JP2013527134A - オリゴヌクレオチドに適した皮膚科的、薬学的組成 - Google Patents

オリゴヌクレオチドに適した皮膚科的、薬学的組成 Download PDF

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Abstract

本発明は、炎症性疾患治療薬として使用するオリゴヌクレオチド、特に、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ，ａｓＤＮＡ又はリボザイムなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、分散された、内部にある、不連続の水相を備えるエマルションにより局所的に使用及び投与するための化粧品及び／又は皮膚科的及び／又は薬学的製剤に関する。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
本発明は、疾患に対する治療薬としてオリゴヌクレオチドを局所的に使用及び塗布するための化粧品及び／又は皮膚科的及び／又は薬学的製剤に関する。特に、本発明は、分散された、内部にある、不連続の水相を備えるエマルションに関し、炎症性疾患治療薬としてのオリゴヌクレオチドを局所的に使用するためにこのエマルションが形成され、処方される。
[技術的背景]
オリゴヌクレオチドは少量のヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡの成分）から構成される物質であり、その塩基配列は一般的に約１０〜１００のヌクレオチドユニットからなる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるプライマーとして知られている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その塩基配列が細胞、ウイルス又は合成ＲＮＡ又はＤＮＡに対して相補的であり、これらをワトソン−クリック型塩基対によって結合することができるオリゴヌクレオチドである。そのような分子は、しばしば、機能的ｍＲＮＡに対して向けられる。ｍＲＮＡへの特異的結合により、このｍＲＮＡによってコードされる蛋白質の形成が、翻訳のブロックによって最終的に阻止される。
アンチセンス分子は、アンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）、「小さな抑制性（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）」ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボゾーム及びＤＮＡザイム、が属する様々な分子クラスに属することができる。後者の２つの分子グループは、特に、結合した標的ＲＮＡを直接開裂に導くことのできる固有の触媒活性によって特徴づけられる。
限定されていないが、ＤＮＡザイムとして、例えば、独国特許出願公開第１０３４６４８７．５号に挙げられているＤＮＡザイムが、炎症性疾患に対する治療薬を製造するために開示されている。
オリゴヌクレオチドは天然又は組換えヌクレアーゼに対して非常に感受性の強いことが一般的に知られている。ヌクレアーゼは汎存性であり、通常のエステル結合の加水分解酵素として作用し、オリゴヌクレオチドの分解及び劣化を触媒する酵素群である。ヌクレアーゼは、ＤＮアーゼ又はＲＮアーゼとして当業者に知られている。
ヌクレアーゼに対する感受性は、オリゴヌクレオチドを医療に使用する場合に特に問題となる。古典的な薬剤と比較して、オリゴヌクレオチドはＤＮアーゼ及びＲＮアーゼによって急速に分解され、このことにより半減期が短くなり、従って標的細胞への生体への利用性がより低くなる。
オリゴヌクレオチドを医学的にも（特に治療に）使用できるようにするためには、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼから効率的に保護することが必要である。そのために、例えば、オリゴヌクレオチドの構造を化学修飾することによって変更し、安定性を高めたり、もしくはいわゆる薬物送達システムを開発したりするなど、様々な技術的アプローチを使って世界中で研究が行われている。この薬物送達システムには、例えばリポソーム、ナノ粒子、ウイルスカプシド及びプロタミンオリゴヌクレオチド粒子が属している。これらの多くの薬物送達システムには、例えば、これらのシステムがヌクレアーゼによる分解に対して十分な保護効果を発揮しないこと、標的組織及び標的細胞への吸収が悪いこと、又はオリゴヌクレオチドの有効性に悪影響を与える毒性のある成分又は有害な成分を含んでいることなどの欠点がある。とりわけ局所的使用には、細菌、真菌及びヌクレアーゼに対する十分な保護能力がないために、ＤＮＡザイムなどのオリゴヌクレオチドを使って形成される、炎症性疾患に対する治療薬として処方可能な適切な製剤は今のところ存在しない。これまで、オリゴヌクレオチドの皮膚科への使用は、特に保護能力の欠如により妨げられている。
[課題]
本発明の課題は、従来技術の欠点を克服し、オリゴヌクレオチドを局所的に使用するための製剤を提供することである。
[解決]
この課題は、本発明に基づき、請求項によって解決され、特に、分散された、内部にある、不連続の水相を備えるエマルションによって解決される。
