CN101921745B - Matp基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了MATP基因的干扰靶位点序列，用于抑制MATP基因表达的小核酸，以及含有该小干扰核酸的化妆品组合物和该小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。本发明提供的小干扰核酸对MATP基因表达的抑制活性高，能够有效地抑制黑色素生成和沉积。

Description

MATP基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用

技术领域

本发明是关于MATP基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用，更确切地说，本发明涉及MATP基因的干扰靶位点序列，用于抑制MATP基因表达的小核酸，以及含有该小干扰核酸的化妆品组合物和该小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。

背景技术

黑色素(melanin)是由黑素细胞合成的一种生物多聚体，由皮肤、毛囊、虹膜和视网膜的黑色素细胞产生，分为黑棕色的真黑素和红黄色的褐黑素。动物与人的皮肤和毛发颜色与黑素体的数目，大小，和分布等都有直接的关系。过量的黑色素会使皮肤变黑，而非均匀分布的黑色素会导致黄褐斑和雀斑的产生。

随着生活水平和生活质量的提高，人们对美的关注也日益增强，美白、去斑就是其中很重要的一项内容。因此，开发一种能够抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的产品称为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供MATP基因的干扰靶位点序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于抑制MATP基因表达的小干扰核酸。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述小干扰核酸的化妆品组合物。

本发明的第四个目的是提供所述小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。

RNA干扰技术的出现为抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素提供了一种新的途径。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应基因的表达或使该基因沉默的过程。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，称为小分子干扰RNA(小干扰核酸)。双链小干扰核酸与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在RNA干扰过程中，双链小干扰核酸中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的相应位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。

本发明人对黑色素的合成以及沉积进行了细致的研究，发现黑色素是由多个基因相互协调并经过一系列复杂的生理生化过程合成，这些与色素沉着相关的基因参与黑色素的合成、运输和分布。在与黑色素生成有关的一系列基因中，MATP基因是其中很重要的一个基因。

MATP(membrane-associated transporter protein)基因全长约40kb，含有7个外显子和6个内含子。小鼠15号染色体上的UW基因(Underwhite Gene)与人MATP基因同源，目前已报道多种UW基因突变，这些突变都导致小鼠眼和皮毛不同程度的色素缺乏。MATP基因变异小鼠的黑素细胞内有相对正常小鼠同样数量的的酪氨酸酶，但其活性却只有正常小鼠细胞的20％，黑素体内聚集的酪氨酸酶也比正常细胞少，这直接影响到黑素体中黑色素的合成。UW突变等位基因所致的色素缺乏说明其编码的蛋白对哺乳动物色素沉着起决定性作用。

MATP基因编码由530个氨基酸残基构成的蛋白，该蛋白是一种为黑素瘤反应性T细胞(melanoma-reactive T-cells)所识别的抗原。

MATP蛋白为跨膜蛋白，其结构与转运蛋白相似，分子量约58kDa，含有12个跨膜区，在多数黑色素细胞系中表达。MATP蛋白具有运载包括酪氨酸酶在内的其他分子出入黑素细胞膜的功能。

MATP基因与色素沉着有密切的关系，其编码的MATP蛋白对哺乳动物色素沉着起决定性作用，因此，通过RNA干扰而专一性地抑制MATP基因的表达，从而沉默MATP基因的活性，是抑制黑色素合成、改善皮肤颜色的有效途径。

本发明提供了MATP基因的干扰靶位点序列，其中，该靶序列具有如SEQ ID Nos：2-10中之一所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸包括能够在严格条件下与所述干扰靶位点序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，其中，该化妆品组合物含有所述小干扰核酸作为活性成分。

本发明还提供了所述小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。

本发明提供的小干扰核酸对MATP基因表达的抑制活性高，能够有效地抑制黑色素生成和沉积。例如，本发明提供的小干扰核酸MATP-1至MATP-18能够高效的抑制MATP基因的表达，这说明本发明提供的小干扰核酸用于抑制MATP基因的表达时，对MATP基因表达的抑制活性较高。

