KR102279110B1 - LasiRNA를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents
LasiRNA를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 타이로시나아제 mRNA를 효율적으로 억제하는 lasiRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 lasiRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 기존의 small molecule 보다 1000배 이상 낮은 농도에서도 뛰어난 타이로시나아제 활성 억제 효과를 갖기 때문에 미백 제품 개발에 유용하다.
본 발명에 따른 lasiRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 기존의 small molecule 보다 1000배 이상 낮은 농도에서도 뛰어난 타이로시나아제 활성 억제 효과를 갖기 때문에 미백 제품 개발에 유용하다.
Description
본 발명은 타이로시나아제(tyrosinase)를 표적으로 하는 lasiRNA 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
siRNA는 선택적으로 표적 유전자의 발현을 억제 할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA로(Elbashir, SM, et al, Nature 2001;411:494-498), 높은 표적 선택성과 효과적인 유전자 억제 효율에 기인하여 암, 바이러스의 감염 등 현재 치료제가 없는 다양한 난치성 질환에 대한 치료제로 각광받고 있다(de Fougerolles A, et al, Nat Rev Drug Discov,2007;6:443-453).
기미(Melasma)는 여성의 피부에서 일어나는 대표적인 난치성 질환중 하나로 (Gupta, AK, et al, J Am Acad Dermatol 2006;55:1048-1065), 피부층의 멜라닌 세포(melanocyte)에서 멜라닌의 과다한 생성에 의하여 피부에 검은 침착이 생기는 매우 흔한 질환이다. 색소 침착을 없애기 위한 표적 유전자로 색소 생성의 핵심 단백질인 MITF(microphthalmia associated transcription factor), 타이로시나아제 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며,In vitro에서 다양한 타이로시나아제 저해제(타이로시나아제 inhibitor)들이 보고되었지만, 임상에서 치료 효과를 나타내는 물질들은 거의 없는 것으로 알려져 있다. 대표적인 화이트닝과 기미치료 원료로 하이드로퀴논(hydroquinone), 레티노익산(retinoic acid), 코지산(kojic acid), 아젤라익산(azelaic acid), 알부틴(arbutin), 글라브리딘(glabridin) 등이 사용되고 있으나, 피부 반점, 피부 발진, 조직 갈변증 등의 부작용을 야기하는 문제점이 있다.
타이로시나아제는 멜라닌의 합성에서 key rate limiting enzyme 역학을 하는 것으로 알려져 있으며, 타이로시나아제 유전자의 돌연변이는 안피부형 백색증(oculocutaneous albinism)등의 다양한 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 타이로시나아제는 멜라닌 합성 과정에서 총 3단계의 촉매 역할 (A. tyrosine→ 3,4-dihydrxyphenylalanine, B. DOPA→DOPA-quinone, C. 5,6-dihydroxy →indole indolequinone)을 한다. 이러한 타이로시나아제의 핵심 역할 때문에, 많은 색소 질환 연구들이 타이로시나아제를 대상으로 하는 억제제(inhibitor)들에 집중되어 있다.
이러한 배경 하에서, 본 출원의 발명자들은 효과적으로 타이로시나아제의 mRNA 및 단백질 생성을 저해하는 long antisense siRNA (lasiRNA)를 스크리닝하여 높은 표적 억제 효율을 갖는 lasiRNA들을 선별하였으며, 각 후보군들을 melanoma인 MNT-1에 처리하여 멜라닌 생성 억제 효능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 타이로시나아제 억제 활성이 뛰어난 lasiRNA 및 이를 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 24 중 하나 이상의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 일부 영역을 포함하는 서열번호 25 내지 48 중 하나 이상의 안티센스 가닥으로 구성되는 lasiRNA(long asymmetric siRNA) 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 lasiRNA는 기존의 small molecule 보다 1000배 이상 낮은 농도에서도 매우 뛰어난 타이로시나아제 활성 억제 효과를 가지므로 기존의 small molecule 미백 치료제에 의하여 일어나는 다양한 부작용을 최소화할 수 있을 뿐 아니라 탁월한 효과를 갖는 미백 조성물을 제공한다.
