KR20170029449A - Tslp 발현을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 미용 또는 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 TSLP의 발현을 억제하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드, dsRNA 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드의 미용 및/또는 약학제적 목적을 위한 이의 용도 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 아토피 개선제/치료제는 아토피 증상 개선효과 및 치료 효과가 우수할 뿐만 아니라, 이를 피부에 적용할 때 다공성 입자 및/또는 양이온성 입자를 사용할 경우 자극 없이, 효과 높은 농도로 안정하고 침투시키는 효능이 있다.

Description

TSLP 발현을 억제하는 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 미용 또는 약제학적 조성물{Oligonucleotides down-regulating the expression of TSLP and the composites for cosmetic or pharmaceutical}
본원은 인간 TSLP의 발현을 억제하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드, dsRNA 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드의 미용 및/또는 약학제적 목적을 위한 이의 용도 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염은 만성적 가려움증과 피부 염증성 증상을 수반하는 난치성 질환이다. 아토피 피부염과 두드러기의 임상적 증상에 있어 가장 큰 차이점은 각각의 가려움증을 우발하는 메커니즘의 차이에 기인한다. 일반적으로 두드러기에서의 가려움증은 비만세포에서 분비되는 히스타민에 의해 매개되므로 항히스타민제로서 치료가 가능하지만, 아토피 피부염에서의 가려움증은 히스타민 이외에도 다양한 면역 염증반응에 의해 매개되므로 항히스타민제 만으로는 가려운 증세 조차도 효과적으로 조절할 수 없다. 그러나 난치성 질환으로서 아토피 피부염의 만성적 염증반응은 '염증반응 매개체 -> 가려움증 -> 긁는 행동 -> 피부조직 손상 -> 피부염증 -> 염증반응 매개체 -> 가려움증 -> 긁는 행동 -> 피부조직 손상 -> 피부염증'의 순환적 악순환이 반복적으로 일어나게 된다 (Lee 등, Allergy Asthma Respir Dis. 2014, 2, 1-8). 따라서, 아토피 피부염의 효과적 치료를 위해서는 면역반응에 의해 매개되는 가려움증을 치유하는 것이 매우 중요하다 (Holgate 등, Trends Immunol. 2007, 28, 248-251).
TSLP (thymic stromal lymphopoietin)는 아토피 피부염의 만성적 염증 반응에 의해 피부상피세포인 케라틴세포 (keratinocytes)에서 다량 분비되며, 만성 아토피 피부염 질환자가 복합 천식 질환자로의 진행을 매개하는 중요한 인자이다. 또한 피부상피세포에서 분비된 TSLP는 TRPA-1 양성-체지각 뉴런을 활성화 시켜 가려움증을 유발한다 (Wilson 등, Cell. 2013, 155, 285-295). 상기 TSLP의 상세한 모든 기능은 알려져 있지 않지만, 최근 연구결과들에 따르면 TSLP의 발현은 병리학적, 면역학적, 그리고 분자생물학적으로 아토피 피부염 및/또는 천식 질환의 유병과 관련되어 있으며, 이의 활성 및 발현의 억제는 미용, 치료, 약제학적으로 중요한 인자라 여겨진다.
따라서, 인간에 적용함에 있어서, 매우 효과적이면서도 양호한 용인선을 나타내는 신규한 TSLP-발현억제 화합물을 수득하는 것이 유리할 것으로 여겨진다.
이러한 방법으로서, 화학적 치료방법과 같이 안티센스 핵산을 이용하거나, 간섭 RNA로 알려져 있는 방법을 사용하는 것으로 유전자 발현 억제를 가능하게 한다. (Dykxhoorn 등, Nat Rev Mol Cell Biol. 2003, 4, 457-467; Soutcheck 등, Nature. 2004, 432, 174-178). 또한, 최근 이중 가닥 RNA (dsRNA) 올리고뉴클레오티드와 siRNA 올리고뉴클레오티드 (12 내지 40개 올리고뉴클레오티드)를 사용함으로써, 피부관리 또는 모발관리 등의 미용분야뿐만 아니라 피부학, 면역학 및 약학 분야에서도 특정한 활성을 얻을 수 있다.
본 출원인은 상술한 종래의 TSLP의 발현이 갖는 병리학적, 면역학적, 그리고 분자생물학적 문제점을 해결하기 위하여 노력하던 중, 인간 TSLP의 발현을 특이적으로 억제하는 신규한 siRNA, dsRNA, 그리고 안티센스 RNA를 개발하였는 바, 탁월한 아토피 피부염 개선 및/또는 치료 효과 및 질환 억제 효과를 얻을 수 있다는 것을 발명함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 신규한 siRNA, dsRNA, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 피부에 침투시키기 위하여 다공성 나노 입자에 담아 피부에 적용하였으며, 이러한 신규한 siRNA, dsRNA, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물을 다공성 나노 입자에 담아 적용할 경우, TSLP의 발현 억제효과 및 아토피 피부염 개선 및/또는 치료 효과가 탁월하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 TSLP의 발현을 억제하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시 예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 TSLP의 발현을 저해하는 신규한 siRNA, dsRNA, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 및 이를 함유하는 미용 그리고/또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 siRNA, dsRNA, 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 항염증 효과 및 아토피 피부염의 증상 개선효과가 우수할 뿐만 아니라, 이를 피부에 적용할 때 다공성 나노 입자를 사용할 경우 자극 없이, 효과 높은 농도로 안정하게 침투시키는 효능이 있다.
도 1은 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스RNA 올리고뉴크르레오티드를 인간피부 각질형성피부세포주인 HaCaT 세포에 트랜스팩션 수행하여 인간 TSLP에 대한 특이적 발현 억제율을 나타낸 것이다.
본 발명은 TSLP의 발현 및 활성을 억제하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 더 상세하게는 TSLP 발현 및 활성을 억제하기 위한 국소 적용 센스 RNA 가닥 및 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하는 짧은 이중나선 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 12 내지 40개의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단일 나선의 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 서로 염기쌍 결합에 의해 이중 나선을 형성한 것에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "짧은 이중나선 RNA 올리고뉴클레오티드', '짧은 이중나선 RNA', 'siRNA 올리고뉴클레오티드', siRNA(short interfering RNA 또는 small interfering RNA)', '짧은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 작은 간섭 RNA (small interfering RNA)'는, 서로 교체하여 사용가능하며, 12내지 40개의 뉴클레오티드로 구성된 두 개의 짧은 단일 나선의 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 서로 염기쌍 결합에 의해 이중 나선(dsRNA)를 형성한 것을 의미한다.