具体实施方式

本发明提供了MATP基因的干扰靶位点序列，其中，该靶序列具有如SEQ ID Nos：2-10中之一所示的核苷酸序列。优选情况下，所述靶序列具有如SEQ ID No：3、SEQ ID No：5或SEQ ID No：8所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸能够通过作用于权利要求1所述的靶位点序列而抑制P基因的表达，该小干扰核酸的GC含量为35-60％。

所述MATP基因全长约40kb，含有7个外显子和6个内含子。MATP基因编码由530个氨基酸残疾构成的蛋白，该蛋白为跨膜蛋白，分子量约58kDa，含有12个跨膜区，在多数黑色素细胞系中表达。MATP基因的突变将直接影响到黑素体中黑色素的合成。因此，通过RNA干扰而专一性地抑制MATP基因的表达，从而沉默MATP基因的活性，是抑制黑色素合成、改善皮肤颜色的有效途径。

根据本发明的一个方面，所述小干扰核酸为包括正义链和反义链的双链分子，所述正义链和反义链的长度分别为15-27个核苷酸；优选情况下，所述正义链和反义链的长度分别为19-21个核苷酸。

在本发明此方面的优选实施方式中，所述小干扰核酸具有MATP-1、MATP-2、MATP-3、MATP-4、MATP-5、MATP-6、MATP-7、MATP-8或MATP-9所示的核苷酸序列，或者具有对MATP-1、MATP-2、MATP-3、MATP-4、MATP-5、MATP-6、MATP-7、MATP-8或MATP-9所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，

MATP-1正义链：5’-CCACCAGCAGACUCAUCAUdTdT-3’

      反义链：5’-AUGAUGAGUCUGCUGGUGGdTdT-3’；

MATP-2正义链：5’-GCAUGGCUCUGUACCUCAAdTdT-3’

      反义链：5’-UUGAGGUACAGAGCCAUGCdTdT-3’；

MATP-3正义链：5’-CCAAGGAGGAAGCUGGUUUdTdT-3’

      反义链：5’-AAACCAGCUUCCUCCUUGGdTdT-3’；

MATP-4正义链：5’-CCCAUCAAAGCCUACUUAUdTdT-3’

      反义链：5’-AUAAGUAGGCUUUGAUGGGdTdT-3’；

MATP-5正义链：5’-GGAAUGUACGAGUAUGGUUdTdT-3’

      反义链：5’-AACCAUACUCGUACAUUCCdTdT-3’；

MATP-6正义链：5’-GGUUCUAUCGAGAAAGUUAdTdT-3’

      反义链：5’-UAACUUUCUCGAUAGAACCdTdT-3’；

MATP-7正义链：5’-CCAUGUUCGGAAGAGAGUUdTdT-3’

      反义链：5’-AACUCUCUUCCGAACAUGGdTdT-3’；

MATP-8正义链：5’-UGUACAGCAUUGUGUGGUUdTdT-3’

      反义链：5’-AACCACACAAUGCUGUACAdTdT-3’；

MATP-9正义链：5’-GCUGUUGCUUUGUCGCUCUdTdT-3’

      反义链：5’-AGAGCGACAAAGCAACAGCdTdT-3’。

优选情况下，所述小干扰核酸具有MATP-2、MATP-4或MATP-7所示的核苷酸序列。

根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：

(1)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰；

(3)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。

所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定小干扰核酸结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式3所示；2’-氧甲基修饰，如式4所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4’-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’-氨基修饰，如式8所示；2’-脱氧修饰，如式9所示。

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式10所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2，6-二氨基嘌呤修饰，如式13所示。

这些修饰可以增加所述小干扰核酸的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。

此外，为了促进小干扰核酸进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。

本发明提供的小干扰核酸的制备方法包括小干扰核酸序列的设计和小干扰核酸的制备。

所述小干扰核酸序列的设计是指在MATP基因cDNA序列(Genbank登记号为NM-016180)的1-1744bp的范围内选取19bp长度的核苷酸序列。19bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则：(1)GC含量在35-55％之间，(2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，(3)避免出现4个以上的连续碱基序列，(4)避免含有单核苷酸多态性位点，(5)避免处于读码框起始密码和终止密码的50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对MATP基因具有特异的抑制作用。

