JP6599874B2 - Mmp−9タンパク質の酵素活性を阻害するアプタマー - Google Patents
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Description
・オリゴヌクレオチドライブラリー中で、SELEX法を用いて、MMP-9タンパク質の触媒部位に対するアプタマーを選抜する工程、
・前工程において選抜したアプタマーについてMMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するポテンシャルを評価する工程、
・そうして選抜したアプタマーをクローニング及びシーケンシングする工程
を含む、本発明のアプタマーの選抜方法に関する。
・5′X1X2X3X4TTTGGTGGGTYTGGGGTWGYKX5X63′、式中Xは0個又は1個のGヌクレオチドを表す(配列番号1);
・5′TGGCRCGGGGTTGGTGTYGGGTT3′ (配列番号2);
・5′GGGWTTGGCTTX7CGGYGCCTGGCG3′、式中Xは0個又は1個のAヌクレオチドを表す(配列番号3);
・5′GTGGTTGGX8GSKRTRGWKGKT3′、式中Xは0個又は1個のTヌクレオチドを表す(配列番号4);
・5′GGGTGGGGGGGTGG3′ (配列番号5);
・5′TTGGTGGGATGGGGGGGGGGTTGTTCGGCT3′ (配列番号6);
・5′CTGGGGGTGTGTYGCGATTGTGTGGGTGGG3′ (配列番号7);
・5′SCSCGGTGGAYTGGTTGGGTTTGGATCCCC3′ (配列番号8);
・5′TGAGGGGGGTGGATGGGAGGGTTCCGCACG3′ (配列番号9);及び
・5′TGGACGGTGGGTTGGGGCGGGGGGTGTCCA3′ (配列番号10)。
配列番号6〜配列番号10、配列番号12〜配列番号17、配列番号19〜配列番号20、配列番号22〜配列番号25、及び配列番号27〜配列番号29
の配列から成る群から選択され、
5′末端に隣接した配列番号30の配列の少なくとも1〜24個の連続したヌクレオチド、及び/又は3′末端に隣接した配列番号31の配列の少なくとも1〜23個の連続したヌクレオチドを含む。
・配列番号11〜17、32〜34、及び40〜45の配列は、配列番号1のコンセンサス配列に含まれる(グループI);
・配列番号18〜20、35〜37、並びに46及び47の配列は、配列番号2のコンセンサス配列に含まれる(グループII);
・配列番号21〜23、38、39、48、及び49の配列は、配列番号3のコンセンサス配列に含まれる(グループIII);
・配列番号24〜27及び50〜52の配列は、配列番号4のコンセンサス配列に含まれる(グループIV);
・配列番号28、29、53、及び54の配列は、配列番号5のコンセンサス配列に含まれる(グループV);
・配列番号55の配列は、配列番号6のコンセンサス配列に含まれる(グループVI);
・配列番号56の配列は、配列番号7のコンセンサス配列に含まれる(グループVII);
・配列番号57の配列は、配列番号8のコンセンサス配列に含まれる(グループVIII);
・配列番号58の配列は、配列番号9のコンセンサス配列に含まれる(グループIX);及び
・配列番号59の配列は、配列番号10のコンセンサス配列に含まれる(グループX)。
・オリゴヌクレオチドライブラリー中でSELEX法を用いてMMP-9タンパク質の触媒部位に対するアプタマーを選抜する工程、
・前工程において同定したアプタマーについてMMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するポテンシャルを評価する工程、
・そうして選抜したアプタマーをクローニング及びシーケンシングする工程
を含む、本発明のアプタマーを選抜するための方法に関する。
[1.1. タンパク質]
C末端の6-Hisタグを含む組換えヒトMMP-9の触媒ドメインは、Biomol(登録商標) Internationalより入手した;MMP-9タンパク質及びMMP-2タンパク質は、Calbiochemより入手した。