도 1는 타이로시나아제를 표적으로 하는 24종의 서열에 대한 lasiRNA의 유전자억제 효율을 나타낸 그래프이다.(3회 반복 실험의 평균과 SD)
HaCaT cells에 각 염기 서열을 표적으로 하는 lasiRNA를 (a) 10nM 또는 (b) 1nM로 transfection한 뒤 24시간 후에 real-time PCR을 이용하여 타이로시나아제 mRNA 의 발현 정도를 측정하였다.
도 2은 MNT-1 세포주에서 lasiRNA 처리 후 72시간 뒤 타이로시나아제 western blot을 수행한 결과 사진이다.
도 3는 타이로시나아제 표적 lasiRNA에 의한 타이로시나아제 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 Melanoma에서 타이로시나아제 표적 lasiRNA(10nM)에 의한 효과적인 색소 생성 억제를 나타낸 결과 사진이다.
HaCaT cells에 각 염기 서열을 표적으로 하는 lasiRNA를 (a) 10nM 또는 (b) 1nM로 transfection한 뒤 24시간 후에 real-time PCR을 이용하여 타이로시나아제 mRNA 의 발현 정도를 측정하였다.
도 2은 MNT-1 세포주에서 lasiRNA 처리 후 72시간 뒤 타이로시나아제 western blot을 수행한 결과 사진이다.
도 3는 타이로시나아제 표적 lasiRNA에 의한 타이로시나아제 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 Melanoma에서 타이로시나아제 표적 lasiRNA(10nM)에 의한 효과적인 색소 생성 억제를 나타낸 결과 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서 "siRNA (small interfering RNA)"란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)를 의미한다.
본 발명에서, "안티센스 가닥(antisense strand)"이란 관심있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA (messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g.,microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적일 수 있다. 본원에서, 안티센스 가닥 및 가이드 가닥은 교환되어 사용될 수 있다.
본 발명에서, "센스 가닥(sense strand)"이란 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서, "lasiRNA"란 제2가닥과 상보적 결합을 형성하지 않는 긴 단일가닥 영역을 갖는 RNAi를 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자, 즉 긴 안티센스 가닥을 가지는 siRNA를 뜻한다. lasiRNA는 기존의 siRNA보다 떠 짧은 이중가닥 길이를 가지면서도 높은 유전자 억제 효율을 갖는 신규한 구조의 비대칭형 RNAi 유도 구조이다.
본 발명에서, "RNAi (RNA interference)"란, 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메카니즘을 의미한다.
또한, 센스 가닥에 비하여 긴 안티센스 역할에 기인하여, siRNA나 asiRNA에 비하여 증가된 최대 유전자 억제 효율을 가져, 기존의 구조들을 대체하여 치료제 개발에 이용될 것으로 기대되고 있다. 또한 다른 구조들에 비하여 더 긴 길이를 가지며, 다양한 변형에도 높은 활성을 유지하는 특성이 있어 비교적 많은 화학적 변형의 자유로운 도입이 가능하여 다양한 기능을 추가할 수 있다는 특징이 있다.
본 발명에서는 타이로시나아제를 표적으로 하는 고효율의 RNAi를 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위하여, 타이로시나아제에 대한 24종의 표적 염기 서열을 디자인 한 뒤 스크리닝을 진행하여 가장 높은 효율로 표적 유전자인 타이로시나아제 mRNA를 억제하는 lasiRNA를 선별하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 타이로시나아제를 표적으로 하는 상기 5종의 lasiRNA가 단백질 수준에서 효과적으로 타이로시나아제의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여, Human melanoma 세포주인 MNT-1 cell에 lasiRNA를 10nM로 transfection 후 western blot을 통하여 타이로시나아제 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과 siRNA, lasiRNA를 처리한 모든 세포주에서 단백질의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. (도 2)
따라서 본 발명의 일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 24 중 하나 이상의 센스가닥 및 상기 센스가닥과 상보적인 일부 영역을 포함하는 서열번호 25내지 48 중 하나 이상의 안티센스 가닥으로 구성되는 lasiRNA에 관한 것이다.