또한, 용어 '간섭(RNA interference, 이하 RNAi)', 센스 핵산 서열을 가진 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 서열 특이성이 높은 표적 핵산의 메신져 RNA(mRNA)와 결합하여 표적 단백질 발현을 억제하는 것으로, RNAi 과정은 작은 간섭 RNA(small interfering RNA 혹은 siRNA)를 이용함으로써 실현될 수 있다.
상기 siRNA는 이의 센스 서열 내에 상동성이 높고, 특히 표적 mRNA 단편에 대해 동일한 서열을 포함하는 12내지 40개의 뉴클레오티드로 구성된 dsRNA이다. siRNA가 혈장막을 지나갈 때 세포의 반응이 이 siRNA 및 동일 또는 상동성이 높은 서열을 포함하는 모든 서열의 메신져 RNA를 파괴한다. 따라서 siRNA 서열에 대해 동일한 mRNA는 파괴될 것이며, 이 유전자의 발현표적은 억제될 것이다. 또한 siRNA는 표적 단백질을 인코딩하는 mRNA의 절단을 수행하게 되고 이는 표적 단백질의 합성을 특이적으로 제한하는 활성을 수행한다. 표적 mRNA의 분해는 dsRNA의 안티센스 가닥이 mRNA에 결합하여 mRNA의 절단을 유도하는 RISC 복합체(RNA Induced Silencing Complex)의 활성에 의해 진행된다 (Tuschl 등, Chem Biochem. 2001, 2, 239-245; Nykanen 등, Cell. 2001, 107, 309-321; Dorsett 등, Nat Rev Drug Discov. 2004, 3, 318-329).
따라서, 본 발명의 siRNA올리고뉴클레오티드, dsRNA뉴클레오티드, 그리고 안티센스RNA 올리고뉴클레오티드를 인코딩하는 mRNA와 특이적으로 결합하여 mRNA의 절단을 유도하고, 결과적으로 TSLP 의 발현 억제 효과를 수행하도록 설계할 수 있다.
또한, 본 발명의 siRNA는 인간의 TSLP의 mRNA 서열에 대하여 상동서열인 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 인간 TSLP의 mRNA 염기서열 (Gene bank 등록번호 NM_033035)의 상동 서열인 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 본발명의 siRNA, dsRNA, 그리고 안티센스 RNA는 각각의 단일가닥이 12내지 40개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 19내지 25개 뉴클레오티드로 이루어진 이중나선의 RNA 올리고뉴클레오티드 절편이다.
본 발명의 siRNA, dsRNA, 그리고 안티센스RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 70으로 구성된 군으로부터 선택된 두 가닥의 서열이 서로 상보적인 결합을 통해 이중 가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 상기 서로 상보적인 결합을 통해 이중가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 본 발명의 제 1 주제는, 임의로 변형된 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70.
이중 가닥인 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 여러 수동 또는 자동으로 생체 내에서 혹은 실험관내 합성 방법에 따라 합성이 가능하다.
실험관내 합성은 화학적 방법과 효소적 방법을 둘다 사용 가능하며, 선택한 DNA 또는 cDNA 서열모델을 전사하는 RNA중합효소 (예를 들면 T3, T5 혹은 SP6)를 사용할 수 있다.
이중 가닥 RNA의 생체내 합성의 방법은 하기의 방법을 참조 할 수 있다(Sambrook 등 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제2판 (1989), DNA cloning, volume I and II, D.N.　Glover (ed. 1985), oligonucleotide Synthesis, M.J. Gaits (ed. 1984), Nucleic Acid Hybridation, B.D. Hames and S.J.　Higgins (ed. 1984), Transcription and Translation B.D. Hames and S.J. Higgins (ed. 1984), Animal Cell Culture, R.I.　Freshney (ed. 1986), Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986), B. Pertal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.H.　Miller및 M.P.　Calos, Cold Spring Harbor Laboratory (ed. 1987), Methods in Enzymology, vol.　154, Wu and Grossman, and 155, Wu, Mayer and Walker (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, Scopes (1987), Protein Purification: Principle and Practice, 2nd ed., Springer-Verlag, N.-Y. and Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV, C.D. Weir 및 C.C.　 Blackwell (1986)). 또한, 특허 출원 WO 01/36646, WO 01/75164 및 US 2003/0088087에 기재의 합성 방법을 참조할 수 있으며, 문헌 US 2004/014956에 기재된 바와 같이 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 다양하게 변형시킬 수 있다.
몇몇의 기관은 인터넷에서 siRNA 디자인으로 무료로 이용할 수 있는 다양한 툴을 제공한다.
인터넷 주소
Ambion http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_design.html
Dharmacon http://www.dharmacon.com/sidesign/
Qiagen http://www1.qiagen.com/Products/GeneSilencing/
Emboss http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sirna.html
Tuschl Laboratory http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html
The Whitehead http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/
siRNA를 합성하는 회사들은 siRNA의 효율을 높일 수 있는 부분을 디자인한다. 이러한 siRNA는 유효성을 테스트를 통해 검증 될 수 있다.