驚くべきことに、分散された、内部にある、不連続の水相を備えるエマルションの形態において、オリゴヌクレオチドを安定して保持し、ヌクレアーゼによる酵素分解から効果的に保護し、標的組織及び標的細胞への良好な吸収を可能にする、安定した有効な製剤が発見された。
1. 製剤の特性
分散された、内部にある、不連続の水相を備えるエマルションの形態における本発明に基づく製剤は、マグネシウムイオン又はナトリウムイオンを添加して、ガレニック剤形を使用することにより、水中油中水型エマルション（いわゆるＷ／Ｏ／Ｗエマルション）又は油中水型エマルション（いわゆるＷ／Ｏエマルション）を生じる。驚くべきことに、製剤にマグネシウムイオン又はナトリウムイオンを添加することはオリゴヌクレオチドの作用に非常に有利であることが明らかとなり、酵素分解から保護することによってオリゴヌクレオチドの安定性が改善され、それによって、例えば皮膚細胞、肺及び腸管上皮細胞、粘膜、鼻粘膜上皮細胞及び鼻咽頭部分の細胞など、標的細胞への良好な吸収が可能となる。

本発明に基づく製剤の材料
本発明に基づく製剤は、少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも一つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分（occlusive components）、少なくとも1つの無機及び／又は有機添加剤、水及び少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでいる。
代替として、本発明に基づく製剤は、さらに、少なくとも１つの親水性乳化剤及び／又は少なくとも１つの両親媒性成分を含んでいる。
代替として、本発明に基づく製剤は、さらに、少なくとも１つの保湿成分を含んでいる。
代替として、本発明に基づく製剤は、さらに、少なくとも１つの防腐剤を含んでいる。
代替として、本発明に基づく製剤は、さらに、少なくとも１つの天然又は合成油又はワックスを含んでいる。
少なくとも１つの親油性乳化剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン誘導体（例えばスパン、ステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、グリセロールモノオレエート）、のグループから選択される。
少なくとも１つの稠度付与剤は、脂肪酸エステル（例えばパルミチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル）、ポリエチレングリコール、ミツロウ、マイクロクリスタリンワックス、ウールワックス及びそのアルコール、水素化ヒマシ油、カルボマー（例えば架橋型アクリル酸ポリマー）、又はセルロース及びその誘導体、のグループから選択される。
少なくとも１つの閉塞性成分は、例えばパラフィン又はポリシロキサン（シリコンオイルなど）といった飽和炭化水素のグループから選択される。
少なくとも１つの無機及び／又は有機添加剤は、塩又はイオン性液体であり、その陽イオン部分は、Ｎａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ａｇ又はこれらの要素の組み合わせ（例えばＮａＣｌ、ＭｇＳＯ4の混合物）又は有機陽イオンを持つ要素の組み合わせ（例えば１-エチル-３-メチルイミダゾリウムクロライド、１-ブチル-３-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１-エチル-３-メチルイミダゾリウム硫酸塩、１-エチル-３-メチルイミダゾリウムトリフルオロメタンスルホン酸、１-エチル-３-メチルイミダゾリウムジシアナミド又は１-エチル-１-メチルピロリジニウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミドなどのイオン性液体中のＭｇ（Ｎ（ＳＯ2ＣＦ3）2）2、Ｍｇ（ＯＳＯ2ＣＦ3）2の混合物など）を含んでいる。
少なくとも１つの親水性乳化剤は、ポリソルベート又はエトキシル化ポリエチレングリコール（例えばトゥイーン、ステアレス、ラウレス、セテアレート）又はエトキシル化エーテル又はエステル、のグループから選択される。
少なくとも1つの両親媒性成分は、リン脂質、好ましくはレシチン又はその誘導体の１つ、のグループから選択される。
少なくとも１つの保湿剤は、グリセリン、ポリオール、オスモライト、のグループから選択される。
少なくとも１つの油は、エステル化脂肪酸（例えばオレイン酸デシル）、ワックス（例えばホホバワックス）又は部分エステル化グリセリド（例えば中鎖脂肪酸トリグリセリド）又は天然油（大豆油、ピーナッツ油、アボカド油、オリーブ油、ひまし油及びナッツ油又は種子油など）、のグループから選択される。
少なくとも１つの防腐剤はパラベンなどである。
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、プライマー、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ又はリボザイム）、のグループから選択される。
限定されていないが、ＤＮＡザイムとして、例えば、独国特許出願公開第１０３４６４８７．５号に挙げられているＤＮＡザイムは、蛋白質ＧＡＴＡ‐３及びＴ‐ｂｅｔのｍＲＮＡに対して向けられ、炎症性疾患に対する治療薬を製造するために開示されている。
例えば、以下のＤＮＡザイムが使用される（個々に、又はその他との組合せで）。

ＧＡＴＡ‐３のｍＲＮＡ配列に対するＤＮＡザイムの名前：