상기 센스가닥은 길이가 13~21nt, 상기 안티센스가닥은 길이가 24~121nt일 수 있다. 따라서, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스가닥과 결합하지 않는 단일 가닥 영역을 포함하며, 상기 단일 가닥 영역은 링커에 의하여 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 영역에 연결되는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 화학적 링커는 핵산 (a nucleic acid moiety), PNA (a PNA moiety), 펩타이드 (a peptide moiety), 다이설퍼이드 결합 (a disulfide bond) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (a polyethylene glycol moiety)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 상기 lasiRNA는 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 lasiRNA에 포함되는 1종 이상의 뉴클레오티드 중 리보스의 2′ 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있으며, 이에 제한되지 않고 핵산 분자의 전달능을 높이기 위해서라면 -Br, -Cl, -R, -R'OR, -SH, -SR, -N3 및 -CN (R=alkyl, aryl, alkylene) 중 어느 하나로도 치환될 수 있다.
또한, 적어도 1종의 뉴클레오티드의 포스페이트 백본이 phosphorothioate form, phosphorodithioate form, alkylphosphonate form, phosphoroamidate form 및 boranophosphate form 중 어느 하나로 치환될 수 있다.
아울러, 상기 화학적 변형은 상기 lasiRNA에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), Morpholino, PNA(peptide nucleic acid) 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 화학적 변형은 상기 lasiRNA가 지질, 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상과 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 lasiRNA는 타이로시나아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명에서는 타이로시나아제를 표적으로 하는 고효율의 RNAi를 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위하여 타이로시나아제에 대한 24종의 표적 염기 서열을 디자인 한 뒤, 스크리닝을 진행하여 표적 유전자인 타이로시나아제 mRNA의 발현능이 우수한 5종의 lasiRNA를 선별하였다.
상기 lasiRNA의 센스 가닥은 서열번호 8, 14, 18, 21 및 22로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 lasiRNA의 안티센스 가닥은 서열번호 32, 38, 42, 45 및 46으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 lasiRNA는 (ⅰ)센스가닥 서열번호 8과 안티센스가닥 서열번호 32를 포함하는 lasiRNA, (ⅱ)센스가닥 서열번호 14와 안티센스가닥 서열번호 38을 포함하는 lasiRNA,(ⅲ)센스가닥 서열번호 18과 안티센스가닥 서열번호 42를 포함하는 lasiRNA,(ⅳ)센스가닥 서열번호 21과 안티센스가닥 서열번호 45를 포함하는 lasiRNA 및 (ⅴ)센스가닥 서열번호 22와 안티센스가닥 서열번호 46을 포함하는 lasiRNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 센스가닥 서열번호 22와 안티센스가닥 서열번호 46인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에서는 타이로시나아제를 표적으로 하는 상기 5종의 lasiRNA가 세포주에서 미백 효과가 있는지 확인하기 위해서 melanoma 세포주인 MNT-1에 lasiRNA를 처리한 후 세포주의 색 변화를 관찰하였다. 그 결과 상기 lasiRNA를 처리한 세포주는 양성 대조군인 하이드로퀴논(hydroquinone)을 처리한 세포주에 비해서도 더 밝은 색을 나타내는 것으로 확인되어, 타이로시나아제 표적 lasiRNA의 미백효능을 확인할 수 있었다(도 4).
