KR20030004349A

KR20030004349A - 탈색제로서 멜라닌 색소의 합성에 포함되는 효소들의발현을 조절하는 신종의 올리고뉴클레오티드들 및올리고뉴클레오티드들의 사용방법

Info

Publication number: KR20030004349A
Application number: KR1020027010455A
Authority: KR
Inventors: 로벵 뀌르퓌르스트; 레진느 졸리
Original assignee: 엘브이엠에이취 러쉐르쉐
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2003-01-14
Also published as: JP2010090145A; DE60123580T2; AU2001235651A1; FR2804960A1; ATE341624T1; EP1255827B1; FR2804960B1; JP5237247B2; JP4056743B2; CN101067135B; US7087743B2; JP2008043334A; CN101067135A; EP1255827A2; CN1411508A; JP2003521929A; HK1051557A1; US20040014700A1; WO2001058918A3; EP1255827B8

Abstract

본 발명은 신종 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)들과 또한 그 유도체들과 관련된다.

이들 신종 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)들은 티로시나아제 (tyrosinase)를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물들을 혼성할 수 있고, 또는 티로시나아제(tyrosinase)-관련-단백질 1(TRP-1)을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 혼성할 수 있다.

본 발명은 또한 미용 합성물 또는 피부병학용 합성물의 탈색제 또는 표백제로서의 이들 신종의 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)들의 사용 방법에 관련되어 있다.

Description

탈색제로서 멜라닌 색소의 합성에 포함되는 효소들의 발현을 조절하는 신종의 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드들의 사용방법 {NOVEL OLIGONUCLEOTIDES AND USES OF OLIGONUCLEOTIDES WHICH MODULATE THE EXPRESSION OF ENZYMES INVOLVED IN THE SYNTHESIS OF MELANIN PIGMENTS, AS DEPIGMENTING AGENTS}

인간에게 있어, 색소형성은 피부, 모근낭 또는 눈에서의 멜라닌 색소의 합성과 분배로 인해 일어난다. 색소형성은 유전적으로 미리 결정되지만, 많은 내부적 또는 외부적 요인들에 의해 조절된다. 멜라노사이트(melanocyte)에 의해 생성되는멜라닌과 또한 멜라노사이트(melanocyte)의 수, 그들의 티로시나아제(tyrosinase) 활동과 케라티노사이트(keratinocyte)에 멜라닌을 전송하는 능력, 그리고 멜라닌 알갱이를 함유하는 멜라노좀(melanosome)들의 크기는 인간 피부 색을 조절하게 된다. 각 개인에 있어서, 피부색은 주로 자외선(UV ray)의 주요한 복사량의 많고 적음에 따라서 다양화된다. 다시 말해서, 각 개인에 있어서, 그가 가장 약한 양의 자외선 복사에 지배될 때, 그것은 그의 가장 약한 피부색에 부합하고, 산의 고지에서 직면할 수 있는 것 같은 강렬한 자외선 복사에 지속적인 기간동안 노출될 때 그의 어두운 피부색에 부합하는 최대한의 색소형성에 도달하는 강한 양의 자외선 복사를 받는 다면 더욱 강한 피부 색소형성에 부합하는 기본적인 피부 색소형성이 존재한다.

게다가, 잘 알려진 바대로, 지구 인종 집단에는 피부 색소형성과 관련하여 매우 거대한 유전적 다양성이 존재한다. 따라서, 집단에 따라, 위에서 특정한 기본 색소형성에 부합하는 피부색은 두 극단-매우 창백하고 매우 어두운-사이에 놓여있는 좀 더 창백하고 좀 더 어두운 피부색을 보여준다. 또한, 집단에 따라, 기본 색소형성과 최대한의 색소형성 사이의 피부색에서의 차이는 좀 더 혹은 좀 덜 의미를 갖는다. 따라서, 창백한 피부(기본적 색소형성)를 갖는 특정한 집단에 속하는 개인들이 자외선 복사의 활동에 신속하고(혹은) 주요하게 반응하고, 따라서 이 개인들이 그들을 지속적인 기간의 시간동안 태양에 신속하게 노출하지 않았을 때 조차 쉽게 어두운 피부색을 가질 수 있다. 앞으로의 서술에서, 이 개인들은 "자외선 복사에 매우 반응적인 개인"이라는 표현으로 표시될 것이다. 이것은 특히 아시아 기원의 집단이나 혼혈종 집단으로 칭해지는 특정 집단에 대한 경우이다.

