)などをその製剤基材として使用できる。この DDS技 術を使ったターゲテイング、徐放の技術も使用可能である。
[0067] リボソーム製剤の場合、そのリボソームの構造体力 大きな 1枚膜リボソーム (LUV) 、多重層リボソーム（ML V)、小さな一枚膜リボソーム（SUV)のいずれであってもよ い。その大きさも、 LUVでは 200力ら 1000nm、 MLVでは 400力ら 3500nm、 SUV では 20から 50nm程度の粒子系をとり得る力 センダイウィルス等を用いる膜融合リ ポソーム製剤の場合は粒子系 200から lOOOnmの ML Vを用いるのが好ましい。
[0068] リボソームの製造方法は、本発明のアンチセンス核酸が保持されるものであれば特 に限定されるものではなぐ慣用の方法、例えば逆相蒸発法 (Szoka, F.ら: Biochim.
Biophys. Acta, Vol.601, 559 (1980))、エーテル注入法（Deamer, D. W. :Ann. N.Y.
Acad. Sci" Vol.308, 250 (1978))、界面活性剤法（Brunner, J.ら： Biochim. Biophys.
Acta, Vol.455, 322 (1976))等を用いて製造することができる。
[0069] リボソーム構造を形成するための脂質としてはリン脂質、コレステロール類や窒素脂 質等が用いられる力 一般的にはリン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホス ファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファ チジルエタノールァミン、ホスファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、卵黄 レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によ つて水素添力卩したものの他、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリ ン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ ン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレォステアロイルホスファチジルコリン、ェ レオステアロイルホスファチジルエタノールァミン、エレォステアロイルホスファチジル セリン等の合成リン脂質等を使用することができる。
[0070] これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることもできるが、 2種以上を併用する ことも可能である。このとき、エタノールアミンゃコリン等の陽性基をもつ原子団を分子 内に持つものを用いることにより、電気的に陰性なアンチセンス核酸の結合率を増加 させることもできる。これらリボソーム形成時の主要リン脂質の他に、一般にリボソーム 形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルァミン、 a トコフエロール 等の添加剤を用いることもできる。
[0071] このようにして得られるリボソームは患部の細胞または目的とする組織の細胞内に 取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばセンダイウィルス、不活化セン ダイウィルス、センダイウィルスより精製された膜融合促進蛋白質、ポリエチレングリコ ール等をカ卩えることができる。
[0072] リボソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、たとえば前記したリボソーム 形成物質を、コレステロール等と共に、テトラヒドロフラン、クロ口ホルム、エタノール等 の有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内 面にリボソーム形成物質の膜を形成する。これにアンチセンス核酸を含有する緩衝 液を加えて撹拌し、得られたリボソームにさらに所望により前記した膜融合促進物質 をカロえた後、リボソームを単離する。このようにして得られるアンチセンス核酸を含有 するリボソームは適当な溶媒中に懸濁させる力、或いはいつたん凍結乾燥したものを 適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。膜融合促進物質はリボソーム 単離後、使用までの間に加えてもよい。
[0073] さらに本発明のアンチセンス核酸は、通常の化学合成アンチセンス核酸と同様に、 微生物や植物、動物などの研究の材料として使用することも可能である。
[0074] 上記説明においては、アンチセンス核酸としてアンチセンス DNAの場合を中心に 説明したが、生物由来の RNAを核酸材料として用いれば、アンチセンス RNAも同様 に製造することができる。
[0075] また本発明のアンチセンス核酸の製造方法を応用することで、 1本鎖であるアンチ センス核酸のみならず、 2本鎖 DNAであるデコイ核酸や 2本鎖 RNAである siRNAも 生産することができる。デコイ核酸とは、転写因子が標的遺伝子に結合することを防 ぎ、転写段階での阻害を目的とする核酸のことである。上述したようにして生物由来 の核酸からアンチセンス側の 1本鎖 DNA (アンチセンス DNA：本発明のアンチセン ス核酸)を製造し、さらにセンス側の 1本鎖 DNA (センス DNA)を本発明の製造方法 を応用して（プローブ核酸としてターゲット遺伝子のアンチセンス側の塩基配列を持 つ核酸を使用する)製造し、それらをァニール (接着)させることでデコイ核酸が製造 できる。