따라서 본 발명의 다른 관점에서, 본 발명은 상기 lasiRNA를 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 치료학적 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 lasiRNA 이외에, 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 예컨대 보존제, 삼투제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 계면활성제, 리포솜, 증점제, 등 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
경우에 따라서, 상기 조성물은 유효 성분으로서 lasiRNA 이외에 siRNA 흡착용 불활성 입자를 포함할 수도 있다. 이러한 lasiRNA 흡착용 불활성 입자로는 ZnO2, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 다른 생체고분자 입자, 금 입자, 알륨(수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄), 나노 입자, 인산칼슘, 및 나트륨 벤토나이트, 칼슘 벤토나이트, 나트륨 클로지트 및 카올린과 같은 다른 점토 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 흡착용 불활성 입자는 본 발명의 유효성분인 lasiRNA와 흡착함으로써, 본 발명의 유효성분인 lasiRNA를 입자 성질, 크기 및 무게에 의해 침강시키거나, 선택할 수 있도록 한다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 lasiRNA를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 복합체는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
타이로시나아제를 타겟으로 한 RNAi를 유도하는 이중가닥의 핵산 분자 스크리닝.
타이로시나아제를 표적으로 하는 고 효율의 RNAi를 유도하는 이중 가닥의 핵산 분자를 확보하기 위하여, 타이로시나아제에 대한 24종의 표적 염기 서열을 디자인 한 뒤 screening을 진행하였다. 표 1의 Antisense와 sense RNA 염기서열들을 합성한 다음, annealing하여 24종의 lasiRNA 구조체들을 합성하였다.
| 서열번호 1 | lasiRNA(#1) S : 5' CAUAUGUCUAAGGAAA 3' |
| 서열번호 25 | lasiRNA(#1) AS : 5' UUUCCUUAGACAUAUGGGCUUAGGGGAAAAU 3' |
| 서열번호 2 | lasiRNA(#2) S : 5' CCAAACUGCACAGAGA 3' |
| 서열번호 26 | lasiRNA(#2) AS : 5' UCUCUGUGCAGUUUGGUCCCCUUUUGCCUUU 3' |
| 서열번호 3 | lasiRNA(#3) S : 5' AGAACCUGAUGGAGAA 3' |
| 서열번호 27 | lasiRNA(#3) AS : 5' UUCUCCAUCAGGUUCUUAGAGGAGCACAGGC 3' |
| 서열번호 4 | lasiRNA(#4) S : 5' GAAAUCUGGAGAGACA 3' |
| 서열번호 28 | lasiRNA(#4) AS : 5' UGUCUCUCCAGAUUUCAGAUCCCCCAAGCAG 3' |
| 서열번호 5 | lasiRNA(#5) S : 5' AUACACUGGAAGGAUU 3' |
| 서열번호 29 | lasiRNA(#5) AS : 5' AAUCCUUCCAGUGUAUUUCUAAAGCUGAAAU 3' |
| 서열번호 6 | lasiRNA(#6) S : UGG AGA AAG AGG AUU A |
| 서열번호 30 | lasiRNA(#6) AS : UAAUCCUCUUUCUCCAUGAGGAGUGGCUGCU |
| 서열번호 7 | lasiRNA(#7) S : CAAUGUCCCAGGUACA |
| 서열번호 31 | lasiRNA(#7) AS : UGUACCUGGGACAUUGUUCCAUUCAUAUAGA |
