CN105264075B - 抑制酪氨酸酶的酶活性的适体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可抑制酪氨酸酶的酶活性的用于将酪氨酸转化成L‑DOPA和多巴醌的DNA适体，及其皮肤学和化妆品用途。

Description

抑制酪氨酸酶的酶活性的适体
技术领域
本发明涉及脱色素或淡化皮肤化妆品和皮肤学应用领域。
背景技术
在人类中，在皮肤、毛囊或眼睛中黑色素的合成和分布造成色素沉着。色素沉着是遗传预先限定的。控制色素沉着的基因直接作用于色素细胞，或间接作用在色素细胞，尤其是角质细胞的环境中。
作用于色素细胞的许多基因已被得到鉴定和表征，其产物是控制黑色素合成的蛋白、黑素体结构蛋白，或控制黑素体生物合成和运输的蛋白。
在刺激黑色素生成的外源性因素中，紫外线排名第一。炎症和氧化胁迫(例如，如由污染引发的那些)刺激黑色素合成。这些胁迫直接作用于黑素细胞，以及也通过激活角质细胞使其随后释放因子如细胞因子或激素而间接地作用。这些因子(如白介素、α-MSH、内皮素1和前列腺素E2)启动导致黑色素合成的反应的序列。这些与真皮-表皮交界的疾病相关的重复刺激引起形成异质性皮肤色素沉着，例如，表现为雀斑，黑斑病或着色斑。
由在皮肤中过量黑色素所引起的色素沉着过度，其由内在因素(如内分泌、代谢或遗传因素)或外在的因素(如光敏、物理、化学或抗炎剂等等)所造成，内在因素和外在因素有时是紧密联系的并难以确定。黑素细胞活性过度导致过度产生黑色素，造成了大多数的色素沉着过度。这些色素沉着过度发生在面部或手部，以及显示为更暗或更深色的区域或斑点，造成皮肤异质性色素沉着。
所有黑色素来自共同合成途径，其涉及氨基酸、酪氨酸和关键酶酪氨酸酶，酪氨酸酶可以是游离的或以酪氨酸酶/酪氨酸-相关蛋白-1复合物的形式存在。酪氨酸酶将酪氨酸转化为DOPA，继而将其转化为多巴醌。从多巴醌开始可能有两条途径，一条途径形成褐黑素，另一条途径形成真黑色素。在真黑色素途径中，多巴醌导致多巴色素的形成。经由形成二羟基吲哚或二羟基吲哚羧基，多巴色素导致形成真黑色素。酪氨酸酶是在该反应顺序中的关键酶，其通过在此顺序的若干反应中单独催化或者通过与酪氨酸酶-相关蛋白1形成复合物来催化而导致黑色素的形成。
因此，为了防止色素沉着过度和抑制黑色素生成，抑制或消除皮肤中的酪氨酸酶的活性是非常重要的。
黑素细胞表达酪氨酸酶。因此，已构想过开发特异性酪氨酸酶抑制剂。
用于调节皮肤色素沉着的天然或合成的化学物质可以通过多种类型的机制起作用：
·通过角质细胞来阻断黑素细胞的刺激，或
·通过在指定点阻断黑色素合成途径，或
·通过阻断黑素体的转移，或
·通过降低黑素细胞的数量。
这些作用机制之中，脱色素剂可以是酪氨酸酶的酶活性的抑制剂。
用于调节皮肤色素沉着以及抑制酪氨酸酶的酶活性的第一活性剂是汞盐、氯化汞、汞氯化胺。汞与铜竞争抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑色素合成的前两个阶段。然而，汞是剧毒物质。已推荐氢醌、氢醌醚或衍生物。其通过竞争性抑制酪氨酸酶来起作用。然而，它诱导线粒体改变以及具有副作用，如刺激或过敏。这些物质的毒理学研究显示出具有皮肤癌和抑制精子发生的风险。
局部使用有效、无害的脱色素物质在化妆品和皮肤学领域是备受追捧的。这些物质特别用于治疗由于黑素细胞机能亢进造成的区域性色素沉着过度(如特发性黑斑病)、由于黑素细胞机能亢进造成的局部色素沉着过度(如称为晒斑和老年斑的色素沉着斑)、意外色素沉着过度(如光敏作用或损伤后愈合)，同时用于治疗白斑病如白癜风。在后者的情况下，缺乏使皮肤重新着色的能力，则减弱褪色区周围的色素沉着以赋予皮肤更同质性的颜色。
脱色素物质也用作皮肤漂白剂(尤其是上述那些，其对紫外线高度反应性)以淡化肤色(特别是脸和手)以便保持可能最浅的皮肤颜色，或减少紫外线的着色作用。
本发明的目的是解决现有技术的技术中的上述问题，并提供对抑制酪氨酸酶的酶活性特别有利的化妆品组合物。
发明内容
本发明涉及用于抑制黑色素生成的新的局部有效的酪氨酸酶抑制剂，其在化妆品可接受的非刺激、非毒性和/或非过敏介质中是稳定的。
本发明还涉及作用在黑色素生成过程中的新的脱色素试剂，其一方面在基本上同质性色素沉着的情况下用于漂白皮肤、头发或体毛，即用于减少其色素沉着，以及在另一方面当皮肤的色素沉着是异质性时用于防止皮肤色素沉着过度。
令人惊讶的是，本发明人观察到耐受核酸酶的DNA(法文ADN)适体，其能够特异性结合到酪氨酸酶并抑制酪氨酸酶活性而满足所有这些标准。特别是，它可以穿透皮肤细胞。
为分离抗-酪氨酸酶的适体，发明人使用磷酸二酯寡核苷酸序列(与天然DNA相同的组合物)的序列文库。以定向方式进行选择以鉴定、分离和表征可特异性与酪氨酸酶相互作用的序列。
然后，对这些适体测试其抑制酪氨酸酶活性的能力。
本发明的第一目的因此涉及能够抑制酪氨酸酶的酶活性以及将酪氨酸转化成L-DOPA和多巴醌的DNA适体，优选耐受核酸酶。
本发明的第二目的涉及根据本发明的适体抑制酪氨酸酶的酶活性的用途。
本发明的第三目的涉及化妆品或药物组合物，其含有足以抑制酪氨酸酶的量的根据本发明的适体作为活性剂，以及一种或更多种药学上可接受的赋形剂。