実施例
[0076] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
[0077] 施例 ί)プローブ核酸 (マウスメラノーマ評価用）の合成
本実施例で用いた全ての合成核酸は、シグマジエノシス社により合成されたものを 使用した。
[0078] マウスのメラニン合成経路を構成する遺伝子であるチロシナーゼ遺伝子、 trp— 1遺 伝子に対するアンチセンス核酸を調製するために、それぞれ下記のプローブ核酸を 合成した。配列番号 1は、マウス由来のチロシナーゼの mRNA配列（Genbank登録 番号： NM#011661)のセンス配列の翻訳開始点の 51塩基上流力も 4塩基上流までの 48塩基であり、これの 5 '末端にピオチンを付カ卩して合成したプローブ核酸を bio-m-T yrと命名した。また、配列番号 2は、マウス由来の Trp— 1の mRNA配列（Genbank登 録番号： NM#031202)のセンス配列の 50塩基上流から 3塩基上流までの 48塩基であ り、これの 5'末端にピオチンを付カ卩して合成したプローブ核酸を bio-m-Trpと命名し た。また、ネガティブコントロールとして、配列番号 1の塩基配列を A、 T、 G、 C含量を 同じにしてランダムに並び替えた塩基配列の核酸 (配列番号 3)の 5'末端をピオチン 化したプローブ核酸も合成し、 Sh-bio-m- Tyrと命名した。また、コントロールとして、マ ウスのチロシナーゼ遺伝子、及び trp-1遺伝子に対するアンチセンス作用を示すと推 測される合成 1本鎖核酸 (ィ匕学合成アンチセンス核酸)を作製し、これらを m-Tyr-olig o (配列番号 4)、 m-Trp- oligo (配列番号 5)と命名した。なお、これらはそれぞれの遺 伝子の翻訳開始点力 47塩基上流から 28塩基上流まで、 38塩基上流から 19塩基 上流までの 20塩基の長さのものである。
施例 2)アンチセンス核酸の Β¾得
(1)サケ白子由来 DNAの切断
サケ白子由来の DNA— Na (-チ口社製） 5% (wZv)溶液 2. 8mlに、 0. 2mg/m 1の DNasel (アマシャム'バイオサイエンス社製） 0. 4ml、 lOOmM MnClを 0. 4ml、
2
10 X DNaseI緩衝液（100mMトリス塩酸pH7. 5、 ImMCaCI )を 0. 4ml添カ卩後、 3
2
7°Cで 10分間保温した。その後、フエノールークロロホルム イソアミルアルコール溶 液（ナカライ社製）を約 4ml添カ卩して、 17, 800 X g、 10分間遠心して、約 4mlの上清 を回収した。これにあらかじめ冷やしておいた 100%エタノールを 8ml、 2. 5M酢酸 アンモ-ゥムを 2mlカ卩え、—20°Cで約 2時間放置した。 17, 800 X g、 10分間遠心し 、得られた沈殿に対して 70%エタノールをカ卩えて、さらに 17, 800 X g、 5分間遠心し た。上清を廃棄し、沈殿を遠心エバポレーターで乾燥させ、 1. 8mlの TE緩衝液（10 mMトリス塩酸緩衝液 pH8. 0、 ImM EDTA)で沈殿を溶解し、これを核酸断片溶 液とした。 [0080] (2) DNAの分画
(1)で調製した核酸断片溶液を ImMになるように調製したものを 100 1分と、実 施例 1で合成した 3つのプローブ核酸（bio- m- Tyr、 bio- m- Trp、 Sh- bio- m- Tyr)とを、 それぞれ 0. 5mlの PCR用チューブにいれ、 PCR用サーマルサイクラ一（GeneAmp P CR System,アプライドバイオシステムズ社製）にセットし、 95°C、 5分間→85°C、 2分 間→75°C、 1分間→65°C、 1分間→55°C、 1分間→45°C、 1分間、その後 4°Cで保 持して、核酸断片の 1本鎖への解離を行うと同時に、プローブ核酸とハイブリダィズさ せた。
[0081] 500 μ 1分の磁性担体（MegaceU— Streptavidinゝ CORTEX BIOSYSTEM社製）を IX BZW緩衝液 500 μ 1で洗浄し、磁性担体のみを回収用磁石 (プロメガ社製)で回収 した (これを洗浄操作とする）。この洗浄操作を 3回繰り返した後、 500 1の 1XBZW 緩衝液に懸濁し、これに前述の 110 1のハイブリダィズさせた DNA溶液を添カロし、 室温で 10分間、攪拌（lOrpm)しながらプローブ核酸を磁性担体に結合させた。そ の後、プローブ核酸 (とそれに接着した 1本鎖核酸)が結合した磁性担体を磁石で回 収し、洗浄操作を 3回繰り返し、非接着核酸断片を除去した。回収したプローブ核酸（ とそれに接着した 1本鎖核酸)が結合した磁性担体に、 100 1の0. 1N水酸ィ匕ナトリ ゥムを添加し、穏やかに混和させた後、約 5分間静置し、プローブ核酸が結合した磁 性担体を磁石で回収'廃棄し、その約 100 1の上清をアンチセンス画分として回収 した。
