KR20150125644A

KR20150125644A - 티로시나제의 효소 활성을 억제시키는 앱타머

Info

Publication number: KR20150125644A
Application number: KR1020157018479A
Authority: KR
Inventors: 장 위베르 카우차드; 로빈 쿠르푸르스트; 실비안느 쉬네베르트; 에릭 다우세; 쟝-자크 툼
Original assignee: 엘브이엠에이취 러쉐르쉐; 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸)
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-11-09
Also published as: FR3000105A1; ES2672195T3; CN105264075A; US9732348B2; CN105264075B; KR102176847B1; EP2935587A1; EP2935587B1; WO2014102213A1; JP2016504910A; FR3000105B1; US20150329863A1; JP6307520B2

Abstract

본 발명은 탈색 또는 미백 피부과학 화장품 및 피부과 적용 분야에 관한 것이다.

Description

티로시나제의 효소 활성을 억제시키는 앱타머 {APTAMERS INHIBITING THE ENZYMATIC ACTIVITY OF TYROSINASE}

인간에서 색소침착은 피부, 모낭 또는 눈에서의 멜라닌 색소의 합성 및 분포로 발생한다. 색소침착은 유전적으로 사전에 결정된다. 색소침착을 제어하는 유전자는 색소 세포에 직접 작용하거나, 또는 색소 세포의 환경, 특히, 각질세포에 간접적으로 작용한다.

색소 세포에 작용하는 많은 유전자들이 확인되었고, 특징이 규명되었으며, 그의 생성물은 멜라닌 합성을 제어하는 단백질, 멜라노솜 구조 단백질, 또는 멜라노솜 생물 발생 및 수송을 제어하는 단백질이다.

멜라닌 형성을 자극하는 외인성 인자들 중 1위는 자외선이다. 예를 들어, 염증 및 산화 스트레스, 예컨대, 오염에 의해 유발된 것이 멜라닌 합성을 자극한다. 이러한 스트레스는 멜라닌 세포에 직접적으로 작용하고, 이는 또한 각질세포를 활성화시킴으로써 간접적으로 작용한 후, 이어서, 인자, 예컨대, 시토카인 또는 호르몬을 방출한다. 이들 인자, 예컨대, 인터루킨, α-MSH, 엔도텔린 1 및 프로스타글란딘 E2는 멜라닌 합성을 유도하는 일련의 반응을 일으킨다. 진피-표피 접합부 장애와 관련된 상기의 반복된 자극은 예를 들어, 주근깨, 기미 또는 흑자로 나타나는 이질적인 피부 색소침착의 형성을 유발한다.

피부에서 멜라닌 과다에 의해 유발되는, 과색소침착은 때로는 밀접한 관련이 있고, 구체적으로 명시하기는 어려운 내인 인자 (예컨대, 내분비, 대사 또는 유전 인자) 또는 외인 인자 (예컨대, 감광제, 물리 작용제, 화학 작용제 또는 염증성 물질 등)로부터 유발된다. 대부분의 과색소침착은 멜라닌 과잉 생산을 유도하는 멜라닌 세포의 과도한 활성으로부터 유발된다. 이러한 과색소침착은 얼굴 또는 손에서 발생하고, 더 어둡거나, 더욱 진한 색상의 영역 또는 반점으로 나타나며, 이로써 피부에서는 이질적인 색소침착이 이루어진다.

모든 멜라닌 색소는 아미노산, 티로신, 및 중요한 효소인, 유리 형태이거나, 또는 티로시나제/티로신 관련 단백질-1 복합체 형태일 수 있는 티로시나제를 포함하는 공통 합성 경로로부터 생산된다. 티로시나제는 티로신을 DOPA로 변환시킨 후, 이어서, DOPA퀴논으로 변화시킨다. DOPA퀴논으로부터는 2가지 경로가 가능한데, 그 하나로는 페오멜라닌이 유도되고, 나머지 다른 하나로는 유멜라닌이 유도된다. 유멜라닌 경로에서, 도파퀴논은 도파크롬 형성을 유도한다. 도파크롬은 디히드록시인돌 또는 디히드록시인돌카르복실 형성을 통해 유멜라닌 형성을 유도한다. 티로시나제는 단독으로 또는 티로시나제-관련 단백질 1과의 복합체 형태로 상기 수개의 일련의 반응을 촉매화시킴으로써 멜라닌 형성을 유도하는 상기 일련의 반응의 중요한 효소이다.

따라서, 과색소침착을 막기 위해 및 멜라닌 형성을 억제시키기 위해서는 피부에서 티로시나제 활성을 억제시키거나, 또는 제거하는 것이 중요하다.

멜라닌 세포가 티로시나제를 발현한다. 따라서, 특이 티로시나제 억제제를 개발하는 것이 구상되었다.

피부 색소침착을 조절하는 천연 또는 합성 화학 화합물은

· 각질세포에 의한 멜라닌 세포의 자극을 차단시킴으로써, 또는

· 주어진 지점에서 멜라닌 합성 경로를 차단시킴으로써, 또는

· 멜라노솜 전달을 차단시킴으로써, 또는

· 멜라닌 세포의 개수를 감소시킴으로써 이루어지는 것과 같은, 수개의 기전 유형을 통해 작용할 수 있다.

상기 작용 기전 중 탈색제가 티로시나제의 효소 활성의 억제제일 수 있다.

피부 색소침착을 조절하고, 티로시나제의 효소 활성을 억제시키는 데 사용되는 최초의 활성 작용제는 수은 염, 염화제2수은, 염화수은아민이었다. 수은은 티로시나제 활성을 억제시키기 위해 구리와 경쟁하여 멜라닌 합성의 처음 두 단계를 억제시킨다. 그러나, 수은은 고도로 독성인 물질이다. 히드로퀴논, 히드로퀴논 에테르 또는 유도체가 제안되었다. 이는 티로시나제의 경쟁적 억제에 의해 작용한다. 그러나, 이는 미토콘드리아 변화 및 부작용, 예컨대, 자극 또는 알레르기를 유도한다. 상기 물질에 대한 독성 연구 결과, 피부암 및 정자 형성 억제의 위험이 있는 것으로 나타났다.

화장품 및 피부과 분야에서는 효과적이고, 무해한 탈색 물질의 국소 사용이 고도로 요구되고 있다. 상기 물질은 특히 멜라닌 세포 과활성 (melanocyte hyperactivity)에 기인하는 국부 과색소침착, 예컨대, 특발성 기미, 멜라닌 세포 과활성에 기인하는 국소 과색소침착, 예컨대, 일광성 흑자 및 노인성 흑자로 알려져 있는 색소침착 반점, 우발성 과색소침착, 예컨대, 광감작 또는 병변 치유 후인 것 뿐만 아니라, 백피증, 예컨대, 백반을 치료하는 데 사용된다. 후자의 경우, 피부를 색소재침착시키는 능력이 없는 바, 탈색된 영역 주변부의 색소침착은 약화되고, 이로써 피부는 더욱 균질한 색상을 얻게 된다.