之后将这样获得的19bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，在此19bp核苷酸序列的互补序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。

根据本发明，所述小干扰核酸的制备方法为本领域技术人员所公知，例如，所述小干扰核酸可以通过化学合成得到，或者通过质粒和/或病毒载体的表达而得到。

所述小干扰核酸序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海GenePharma公司进行合成。

一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。

例如，具有MATP-1所示核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如下：

(1)寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的合成是在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上进行，根据MATP-1所示的核苷酸序列(正义链：5’-CCACCAGCAGACUCAUCAUdTdT-3’，反义链：5’-AUGAUGAGUCUGCUGGUGGdTdT-3’)的顺序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于小干扰核酸是由一段19个寡聚核糖核苷酸和2个脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上5’位的保护基在三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05M碘水作用下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如，羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护

将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇/胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出溶液，并将固相再次用双蒸水淋洗，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。

(3)纯化分离

将小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过反应C18高压液相色谱的分离，运用梯度淋洗的方法，收集小干扰核酸主产物(淋洗液A：0.1M乙酸铵；淋洗液B：20％的0.1M乙酸铵和80％的乙腈)，除去主产物中的溶剂，并加入5毫升80％的乙酸水溶液，在室温静置15分钟，然后将此溶液进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的小干扰核酸(梯度淋洗，淋洗液A：0.025M的Tris-HCl，0.025M的NaCl，pH＝8，5％的乙腈；淋洗液B：0.025M的Tris-HCl，2.0M的NaCl，pH＝8，5％的乙腈)。

(4)脱盐无菌消毒

纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以备随时使用。

根据本发明提供的用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，该化妆品组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。

根据本发明，所述化妆品组合物还含有载体。

本发明中，所述小干扰核酸与载体的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相对于100重量份的小干扰核酸，所述载体的含量为1000-10000000重量份；进一步优选为，相对于100重量份的小干扰核酸，所述载体的含量为2000-100000重量份。

本发明中，对所述载体没有特别的限制，可以是任何用于化妆品组合物的载体，例如可以为动植物油、烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种；例如，所述动植物油可以为貂油、鳖油、大豆油、芝麻油、玉米油、油菜籽油、棉籽油、橄榄油和蓖麻油中的一种或几种；所述烃油可以为石蜡油、异三十六烷和凡士林中的一种或几种；所述酯可以为棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、异壬酸异壬酯、2-乙基己基棕榈酸酯、2-己基癸基月桂酸酯和2-辛基十二烷基肉豆蔻酸酯中的一种或几种；所述高级脂肪酸可以为棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸中的一种或几种；高级脂肪醇可以为鲸蜡醇和/或十八烷醇。

根据本发明，所述化妆品组合物还含有其它用于化妆品组合物的成分。

本发明中，所述小干扰核酸与其它用于化妆品组合物的成分的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相对于100重量份的小干扰核酸，所述其它用于化妆品组合物的成分的含量为1000-10000000重量份；进一步优选为，相对于100重量份的小干扰核酸，所述其它用于化妆品组合物的成分的含量为2000-100000重量份。

本发明中，对所述其它用于化妆品组合物的成分没有特别的限制，例如，可以为保湿剂、着色剂、防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、表面活性剂和佐剂中的一种或几种。

本发明中，对所述保湿剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的保湿剂，例如，所述保湿剂可以为丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨醇、己二醇、1，3-丁二醇和甘油中的一种或几种。

本发明中，对所述着色剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的着色剂，例如，所述着色剂可以为胭脂红、滑石、云母、碳酸镁、碳酸钙、硅酸镁、二氧化硅、氧化锌和群青中的一种或几种。