[0082] アンチセンス画分に、約 100 μ 1の 0. 1N塩化水素を添カ卩して中和した後、 400 μ 1 の 100%エタノールと 100 /z lの 2. 5M塩化ナトリウムをカ卩え、 20°Cでー晚インキュ ペートした。続いて、 14, 000rpm、 15分間遠心してアンチセンス核酸を回収し、 70 o/oエタノールで洗浄した後、減圧下で乾燥させた。その後、 15 1の TE緩衝液に懸 濁し、吸光度計によりその濃度を決定し、それぞれ約 8 gのアンチセンス核酸を得 た。なお、プローブ核酸として bio-m-Tyrを用いて得られたアンチセンス核酸を m-Ty r-antiDNA、プローブ核酸として bio-m- Trpを用いて得られたアンチセンス核酸を m- Trp-antiDNA、またプローブ核酸として Sh-bio-m- Tyrを用いて得られたアンチセンス 核酸を Sh-m- Tyr-DNAとした。 [0083] (実施例 3)マウスメラノーマ細胞での ¾色化阳.害効 ー焙地に添加して効 を碓 マウスメラノーマ細胞（B16) (HS財団より分譲。分譲株 No. JCRB0202)を、 DME M培地（ゥシ胎児血清を 10%になるように含むダルベッコ変法イーグル培地、インビ トロジヱン社製)で増幅させたのち、 96穴プレートに 1穴当たり 104個となるように加え、 そこに実施例 2 (2)で調製した m- Tyr- antiDNA、 m- Trp-antiDNAを最終濃度 100η M、 1 Mになるように含有する DMEM培地を用いて、 37°Cで COインキュベーター
2
内で培養した。陰性コントロールとして、 2本鎖 DNAである実施例 2 (1)で調製した核 酸断片 (未分画核酸)を同じ濃度になるように加え、さらに、比較対照として、実施例 1の合成 1本鎖核酸の m-Tyr-oligo、 m-Trp- oligoを同じ濃度になるように加えた。
[0084] これら核酸の含有した DMEM培地 200 μ 1で毎日培地交換を行!、、 7日間培養し た。その後、培地を除去し、 PBSで接着した細胞を軽く洗浄し、 50 1のトリトン X-10 0を 0.1%の濃度で含む PBS溶液を添加し、 4°Cで 1時間インキュベートした。その後、 10mM L DOPA溶液を 50 μ 1加え、 37°Cで約 1時間保温した。
[0085] 上清を回収し、 L DOPAを基質として黒色化の度合いを測定するため、プレート リーダー（マルチスキャンプラス ΜΚΠ、 日本フロウラボラトリー社製）で 492nmにおけ る吸光度を測定した。その結果を表 1に示す。なお、表の数値は核酸サンプルのか わりに TE緩衝液を加えた場合の活性を 100%とした場合の残存活性を表し、つまり この数値が低!、方が抑制率が高 ヽことを示す。これより明ら力なように実施例 2の本 発明のアンチセンス核酸を添加した細胞において、メラニン生成による黒色化が抑 制されていることが明ら力となった。
[0086] [表 1]
Figure imgf000024_0001
さらに m- Tyr- antiDNA、 Sh- m- Tyr- DNA、 m- Tyr- oligo及び実施例 2 (1)の未分画 核酸を終濃度 50ηΜ、 ΙΟΟηΜになるように添カ卩して同様に検討した結果を表 2に示 す。この場合も TEをサンプルのかわりにカ卩えた場合の活性を 100%とした場合の残 存活性を示す。
[表 2]
Figure imgf000025_0001
[0089] この結果からも特異的な分画によって分離されたアンチセンス核酸により抑制効果 が発揮されて 、ることが明らかである。
[0090] (実施例 4) マウスメラノーマ細胞での黒色化阳.害効 細胞に導入
細胞への導入は SAINT— MIX (タカラバイオ社製)を用いた。実施例 2で調製した m-Tyr-antiDNA, Sh- m- Tyr- DNA、および実施例 2 ( 1)の未分画核酸の 500 溶 液を 2 μ 1と、 100 μ 1の HBSをそれぞれ混合し、室温で約 5分間放置し、これと 20 μ 1 の SAINT— MIXと 80 μ 1の HBSの混液とを混合した。これに約 800 μ 1の DMEM 培地 (インビトロジェン社製)を添加し、これらの混合液を、マウスメラノーマ細胞 B16 力 X 105個 Ζゥェルになるように添カ卩した 6穴プレートに添カ卩した。 COインキュベー
2
ター内で 37°C、約 3時間インキュベートした後、 2mlの DMEM培地を添カ卩し、同様 に 24時間インキュベートした。その後、培地を破棄し、トリプシン溶液 (インビトロジェ ン社製)を用いて、細胞をプレートよりはがし、遠心 (430 X g、 3分間）して細胞を遠 沈管に回収し、 目視によりその黒色度を判定した。さらには、実施例 3と同様にして、 トリトン X— 100溶液を添加して細胞を溶解し、そこに L— DOPA溶液をカ卩えて、黒色 化の度合いを評価した (表 3)。この場合、 106個の細胞あたりに換算した、波長 492η mにおける吸光度の値が低 、方が、黒色化が抑制されて 、る。
[0091] [表 3] m-Tyr-antiD A Sh-m-Tyr-DNA 未分画核酸
1 fl M 0.225 0.329 0.295
100 nM 0.227 0.281 0.31 1 [0092] その結果、本発明のアンチセンス核酸を導入した細胞にぉ 、て、黒色化を優位に 抑えていることが判明した。
[0093] (実施例 5)プローブ核酸 (ヒトメラノサイト評価用）の合成
ヒトのメラニン合成経路を構成する遺伝子であるチロシナーゼ遺伝子に対するアン チセンス核酸を調製するために、下記のプローブ核酸を合成した。配列番号 6は、ヒ ト由来の Tyr— 1の mRNA配列（Genbank登録番号： NM#000372)のセンス配列の、 翻訳開始点の 48塩基上流から 1塩基上流までの 48塩基であり、これの 5'末端にビ ォチンを付カ卩して合成したプローブ核酸を bio-h-Tyrと命名した。
[0094] またコントロールとして、ヒトのチロシナーゼ遺伝子に対するアンチセンス作用を示 すと推測される合成 1本鎖核酸を作製し、これらを h-Tyr-oligo (配列番号 7)と命名し た。なお、これらはヒトチロシナーゼ遺伝子の翻訳開始点から 67塩基上流力も 48塩 基上流までの 20塩基の長さのものである。
[0095] 列 6)ヒトメラノサイトでの ¾ 阳.