30 내지 70%의 구아닌 및 시토신으로 구성되는 서열을 가지는 siRNA는 구아닌과 시토신 함량이 높은 서열에 비해 훨씬 효과적인 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA는 30 내지 70%의 구아닌과 시토신으로 이루어진 서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 구아닌 및 시토신 함량비가 30 내지 70%이며, 바람직하게는 40 내지 55%이다. 이때, 30% 미만의 경우 서열 비특이적인 결합에 문제가 야기될 수 있으며, 70% 초과의 경우에는 RISC complex를 형성하는데 어려움이 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 siRNA는 2개의 상보적 단일 가닥 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 상기 2개의 상보적 부분은 헤어핀 타입 구조(short hairpin RNA; shRNA)에 의해 한쪽 면에 공유 결합하는데, 이것은 siRNA에 포함되는 현상으로 간주한다. 전체적으로 명세서에서 용어 siRNA는 다르게 표시되지 않는한 shRNA를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 siRNA는 센스 및/또는 안티센스 RNA 가닥에 추가적으로 2 내지 4개 뉴클레오타이드의 3'오버행(overhang) 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 표현 "2 내지 4개 뉴클레오타이드의 3' 오버행 단편"은 한가닥의 3' 원위 말단에 있는 상보적 가닥과 쌍을 이루지 않는 2 내지 4개 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스의 최소한 한 개의 가닥에 존재하는 것으로 이해된다. 3' 오버행 단편에 사용된 뉴클레오타이드는 자연상태의 뉴클레오타이드(리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드), 또는 리보오스의 2' 및 4' 포지션 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 LNA(Locked Nucleic Acid)와 같은 변형된 뉴클레오타이드가 될 수 있다(Soutschek 등, Nature. 2004, 432, 173-178). 또한, 3'오버행 단편은 본 발명에 따른 siRNA의 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA 가닥에 관한 문단에서 기술된 모든 형태의 화학적 변형을 가질 수 있다. 3' 오버행 단편에 대한 바람직한 서열은 T(여기서 T는 데옥시티미딘) 또는 U(여기서 U는 우라실)의 연속적인 서열로 이루어지며, 바람직하게는 T의 연속적인 서열이다. 또한 3'오버행 단편의 서열 길이는 연속적인 2개의 뉴클레오타이드 염기이며, 바람직하게는 "TT" 또는 "UU"(여기서 U는 우라실)이다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 siRNA의 상보적 가닥 모두는 3' 오버행 단편을 포함한다. 이 경우, 2개의 3' 오버행 단편의 길이와 서열은 동일하거나 다를 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 siRNA의 상보적 가닥 모두는 서열 "TT"를 가진 2개 뉴클레오타이드의 동일한3' 오버행 단편을 포함할 수 있다. 상기와 같은 3' 오버행 단편은 타겟 서열과의 결합을 방해하지 않으면서, cell conjugation에 유리한 추가구성이 된다.
TSLP에 특이적으로 작용하는 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 일단 세포 또는 조직에 침투하면 활성화되며, 침투된 siRNA는 부착된 형광표지로 측정이 가능하며, 그 활성은 PCR 혹은 단백질 검정(assay)를 통해 확인 가능하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 TSLP 활성을 특이적으로 억제하는 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 다공성 입자에 관한 것이다. 여기에서 언급하고 있는 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 상기 'TSLP 활성을 억제하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드'에서 기재한 내용과 동일하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 TSLP의 발현을 특이적으로 저해하여 탁월한 아토피 피부염증 개선효과를 달성한다.
또한, 여기에서 언급한 피부 외용 조성물은 화장료 조성물, 약학 조성물 및 치료학적 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 피부 외용 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 이외에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 예컨데, 보존제, 삼투제, 보습제, pH조절제, 완충제, 안정제, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 계면활성제, 리포솜, 증점제, 등 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "유효성분으로 함유하는"은 아토피 피부염의 개선, 예방, 또는 치료의 효과를 가져오는 용량 범위로 함유하는 것을 의미하고, 중증도 및 제형에 따라 용량범위는 별할 수 있으며, 적용횟수도 적용 대상의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다.
본 발명에서 "아토피 피부염"이 있는 경우는, 아토피 피부염에 의해 피부의 감염 부위가 변화된 상태를 의미하며, 이러한 상태는 피부질환으로 간주되는 상태와 피부질환으로 간주되지 않은 상태를 모두 포함한다.
본 발명에서 "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 아토피 피부염 부위에 적용한 결과로서 아토피 피부염 증세의 완치는 물론 아토피 피부염 증세의 부분적 완치 호전 및 경감을 포함한다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 피부, 특히 아토피 피부염에 적용하여 피부에의 아토피 피부염 증세를 억제 또는 차단함으로써, 아토피 피부염 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 TSLP에 특이적인 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 함유된 미용 또는 약제학적 조성물은 아토피 피부염의 원인인 TSLP이 발현을 억제함으로써 활성을 저해하여 아토피 피부염을 개선시키거나 치료할 수 있다.
본 발명은 일 관점에서, TSLP에 특이적인 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는, TSLP 저해능에 의한 아토피 피부염 개선능을 가지는 미용(cosmetic) 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 크림, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 로션, 모이스처 로션, 밀크로션, 영양로션, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아이스트린젠트, 팩, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 스킨 젤, 스킨 오일, 스킨 토너, 훼이스 로션(face lotion), 수렴수 및 디오더런트로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 세정용일 수 있고, 상기 피부 세정용의 화장료 조성물은 크림, 로션, 화장수, 클렌저, 폼, 클렌징 폼, 필링젤, 바디워시, 스크럽, 비누, 오일, 에멀젼, 헤어비누, 헤어 린스, 바디클렌져, 샴푸, 유액, 고형 세정제 및 액상 세정료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 정제수, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 항염증제, 착색제, 물 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 기타 성분 등을 포함할 수 있으며, 이들 성분은 전체 조성물의 98.0 내지 99.1중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 계면활성제는 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 모두를 포함하며, 사용량은 전형적으로 30중량%이상, 바람직하게는 70중량% 이상이다. 