本发明中，对所述增稠剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的增稠剂，例如，所述增稠剂可以为蜂蜡、小烛树蜡、鲸蜡、微晶蜡、淀粉、黄原胶、阿拉伯胶、瓜尔胶、果胶和膨润土中的一种或几种。

本发明中，对所述防腐剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的防腐剂，例如，所述防腐剂可以为苯甲酸、水杨酸、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯和间苯二酚中的一种或几种。

本发明中，对所述抗氧化剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的抗氧化剂，例如，所述抗氧化剂可以为抗坏血酸、维生素A、β-胡萝卜素、维生素B、半胱氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢酶、柠檬酸和二茶酚中的一种或几种。

本发明中，对所述表面活性剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的表面活性剂，例如，所述表面活性剂可以为脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、烷基苯磺酸钠、磺基琥珀酸二烷基酯、N-酰基谷氨酸和聚氧乙烯烷基硫酸钠中的一种或几种。

所述佐剂的种类没有特别的限制，可以为各种能够用于化妆品组合物的佐剂，例如，所述佐剂可以为维生素B3、海藻提取物、氮酮、海藻糖、双咪唑烷基脲和透明质酸中的一种或几种。

所述化妆品组合物可以为各种常规的化妆品组合物的形式，例如，可以为乳剂、膏剂、液剂、气雾剂或粉剂。所述化妆品组合物为外用剂，可以用于身体各个部位的皮肤，例如脸部、颈部、手臂、躯干(胸部、腹部和背部)、腿部、手部和脚部。

本发明还提供了一种小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用，其中，所述小干扰核酸为本发明提供的小干扰核酸。

本发明提供的小干扰核酸、化妆品组合物和应用可以用于防止、改善、和祛除皮肤的色素沉淀，以达到防止、改善、和祛除不理想或不健康的皮肤以及美白皮肤的目的。并且，本发明的小干扰核酸能够特异、高效、稳定地特异抑制MATP蛋白的表达，本发明提供的小干扰核酸能够广泛地用于制备各种用于防止、改善、和祛除皮肤的色素沉淀相关的药品或化妆品。并且本发明提供的小干扰核酸、化妆品组合物等可以直接涂抹或转载到作用部位。

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。

实施例1

小干扰核酸的合成

在MATP基因的cDNA序列(Genebank登记号为NM-016180)的1-1744bp的范围内选取19bp长度的核苷酸序列。19bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则：(1)GC含量在35-55％之间，(2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，(3)避免出现4个以上的连续碱基序列，(4)避免含有单核苷酸多态性位点，(5)避免处于读码框起始密码和终止密码的50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对MATP基因具有特异的抑制作用。

之后将这样获得的19bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，在此19bp核苷酸序列的互补序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。

设计好的小干扰核酸经上海吉玛(GenePharma)公司进行化学合成，得到小干扰核酸MATP-1至MATP-9，所述小干扰核酸MATP-1至MATP-9的核苷酸序列如表1所示。

表1

所述攻击范围是指该小干扰核酸在序列表第1号序列中的相对应位置。

实施例2

(1)黑素细胞的培养

用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，在六孔细胞培养板上以5×10⁶个细胞/孔的密度接种SK-MEL-3黑色素肿瘤细胞(北京百星高科技术开发有限公司)，在温度为37℃及CO₂含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。

(2)小干扰核酸的转染

使用Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000脂质体对实施例1得到的小干扰核酸MATP-1至MATP-9分别进行转染，以无关小干扰核酸(正义链：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3；反义链：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)作为阴性对照。具体操作步骤如下：将小干扰核酸溶解于无RNA酶的无菌水中，配制成浓度为20μmol/L的溶液。将SK-MEL-3黑色素瘤细胞接种至24孔板中，用OptiMEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)稀释成浓度为8×10⁵个细胞/ml，每孔500μl。分别将1.5μl小干扰核酸(20μmol/L)稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，将1μl Lipofectamine^TM 2000脂质体稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，，然后将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合，混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl该混合溶液加到接种有细胞的所述24孔板中。小干扰核酸的最终浓度是50nM。细胞37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，然后在37℃下再培养24小时。