実施例 2と同様にして、プローブ核酸として bio-h-Tyrを使用し、担体に結合させる ことで、サケ白子 DNA断片よりアンチセンス核酸を分離し、これを h- Tyr-antiDNAと 命名した。ヒト正常メラノーマ細胞 (クラボウ社製）に、該アンチセンス核酸を与えた場 合の黒色化抑制の度合!ヽを検証した。
[0096] Medium254培地（HMGSを添カ卩したヒトメラノサイト培地、クラボウ社製)で増幅させた ヒト正常メラノサイト（クラボウ社製)を 96穴プレートに 1穴当たり 104個となるように加え 、それを、 h-Tyr-antiDNAをそれぞれ最終濃度 100nM、 1 μ Μになるように含有する Medium254培地中、 37°C、 COインキュベーター内で培養した。さらに合成アンチセ
2
ンス核酸のコントロールとして実施例 5で合成した h-Tyr- oligoを、陰性コントロールと して実施例 2 (1)の未分画核酸を、同じ濃度になるように加えたものでも実施した。
[0097] これら核酸の含有した Medium254培地 200 μ 1で毎日培地交換を行!、、 7日間培養 した。その後、培地を除去し、 PBSで接着した細胞を軽く洗浄し、 50 1のトリトン X- 1 00を 0.1%の濃度で含む PBS溶液を添加し、 4°Cで 1時間インキュベートした。その後 、 10mM 1^ 00?八溶液を50 1加ぇ、 37°Cで約 1時間保温した。
[0098] 上清を回収し、 L DOPAを基質として黒色化の度合いを測定するため、プレート リーダー（マルチスキャンプラス ΜΚΠ、 日本フロウラボラトリー社製）で 492nmを測定 、その結果を表 4に示す。なお、表の数値は核酸サンプルのかわりに TE緩衝液をカロ えた場合の活性を 100%とした場合の残存活性を表し、つまりこの数値が低 、ほど抑 制率が高いことを示す。これより明らかなように本発明のアンチセンス核酸を添加した 細胞において、メラニン生成による黒色化が抑制されていることが明ら力となった。
[0099] [表 4]
Figure imgf000027_0001
[0100] (実施例 7)プローブ核酸 (ヒト繊維芽細朐評価用）の合成
ヒトのマトリックスメタ口プロテアーゼ 1 (ΜΜΡ— 1)遺伝子に対するアンチセンス核酸 を調製するために、下記のプローブ核酸を合成した。配列番号 8は、ヒト由来の ΜΜΡ 1の mRNA配列（Genbank登録番号： N W002421)のセンス配列の翻訳開始点の 48塩基上流から 1塩基上流までの 48塩基であり、これの 5'末端にピオチンを付カロし て合成したプローブ核酸を bio- h-MMPlと命名した。またコントロールとしてヒトの MM P— 1遺伝子に対するアンチセンス作用を示すと推測される合成アンチセンス核酸を 作製し、これらを h-MMPl-oligo (配列番号 9)と命名した。なお、これはヒトチ口シナー ゼ遺伝子の翻訳開始点から 20塩基上流から 1塩基上流までの 20塩基の長さのもの である。
[0101] (実施例 8)ヒトマトリックスメタ口プロティナーゼー 1 (MMP— 1)阳.害 実施例 2と同様にして、プローブ核酸として bio-h-MMPlを使用し、担体を利用して 、サケ白子 DNA断片よりアンチセンス核酸を分離し、これらを h-MMPl-antiDNAと命 名した。ヒト正常繊維芽細胞 (クラボウ社製）に該アンチセンス核酸を与えた場合のマ トリックスメタ口プロティナーゼ 1 (MMP— 1)抑制の度合いを検証した。
[0102] 2%FBSを含む Mediuml06S培地（クラボウ社製)で増幅させたヒト正常繊維芽細 胞 (クラボウ社製)を 24穴プレートに 1穴当たり 5 X 104個となるように加え、 COインキ ュベータ内、 37°Cで 24時間培養を行った。その後、 FBSを含まない同培地に交換し 、 UV照射装置 (タリ-カルサプライ社製)で 3. 7jZcm2の条件で UV照射 (ピーク波 長 352nm)を 12分間実施した。そこ h- MMP1- antiDNAを最終濃度 1 μ Μになるよう に含有する Mediuml06S培地で 37°C、 COインキュベーター内で 48時間培養した
2
。コントロールとして、合成アンチセンス核酸の h-MMPl- oligoを同じ濃度になるように 加えた (サンプル未添加の場合を陰性コントロールとした)。
[0103] 培養後の培養上清を回収し、このサンプル中の MMP— 1量をウェスタンブロッティ ングにより確認を行った。サンプルの蛋白質量はゥシ血清アルブミンをスタンダードと して MicroBCA assay kit (PIRCE社製）により定量し、アプライするサンプルのタンパ ク質量が同じになるようにし、電気泳動の際は、ウェスタンブロッテイング用、 CBB染 色確認用の 2枚のゲルで同溶液量のサンプルをアプライした。具体的には、サンプ ル 5 μ gに電気泳動サンプルバッファーを添カ卩し、 95°Cで 5分間加熱処理し、 10%ポ リアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を行った。
[0104] ウェスタンブロッテイング用ゲルは、「セミドライブロッテイング実験方法: ATTO社」 を参考にし、ポリビ-リデンフルオライド膜（PVDF膜、 Hybond P:Amersham Bioscien ces社製)への転写操作を行った。
[0105] 転写後の PVDF膜はブロッキング溶液（0. 3%スキムミルク ZPBST (Phosphate Bu ffered Saline with 0.1% Tween20) )に浸して室温で 3時間ブロッキングし、その後、 PB STで膜をよく洗净した。