Sigmaより供給されたDNAライブラリー及びプライマーをHPLCにより精製した。プライマー配列(P3) 5′ GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA 3′ (配列番号60)及び(P5) 5′ GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA 3′ (配列番号30)を、無作為に選択した30ヌクレオチドウインドウを含むライブラリーの増幅に用いた。5′ ACTGACTGACTGACTGACTA-6C3-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA 3′ (配列番号61)の配列を用いて、文献(Williams及びBartel、1995)に記述されるとおりに一本鎖を作製した。5′ビオチン化プライマー(P3)を用いて、一本鎖の候補DNAを作製した。候補DNAを合成し、EurogentecのHPLCにより精製した(図1及び図2)。各実験の前に、DNAの集団及び候補を75℃で5分間加熱し、氷上に5分間静置し、その後室温に少なくとも5分間静置した。
選抜の前に、第一のラウンド及び第二のラウンドについては2回、他の全てのラウンドについては1回、DNAライブラリー(1ナノモル)を、PBS (50 mM Tris-HCl、pH 7.4、50 mM NaCl、100 mM KCl、5 mM CaCl2、1 mM (CH3COO)2Mg)中、20分間、室温で、フィルター(0.45 μM HAWP、Millipore)で処理しインキュベートした。各ラウンドにおいて、追加のカウンターセレクションを6-His-GSTタグに対して行った。次に、カウンターセレクションされたライブラリーをMMP-9の触媒ドメイン(20ピコモル)と20分間混合し、フィルターリテンション法を用いて、未結合の候補を分離した。濾過後、MMP-9の触媒ドメインに結合している候補を、500 μlの7 Mフェノール/尿素中、20分間、65℃でのインキュベーションにより溶出し、沈殿させてPCRにより増幅し、選抜のその後のラウンドに用いるための一本鎖を作製した。選抜中、候補及び標的の量を減少させて、それぞれ25ピコモル及び1ピコモルに達し、11回目のラウンドでは選抜のストリンジェンシーが増加した。クローニングの前に、MMP-9活性を阻害する能力について、選抜の各ラウンドの集団を評価した。
11ラウンドの選抜後、ラウンド8及びラウンド11から選抜された配列を、メーカーの取り扱い説明書に従い、TOPO MT Cloning Kit (Invitrogen)を用いてクローニングし、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いてシーケンシングした。
DNAアプタマーを、20 mMカコジル酸ナトリウム緩衝液(140 mM塩化カリウム、20 mM塩化ナトリウム、及び3 mM塩化マグネシウム含有)、pH 7.3、20℃中に調製した。DNAのサンプルを、全長の候補及び短縮された候補についてそれぞれ終濃度3 μM又は10 μMに調製した。サンプルを75℃で5分間変性させ、氷上に5分間静置し、室温で20分間インキュベートした。サンプルの変性は、0.4℃/分、4℃〜90℃の加熱により行い、260 nm及び295 nmでモニタリングした。熱変性は、温度を±0.1℃で制御するペルチェ効果装置をインターフェース接続したUvikon分光光度計を用いてモニタリングした。
光学ピッチ10 mmの石英セルを用いて、JASCO J-815円偏光二色性分光計でCDスペクトルを得た。スキャンを23℃、レスポンスタイム0.5秒、スキャンスピード500 nm/分、及び波長範囲230 nm〜320 nmで実行した。緩衝液のシグナルへの寄与分のベースラインを各スペクトルから差し引いた。
酵素活性を特異的に阻害するDNA アプタマーを同定するために、MMP-9の触媒ドメインに対してSELEX法を用いた。11ラウンドのインビトロ選抜を実行した。クローニング及びシーケンシングの前に、MMP-9活性を阻害する能力について、(ラウンド11のライブラリーから始まる)集団を評価した。
[2.1. 原理]
酵素は、1つ又は2つの基質の転換を特異的に触媒することができるタンパク質である。単純化された酵素反応モデル:
MMPの酵素活性の測定は、共鳴エネルギー移動すなわちRET、又は蛍光共鳴エネルギー移動すなわちFRETの原理に基づく。基質は、蛍光基(F)すなわちエネルギードナー、及び消光基(Q)すなわちエネルギーアクセプターを含むオリゴペプチドから成る。加水分解後、消光基が放出され、それにより蛍光の増加を測定することが可能になる。
様々な候補又は対照の存在下での細胞又は3次元モデルのインキュベーション後、条件培地を取り出し、細胞の破片を除去するために10,000 gで10分間、+4℃で遠心分離し、同じタンパク質濃度に調整する。10 kDaカットオフの膜を備えたNanosep(登録商標)微量濃縮器(microconcentrator)を用いて、培養培地に含まれるフェノールレッドを透析濾過により除去する。50 μlの条件培地を14,000 gで6分間、+4℃で遠心分離する。リテンテートを 50 μlの50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2緩衝液(pH 7.5)に懸濁し、同条件下で再度遠心分離する。この工程を3回繰り返し、それにより完全にフェノールレッドを除去する。