더욱이, 개인들은 그들의 피부 위에 특히 얼굴이나 손에서, 피부에 특정한 이질감을 주는 더 어둡거나 더 색이 짙은 영역이나 결점의 출현을 목격한다.이러한 결점들은 표피의 케라티노사이트(keratinocyte)들의 멜라닌의 상당한 농도에 기인한다.

피부 색소형성의 메커니즘은 멜라닌의 합성을 포함한다. 이 메커니즘은 특별히 복잡하고 개략적으로 다음 주요 단계를 포함한다.

티로신(Tyrosine) --> 도파(Dopa) --> 도파퀴논(Dopaquinone) --> 도파크롬(Dopachrome) --> 멜라닌

이 반응의 계열들에 포함되는 것으로 알려진 효소는 티로시나아제(tyrosinase)와 단백질 1 관련 티로시나아제(tyrosinase)(TRP-1)이다. 특히 이 효소들은 티로신(Tyrosine)의 도파(Dopa)에의 치환 반응과 멜라닌 색소의 형성을 이끄는 도파(Dopa)의 도파퀴논(Dopaquinone)으로의 치환반응을 촉진한다. 이 효소들은 멜라노지네시스(melanogenesis)의 반응 메카니즘 동안 개별적으로 포함되지는 않는다. 사실, 티노시나아제(tyrosinase)와 TRP-1는 효소착물을 형성한다.(Winder et al. (1994) Cell. Mol. Biol. Res. 40: 7-8; Orlow et al. (1994) J. of Investigative Dermatology 103: 196-211) 이 두 효소들은 따라서 일제히 행동하고 상대방이 없을 때에는 결코 기능하지 않는 것으로 나타난다. 세포가 TRP-1이 고갈되었을 때, 티로시나아제(tyrosinase) 활동의 손실이 관측된다.(Orlow et al. (1994)) ; 이것은 활성화를 위해서는 티로시나아제(tyrosinase)는 TRP-1의 존재를 필요로 한다는 것을 의미한다.(Zhao et al. (1996) J. of Investigative Dermatology 106: 744-752)

앞으로는, 멜라닌의 합성경로에 포함되는 이 필수적인 효소들이 "색소형성을 위해 필수적인 효소들"로 표시될 것이다.

분자는 이 세포들의 활동 저해에 의해 표피의 멜라노사이트(melanocyte)에 직접적으로 행동한다면, 그리고/또는 멜라닌 생합성의 단계들 중 하나를 막는 다면 색소분해 분자로 인정된다. 이것은 특히 분자가 멜라노지네시스(melanogenesis)에 포함된 효소들의 하나를 저해할 때 또는 멜라닌 합성 체인의 화학적 화합물과 반응할 때의 경우이다.

알려진 색소분해 물질들은 특히 하이드로퀴논(hydroquinone)과 그 유도체, 아스코빅(ascorbic)산과 그 유도체, 태반 추출물, 코직산, 페룰릭산, 알부틴, 디하이드록시벤젠 유도체(WO 00/47045), 구아이콜 유도체(WO 00/47179), 4-(2,3-디하이드록시페닐)시클로렉사놀 (WO 00/56279), 레조키놀(resorcinol) 유도체(WO 00/56702)와 페놀 아미드(phenol amide)(WO 99/32077)이다. 이 물질들은 특정한 결점을 가질 수 있다. 그들은 불안정하거나, 고농도의 사용을 필요로하거나, 그들의 활동 모드에 관계되는 한정성을 결핍하거나 또는 세포독성이나 자극적인 힘을 가질 수 있다. 효과적이고 해가 없는 색소분해 물질의 논제의 사용은 미용과 피부병학에서 특히 요구된다. 물질들은 특히 특수 경로 멜라즈마와 같은멜라노사이트(melanocyte)의 과도한 반응에 기인하는 국부적인 과도한 색소형성과, 노쇠 색소 결점으로 알려진 색소 결점(노년의 모반)과 같은 양성 멜라노사이트(melanocyte)의 과도반응과 증식에 기인하는 국지적인 과도 색소형성과, 광감작(光感作)이나 반흔(瘢痕) 모양의 과도한 색소형성과 같은 우연한 과도색소형성과, 백반(白斑)과 같은 각막 백반 피부를 다루기 위해 사용된다. 후자의 경우들에서, 피부의 색소 재형성은 불가능하기 때문에, 탈색된 영역의 가장자리 주위의 색소형성은 더욱 동질의 색상을 피부에 주기 위하여 희석되게 한다.