[0106] ブロッキング後の膜は、 0. 3%スキムミルク ZPBS (Phosphate Buffered Saline)で 1 O ^ g Zmlに希釈した抗 MMP— 1 (Collagenase- 1)抗体（LAB VISION社製）の溶液 に浸して 4°C、一晩反応させ、反応終了後、 PBSTでよく洗浄した。
[0107] 次に、 0. 3%スキムミルク ZPBSで 1000倍に希釈したャギ抗ゥサギ IgGポリクロー ナル抗体 ペルォキシダーゼ標識物（DAKO社製)の溶液に膜を浸し、室温で 2時 間反応させた。反応終了後、膜は PBSTでよく洗浄した。
[0108] 洗净後、膜を基質液 (ECL Plus Western Blotting Detection System : Amersham Bio sciences社製）に浸し、生じた化学発光をフィルム（Hyperfilm ECL: Amersham Bioscie nces社製）に感光させることによってシグナルを可視化した。また CBB染色確認用ゲ ルは、 CBB (Coomassie Brilliant Blue)でタンパク質染色を行い、アプライしたタンパ ク質量がほぼ同じであることを確認した。
[0109] 感光させたフィルムの MMP— 1検出バンドの結果を図 1に示す。図 1より、本発明 のアンチセンス核酸を添カ卩した細胞において、 MMP— 1のタンパク質発現が阻害さ れていることが明ら力となった。
[0110] (2) MMP— 1活性での確認
( 1)で使用した培養上清を用 ヽて MMP— 1活性を測定し、その阻害の度合 ヽを確 認した。培地上清中の I型マトリックスメタ口プロテアーゼ活性は、最終濃度 0. 05mg ZmLのトリプシンを添カ卩して 37°Cで 15分間インキュベートした後、最終濃度 0. 25 mgZmLの大豆トリプシン阻害用組成物を添カ卩し、これについて、フルォレセインィ ソチオシァネート (FITC)で標識した I型コラーゲンを基質として用いて測定した。す なわち、 0. 25mgZmLの FITC標識 I型コラーゲンを含有する lOOmMトリス塩酸緩 衝液（pH7. 5、 0. 4M塩化ナトリウム、 0. 01M塩化カルシウム及び 0. 04(w/v)%7 ジ化ナトリウムを含む） 50 μ Lを、前記トリプシン処理した培地上清 50 μ Lにカ卩え、遮 光下にて 37°Cで 2時間反応させた。次!、で 40mMの 0-フエナント口リン（phenanthroli ne) 5 μ Lを加え反応を停止した後、 37°Cにて 30分間コラーゲンの変性処理を行い、 エタノールと 0. 17Mトリス塩酸緩衝液（pH9. 5、0. 67M塩化ナトリウムを含む）との 容量比 7 : 3の混合液 50 /z Lを添カ卩し、変性されたコラーゲンのみを抽出した。 2, 00 Orpmで 15分間遠心分離し、上清の蛍光強度を励起波長 495nm,蛍光波長 520η mで測定した。その結果を表 5に示す。陰性コントロールの前記酵素活性を 100とし て示した相対活性により、評価を行った。
[0111] [表 5]
Figure imgf000029_0001
[0112] その結果、 MMP—1活性からも本発明のアンチセンス核酸による阻害が確認され [0113] (実施例 9)本発明のアンチセンス核酸の分析と分画
(1)アンチセンス核酸の調製
本実施例では、実施例 2 (2)で調製したマウスチロシナーゼ阻害用アンチセンス核 酸、 m- Tyr- antiDNAを使用した。
[0114] (2)アンチセンス核酸のクロマト分画
m— Tyr— antiDNAを高速液体クロマトグラフィーを用いて分画を行った。すなわち 、 0. 1mlの m— Tyr— antiDNA溶液（濃度 ImM)を HPLCにインジェクションし、陰ィ オン交換カラム (COSMOSIL DEAE、ナカライ社製)を用いた分画を実施した。インジ ェクシヨン後、緩衝液（20mMトリス塩酸緩衝液、 pH8. 2)で洗浄した後、塩化ナトリ ゥム濃度勾配 (0〜： LM)による溶出操作を実施し、溶出画分を以下の集団になるよう に 1つにまとめた。なお、その際のクロマトパターンを図 2に示した (横軸は時間経過、 縦軸は 254nmの吸収を示す)。
[0115] 図 2からも明らかなように、本発明のアンチセンス核酸は分布幅を有する溶出パタ ーンを示し、多種類の連続した大きさの核酸の集合体であることが確認された。
[0116] (3)マウスメラノーマ細胞での黒色化阻害効果 培地に添加して効果を確認
(2)のクロマト分画にお 、て、勾配をかけて ヽな ヽ塩ィ匕ナトリウム濃度が 0の状態の ものをコントロール、塩化ナトリウム勾配力 0より大きく lOOmM以下のフラクション分 を（a)ゝ lOOmMより大きく 200mM以下のフラクション分を（b)、 200mMより大きく 3 OOmM以下のフラクションを（c)、 300mMより大きく 400mM以下のフラクションを（d )、 400mMよりも大きく 500mM以下のフラクションを（e)、 500mMよりも大きく 1M以 下のものを (f)としてそれぞれ分取した。これらのフラクションは、それぞれ、エタノー ル沈殿により、濃縮し、 TE緩衝液に懸濁した。
[0117] DMEM培地（ゥシ胎児血清を 10%になるように含むダルベッコ変法イーグル培地 、インビトロジェン社製)で増幅させたマウスメラノーマ細胞 (B16) (HS財団より分譲。 分譲株 No. JCRB0202)を 96穴プレートに 1穴当たり 104個となるように加え、そこに上 記 (a)〜 (f)のフラクションの懸濁液を、それぞれ最終濃度が ΙΟΟηΜになるように含 有する DMEM培地を加え、 37°Cで COインキュベーター内で培養した。コントロール
2
