BR112012019868B1 - composição farmacêutica para uso tópico - Google Patents
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Abstract
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA USO TÓPICO A presente invenção refere-se a uma composição cosmética e/ou dermatológica e/ou farmacêutica para uso tópico e aplicação de oligonucleotídeos, particularmente oligonucleotídeos anti-sentido, como DNAzimas, siRNAs, asDNAs ou ribozimas, para uso como agentes contra doenças inflamatórias, por meio de emulsões com fase aquosa dispersa, interna, descontínua.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma composição cosmética e/ou dermatológica e/ou farmacêutica para o uso tópico e aplicação de oligonucleotídeos como agentes contra doenças. Particularmente a invenção refere-se a emulsões com fase dispersa, interna, descontínua, com que é possível formular e aplicar oligonucleotídeos como agentes contra doenças inflamatórias para uso tópico.
[002] Oligonucleotídeos são substâncias constituídas de poucos nucleotídeos (constituintes de DNA ou RNA), cuja sequência de nucleotídeos consiste geralmente de cerca de 10-100 unidades de nucleotídeos. Oligonucleotídeos são conhecidos, p. ex., como iniciadores que são usados na reação em cadeia da polimerase (PCR). Oligonucleotídeos anti-sentido são oligonucleotídeos cuja sequência de bases é complementar a um DNA ou RNA celular, viral ou sintético e sendo que estes podem ligar via pareamento de bases de Watson-Crick. Frequentemente moléculas desse tipo são dirigidas contra mRNAs funcionais. Por meio da ligação específica ao mRNA impede- se, através do bloqueio da tradução, finalmente, a formação da proteína referida que é codificada com este mRNA.
[003] Moléculas anti-sentido podem pertencer a diversas classes de moléculas a que pertencem DNA anti-sentido (asDNA [antisenseDNA]), RNA inibitório curto ["small inhibitory" RNA (siRNA)), Ribozimas e DNAzimas. Estes últimos dois grupos de moléculas distinguem-se por uma atividade catalítica inerente que, entre outras coisas, pode levar a uma separação direta do RNA-alvo ligado.
[004] Por exemplo, embora sem limitação indica-se como DNAzimas as DNAzimas da DE 103 46 487.5, que são reveladas para a preparação de um agente contra doenças inflamatórias.
[005] É de conhecimento geral que oligonucleotídeos são muito sensíveis relativamente a nucleases naturalmente ocorrentes ou recombinantes. Nucleases são um grupo de enzimas que ocorrem ubiquitariamente e, na maior parte das vezes atuam como hidrolases em ligações éster, e catalisam a decomposição e a degradação de oligonucleotídeos. A pessoa versada na arte conhece nucleases como sendo DNAses ou RNAses.
[006] A sensibilidade a nucleases é problemática particularmente no uso medicinal dos oligonucleotídeos. Em comparação com fármacos clássicos, oligonucleotídeos podem ser decompostos rapidamente por DNAses e RNAses, o que leva a uma meia-vida curta e, com isso, a uma biodisponibilidade mais reduzida nas células-alvos.
[007] Para que oligonucleotídeos também possam ser usados clinicamente (em particular terapeuticamente), eles precisam ser protegidos de maneira eficaz contra as nucleases. Para tanto têm sido empreendidos grandes esforços técnicos a nível mundial, p. ex. para alterar a estrutura dos oligonucleotídeos por meio de modificações químicas, de forma a elevar a estabilidade ou desenvolver sistemas-veículo de fármacos, os assim-chamados sistemas de fornecimento de drogas [Drug-Delivery Systems].
[008] A estes sistemas de fornecimento de drogas pertencem, p. ex. os liposomas, nanopartículas, capsídeos de capa viral e partículas do oligonucleotídeo protamina. Muitos destes sistemas de fornecimento de drogas apresentam desvantagens, p. ex. eles não protegem suficientemente e de maneira eficaz contra a decomposição por nucleases, eles apresentam apenas uma absorção deficiente nos tecidos-alvos e células-alvos, ou contêm componentes tóxicos ou deletérios, que prejudicam a eficácia dos oligonucleotídeos.
[009] Principalmente para o uso tópico não há presentemente uma preparação apropriada com que se possa formular oligonucleotídeos, como p. ex., DNAzimas, e aplicar como agentes contra doenças inflamatórias, já que não há suficientes possibilidades de proteção contra bactérias, fungos e nucleases. O uso bem sucedido de oligonucleotídeos na dermatologia tem sido impedido até aqui, entre outras razões, pela falta destas possibilidades de proteção.