(3)抑制活性检测

通过RT-PCR分别检测转染了小干扰核酸MATP-1至MATP-9的SK-MEL-3黑色素瘤细胞中MATP基因mRNA的表达量，具体步骤为：

用1ml TRIzol(GIBCOL公司)裂解转染小干扰核酸的SK-MEL-3黑色素瘤细胞，并提取总RNA，提取总RNA的具体步骤为：将转染后的细胞在37℃温度下，及CO₂含量为5％的培养箱中培养24小时，离心收集细胞，去除上清，并用预冷的PBS洗一遍；所述PBS的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO44.3mmol/L，KH₂PO41.4mmol/L；每孔加入1ml Trizol裂解细胞3分钟；吹打细胞，将裂解物转移到1.5ml EP管中，室温放置10分钟；加入200μl氯仿，在振荡器上剧烈震荡15秒，室温放置10分钟；12000rpm 4℃离心20分钟；取上清约300-500μl放于一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，-30℃沉淀过夜；12,000rpm，4℃离心10分钟。去上清，1ml 75％乙醇洗一次；12,000rpm，4℃离心10分钟；吸去上清，干燥RNA沉淀10分钟；加入20μl DEPC水溶解RNA。

将2单位的DNase I(RNase-free)(TakaRa公司)加入至总RNA中，并在37℃条件下静置30分钟，以除去总RNA中残留的DNA。经过DNase I处理后，对总RNA进行提纯，提纯的具体步骤为：(采用Invitrogen公司PureLinkMicro-to-Midi Total RNA Purification Kit)，在总RNA中加入等体积的70％乙醇，振荡混合均匀，将混合物转移至纯化柱上，室温12000g离心15秒，弃过滤液，加入700μl清洗缓冲液I，室温12000g离心15秒，弃过滤液，加入500μl清洗缓冲液II，室温12000g离心15秒，弃过滤液，再加入500μl清洗缓冲液II，室温12000g离心15秒，弃过滤液，室温12000g离心1分钟，将纯化柱转移至RNA收集管上，加入30μlDEPC水，室温放置1分钟，室温13000g离心2分钟，丢弃纯化柱，将RNA样品至于-80℃保存。

对提纯后得到的总RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为Promega公司的M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为：将1ug提纯后的总RNA与0.5ug的Oligo dT在试管中进行混合，用DEPC水将总体积补足至16.25μl，将试管进行加热，加热的条件包括加热温度为70℃，加热时间为5分钟；然后将试管迅速冷却至0℃，并加入缓冲液(5×MLVbuffer 5μl，10mM Dntp 1.25μl，RNasin 0.5μl，M-MLV 1μl)，在42℃条件下孵育1小时，得到cDNA。

将得到的cDNA作为PCR反应的模板，进行Real-time PCR反应。Real-time PCR反应体系为：ddH₂O 17.5μl，10mM Dntp 0.5μl，10×Taq buffer2.5μl，Taq 0.5μl，F primer 0.5μl，R primer 0.5μl，Syber Green I 1μl，cDNA 2μl；PCR反应的条件为：94度2分钟，94度15秒，60度30秒，共40个循环。根据Real-time PCR反应的Ct值确定小干扰核酸的抑制活性，结果如表2所示。

小干扰核酸抑制活性＝[1-(小干扰核酸转染后的MATP基因的拷贝数/小干扰核酸转染后的GAPDH拷贝数)/(对照孔MATP基因的拷贝数/对照孔GAPDH拷贝数)]×100％。

GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶基因。3-磷酸甘油醛脱氢酶基因是细胞中的看家基因，在细胞中稳定表达，不受其他外加因素的影响，因此作为荧光定量PCR反应的内参照。

表2

从表2可以看出，本发明提供的小干扰核酸MATP-1至MATP-9能够高效的酪氨酸酶基因的表达，特别是小干扰核酸MATP-2、MATP-4和MATP-7对MATP基因的抑制活性达分别到82％、85％和86％，说明本发明提供的小干扰核酸用于抑制MATP基因的表达时，对MATP基因表达的抑制活性高。