として、 m- Tyr-antiDNAを同じ濃度になるように加えた。 [0118] これらアンチセンス核酸の含有した DMEM培地 200 μ 1で毎日培地交換を行!、、 7 日間培養した。その後、培地を除去し、 PBSで接着した細胞を軽く洗浄し、 50 1のト リトン X- 100を 0.1%の濃度で含む PBS溶液を添カ卩し、 4°Cで 1時間インキュベートし た。その後、 10mM ー00?八溶液を50 1加ぇ、 37°Cで約 1時間保温した。
[0119] 上清を回収し、 L DOPAを基質として黒色化の度合いを測定するため、プレート リーダー（マルチスキャンプラス ΜΚΠ、 日本フロウラボラトリー社製）で 492nmにおけ る吸光度を測定した。その結果を表 6に示す。なお、表の数値は核酸サンプルのか わりに TE緩衝液をカ卩えた場合 (これを陰性コントロールとする）の活性を 100%とした 場合の残存活性を表し、つまりこの数値が低い方が抑制率が高いことを示す。これよ り明らかなように（a)から (f)のどの画分のアンチセンス核酸を添カ卩した細胞において も、メラニン生成による黒色化が抑制されていることが明ら力となった。
[0120] [表 6]
Figure imgf000031_0001
[0121] 施例 ίθ)長鎖プローブ核酸 (マウスメラノーマ評価用）の合成
マウスのメラニン合成経路を構成する遺伝子であるチロシナーゼ遺伝子をターゲッ トとしたアンチセンス核酸を調製するために、下記の長鎖プローブ核酸を PCRにより 合成した。配列番号 10、 11、 12及び 13の核酸は、マウス由来のチロシナーゼの配 列（Genbank登録番号:NM#011661)の転写開始点から、その下流 70番目の塩基ま でを PCRで合成できるようにデザインしたもので、これらを PCR-m- Tyr-1、 PCR-m- T yr- 2、 PCR-m- Tyr-3及び PCR-m- Tyr-4と命名した。これらの核酸を利用して転写開 始点からその下流 70番目までの 2本鎖 DNAを PCRにより合成し、これを 1本鎖の長 鎖プローブ核酸を PCR合成するための铸型とした。
[0122] 次に上記のものを铸型として用い、配列番号 10の合成核酸をプライマーとしたリニ ァー PCRを実施し、 1本鎖の長鎖プローブ核酸を合成した。 PCRの条件は 94°C、 2 分間後の変性後に 94°C、 30秒→55°C、 30秒→72°C、 15秒の反応サイクルを 100 回実施した。その後、エタノール沈殿により、増幅された断片を回収し、これを 500 1の滅菌水に懸濁した。この長鎖プローブ核酸を L-PCR-m- Tyr (分子量約 21, 000) と命名した。
[0123] (実施例 11)アンチセンス核酸の取得
(1)サケ白子由来 DNAの切断と分画
サケ白子由来の DNA— Na (-チ口社製） 10% (wZv)溶液 20mlを、超音波破砕 機（SMT社製)で 20分間処理して DNAを細断し、その溶液を排除分子量 2, 000の 限外ろ過透析膜け力ライ社製）に注入し、滅菌水中、室温で一晩放置した。その後 、内容物（分子量 2, 000以上の核酸)を、今度は排除分子量 15, 000の限外ろ過透 析膜 (ナカライ社製）に添加し、 40mlの滅菌水中、室温で一晩、振とうを加えながら 放置した。その外液である滅菌水中に含まれる DNA断片（分子量 2, 000-15, 00 0)をエタノール沈殿により回収し、 4mlの滅菌水に懸濁した。これを分画核酸断片溶 液とした。
[0124] (2)目的のアンチセンス核酸の分離
(1)で調製した分画核酸断片溶液を 5mMの濃度になるように調製したものを 900 μ 1分と、実施例 10の L- PCR- m- Tyrの 100 μ 1を、エツペンドルフチューブにいれ、ヒ ートブロック (タイテック社製）にセットし、 100°Cで 5分間加熱して分画核酸断片を 1 本鎖化させた後、 30°Cで 5分間保持して、長鎖プローブ核酸と分画核酸断片とをノ、 イブリダィズさせた。
[0125] これを排除分子量 15, 000の限外ろ過膜け力ライ社製）に添加し、 4Lの滅菌水中 でー晚放置し、長鎖プローブ核酸にァニールしていない分子量 15, 000以下の分 画核酸断片を排除した。その後、 目的のアンチセンス核酸が接着したプローブ核酸 溶液の入った限外ろ過膜を 5mlの滅菌水の入った容器に入れ、 105°C、 10分間加 熱し、長鎖プローブ核酸にァニールした 1本鎖核酸をはがし、外液に溶出させること により、アンチセンス核酸を回収し、これを f-m- Tyr- antiDNAとした。なおその回収は 約 5mlの外液をエタノール沈殿法で処理し、 300 1の TE緩衝液に懸濁することによ り実施した。
[0126] (3)マウスメラノーマ細胞での黒色化阻害効果
(2)で回収したアンチセンス核酸を実施例 3と同様にして、マウスメラノーマ細胞 (B 16)に対する黒色化阻害によりその効果を検証した。添加したアンチセンス核酸は、 (2)の f-m- Tyr-antiDNA、実施例 2 (2)で調製したm-Tyr-antiDNA、コントロールとし て合成アンチセンス核酸 m-Tyr-oligoを用い、細胞培養液にアプライする際の最終添 加濃度を全て 1 Mになるようにした。その結果を表 7に示す。なお、表の数値はサ ンプルのかわりに TE緩衝液を加えた場合の活性を 100%とした場合の残存活性を 表し、つまりこの数値が低い方が抑制率が高いことを示す。これより明らかなように、 限外ろ過膜を利用して調製したアンチセンス DNAを添加した細胞にぉ ヽて、磁性担 体を使用した場合の方法と比較してもほぼ同程度の阻害活性を示すことが明らかと なった。
[0127] [表 7]
Figure imgf000033_0002