탈색 물질은 또한 피부색를 가능한 가장 밝게 보존시키거나, 또는 UV 선의 색소침착 효과를 감소시키기 위하여 안색을, 특히, 얼굴 및 손을 미백화 (lightening)시키는 피부 미백제로서, 특히, UV 선에 고도로 반응성인 상기 언급된 것으로서 사용된다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 기법의 상기 언급된 문제점들을 해소하고, 티로시나제의 효소 활성을 억제시키는 데 특히 이로운 화장용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은 화장학상 허용되는 비자극성, 비독성 및/또는 비알레르기성 매질 중에서 안정적인, 멜라닌 형성을 억제시키는 데 국소적으로 효과적인 신규한 티로시나제 억제제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 한편에서는 실질적으로 균질한 색소침착인 경우에는 피부, 모발 또는 체모의 미백을 위해, 즉, 그의 색소침착 감소를 위한 것, 및 다른 한편에서는 피부 과색소침착을 막기 위한 것, 즉, 피부의 색소침착이 이질적인 경우에 그를 막기 위한 것으로 의도되는, 멜라닌 형성 과정에 작용하는 신규한 탈색제에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 티로시나제에 특이적으로 결합할 수 있고, 티로시나제 활성을 억제시킬 수 있는 뉴클레아제-저항성 DNA 앱타머가 상기 기준 모두를 충족시켰다는 것을 관찰하게 되었다. 특히, 상기 앱타머는 피부 세포를 투과할 수 있다.

항-티로시나제 앱타머를 단리시키기 위해, 본 발명자들은 (천연 DNA와 조성이 동일한) 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 서열의 서열 라이브러리를 사용하였다. 티로시나제와 특이적으로 상호작용할 수 있는 서열을 확인하고, 단리시키고, 특징을 규명하기 위해 지정된 방식으로 선택을 수행하였다.

이어서, 이들 앱타머를 티로시나제 활성을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 시험하였다.

따라서, 본 발명의 제1 목적은 티로시나제의 효소 활성, 및 티로신의 L-DOPA 및 도파퀴논으로의 전환을 억제시킬 수 있는, DNA 앱타머, 바람직하게, 뉴클레아제에 대해 저항성인 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 발명의 제2 목적은 티로시나제의 효소 활성을 억제시키기 위한 본 발명에 따른 앱타머의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 제3 목적은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 및 활성 작용제로서 본 발명에 따른 앱타머를 티로시나제를 억제시키는 데 충분한 양으로 포함하는 화장용 또는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제4 목적은 본 발명에 따른 앱타머의 화장용 용도에 관한 것이다.

본 발명의 제5 목적은 약제로서의 본 발명에 따른 앱타머에 관한 것이다.

본 발명의 제6 목적은

- SELEX 방법에 의해 DNA 라이브러리 중에서 티로시나제의 촉매성 부위에 대한 앱타머를 선택하는 단계,

- 전 단계에서 확인된 앱타머의 티로시나제의 효소 활성을 억제시킬 수 있는 잠재능을 평가하는 단계,

- 상기와 같이 선택된 앱타머를 클로닝하고, 서열 분석하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 앱타머를 선택하는 방법에 관한 것이다.

도　1: 앱타머 T10 .1 및 그의 절두된 버전의 예측된 2차 구조이다.
도　2: 앱타머 T10 .1- 티로시나제 복합체의 센서그램이다 .
도　3: 라운드 10으로부터의 각종 앱타머에 의한 티로시나제 활성 조절을 측정한 측정치이다.
도　4: 생성물 (P)의 출현과 시간 (t) 사이의 관계인, (P)=f(t) 곡선이다.

따라서, 본 발명의 목적은 티로신을 L-DOPA로 전환시키는 티로시나제 단백질의 효소 활성을 억제시킬 수 있는 DNA 앱타머, 바람직하게는 뉴클레아제에 저항성인 DNA 앱타머에 관한 것이다.

앱타머란, 단백질에 대하여 고친화도를 가지는 리간드-특이 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 결과적으로, 상기 의미는 "천연" 앱타머 및 화학적으로 변형된 유사체를 포함한다.

앱타머는 다윈설 방식으로 집단의 진화를 지시할 수 있는 선택/증폭의 변경에 의해 선택되고: 상기 집단에서 가장 "적절한" 분자가 선택되는 바, 이에 원하는 특징을 가지는 올리고뉴클레오티드에 붙여진 "앱타머"라는 명칭의 기원은 선택에서 기인하는 것이다. 표준 유전자 조작 기법 (클로닝, 서열 분석, 발현)을 통해 상기 앱타머들을 개별적으로 쉽게 확인할 수 있으며, 이어서, 그의 특징을 규명할 수 있고, 그를 대량으로 제조할 수 있다.

앱타머는 지수적 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화(systemic evolution of ligands by exponential enrichment: SELEX) (WO　91/19813)로 알려져 있는 최적화된 시험관내 선택 프로토콜에 의해 선택될 수 있다.

SELEX 방법을 통해 친화도 및 특이성이 매우 높은 리간드를 대량으로 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 잠재적인 리간드로 이루어진 라이브러리에의 표적 분자의 노출에 의존한다. 탈착/선택 사이클 시스템을 통해 표적 분자와 가장 특이적으로 상호작용하는 리간드 집단이 농축될 수 있다. 이어서, 수득된 최종 집단을 단리시키고, 특징을 규명함으로써 그를 대규모로 재합성할 수 있다.

비록 SELEX 방법이 앱타머를 선택하는 일반 기법으로서 확립되기는 하였지만, 임의 표적에 대해 예측적인 것도, 표적화된 것도 아니다. 그와는 반대로, SELEX 방법은 각각의 특정 표적에 대해 최적화되고, 적합화될 수 있다. SELEX 방법이 모든 표적에 대해 보증되는 것은 아니다.

앱타머를 선택할 때에는 수개의 인자가 중요하다. 예를 들어, SELEX 방법은 수회에 걸쳐 진행되는 결합, 선택, 및 증폭 사이클을 포함하기 때문에, 표적 분자는 각 SELEX 사이클에서 안정적이어야 하고, 쉽게 재현가능하여야 한다. 추가로, 표적에 대하여 특이 결합을 보이는 핵산이 초기 라이브러리에 존재하여야 한다. 따라서, 고도로 다양화된 초기 핵산 라이브러리를 제조해야 한다.

SELEX 방법에 의해 앱타머를 선택하는 것은 예측불가능하다. 심지어 모든 인자가 앱타머를 선택하는 데 있어 최적인 경우에도, SELEX 방법을 통해서 항상 각 표적에 대해 실행가능한 앱타머를 획득할 수 있는 것은 아니다.

초기 후보물질 라이브러리는, 각각이 3'　및 5' 말단에 라이브러리의 모든 후보물질에 대하여 동일한 불변 영역이 측면에 위치하는 n개의 뉴클레오티드의 장쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 화학적으로 합성된 DNA 서열로 구성되어 있다. 상기 불변 영역을 통해 중앙부는 특히 PCR에 의한 SELEX 동안 조작될 수 있다. 가변부의 길이가 라이브러리의 다양도를 결정짓게 되며, 각 위치는 4개의 뉴클레오티드 A, T, G 또는 C 중 하나로 점유될 수 있는 바, 이에 상기 다양도는 4 ⁿ 이다. 윈도우가 클 경우, 막대한 복잡도가 생기게 된다; n　=　50일 때, 이론상 다양도는 4⁵⁰ (10³⁰)이며, 이는 실제로는 접근불가능한 값인데, 그 이유는 그 값이 각 서열이 1회 제시되는 라이브러리에 대해 10⁵ 톤 초과인 것에 상응하기 때문이다. 실험상 한계는 약 10¹⁵개의 상이한 서열이며, 이는 25-뉴클레오티드 가변 영역을 가지는 모든 후보물질이 제시되는 라이브러리의 것이다. 따라서, 이론상 다양도가 약 10¹⁸인 30-뉴클레오티드 윈도우를 포함하는 라이브러리를 조작하기 위해 선택할 경우에는 단지 1/1,000의 가능성만이 조사될 것이다. 실제로, 일반적으로는 원하는 특성을 가지는 앱타머를 수득하는 데 충분하다. 추가로, 사용되는 폴리머라제가 신뢰할 수 없고, 약 10^-4의 비율로 오차를 도입하기 때문에, SELEX 프로세스 내내 서열 풀의 다양도를 유의적으로 강화시키는 데 기여한다: 무작위 영역의 길이가 100개의 뉴클레오티드 길이인 것인 라이브러리의 경우, 각 증폭 사이클에서 100인 한 후보물질이 변형될 것이며, 이로써, 전체 라이브러리에 대해 10¹³개의 새 후보물질이 출현하게 된다.