实施例3

黑素细胞内黑色素含量的抑制

(1)黑素细胞的培养

选用SK-MEL-3黑色素瘤细胞进行培养，具体培养过程为：用含有15％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100μ/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液在37℃条件下，及CO₂含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。

(2)黑色素含量检测

分别检测小干扰核酸MATP-1至MATP-9对黑色素含量的抑制效果，具体步骤如下：

以每孔2×10⁵细胞/1mL接种于6孔培养板，每孔分别加入小干扰核酸和Lipofectamine^TM2000脂质体(Invitrogen)进行转染，小干扰核酸的最终浓度为50nM。以无关小干扰核酸(正义链：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3；反义链：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)作为阴性对照。转染后72小时弃培养基，用pH7.4的PBS洗涤2次，所述PBS的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO44.3mmol/L，KH₂PO41.4mmol/L；然后每孔加500μL浓度为1重量％的TritonX-100溶液，所述TritonX-100溶液的组成为99ml水、1ml TritonX-100；迅速放置于-80℃中，冻存30分钟；随后室温融化使细胞完全破裂，离心，沉淀用浓度为10重量％的三氯乙酸和无水乙醇各洗涤1次，12000×g离心5分钟，弃上清液，最后加入1M NaOH(含10％体积DMSO)在80℃水浴保温2小时后于405nm测吸光度值并计算黑色素含量的抑制率，结果如表3所示。

黑色素含量抑制率＝[1-[(小干扰核酸转染后的孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]]×100％

表3

从表3可以看出，本发明提供的小干扰核酸MATP-1至MATP-9能够显著的提高黑色素含量的抑制率，特别是通过小干扰核酸MATP-2、MATP-4和MATP-7，说明本发明提供的小干扰核酸能够显著的提高黑色素含量的抑制率。

实施例4

人体皮肤的美白效果检验

为了增强小干扰核酸的稳定性，委托上海吉玛公司合成化学修饰的小干扰核酸MATP-1至MATP-9。其中，化学修饰是指对小干扰核酸MATP-1至MATP-9正义链的U、C和G核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氧甲基修饰，反义链U和C核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氟代修饰。

然后按表4所示的组成将各组分混合，然后搅拌均匀得到组合物1-9，以评价含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分的组合物的临床美白效果。

表4

选择20名健康的年龄在18-55岁之间的女性志愿者，在志愿者的臀部利用GS2006型日光模拟器(中国北京奥华设备有限公司)诱导皮肤的黑化，诱导黑化的时间为1小时，形成直径1.0cm的黑化斑点，明显黑于未黑化皮肤的肤色；之后，分别使用组合物1-9施用于黑化的皮肤，早、晚各一次，每次用量为0.5ml，并在施用后每一个月的最后一天观察黑化皮肤颜色的变化，结果如表5所示。

表5

组合物编号

1个月

2个月

3个月

4个月

5个月

6个月

1

无效果

无效果

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

2

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

显著效果

显著效果

3

无效果

无效果

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

4

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

显著效果

显著效果

5

无效果

无效果

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

6

无效果

无效果

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

7

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

显著效果

显著效果

8

无效果

无效果

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

9

无效果

无效果

轻微效果

轻微效果

显著效果

显著效果

美白效果评价标准：

无效果：无任何变化；

轻微效果：黑化皮肤的肤色略微变白，但仍比未黑化皮肤的肤色略黑；

显著效果：黑化皮肤的肤色明显变白与未黑化皮肤的肤色基本一致。

从表5可以看出，含有本发明提供的小干扰核酸MATP-1至MATP-9的组合物在使用5个月后，对黑化皮肤具有显著的美白效果，特别是通过含有MATP-2、MATP-4和MATP-7的组合物在使用1个月后，对黑化皮肤具有轻微美白效果，使用3个月后，对黑化皮肤具有显著的美白效果。