탈색물질은 또한 특정한 개인, 특히 위에서 자외선 복사에 민감하게 반응하는 개인으로 표현된 개인들에 의해 그들의 피부색을 밝게하기 위하여, 특히 가능한 한 창백하거나 동질의 피부색을 유지하기 위해, 혹은 자외선의 색소 형성 효과를 최소로 줄이기 위해 그들의 얼굴이나 그들의 손에 탈색제로서 사용된다.

전문가가 직면하는 문제는 따라서 예를 들면 피부에 자극적이고, 유독한 그리고/또는 알러지성이지 않고, 성분이 안정적인 기존 물질의 결점을 갖지 않는 인간 피부, 체모 또는 모발을 위한 새로운 탈색제 또는 새로운 표백제의 고안, 생산 또는 분리이다.

멜라노사이트(melanocyte) 기능이상, 특히 백반증과 다른 탈색소 질병에 기인하는 질병을 다루기 위한 안티센(antisenese) 올리고뉴클레오티드의 사용은 WO 99/25819에 기술되어 있다. 이 병리학의 피부 조건들에서, 색소형성 결핍은 비정상적으로 높은 테나신 함유량에 기인한다. 상기 문서에 표현되어 있는 올리고뉴클레오티드는 테나신(tenascin) 발현의 조절에 의해 색소형성 결핍에 대응하여 행동한다.

반면, 본 발명의 목적은, 첫번째로 충분히 동등한 색소형성의 경우에 예를 들면 피부, 체모, 모발의 색소형성을 감소시켜 탈색하기 위해 의도된, 멜라노지네시스(melanogenesis)의 과정에 작용하는 탈색제를 제공하는 데에 있다. 그리고 두번째로 예를 들면 피부가 이질적인 색소형성을 나타날 때 피부의 과다 색소형성과 싸우는 데에 있다.

본 발명은 새로운 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)과 그 유도체에 관계된다.

이들 새로운 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)들은 멜라닌 색소의 합성 경로에 관계되는 필수 효소의 하나를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 합성할 수 있다.

본 발명은 또한 미용이나 피부병학용 합성물질로 피부에 사용되는 탈색제나 표백제로서의 이들 새로운 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)들의 사용방법에 관계되어 있다.

본 발명의 발명자는 올리고뉴클레오티드가 유전자, 또는 색소형성을 위해 필수적인 효소를 인코딩하는 유전자(RNA와 같은)의 생성물을 합성할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 멜라노사이트(melanocyte) 내의 색소형성을 위한 필수적 효소의 발현을 조절하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 상기 멜라노지네시스(melanogenesis) 반응의 역행이다. 이 활동은 심지어 이들 올리고뉴클레오티드의 이점을 증가시키는 매우 낮은 농도에서도 존재한다. 게다가, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 세포 독성을 보이지 않는다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 종래에 사용되던 물질에 의해 제기되는 문제들의 이상적인 해법을 제안한다. 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 활동을 저해하는 알려진 물질들(특히 하이드로퀴논(hydroquinone)과 그 유도체, 아스코빅(ascorbic)산과 그 유도체, 태반 추출물, 코직(kojic)산, 알부틴(arbutin))은 그들의 결함 있는 특이성에 기인하는 많은 받아들일 수 없는 부작용을 가진다.본 발명은 따라서 탈색 효과를 얻기 위해 효소를 직접적으로 막는 대신에 색소형성을 위한 필수적 효소의 생성물을 조절함에 의해 앞선 연구자들에 의해 직면된 문제들을 해결한다.

필수 효소들이 착물의 형태로 일제히 기능하기 때문에, 본 발명자들은 제기된 문제를 풀기 위해 착물의 효소들의 하나 또는 다른 것의 발현을 막는 신종의 올리고뉴클레오티드를 서술하였다.

본 발명에 관한 올리고뉴클레오티드는 의약용 생산품으로서 본질적으로 새로운 것이다.