각 라운드에서의 선택은 표적과 회합된 분자의 유리 분자로부터의 물리적 분리에 의해 이루어진다. 다중 기법 (크로마토그래피, 필터 보유, 전기영동 등)이 적용될 수 있다. 후보물질 사이의 표적-결합 경쟁이 일어날 수 있도록 선택 조건 (표적/후보물질의 상대적인 온도, 이온 농도, 온도, 세척 등)은 조정된다. 일반적으로, 친화도가 가장 높은 후보물질의 포획을 촉진시키기 위한 목적으로 라운드가 진행됨에 따라 엄격도를 증가시킨다. 추가로, 지지체 (필터, 비드 등)를 인식하는 후보물질을 제거하기 위해 역-선택을 수행한다.

올리고뉴클레오티드는, 각 단위가 적층 상호작용을 생성할 수 있는 중성 pH의 전하, 수소 결합 공여체/수용체 부위, 및 방향족 헤테로사이클 (핵 염기)을 가지는, 올리고-음이온이다. 염기쌍 형성 후, 이들 올리고머는 폴딩하여 2차 및 3차 구조를 생성한다. 따라서, 초기 서열 라이브러리는 각각이 정전기 상호작용을 일으킬 수 있고, H 결합을 형성할 수 있는 등 그러한 것을 할 수 있는 단위 분포에 상응하는, 3차원 형상의 라이브러리이다. 선택은 라이브러리 중 표적에 맞는 형상, 즉, 가장 많은 개수의 가장 안정한 앱타머-표적 복합체가 상호작용하여 형성될 수 있도록 하는 형상을 확인하는 것의 문제가 된다. 소형 표적 (염료, 항생제 등)의 경우, 확인된 앱타머는 마이크로몰 범위의 평형 해리 상수에 의해 특징이 규명되는 반면, 단백질 표적의 경우, 10^-9 M 미만의 K_d 값이 희귀한 값은 아니다.

앱타머 생성을 위해 고도로 다양화된 표적이 겨냥되었다: 아미노산, 펩티드, 단백질 및 효소, 및 또한 복합체 구조, 예컨대, 온전한 바이러스 및 살아있는 세포.

앱타머의 가장 뚜렷한 특성은 그의 리간드와 체결되는 상호작용의 특이성이며, 이를 통해 앱타머는 표적 인식에 대해 이상적인 작용제가 된다.

앱타머는 올리고데옥시뉴클레오티드 (DNA) 또는 올리고리보뉴클레오티드 (RNA)일 수 있다. 후자의 경우, 제1 SELEX 단계는 후보물질 5' 불변 영역의 프로모터 서열을 통해 초기 DNA 라이브러리를 전사시키는 것으로 이루어진다. 선택 후, 후보물질을 역전사에 의해 DNA로 전환시킨 후, 증폭시킨다. 유사한 특징을 가지는 RNA 및 DNA 앱타머를 같은 표적에 대해 선택하였다. 추가로, 두 화합물 모두 서로 경쟁적 억제제이며, 이는 상호작용 부위가 중복된다는 것을 시사한다. 상기는 화학적으로 변형된 앱타머 제조에 대해 중요한 결과를 낳는다.

안티센스 접근법의 개발로, 예를 들어, 생물학적 환경 (세포 배양 배지 또는 생체내)에서 유용한 특성인, 뉴클레아제에 대해 저항성인 것을 올리고머에 제공하는 것인 일부 유사체를 포함하는, 다수의 유사체 합성이 이루어졌다. 포스포디에스테르 결합, 당 또는 당-포스페이트 골격, 예컨대, 2'-O-메틸, "잠금" 핵산 또는 보라노포스페이트 유도체를 변형시키면, 뉴클레아제-저항성 올리고머가 생성된다. 상기 특성은 앱타머에 대해 이로울 수 있다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 후속하여 이루어지는 선택된 RNA 또는 DNA 형태의 앱타머의 화학적 구조의 완전한 변화를 통해 선택 특성이 감소되거나, 상실된다. 상기는 특정 위치에서 변형을 도입하는 것이 불가능하다는 것을 의미하는 것은 아니다. 그러나, 변형에 대하여 내성을 띠는 위치를 확인하는 것이 바람직하다. 이는 풋프린팅의 변형인, 소위 화학적 개입으로 불리는 체계적인 접근법에 의해 또는 특이적인 변이체의 시험에 의해 수행될 수 있다.

물론 비-천연 올리고뉴클레오티드 선택을 직접 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트가 효율적으로 혼입되고, 변형된 매트릭스가 SELEX 동안 사용되는 폴리머라제에 의해 정확하게 판독된다고 가정한다. 매우 극소수의 유사체가 상기 요건을 충족시킨다. 저항성을 뉴클레아제에 부여하는 유도체의 경우, 가능성은 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트 또는 2'-메틸-, 2'-아미노-, 또는 2'-플루오로-피리미딘 유사체로 제한되며, 후자의 것이 단연 최고로 가장 일반적으로 사용된다. 이와 같은 경우에서 확인된 앱타머는 변형된 피리미딘 뉴클레오시드 및 비변형된 퓨린 잔기 (2-히드록실)를 가진다. 이들 분자는 뉴클레아제에 대해 더욱 큰 저항성을 가진다. 상기 명시된 바와 같이, 필요할 경우, 변형된 퓨린 잔기가 추후에 도입될 수 있다. 추가로, 피리미딘의 C(5) 위치에 또는 퓨린의 N(7), C(8) 위치에 치환기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 선택할 수 있다. 상기는 뉴클레아제에 대한 감수성에는 어떤 영향도 미치지 않지만, 새로운 작용성 (소수성, 광활성 등)을 첨가할 수는 있다.

매우 다른 접근법은 광학 이성질체의 사용에 관한 것이다. 천연 핵산은 D-이성질체이다. L-유사체는 뉴클레아제에 대하여 저항성을 띠지만, 폴리머라제에 의해 제조될 수는 없다. 광학 이성질체 현상의 법칙에 따르면, L-시리즈 앱타머는 그의 표적 (T)과 함께, D-시리즈 이성질체 및 표적 (T)의 거울상이성질체(T')에 의해 형성되는 복합체와 동일한 특징을 가지는 복합체를 형성할 것이다. 그 결과, 화합물 T'가 화학적으로 합성될 경우, 이는 천연 앱타머 (D)의 선택을 수행하는 데 사용될 것이다. 일단 확인되고 나면, 상기 앱타머는 L-시리즈로 화학적으로 합성될 것이다. 상기 L-앱타머는 천연 표적 (T)의 리간드가 될 것이다.

최근 2차원 SELEX로 기술되고 있는 또 다른 접근법은 시험관내 올리고뉴클레오티드 선택 및 동적 조합 화학법 (DCC), 즉, 올리고뉴클레오티드의 특정 기 (아민 기)와 알데히드 화합물의 라이브러리 사이의 가역적 반응을 동시에 적용시킨다. 반응을 통해 이민 올리고뉴클레오티드가 제조되고, 이는 종래 SELEX에 대한 원리와 동일한 원리로 선택된다. 따라서, 천연 앱타머와는 다른 표적 헤어핀 RNA 변형된 앱타머를 확인할 수 있었다.