hgd1 5'-TCGGTCAGAggctagctacaacgaTGCGTTGCT-3'
hgd2 5'-GGCGTACGAggctagctacaacgaCTGCTCGGT-3'
hgd3 5'-GGCGGCGTAggctagctacaacgaGACCTGCTC-3'
hgd4 5'-CTCGGGTCAggctagctacaacgaCTGGGTAGC-3'
hgd5 5'-TCCTCTGCAggctagctacaacgaCGGGGTCCT-3'
hgd6 5'-ACTCTGCAAggctagctacaacgaTCTGCGAGC-3'
hgd7 5'-GGGCGACGAggctagctacaacgaTCTGCAATT-3'
hgd8 5'-AAGGGGCGAggctagctacaacgaGACTCTGCA-3'
hgd9 5'-AAAACGGGAggctagctacaacgaCAGGTTGTA-3'
hgd10 5'-AGAATAAAAggctagctacaacgaGGGACCAGG-3'
hgd11 5'-ATGGCAGAAggctagctacaacgaAAAACGGGA-3'
hgd12 5'-AACTGGGTAggctagctacaacgaGGCAGAATA-3'
hgd13 5'-ATCCAAAAAggctagctacaacgaTGGGTATGG-3'
hgd14 5'-AGGGGAAGAggctagctacaacgaAAAAATCCA-3'
hgd15 5'-TTTTAAAAAggctagctacaacgaTATCTTGGA-3'
hgd16 5'-GTGGGGGGAggctagctacaacgaGGGAAGGCT-3'
hgd17 5'-GTTGAATGAggctagctacaacgaTTGCTTTCG-3'
hgd18 5'-GTCGTTGAAggctagctacaacgaGATTTGCTT-3'
hgd19 5'-GGCCCGGAAggctagctacaacgaCCGCGCGCG-3'
hgd20 5'-TCACCTCCAggctagctacaacgaGGCCTCGGC-3'
hgd21 5'-CCGCCGTCAggctagctacaacgaCTCCATGGC-3'
hgd22 5'-GGTGGCTCAggctagctacaacgaCCAGCGCGG-3'
hgd23 5'-CGTTGAGCAggctagctacaacgaGGCGGGGTG-3'
hgd24 5'-CCGCGTCCAggctagctacaacgaGTAGGAGTG-3'
hgd25 5'-CAGCGGGTAggctagctacaacgaTGCGCCGCG-3'
hgd26 5'-GCACATCCAggctagctacaacgaCTCCTCCGG-3'
hgd27 5'-AAAAGCACAggctagctacaacgaCCACCTCCT-3'
hgd28 5'-TAAAAAGCAggctagctacaacgaATCCACCTC-3'
hgd29 5'-GACCGTCGAggctagctacaacgaGTTAAAAAG-3'
hgd30 5'-TTGCCTTGAggctagctacaacgaCGTCGATGT-3'
hgd31 5'-AGGGCGGGAggctagctacaacgaGTGGTTGCC-3'
hgd32 5'-TGGCCCTGAggctagctacaacgaCGAGTTTCC-3'
hgd33 5'-ACCTCTGCAggctagctacaacgaCGTGGCCCT-3'
hgd34 5'-CGGAGGGTAggctagctacaacgaCTCTGCACC-3'
hgd35 5'-GGCGGCACAggctagctacaacgaCTGGCTCCC-3'
hgd36 5'-CGGGCGGCAggctagctacaacgaACCTGGCTC-3'
hgd37 5'-AGGGATCCAggctagctacaacgaGAAGCAGAG-3'
hgd38 5'-GGGTAGGGAggctagctacaacgaCCATGAAGC-3'
hgd39 5'-GGGCTGAGAggctagctacaacgaTCCAGGGGG-3'
hgd40 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG-3'
hgd41 5'-CGTGGTGGAggctagctacaacgaGGACGTCTT-3'
hgd42 5'-GGGGGTAGAggctagctacaacgaGGAGAGGGG-3'
hgd43 5'-GGAGGAGGAggctagctacaacgaGAGGCCGGG-3'
hgd44 5'-GCCCCCCGAggctagctacaacgaAAGGAGGAG-3'
hgd45 5'-CCGGGGAGAggctagctacaacgaGTCCTTCGG-3'
hgd46 5'-GGACAGCGAggctagctacaacgaGGGTCCGGG-3'
hgd47 5'-TGGGGTGGAggctagctacaacgaAGCGATGGG-3'
hgd48 5'-CTTGAGGCAggctagctacaacgaTCTTTCTCG-3'
hgd49 5'-CACCTGGTAggctagctacaacgaTTGAGGCAC-3'
hgd50 5'-GCAGGGGCAggctagctacaacgaCTGGTACTT-3'
hgd51 5'-CCAGCTTCAggctagctacaacgaGCTGTCGGG-3'
hgd52 5'-GTGGGACGAggctagctacaacgaTCCAGCTTC-3'
hgd53 5'-GGAGTGGGAggctagctacaacgaGACTCCAGC-3'