[0010] A tarefa da presente invenção consiste em eliminar as desvantagens do estado da técnica e proporcionar uma preparação para o uso tópico de oligonucleotídeos. Solução da tarefa da invenção
[0011] A tarefa é resolvida de acordo com a invenção com as reivindicações, particularmente por meio de uma emulsão com fase água dispersa, interna, descontínua. Surpreendentemente verificou-se uma formulação eficaz e estável em forma de uma emulsão com fase água dispersa, interna, descontínua, que mantém os oligonucleotídeos estáveis, que protege contra a decomposição enzimática por parte de nucleases e que permite uma boa absorção nos tecidos-alvos e células-alvos. 1. Caracterização da formulação
[0012] A formulação de acordo com a invenção em forma de uma emulsão com fase água dispersa, interna, descontínua é preparada usando-se a forma galênica emulsão água-em-óleo-em-água, assim-chamada emulsão W- O-W, ou emulsão água-em-óleo, assim-chamadas emulsões W-O, com adição de íons magnésio ou sódio. Surpreendentemente verificou-se que a adição de íons magnésio ou sódio é muito vantajosa para a formulação visando o efeito dos oligonucleotídeos, que melhora a estabilidade dos oligonucleotídeos por meio da proteção contra a decomposição enzimática e, com isso, permite uma boa absorção nas células-alvos, p. ex. células da pele, células do pulmão e do epitélio intestinal, mucosas, células do epitélio nasal e células da faringe. Substâncias da formulação de acordo com a invenção
[0013] A formulação de acordo com a invenção compreende pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um espessante, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico, água e pelo menos um oligonucleotídeo.
[0014] Alternativamente, a formulação de acordo com a invenção compreende adicionalmente pelo menos um emulsificador hidrofílico e/ou pelo menos um componente anfifílico.
[0015] Alternativamente, a formulação de acordo com a invenção compreende adicionalmente pelo menos um fator de retenção de umidade.
[0016] Alternativamente, a formulação de acordo com a invenção compreende adicionalmente pelo menos um agente conservante.
[0017] Alternativamente, a formulação de acordo com a invenção compreende adicionalmente pelo menos uma cera ou óleo natural ou sintético.
[0018] O pelo menos um emulsificante lipofílico é selecionado do grupo que consiste de ésteres de ácido graxo de sorbitano, derivados de glicerol (p. ex. Spans, também estearatos de glicerol, dioleatos de glicerol, monooleatos de glicerol).
[0019] O pelo menos um espessante é selecionado do grupo que consiste dos ésteres de ácido graxo (p. ex. palmitato de cetila, miristatos de miristila) polietilenoglicóis, cera de abelhas, cera microcristalina, lanolina e seus alcoóis, óleo de mamona hidrogenado, carbômeros (p. ex. polímeros de ácido acrílico reticulados) ou celulose e seus derivados.
[0020] O pelo menos um componente oclusivo é selecionado do grupo que consiste dos hidrocarbonetos saturados, como p. ex., parafina ou polissiloxanos, como óleos de silicone. O pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico é um sal ou um líquido iônico cuja porção catiônica compreende Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag ou uma combinação destes elementos (p. ex., mistura de NaCl, MgSO4) ou uma combinação dos elementos com cátions orgânicos (p. ex. mistura de Mg(N(SO2CF3)2)2, Mg(OSO2CF3)2 em um líquido iônico, como p. ex., cloreto de 1-etil-3- metilimidazólio, tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio, sulfato de 1- etil-3-metilimidazólio, trifluorometanossulfonato de 1-etil-3-metilimidazólio, dicianamida de 1-etil-3-metilimidazólio ou bis(trifluorometilsulfonil)amida) de 1-etil-1-metilpirrolidínio.
[0021] O pelo menos um emulsificante hidrofílico é selecionado do grupo que consiste dos polissorbatos ou polietilenoglicóis etoxilados (como p. ex., Tweens, estearetos, lauretos, cetearetos) ou ésteres ou éteres etoxilados.
[0022] O pelo menos um componente anfifílico é selecionado do grupo que consiste dos fosfolipídeos, de preferência, lecitina ou um de seus derivados.
[0023] O pelo menos um fator de retenção de umidade é selecionado do grupo que consiste deglicerina, polióis, osmólitos.
[0024] O pelo menos um óleo é selecionado do grupo que consiste dos ácidos graxos esterificados (p. ex., oleatos de decila), ceras (p. ex., cerca de jojoba) ou glicerídeos parcialmente esterificados (p. ex. triglicerídeos de cadeia média) ou óleos naturais, como óleos de soja, amendoim, abacate, oliva, óleo de rícino, e também óleos de nozes ou sementes.
[0025] O pelo menos um agente conservante é, p. ex., parabeno.
[0026] O pelo menos um oligonucleotídeo é selecionado do grupo que consiste dos iniciadores, aptâmeros, oligonucleotídeos anti-sentido, como p. ex., DNAzimas, siRNAs, asDNAs ou Ribozimas.