본 발명은 유전자 또는 색소형성을 위해 필수적인 효소들의 하나를 인코딩하는 유전자의 생성물을 합성할 수 있는 7과 25사이의 번호의 뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드에 관계되고, 바람직하게는 9와 25사이, 12와 25사이, 15와 25 사이 또는 18과 25 사이, 더욱 바람직하게는 20과 동등한 번호로 구성되는 올리고뉴클레오티드와 관계된다. 특히, 상기 올리고뉴클레오티드는 유전자 또는 티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전사의 생성물, 또는 유전자 또는 단밸질1 관련 티로시나아제(tyrosinase)(TRP1)를 인코딩하는 유전자의 생성물을 합성할 수 있다.

본 발명은 더욱이 위에서 한정되고, 특히 유전자 또는 티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전사의 생성물, 또는 유전자 또는 TRP1을 인코딩하는 유전자의 생성물을 합성할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관계된다.

특히, 다음에 나타나는 서열(sequence) SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11로부터 선택되는 서열(sequence)의 올리고뉴클레오티드이다.

- SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'

- SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'

- SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'

- SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'

- SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'

- SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'

- SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'

- SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'

- SEQ ID NO. 9 5'-CTAGACACAATCTGCCAAGA-3'

- SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'

- SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'

본 발명의 과제는 또한 위에서 서술한 서열(sequence) SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11의 하나의 서열(sequence)인 새로운 생성물로서 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에 관한 문맥에서, "티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자"라는 표현은 티로시나아제(tyrosinase) 유전자의 유전적 서열(sequence)을 의미하는 것으로 의도된다. 유사하게, "TRP-1을 인코딩하는 유전자"라는 표현은 TRP-1 유전자를 인코딩하는 유전적 서열(sequence)을 의미하는 것으로 의도된다.

멜라노지네시스(melanogenesis)에서 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1의 핵심 역할은 알려져 있다. 효소나 단백질의 발현을 조절하기 위한 효소나 단백질을 인코딩하는 메신저RNA에 직접적으로 대항하는 올리고뉴클레오티드의 사용 또한 알려져있다. 그러나, 본 발명의 발명자들에 의해 발전된 기술은 탈색의 수단으로서 결코 사용된 적이 없다.

본 발명에 관한 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 메신저RNA나 유전자 합성하기 위하여 한정된다. 그들은 따라서 유전자에 의해 생산되는 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 양의 궁극적인 조절을 수행하는 것을 가능하게 한다.

본 문서에서, "합성"이라는 용어는 왓슨-크릭 짝짓기로도 알려진 이중 나선의 형태로 중복부위를 형성하기 위한 종래의 핵산의 두개의 가닥 위의 상보성의 염기들 사이의 수소 결합의 구조를 나타내는 것으로 사용된다.

동일한 길이의 두 핵산 사이의 상보성의 정도는 정렬 후에 첫번째 서열(sequence)을 두번째 서열(sequence)에 상보적인 서열(sequence)과 비교하는 것에 의해 결정된다. 상보성의 정도는 이들 두 서열(sequence) 사이의 상보성의 정도를 얻기 위하여 비교되는 두 서열(sequence) 사이의 뉴클레오티드가 동일한 동등한 위치의 수를 결정하고, 이 동등한 위치의 수를 전체 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하는 것에 의해 계산된다.

"특정(specific) 합성"이라는 용어는 특히 특정된 부착이 요구되는 조건 하의 올리고뉴클레오티드의 표적되지 않은 서열(sequence)로의 특정되지 않은 부착을 피하기에 충분한 상보성의 정도가 존재하는 것을 의미한다. 이것은 올리고뉴클레오티드가 특정적으로 핵산을 합성하기 위해 표적 핵산의 서열(sequence)로 100%상보성을 가질 필요가 없다는 것으로 이해된다. 특히, 적어도 약 80%에 동등한 상보성의 정도를 갖는 올리고뉴클레오티드는 표적으로서 선택된 핵산으로 특정적으로 합성할 수 있는 것이다.