(プロMMP-9の活性化)
プロMMP-9は、18時間、+4℃で、0.1 Mソーダ中10 mMの濃度に調製した1 mM 酢酸フェニル水銀(PMAA)の存在下でのインキュベーションにより活性化される。
50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2緩衝液(pH 7.5)中の様々な候補の非存在下又は存在下で、同じ緩衝液中の0.1% (w/v)BSA溶液を用いて非特異的結合部位をブロックしてある黒色96ウェルプレートにおいて、200 pM MMP-9を+20℃で5分間予備インキュベートする。10 μlの特異的基質を加えて、終濃度2 μM、最終反応液量200 μlにすることにより、反応を開始させる。経時的な蛍光(励起波長:326 nm、放射波長:465 nm)の変動を、+20℃でBMG Polarstarリーダー蛍光光度計を用いてモニタリングする。蛍光(RFU)を時間(分)の関数として表す曲線をプロットする。蛍光(RFU)を時間(分)の関数として表す曲線をプロットする。
結果を図4〜図6に表す。図5及び図6において、用量依存的効果を観察することができ、用量はナノモル濃度で、横軸上に、アプタマーの名称の後に表示する。
Claims (9)
- MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害することができるG四重鎖構造化アプタマーであって、配列番号12、32、33、35〜38、40、46、及び48の配列から成る群から選択される少なくとも1個のヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
- MMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するために十分な量で請求項1に記載のアプタマーを活性剤として含み、1種以上の化粧料的又は医薬的に許容される賦形剤を含む、化粧料組成物又は医薬組成物。
- 組成物の0.000001質量%〜10質量%、好ましくは0.000002質量%〜5質量%、より好ましくは0.000005質量%〜1質量%の1つ以上の請求項1に記載のアプタマーを含むことを特徴とする、請求項2に記載の化粧料組成物又は医薬組成物。
- 顕在性であるか否かに関わらず、内因性の及び/若しくは外因性の肌の老化の兆候の出現を処置する若しくは防止するための、又はその影響を遅延させる若しくは軽減させるための、好ましくは肌のリモデリングを制御するための、肌を再構築させるための、肌の調子を高めるための、並びに/又はしわを予防する若しくはしわを滑らかにすること若しくは吸収させることを促進するための、請求項1に記載のアプタマーの美容的使用。
- 医薬品としての、請求項1に記載のアプタマー。
- MMP-9の過剰発現及び/又は機能亢進に関連する病態の治療及び/又は予防に用いるための、請求項1又は5に記載のアプタマー。
- 前記病態が、乾癬等の皮膚の炎症疾患、基底細胞癌等の皮膚腫瘍、慢性的な傷などの皮膚病変、瘢痕性病態、水疱性類天疱瘡等の水疱性皮膚疾患、皮膚のサルコイドーシス等の非感染性肉芽腫疾患、環状肉芽腫及び類壊死脂肪性浮腫、並びに紫外線に関する皮膚損傷から好ましくは選択される皮膚疾患であることを特徴とする、請求項6に記載のアプタマー。
- 前記病態が、腫瘍病態、喘息、肺気腫、珪肺、気管支拡張症、アナフィラキシー様紫斑病、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、慢性関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、ループス腎炎、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、動脈瘤、末梢神経損傷、アルツハイマー病、ギラン・バレー症候群、嚢胞性線維症、及び髄膜炎から成る群から選択されることを特徴とする、請求項6に記載のアプタマー。
- ・オリゴヌクレオチドライブラリー中でSELEX法を用いてMMP-9タンパク質の触媒部位に対するアプタマーを選抜する工程、
・前工程において同定したアプタマーについてMMP-9タンパク質の酵素活性を阻害するポテンシャルを評価する工程、
・そうして選抜したアプタマーをクローニング及びシーケンシングする工程
を含む、請求項1に記載のアプタマーを選抜する方法。
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