hgd54 5'-ATGCTGCCAggctagctacaacgaGGGAGTGGG-3'
hgd55 5'-GGGCGGTCAggctagctacaacgaGCTGCCACG-3'
hgd56 5'-GAGGCTCCAggctagctacaacgaCCAGGGCGG-3'
hgd57 5'-GTGGGTCGAggctagctacaacgaGAGGAGGCT-3'
hgd58 5'-AGGTGGTGAggctagctacaacgaGGGGTGGTG-3'
hgd59 5'-ACTCGGGCAggctagctacaacgaGTAGGGCGG-3'
hgd60 5'-GGAGCTGTAggctagctacaacgaTCGGGCACG-3'
hgd61 5'-GGACTTGCAggctagctacaacgaCCGAAGCCG-3'
hgd62 5'-GGGCCTGGAggctagctacaacgaTTGCATCCG-3'
hgd63 5'-TGTGCTGGAggctagctacaacgaCGGGCCTTG-3'
hgd64 5'-GTTCACACAggctagctacaacgaTCCCTGCCT-3'
hgd65 5'-CAGTTCACAggctagctacaacgaACTCCCTGC-3'
hgd66 5'-CACAGTTCAggctagctacaacgaACACTCCCT-3'
hgd67 5'-GTTGCCCCAggctagctacaacgaAGTTCACAC-3'
hgd68 5'-TCGCCGCCAggctagctacaacgaAGTGGGGTC-3'
hgd69 5'-CCCGTGCCAggctagctacaacgaCTCGCCGCC-3'
hgd70 5'-GGCGTTGCAggctagctacaacgaAGGTAGTGT-3'

Ｔ‐ｂｅｔのｍＲＮＡ配列に対するＤＮＡザイムの名前：
td1 5'-TGGCTTCTAggctagctacaacgaGCCCTCGTC-3'
td2 5'-GGGCTCTGAggctagctacaacgaGCCTGGCTT-3'
td3 5'-GGGACCCCAggctagctacaacgaCGGAGCCCG-3'
td4 5'-GGTGGGGGAggctagctacaacgaCCCACCGGA-3'
td5 5'-GGCGGGGGAggctagctacaacgaCCGAGGGCC-3'
td6 5'-GGGCTGGGAggctagctacaacgaGGGCAGGGA-3'
td7 5'-CGTCGAGGAggctagctacaacgaCCGCCCCTC-3'
td8 5'-GGGCTGGCAggctagctacaacgaCTTCCCGTA-3'
td9 5'-CGATGCCCAggctagctacaacgaCCGGGGCGG-3'
td10 5'-GCTCCACGAggctagctacaacgaGCCCATCCG-3'
td11 5'-CCGGCTCCAggctagctacaacgaGATGCCCAT-3'
td12 5'-TCTCCGCAAggctagctacaacgaCCGGCTCCA-3'
td13 5'-CCGTCAGCAggctagctacaacgaGTCTCCGCA-3'
td14 5'-TCCCCGGCAggctagctacaacgaCGGCTCGGT-3'
td15 5'-CCCCCGCGAggctagctacaacgaGCTCGTCCG-3'
td16 5'-GTAGGGAGAggctagctacaacgaCCCAGGCTG-3'
td17 5'-GGGCGGGCAggctagctacaacgaCAAGGCGCC-3'
td18 5'-CGGGAAGGAggctagctacaacgaTCGCCCGCG-3'
td19 5'-TAGTCCTCAggctagctacaacgaGCGGCCCCG-3'
td20 5'-TCCCCGACAggctagctacaacgaCTCCAGTCC-3'
td21 5'-TTTCCCCGAggctagctacaacgaACCTCCAGT-3'
td22 5'-TGAGCGCGAggctagctacaacgaCCTCAGTTT-3'
td23 5'-GGACCACAAggctagctacaacgaAGGTGGTTG-3'
td24 5'-CTTGGACCAggctagctacaacgaAACAGGTGG-3'
td25 5'-AAACTTGGAggctagctacaacgaCACAACAGG-3'
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Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの成分：
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも１つの両親媒性成分、少なくとも１つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分、少なくとも1つの無機及び有機添加剤、少なくとも１つの親水性乳化剤を含んでいる。
特に、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも１つの親油性乳化剤を含み、この親油性乳化剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン誘導体（例えばスパン）、のグループから選択される。