본 발명에 관한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 특정적으로 유전자 또는 색소형성을 위해 필수적인 효소를 인코딩하는 유전자의 생성물로 핵산을 합성한다. 특히, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자의 DNA, 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 DNA, 또는 대안적으로 이 유전자들의 하나 또는 다른 것으로부터 파생되는 mRNA 중의 어느 하나로 합성할 수 있다. 본 발명에 관한 올리고뉴클레오티드는 동일한 것과 특정적으로 핵산을 합성하는 수에서 충분한 뉴클레오티드의 수로 구성된다. 이 특성은 일반적으로 "안티센(antisenese)"이라 명명된다.

본 발명의 과제는 따라서 관련된 유전자의 코딩영역으로의 또는 대안적으로 이 유전자의 번역을 위한 개시코돈을 제시하는 영역으로 역행하는 특정적으로 핵산을 합성하는 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 과제는 또한 DNA, 또는 색소형성을 위한, 특히 티로시나아제(tyrosinase)나 TRP-1을 위한 필수적인 효소의 하나를 인코딩하는 메신저 RNA 중의 하나로 특정적으로 핵산을 합성하는 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 과제는 또한 코딩되지 않는 영역 5', 개시코돈을 제시하는 영역, 코딩 영역, 또는 유전자나, 색소형성의 필수적인 효소, 특히티로시나아제(tyrosinase)나 TRP-1의 하나를 인코딩하는 mRNA의 코딩되지 않는 영역 3' 중의 하나로 특정적으로 합성하는 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 문맥에서, "티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 DNA" 또는 "TRP-1을 인코딩하는 DNA"라는 표현은 엑손(exon)과 인트론(intron) 양쪽 모두를 의미하는 것으로 의도되고, 특히 엑손(exon)을 의미하는 것으로 의도된다.

이것은 다음과 같이 특정된다.

* SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 서열(sequence)의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 그 유전자 또는 TRP-1을 인코딩하는 mRNA의 코딩되지 않는 영역 5'로 특정적으로 핵산을 합성한다.

* SEQ ID NO. 5 서열(sequence)의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유전자 또는 TRP-1을 인코딩하는 mRNA의 개시코돈을 제시하는 영역으로 특정적으로 핵산을 합성한다.

* SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 서열(sequence)의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유전자 또는 티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 mRNA의 코딩되지 않는 영역 5'로 특정적으로 핵산을 합성한다.

* SEQ ID NO. 9 서열(sequence)의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유전자 또는 티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 mRNA의 코딩 영역으로 특정적으로 핵산을 합성한다.

* SEQ ID NO. 10 서열(sequence)의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유전자 또는 티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 mRNA의 개시코돈을 제시하는 영역으로 특정적으로 핵산을 합성한다.

* SEQ ID NO. 11 서열(sequence)의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유전자 또는 TRP-1을 인코딩하는 mRNA의 코딩되지 않는 영역 5'로 특정적으로 핵산을 합성한다.

본 발명의 과제는 또한 그들의 당류 구성성분, 핵염기 구성성분, 또는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 증가된 생체 이용률, 표적 서열(sequence)에 대한 친화력의 증가, 세포의 내재화의 증가, 또는 더 좋은 생물학적 안정성 또는 세포의 뉴클레아제 존재의 안정성의 증가와 같은 바람직한 물리화학적 특성을 부여하는 인터뉴클레오티드(internucleotide)의 중요 요소로의 하나 또는 그 이상의 화학적 변형물로 구성되는 올리고뉴클레오티드이다.

예증으로서, 이러한 특성을 부여할 수 있는 변형물은 뉴클레오시드의 당류 구성성분의 2'-O-알킬과 2'-O-불소 유도체들과 인터뉴클레오티드(internucleotide)의 중요 성분 내의 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 유도체 또는 메틸인산(methyl phosphonate) 유도체들이다.

본 문서에서, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 천연 핵염기들과, 자연 그대로의 포스포디에스테르(phosphodiester) 연결을 경유하여 서로 연결되는 뉴클레오사이드를 형성하는 펜타푸라노사일(penatafuranosyle)로부터 만들어지는 폴리뉴클레오티드라고 언급한다. 따라서 "올리고뉴클레오티드"는 자연종, 또는 자연 단위 또는 그 폐쇄 동족체로부터 만들어지는 합성종으로 언급한다.