| 서열번호 8 | lasiRNA(#8) S : AAGAACCUGAUGGAGA |
| 서열번호 32 | lasiRNA(#8) AS : UCUCCAUCAGGUUCUUAGAGGAGACACAGGC |
| 서열번호 9 | lasiRNA(#9) S : UCUGGUUCCAUGGAUA |
| 서열번호 33 | lasiRNA(#9) AS : UAUCCAUGGAACCAGAUUCAUAUUGGGUCAA |
| 서열번호 10 | lasiRNA(#10) S : CCAAAGAUCUGGGCUA |
| 서열번호 34 | lasiRNA(#10) AS : UAGCCCAGAUCUUUGGAUGGAAGAAAUAAAU |
| 서열번호 11 | lasiRNA(#11) S : UAAUCCUGGAAACCAU |
| 서열번호 35 | lasiRNA(#11) AS : AUGGUUUCCAGGAUUACGCCGUAAAGGUCCC |
| 서열번호 12 | lasiRNA(#12) S : CUGAAAUCUGGAGAGA |
| 서열번호 36 | lasiRNA(#12) AS : UCUCUCCAGAUUUCAGAUCCCCCAAGCAGUG |
| 서열번호 13 | lasiRNA(#13) S : CAUUUGUUGACAGUAU |
| 서열번호 37 | lasiRNA(#13) AS : AUACUGUCAACAAAUGCAUGGUGAAGAAGAA |
| 서열번호 14 | lasiRNA(#14) S : GCAACUUCAUGGGAUU |
| 서열번호 38 | lasiRNA(#14) AS : AAUCCCAUGAAGUUGCCAGAGCACUGGCAGG |
| 서열번호 15 | lasiRNA(#15) S : UAAAGCUGCCAAUUUC |
| 서열번호 39 | lasiRNA(#15) AS : GAAAUUGGCAGCUUUAUCCAUGGAACCAGAU |
| 서열번호 16 | lasiRNA(#16) S : AGAAGUUUAUCCAGAA |
| 서열번호 40 | lasiRNA(#16) AS : UUCUGGAUAAACUUCUUGAAGAGGACGGUGC |
| 서열번호 17 | lasiRNA(#17) S : AUAAAGCUGCCAAUUU |
| 서열번호 41 | lasiRNA(#17) AS : AAAUUGGCAGCUUUAUCCAUGGAACCAGAUU |
| 서열번호 18 | lasiRNA(#18) S : CUAUGGCCAAAUGAAA |
| 서열번호 42 | lasiRNA(#18) AS : UUUCAUUUGGCCAUAGGUCCCUAUGGGGAUG |
| 서열번호 19 | lasiRNA(#19) S : CAAAGCAGCAUGCACA |
| 서열번호 43 | lasiRNA(#19) AS : UGUGCAUGCUGCUUUGAGAUCCGCUAUGGCA |
| 서열번호 20 | lasiRNA(#20) S : UACCACUGUACAGAAA |
| 서열번호 44 | lasiRNA(#20) AS : UUUCUGUACAGUGGUAUAAAAGGAACCAUGU |
| 서열번호 21 | lasiRNA(#21) S : GGUUCCUGUCAGAAUA |
| 서열번호 45 | lasiRNA(#21) AS : UAUUCUGACAGGAACCUCUGCCUGAAAGCUG |
| 서열번호 22 | lasiRNA(#22) S : CCUAUGGCCAAAUGAA |
| 서열번호 46 | lasiRNA(#22) AS : UUCAUUUGGCCAUAGGUCCCUAUGGGGAUGA |
| 서열번호 23 | lasiRNA(#23) S : AAUCUGGAGAGACAUU |
| 서열번호 47 | lasiRNA(#23) AS : AAUGUCUCUCCAGAUUUCAGAUCCCCCAAGC |
| 서열번호 24 | lasiRNA(#24) S : UCCACUUACUGGGAUA |
| 서열번호 48 | lasiRNA(#24) AS : UAUCCCAGUAAGUGGACUAGCAAAUCCUUCC |
각 lasiRNA 염기 서열들의 타이로시나아제 mRNA발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 각 구조들을 A375세포주(한국 세포주 은행)에 10nM 또는 1nM 로 transfection 한 뒤 Real-time PCR로 타이로시나아제 mRNA 발현 정도를 측정하였다.