[0128] 続いて、本発明のアンチセンス核酸を使用した、皮膚外用剤についての実施例の 処方を示す。なお、下記処方において、アンチセンス核酸は実施例 6で得られたアン チセンス核酸を使用した。処方中の配合量はすべて重量部である。
[0129]
Figure imgf000033_0001
(1)エタノール 10. 0
(2)ヒドロキシェチノレセノレロース 1. 0
(3)アンチセンス核酸 0. 01
(4)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1
(5)精製水 88. 8 製法: (1)〜(4)を順次 (5)に添加し、均一に溶解する。
Figure imgf000034_0001
(1)ステアリン酸 0. 2
(2)セタノール 1. 5
(3)ワセリン 3. 0
(4)流動パラフィン 7. 0
(5)ポリオキシエチレン (10E.O.)モノォレイン酸エステル 1. 5
(6)酢酸トコフェローノレ 1. 0
(7)グリセリン 5. 0
(8)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1
(9)トリエタノールァミン 1. 0
(10)精製水 79. 5
(11)アンチセンス核酸 0. 01
製法:（1)〜(6)の油相成分を混合，加熱して均一に溶解し、 70°Cに保つ。一方、 )〜 (10)の水相成分を混合、加熱して均一とし、 70°Cとする。この水相成分に前記油相成 分を攪拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却した後 40°Cにて (11)を添加、混合す る。
[0131] ( 你 114) Itfflゲル剤
(1)ジプロピレングリコール 10. 0
(2)カノレボキシビニノレポリマー 0. 5
(3)水酸化カリウム 0. 1
(4)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1
(5)精製水 88. 8
(6)アンチセンス核酸 0. 01
製法 : (5)に (2)を均一に溶解した後、（1)に (4)を溶解して添加し、次いで (3)を加えて増 粘させ、（6)を添加、混合する。
[0132] 例 15)皮膚 ffiクリーム
(1)ミツロウ 6. 0 (2)セタノール 5. 0
(3)還元ラノリン 8. 0
(4)スクヮラン 27. 5
(5)グリセリル脂肪酸エステル 4. 0
(6)親油型グリセリルモノステアリン酸エステル 2. 0
(7)ポリオキシエチレン (20E.O.)ソルビタンモノラウリン酸エステル 5. 0
(8)プロピレングリコール 5. 0
(9)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1
(10)精製水 36. 4
(11)アンチセンス核酸 0. 01
製法:（1)〜 )の油相成分を混合、溶解して 75°Cに加熱する。一方、（8)〜(10)の水相 成分を混合、溶解して 75°Cに加熱する。次いで、上記水相成分に油相成分を添カロ して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し、冷却後 40°Cにて (11)を添加、 混合する。
[0133] WMA 6) τΚΦ油型 ¾, 件 膏
(1)白色ワセリン 25. 0
(2)ステアリルアルコール 25. 0
(3)グリセリン 12. 0
(4)ラウリル硫酸ナトリウム 1. 0
(5)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1
(6)精製水 36. 3
(7)アンチセンス核酸 0. 01
製法 :(1)〜(4)の油相成分を混合，溶解して均一とし、 75°Cに加熱する。一方、（5)を（ 6)に溶解して 75°Cに加熱し、これに前記油相成分を添加して乳化し、冷却後 40°Cに て (7)を添加，混合する。
[0134] (実施例 17)化粧水
(1)エタノール 10. 00
(2) 1,3-ブチレングリコール 5. 00 (3)アンチセンス核酸 0. 01
(4)香料 0. 10
(5)精製水 84. 89
製法 : (1)〜(4)を順次 (5)に添加して均一に混合、溶解する。
Figure imgf000036_0001
(1)グリセリン 2. 00
(2) 1,3-ブチレングリコール 3. 00
(3)ポリオキシエチレン (25E.O.)ォレイルエーテル 0. 50
(4)アンチセンス核酸 0. 01
(5)エタノール 15. 00
(6)パラォキシ安息香酸メチル 0. 10
(7)香料 0. 10
(8)精製水 79. 25
製法: (6), (7)を (5)に溶解し、これを (1)〜(4)とともに (8)に添加して均一に混合，溶解 する。
[0136] (実施例 19)ェモリエントクリーム（油中水型)
(1)流動パラフィン 30. 00
(2)マイクロクリスタリンワックス 2. 00
(3)ワセリン 5. 00
(4)ジグリセリルジォレイン酸エステル 5. 00
(5) L-グルタミン酸ナトリウム 1. 60
(6) L-セリン 0. 40
(7)プロピレングリコール 3. 00
(8)パラォキシ安息香酸メチル 0. 10
(9)精製水 52. 75
(10)香料 0. 10
(11)アンチセンス核酸 0. 01
製法: (5), (6)を (9)の一部に溶解して 50°Cとし、 50°Cに加熱した (4)に攪拌しながら徐 々に添加する。これをあら力じめ混合し 70°Cに加熱溶解した (1)〜(3)に均一に分散し 、これに (7), (8)を (9)の残部に溶解して 70°Cに加熱したものを攪拌しながら添加し、ホ モミキサーにて乳化する。冷却後、 40°Cにて (10)，（11)を添加、混合する。