"올리고뉴클레오티드"는 또한 천연 올리고뉴클레오티드와 유사한 기능을 가지지만 천연적이지 않은 부분을 포함할 수 있는 구성성분으로 언급된다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 당류 구성성분, 변형된 핵염기 구성성분, 또는 변형된 인터뉴클레오티드(internucleotide) 연관을 가질 수 있다. 가능한 변형물 중에서, 바람직한 변형물은 당류 구성성분의 2'-O-알킬 유도체들이고, 특히 2'-O-에틸옥시-메틸 또는 2'-O-메틸 유도체, 또는 인터뉴클레오티드(internucleotide) 주요 구성요소를 위한 포르포로시오에이트 또는 메틸인산(methyl phosphonate)들이다.

키메라 올리고뉴클레오티드(chimeric oligonucleotide)는 본 발명의 우선적인 변형물에 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 각각 적어도 하나의 뉴클레오티드로 구성되는 적어도 두개의 화학적으로 다른 영역을 포함한다. 이것은 특히 하나 또는 그 이상의 유익한 성질, 예를 들면 더 나은 생물학적 안정성, 증가된 생체 이용률, 세포의 내재화의 증가, 또는 표적 RNA에 대한 친화력의 증가 등을 제공하는 변형된 뉴클레오티드로 구성된 하나 또는 그 이상의 영역을 포함한다.

바람직하게는, 인터뉴클레오티드(internucleotide) 주요 구성요소는 완전히 또는 부분적으로 포스포디에스테르(phosphodiester), 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 또는 메틸인산(methyl phosphonate), 또는 포스포디에스테르(phosphodiester)와/또는 포스포로시오에이트(phosphorothioate)와/또는 메틸인산(methyl phosphonate) 연관들의 결합으로 구성될 수 있다.

따라서, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는 그것의 인터뉴클레오티드 (internucleotide) 주요 구성요소의 포스포디에스테르(phosphodiester)의 일부가 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 그룹과/또는 메틸인산(methyl phosphonate)그룹으로 대체되는 것으로 특성화된다.

택일적으로, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는 모든 포스포디에스테르(phosphodiester) 그룹이 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 그룹 또는 메틸인산(methyl phosphonate) 그룹으로 대체되는 것으로 특성화된다.

택일적으로, 포스포디에스테르(phosphodiester) 그룹은 완전히 또는 부분적으로 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 그룹과/또는 메틸인산(methyl phosphonate) 그룹으로 대체된다.

"올리고뉴클레오티드"라는 용어는 또한 플라스미드 타입의 환형 투여 매개체 또는 핵산이나 펩티드 타입의 선형 투여 매개체가 이식되는 올리고뉴클레오티드로 언급된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 의학용 생산품으로서는 새로운 것이다.

본 발명의 과제는 또한 상기에서 기술된 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 미용적으로 또는 피부병학적으로 받아들일 수 있는 매질을 포함하는 미용의 또는 피부병학용의 합성물이다. 그러한 합성물은 또한 바라는 효과를 강화하도록 의도된 하나 또는 그 이상의 즉효성의 약제를 포함한다.

본 발명의 과제는 또한 인간의 피부, 체모 또는 모발을 탈색하거나 표백하기 위한, 또는 인간 피부 위의 색소 결점을 희박시키기 위한 미용 또는 피부병학용의 합성물의 생산에, 또는 생산을 위해 색소형성을 위한 필수적인 효소, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 하나를 인코딩하는 유전자의 전사(轉寫)의 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)의 사용방법이다.

본 발명은 또한 유전자 또는 색소형성을 위해 필수적인 효소 특히, 미용 약제로서, 특히 인간의 피부, 체모 또는 모발을 탈색하거나 표백하기 위한, 또는 인간 피부 위의 색소 결점을 희박시키기 위한 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 하나를 인코딩하는 유전자의 생성물로 특정적으로 핵산을 합성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사용방법과 관련된다.

본 발명의 과제는 또한 멜라닌 합성의 저해자로서 미용 또는 피부병학용의 합성물의 생산에 또는 생산을 위해 색소형성을 위해 필수적인 효소의 하나, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사의 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 사용에 있다.