즉, A375세포주를 100mm petri dish에 10% fetal bovine serum (Gibco), 100μg/ml penicillin/streptomycin을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)에서 배양하였다. A375의 경우 transfection하기 직전에 12-well plate에 8X104개의 세포를 seeding하였다. 한편, 상기 lasiRNA의 경우 1X siRNA duplex buffer (STpharm)에 알맞은 농도로 희석하여 90℃에서 2분, 37℃에서 1시간 incubation하였다. Annealing된 siRNA들은 10% polyacrylamide gel에 전기영동 한 후, EtBr에서 5분 staining하여 UV transiluminator를 통해 밴드를 확인하였다. 이들은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)에서 제공하는 manual에 기초하여 siRNA를 transfection한 뒤 24시간 후에 mRNA level을 측정하였다.
이때, transfection 후 Isol-RNA lysis reagent (5PRIME)를 사용하여 total RNA를 추출하였고, 그 중 500ng의 RNA를 cDNA합성에 사용하였다. cDNA는 High-capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems)을 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 합성되었다. 합성된 cDNA는 dilution을 통해 농도를 낮춘 후, step one real-time PCR system (Applied Biosystems)을 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 정량적인 real-time PCR에 이용하였다. 표적유전자는 유전자에 특이적인 primer와 함께 power SYBR green PCR master Mix(Applied Biosystems)를 이용하여 확인하였다.
실험에 사용된 primer 염기서열은 다음과 같다.
Human GAPDH-forward 5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3' (서열번호 49)
Human GAPDH-reverse 5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3'(서열번호 50)
Human 타이로시나아제-forward : 5'-GGA TCT GGT CAT GGC TCC TT-3'(서열번호 51)
Human 타이로시나아제)-reverse : 5'-GTC AGG CTT TTT GGC CCT AC-3' (서열번호 52)
24개의 염기 서열에 대한 screening 결과, 총 24개의 염기서열 중 8번, 14번, 18번, 21번, 22번 5개의 염기서열이 가장 높은 효율로 표적 유전자인 타이로시나아제 mRNA의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며(도 2), 상기 5종의 lasiRNA를 이용하여 후속 연구를 진행하였다.
타이로시나아제를 타겟으로 한 lasiRNA들의 타이로시나아제 단백질 억제 효능 및 타이로시나아제 activity 억제 효능.
타이로시나아제를 표적으로 하는 상위 5종의 lasiRNA가 단백질 수준에서 효과적으로 tyrosianse의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여, Human melanoma 세포주인 MNT-1 cell에 lasiRNA를 10nM 로 transfection 후 western blot을 통하여 타이로시나아제 단백질의 발현을 확인하였다.
즉, MNT-1 세포를 100mm petri dish에 20% fetal bovine serum (Gibco), 100μg/ml penicillin/streptomycin을 첨가한 media (295ml MEM + 50ml DMEM + 20% FBS + 50ml HEPES(200mM) + 1% P/S)에서 배양하였다. MNT-1의 경우 transfection하기 직전에 12-well plate에 8X104개의 세포를 seeding 하였다.
한편, 상기 lasiRNA의 경우 1X siRNA duplex buffer (STpharm)에 알맞은 농도로 희석하여 90℃에서 2분, 37℃에서 1시간 incubation하였다. Annealing된 siRNA들은 10% polyacrylamide gel에 전기영동 한 후, EtBr에서 5분 staining하여UV transiluminator를 통해 밴드를 확인하였다. 이들은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)에서 제공하는 manual에 기초하여 lasiRNA를 transfection한 뒤 72시간 후에 western blot과 타이로시나아제 assay를 수행하였다.