[0027] Por exemplo, porém de maneira não conclusiva indica-se como DNAzimas, as DNAzimas da DE 103 46 487.5, que são dirigidas contra o mRNA das proteínas GATA-3 e T-bet e que são reveladas para a preparação de um agente contra doenças inflamatórias. Por exemplo, usa-se as seguintes DNAzimas (cada uma individualmente ou em combinação com as outras):
[0028] Nome da DNAzima contra sequência de mRNA GATA-3: hgdl 5'-TCGGTCAGAggctagctacaacgaTGCGTTGCT-3' hgd2 51-GGCGTACGAggctagctacaacgaCTGCTCGGT-3' hgd3 5’-GGCGGCGTAggctagctacaacgaGACCTGCTC-3' hgd4 5'-CTCGGGTCAggctagctacaacgaCTGGGTAGC-3 hgd5 5'-TCCTCTGCAggctagctacaacgaCGGGGTCCT-3 hgdô 51-ACTCTGCAAggctagctacaacgaTCTGCGAGC-3 hgd7 51-GGGCGACGAggctagctacaacgaTCTGCAATT-3 hgd8 51-AAGGGGCGAggctagctacaacgaGACTCTGCA-3 hgd9 5'-AAAACGGGAggctagctacaacgaCAGGTTGTA-3 hgdlO 5 1 -AGAATAAAAggctagctacaacgaGGGACCAGG-3 hgdll 5 ' -ATGGCAGAAggctagctacaacgaAAAACGGGA-3 hgdl2 5'-AACTGGGTAggctagctacaacgaGGCAGAATA-3 hgdl3 5'-ATCCAAAAAggctagctacaacgaTGGGTATGG-3 hgdl4 5 ' -AGGGGAAGAggctagctacaacgaAAAAATCCA-3 hgdl5 51-iTTTAAAAAggctagctacaacgaTATCTTGGA-3 hgdlδ 5'-GTGGGGGGAggctagctacaacgaGGGAAGGCT-3 hgdl7 5'-GTTGAATGAggctagctacaacgaTTGCTTTCG-3 hgdl8 5'-GTCGTTGAAggctagctacaacgaGATTTGCTT-3 hgdl9 5'-GGCCCGGAAggctagctacaacgaCCGCGCGCG-3 hgd2 0 5'-TCACCTCCAggctagctacaacgaGGCCTCGGC-3 hgd21 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-AAGGGGTTAggctagctacaacgaTATCAATTT-3 ’ td77 5'-CTCCCGGAAggctagctacaacgaCCTTTGGCA-3' td78 5'-GTACATGGAggctagctacaacgaTCAAAGTTC-3' Componentes da emulsão W-O-W [água-em-óleo-em-água]:
[0029] A emulsão W-O-W compreende pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um componente anfifílico, pelo menos um espessante, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um aditivo inorgânico e orgânico, pelo menos um emulsificador hidrofílico.
[0030] Particularmente a emulsão W-O-W compreende pelo menos um emulsificante lipofílico, sendo que o emulsificante lipofílico é selecionado do grupo que consiste de sorbitano, ésteres de ácido graxo, derivados de glicerol (p. ex. Spans).
[0031] Pelo menos um componente anfifílico, sendo que este componente anfifílico é selecionado do grupo que consiste de fosfolipídeos, de preferência, lecitina ou um de seus derivados.
[0032] Pelo menos um espessante, sendo que o espessante é selecionado do grupo que consiste de ésteres de ácido graxo (p. ex., palmitato de cetila, miristatos de miristila) polietilenoglicóis, cera de abelhas, cera microcristalina, lanolina, óleo de mamona hidrogenado, Protegina W, Protegina WX, carbômeros (p. ex., polímeros de ácido acrílico reticulados), ou celulose e seus derivados.
[0033] Pelo menos um componente oclusivo, sendo que o componente oclusivo é um hidrocarboneto saturado selecionado do grupo que consiste deparafina ou polissiloxanos, como óleos de silicone.
[0034] Alternativamente um óleo, selecionado do grupo que consiste dos ácidos graxos esterificados (p. ex., oleatos de decila), ceras (p. ex., cerca de jojoba) ou glicerídeos parcialmente esterificados (p. ex., triglicerídeos de cadeia média) ou óleos naturais, como óleos de soja, amendoim, abacate, oliva, óleo de rícino, e também óleos de nozes ou sementes.
[0035] Pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico, de preferência um sal ou um líquido iônico cuja porção catiônica compreende Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag ou uma combinação dos elementos.
[0036] Pelo menos um emulsificador hidrofílico, sendo que o emulsificante hidrofílico é selecionado do grupo que consiste de polissorbatos, polietilenoglicóis etoxilados (como p. ex., Tweens, estearetos, lauretos, cetearetos), éteres etoxilados, ésteres etoxilados.
[0037] Pelo menos um oligonucleotídeo selecionado do grupo que consiste de oligonucleotídeos anti-sentido, como p. ex., DNAzima, siRNAs, asDNAs ou Ribozimas, ou iniciadores ou aptâmeros.
[0038] Alternativamente a emulsão W-O-W compreende adicionalmente pelo menos um fator de retenção de umidade, sendo que o fator de retenção de umidade é selecionado do grupo que consiste de glicerina, polióis, osmólitos.