本发明的第四目的涉及根据本发明的适体的化妆品用途。
本发明的第五目的涉及根据本发明的适体作为药物。
本发明的第六目的涉及用于选择根据本发明的适体的方法，包括以下步骤：
-通过SELEX方法在DNA文库中选择针对酪氨酸酶催化位点的适体，
-评估在前述步骤中所鉴定的适体抑制酪氨酸酶的酶活性的潜能，
-克隆和测序由此选择的适体。
附图说明
图1：适体T10.1及其截短形式的预测的二级结构。
图2：适体T10.1酪氨酸酶复合物的传感图。
图3：来自轮10的各种适体的酪氨酸酶活性调节的测量。
图4：(P)＝f(t)曲线，在产物(P)的表观和时间(t)之间的关系。
具体实施方式
因此，本发明的第一目的涉及DNA适体，优选耐受核酸酶，其能够抑制将酪氨酸转化成L-DOPA的酪氨酸酶蛋白的酶活性。
“适体”是指对蛋白具有高亲和性的配体特异性DNA或RNA(法文为ARN)分子。因此，这意味着包括“天然”适体和化学修饰类似物。
通过选择/扩增的交替来选择适体，这能够以达尔文式的方式指导群体的进化：在群体中，选择出最“适(apt)”的分子，因此这也是对源自选择的具有所需特征的寡核苷酸命名为“适体”的原因。标准的基因工程技术(克隆、测序、表达)可以很容易地鉴定出这些适体个体，然后将其表征以大量生产。
可以通过优化的体外选择操作规程，称为指数富集(SELEX)的配体系统进化，来选择适体(WO 91/19813)。
SELEX方法使得能够产生极高亲和性和特异性的大量配体。此方法依赖于将靶分子暴露在潜在配体的文库中。解吸/选择循环的系统使得能够富集到与靶分子最特异地相互作用的配体群体。然后分离和表征所得到的最终群体，以允许其大规模重新合成。
虽然SELEX方法已被建立为用于选择适体的通用技术，对任何靶标而言它既不是预测性的也不是标准化的。与此相反，SELEX方法必须进行优化来适于每个特定的靶标。对于每个靶标而言，SELEX方法是没有保证的。
选择适体时有几个重要因素。例如，靶标分子在每个SELEX循环中必须是稳定的并容易再现，因为SELEX方法中涉及结合、选择和扩增的若干次循环。此外，显示出特异性结合靶标的核酸必须呈现在初始文库中。因此，有必要产生高度多样化的初始核酸文库。
通过SELEX方法的方式选择适体是不可预知的。即使所有的因素对选择适体而言是最佳的，SELEX方法并不总是对于每个靶标都能获得可行的适体。
初始候选物文库是由化学合成的DNA序列所组成，所述每个DNA序列都包括n个核苷酸的长可变区，在其3'和5'末端两侧为对文库的所有候选物都相同的恒定区。这些恒定区允许中央部分在SELEX过程中特别是通过PCR方式被操纵。可变部分的长度确定文库的多样性，这等同于4n，因为每个位置可被四种核苷酸A、T、G或C之一所占用。对于大窗口而言，出现巨大复杂性：当n＝50时，理论多样性是450(1030)，这在实践中是不能达到的值，因为它对应于超过105吨的文库(其中每个序列只出现一次)。实验极限是大约1015个不同的序列，这是其中具有25个核苷酸可变区的所有候选物都得到呈现的文库的序列。如果选择操纵包括30个核苷酸窗的文库(其理论的多样性是大约1018)，那么只有1/1000的可能性将得到探索。在实践中，这通常足以获得具有所需性质的适体。另外，由于所用聚合酶不可靠并以10-4数量级的比例引入错误，它们有助于通过SELEX方法显著丰富序列池的多样性：对于具有100个核苷酸长的随机区的文库而言，在每个扩增循环中100个候选物中就有一个将被改变，这导致对整个文库而言出现1013个新候选物。
通过从游离分子中物理分离出靶标相关分子的方式在每轮进行选择。可以应用多种技术(层析法、过滤器贮留(rétention)、电泳等)。调节选择条件(靶标/候选物的相对浓度、离子浓度、温度、洗涤等)使得候选物之间产生靶标-结合竞争。一般而言，为促进对具有最高亲和性的候选物的捕捉，严谨性随着轮数进行而增加。此外，执行反向选择以消除识别支持物(过滤器、珠等)的候选物。
寡核苷酸是每个单元在中性pH中具有电荷、氢键供体/受体位点以及可以产生堆积相互作用的芳族杂环(核酸碱基)的寡阴离子。在碱基对形成之后，这些寡聚物折叠以产生二级和三级结构。因此初始序列文库是三维形状的文库，每个对应着可以启动静电相互作用、产生H键等的单元分布。选择在文库中鉴定适合靶的形状的方面成为了问题，即这种形状允许最大数目的相互作用和形成最稳定的适体-靶标复合物。对于小靶标(染料、抗生素等)而言，通过在微摩尔范围中的平衡解离常数来表征鉴定的适体，而对蛋白质靶标而言，低于10-9M的Kd值并不少见。
针对高度多变的靶标以产生适体：氨基酸、肽、蛋白质和酶，以及复杂的结构，如完整的病毒和活细胞。
适体最显著的性质是与其配体进行相互作用的特异性，使其成为靶标识别的理想试剂。
适体可以是寡脱氧核苷酸(DNA)或寡核糖核苷酸(RNA)。在后一种情况下，第一SELEX步骤在于经由候选物的5'恒定区的启动子序列转录初始的DNA文库。选择后，候选物在扩增之前通过反转录转化成DNA。针对相同的靶标，选择具有可比的特性的RNA和DNA适体。此外，这两种化合物是彼此的竞争性抑制剂，表明重叠的相互作用位点。其具有产生化学修饰适体的主要后果。