SEQUENCE LISTING

<110>苏州瑞博生物技术有限公司

<120>MATP基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用

<130>I10628SRB

<160>19

<170>Patent In version 3.4

<210>1

<211>1734

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>1

gccaggctcc acgtcaaatc cagtttgaaa cacagaccct aggaccacgc aggaggtggt   60

gggctcgcag gaaggttcct ctcccagtgg ccatgggtag caacagtggg caggctggcc  120

gccacatcta taaatcccta gctgatgatg gcccctttga ctctgtggag ccgcctaaaa  180

gacccaccag cagactcatc atgcacagca tggccatgtt cggaagagag ttctgctacg  240

cggtggaggc agcgtatgtg accccagtcc tgctcagcgt aggtctgccc agcagcctgt  300

acagcattgt gtggttcctc agccccatcc tgggattcct gctgcagccc gtggtcggat  360

cggccagcga ccactgccgg tccaggtggg gccgccggag accctacatc ctcaccctgg  420

gagtcatgat gctcgtgggc atggctctgt acctcaatgg ggctactgtt gtagcagctt  480

tgattgctaa cccaaggagg aagctggttt gggccataag tgtcaccatg ataggtgtcg  540

ttctctttga ttttgctgcc gacttcattg atgggcccat caaagcctac ttatttgatg  600

tctgctccca tcaggacaag gagaagggcc tccactacca tgccctcttc acaggttttg  660

gaggtgccct gggttacctt ttgggtgcta tagactgggc ccatctggag ctgggaagac  720

tgttgggtac agaattccag gtcatgttct tcttctctgc attggtgctc actttgtgtt  780

ttactgttca tctgtgcagt atctctgaag ccccacttac agaggttgca aagggcattc  840

ccccacagca aacccctcag gaccctccat tgtcatcaga tggaatgtac gagtatggtt  900

ctatcgagaa agttaaaaat ggttacgtaa atccagagct ggcaatgcag ggagcaaaaa  960

acaaaaatca tgctgaacag actcgcaggg caatgacatt aaagtcactg ctgagagcac    1020

tggtgaacat gcctcctcac taccgctacc tttgcatcag ccacctcatt ggatggacgg    1080

ccttcctgtc caacatgctg ttcttcacag atttcatggg ccagattgtg taccgcgggg    1140

atccctatag tgcacacaac tccacagagt ttctcatcta cgaaagagga gtcgaggttg    1200

gatgttgggg cttctgcatc aactccgtgt tttcctcact ttattcttac tttcagaaag    1260

ttttggtatc ctacattgga ttaaagggtc tttacttcac gggatatttg ctgtttggcc    1320

tggggacggg atttattggg ctcttcccga atgtctactc caccctggtc ctgtgcagcc    1380

tgtttggtgt aatgtccagc accctgtaca ctgtgccctt taacctcatt actgagtacc    1440

accgcgagga agaaaaggag aggcagcagg ccccaggagg ggacccagac aacagcgtga    1500

gagggaaggg catggactgc gccaccctca catgcatggt gcagctggct cagatcctgg    1560

tcggaggtgg cctgggcttt ctggtcaaca cagccgggac cgttgtcgtc gtggtgatca    1620

cagcgtctgc ggtggcactg ataggctgtt gctttgtcgc tctctttgtt agatatgtgg    1680

attaggtcaa taaagagaca atgaccctaa cctcagaaaa aaaaaaaaaa aaaa          1734

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>2

ccaccagcagactcatcat                    19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>3

gc atggctctgt acctcaa                  19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>4

ccaaggaggaagctggttt                    19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>5

cccatcaaagcctacttat                    19

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>6

ggaatgtacgagtatggtt                    19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>7

ggttctatcgagaaagttaaaaat               19

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>8

ccatgttcggaagagagtt                    19

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>9

gtacagcattgtgtggtt                     19

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>10

gctgttgctttgtcgctct            19

<210>11

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>11

augaugaguc ugcugguggt t        21

<210>12

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>12

uugagguaca gagccaugct t        21

<210>13

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>13

aaaccagcuu ccuccuuggt t        21

<210>14

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>14

auaaguaggc uuugaugggt t        21

<210>15

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>15

aaccauacuc guacauucct t        21

<210>16

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>16

uaacuuucuc gauagaacct t        21

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>17

aacucucuuc cgaacauggt t        21

<210>18

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>18

aaccacacaa ugcuguacat t        21

<210>19

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<400>19

agagcgacaa agcaacagct t        21

Claims (12)