Western blot의 경우, lasiRNA transfection 72시간 뒤 세포을 거둬 RIPA buffer (GE)에 lysis하여 단백질을 얻었다. 모든 sample에서 15ug의 단백질을 12% PAGE gel에 loading하여 120V로 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 뒤 gel상에서 separating된 단백질들은 미리 methanol (Merck)에 activation해 둔 PVDF membrane (Bio-rad)으로 1시간 동안 300mA로 transfer 하였다. Membrane은 5 % skim milk (서울우유)로 상온에서 1시간동안 blocking 한 뒤, anti-타이로시나아제 (Santa cruz), anti-β-actin (Santa cruz)가 각각 1:200, 1:1000의 비율로 희석되어있는 5 % skim milk에 담가져 4℃에서 overnight shaking incubation하였다. 다음날 1X TBST (바이오 세상)로 10분간 3회 membrane을 washing 한 다음, secondary antibody(HRP-conjugated, 타이로시나아제/anti-goat, β-actin/anti-mouse, Santa cruz)를 1:10000의 비율로 5 % skim milk에 희석하여 1시간 동안 상온에서 incubation하였다. 1X TBST로 10분간 3회 washing 해 준 뒤 1X ECL (Thermo)에 1분간 반응시켜 chemidoc (Bio-rad)으로 타이로시나아제와 β-actin band를 detection하여 단백질의 발현을 확인하였다(도 2).
그 결과, siRNA, lasiRNA를 처리한 모든 세포주에서 70% 이상 타이로시나아제 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 2). 또한 음성 대조군인 siRNA (scram)과 lasiRNA (scram)에서는 타이로시나아제의 발현이 변화하지 않는 것으로 나타났으며, 이를 통하여 lasiRNA 타이로시나아제들이 염기서열 특이적으로 표적 단백질인 타이로시나아제의 발현을 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 타이로시나아제의 inhibitor인 하이드로퀴논(hydroquinone)은 타이로시나아제의 발현에 거의 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. 실험에 사용된 siTYR과 siRNA (Scram), lasiRNA(Scram)의 염기서열은 다음과 같다.
| 서열번호 53 | siTYR S : 5' AGACGACUCUUGGUGAGAA(dTdT) 3' |
| 서열번호 54 | siTYR AS : 5' UUCUCACCAAGAGUCGUCU(dTdT) 3' |
| 서열번호 55 | siRNA (Scram) S : 5' AGGAGCAGAAGUCGGCCAA(dTdT) 3' |
| 서열번호 56 | siRNA (Scram) AS : 5' UUGGCCGACUUCUGCUCCU(dTdT) 3' |
| 서열번호 57 | lasiRNA (Scram) S : 5' CUUACCGACUGGAAGA 3' |
| 서열번호 58 | lasiRNA(Scram)AS: 5' UCUUCCAGUCGGUAAGCCGCGAGGGCAGGCC 3' |
타이로시나아제 assay의 경우, lasiRNA transfection 72시간 뒤 세포를 거둬 PBS (Gibco)를 사용하여 세포를 2회 세척한 다음, 1% triton X-100 (sigma) 용액을 이용하여 세포를 용해하였다. 이 중 100ug의 단백질을 96 well에 넣어 준 다음, 2mM L-DOPA(3,4-Dihydroxy-L-Phenylalanine, sigma)와 1시간 동안 반응 후 490nm에서 흡광을 측정하여 타이로시나아제의 활성을 측정하였다. 대조군으로는 10uM의 하이드로퀴논(sigma)을 처리한 세포주를 사용하여 타이로시나아제 assay를 진행하였다.
그 결과 하이드로퀴논(Hydroquinone)의 경우 10uM에서 약 30% 정도의 타이로시나아제 활성 억제 효과를 갖는 것으로 확인되었다. lasiRNA의 경우 5종의 lasiRNA 모두 10nM에서 80% 이상 타이로시나아제의 활성을 저해하는 것으로 확인되어, 기존에 가장 많이 사용되는 미백 시약인 하이드로퀴논(10uM)에 비하여 1,000배 이상 낮은 10nM 농도 에서도 더 효과적으로 타이로시나아제에 의한 멜라닌 색소의 형성을 억제할 수 있음을 확인하였다(도 3).
Melanoma에서 타이로시나아제표적 lasiRNA의 미백 효능 검증.