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも1つの両親媒性成分を含み、この両親媒性成分は、リン脂質、好ましくはレシチン又はその誘導体のグループから選択される。
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも１つの稠度付与剤を含み、この稠度付与剤は、脂肪酸エステル（例えばパルミチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル）、ポリエチレングリコール、ミツロウ、マイクロクリスタリンワックス、ウールワックス、水素化ヒマシ油、プロテギンＷ（Ｐｒｏｔｅｇｉｎ Ｗ）、プロテギンＷＸ（Ｐｒｏｔｅｇｉｎ ＷＸ）、カルボマー（例えば架橋型アクリル酸ポリマー）、又はセルロース及びその誘導体、のグループから選択される。
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも１つの閉塞性成分を含み、この閉塞性成分は、例えばパラフィン又はポリシロキサン（シリコンオイルなど）といった飽和炭化水素のグループから選択される。
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、代替として油を含み、この油は、エステル化脂肪酸（例えばオレイン酸デシル）、ワックス（例えばホホバワックス）又は部分エステル化グリセリド（例えば中鎖脂肪酸トリグリセリド）又は天然油（大豆油、ピーナッツ油、アボカド油、オリーブ油、ひまし油及びナッツ油又は種子油など）、のグループから選択される。
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも１つの無機及び／又は有機添加剤、好ましくは塩又はイオン性液体を含み、その陽イオン部分は、Ｎａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ａｇ又はこれらの要素の組み合わせを含んでいる。
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、少なくとも１つの親水性乳化剤を含み、この親水性乳化剤は、ポリソルベート又はエトキシル化ポリエチレングリコール（例えばトゥイーン、ステアレス、ラウレス、セテアレート）、エトキシル化エーテル、エトキシル化エステル、のグループから選択される。
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ又はリボザイム）、又はプライマー、又はアプタマー、のグループから選択される。
代替として、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションは、さらに少なくとも１つの保湿剤を含み、この保湿剤は、グリセリン、ポリオール、オスモライト、のグループから選択される。
代替として、さらにＷ／Ｏ／Ｗエマルションは、パラベンなど少なくとも１つの防腐剤を含んでいる。

Ｗ／Ｏエマルションの成分：
Ｗ／Ｏエマルションは、少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも１つの閉塞性成分、少なくとも１つの稠度付与剤、少なくとも1つの無機及び／又は有機添加剤、少なくとも１つの親水性乳化剤を含んでいる。
特に、Ｗ／Ｏエマルションは、少なくとも１つの親油性乳化剤を含み、この親油性乳化剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン誘導体（例えばステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、グリセロールモノオレエート）、のグループから選択される。
Ｗ／Ｏエマルションは、少なくとも１つの閉塞性成分を含み、この閉塞性成分は、例えばパラフィン又はポリシロキサン（シリコンオイルなど）といった飽和炭化水素のグループから選択される。
Ｗ／Ｏエマルションは、代替として油を含み、この油は、エステル化脂肪酸（例えばオレイン酸デシル）、ワックス（例えばホホバワックス）又は部分エステル化グリセリド（例えば中鎖脂肪酸トリグリセリド）又は天然油（大豆油、ピーナッツ油、アボカド油、オリーブ油、ひまし油及びナッツ油又は種子油など）、のグループから選択される。
Ｗ／Ｏエマルションは、少なくとも１つの稠度付与剤を含み、この稠度付与剤は、脂肪酸エステル（例えばパルミチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル）、ポリエチレングリコール、ミツロウ、マイクロクリスタリンワックス、ウールワックス又はそのアルコール、水素化ヒマシ油、プロテギンＷ（Ｐｒｏｔｅｇｉｎ Ｗ）、プロテギンＷＸ（Ｐｒｏｔｅｇｉｎ ＷＸ）、カルボマー（例えば橋型アクリル酸ポリマー）、又はセルロース及びその誘導体、のグループから選択される。
Ｗ／Ｏエマルションは、少なくとも１つの無機及び／又は有機添加剤、好ましくは塩又はイオン性液体を含み、その陽イオン部分は、Ｎａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ａｇ又はこれらの要素の組み合わせを含んでいる。
代替として、Ｗ／Ｏエマルションは、さらに少なくとも１つの保湿剤を含み、この保湿剤は、グリセリン、ポリオール、オスモライト、のグループから選択される。
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ又はリボザイム）、又はプライマー、又はアプタマー、のグループから選択される。