본 발명은 또한 논제의 경로를 경유하는, 티로시나아제(tyrosinase)와/또는 TRP-1의 과도한 발현에서 초래되는 질병의 처리 또는 방지를 위해 의도된 의약 생성물의 생산을 위해 위에서 기술된 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 사용에 관련된다. 이 의약용 생성물은 멜라닌 합성을 저해하기 위해, 특히 피부를 탈색하거나 표백하기 위해 의도될 수 있고, 그러나 또한 노년의 색소형성 결점(노년의 모반)과 같은 양성의 멜라노사이트(melanocyte) 과도반응과 증식에 기인하는 국지화된 과도 색소형성의, 그리고 광감작(光感作) 또는 상처자국과 같은 우연한 과도 색소형성의, 독자 경로의 멜라즈마와 같은 멜라노사이트(melanocyte)의 과도 반응에서 기인하는 국부적인 과도 색소형성을 처리하거나 다루기 위해, 그리고 백납과 같은 특정 백반의 취급을 위해 의도될 수 있다.

본 발명의 과제는 또한 인간 피부를 위한 탈색 또는 표백의 미용 합성물에서 색소형성을 위한 필수적인 효소의 하나, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사의 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)의 사용에 있다.

본 발명은 또한 색소형성을 위한 필수적인 효소, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 하나의 발현을 조절하기 위한 위에서 기술된 올리고뉴클레오티드의 사용과 관련된다.

본 발명의 과제는 또한 인간 피부를 위한 탈색 또는 표백의 피부병학용 합성물의 생산을 위해 색소형성에 필수적인 효소, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 하나를 인코딩하는 유전자의 전사의 생성물에 대해 직접적인 적어도 하나 이상을 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)의 사용에 있다.

본 발명은 또한 색소형성을 위해 필수적인 효소의 하나, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사의 생성물에 대해 직접적인 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)로 구성되는 착색된 피부로의 미용 합성물의 적용에 구성되는 인간 피부의 탈색 또는 표백을 위한 미용 또는 피부병학용 처리 방법에 관련된다.

본 발명의 과제는 또한 미용적 또는 피부병학적으로 받아들일 수 있는 매질로, 색소형성에 필수적인 이 효소들의 하나, 특히 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사의 생성물에 대해 직접적인 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)을 포함하는 것으로 특성화 되는 탈색 합성물에있다.

앞서 언급된 합성물, 사용, 처리방법들에 대한 본 발명의 바람직한 구체화에 따라, 올리고뉴클레오티드는 밑에 한정된 그것들의 하나의 그것들의 서열(sequence)이다.

- SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'

- SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'

- SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'

- SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'

- SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'

- SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'

본 발명에 따른 미용 또는 피부병학용의 합성물은 논제의 사용을 위해 적합하고 따라서 미용적으로, 또는 피부병학적으로 받아들일 수 있는 매질, 예를 들면 피부에 잘 맞는 매질을 포함한다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 서열(sequence)은 구성물 총 중량의 0.00001%에서 10%사이, 바람직하게는 0.0003%에서 3%사이의 범위의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 합성물은 논제의 적용을 위해 전통적으로 사용되는 모든 약제의 형태 특히 수성 또는 오일 겔의, 액상, 풀, 또는 고형 무수의 생산물의, 또는 미국특허 4,508,703에 기술된 대로 수성 또는 유성 상에서 나노스피어(nanosphere)와 나노캡슐(nanocapsule)과 같은 폴리머 입자의 디스퍼젼의, 또는 이온 또는 이온이 아닌 타입의 지질 소낭의 디스퍼젼의 기름-포함-물 또는 물-포함-기름의 수성, 수성-알콜성 또는 다중 에멀젼의 형태로 제공될 수 있다.

이 합성물은 덜 또는 더욱 유동성일 수 있고, 백색이나 색상을 가진 크림, 연고, 유제, 겔, 로우션, 혈청제, 페이스트, 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이것은 선택적으로 에어로졸의 형태로 피부에 적용될 수 있다. 이것은 또한 예를 들어 스틱이나 컴팩트 파우더의 형태로 분말이거나 그렇지 않은 고체의 형태로 제공될 수 있다. 이것은 또한 패치의 형태로, 연필의 형태로, 얼굴이나 손의 결점에 국지적으로 적용될 수 있는 솜막대의 형태로 제공될 수 있다. 이것은 치료용 생산품 또는 미용 생산품으로 사용될 수 있다.