[0039] Alternativamente a emulsão W-O-W compreende adicionalmente pelo menos um agente conservante, como p. ex., parabeno.
[0040] Componentes da emulsão W-O [água-em-óleo]:
[0041] A emulsão W-O compreende pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um espessante, pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico, pelo menos um emulsificador hidrofílico.
[0042] Particularmente a emulsão W-O compreende pelo menos um emulsificante lipofílico, sendo que o emulsificante lipofílico é selecionado do grupo que consiste de sorbitano, ésteres de ácido graxo, derivados de glicerol (p. ex., estearatos de glicerol, dioleatos de glicerol, monooleatos de glicerol).
[0043] Pelo menos um componente oclusivo, sendo que o componente oclusivo é um hidrocarboneto saturado selecionado do grupo que consiste deparafina ou polissiloxanos, como óleos de silicone.
[0044] Alternativamente um óleo, selecionado do grupo que consiste dos ácidos graxos esterificados (p. ex., oleatos de decila), ceras (p. ex., cerca de jojoba) ou glicerídeos parcialmente esterificados (p. ex., triglicerídeos de cadeia média) ou óleos naturais, como óleos de soja, amendoim, abacate, oliva, óleo de rícino, e também óleos de nozes ou sementes.
[0045] Pelo menos um espessante, sendo que o Konsistenzgeber/fornecedor de consistência é selecionado do grupo que consiste de ésteres de ácido graxo (p. ex., palmitato de cetila, miristatos de miristila) polietilenoglicóis, cera de abelhas, cera microcristalina, lanolina ou seus alcoóis, óleo de mamona hidrogenado, Protegina W, Protegina WX, carbômeros (p. ex., polímeros de ácido acrílico reticulados), ou celulose e seus derivados.
[0046] Pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico, de preferência um sal ou um líquido iônico cuja porção catiônica compreende Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag ou uma combinação dos elementos.
[0047] Alternativamente a emulsão W-O compreende adicionalmente pelo menos um fator de retenção de umidade, sendo que o fator de retenção de umidade é selecionado do grupo que consiste de glicerina, polióis, osmólitos.
[0048] Pelo menos um oligonucleotídeo selecionado do grupo que consiste de oligonucleotídeos anti-sentido, como p. ex., DNAzimas, siRNAs, asDNAs ou Ribozimas, ou iniciadores ou aptâmeros.
[0049] Alternativamente a emulsão W-O compreende adicionalmente pelo menos um agente conservante, como p. ex., parabeno. Preparação das emulsões
[0050] A composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso tópico compreendendo, pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um espessante, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico e pelo menos um oligonucleotídeo são combinados segundo um processo usual para a pessoa versada na arte.
[0051] A composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso tópico compreendendo, pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um espessante, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico e pelo menos um oligonucleotídeo é mais ou menos fluída, é um xampu, uma solução, uma solvente, uma loção, creme, pomada, leite, uma pasta ou uma espuma. Alternativamente ela é um aerossol e é aplicada via o pulmão.
[0052] A composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso tópico compreendendo, pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um espessante, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico e pelo menos um oligonucleotídeo é usada principalmente em mamíferos, particularmente em humanos.
[0053] A formulação de acordo com a invenção em forma de uma emulsão com fase água dispersa, interna, descontínua é particularmente vantajosa, com a adição de íons magnésio ou sódio, para a proteção dos oligonucleotídeos, porque estes são estabilizados e protegidos da decomposição enzimática, permitindo uma boa absorção nas células-alvos. Portanto, a formulação de acordo com a invenção é apropriada como preparação cosmética e/ou dermatológica e/ou farmacêutica para o uso e aplicação tópicos. Através do uso de oligonucleotídeos, que são conhecidamente eficazes contra doenças inflamatórias, p. ex., as DNAzimas da DE 103 46487.5, a formulação de acordo com a invenção é apropriada para a preparação de um agente para a terapia e profilaxia de doenças inflamatórias, que é útil para o uso tópico.
[0054] A formulação de acordo com a invenção apresenta uma boa absorção dos oligonucleotídeos, p. ex., das DNAzimas, particularmente da DE 103 46 487.5, em células-alvos para uso tópico, p. ex., células da pele, células do pulmão e do epitélio intestinal, mucosas, células epiteliais do nariz e células da faringe.