反义方法的发展导致合成大量类似物，包括一些，例如赋予寡聚物对核酸酶耐受性的那些，在生物环境(细胞培养介质或在体内)中有用的性质。磷酸二酯键、糖或糖-磷酸主链的修饰，如2'-O-甲基、“锁”核酸或硼烷(borano)-磷酸衍生物，导致耐受核酸酶的低聚物。这种性质对适体可能是有利的。然而，如上所述，以RNA或DNA形式所选择的适体的化学结构随后完全改变通常导致被选择的性质的减少或消失。这并不意味着不可能在某些位置引入修饰。但最好是鉴定耐受修饰的位置。这可以通过测试特异性变体或通过系统性方法(所谓的化学干扰，其是足迹法的变体)来进行。
当然，优选直接执行非天然寡核苷酸的选择。这假设有效地引入修饰的三磷酸核苷，以及修饰的基质通过使用的聚合酶在SELEX过程中正确读取。极少数类似物满足要求。至于赋予核酸酶耐受性的衍生物，可能性限于硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)或2'-甲基-、2'-氨基-或2'-氟-嘧啶类似物，后者是目前为止最常用的。在这种情况下，鉴定的适体具有修饰的嘧啶核苷和未修饰的嘌呤残基(2'-羟基)。这些分子对核酸酶具有更强的耐受性。如上所述，如果需要的话，可以稍后引入修饰的嘌呤残基。此外，可能选择在嘧啶C(5)位置或者嘌呤的N(7)、C(8)位置含有取代基的寡核苷酸。其对于对核酸酶的灵敏度没有影响，但可能添加新的功能(疏水性、光反应性等)。
一种非常不同的方法涉及使用光学异构体。天然核酸是D-异构体。L-类似物具有核酸酶耐受性但不能由聚合酶产生。根据光学异构的规律，L系列适体将与其靶标(T)形成复合物，所述复合物与靶标(T)的D系列异构体和对映异构体(T')形成的复合物具有相同特性。因此，如果化合物T'可以是化学合成，它将用于进行天然适体(D)的选择。一旦得以鉴定，这种适体将以L系列进行化学合成。这种L-适体将是天然靶标(T)的配体。
另一种方法，最近描述为二维SELEX，同时适用于体外寡核苷酸选择和动态组合化学(DCC)，即寡核苷酸(胺基)的某些基团和醛化合物文库之间的可逆反应。这种反应产生亚胺寡核苷酸，其基于与传统SELEX相同的原理进行选择。因此有可能鉴定与天然适体不同的靶标发夹RNA修饰的适体。
不同于主链修饰，主链修饰可以改变结构，因而需要在引入前采取预防措施以避免失去适体-靶标相互作用的性质，也可以在寡核苷酸的3'或5'端之一缀合各种基团以将其转化成工具、探针或传感器而不破坏其特性。这种通用性构成适体的其它显著性优势，特别是在诊断方面。
表述“适体类似物”在本文指上述的一种或更多种修饰。
优选地，根据本发明的适体可以以高亲和性结合酪氨酸酶。
“高亲和性”在本发明的上下文中指适体与靶标的特异性相互作用，以及足够低以允许显著抑制酶的催化活性的解离常数。
优选地，根据本发明的适体包含至少序列SEQ ID NO：5。
更优选地，根据本发明的适体包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO:6的至少一个序列。
已经通过SELEX方法选择序列SEQ ID NO：1。
序列SEQ ID NO：2至5是SEQ ID NO：1缩短的衍生物。
序列SEQ ID NO：6对应于SEQ ID NO：1不含引物的部分。
下面的表1总结了这些序列。
更优选地，根据本发明的适体包含SEQ ID NO：6的至少10个连续核苷酸，在其5'侧接序列SEQ ID NO：7从其3'端开始的一个或更多个连续核苷酸，和/或在所述SEQ ID NO：6的至少10个连续核苷酸的3'侧接序列SEQ ID NO：8从其5'端开始的一个或更多个连续核苷酸。
更优选地，根据本发明的适体包含SEQ ID NO：6，在其3'侧接序列SEQ ID NO：7从其5'端开始的一个或更多个连续核苷酸，和/或在所SEQ ID NO：6的5'侧接序列SEQ ID NO：8从其3'端开始的一个或更多个连续核苷酸。
“一个或更多个”是指任何数目的核苷酸，优选为3至10，特别优选的方式是5个核苷酸。
例如，可以提及序列：
-SEQ ID NO：10：
TCGAACGCAATGGGCGCAGATTGGAAGGCCTAGCATTGAG，其包含SEQ ID NO：6，在其5'侧接SEQ ID NO：7的3'端的5个连续核苷酸并且在3'侧接SEQ ID NO：8的5'端的5个连续核苷酸。
-SEQ ID NO：11：GTCGAACGCAATGGGCGCAGATTGGAAGGCCTAGCA，其包含SEQ ID NO：6，在SEQ ID NO：6的5'侧接SEQ ID NO：7的3'端的6个连续核苷酸。
根据本发明的适体还可以包含衍生自T10.1C(SEQ ID NO：4)的具有相同的尖端茎-环-茎-环二级结构的序列(见图1)，每个茎由G-C、C-G、A-T或T-A对组成，每个环包括2至10个核苷酸。
该序列也可表示如下：
X1---XnX(n+1)---XmX(m+1)---XpX(p+1)---XrX(r+1)---XoX(o+1)---XsX(s+1)---Xt
其中每个X是核苷酸
1≤n≤5
n+1≤m≤n+5，优选n+1≤m≤n+3
m+1≤p≤m+5
p+1≤r≤p+10，优选p+2≤r≤p+8，特别优选的方式中r＝p+5
r+1≤o≤r+5