계면활성제의 종류 및 사용량을 선택 결정하는 것은 본 분야의 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 안정화제로는, 이로서 한정되는 것은 아니지만, 글리콜 스테아레이트가 포함된다. 안정화제가 사용되는 경우, 일반적으로, 조성물의 0.1 내지 5중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 보존제로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 테트라나트륨 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트라아자-1-아다만탄, 파라벤, 메틸파라벤, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 혼합물, 페녹시에탄올, 벤질알코올, 벤조페논-4, 메틸클로로이소티아졸리논 및 메틸이소티아졸리논 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 보존제가 사용되는 경우, 이의 양은 전형적으로 조성물의 0.01 내지 6중량%이고, 바람직한 양은 0.05 내지 4중량%, 더욱 바람직한 양은 0.1 내지 2중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 습윤화제로는 밀 단백질(예, 라우르디모늄 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질), 헤어 케라틴 아미노산, 나트륨 퍼옥실린카르볼산, 판테놀, 토코페롤(비타민 E) 및 디메티콘 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 또한 염화나트륨이 존재할 수 있으며 특히 헤어 케라틴 아미노산이 습윤화제로서 포함되는 경우 그러하다. 습윤화제는 전형적으로 조성물의 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 0.05 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%가 사용된다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 착색제로는 FD&C 그린 3번, Ext. D&C 바이올렛 2번, FD&C 옐로우 5번 및 FD&C 레드 40번 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 착색제는 사용되는 경우 전형적으로 조성물의 0.001 내지 0.1중량%, 바람직하게는 0.005 내지 0.05중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 바람직한 항염증제로는 국소적으로 투여하기에 적합하고 약학적으로 허용되는 화합물이라면 그 어느 것도 포함되며, 바람직하게는 알란토인이다. 항염증제는 사용하는 경우 염증 억제 또는 경감시키기에 충분한 양으로 사용되며 전형적으로는 조성물의 0.1 내지 2중량%, 바람직하게는 0.3 내지 1.5중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 항산화제는 효소형 항산화제와 비효소형 항산화제 모두 사용될 수 있다. 천연 효소형 항산화제의 예로는 과산화물 디스뮤타제(SOD), 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제를 들 수 있다. 적합한 비효소형 항산화제로는 비타민 E(예, 토코페롤), 비타민 C(아스코브산), 카로테노이드, 에키나코시드(Echinacoside), 카페오일 유도체, 올리고머 프로안토시아니딘, 프로안타놀(예, 포도 종자 추출물), 실리마린(예, 밀크 엉겅퀴 추출물, 실리붐 마리아늄), 은행나무(Ginkgo biloba) 및 녹차 폴리페놀 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 카로테노이드는 강력한 항산화제이며 이의 예로는 베타-카로틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, 라이코펜, 루테인, 크로세틴 및 캡산틴 등이 포함된다. 바람직한 항산화제는 비타민 E, 비타민 C 또는 카로테노이드이다. 항산화제는 사용되는 경우 피부에서 유리-라디칼의 영향을 억제하거나 경감시키기에 충분한 양으로 사용된다. 항산화제의 전형적인 사용량은 조성물의 0.001 내지 1중량%이고, 바람직한 양은 0.01 내지 0.5중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 분야에서 통상적으로 사용되는 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 향료, 염료(헤어를 동시에 염색하거나 색조를 부가하는 염료를 포함), 용매, 불투명화제, 펄제(pearlescent agent)(예를 들어, 지방산과 폴리올의 에스테르, 지방산의 마그네슘 염 및 아연 염), 공중합체 계 분산액, 농후화제(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄 및 황산나트륨), 지방산 알킬올아미드, 셀룰로즈 유도체, 천연 검, 식물 추출물, 알부민 유도체(예를 들어 젤라틴), 콜라겐 가수분해 생성물, 천연 또는 합성폴리펩타이드, 난황, 레시틴, 라놀린 또는 라놀린 유도체, 지방, 오일, 지방 알코올, 실리콘, 디오더런트, 항균물질, 항지루성 물질, 각질용해제(예를 들어, 황, 살리실산, 벤조일 퍼옥사이드, 셀레늄 설파이드, PG, FA, 효소) 및 각화제(예를 들어, 타르, 황, 살리실산, 셀레늄 설파이드, 항균제, 벤조일 퍼옥사이드, 클로르헥시딘, 요오드, 트리클로산, 항진균제 및 효소) 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
상기 약학 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 경피투여용인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 경피투여용의 조성물은 연고, 크림, 파스타제(pastes), 로션, 찰제(liniments), 파스타제(pastes), 외용 액제, 틴크제, 글리세로젤라틴(glycerogelatins), 외용산제, 에어로졸 및 경고제(plasters)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌에 기술되어 있다(Blaug et al., Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975).
상기 제형의 바람직한 양태는 연고이다. 상기 연고는 페트롤라툼(patrolatum), 화이트 페트롤라툼, 엘로우 연고, 미네랄 오일과 같은 탄화수소 기제, 친수성 페트롤라툼, 무수 라놀린, 라놀린, 콜드크림과 같은 흡수 기제, 친수성 연고와 같은 수세가 가능한 기제, 폴리에틸렌 글리콜 연고와 같은 수용성 기제 어느 것으로도 제조 가능하다. 이들의 선택 및 제조는 약물의 기제로부터의 방출속도, 기제에 의한 경피 흡수의 증가 기대, 기제에 의한 피부 수분 밀봉 여부, 약물의 기제 내에서의 안정성, 기제에 대한 약물의 영향과 같은 요인을 고려하여 이루어지지만 약제 제형 분야의 당업자에게는 통상적인 기술에 속한다.
상기 제형의 바람직한 양태는 크림이다. 상기 크림은 콜드크림, 에몰리엔트 크림(emollient cream)과 같은 W/O형 및 쉐이빙 크림, 바니싱 크림, 핸드크림, 린싱크림(reansing cream)과 같은 O/W형을 포함한다. 더욱 바람직한 크림은 전형적으로 물과 스테아린산을 함유하는 바니싱 크림이다. 보통 환자나 의사는 O/W 크림이 연고보다 씻어내기 쉽기 때문에 연고제보다 크림을 선호하는데 이러한 관점에서 본 발명의 약제에서 바람직한 것은 크림이다.
상기 제형의 바람직한 양태는 로션이다. 상기 로션은 현탁제, 유제, 액제 등과 같은 방법으로 조제되며 이들 또한 약제 제형 분야의 당업자에게는 통상적인 기술에 속한다. 본 발명에 있어서 더욱 바람직한 것은 화이트 로션(white lotion)이며 이 제제 또한 제형 분야의 당업자에게는 통상적인 기술에 속한다.
상기 제형의 또 다른 바람직한 양태는 찰제이다. 상기 찰제는 유성 찰제 및 에탄올성 찰제 어느 것으로 제조 가능하다. 바람직한 것은 피부에 자극이 적은 유성 찰제이다. 유성 찰제의 경우 아몬드 오일, 낙화생유, 면실유 등의 불휘발성유, 윈터그린(wintergreen), 투르펜틴(turpentine) 같은 휘발성유 또는 불휘발성유의 배합 등이 있다.