[0055] As enzimas água-em-óleo-em-água (emulsões W-O-W) contendo DNAzima de acordo com a invenção compreendem, de preferência, os seguintes componentes: W-O-W [%] (faixa) emulsificante lipofílico, de preferência, ésteres de ácido graxo de 0,5-20 sorbitano, derivados de glicerol (p. ex., Spans) componente anfifílico 0,05-5 fosfolipídeos, de preferência, lecitina ou um de seus derivados, espessante, como ésteres de ácido graxo (p. ex., palmitato de cetila, 0,1-5 miristatos de miristila) polietilenoglicóis, cera de abelhas, cera microcristalina, lanolina, óleo de mamona hidrogenado, carbômeros (p. ex., polímeros de ácido acrílico reticulados), Protegina W, Protegina WX ou celulose e seus derivados componente oclusivo, à base de hidrocarbonetos saturados, como 1-25 parafina ou polissiloxanos, como óleos de silicone alternativamente um óleo, selecionado do grupo que é selecionado 1-25 dos ácidos graxos esterificados (p. ex., oleatos de decila), ceras (p. ex., cerca de jojoba) ou glicerídeos parcialmente esterificados (p. ex., triglicerídeos de cadeia média) ou óleos naturais, como óleo de soja, amendoim, abacate, olivas, óleo de rícino, e também óleos de nozes ou sementes. aditivo inorgânico e/ou orgânico, p. ex., um sal ou líquido iônico 0,01-2 cuja porção catiônica compreende Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag ou uma combinação dos elementos oligonucleotídeo, p. ex., um das DNAzimas da DE 103 46 487.5 0,01-5 água q.s emulsificante hidrofílico, como polissorbatos ou polietilenoglicóis 1-8 etoxilados (p. ex., Tweens, estearetos, lauretos, cetearetos) ou ésteres ou éteres etoxilados fatores de retenção de umidade (p. ex., glicerina, polióis, 0,1-10 osmólitos) agentes conservantes, como parabenos q.s. 3.1.1. Exemplo de realização selecionado (W-O-W 167) W-O-W 167 [% peso/peso] monooleatos de sorbitano 4 lecitina 0,2 parafina 15,8 NaCl 0,074 DNAzima hdg. 40 0,4 água ad. 100 Steareth-20 água+parabenos 59 3.1.2. Exemplo de realização selecionado (W-O-W 146) W-O-W 146 [% peso/peso] monooleatos de sorbitano 4 lecitina 0,2 parafina 15,8 MgSO4 x 7 H2O 0,308 DNAzima hdg. 40 0,4 água ad. 100 água+água conservada com parabenos (fase exterior) 59 3.2. Exemplo de realização para emulsão W-O [água-em- óleo]
[0056] As emulsões água-em-óleo (emulsões W-O) contendo DNAzima de acordo com a invenção compreendem, de preferência, os seguintes componentes: W-O [%] faixa Um ou mistura de emulsificadores lipofílicos, como ésteres de 1-15 ácido graxo de sorbitano ou derivados de glicerol (estearatos de glicerol, dioleatos de glicerol, monooleatos de glicerol) componente oclusivo, à base de hidrocarbonetos saturados, como 10-70 parafina ou polissiloxanos, como óleos de silicone alternativamente um óleo, selecionado do grupo dos ácidos graxos 10-70 esterificados (p. ex., oleatos de decila), ceras (p. ex., cerca de jojoba) ou glicerídeos parcialmente esterificados (p. ex., triglicerídeos de cadeia média) ou óleos naturais, como óleo de soja, amendoim, abacate, olivas, rícino, e também óleos de nozes ou sementes. espessante, como ésteres de ácido graxo (p. ex., palmitato de cetila, 0,5-10 miristatos de miristila) polietilenoglicóis, cera de abelhas, cera microcristalina, lanolina, óleo de mamona hidrogenado, Protegina W, Protegina WX, carbômeros (p. ex., polímeros de ácido acrílico reticulados), ou celulose e seus derivados lanolina ou seus alcoóis 1-8 agentes conservantes (p. ex., parabenos) q.s. aditivo inorgânico e/ou orgânico, p. ex., um sal ou líquido iônico 0,01-2 cuja porção catiônica compreende Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag ou uma combinação dos elementos oligonucleotídeo, p. ex., um da DNAzima da DE 103 46 487.5 0,01-5 fatores de retenção de umidade (p. ex., glicerina, polióis, 0,1-10 osmólitos) 3.2.1. Exemplo de realização selecionado (W-O 126) W-O 126 [% peso/peso] estearatos de glicerol 1 monooleatos de glicerol (Imwitor 946) 2 dioleatos de glicerol (Crossential GDO) 2 parafina 38 palmitato de cetila 2 lanolina 3 óleo de mamona hidrogenado 2 água conservada + parabenos ad. 100 NaCl 0,5 DNAzima hdg. 40 0,4 glicerina 3 3.2.2. Exemplo de realização selecionado (W-O 162) W-O 162 [% peso/peso] estearatos de glicerol 1 monooleatos de glicerol (Imwitor 946) 2 dioleatos de glicerol (Crossential GDO) 2 parafina 38 palmitato de cetila 2 lanolina 3 água + água conservada com parabenos ad. 100 MgSO4 x 7 H2O DNAzima hdg. 40 glicerina
[0057] Como oligonucleotídeo usa-se, por exemplo, todas as DNAzimas hgd. 1-70 e td 1-78 reveladas na DE 103 46 487.5, de preferência, usa-se hgd. 40 como DNAzima dirigida contra GATA-3 e td69 ou td70 como DNAzima diridiga contra T-bet.