代替として、さらに、Ｗ／Ｏエマルションはパラベンなど、少なくとも１つの防腐剤を含んでいる。

エマルションの製造
局所的に使用するための本発明に基づく薬学的組成は、少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも１つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分、少なくとも1つの無機及び／又は有機添加剤及び少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、当業者には一般的な方法に従って混合される。
局所的に使用するための本発明に基づく薬学的組成は、少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも１つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分、少なくとも1つの無機及び／又は有機添加剤及び少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、ほぼ液状であり、シャンプー、溶液、ローション、クリーム、軟膏、ミルク、ペースト又はフォームである。代替として、この組成物はエアロゾルであり、肺から投与される。
局所的に使用するための本発明に基づく薬学的組成は、少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも１つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分、少なくとも1つの無機及び／又は有機添加剤及び少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、特に哺乳動物、とりわけヒトに使用される。

２. 疾患の治療薬及び予防薬としての使用
分散された、内部にある、不連続の水相を備えるエマルションの形態における本発明に基づく製剤は、マグネシウムイオン又はナトリウムイオンを添加することにより、特にオリゴヌクレオチドの保護に適し、それは、このオリゴヌクレオチドが安定化されており、酵素分解から効果的に保護され、標的組細胞への良好な吸収が可能にされているためである。従って、本発明に基づく製剤は、局所的に使用及び処方するための化粧品及び／又は皮膚科的及び／又は薬学的製剤として適している。例えば文献１のＤＮザイムなど、炎症性疾患に対する有効性が知られているオリゴヌクレオチドを使用することにより、本発明に基づく製剤は、局所的に用いられる炎症性疾患治療薬及び予防薬の製造に適している。
本発明に基づく製剤は、例えばＤＮＡザイム、特に独国特許出願公開第１０３４６４８７．５号のＤＮＡザイムなどのオリゴヌクレオチドの、例えば皮膚細胞、肺及び腸管上皮細胞、粘膜、鼻粘膜上皮細胞及び鼻咽頭部分の細胞など、局所的に使用した標的細胞への良好な吸収を示している。
ＤＮＡザイム含有製剤ＷＯＷ１４６（ＭｇＳＯ4を含む製剤）（図１ａ）及び１６７（ＮａＣｌを含む製剤）（図１ｂ）の粘性（Ｐａ・ｓ）を１５０日間にわたって比較した図である。ＷＯＷ１４６（ＭｇＳＯ4を含む製剤）の安定性は、ＷＯＷ１６７（ＮａＣｌを含む製剤）の安定性よりも優れている。 皮膚からのＤＮアーゼによるＤＮＡザイム分解のＨＰＬＣによる測定図である。図２ａは２分後の皮膚でのＤＮＡザイムのＨＰＬＣ測定を示す。図２ｂは１５２分後の皮膚でのＤＮＡザイムのＨＰＬＣ測定を示す。図２ａ及び２ｂは、皮膚において、保護されていないＤＮアーゼ分解が、そこに存在するＤＮアーゼによってすでに２分後に始まり、１５２分後にはほぼ全部のＤＮＡザイムが分解されていることを示している。この反応は、全てのオリゴヌクレオチドで同様に起こり、ＤＮＡザイムに限定されていない。 ＤＮアーゼによる分解に対するＤＮＡザイム含有製剤の保護を示す図である。ＤＮＡザイム含有製剤ＷＯＷ１４６が９０％を超えるＤＮＡザイムの保護を有しているのに対し、ＤＮＡザイム含有製剤ＷＯＷ１６７は６０％の保護しか有していない。対照として、ＤＮＡザイム含有標準溶液（ＰＢＳバッファ中の０．４％のＤＮＡザイム）が使用された。 実験的に炎症性皮膚疾患を誘発し、治療薬としての有効性がテストされる動物モデルの実験計画を示す図である。このモデルでは、マウス（系統：Ｂａｌｂ）の皮膚にオボアルブミン（ＯＶＡ）などのモデルアレルゲンを、皮膚パッチによって連続的に経皮投与してアレルギー感作を行い、炎症性皮膚疾患に典型的な炎症反応を誘発した。この感作は腹腔内投与（ｉ．ｐ）によって行われ、ＤＮＡザイムによる治療は、様々な製剤の皮内（ｉ．ｄ．）投与又は経皮（ｅ．ｃ．）投与によって行われた。
３. 実施例：
３．１．Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの実施例
本発明に基づく、ＤＮＡザイムを含む水中油中水型エマルション（Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション）は、好ましくは以下の成分を含んでいる。
3. 1. 1. 選択実施例（Ｗ／Ｏ／Ｗ１６７）
３．１．２. 選択実施例（Ｗ／Ｏ／Ｗ１４６）
３．２．Ｗ／Ｏエマルションの実施例
本発明に基づく、ＤＮＡザイムを含む水中油型エマルション（Ｗ／Ｏエマルション）は、好ましくは以下の成分を含んでいる。
３．２．１．選択実施例（Ｗ／Ｏ １２６）
３．２．２. 選択実施例（Ｗ／Ｏ １６２）