o+1≤s≤o+5
s+1≤t≤s+5
t–s＝n
o–r＝p–m
n、m、p、r、o、s、t均为整数并表示核苷酸的位置，
核苷酸X1至Xn以及X(s+1)至Xt是A、T、G或C，优选G或C，前提是它们是配对的，因此形成茎，
核苷酸X(m+1)至Xp以及X(r+1)至Xo是A、T、G或C，优选G或C，前提是它们是配对的，因此形成茎，
核苷酸X(n+1)至Xm以及X(o+1)至Xs是A、T、G或C且不配对，因而形成环，
核苷酸X(p+1)至Xr是A、T、G或C且不配对，因而形成环。
“茎”是完全配对的双链序列，例如：
G–C A–T
C–G A–T
G–C A–T
C–G A–T
“环”是双链序列内不配对的基序。
根据本发明的具体的实施方案，根据本发明的适体还可以包含衍生自T10.1C(SEQID NO：4)的具有相同尖端茎-环-茎-环二级结构的序列(见图1)，每个茎由三个G-C、C-G、A-T或T-A对组成，每个环包括5个核苷酸。
此序列SEQ ID NO：12也可以表示如下：
X1---XnX(n+1)---XmX(m+1)---XpX(p+1)---XrX(r+1)---XoX(o+1)---XsX(s+1)---Xt
其中每个X是核苷酸
n＝3
m＝n+3
p＝m+3
r＝p+5
o＝r+3
s＝o+2
t＝s+3
n、m、p、r、o、s、t均为整数并表示核苷酸的位置，
核苷酸X1至Xn以及X(s+1)至Xt是A、T、G或C，优选G或C，前提是它们是配对的，从而形成茎，
核苷酸X(m+1)至Xp以及X(r+1)至Xo是A、T、G或C，优选G或C，前提是它们是配对，从而形成茎，
核苷酸X(n+1)至Xm以及X(o+1)至Xs是A、T、G或C且不配对，从而形成环，
核苷酸X(p+1)至Xr是A、T、G或C且不配对，从而形成环。
“茎”是完全配对的双链序列，例如：
G–C A–T
C–G A–T
G–C A–T
C–G A–T
本发明的另一目的涉及根据本发明的适体在抑制酪氨酸酶的酶活性中的用途。
酪氨酸酶将酪氨酸转化为L-DOPA。酪氨酸酶的酶活性可以通过测量多巴色素(L-DOPA的有色氧化产物)的表观来评估。通过在450nm处测量吸光度来监测这种氧化产物表观的动力学。
优选地，本发明涉及根据本发明的适体作为化妆品或皮肤学组合物中的皮肤脱色素或淡化试剂中的用途。
本发明的另一目的涉及化妆品或药物组合物，其包括足以抑制酪氨酸酶的酶活性的量的根据本发明的至少一种适体作为活性试剂，以及一种或更多种化妆品上/药学上可接受的赋形剂。
优选地，本发明的组合物含有从0.00001％至10％，优选从0.00005％至5％，更优选从0.001％至1％的根据本发明的一种或更多种适体。通常，本发明的任何组合物可被施用至皮肤或皮肤附属物。
它可以以适合局部施用的所有药物形式来提供。
本发明的组合物可特别具有以下形式：水或油溶液、或洗剂-或精华液-型分散剂、具有液体或半液体稠度的乳型乳剂、或者具有霜剂-或凝胶-型柔软稠度的含水的或无水的悬浮剂或乳剂、或微胶囊或微粒、或离子型和/或非离子型囊泡分散剂，或泡沫剂，其中具有液体或半液体稠度的乳型乳剂通过以下方式获得：将水相分散在硅酮相(H/Si)、或将脂肪相分散在水相(水包油乳剂)、或相反地将水相分散在脂肪相(油包水乳剂)。使用常规方法制备这些组合物。根据本发明的组合物的各种组分的量是考虑到的领域中通常使用的那些。
在化妆品领域，配制这些组合物特别用于清洁、保护、治疗或护理面部、手部、脚部或身体的霜剂(例如，日霜、晚霜、卸妆霜、粉底霜、防晒霜)、液体粉底、卸妆乳、身体保护或护理乳、防晒乳、护肤洗剂、凝胶或泡沫，如清洁洗剂、防晒洗剂，人工晒黑洗剂、用于洗浴的组合物、含有杀菌剂的除臭剂组合物、须后凝胶或洗剂、脱毛霜。
根据本发明的组合物还可以由粉末或无粉固体制剂所组成，例如以条、压实粉末、清洁皂或棒的形式。还可以提供为允许对面部或手部斑点进行局部施用的贴、笔、刷和敷涂剂。它可用作护理产品或作为化妆产品。
当组合物是乳剂时，脂肪相的比例可以变化，从相对于组合物总重量的约5％至80％重量，优选从约5％至50％重量。在乳剂形式的组合物中使用的油、蜡、乳化剂和助乳化剂选自在化妆品领域通常使用的那些。乳化剂和助乳化剂以相对于组合物总重量的0.3％至30％重量，以及优选0.5％至20％重量的比例存在于组合物中。另外，乳剂可含有脂质囊泡。
当组合物是一种油状溶液或凝胶，脂肪相可占组合物的总重量的90％以上。
在已知的方式中，本发明的化妆品或药物组合物还可以含有化妆品或制药领域中通常使用的佐剂，如亲水性或亲脂性胶凝剂、亲水性或亲脂性活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香味剂、充填剂、过滤器、色素、气味吸收剂和着色剂。这些各种佐剂的量是在所考虑的领域中通常使用的那些。这些辅助剂根据其性质可以加入到脂肪相、水相、脂质囊泡或纳米颗粒中。这些各种佐剂的量是化妆品和制药领域中通常使用的那些，并且可以变化，例如，从组合物总重量的约0.01％到10％。这些辅助剂根据其性质可以加入到脂肪相、水相和/或脂质小球体中。