[0058] As formulações contendo DNAzima de acordo com a invenção WOW 167 e WOW 146 distinguem-se pelos eletrólitos adicionados na fase água interna, como representado graficamente na figura 1. Neste caso usa-se para a preparação de WOW 167 e WOW 146, de preferência, soluções com 0,13 M, formulações com concentrações maiores de eletrólitos reduzem a estabilidade das formulações. A medição da estabilidade é realizada comparativamente e ao longo de um período de 150 dias.
[0059] Diretamente após a formulação a viscosidade da WOW 167 (formulação com NaCl) com 1,4 Pa.s é um tanto mais elevada, do que a viscosidade da WOW 146 (formulação com MgSO4) com 1 Pa.s. A viscosidade da formulação WOW 146 (formulação com MgSO4) diminui um tanto nos primeiros 5 dias até 0,75 Pa.s, permanecendo depois amplamente inalterada em 0,75 Pa.s. A viscosidade da WOW 167 (formulação com NaCl) diminui até o dia 50 a 0,6 Pa.s e, depois, ainda mais até 0,4 Pa.s.
[0060] A WOW 146 (formulação com MgSO4) é, portanto, um tanto mais estável do que a WOW 167 (formulação com NaCl). Deve-se observar que a ligeira queda das viscosidades não influi negativamente sobre a estabilidade ou sobre a proteção, as emulsões não apresentam inversão de fases ou separação e são estáveis.
[0061] Os tamanhos medidos das gotas situam-se na faixa de 10-20 pm.
[0062] As formulações WO 162 e WO 126 contendo DNAzima de acordo com a invenção distinguem-se também pelos eletrólitos adicionados na fase água interna. A medição da estabilidade ocorre comparativamente e ao longo de um período de 150 dias, sendo que a viscosidade permanece inalterada após 150 dias, situando-se em cerca de 4 Pa.s para WO 126 e 4,2 para WO 162.
[0063] Aqui o tamanho das gotas situa-se na faixa de 0,5-2,5 pm.
[0064] As formulações WOW 167 e WOW 146 contendo DNAzima de acordo com a invenção contém a DNAzima da DE 103 46 487.5, cada vez DNAzimas hgd. 1 até hgd. 70 contra GATA-3 e as DNAzimas td 1 até td 78 contra T-bet e protegem estas contra a decomposição ou a degradação por nucleases, particularmente DNAses. É importante proteger as DNAzimas contra a decomposição por DNAse, para que elas possam desdobrar sua eficácia terapêutica.
[0065] Experimentalmente usa-se, para a medição da estabilidade das formulações contendo DNAzimas de acordo com a invenção relativaente à DNAse, uma DNAse I comercialmente obtenível com uma atividade de 105 U e adiciona-se às formulações WOW 167 e WOW 146. Além disso, a decomposição é demonstrada por um lisado de pele como controle positivo. A decomposição das DNAzyme é observada por meio de HPLC.
[0066] Esta medição ocorre com o seguinte método: Decomposição de DNAzimas por DNAse da pele 1) Processo Pele: cerca de 50 mg Solução: 1 ml de padrão de DNAzima (0,1625 mg/ml) + 3 ml de água RO (água de osmose reversa [reverse osmosis])
[0067] Processo: Pele foi cominuída com um bisturi e misturada com solução e isto foi ligeiramente agitado. Em seguida, isto foi filtrado e analisou-se a decomposição por meio de HPLC após 2 min, 52 min, 102 min e 152 min.
[0068] As figuras 2a e 2b mostram que as DNAses naturalmente ocorrentes na pele já começam a decompor a DNAzima após 2 minutos, sendo que após 152 minutos praticamente toda a quantidade de DNAzima é decomposta.
[0069] Solução: DNAse I com atividade 105 U em tamponador Tris + 10 mM de MgSO4
[0070] Processo: 20 mg das respectivas formulações são misturadas com 1 ml de uma solução de DNAse I. Após o tempo de incubação de 1 min a mistura é agitada ligeiramente durante 10 min em um Thermomixer a uma temperatura de 99°C, para interromper a atividade da DNAse. Para a dissolução da emulsão incuba-se a preparação em um banho de ultrassom a 50°C durante 10 min. A preparação é filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 pm e realiza-se análise de HPLC.
[0071] A ilustração 3 mostra que a formulação WOW 146 apresenta uma proteção da DNAzima contra decomposição por DNAse da ordem de cerca de 61 %, a formulação WOW 167 situa-se numa proteção de 51 %. Como controle usou-se uma solução padrão contendo DNAzima (0,4 % de DNAzima hgd. 40 em tamponador de PBS (PBS = solução salina tamponada com fosfato -137mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 12 mM de Na2HPO4 e KH2PO4 pH=7,4) ), sendo que aqui não foi possível encontrar substância ativa. Com isto, de uma maneira geral, a formulação WOW167 protege melhor. Uma galênica comparativa O/W (Microemulsão: água conservada, componente óleo, glicerina, emulsificante hidrofílico, sulfato de magnésio) com quantidade igual de DNAzima também não apresentou proteção, sendo que 100 % da DNAzima foram decompostos.