オリゴヌクレオチドとしては、例えば独国特許出願公開第１０３４６４８７．５号に開時されている全てのＤＮＡザイムｈｇｄ１〜７０及びｔｄ１〜７８が使用され、好ましくはＧＡＴＡ‐３に向けられるＤＮＡザイムとしてｈｇｄ４０を用い、Ｔ‐ｂｅｔに向けられるＤＮＡザイムとしてｔｄ６９又はｔｄ７０を用いる。
４．製剤の安定性測定
本発明に基づくＤＮＡザイム含有製剤ＷＯＷ１６７及びＷＯＷ１４６は、内部の水相に加えられている電解質によって区別される（図１）。この場合、ＷＯＷ１６７及びＷＯＷ１４６を製造するため、好ましくは０．１３Ｍの溶液が使用され、高い電解質濃度をもつ製剤は、製剤の安定性を低下させる。安定性の測定は、１５０日の期間をかけた比較試験で行われる。
製剤直後のＷＯＷ１６７（ＮａＣｌを含む製剤）の粘性は１．４Ｐａ・ｓであり、ＷＯＷ１４６（ＭｇＳＯ４を含む製剤）の粘性１Ｐａ・ｓよりも高い。ＷＯＷ１４６（ＭｇＳＯ4を含む製剤）の粘性は、最初の５日で約０．７５Ｐａ・ｓまで低下し、その後は０．７５Ｐａ・ｓで変化していない。ＷＯＷ１６７（ＮａＣｌを含む製剤）の粘性は最初の５０日までに０．６Ｐａ・ｓまで低下し、その後も、引き続き０．４Ｐａ・ｓまで低下している。
従って、ＷＯＷ１４６（ＭｇＳＯ4を含む製剤）は、ＷＯＷ１６７（ＮａＣｌを含む製剤）よりも明らかに安定している。粘性が僅かに低下しても、安定性又は保護効果にマイナスに作用しないことを指摘しておく必要があり、エマルションには位相の変化又は分離は見られず、安定している。
測定された液滴の大きさは１０〜２０μｍの範囲である。
本発明に基づくＤＮＡザイム含有製剤ＷＯ１６２及びＷＯ１２６は、同様に内部の水相に加えられている電解質によって区別される。安定性の測定は、１５０日の期間にわたる比較試験で行われ、粘性はＷＯ１２６が約４Ｐａ・ｓ、ＷＯ１６２が４．２Ｐａ・ｓで１５０日間変化していない。
測定された液滴の大きさは０．５〜２．５μｍの範囲である。
５. ＤＮアーゼなどのヌクレアーゼによる分解に対する安定性
本発明に基づくＤＮＡザイム含有製剤ＷＯＷ１６７及びＷＯＷ１４６は文献１のＤＮＡザイムを含み、それぞれＧＡＴＡ‐３に対してはＤＮＡザイムｈｇｄ１〜ｈｇｄ７０を含み、Ｔ‐ｂｅｔに対してはＤＮＡザイムｔｄ１〜ｔｄ７８を含み、ヌクレアーゼ（特にＤＮアーゼ）による分解又は劣化に対してこれらを保護している。ＤＮＡザイムがＤＮアーゼによる分解を防止し、それによって治療効果を広げられることは重要である。
経験的に、本発明に基づくＤＮＡザイム含有製剤のＤＮアーゼに対する安定性を測定するため、市場で入手可能な１０５Ｕの活性をもつＤＮアーゼＩが使用され、ＷＯＷ１６７及びＷＯＷ１４６製剤に加えられる。さらに、皮膚のライセートによる分解は陽性対照として示される。ＤＮアーゼの分解は、ＨＰＬＣによって観察される。
この測定は、以下の方法で行われる。
皮膚からのＤＮアーゼによるＤＮＡザイムの分解
１）方法
皮膚：約５０ｍｇ
溶液：１ｍｌのＤＮＡザイム標準（０．１５２５ｍｇ／ｍｌ）＋３ｍｌのＲＯ水（逆浸透水）
方法：皮膚を外科用メスで細かく切断し、溶液に混ぜ合わせ、軽くかき混ぜる。その後でろ過し、２分、５２分、１０２分、１５２分後にＨＰＬＣによって分解を検査する。
図２ａ及び２ｂは、皮膚内で自然に発生するＤＮアーゼがすでに２分後にＤＮＡザイムを分解し始めていることを示し、１５２分後にはほぼ全部のＤＮＡザイムが分解された。
６. 開発された本発明に基づく製剤ＷＯＷ１４６、ＷＯＷ１６７、ＷＯ１２６、ＷＯ１６２による、ＤＮアーゼのＤＮＡザイム分解保護
ガレニック製剤：２０ｍｇ
溶液：活性１０５ＵのＤＮアーゼＩ（トリスバッファ内）＋１０ｍｇのＭｇＳＯ4
方法：２０ｍｇの各製剤をＤＮアーゼＩ溶液１ｍｌと混ぜ合わせる。１分の培養時間の後、温度を９９℃にしてサーモミキサー内で１０分間軽く振って攪拌し、ＤＮアーゼの活性を停止する。エマルションを裂開するため、５０℃の超音波浴において製剤を１０分間培養する。製剤を０．４５μｍシリンジフィルターによってろ過し、ＨＰＬＣ分析を行う。
図３は、製剤ＷＯＷ１４６がＤＮアーゼ分解からＤＮＡザイムを約６１％保護しており、製剤ＷＯＷ１６７は５１％保護していることを示している。対照として、ＤＮＡザイム含有の標準溶液（ＰＢＳバッファ（リン酸緩衝生理食塩水―１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＮａ2ＨＰＯ及びＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ＝７．４）中に０．４％のＤＮＡザイムｈｇｄ４０）が使用され、この場合、活性物質が回復されることはなかった。従って、ＷＯＷ１６７製剤の保護は全体として良好である。同量のＤＮＡザイムを含有したＯ／Ｗの比較ガレニック製剤（マイクロエマルション：防腐剤添加水、油成分、グリセリン、親水性乳化剤、硫酸マグネシウム）も同様に保護を示さず、１００％のＤＮＡザイムが分解された。
７. 水中油型製剤（Ｏ／Ｗ製剤）と比較した場合の安定性
ガレニック製剤中の活性剤の安定性を証明するため、ＷＯ１６２、ＷＯＷ１４６及び対照としてＯＷ比較ガレニック製剤（マイクロエマルション：防腐剤添加水、油成分、グリセリン、親水性乳化剤、硫酸マグネシウム）における０．４％の活性物質ＤＮＡザイムｈｇｄ４０の回復が１カ月後にＨＰＬＣによって分析された。
１００％のスタート値に対する１カ月後のＤＮＡザイムｈｇｄ４０の回復は、Ｏ／Ｗ比較ガレニック製剤で３５．９８＋／−０．１６％であった。Ｗ／Ｏ１６２では、１カ月後の回復９５．６６＋／−２．７７％であった。Ｗ／Ｏ／Ｗでは、１カ月後の回復は１０３．１５＋／−２．２９％であった。