1.MATP基因的干扰靶位点核苷酸分子，其特征在于，该核苷酸分子具有如SEQ ID Nos：2-10中之一所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的干扰靶位点核苷酸分子，其中，所述核苷酸分子具有如SEQ ID No：3、SEQ ID No：5或SEQ ID No：8所示的核苷酸序列。

3.一种小干扰核酸，其特征在于，该小干扰核酸具有MATP-1、MATP-2、MATP-3、MATP-4、MATP-5、MATP-6、MATP-7、MATP-8或MATP-9所示的核苷酸序列，或者具有对MATP-1、MATP-2、MATP-3、MATP-4、MATP-5、MATP-6、MATP-7、MATP-8或MATP-9所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，

MATP-1  正义链：5’-CCACCAGCAGACUCAUCAUdTdT-3’

        反义链：5’-AUGAUGAGUCUGCUGGUGGdTdT-3’；

MATP-2  正义链：5’-GCAUGGCUCUGUACCUCAAdTdT-3’

        反义链：5’-UUGAGGUACAGAGCCAUGCdTdT-3’；

MATP-3  正义链：5’-CCAAGGAGGAAGCUGGUUUdTdT-3’

        反义链：5’-AAACCAGCUUCCUCCUUGGdTdT-3’；

MATP-4  正义链：5’-CCCAUCAAAGCCUACUUAUdTdT-3’

        反义链：5’-AUAAGUAGGCUUUGAUGGGdTdT-3’；

MATP-5  正义链：5’-GGAAUGUACGAGUAUGGUUdTdT-3’

        反义链：5’-AACCAUACUCGUACAUUCCdTdT-3’；

MATP-6  正义链：5’-GGUUCUAUCGAGAAAGUUAdTdT-3’

        反义链：5’-UAACUUUCUCGAUAGAACCdTdT-3’；

MATP-7  正义链：5’-CCAUGUUCGGAAGAGAGUUdTdT-3’

        反义链：5’-AACUCUCUUCCGAACAUGGdTdT-3’；

MATP-8  正义链：5’-UGUACAGCAUUGUGUGGUUdTdT-3’

        反义链：5’-AACCACACAAUGCUGUACAdTdT-3’；

MATP-9  正义链：5’-GCUGUUGCUUUGUCGCUCUdTdT-3’

        反义链：5’-AGAGCGACAAAGCAACAGCdTdT-3’，

其中，所述化学修饰为对正义链的U、C和G核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氧甲基修饰，对反义链U和C核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氟代修饰。

4.根据权利要求3所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸通过化学合成得到，或者通过质粒和/或病毒载体的表达而得到。

5.根据权利要求3所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有MATP-2、MATP-4或MATP-7所示的核苷酸序列。

6.一种用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，其特征在于，该化妆品组合物含有权利要求3-5中的任意一项所述的小干扰核酸作为活性成分。

7.根据权利要求6所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还含有载体，所述载体选自动植物油、烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种。

8.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其中，相对于100重量份的小干扰核酸，所述载体的含量为1000-10000000重量份。

9.根据权利要求7或8所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还含其它用于化妆品组合物的成分，所述其它用于化妆品组合物的成分选自保湿剂、着色剂、防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、表面活性剂和佐剂中的一种或几种。

10.根据权利要求9所述的化妆品组合物，其中，相对于100重量份的小干扰核酸，所述其它用于化妆品组合物的成分的含量为1000-10000000重量份。

11.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其中，该化妆品组合物为乳剂、膏剂、液剂、气雾剂或粉剂。

12.权利要求3-5中的任意一项所述的小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。