[0072] Para a comprovação da estabilidade da substância ativa nas galênicas analisou-se por HPLC a recuperação de 0,4 % da substância ativa DNAzima hgd. 40 na WO 162, da W/OW 146 e como referência em uma galênica comparativa O/W (Microemulsão: água conservada, componente óleo, glicerina, emulsificante hidrofílico, sulfato de magnésio) após um mês.
[0073] A recuperação de DNAzima hgd. 40 relativamente ao valor de partida de 100 % após um mês é de 35,98 +/- 0,16% na galênica comparativa O/W. Na W/O 162 a recuperação após um mês situa-se em 95,66 +/- 2,77 %. No caso da W/O/W a recuperação após um mês situa-se em 103,15 +/- 2,29 %.
[0074] A eficácia da composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso tópico compreendendo, pelo menos um emulsificante lipofílico, pelo menos um espessante, pelo menos um componente oclusivo, pelo menos um aditivo inorgânico e/ou orgânico e pelo menos um oligonucleotídeo como agente para o tratamento de doenças dermatológicas inflamatórias no Exemplo de formulações contendo GATA-3 DNAzima é ilustrada no modelo animal.
[0075] Para isto usou-se um modelo de camundongo (ver Ilustração 4), em que se induz, através de sensibilização alérgica com um alérgeno modelo, p. ex., Ovalbumina (OVA) e subsequente aplicação epicutânea repetida por meio de adesivos dérmicos, uma reação inflamatória específica na pele dos camundongos. Além das alterações histológicas típicas na pele dispara-se e comprova-se, neste caso também, a esperada expressão elevada do gene-alvo, p. ex., GATA-3 e também das citocinas para Th2 IL-4, IL-5 e IL-13 nas áreas de pele inflamadas.
[0076] Através do emprego das formulações contendo DNAzima de acordo com a invenção como agente para o tratamento de doenças epidérmicas inflamatórias torna-se visível uma eficácia terapêutica. Assim foi possível comprovar um escore inflamatório diminuído significativo em camundongos após tratamento com formulações de DNAzima. Adicionalmente demostrou-se histologicamente que após este tratamento verifica-se menos células inflamatórias, particularmente linfócitos T CD4+, nas áreas de pele inflamadas.
[0077] A título de exemplo utilizou-se Sensibilização: 10 pg de OVA + 10 pg de Al(OH)3 em 100 μl de PBS, adesivos aplicados intraperitonealmente: 100 pg de OVA + 10 pg de Al(OH)3 aplicados epicutaneamente por meio de tratamento com o método de teste de adesivo [Patch-test Method]: 200 pg de DNAzima em 50 pl de PBS [por aplicação] intradérmica ou epicutânea local nas formulações WOW146, WO162 e WOW167.
[0078] As avaliações mostraram que as formulações contendo DNAzima são eficazes contra doenças dermatológicas inflamatórias provocadas experimentalmente. Legendas das figuras e lista de referências
[0079] A figura 1 mostra a viscosidade [Pa.s] das formulações contendo DNAzima figura 1a) WOW 146 (formulação com MgSO4) e figura 1 b) 167 (formulação com NaCl) comparativamente ao longo de um período de 150 dias. A estabilidade da WOW 146 (formulação com MgSO4) é maior do que a estabilidade da WOW 167 (formulação com NaCl).
[0080] A figura 2 mostra a decomposição de DNAzima por DNAse da pele medida com HPLC
[0081] A figura 2 a mostra a medição com HPLC de DNAzima sobre pele após 2 min.
[0082] A figura 2 b mostra a medição com HPLC de sobre pele após 152 min.
[0083] As figuras 2a e 2b mostram que a decomposição não-protegida de DNAzimas sobre pele já começa por meio de DNAses ali presentes após 2 minutos, e após 152 minutos a DNAzima já está quase totalmente decomposta. Esta reação ocorre com igualmente com todos os oligonucleotídeos e não se limita a DNAzimas.
[0084] A figura 3 mostra a proteção das formulações contendo DNAzima relativamente à decomposição por DNAse. Representa-se as formulações contendo DNAzima WOW 146, que apresenta uma proteção das DNAzimas acima de 90 %, enquanto que a formulação contendo DNAzima WOW 167 só apresenta uma proteção de 60 %. Como controle usa-se uma solução padrão contendo DNAzima (0,4 % de DNAzima em tamponador de PBS).
[0085] A figura 4 mostra a montagem experimental de um modelo animal, em que se induz experimentalmente uma doença epidérmica inflamatória, e se testa a eficácia de agentes para o tratamento da mesma.