可以在本发明中采用的示例性的油或蜡包括矿物油(液体石蜡)、植物油(乳木果油的液体馏分、向日葵油)、动物油(全氢化角鲨烯)、合成油(Purcellin油)、硅油或蜡(环甲聚硅氧烷)和氟油(全氟聚醚)、蜂蜡、巴西棕榈蜡或石蜡。脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)可以加入到这些油中。可用于本发明的示例性乳化剂包括例如，甘油硬脂酸酯、聚山梨酸酯60以及由Gattefosse公司以名称Tefose 63出售的混合物PEG-6/PEG-32/乙二醇硬脂酸酯。
可在本发明中使用的示例性溶剂包括低级醇，尤其是乙醇和异丙醇，和丙二醇。
可在本发明中使用的示例性的亲水性凝胶剂包括羧基乙烯基聚合物(卡波姆)、丙烯酸共聚物如丙烯酸酯/烷基酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖如羟丙基纤维素、天然树胶和粘土，以及示例性的亲脂性凝胶剂，包括改性粘土如膨润土、脂肪酸的金属盐如硬脂酸铝、疏水性二氧化硅、乙基纤维素和聚乙烯。
本发明的组合物还可以包含一种或更多种其它活性剂，例如用于抑制黑色素生成。
可与根据本发明的适体组合使用的上述活性剂，以纯的形式使用或来自含有这些分子的提取物，特别是下列化合物：鞣花酸及其衍生物；对苯二酚；熊果苷；间苯二酚及其衍生物；维生素C及其衍生物；泛酸磺酸及其衍生物；曲酸；直接或间接地干扰α-黑素细胞刺激素(α-MSH)或其受体或促肾上腺皮质激素(ACTH)的分子；多元醇如甘油、乙二醇或丙二醇；维生素；角质分离剂或脱屑剂，如水杨酸及其衍生物；α-羟基酸，如单独或接枝的乳酸或苹果酸；β-羟基酸；抗坏血酸及其衍生物；维甲酸；视黄醛；在或不在脂质体制剂中的视黄醇及其衍生物，如棕榈酸盐、丙酸盐或乙酸盐；单独或组合使用的抗糖化剂或抗氧化剂，如生育酚及其衍生物、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、焦磷酸硫胺素、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、三磷酸腺苷；抗炎剂，如硬脂基甘草次酸；舒缓剂及其混合物，化学或物理防晒剂，如辛基甲氧基肉桂酸酯、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、微粉化的氧化钛和氧化锌；以及脱氧核糖核酸或核酸。
本发明还涉及根据本发明的至少一种适体在用于制备旨在同时、分开或顺序地与一种或更多种其它活性剂(例如上述活性剂)组合施用的药物中的用途。
本发明还具有一个目的，根据本发明的至少一种适体在化妆品或皮肤学组合物中用于脱色素或淡化人类皮肤、头发或体毛、或除去或减弱在人类皮肤上的色素沉着斑点的用途。
本发明还具有一个目的，根据本发明的至少一种适体在或用于制备作为黑色素合成抑制剂的化妆品或皮肤学组合物中的用途。
本发明还涉及根据本发明的至少一种适体调节酪氨酸酶表达的用途。
本发明还具有一个目的，根据本发明的至少一种适体在脱色素或淡化人类皮肤的化妆品组合物中的用途。
本发明还具有一个目的，根据本发明的至少一种适体在制备脱色素或淡化人类皮肤的皮肤学组合物中的用途。
本发明的另一个目的涉及根据本发明的适体的化妆品用途，优选用于脱色素或淡化皮肤、体毛和/或头发。
本发明还涉及化妆品或皮肤学治疗方法来控制过量色素沉着以脱色素或淡化人类皮肤，其在于在皮肤上施加包含根据本发明的至少一种适体的化妆品或皮肤学组合物。
本发明还涉及根据本发明的至少一种适体在制备用于局部治疗或预防导致过表达酪氨酸酶的疾病的药物中的用途。
本发明的另一目的涉及根据本发明的适体用于治疗或预防色素沉着过度，例如由于黑素细胞机能亢进所引起的区域色素沉着过度如特发性黑斑病、由于良性黑素细胞机能亢进和增殖所引起的局部色素沉着过度如年龄斑或肝斑(老年斑)、意外色素沉着过度，如光敏或与疤痕相关的色素沉着过度、以及用于治疗某些白斑病如白癜风。
本发明的另一个目的涉及根据本发明的适体作为药物，优选用于淡化或脱去皮肤、体毛和/或头发的色素。
本发明的另一个目的涉及根据本发明的适体用于治疗或预防色素沉着过度，例如由于黑素细胞机能亢进所引起的区域色素沉着过度如特发性黑斑病、由于良性黑素细胞机能亢进和增殖所引起的局部色素沉着过度如年龄斑或肝斑(老年斑)、意外色素沉着过度如光敏或与疤痕相关的色素沉着过度、以及用于治疗某些白斑病如白癜风。
根据本发明的适体可以根据本发明以载体化的形式使用，即连接到载体中。这种类型的载体是本领域技术人员所熟知的。例如，其可以是胆固醇残基或纳米颗粒。
根据本发明的适体也可以根据本发明以两种适体的二聚体形式或若干适体的缀合物的形式来使用。
本发明的另一目的涉及用于选择根据本发明的适体的方法，包括以下步骤：
-通过SELEX方法在DNA文库中选择针对酪氨酸酶的适体，
-评估在前述步骤中鉴定的适体抑制酪氨酸酶的酶活性的潜能，
-克隆和测序由此选择的适体。
实施例1：用于选择抗酪氨酸酶适体的材料和方法
蛋白
通过Abnova公司提供含N-末端GST标签的重组人酪氨酸酶(TYR)蛋白。在欧洲化学和生物学研究所生产多组氨酸-GST标签。
寡核苷酸和文库