또한, 아토피 피부염에 대한 예방 또는 치료 용량 범위는 중증도 및 제형에 따라 변할 수 있다. 또한, 적용 횟수도 환자의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연, 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 여컨대 물, 에탄올, 이스프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 에스테르 및 폴리에시에틸렌 솔비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 피부 외용 조성물은 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 고용체 퍼포레이트(SSSP)의 제형으로 제조되며, 이때 피부 침투력이 가장 우수하여 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드의 효과를 극대화 시킨다. 본 발명의 더 구체적인 구현예에 따르면 고용체 퍼포레이트 제형은 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드, 가용성 기질 물질 및 불활성 입자를 포함하는 현탁액(서스팬션 겔)으로 제조된다. 제조된 현탁액은 적당한 고용체 퍼포레이트 몰드에 채워진 후 압축 또는 건조를 통하여 제형이 완성된다. 또한 상기 제형은 피부 침투력을 더 증강시키기 위해 원심분리 방법 등의 다양한 제조 방법과 파라미터에 의해 본 발명의 siRNA를 피부와 접촉하는 다공성 입자의 내부 또는 안쪽 표면 또는 바깥쪽 표면으로 이동시킬 수 있다.
본 명세서에서 언급한 '고용체 퍼포레이터(solid solution perforator; 이하 SSSP)'는 경피 기질 전달의 한 방법으로, 상기 고용체 퍼포레이터에 유효물질을 담아 피부에 적용 시 표피에서 진피로 유효물질이 효과적으로 침투되도록 하는 시스템이다. 예를 들어, 다공성 입자 등이 포함된다. 유효성분의 추가 적용은 퍼포레이터에 적재된 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드 등이 피부 구멍, 모공, 땀샘 등을 통해 선택적으로 전달될 수도 있다. 또한 SSPP 시스템은 공지의 기술에 따라 다양한 모양 및 크기로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물 (RNAi 함유 조성물)은 조성물의 총량에 대하여 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 0.1 nM 내지 100 uM, 바람직하게는 0.1 nM 내지 100 nM로 함유된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA 올리고뉴클레오티드, dsRNA 올리고뉴클레오티드, 그리고/또는 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 고용체 퍼포레이터 시스템을 피부에 적용하여 아토피 피부염, 건선, 피부염의 개선 및/또는 치료효과를 달성하는 미용, 그리고 약제학적 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 올리고뉴클레오티드는 크기가 1000 um 이하인 다공성 입자 또는 제타 전위가 10 내지 80 mV 이고 크기가 1000 um 이하인 양이온성 입자에 결합되어 있을 수 있다.
본 발명의 미용, 약제학적 조성물은 색소침착 흔적 또는 노화 흔적의 형성을 예방하거나 이를 제거하기 위한, 또는 갈색화된 피부를 밝게 또는 희게하거나, 또는 갈색화된 피부의 색을 고르게 할 수 있다.
본 발명의 미용, 약제학적 조성물은 아토피 피부염, 천식, 호흡기 질환, 어루러기, 두드러기, 감염성 질환, 환경성 질환, 탈모,관절염, 창상치료, 열상, 욕창 등의 증상을 완화시키거나 예방, 개선시킬 수 있다.
본 발명의 미용, 약제학적 조성물은 국소용 조성물에 1 nM 내지 1 mM의 농도범위로 제형화될 수 있다.
본 발명의 미용, 약제학적 조성물은 카르복실메틸셀룰로오스나트륨(SCMC), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 말토덱스트린, 폴리아크릴산, 폴리스티렌설포네이트, 폴리펩티드, 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 히드록시에틸 셀룰로오스(HEC), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 폴리아크릴산, 덱스트린, 덱스트란, 단당류 및 다당류, 폴리알코올, 젤라틴, 아라비아 고무, 알기네이트, 키토산, 사이클로덱스트린 및 다른 수용성 천연 및 합성 중합체, 또는 상기의 조합을 포함하는 중합체로 이루어지는 기질 물질; 트레할로스, 글루코오스, ?㎰음?, 락토오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락툴로오스, 프룩토오스, 투라노오스, 멜리토스, 만노오스, 멜레치토오스, 덱스트란, 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이노시톨, 팔라티니트 및 만니톨로 구성된 군으로부터 선택되는 탄수화물 유도체; 및 인산염, 질산염 및 카르복실산염 유리, 염화칼슘 및 염화마그네슘으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 성분을 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
TSLP의 siRNA , dsRNA , 안티센스 RNA 검색
염기서열은 미국 국립생물정보센터(http://www.ncbi.nim.nih.gov)에서 검색 가능하며, 공식 심볼(TSLP)과 전체 공식 명식으로 thymic stromal lymphopoietin로 기재되며 승인번호 NM_033035.4의 인간서열을 사용하여 인간 TSLP에 대한 siRNA, dsRNA, 안티센스 RNA서열을 디자인 하였다. siRNA design을 제공하는 인터넷 사이트 중 GE Healthcare(http://dharmacon.gelifesciences.com/design-center/?redirect=true) 에서 Dharmacon RNAi & Gene Expression 서비스를 통해 siRNA를 디자인 하였다. 이 때, 디자인한 DNA 절편 중 타겟 서열의 GC 함량이 30% 내지 70% 사이인 siRNA 서열1 내지 서열 10까지의 서열 10개를 선별하였다. 또한, 서열 11 내지 서열 23까지의 서열 13개는 발명자가 GC 함량이 30% 내지 70% 사이인 siRNA 서열을 디자인하였다. 최종 선별된 23개의 siRNA는 바이오니아 (<http://www.bioneer.co.kr>)에 주문 의뢰하여 제조하였다. 이 때, siRNA제조를 위해 TSLP의 타겟 서열에 대한 센스 서열 및 안티센스 서열을 각각 디자인하였다. 또한 각각의 단일 서열인 센스 서열과 안티센스 서열을 특이적인 염기쌍 결합에 의하여 dsRNA를 제작하였다.
인간 TSLP 유전자 서열 내 siRNA, dsRNA, 안티센스RNA의 위치와 특이 서열.