[0086] Neste modelo induz-se na pele de camundongos (variedade: Balb), por meio de sensibilização alérgica com um alérgeno modelo, p. ex., Ovalbumina (OVA) e subsequente aplicação epicutânea repetida por meio de adesivos dérmicos, a reação inflamatória típica de doenças dérmicas inflamatórias.
[0087] A sensibilização ocorre por meio de aplicação intraperitoneal (i.p.), o tratamento com DNAzima por meio de aplicação intradérmica (i.d.) ou aplicação epicutânea (e.c.) de diferentes formulações.
Claims (18)
1. Composição farmacêutica para aplicação tópica na forma de (i) uma emulsão água-em-óleo-em-água ou (ii) uma emulsão água-em-óleo, cada uma das referidas emulsões compreendendo uma fase aquosa interna, dispersa, descontínua, a composição caracterizada pelo fato de que compreende: (a) pelo menos um emulsificante lipofílico selecionado do grupo que consiste em um éster de ácido graxo de sorbitano e um derivado de glicerol; (b) pelo menos um agente de consistência; (c) pelo menos um óleo sintético, óleo natural, cera ou hidrocarboneto saturado selecionado do grupo que consiste em uma parafina e um polissiloxano; (d) pelo menos um aditivo compreendendo um sal ou um líquido iônico, em que o componente catiônico do sal ou do líquido iônico compreende um elemento selecionado do grupo que consiste em Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag e uma combinação desses elementos; e, (e) pelo menos um oligonucleotídeo antisenso mantido pela fase aquosa interna, em que o pelo menos um oligonucleotídeo antisenso é uma DNAzima dirigida contra o mRNA que codifica para a proteína GATA- 3, a DNAzima selecionada a partir de um grupo que consiste em DNAzimas de SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 70.
2. Composição farmacêutica para aplicação tópica na forma de (i) uma emulsão água-em-óleo-em-água ou (ii) uma emulsão água-em-óleo, cada uma das referidas emulsões compreendendo uma fase aquosa interna, dispersa, descontínua, a composição caracterizada pelo fato de que compreende: (a) pelo menos um emulsificante lipofílico selecionado do grupo que consiste em um éster de ácido graxo de sorbitano ou um derivado de glicerol; (b) pelo menos um agente de consistência; (c) pelo menos um óleo sintético, óleo natural, cera ou hidrocarboneto saturado selecionado do grupo que consiste em parafina ou um polissiloxano; (d) pelo menos um aditivo compreendendo um sal ou um líquido iônico, em que o componente catiônico do sal ou do líquido iônico compreende um elemento selecionado do grupo que consiste em Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag e uma combinação desses elementos; e, (e) pelo menos um oligonucleotídeo antisenso mantido pela fase aquosa interna, em que o pelo menos um oligonucleotídeo antisenso é uma DNAzima dirigida contra o mRNA que codifica para a proteína T-bet, a DNAzima selecionada a partir de um grupo que consiste em DNAzimas de SEQ ID NO 71 a SEQ ID NO 148.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um emulsificante hidrofílico selecionado do grupo que consiste em polissorbatos, polietilenoglicóis etoxilados, éteres etoxilados e ésteres etoxilados.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um componente anfifílico.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o componente anfifílico é um fosfolipídeo.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um fator umectante.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o fator umectante é selecionado do grupo que consiste em glicerol, polióis e osmólitos.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um conservante.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o emulsificante lipofílico é um monooleato de sorbitano.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o emulsificante lipofílico é um derivado de glicerol selecionado a partir do grupo que consiste em Spans, estearato de glicerol, dioleato de glicerol e monooleato de glicerol.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o agente de consistência é selecionado a partir do grupo que consiste em um éster de ácido graxo, um polietilenoglicol, cera alba, uma cera microcristalina, lanolina, óleo de rícino hidrogenado, protegina W, protegina WX, carbômeros e celulose.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o óleo sintético é um ácido graxo esterificado ou um glicerídeo parcialmente esterificado.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o óleo natural é selecionado do grupo que consiste em óleo de soja, óleo de amendoim, óleo de abacate, óleo de oliva, óleo de rícino, um óleo de semente e um óleo de noz.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a cera é cera de jojoba.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o conservante é parabeno.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o cátion é selecionado a partir do grupo que consiste em Na, Mg e uma combinação dos mesmos.
17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o sal é selecionado a partir do grupo que consiste em NaCl, MgSO4, Mg(N(SO2CF3)2)2 e Mg(OSO2CF3)2.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o líquido iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em cloreto de 1-etil-3-metilimidazólio, tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio, sulfato de 1-etil-3- metilimidazólio, trifluorometanossulfonato de 1-etil-3-metilimdazólio, dicianamida de 1-etil-3-metilimidazólio e bis(trifluorometilsulfonil)amida) de 1-etil-1-metilpirrolidínio.
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