通过HPLC纯化由Sigma提供的DNA文库和引物。引物序列(P3)5'GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA(SEQ ID NO：9)和(P5)的5'GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA(SEQ IDNO：7)用于扩增含有随机选择的30个核苷酸窗的文库。序列5'ACTGACTGACTGACTGACTA-6C3-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA用于生产如在文献中所述的单链(Williams KP,Bartel DP.PCR product with strands of unequal length.Nucleic Acids Res.1995 Oct 25；23(20):4220–1)。5'生物素化的引物(P3)用于产生单链候选DNA。由Eurogentec通过HPLC合成和纯化候选DNA(表1)。每个实验前，将DNA群体与候选物在75℃加热5分钟，在冰上放置5分钟，然后在室温下放置至少5分钟。
体外选择
选择之前，如上所述处理DNA文库(1纳摩尔)，对于第一轮和第二轮将DNA文库与过滤器一起(0.45μm HAWP，Millipore)孵育两次，以及对于所有其它轮在PBS-Mg缓冲液(154mM NaCl、1mM KH2PO4、2.96mM Na2HPO4·7H2O、1mM(CH3COO)2Mg)中孵育一次，在室温下进行20分钟。在每一轮，针对多组氨酸-GST标签进行额外的反向选择。接着，将反向选择的文库与酪氨酸酶(20皮摩尔)混合20分钟，通过过滤贮留技术的方式将未结合的候选物分离。过滤后，通过在500μl的7M苯酚/尿素中在65℃孵育20分钟来洗脱结合至酪氨酸酶的候选物，将其沉淀并通过PCR扩增以产生用于下一轮选择的单链。减少选择中候选物和靶标的量以使其分别达到25和1皮摩尔，在第十轮增加选择的严谨性。克隆前，对每轮选择的群体评价其抑制酪氨酸酶活性的能力。
克隆和测序
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)来克隆选自轮7和轮10的序列，并根据制造商说明使用BigDye Terminator v1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)进行测序。
表征表面等离子体共振(SPR)候选物
在Biacore 3000设备上用PBS-Mg缓冲液在23℃进行所有的实验。
生物素化的寡核苷酸在75℃加热5分钟、在冰上放置5分钟、然后放置在室温下至少5分钟，之后将生物素化的寡核苷酸固定在链霉亲和素包被的传感器芯片(XanTecbioanalytics)上。以5μl/min注入100nM寡核苷酸4分钟以达到800至1000RU。
23℃以20μl/min的速率分别以500nM和1μM注入酪氨酸酶和GST-His对照。使用PBS-Mg缓冲液和酪氨酸酶储存缓冲液进行相同的注入以从特异性传感图中减去缓冲液的作用。
每次注入蛋白后，使用40％甲酰胺、3.6M尿素和30mM EDTA的混合物进行1分钟脉冲以再生传感器芯片的功能化表面。
使用BIA eval 4.1软件分析数据。
实施例2：抗酪氨酸酶适体选择的结果
重复10次针对靶标酪氨酸酶的选择-扩增程序；克隆和测序SELEX轮7和10。分别分析来自轮7和10的41和74个候选物DNA。序列T10.1代表轮10序列的42％。其它序列表现出极大的多样性。序列T10.1在轮7中不存在。
使用mfold软件(Zuker,M.,2003.Nucleic Acids Res 31(13),3406–3415)预测候选物T10.1的二级结构。经预测，长的不完美的茎-环包括5'引物P5(GCCTCCTGTCGAA)的部分，以及表示出潜在的5-核苷酸内部环和5核苷酸尖端环(图1)。
通过表面等离子体共振(SPR)研究这种候选物T10.1和源自全长候选物的截短形式(表1)的结合。约1000共振单位(RU)的生物素化的候选物T10.1被固定，酪氨酸酶以500nM或1μM注入。对500nM和1μM分别检测到16和42RU的信号，说明候选物T10.1和酪氨酸酶之间的相互作用(图2)。
实施例3：测量酪氨酸酶活性
3.1原理
酶是可以特异性催化一种或两种底物转化的蛋白质。取简化的酶促反应模式：反应速率写为：
要绘制(P)＝f(t)曲线，酶(E)作用在底物(S)上；时间零对应于反应启动。产物(P)的表观测量为时间的函数(参见图4)。
在初始条件(曲线的0A部分)过程中，反应速率是常数。对于曲线的这部分，通过原点的切线与曲线汇合：速率是切线0A的斜率，称为初始速率。然后，速率减小(曲线的AB部分)再变为零(BC部分)。当底物之一消耗完或者当建立平衡时，速率变为零。
当酶反应的速率确定时，它始终是计算出的初始速率。因此，在其中少于10％底物量被水解的初始条件下进行速率测量。当[S]＞＞[E]时，初始速率与酶浓度成比例：因此其反映以酶单位表达的酶制剂的活性。
通过检测酪氨酸酶产物的着色氧化产物来测量酪氨酸酶的酶活性。酪氨酸酶的产物L-DOPA被氧化成有色产物多巴色素。通过测量450nm处的吸光度来监测L-DOPA连续氧化的这种产物以及之后L-多巴醌的表观动力学。