Target sequence 1:
GCA GCC UAU CUC AGU ACU A
(Position in gene sequence: 140)		 GC content: 47.37%
Sense strand:
GCA GCC UAU CUC AGU ACU AUU
Antisense strand:
UAG UAC UGA GAU AGG CUG CUU
dsRNA:
GCA GCC UAU CUC AGU ACU AUU UCU A
Target sequence 2:
GCC UAU CUC AGU ACU AUU U
(Position in gene sequence: 143)		 GC content: 36.85%
Sense strand:
GCC UAU CUC AGU ACU AUU UUU
Antisense strand:
AAA UAG UAC UGA GAU AGG CUU
dsRNA:
GCC UAU CUC AGU ACU AUU UCU AAA G
Target sequence 3:
GCC ACA UUG CCU UAC UGA A
(Position in gene sequence: 235)		 GC content: 47.37%
Sense strand:
GCC ACA UUG CCU UAC UGA AUU
Antisense strand:
UUC AGU AAG GCA AUG UGG CUU
dsRNA:
GCC ACA UUG CCU UAC UGA AAU CCA G
Target sequence 4:
CCA CAU UGC CUU ACU GAA A
(Position in gene sequence: 236)		 GC content: 42.11%
Sense strand:
CCA CAU UGC CUU ACU GAA AUU
Antisense strand:
UUU CAG UAA GGC AAU GUG GUU
dsRNA:
CCA CAU UGC CUU ACU GAA AUC CAG A
Target sequence 5:
UCC AGA GCC UAA CCU UCA A
(Position in gene sequence: 255)		 GC content: 47.37%
Sense strand:
UCC AGA GCC UAA CCU UCA AUU
Antisense strand:
UUG AAG GUU AGG CUC UGG AUU
dsRNA:
UCC AGA GCC UAA CCU UCA AUC CCC A
Target sequence 6:
CCA GAG CCU AAC CUU CAA U
(Position in gene sequence: 256)		 GC content: 47.37%
Sense strand:
CCA GAG CCU AAC CUU CAA UUU
Antisense strand:
AUU GAA GGU UAG GCU CUG GUU
dsRNA:
CCA GAG CCU AAC CUU CAA UCC CAC C
Target sequence 7:
GCG UCG CUC GCC AAA GAA A
(Position in gene sequence: 290)		 GC content: 52.9%
Sense strand:
GCG UCG CUC GCC AAA GAA A UU
Antisense strand:
UUU CUU UGG CGA GCG ACG CUU
dsRNA:
GCG UCG CUC GCC AAA GAA AUG UUC G
Target sequence 8:
CCA AAG AAA UGU UCG CCA U
(Position in gene sequence: 300)		 GC content: 42.11%
Sense strand:
CCA AAG AAA UGU UCG CCA UUU
Antisense strand:
AUG GCG AAC AUU UCU UUG GUU
dsRNA:
CCA AAG AAA UGU UCG CCA UGA AAA C
Target sequence 9:
GCU UCA AUC GAC CUU UAC U
(Position in gene sequence: 468)		 GC content: 42.11%
Sense strand:
GCU UCA AUC GAC CUU UAC UUU
Antisense strand:
AGU AAA GGU CGA UUG AAG CUU
dsRNA:
GCU UCA AUC GAC CUU UAC UGA AAC A
Target sequence 10:
UCA AUC GAC CUU UAC UGA A
(Position in gene sequence: 471)		 GC content: 36.85%
Sense strand:
UCA AUC GAC CUU UAC UGA AUU
Antisense strand:
UUC AGU AAA GGU CGA UUG AUU
dsRNA:
UCA AUC GAC CUU UAC UGA AAC AAC A
Target sequence 11:
GCC UUA CUA UAU GUU CUG UC
(Position in gene sequence: 32)		 GC content: 40.00%
Sense strand:
GCC UUA CUA UAU GUU CUG UCU U
Antisense strand:
GAC AGA ACA UAU AGU AAG GCU U
dsRNA:
GCC UUA CUA UAU GUU CUG UCA GUU U
Target sequence 12:
CCU UAC UAU AUG UUC UGU CAG
(Position in gene sequence: 33)		 GC content: 38.10%
Sense strand:
CCU UAC UAU AUG UUC UGU CAG UU
Antisense strand:
CUG ACA GAA CAU AUA GUA AGG UU
dsRNA:
CCU UAC UAU AUG UUC UGU CAG UUU C
Target sequence 13:
CAG GAA AAU CUU CAU CUU AC
(Position in gene sequence: 61)		 GC content: 35.00%
Sense strand:
CAG GAA AAU CUU CAU CUU ACU U
Antisense strand:
GUA AGA UGA AGA UUU UCC UGU U
dsRNA:
CAG GAA AAU CUU CAU CUU ACA ACU U
Target sequence 14:
GCU GGU GUU AAC UUA CGA CU
(Position in gene sequence: 91)		 GC content: 45.00%
Sense strand:
GCU GGU GUU AAC UUA CGA CUU U
Antisense strand:
AGU CGU AAG UUA ACA CCA GCU U
dsRNA:
GCU GGU GUU AAC UUA CGA CUC UUC A
Target sequence 15:
GGU GUU AAC UUA CGA CUU CA
(Position in gene sequence: 94)		 GC content: 40.00%
Sense strand:
GGU GUU AAC UUA CGA CUU CAU U
Antisense strand:
UGA AGU CGU AAG UUA ACA CCU U
dsRNA:
GGU GUU AAC UUA CGA CUU CAC UAA C
Target sequence 16:
CAC UAA CUG UGA CUU UGA G
(Position in gene sequence: 112)		 GC content: 42.11%
Sense strand:
CAC UAA CUG UGA CUU UGA GUU
Antisense strand:
CUC AAA GUC ACA GUU AGU GUU
dsRNA:
CAC UAA CUG UGA CUU UGA GAA GAU U
Target sequence 17:
GAC CUG AUU ACA UAU AUG AG
(Position in gene sequence: 167)		 GC content: 35.00%
Sense strand:
GAC CUG AUU ACA UAU AUG AGU U
Antisense strand:
CUC AUA UAU GUA AUC AGG UCU U
dsRNA:
GAC CUG AUU ACA UAU AUG AGU GGG A
Target sequence 18:
CCG AGU UCA ACA ACA CCG U
(Position in gene sequence: 201)		 GC content: 52.63%
Sense strand:
CCG AGU UCA ACA ACA CCG UUU
Antisense strand:
ACG GUG UUG UUG AAC UCG GUU
dsRNA:
CCG AGU UCA ACA ACA CCG UCU CUU G
Target sequence 19:
ACC GUC UCU UGU AGC AAU CG
(Position in gene sequence: 215)		 GC content: 50.00%
Sense strand:
ACC GUC UCU UGU AGC AAU CGU U
Antisense strand:
CGA UUG CUA CAA GAG ACG GUU U
dsRNA:
ACC GUC UCU UGU AGC AAU CGG CCA C
Target sequence 20:
AAG GCU GCC UUA GCU AUC UG
(Position in gene sequence: 326)		 GC content: 50.00%
Sense strand:
AAG GCU GCC UUA GCU AUC UGU U
Antisense strand:
CAG AUA GCU AAG GCA GCC UUU U
dsRNA:
AAG GCU GCC UUA GCU AUC UGG UGC C
Target sequence 21:
CGG AAA CUC AGA UAA AUG C
(Position in gene sequence: 360)		 GC content: 42.11%
Sense strand:
CGG AAA CUC AGA UAA AUG CUU
Antisense strand:
GCA UUU AUC UGA GUU UCC GUU
dsRNA:
CGG AAA CUC AGA UAA AUG CUA CUC A
Target sequence 22:
CCA ATA AAT GTC TGG AAC AA
(Position in gene sequence: 420)		 GC content: 35.00 %
Sense strand:
CCA AUA AAU GUC UGG AAC AAU U
Antisense strand:
UUG UUC CAG ACA UUU AUU GGU U
dsRNA:
CCA ATA AAT GTC TGG AAC AAG UGU C
Target sequence 23:
CAA GGA UUG UGG CGU CGC U
(Position in gene sequence: 442)		 GC content: 57.89%
Sense strand:
CAA GGA UUG UGG CGU CGC UUU
Antisense strand:
AGC GAC GCC ACA AUC CUU GUU
dsRNA:
CAA GGA UUG UGG CGU CGC UGC UUC A
인간 TSLP 발현 분석(Real-Time PCR )
2-1. 인간피부 각질형성세포주 HaCaT 세포의 배양
인간TSLP 특이적인 siRNA, dsRNA, 안티센스RNA올리고뉴클레오티드가 피부세포에서 발생되는 TSLP의 생산을 저해시킬 수 있는지 탐색시험을 수행하기 위하여, 인간피부의 구성 세포주인 각질형성세포 HaCaT 세포주 (CLC cell line service, Germany)를 사용하였다. HaCaT 세포주를 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA)와 항생제가 함유된 DMEM 배양액 (Gibco BRL, USA)에서 배양하였다. 배양접시는 100 mm culture dish와 6-well plate를 사용하였으며, 5% CO2가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양액은 2일 마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되기 직전에 계대배양 하였다.
2-2. 올리고뉴클레오티드의 트랜스팩션 ( transfection )
인간TSLP 특이적인 siRNA, dsRNA, 안티센스RNA올리고뉴클레오티드를 HaCaT 세포주에 트랜스팩션(transfection) 하기 전에는 세포 컨플류언시(cell confluency)를 70%로 유지하였다. 올리고뉴클레오티드를 트랜스팩션하기 12시간 전에 1% FBS가 함유된 DMEM 배양액으로 교체하였다. 올리고뉴클레오티드는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)와 다공성 입자를 이용하여 HaCaT 세포주에 트랜스팩션을 수행하였다.
2-3. Total RNA 분리와 인간 TSLP의 발현분석(Real-Time PCR )
Real-Time PCR에 사용될 cDNA를 합성하기 위하여, 올리고뉴클레오티드의 트랜스팩션 수행한지 24시간 이후의 HaCaT 세포주로부터 total RNA를 Trizol (Invitrogen, USA)를 이용하여 추출하였다. Total RNA를 이용한 cDNA를 합성하기 위하여 전체 반응액 20 ul의 아래의 조성들로 구성하였다. 5X PrimeScript Buffer 4 ul와 PrimeScript RT Enzyme Mix 1 ul와 OligodT Primer 1 ul와 Random Primer 4 ul, 그리고 마지막으로 total RNA 10ul를 혼합하여 PCR tube에 넣은 후, 충분히 섞은 다음 PCR 기계를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 반응 조건은 37℃에서 15분, 85℃ 5초로 반응하고 4℃로 처리하여 반응을 종료하였다. 처리가 끝난 cDNA는 하기 방식으로 Real-Time PCR로 분석하였다. 인간 TSLP의 발현양을 분석하기 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다. 인간 TSLP 센스 5'-TAG CAA TCG GCC ACA TTG CC-3, 인간 TSLP 안티센스 5'-CTG AGT TTC CGA ATA GCC TG-3', 그리고 인간 GAPDH 센스 5'-ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG-3', 인간 GAPDH 안티센스 5'-GCT AAG CAG TTG GTG GTG CA-3'. Real-Time PCR은 Platinum SYBR Green quantitative PCR SuperMix-UDG with ROX (Invitrogen, USA)와 ABI 7700 sequence detector(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 인간 TSLP mRNA 발현 수준은 GAPDH mRNA 발현양으로 노멀라이즈하여 분석하였다.
수득된 결과는 표2에 나타내었다.
인간 TSLP mRNA(Gene Bank number: NM_033035)의 발현 억제에 대한 70개 siRNA, dsRNA, 그리고 안티센스 RNA올리고뉴클레오티드의 유효성에 대한 검정(assay).
염기서열 번호 발현 억제율 (%) 염기서열 번호 발현 억제율 (%) 염기서열 번호 발현 억제율 (%) 염기서열 번호 발현 억제율 (%)
1 89.74 19 97.07 37 93.44 55 83.50
2 82,27 20 94.36 38 95.88 56 92.48
3 88.18 21 89.02 39 92.75 57 91.74
4 92.91 22 88.11 40 67.53 58 42.11
5 93.57 23 89.57 41 95.72 59 53.26
6 79.44 24 78.80 42 93.29 60 64.82
7 98.77 25 98.42 43 87.07 61 27.08
8 95.29 26 92.58 44 93.79 62 45.89
9 89.73 27 93.28 45 87.83 63 79.64
10 87.14 28 84.57 46 79.14 64 93.58
11 74.17 29 86.24 47 96.22 65 95.19
12 72.58 30 88.91 48 94.66 66 89.27
13 97.32 31 59.03 49 94.87 67 68.92
14 94.59 32 48.81 50 89.20 68 45.72
15 92.73 33 67.23 51 93.17 69 78.94
16 96.18 34 81.29 52 74.35 70 74.38
17 88.74 35 74.98 53 85.68 - -
18 82.19 36 96.73 54 88.90 - -
다음으로 가장 효과적이었던, 즉 1 nM에서 90% 초가의 유효성을 가진 서열들에 대하여 인간 TSLP발현 억제효과를 그래프로 나타내었다.