[0137] (実施例 20)メイクアップベースクリーム
(1)ステアジン酸 12. 00
(2)セタノール 2. 00
(3)グリセリルトリ 2-ェチルへキサン酸エステル 2. 50
(4)自己乳化型グリセリルモノステアリン酸エステル 2. 00
(5)プロピレングリコーノレ 10. 00
(6)水酸化カリウム 0. 30
(7)精製水 69. 58
(8)酸化チタン 1. 00
(9)ベンガラ 0. 10
(10)黄酸化鉄 0. 40
(11)香料 0. 10
(12)アンチセンス核酸 0. 01
製法:（1)〜(4)の油相成分を混合し、 75°Cに加熱して均一とする。一方 (5)〜(7)の水 相成分を混合し、 75°Cに加熱、溶解して均一とし、これに (8)〜(10)の顔料を添加し、 ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミ キサ一にて乳化した後冷却し、 40°Cにて (11)、（12)を添加、混合する。
[0138] ( 施例 21 ) \ ,液状ファンデーション
(1)ステアリン酸 2. 00
(2)スクヮラン 5. 00
(3)ミリスチン酸オタチルドデシル 5. 00
(4)セタノーノレ 1. 00
(5)デカグリセリルモノイソパルミチン酸エステル 9. 00
(6) 1,3-ブチレングリコール 6. 00
(7)水酸化カリウム 0. 10 (8)パラォキシ安息香酸メチル 0. 10
(9)精製水 53. 40
(10)酸ィ匕チタン 9. 00
(11)タノレク 7. 40
(12)ベンガラ 0. 50
(13)黄酸化鉄 1. 10
(14)黒酸化鉄 0. 10
(15)香料 0. 15
(16)アンチセンス核酸 0. 01
製法:（1)〜(5)の油相成分を混合し、 75°Cに加熱して均一とする。一方 (6)〜(9)の水 相成分を混合し、 75°Cに加熱、溶解して均一とし、これに (10)〜(14)の顔料を添加し 、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモ ミキサーにて均一に乳化した後冷却し、 40°Cにて (15)、（16)を添加、混合する。
施例 22)ハンドクリーム
(1)セタノール 4. 0
(2)ワセリン 2. 0
(3)流動パラフィン 10. 0
(4)グリセリルモノステアリン酸エステル 1. 5
(5)ポリオキシエチレン (60E.O.)グリセリルイソステアリン酸エステル 2. 5
(6)酢酸トコフェローノレ 0. 5
(7)グリセリン 20. 0
(8)パラォキシ安息香酸メチル 0. 1
(9)精製水 59. 2
(10)アンチセンス核酸 0. 01
製法 :(1)〜(6)の油相成分を混合、溶解して 75°Cに加熱する。一方、 )〜 (9)の水相 成分を混合、溶解して 75°Cに加熱する。次いで、上記水相成分に油相成分を添カロ して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化して冷却し、 40°Cにて (10)を添加 、混合する。

Claims

請求の範囲
[I] 生物由来の核酸原料を処理することを特徴とするアンチセンス核酸の製造方法。
[2] 由来となる生物力 微生物又は動植物である請求項 1記載のアンチセンス核酸の製 造方法。
[3] 生物由来の核酸を細断して 1本鎖化したものを、ターゲット遺伝子の少なくとも一部の 塩基配列を有するプローブ核酸と接着させ、該接着核酸を未接着核酸と分離した後 、プローブ核酸より接着した 1本鎖核酸をはがして回収することを特徴とする請求項 1 又は 2記載のアンチセンス核酸の製造方法。
[4] 少なくとも上記接着核酸を分離する工程において、プローブ核酸が担体に固定化さ れていることを特徴とする請求項 3記載のアンチセンス核酸の製造方法。
[5] 上記接着核酸を分離および Zまたは回収する工程において、限外ろ過膜を使用す ることを特徴とする請求項 3記載のアンチセンス核酸の製造方法。
[6] 下記の（a)〜（d)の工程力もなる請求項 5記載のアンチセンス核酸の製造方法：
(a)生物由来の核酸を細断して、分画する工程、
(b)分画核酸断片を、 1本鎖化してプローブ核酸と接着させる工程、
(c)限外ろ過膜を用いて未接着核酸を分離除去する工程、
(d)プローブ核酸より 1本鎖核酸断片をはがし、限外ろ過膜を用いて回収する工程。
[7] 分離および回収する工程において使用する限外ろ過膜の排除分子量より大きな分 子量を有するプローブ核酸を利用して、工程 (b)〜（d)を繰り返し実施することを特 徴とする請求項 6記載のアンチセンス核酸の製造方法。
[8] 生物由来であることを特徴とするアンチセンス核酸。
[9] 由来となる生物力 微生物または動植物である請求項 8記載のアンチセンス核酸。
[10] 核酸の種類に分布幅を有するアンチセンス核酸。
[I I] 請求項 3記載の製造方法によって得られるアンチセンス核酸。
[12] アンチセンス核酸が、メラニン合成経路関連遺伝子、皺形成関連遺伝子、加齢関連 遺伝子、育毛関連遺伝子、又はガン関連遺伝子にハイブリダィズする核酸である請 求項 8〜： L 1いずれ力 1項記載のアンチセンス核酸。
[13] ヒトチロシナーゼ遺伝子又はヒト MMP— 1遺伝子にハイブリダィズする核酸である請 求項 12記載のアンチセンス核酸。
[14] 請求項 8〜13いずれか 1項記載のアンチセンス核酸を有効成分として含有する化粧 用組成物又は皮膚外用剤。
[15] 請求項 8〜13いずれか 1項記載のアンチセンス核酸を有効成分として含有する医薬 用組成物。
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