3.2 在黑素细胞培养物中测量酪氨酸酶的酶活性
以每孔1×104个细胞的浓度将正常人类黑素细胞接种在96孔微板。使用来自轮10的各种候选物和源自轮10的候选物(T10.1、T.10.1A、T10.1B、T10.1C、T10.1D)进行处理72小时后，确定酪氨酸酶的酶活性。在四个递增的浓度：4、20、100和200nM测试每个适体。
将细胞用PBS冲洗，然后将50μl的Triton X100(0.5％)加入到每个孔中，将板在4℃下振荡1小时。通过加入50μl底物(10mM L-DOPA，Sigma)至各孔启动反应。在稳定的振荡中，在37℃下每2分钟在450nm处测量多巴色素的表观持续1小时。由此得到的反应速率以OD单位/分钟表示。
使用BMG POLARstar板读数器分光光度计在+20℃下监测吸光度(450nm)随时间的变化。绘制表示吸光度(吸光度单位)作为时间(分钟)函数的曲线。
反应的初始速率由通过原点计算切线的斜率来确定。V0表示在没有效应物时的初始速率，以及Vi表示在存在效应物时的这种速率。计算比率(Vi/V0)×100：如果这种比率等于100，效应物对酶活性没有作用；如果低于100，则效应物是酶活性的抑制剂；如果在100以上，则其为活化剂。这种测量的结果示于图3。
在图3显示的结果表示每个测试的候选物对酪氨酸酶活性都具有抑制作用。除了在缩短最多的候选物T10.1D的最低浓度(4和20nM)中以外，这种作用对每个测试条件都是显著的。
不管以何种浓度进行测试，构成轮10的候选物的组在酪氨酸酶活性上具有显著作用，在75％以上。未观察到剂量依赖性作用。对于T10.1候选物获得类似结果。
缩短的候选物T10.1A和T10.1B也都是酪氨酸酶活性的抑制剂。然而这种抑制弱于全长轮10候选物和T10.1的抑制，特别是在最低浓度(4和20nM)时。
无论测试浓度如何，候选物T10.1C都具有抑制这种酶的良好能力。特别地，当此候选物以200nM的浓度使用时，注意到近95％酪氨酸酶活性的抑制。没有其它测试候选物在此浓度具有如此高的活性。
无论测试浓度如何，缩短最多的候选物T10.1D具有最低的抑制活性。
这些结果表明适体T10.1D的结构中不存在对抑制酪氨酸酶活性重要的区域。
示例性制剂
实施例A：淡化面部肤色的化妆粉末
微纤维素 20.00％
月桂醇磺基乙酸酯钠 15.00％
根据本发明的适体 1％
香味剂、着色剂、防腐剂 适量
滑石粉 适量至100％
该粉末具有双重作用。它清洁皮肤，此外通过若干天的经常使用来淡化肤色。它可一天两次施加到面部皮肤上。
实施例B：乳液-凝胶形式的化妆脱色素日霜
甘油 5.00％
辛酸/癸酸/琥珀酸甘油三酯 5.00％
甲氧基肉桂酸辛酯 1.00％
二甲基硅氧烷共聚醇 0.50％
丙烯酸酯/C10-30丙烯酸烷基酯交联聚合物 0.50％
根据本发明的适体 1％
中和剂 适量
防腐剂、香味剂、着色剂 适量
水 适量至100％
一些人暴露至相对强烈的日光照射中、或者甚至是阳光直射中，他们希望保持浅肤色以及避免色素斑的出现。使用上述乳液-凝胶将有可能实现此目的。这种组合物通常在早晨时施加至面部。它既用于预防又用于治疗面部无论均匀与否的色素沉着。
实施例C：化妆液防晒组合物(SPF 30)
挥发性环戊聚甲基硅氧烷(pentacyclométhicone) 49.00％
二氧化钛 15.00％
甲氧基肉桂酸辛酯 7.50％
甘油 5.00％
苯基三聚甲基硅氧烷(Phenyltriméthicone) 5.00％
二甲基硅氧烷共聚醇 3.00％
聚甲基丙烯酸甲酯 2.50％
丁基甲氧基二苯甲酰甲烷 1.00％
根据本发明的适体 1％
中和剂、香味剂、防腐剂、抗氧化剂 适量
水 适量至100％
这种组合物在暴露于强烈的阳光之前使用。它可以防止易患色素沉着斑的人出现这种现象。应当指出的是，高浓度防晒的存在补偿了天然保护的减少，导致黑色素水平的降低。
实施例D：用于治疗由病理或外伤造成的皮肤色素沉着过度的皮肤霜
硬脂酸甘油酯+Peg-100硬脂酸酯 5.00％
氢化聚异丁烯 4.00％
抗坏血酸磷酸镁 3.00％
三辛酸/癸酸甘油酯 3.00％
角鲨烷 3.00％
甘油 2.00％
蜂蜡 1.50％
鲸蜡硬脂辛酸 1.50％
鲸蜡醇 1.00％
硬脂醇 1.00％
二甲基硅氧烷 1.00％
黄原胶 0.30％
乙二胺四乙酸 0.20％
柠檬酸 0.10％
柠檬酸钠 0.10％
根据本发明的适体 1％
中和剂、香味剂、防腐剂 适量
水 适量至100％
使用此霜剂以减弱由病理或创伤造成的皮肤色素沉着过度。此霜还减弱在白癜风的情况下褪色区域周边的颜色对比。
实施例E：用于淡化肤色的化妆面部洗剂
乙醇 30.00％
PPG-3肉豆蔻醚 5.00％
甘油 2.00％
卡波姆 0.20％
聚山梨酯20 0.20％
根据本发明的适体 1％
中和剂、香味剂、防腐剂 适量
水 适量至100％
这种用于淡化肤色的洗剂在卸妆和清洁皮肤后使用。
实施例F：用于面部的化妆淡化精华液
通常在施用面霜前将一滴这种高浓缩的精华液组合物施用至面部。这种精华液通常用在一至两周的治疗中以获得或保持淡化的肤色。
实施例G：用于淡化体毛的化妆洗剂
水 适量至100％
乙醇 50％