수득된 결과는 도 1에 나타내었다.
<110> WON, Cheolhee Lemonex Inc <120> Oligonucleotides down-regulating the expression of TSLP and the composites for cosmetic or pharmaceutical <130> P-1001 <160> 70 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 540 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(540) <223> TSLP (NM_033035.4) <400> 1 tggaattggg tgtccacgta tgttcccttt tgccttacta tatgttctgt cagtttcttt 60 caggaaaatc ttcatcttac aacttgtagg gctggtgtta acttacgact tcactaactg 120 tgactttgag aagattaaag cagcctatct cagtactatt tctaaagacc tgattacata 180 tatgagtggg accaaaagta ccgagttcaa caacaccgtc tcttgtagca atcggccaca 240 ttgccttact gaaatccaga gcctaacctt caatcccacc gccggctgcg cgtcgctcgc 300 caaagaaatg ttcgccatga aaactaaggc tgccttagct atctggtgcc caggctattc 360 ggaaactcag ataaatgcta ctcaggcaat gaagaagagg agaaaaagga aagtcacaac 420 caataaatgt ctggaacaag tgtcacaatt acaaggattg tggcgtcgct tcaatcgacc 480 tttactgaaa caacagtaaa ccatctttat tatggtcata tttcacagca ccaaaataaa 540 540 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcagccuauc ucaguacuau u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uaguacugag auaggcugcu u 21 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gcagccuauc ucaguacuau uucua 25 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 gccuaucuca guacuauuuu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 aaauaguacu gagauaggcu u 21 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 gccuaucuca guacuauuuc uaaag 25 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 gccacauugc cuuacugaau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uucaguaagg caauguggcu u 21 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 gccacauugc cuuacugaaa uccag 25 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 ccacauugcc uuacugaaau u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uuucaguaag gcaauguggu u 21 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 ccacauugcc uuacugaaau ccaga 25 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 uccagagccu aaccuucaau u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 uugaagguua ggcucuggau u 21 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 uccagagccu aaccuucaau cccca 25 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 ccagagccua accuucaauu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 auugaagguu aggcucuggu u 21 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 ccagagccua accuucaauc ccacc 25 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 gcgucgcucg ccaaagaaau u 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 uuucuuuggc gagcgacgcu u 21 <210> 22 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 gcgucgcucg ccaaagaaau guucg 25 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 ccaaagaaau guucgccauu u 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 auggcgaaca uuucuuuggu u 21 <210> 25 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 ccaaagaaau guucgccaug aaaac 25 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 gcuucaaucg accuuuacuu u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 aguaaagguc gauugaagcu u 21 <210> 28 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 gcuucaaucg accuuuacug aaaca 25 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 ucaaucgacc uuuacugaau u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uucaguaaag gucgauugau u 21 <210> 31 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 ucaaucgacc uuuacugaaa caaca 25 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 gccuuacuau auguucuguc uu 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 gacagaacau auaguaaggc uu 22 <210> 34 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 gccuuacuau auguucuguc aguuu 25 <210> 35 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 ccuuacuaua uguucuguca guu 23 <210> 36 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 cugacagaac auauaguaag guu 23 <210> 37 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 ccuuacuaua uguucuguca guuuc 25 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 caggaaaauc uucaucuuac uu 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 guaagaugaa gauuuuccug uu 22 <210> 40 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 caggaaaauc uucaucuuac aacuu 25 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 gcugguguua acuuacgacu uu 22 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 agucguaagu uaacaccagc uu 22 <210> 43 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 gcugguguua acuuacgacu cuuca 25 <210> 44 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 gguguuaacu uacgacuuca uu 22 <210> 45 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 ugaagucgua aguuaacacc uu 22 <210> 46 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 gguguuaacu uacgacuuca cuaac 25 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 cacuaacugu gacuuugagu u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 cucaaaguca caguuagugu u 21 <210> 49 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 cacuaacugu gacuuugaga agauu 25 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 gaccugauua cauauaugag uu 22 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 cucauauaug uaaucagguc uu 22 <210> 52 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 gaccugauua cauauaugag uggga 25 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 ccgaguucaa caacaccguu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 acgguguugu ugaacucggu u 21 <210> 55 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 ccgaguucaa caacaccguc ucuug 25 <210> 56 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 accgucucuu guagcaaucg uu 22 <210> 57 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 cgauugcuac aagagacggu uu 22 <210> 58 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 accgucucuu guagcaaucg gccac 25 <210> 59 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 aaggcugccu uagcuaucug uu 22 <210> 60 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 cagauagcua aggcagccuu uu 22 <210> 61 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 aaggcugccu uagcuaucug gugcc 25 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 cggaaacuca gauaaaugcu u 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 gcauuuaucu gaguuuccgu u 21 <210> 64 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 cggaaacuca gauaaaugcu acuca 25 <210> 65 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 ccaauaaaug ucuggaacaa uu 22 <210> 66 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 uuguuccaga cauuuauugg uu 22 <210> 67 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 ccaataaatg tctggaacaa guguc 25 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 caaggauugu ggcgucgcuu u 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 agcgacgcca caauccuugu u 21 <210> 70 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 caaggauugu ggcgucgcug cuuca 25

Claims (5)

  1. 서열번호 2 내지 70 중 하나 이상의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 다공성 나노 입자에 포함되는 것인 의약 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 제타 전위가 10 내지 80 mV 이고 크기가 1000 um 이하인 양이온성 입자에 결합되어 있는 의약 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 1nM 내지 100pM의 농도 범위로 제형화되는 의약 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 피부 외용 조성물인 의약 조성물.
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