구조를 변경시킬 수 있으며, 앱타머-표적 상호작용 특성이 손실되는 것을 막기 위한 목적으로 도입 이전에 예방적 조치를 취하는 것을 필요로 하는 골격 변경과 달리, 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5 말단 중 하나에 있는 다양한 기를 그의 특징을 파괴시키지 않으면서 그를 도구, 프로브, 또는 센서로 전환시키기 위해서 컨쥬게이트시킬 수 있다. 이러한 다기능성은 추가로 특히 진단학적인 면에서 앱타머의 유의적인 장점을 구성한다.

본원에서 "앱타머 유사체"라는 표현은 상기 기술된 하나 이상의 변형을 의미한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 앱타머는 고친화도로 티로시나제에 결합할 수 있다.

"고친화도"란, 본 발명과 관련하여, 앱타머가 표적과 특이적으로 상호작용하고, 해리 상수가 효소의 촉매 활성을 유의적으로 억제시킬 수 있을 정도로 충분히 낮다는 것을 의미한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 앱타머는 서열 번호 5의 1 이상의 서열을 포함한다.

더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 앱타머는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 서열을 포함한다.

서열 번호 1의 서열이 SELEX 방법에 의해 선택되었다.

서열 번호 2 내지 5의 서열은 서열 번호 1의 단축된 유도체이다.

서열 번호 6의 서열은 프라이머가 없는 서열 번호 1의 일부에 상응한다.

하기 표 1에는 상기 서열들이 요약되어 있다.

더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 앱타머는 서열 번호 7의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 3' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 5' 측면에 위치하고/거나, 서열 번호 8의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 5' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 3' 측면에 위치하는, 서열 번호 6의 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다.

더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 앱타머는 서열 번호 7의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 5' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 3' 측면에 위치하고/거나, 서열 번호 8의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 3' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 5' 측면에 위치하는, 서열 번호 6을 포함한다.

"하나 이상의"라는 것은 임의 개수의 뉴클레오티드, 바람직하게, 3 내지 10개, 더욱 특히 바람직한 방식으로 5개의 뉴클레오티드를 의미한다.

예를 들어, 하기 서열을 언급할 수 있다:

- 서열 번호 10: 서열 번호 7의 3' 말단의 5개의 인접한 뉴클레오티드가 서열 번호 6의 5' 측면에 위치하고, 서열 번호 8의 5' 말단의 5개의 인접한 뉴클레오티드가 서열 번호 6의 3' 측면에 위치하는 서열 번호 6을 포함하는, TCGAACGCAATGGGCGCAGATTGGAAGGCCTAGCATTGAG,

- 서열 번호 11: 서열 번호 7의 3' 말단의 6개의 인접한 뉴클레오티드가 서열 번호 6의 5' 측면에 위치하는 서열 번호 6을 포함하는, GTCGAACGCAATGGGCGCAGATTGGAAGGCCTAGCA.

본 발명에 따른 앱타머는 또한 각 스템 (stem)이 G-C, C-G, A-T 또는 T-A 쌍으로 이루어지고, 각 루프가 2 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 동일한 정단의 스템-루프-스템-루프 2차 구조 (도 1 참조)의 T10.1C (서열 번호 4)로부터 유래된 서열을 포함한다.

상기 서열은 또한 하기와 같이 표시될 수 있다:

X₁---X_nX_(n+1)---X_mX_(m+1)---X_pX_(p+1)---X_rX_(r+1)---X_oX_(o+1)---X_sX_(s+1)---X_t

여기서, 각 X는 뉴클레오티드이고,

1≤n≤5이고,

n+1≤m≤n+5, 바람직하게, n+1≤m≤n+3이고,

m+1≤p≤m+5이고,

p+1≤r≤p+10, 바람직하게, p+2≤r≤p+8, 특히 바람직한 방식으로, r=p+5이고,

r+1≤o≤r+5이고,

o+1≤s≤o+5이고,

s+1≤t≤s+5이고,

t-s=n이고,

o-r=p-m이고,

n, m, p, r, o, s, t는 정수이고, 뉴클레오티드의 위치를 나타내고,

뉴클레오티드 X₁ 내지 X_n 및 X_(s+1) 내지 X_t는 A, T, G 또는 C, 바람직하게, G 또는 C이되, 단, 상기 뉴클레오티드는 쌍을 형성하고, 이로써 스템을 형성하고,

뉴클레오티드 X_(m+1) 내지 X_p 및 X_(r+1) 내지 X_o는 A, T, G 또는 C, 바람직하게, G 또는 C이되, 단, 상기 뉴클레오티드는 쌍을 형성하고, 이로써 스템을 형성하고,

뉴클레오티드 X_(n+1) 내지 X_m 및 X_(o+1) 내지 X_s는 A, T, G 또는 C이고, 쌍을 형성하지 않고, 이로써 루프를 형성하고,

뉴클레오티드 X_(p+1) 내지 X_r은 A, T, G 또는 C이고, 쌍을 형성하지 않고, 이로써 루프를 형성한다.

"스템"은 완벽하게 쌍을 형성하는 이중 가닥 서열로서, 예를 들어:

G-C A-T

C-G A-T

G-C A-T

C-G A-T가 있다.

"루프"는 이중 가닥 서열 내에서 쌍을 형성하지 않는 모티프이다.

본 발명의 특정 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 앱타머는 각 스템이 3개의 G-C, C-G, A-T 또는 T-A 쌍으로 이루어지고, 각 루프가 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 동일한 정단의 스템-루프-스템-루프 2차 구조 (도 1 참조)의 T10.1C (서열 번호 4)로부터 유래된 서열을 포함한다.

상기 서열 번호 12의 서열은 또한 하기와 같이 표시될 수 있다:

여기서, 각 X는 뉴클레오티드이고,

n=3이고,

m=n+3이고,

p=m+3이고,

r=p+5이고,

o=r+3이고,

s=o+2이고,

t=s+3이고,

"스템"은 완벽하게 쌍을 형성하는 이중 가닥 서열, 예를 들어:

G-C A-T

C-G A-T

G-C A-T

C-G A-T가 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 티로시나제의 효소 활성을 억제시키기 위한 본 발명에 따른 앱타머의 용도에 관한 것이다.

티로시나제는 티로신을 L-DOPA로 변환시킨다. 티로시나제의 효소 활성은 L-DOPA의 색상을 띠는 산화 생성물인 DOPA크롬의 출현을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 산화 생성물의 출현의 동역학적 성질은 450　nm에서의 흡광도를 측정함으로써 모니터링된다.

바람직하게, 본 발명은 화장용 또는 피부과용 조성물 중의 피부 탈색제 또는 미백제로서의 본 발명에 따른 앱타머의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 화장학상/제약상 허용되는 부형제, 및 활성 작용제로서 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머를 티로시나제의 효소 활성을 억제시키는 데 충분한 양으로 포함하는 화장용 또는 제약 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 0.00001% 내지 10%, 바람직하게, 0.00005% 내지 5%, 더욱 바람직하게, 0.001% 내지 1%의 하나 이상의 본 발명에 따른 앱타머를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 임의의 조성물은 피부 또는 피부 부속기에 도포될 수 있다.

이는 국소 도포용으로 적합한 모든 제약 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 특히 수용액 또는 유성 용액 형태 또는 실리콘 상 중 수성상의 분산에 의해 (H/Si), 수성상 중 지방상의 분산에 의해 (수중유 에멀젼) 또는 반대로 지방상 중 수성상의 분산에 의해 (유중수 에멀젼) 수득된, 액상 또는 반액상 컨시스턴시를 가지는 로션- 또는 세럼-타입 분산액, 밀크-타입 에멀젼 형태, 또는 크림- 또는 겔-타입 연질 컨시스턴시를 가지는 수성 또는 무수 현탁액 형태, 또는 마이크로캡슐 또는 미세입자 형태, 또는 이온성 및/또는 비이온성-타입 소포성 분산액 형태, 또는 기포 형태를 가질 수 있다. 이들 조성물은 종래 방법을 사용하여 제조된다. 본 발명에 따른 조성물의 다양한 성분들의 양은 고려 중에 있는, 본 분야에서 전형적으로 사용되는 것이다.