泛醇基乙基醚(Panthenylethyl ether) 0.5％
DL-α-生育酚乙酸酯 0.2％
聚山梨酯60 1％
根据本发明的适体 1％
香味剂 0.2％
甘油 0.5％
着色剂 适量
这种洗剂施用至待淡化的毛发区域(特别是手臂)足够长一段时间以获得毛发逐渐变淡。
实施例H：用于手部的防止斑点的化妆霜剂凝胶
辛酸/癸酸二甘油琥珀酸酯 6％
辛酸辛酯 2.5％
甲氧基肉桂酸辛酯 6％
根据本发明的适体 1％
苯基三聚甲基硅氧烷 2.5％
苯甲酮-3 0.5％
透明质酸钠 0.05％
黄原胶 0.2％
丙烯酸酯/C10.30丙烯酸烷基酯共聚物 0.5％
甘油 2％
PEG 150 3％
中和剂、着色剂、香味剂、防腐剂 适量
纯化水 适量至100％
这种霜剂应直接施用至手部斑点(太阳斑和/或老年斑)以减弱斑点的颜色。

Claims (22)

1.一种能够抑制酪氨酸酶的酶活性用于将酪氨酸转化成L-DOPA和多巴醌的DNA适体，其中所述适体包含序列SEQ ID NO:5。
2.根据权利要求1所述的适体，能够以高亲和性结合至酪氨酸酶。
3.根据权利要求1或2所述的适体，其耐受核酸酶。
4.根据权利要求1所述的适体，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的序列。
5.根据权利要求1所述的适体，其包含SEQ ID NO：6的至少10个连续核苷酸，在其5'侧接序列SEQ ID NO：7从其3'端开始的一个或更多个连续核苷酸，和/或在3'侧接序列SEQ IDNO：8从其5'端开始的一个或更多个连续核苷酸。
6.根据权利要求5所述的适体，其包含SEQ ID NO：6，在所述SEQ ID NO:6的5'侧接序列SEQ ID NO：7从其3'端开始的一个或更多个连续核苷酸，和/或在所述SEQ ID NO：6的3'侧接序列SEQ ID NO：8从其5'端开始的一个或更多个连续核苷酸。
7.根据权利要求1所述的适体，其包含下列序列：
X1---XnX(n+1)---XmX(m+1)---XpX(p+1)---XrX(r+1)---XoX(o+1)---XsX(s+1)---Xt
其中每个X是核苷酸
1≤n≤5
n+1≤m≤n+5
m+1≤p≤m+5
p+1≤r≤p+10
r+1≤o≤r+5
o+1≤s≤o+5
s+1≤t≤s+5
t–s＝n
o–r＝p–m
n、m、p、r、o、s、t均为整数并表示核苷酸的位置，
核苷酸X1至Xn以及X(s+1)至Xt是A、T、G或C，前提是它们是配对的，从而形成茎，
核苷酸X(m+1)至Xp以及X(r+1)至Xo是A、T、G或C，前提是它们是配对的，从而形成茎，
核苷酸X(n+1)至Xm以及X(o+1)至Xs是A、T、G或C且不配对从而形成环，
核苷酸X(p+1)至Xr是A、T、G或C且不配对从而形成环。
8.根据权利要求7所述的适体，其中p+2≤r≤p+8。
9.根据权利要求8所述的适体，其中r＝p+5。
10.根据权利要求7所述的适体，其中所述的核苷酸X1至Xn以及X(s+1)至Xt是G或C，前提是它们是配对的，从而形成茎。
11.根据权利要求7所述的适体，其中所述的核苷酸X(m+1)至Xp以及X(r+1)至Xo是G或C，前提是它们是配对的，从而形成茎。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的至少一种适体在抑制酪氨酸酶的酶活性中的用途。
13.一种化妆品或药物组合物，其含有：
足以抑制酪氨酸酶的酶活性的占组合物重量的从0.00001％至10％的量的一种或更多种权利要求1至11中任一项所述的适体作为活性剂，以及
一种或更多种化妆品上/药学上可接受的赋形剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其包含占组合物重量的从0.00005％至5％的一种或更多种适体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其包含占组合物重量的从0.001％至1％的一种或更多种适体。
16.权利要求1至11中任一项所述的适体在制备化妆品中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述的适体用于脱色素或淡化皮肤、体毛和/或头发。
18.权利要求1至11中任一项所述的适体在制备用于治疗或预防由于黑素细胞机能亢进所引起的区域色素沉着过度、由于良性黑素细胞机能亢进和增殖所引起的局部色素沉着过度、意外色素沉着过度、与疤痕相关的色素沉着过度、以及用于治疗白斑病的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述的由于黑素细胞机能亢进所引起的区域色素沉着过度是特发性黑斑病。
20.根据权利要求18所述的用途，其中所述的由于良性黑素细胞机能亢进和增殖所引起的局部色素沉着过度是年龄斑或肝斑。
21.根据权利要求18所述的用途，其中所述的意外色素沉着过度是光敏。
22.根据权利要求18所述的用途，其中所述的白斑病是白癜风。
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