타이로시나아제를 표적으로 하는 lasiRNA가 세포주에서 미백 효과가 있는지 확인하기 위하여 melanoma세포주인 MNT-1에 lasiRNA #22를 처리후 세포주의 색 변화를 관찰하였다. 실시예 2와 동일하게 MNT-1에 lasiRNA #22를 10nM로 transfection 한 후 72시간 뒤에 세포를 침전하여 색 변화를 관찰하였다. 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 (0nM) 대조군에 비하여 lasiRNA #22를 처리한 세포에서 확연히 검은색 색소가 사라진 것을 확인할 수 있었다(도 4).
또한 lasiRNA #22를 처리한 세포주는 양성 대조군인 하이드로퀴논(hydroquinone)을 처리한 세포주에 비해서도 더 밝은 색을 나타내는 것으로 확인되어, 타이로시나아제 표적 lasiRNA가 기존의 미백제품보다 더 뛰어난 색소 침착 방지 효과 및 미백효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 내용은 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점을 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> OliX Pharmaceuticals, Inc.
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Active Ingredient
<130> PN131356KR
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ggatctggtc atggctcctt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human tyrosinase-reverse
<400> 52
gtcaggcttt ttggccctac 20
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siTYR Sense
<220>
<221> mutation
<222> (20)..(21)
<223> t is 3-deoxy thymine.
<400> 53
agacgacucu uggugagaat t 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siTYR Antisense
<220>
<221> mutation
<222> (20)..(21)
<223> t is 3-deoxy thymine.
<400> 54
uucucaccaa gagucgucut t 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA (Scram) Sense
<400> 55
aggagcagaa gucggccaat t 21
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA (Scram) Antisense
<400> 56
uuggccgacu ucugcuccut t 21
<210> 57
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lasiRNA (Scram) Sense
<400> 57
cuuaccgacu ggaaga 16
<210> 58
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lasiRNA (Scram) Antisense
<400> 58
ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31
Claims (15)
- (ⅰ) 센스가닥 서열번호 8과 안티센스가닥 서열번호 32를 포함하는 lasiRNA;
(ⅱ) 센스가닥 서열번호 14와 안티센스가닥 서열번호 38을 포함하는 lasiRNA;
(ⅲ) 센스가닥 서열번호 18과 안티센스가닥 서열번호 42를 포함하는 lasiRNA;
(ⅳ) 센스가닥 서열번호 21과 안티센스가닥 서열번호 45를 포함하는 lasiRNA; 및
(ⅴ) 센스가닥 서열번호 22와 안티센스가닥 서열번호 46을 포함하는 lasiRNA로 구성된 군에서 선택되는 lasiRNA(long asymmetric siRNA).
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 lasiRNA는 타이로시나아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제1항에 있어서, 상기 lasiRNA의 센스가닥 중 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하지 않는 단일 가닥 영역은, 링커에 의하여 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 영역에 연결되는 것을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제8항에 있어서, 상기 링커는 핵산(a nucleic acid moiety), PNA(PNA moiety), 펩타이드(peptide moiety), 다이설퍼이드 결합(a disulfide bond) 및 폴리에틸렌 글리콜(a polyethylene glycol moiety)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 화학적 링커(화학적 linker)인 것을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제1항에 있어서, 상기 lasiRNA는 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제10항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 lasiRNA에 포함되는 1종 이상의 뉴클레오티드 중 리보스의 2′ 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제10항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 lasiRNA에 포함되는 1종 이상의 뉴클레오티드 중 포스페이트 백본이 phosphorothioate form, phosphorodithioate form, alkylphosphonate form, phosphoroamidate form 및 boranophosphate form 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제10항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 상기 lasiRNA에 포함되는 1종의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), Morpholino 및 PNA(peptide nucleic acid) 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제10항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 상기 lasiRNA가 지질, 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide) 및 세포 표적 리간드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상과 결합하는 것을 특징으로 하는 lasiRNA.
- 제1항, 및 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항의 lasiRNA를 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물.
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Applications Claiming Priority (1)
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-
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Non-Patent Citations (1)
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20200308 Patent event code: PE09021S01D |
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