화장품 분야에서, 상기 조성물은 특히 얼굴, 손, 발 또는 바디 세정용, 보호용, 관리용 또는 케어용 크림 (예를 들어, 데이 크림, 나이트 크림, 메이크업 리무버 크림, 파운데이션 크림, 선스크린 크림), 액상 파운데이션, 메이크업 리무버 밀크제, 바디 보호용 또는 케어용 밀크제, 선스크린 밀크제, 피부 케어 로션, 겔 또는 폼, 예컨대, 세정용 로션, 선스크린 로션, 인공 태닝용 로션, 목욕용 조성물, 살균제를 포함하는 데오도런트 조성물, 애프터셰이브 겔 또는 로션, 제모용 크림을 구성한다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 예를 들어, 스틱, 콤팩트 파우더, 세정용 비누 또는 바 형태의 파우더 또는 비-파우더 고체 제제로 구성될 수 있다. 이는 얼굴 또는 손 위의 반점에 국소적으로 도포될 수 있게 하는 패치, 펜슬, 브러쉬 및 도포용 도구로서도 제공될 수 있다. 이는 케어 제품으로서, 또는 메이크업 제품으로서 사용될 수 있다.

조성물이 에멀젼일 때, 지방상의 비율은 조성물의 총 중량에 대해 상대적으로 약 5중량% 내지 80중량%, 및 바람직하게, 약 5중량% 내지 50중량%로 달라질 수 있다. 에멀젼 형태의 조성물에 사용되는 오일, 왁스, 유화제 및 공-유화제는 화장품 분야에서 전형적으로 사용되는 것으로부터 선택된다. 유화제 및 공-유화제는 조성물 중에 조성물의 총 중량에 대해 상대적으로 0.3중량% 내지 30중량%, 및 바람직하게, 0.5중량% 내지 20중량%의 비율로 존재한다. 추가로, 에멀젼은 액상 소포체를 함유할 수 있다.

조성물이 유성 용액 또는 겔일 때, 지방상은 조성물 총 중량의 90% 초과로 나타날 수 있다.

공지된 방식으로, 본 발명의 화장용 또는 제약 조성물은 또한 화장품 또는 제약 분야에서 보편적으로 사용되는 애주번트, 예컨대, 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성 작용제, 보존제, 항산화제, 용매, 향미제, 충전제, 필터, 색소, 악취 흡수제 및 착색제를 함유할 수 있다. 이러한 각종 애주번트의 양은 고려 중에 있는, 본 분야에서 전형적으로 사용되는 것이다. 이들 애주번트는 그의 성질에 따라 지방상, 수성상, 지질 소포체 또는 나노입자에 첨가될 수 있다. 이러한 각종 애주번트의 양은 화장품 또는 제약 분야에서 전형으로 사용되는 것이며, 이는 예를 들어, 조성물 총 종량의 약 0.01% 내지 10%로 달라진다. 이들 애주번트는 그의 성질에 따라 지방상, 수성상, 및/또는 지질 소구에 첨가될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 오일 또는 왁스의 예로는 광유 (액상 파라핀), 식물성 오일 (시어 버터의 액상 분획, 해바라기 오일), 동물성 오일 (퍼히드로스쿠알렌), 합성 오일 (푸르셀린(Purcellin) 오일), 실리콘 오일 또는 왁스 (시클로메티콘) 및 플루오로 오일 (퍼플루오로폴리에테르), 밀납, 카르나우바 왁스 또는 파라핀 왁스를 포함한다. 상기 오일에 지방 알콜 및 지방산 (스테아린산)을 첨가할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유화제의 예로는 예를 들어, 글리세롤스테아레이트, 폴리소르베이트 60 및 카테포세(Gattefosse)라는 회사에 의해 테포즈 63(Tefose 63)이라는 명칭하에 시판되는 혼합물 PEG-6/PEG-32/글리콜 스테아레이트를 포함한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 용매의 예로는 저급 알콜, 특히, 에탄올 및 이소프로판올, 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 친수성 겔화제의 예로는 카르복시비닐 중합체 (카보머), 아크릴릭 공중합체, 예컨대, 아크릴레이트/알킬아크릴레이트 공중합체, 폴리아크릴아미드, 다당류, 예컨대, 히드록시프로필셀룰로스, 천연 검 및 점토를 포함하고, 친유성 겔화제의 예로는 개질된 점토, 예컨대, 벤톤, 지방산의 금속 염, 예컨대, 스테아린산 알루미늄, 소수성 실리카, 에틸셀룰로스 및 폴리에틸렌을 포함한다.

본 발명의 조성물은 또한 예를 들어, 멜라닌 형성을 억제하기 위한 하나 이상의 추가의 활성 작용제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 앱타머와 함께 사용될 수 있는 상기 언급된 활성 작용제는 순수한 형태로, 또는 상기 분자를 함유하는 추출물로부터 사용되며, 이는 특히 하기 화합물이다: 엘라그산 및 그의 유도체; 히드로퀴논; 아르부틴; 레조르시놀 및 그의 유도체; 비타민 C 및 그의 유도체; 판토테네이트 술포네이트 및 그의 유도체; 코지산; 알파-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH) 또는 그의 수용체 또는 부신 피질 자극 호르몬 (ACTH)을 직접 또는 간접적으로 방해하는 분자; 폴리올, 예컨대, 글리세린, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜; 비타민; 각질 용해제 또는 박리제, 예컨대, 살리실산 및 그의 유도체; 단독 또는 접합된 알파-히드록시 산, 예컨대, 락트산 또는 말산; 베타-히드록시 산; 아스코르브산 및 그의 유도체; 레티노산; 레틴알데히드; 리포솜 제제 중인지 여부와는 상관없이 레티놀 및 그의 유도체, 예컨대, 팔미테이트, 프로피오네이트 또는 아세테이트; 단독 또는 조합된 형태의 안티글리케이션 제제 또는 항산화제, 예컨대, 토코페롤 및 그의 유도체, 티오타우린, 히포타우린, 아미노구아니딘, 티아민 피로포스페이트, 피리독사민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 아데노신, 트리포스페이트; 항염증제, 예컨대, 스테아릴 글리시레티네이트; 진정제 및 그의 혼합물, 화학적 또는 물리적 선스크린, 예컨대, 옥틸 메톡시신나메이트, 부틸-메톡시에톡시디베조일메탄, 미분화 이산화티탄 및 산화아연; 및 데옥시리보핵산 또는 핵산.

본 발명은 또한 하나 이상의 다른 활성 작용제, 예를 들어, 상기 기술된 활성 작용제와 함께 조합하여 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여하기 위한 약제 제조를 위한 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 목적으로서 인간의 피부, 모발 또는 체모의 탈색 또는 미백화를 위한, 또는 인간의 피부 상의 색소침착 반점을 제거 또는 희석시키기 위한 화장용 또는 피부과용 조성물 중의 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도를 가진다.

본 발명은 또한 목적으로서 멜라닌 합성의 억제제로서의 화장용 또는 피부과용 조성물의 제조에서의, 또는 그의 제조를 위한 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도를 가진다.

본 발명은 또한 티로시나제의 발현을 조절하기 위한 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 목적으로서 인간의 피부의 탈색 또는 미백화시키는 화장용 조성물 중의 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도를 가진다.