８. 動物モデルにおけるＧＡＴＡ‐３‐ＤＮＡザイム製剤の効果証明
少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも１つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分、少なくとも１つの無機及び／又は有機添加剤及び炎症性皮膚疾患治療薬としての少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、局所的に使用するための本発明に基づく薬学的組成の効果を、ＧＡＴＡ‐３‐ＤＮＡザイム含有製剤を例にして動物モデルで示す。
このためにマウスモデルが使用され（図４を参照）、このモデルにおいて、オボアルブミン（ＯＶＡ）などのモデルアレルゲンを皮膚パッチによって連続的に経皮投与してアレルギー感作を行い、マウスの皮膚に特異的な炎症反応を誘発した。この場合、皮膚における典型的な組織学的変化の他に、皮膚の炎症部位においてＧＡＴＡ‐３並びにＴｈ２サイトカインＩＬ‐４、ＩＬ‐５及びＩＬ‐１３などの標的遺伝子の想定された発現増加が生じ、証明された。本発明に基づく、炎症性皮膚疾患の治療薬としてのＤＮＡザイム含有製剤の使用により、治療効果が明らかになった。すなわち、ＤＮＡザイム製剤による治療後におけるマウスの炎症スコアは顕著に低下していることが証明された。さらに、この治療後、皮膚の炎症部位において、炎症細胞、特にＣＤ４＋−Ｔリンフォサイトが少なくなっていることが組織学的に示された。
以下が、例として使用された。
感作：ＯＶＡ１０μｇ＋Ａｌ（ＯＨ）3１０μｇ（ＰＢＳ１００μｌ中）、腹腔内投与
パッチ：ＯＶＡ１００μｇ＋１０μｇＡｌ（ＯＨ）３をパッチテスト法で経皮投与
治療：ＰＢＳ５０μｌ中のＤＮＡザイム２００μｇを、製剤ＷＯＷ１４６、ＷＯ１６２及びＷＯＷ１６７で局所的に皮内又は経皮投与
評価は、ＤＮＡザイム含有製剤が、実験的に発症させた炎症性皮膚炎に対して有効であることを示している。

Claims (10)

  1. 少なくとも１つの親油性乳化剤、少なくとも一つの稠度付与剤、少なくとも１つの閉塞性成分又は代替として合成あるいは天然の油もしくはワックス、少なくとも１つの無機及び／又は有機添加剤及び少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、局所的に使用するための薬学的組成。
  2. 少なくとも１つの親水性乳化剤及び／又は少なくとも１つの両親媒性成分を含む、請求項１に記載の薬学的組成。
  3. 少なくとも１つの保湿剤及び／又は防腐剤を含む、請求項１に記載の薬学的組成。
  4. 前記親油性乳化剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン誘導体（例えばスパン、ステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、グリセロールモノオレエート）、のグループから選択され、前記親水性乳化剤は、ポリソルベート又はエトキシル化ポリエチレングリコール（例えばトゥイーン、ステアレス、ラウレス、セテアレート）又はエトキシル化エーテル又はエステル、のグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成。
  5. 前記無機及び／又は有機添加剤は、塩又はイオン性液体を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成。
  6. 前記塩が、Ｎａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ａｇを備える陽イオン部分又はこれらの要素の組み合わせを含んでいることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成。
  7. 前記イオン性液体が、有機陽イオンを持つ要素の組み合わせを含んでいることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成。
  8. 前記少なくとも１つの親水性乳化剤は、ポリソルベート又はエトキシル化ポリエチレングリコール（例えばトゥイーン、ステアレス、ラウレス、セテアレート）又はエトキシル化エーテル又はエステル、のグループから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成。
  9. 前記少なくとも1つの両親媒性成分は、リン脂質、レシチン又はその誘導体の１つ、のグループから選択され、前記少なくとも１つの保湿剤は、グリセリン、ポリオール、オスモライト、のグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成。
  10. 前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ又はリボザイムなどのアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はプライマー、又はアプタマー、のグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成。
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