본 발명은 또한 목적으로서 인간의 피부의 탈색 또는 미백화시키는 피부과용 조성물의 제조를 위한 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도를 가진다.

본 발명의 또 다른 목적은 바람직하게는 피부, 체모 및/또는 모발을 탈색 또는 미백화시키기 위한, 본 발명에 따른 앱타머의 화장용 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머를 포함하는 화장용 또는 피부과용 조성물을 피부 상에 도포하는 것으로 구성된, 과도한 색소침착을 제어하기 위한, 인간의 피부를 탈색 또는 미백화시키기 위한 화장용 또는 피부과용 관리 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 티로시나제를 과다발현시키는 질환의 국소 치료용 또는 예방용 약제의 제조를 위한 1 이상의 본 발명에 따른 앱타머의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적에는 과색소침착, 예컨대, 멜라닌 세포 과활성에 기인하는 국부 과색소침착, 예컨대, 특발성 기미, 양성 멜라닌 세포 과활성 및 증식에 기인하는 국소 과색소침착, 예컨대, 검버섯 또는 작은 갈색 반점 (노인성 흑자), 우발성 과색소침착, 예컨대, 광감작 또는 흉터 관련 과색소침착을 치료 또는 예방하는 데, 및 특정 백피증, 예컨대, 백반을 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 앱타머가 고려된다.

본 발명의 또 다른 목적은 바람직하게는 피부, 체모 및/또는 모발을 미백화 또는 탈색시키기 위한 약제로서의 본 발명에 따른 앱타머에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 과색소침착, 예컨대, 멜라닌 세포 과활성에 기인하는 국부 과색소침착, 예컨대, 특발성 기미, 양성 멜라닌 세포 과활성 및 증식에 기인하는 국소 과색소침착, 예컨대, 검버섯 또는 작은 갈색 반점 (노인성 흑자), 우발성 과색소침착, 예컨대, 광감작 또는 흉터 관련 과색소침착을 치료 또는 예방하는 데, 및 특정 백피증, 예컨대, 백반을 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 앱타머에 관한 것이다.

본 발명에 따른 앱타머를 벡터화된 형태로, 즉, 벡터에 연결된 형태로 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 이러한 유형의 벡터는 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 이는 콜레스테롤 잔기 또는 나노입자일 수 있다.

본 발명에 따른 앱타머를 또한 두 앱타머의 이량체 형태로 또는 수개의 앱타머로 된 컨쥬게이트 형태로 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은

- SELEX 방법에 의해 DNA 라이브러리 중에서 티로시나제에 대한 앱타머를 선택하는 단계,

실시예 1: 항- 티로시나제 앱타머 선택을 위한 물질 및 방법

단백질

N-말단 GST 태그를 함유하는 재조합 인간 티로시나제 (TYR) 단백질은 압노바(Abnova)로부터 제공받았다. 폴리히스티딘-GST는 유럽 화학 및 생물학 협회(European Institute of Chemistry and Biology)에서 제조하였다.

올리고뉴클레오티드 및 라이브러리

시그마로부터 제공받은 DNA 라이브러리 및 프라이머를 HPLC에 의해 정제하였다. 무작위로 선택된 30-뉴클레오티드 윈도우를 함유하는 라이브러리의 증폭을 위해 프라이머 서열 (P3) 5' GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA (서열 번호 9) 및 (P5) 5' GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA (서열 번호 7)를 사용하였다. 서열 5' ACTGACTGACTGACTGACTA-6C3-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAA를 사용하여 문헌 [ Williams KP, Bartel DP . PCR product with strands of unequal length . Nucleic Acids Res . 1995 Oct 　25;23(20):4220-1)]에 기술된 바와 같이 단일 가닥을 제조하였다. 5' 비오티닐화된 프라이머 (P3)를 사용하여 단일 가닥 후보물질 DNA를 제조하였다. 유로젠텍(Eurogentec)에 의해 후보물질 DNA를 합성하고, HPLC에 의해 정제하였다 (표 1). 매 실험 전에 DNA 집단 및 후보물질을 75℃에서 5분 동안 가열하고, 5분 동안 얼음 상에 놓은 후, 실온에서 5분 이상 동안 놓았다.

시험관내 선택

선택하기 전, DNA 라이브러리 (1 나노몰)를 상기 기술된 바와 같이 처리하고, 실온에서 20분 동안 PBS-Mg 완충제 (154　mM NaCl, 1　mM KH₂PO₄, 2.96　mM Na₂HPO₄·7H₂O, 1　mM (CH₃COO)₂Mg) 중에서 제1 및 제2 라운드를 위해 2회, 및 모든 다른 라운드를 위해 1회에 걸쳐 필터 (0.45　㎛ HAWP, 밀리포어(Millipore))와 함께 인큐베이션시켰다. 매 라운드마다, 폴리히스티딘-GST 태그에 대한 추가의 역-선택을 수행하였다. 이어서, 역-선택된 라이브러리를 20분 동안 티로시나제 (20 피코몰)와 혼합하고, 필터 보유 기법에 의해 비결합 후보물질을 분리하였다. 여과한 후, 500 ㎕의 7 M 페놀/우레아 중에서 65℃에서 20분 동안 인큐베이션시킴으로써 티로시나제에 결합된 후보물질을 용리시키고, 침전시키고, PCR에 의해 증폭시켜 다음 선택 라운드를 위해 사용되는 단일 가닥을 제조하였다. 제10 라운드에서는 선택 동안 후보물질 및 표적의 양이 각각 25 피코몰 및 1 피코몰에 도달하도록 감소시킴으로써 선택 엄격도는 증가하였다. 클로닝하기 전, 매 선택 라운드의 집단을 티로시나제 활성을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다.

클로닝 및 서열 분석

제조사의 설명서에 따라 TOPO TA 클로닝 키트(TOPO TA Cloning Kit) (인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 라운드 7 및 10으로부터 선택된 서열을 클로닝하고, 빅다이 터미네이터 v1.1 사이클 시퀀싱 키트(BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 서열 분석하였다.

표면 플라스몬 공명 ( SPR ) 후보물질의 특징 규명

모든 실험은 23℃에서 PBS-MG를 이용하여 비아코어 3000(Biacore 3000) 장치 상에서 수행하였다.

75℃에서 5분 동안 가열하고, 5분 동안 얼음 상에 놓은 후, 실온에서 5분 이상 동안 놓아 두었던 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 스트렙트아비딘 코팅된 센서 칩 (크산테크 바이오애날리틱스(XanTec bioanalytics)) 상에 고정화시켰다. 올리고뉴클레오티드를 100　nM로 800 내지 1,000　RU에 도달할 때까지 5　㎕/min으로 5분 동안 주입하였다.

23℃에서 티로시나제 및 GST-His 대조군을 500　nM 및 1 μM로 20 ㎕/min으로 주입하였다. 특이 센서그램으로부터 완충제의 효과를 감산하기 위해 PBS-Mg 완충제 및 티로시나제 보관용 완충제를 이용하여 상기와 같은 주입을 수행하였다.

단백질을 각각 주입한 후, 센서 칩의 관능화된 표면을 1분 펄스 동안 40% 포름아미드, 3.6　M 우레아 및 30　mM EDTA의 혼합물을 이용하여 재생시켰다.

BIA 에발 4.1(BIA eval 4.1) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.

실시예 2: 항- 티로시나제 앱타머 선택 결과

표적인 티로시나제에 대한 선택-증폭 방법을 10회에 걸쳐 반복하였다: SELEX 라운드 7 및 10을 클로닝하고, 서열 분석하였다. 라운드 7 및 10으로부터 각각 41개 및 74개의 후보물질 DNA를 분석하였다. 서열 T10.1이 라운드 10의 서열의 42%를 나타내었다. 다른 서열은 큰 다양성을 보였다. 서열 T10.1은 라운드 7에 나타나지 않았다.

m폴드 소프트웨어를 사용하여 후보물질 T10.1의 2차 구조를 예측하였다 (문헌 [Zuker, M., 2003. Nucleic Acids Res 31(13), 3406-415]). 5' 프라이머 P5 (GCCTCCTGTCGAA)의 일부를 포함하고, 잠재적인 5-뉴클레오티드 내부 루프 및 5-뉴클레오티드 정단 루프를 보이는 장쇄의 불완전 스템-루프를 예측하였다 (도 1).

표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 상기 후보물질, T10.1, 및 전장의 후보물질로부터 유래된 절두된 버전 (표 1)의 결합을 조사하였다. 약 1,000 공명 단위 (RU)의 비오티닐화된 후보물질 T10.1을 고정화시키고, 티로시나제를 500　nM 및 1 μM로 주입하였다. 500　nM 및 1 μM에 대하여 각각 16 및 42　RU의 신호가 검출되었으며, 이는 후보물질 T10.1과 티로시나제 사이의 상호작용을 나타내는 것이다 (도　2).

실시예 3: 티로시나제 활성 측정

3.1 원리

효소란 1 또는 2개의 기질의 형질변환을 특이적으로 촉매화시킬 수 있는 단백질이다. 간략화된 효소 반응 모델을

라고 간주할 때, 반응 속도는 하기와 같이 작성된다:

.

(P)=f(t) 곡선을 플롯팅하기 위해 효소 (E)는 기질 (S)에 대해 작용하고; 시점 0은 반응 시발점에 상응한다. 생성물 (P)의 출현은 시간 함수로서 측정된다 (도 4 참조).

반응 속도

는 초기 상태 동안 일정하다 (곡선의 OA 부분). 곡선의 상기 부분의 경우, 원점을 지나는 접선은 곡선과 병합된다: 접선 0A의 기울기인 속도는 초기 속도로 불린다. 이어서, 속도는 감소하게 되고 (곡선의 AB 부분), 0이 된다 (BC 부분). 속도는 기질 중 하나가 소모되었을 때, 또는 평형이 확립되었을 때에 0이 된다.

효소 반응의 속도를 측정할 때, 항상 초기 속도를 계산한다. 따라서, 기질 양의 10% 미만이 가수분해되었을 때인 초기 상태하에서 속도를 측정한다.

일 경우, 초기 속도는 효소 농도에 비례한다: 따라서, 이는 효소 단위로 표시된 효소 제제의 활성을 반영한다.

티로시나제의 효소 활성은 티로시나제의 생성물의 색상을 띠는 산화 생성물을 검출함으로써 측정된다. 티로시나제의 생성물인 L-DOPA는 색상을 띠는 생성물인 도파크롬으로 산화된다. L-DOPA, 이어서, L-도파퀴논의 연속적인 산화의 상기 생성물의 출현의 동역학적 성질은 450　nm에서의 흡광도를 측정함으로써 모니터링된다.

3.2 멜라닌 세포 배양물 중에서의 티로시나제의 효소 활성 측정

정상적인 인간 멜라닌 세포를 96-웰 마이크로플레이트에 웰당 1x10⁴ 개의 세포인 농도로 시딩하였다. 라운드 10으로부터의 다양한 후보물질 및 라운드 10으로부터 유래된 후보물질 (T10.1, T.10.1A, T10.1B, T10.1C, T10.1D)로 처리한 후 72시간 경과하였을 때, 티로시나제의 효소 활성을 측정하였다. 각 앱타머를 농도를 증가시켜가면서 하기 4개의 농도로 시험하였다: 4, 20, 100 및 200　nM.

세포를 PBS로 세정한 후, 50 ㎕의 트리톤X100 (0.5%)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 50 ㎕의 기질 (10　mM L-DOPA, 시그마(Sigma))을 각 웰에 첨가함으로써 반응이 일어나도록 하였다. 꾸준히 계속해서 진탕시키면서 1시간 동안 37℃에서 450　nm에서 매 2분마다 도파크롬 출현을 측정하였다. 따라서, 수득된 반응 속도는 OD 단위/분으로 표시된다.

+20℃에서 BMG 폴라스타(BMG POLARstar) 플레이트 판독기 분광광도계를 사용하여 시간 경과에 따른 흡광도 (450　nm) 변동을 모니터링하였다. 시간 함수 (분)로서 흡광도 (흡광도 단위)를 나타내는 곡선을 플롯팅하였다.

원점을 지나는 접선의 기울기를 계산함으로써 반응의 초기 속도를 측정하였다. V₀은 효과기의 부재하에서의 초기 속도를 나타내고, V_i은 효과기의 존재하에서의 초기 속도를 나타낸다. 비 (V_i/V₀) x 100을 계산하였다: 상기 비가 100일 경우, 효과기는 효소 활성에 대해 어떤 영향도 미치지 않는 것이며; 상기 비가 100 미만일 경우, 효과기는 효소 활성의 억제제이고; 상기 비가 100을 초과하는 경우, 효과기는 활성 작용제이다. 본 측정 결과는 도 3에 제시되어 있다.

시험된 각 후보물질은 티로시나제 활성에 대해 억제 효과를 미친다는 것을 도 3에 제시된 결과로부터 알 수 있었다. 이러한 효과는 시험된 각 조건에 대해 유의적이되, 단, 최저 농도의 가장 단축된 후보물질인 T10.1D (4 및 20　nM)는 예외적이었다.

라운드 10을 구성하는 후보물질 세트는 시험 농도가 어떻든 간에 티로시나제 활성에 대하여 유의적인 효과인 75% 초과의 효과를 미쳤다. 용량 의존성 효과는 관찰되지 않았다. T10.1 후보물질에 대해서도 유사한 결과를 얻었다.

단축된 후보물질인 T10.1A 및 T10.1B 또한 둘 모두 티로시나제 활성의 억제제이다. 그러나, 상기 억제제는 특히 최저 농도일 때 (4 및 20　nM) 전체 크기의 라운드 10 후보물질 및 T10.1의 것보다 열등하였다.

후보물질 T10.1C는 시험된 농도와는 상관없이, 상기 효소를 억제시킬 수 있는 매우 우수한 능력을 가졌다. 특히, 상기 후보물질의 경우, 200　nM 농도로 사용하였을 때에는 티로시나제 활성의 거의 95%를 억제시키는 것으로 관찰되었다. 상기 농도에서 시험된 다른 후보물질 중 어느 것도 상기와 같이 높은 활성을 보이지는 않았다.

가장 단축된 후보물질인 T10.1D가 시험된 농도와는 상관없이, 가장 낮은 억제 활성을 가졌다.

이러한 결과는 앱타머 T10.1D의 구조내 티로시나제 억제 활성에 중요한 영역의 부재를 제안한다.

예시적인 제제

실시예 A: 얼굴 안색 미백화를 위한 화장용 파우더

상기 파우더는 이중 작용을 한다. 이는 피부를 세정하고, 또한 수일간의 규칙적인 사용에 의해 안색을 미백화시킨다. 이는 1일 2회에 걸쳐 피부에 도포될 수 있다.

실시예 B: 에멀젼 -겔 형태의 화장용 탈색 데이 크림

상대적으로 강렬한 일광 조사, 또는 심지어는 태양 직사광에 노출된 일부 사람들은 밝은 안색을 유지하고, 착색된 반점이 출현하는 것을 방지하기를 희망한다. 상기 에멀젼-겔을 사용하게 되면 이러한 목표를 달성할 수 있게 될 것이다. 상기 조성물은 일반적으로 오전에 얼굴에 도포된다. 이는 균질 여부와 상관 없이 얼굴의 색소침착을 예방 및 치료하는, 두 작용 모두를 한다.

실시예 C: 화장용 액상 선스크린 조성물 ( SPF 30)

상기 조성물은 강렬한 햇빛에 노출되기 전에 사용하고자 하는 것이다. 이는 색소침착 반점 출현의 성향이 있는 사람들에서 그러한 현상을 예방하는 것이다. 고농도의 선스크린의 존재가 멜라닌 수준의 감소 결과인 천연 보호의 감소를 보충한다는 것에 주목하여야 한다.

실시예 D: 병상 또는 외상에 의해 유발된 피부 과색소침착을 치료하기 위한 피부과용 크림

상기 크림을 사용하면 병상 또는 외상에 의해 유발되는 피부 과색소침착은 약화된다. 상기 크림은 또한 백반 사례의 경우에서는 탈색된 국부 부위 주변부의 색상 대비를 약화시킨다.

실시예 E: 안색 미백화를 위한 얼굴용 로션

안색 미백화를 위한 상기 로션은 화장을 지우고, 피부를 세정한 후에 사용된다.

실시예 F: 얼굴 미백화를 위한 화장용 세럼

일반적으로 얼굴용 크림을 도포하기 전에 상기 고도로 농축된 세럼 조성물 1 방울을 얼굴에 도포한다. 상기 세럼은 미백화된 안색을 얻거나, 유지시키기 위해서는 전형적으로 1 또는 2주 관리로 사용된다.

실시예 G: 체모 미백화를 위한 화장용 로션

체모가 점진적으로 미백화되도록 하는 데 충분한 기간 동안 본 로션을 미백화시키고자 하는 털이 많은 국부 부위, 특히 팔에 도포한다.

실시예 H: 반점 예방을 위한 화장용 핸드 크림 겔

반점의 색상을 희석시키기 위해서는 상기 크림은 손 위 반점 (일광성 및/또는 노인성 흑자)에 직접 도포되어야 한다.

<110> L V M H RECHERCHE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) <120> APTAMERS INHIBITING THE ENZYMATIC ACTIVITY OF TYROSINASE <130> IPA150661-FR <150> FR 1262754 <151> 2012/12/24 <160> 12 <170> KopatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 1 gcctgttgtg agcctcctgt cgaacgcaat gggcgcagat tggaaggcct agcattgagc 60 gtttattctt gtctccc 77 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 2 gcctcctgtc gaacgcaatg ggcgcagatt ggaaggc 37 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 3 ccctgtcgaa cgcaatgggc gcagattggg 30 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 4 cccgaacgca atgggcgcag gg 22 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 5 cgcaatgggc g 11 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 6 cgcaatgggc gcagattgga aggcctagca 30 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Amorce P5 <400> 7 gcctgttgtg agcctcctgt cgaa 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 8 ttgagcgttt attcttgtct ccc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Amorce P3 <400> 9 gggagacaag aataaacgct caa 23 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 10 tcgaacgcaa tgggcgcaga ttggaaggcc tagcattgag 40 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <400> 11 gtcgaacgca atgggcgcag attggaaggc ctagca 36 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Aptamere <220> <221> stem_loop <222> (1)..(22) <223> tige entre les nucl?tides 1 ?3 et 20 ?22 boucle entre les nucl?tides 4 ?6 et 18 ?19 tige entre les nucl?tides 7 ?9 et 15 ?17 boucle entre les nucl?tides 10 ?14 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22

Claims

티로신의 L-DOPA 및 도파퀴논으로의 전환을 위한 티로시나제의 효소 활성을 억제시킬 수 있는, DNA 앱타머.
제1항에 있어서, 고친화도로 티로시나제에 결합할 수 있는 앱타머.
제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레아제에 대해 저항성인 앱타머.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 5의 서열을 포함하는 앱타머.
제4항에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 앱타머.
제4항에 있어서, 서열 번호 7의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 3' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 5' 측면에 위치하고/거나, 서열 번호 8의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 5' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 3' 측면에 위치하는, 서열 번호 6의 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머.
제6항에 있어서, 서열 번호 7의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 3' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 5' 측면에 위치하고/거나, 서열 번호 8의 서열의 하나 이상의 인접한 뉴클레오티드가 그의 5' 말단으로부터 출발하여 서열 번호 6의 3' 측면에 위치하는, 서열 번호 6을 포함하는 앱타머.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열을 포함하는 앱타머:
X₁---X_nX_(n+1)---X_mX_(m+1)---X_pX_(p+1)--- X_rX_(r+1)---X_oX_(o+1)---X_sX_(s+1)---X_t
여기서, 각 X는 뉴클레오티드이고,
1≤n≤5이고,
n+1≤m≤n+5이고,
m+1≤p≤m+5이고,
p+1≤r≤p+10, 바람직하게, p+2≤r≤p+8, 특히 바람직한 방식으로, r=p+5이고,
r+1≤o≤r+5이고,
o+1≤s≤o+5이고,
s+1≤t≤s+5이고,
t-s=n이고,
o-r=p-m이고,
n, m, p, r, o, s, t는 정수이고, 뉴클레오티드의 위치를 나타내고,
뉴클레오티드 X₁ 내지 X_n 및 X_(s+1) 내지 X_t는 A, T, G 또는 C, 바람직하게, G 또는 C이되, 단, 상기 뉴클레오티드는 쌍을 형성하고, 이로써 스템 (stem)을 형성하고,
뉴클레오티드 X_(m+1) 내지 X_p 및 X_(r+1) 내지 X_o는 A, T, G 또는 C, 바람직하게, G 또는 C이되, 단, 상기 뉴클레오티드는 쌍을 형성하고, 이로써 스템을 형성하고,
뉴클레오티드 X_(n+1) 내지 X_m 및 X_(o+1) 내지 X_s는 A, T, G 또는 C이고, 쌍을 형성하지 않고, 이로써 루프를 형성하고,
뉴클레오티드 X_(p+1) 내지 X_r은 A, T, G 또는 C이고, 쌍을 형성하지 않고, 이로써 루프를 형성한다.
티로시나제의 효소 활성을 억제시키기 위한, 1 이상의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 앱타머의 용도.
하나 이상의 화장학상/제약상 허용되는 부형제, 및 활성 작용제로서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 티로시나제의 효소 활성을 억제시키는 데 충분한 양으로 포함하는 화장용 또는 제약 조성물.
제10항에 있어서, 조성물의 0.00001중량% 내지 10중량%, 바람직하게, 0.00005중량% 내지 5중량%, 더욱 바람직하게, 0.001중량% 내지 1중량%로 하나 이상의 앱타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
바람직하게 피부, 체모 및/또는 모발의 탈색 또는 미백화 (lightening)를 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 앱타머의 화장용 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서의 앱타머.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 멜라닌 세포 과활성 (melanocyte hyperactivity)에 기인하는 국부 과색소침착, 예컨대, 특발성 기미, 양성 멜라닌 세포 과활성 및 증식에 기인하는 국소 과색소침착, 예컨대, 검버섯 또는 작은 갈색 반점 (노인성 흑자), 우발성 과색소침착, 예컨대, 광감작 또는 흉터 관련 과색소침착을 치료 또는 예방하는 데, 및 특정 백피증, 예컨대, 백반을 치료하는 데 사용하기 위한 앱타머.
- SELEX 방법에 의해 DNA 라이브러리 중에서 티로시나제에 대한 앱타머를 선택하는 단계,
- 전 단계에서 확인된 앱타머의 티로시나제의 효소 활성을 억제시킬 수 있는 잠재능을 평가하는 단계,
- 상기와 같이 선택된 앱타머를 클로닝하고, 서열 분석하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 앱타머를 선택하는 방법.