알려진 방식으로, 본 발명의 합성물은 또한 친수성 또는 지방 친화성의 겔 약제, 친수성 또는 지방 친화성의 즉효제, 보존제, 산화방지제, 용매, 방향제, 첨가재, 차단제, 안료, 악취 흡수제 그리고 염료와 같은 미용 화장품과 피부학에서 일반적인 보조제를 포함할 수 있다. 이 다양한 보조제들의 양은 연구중의 영역에서 전통적으로 사용되는 것들이다. 그들의 본성에 의존하여, 이 보조제들은 지방상으로 , 액상으로, 지질소낭 또는 미세입자로 소개될 수 있다.

본 발명의 미용 또는 피부병학용의 합성물이 에멀전일 때, 지방상의 비율은 일반적으로 합성물의 총 중량에 상대적으로 5에서 80%의 범위 일 수 있고 바람직하게는 5에서 50%의 범위 일 수 있다. 에멀전의 형태로 합성물에서 사용되는 오일, 유화유(乳化油,emulsifiers)와 혼성-유화유(co-emulsifiers)는 일반적으로 합성물 총 중량의 0.3%에서 30%, 바람직하게는 0.5%에서 20%의 상대적 중량의 범위의 비율로 합성물에서 존재한다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있는 오일로서, 미네랄 오일(액상 석유 젤리), 식물성 오일(아보카도 오일, 콩기름), 동물성 기름(라놀린), 합성오일(퍼하이드로스쿠알렌(perhydrosqualene)), 실리콘 오일(사이클로메티콘(cyclomethicone)), 플루오르 오일(퍼플루오르폴리에테르)로 언급될 수 있다. 지방성 알콜(세틸 알콜(cetyl alcohol)), 지방산과 왁스들(카나바 왁스, 오조케리트(ozokerite))은 또한 지방성 물질로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합으로 사용될 수 있는 유화유(乳化油,emulsifiers)와 혼성-유화유(co-emulsifiers)로서 예를 들어, PEG-20 스테아르산염(stearate)과 같은 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르와, 글리세릴 스테아르산염(stearate)과 같은 글리세린 지방산 에스테르로 언급될 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합으로 사용될 수 있는 친수성의 겔 제로서 특히 카르복시비닐 폴리머(카보머(carbomer)), 아크릴산염(acrylate)/알킬아크릴산염(acrylate) 혼성 폴리머와 같은 아크릴 혼성 폴리머, 폴리아크릴아미드, 폴리사카라이드(polysaccharide), 천연 검과 점토로 언급될 수 있다. 지방 친화성 겔 제로서, 벤톤(bentone)과 같은 변형된 점토, 지방산의 금속 염, 소수성의 실리카와 폴리에틸렌으로 언급될 수 있다.

본 발명의 과제는 적어도 하나 이상의 위에서 기술된 올리고뉴클레오티드와 하나 또는 그 이상의 다른 즉효제를 포함하는 미용 또는 피부병학용의 합성물에 있다.

본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 즉효제를 조합하는데 있어 동시에 또는분리되어 또는 시간에 걸쳐 사용되는 방식으로 행해지는 용법으로 의도된 약제 생산물의 제조를 위해 위에서 기술된 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 사용방법과 관련되어 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합으로 사용될 수 있고, 순수한 또는 이 분자를 포함하는 추출물로부터 기원되어 사용될 수 있는 상기 즉효제는 특히 다음의 화합물이다: 엘라그산(ellagic acid)과 그 유도체; 하이드로퀴논(hydroquinone); 알부틴(arbutin); 레조키놀(resorcinol)과 그 유도체; 비타민 C와 그 유도체; 술폰산 판토텐염(pantothenate sulphonate)과 그 유도체; 코직(kojic)산; 태반 추출물; 알파-멜라노사이트(melanocyte)-자극 호르몬(α-MSH) 또는 그 수용기 또는 아드레노-코디코트로픽 호르몬(ACTH)로 직접 또는 간접적으로 방해하는 분자; 글리세롤, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올(polyol); 비타민; 살리실산(salicylic acid)과 그 유도체와 같은 각질용 또는 박리용제; 랙틱(lactic)산 또는 말릭(malic)산 혼자 또는 이식된 α-하이드록산(α-hydroxy acid); 아스코빅(ascorbic)산과 그 유도체; 레티노 산(retinoic acid)(retinoic acid); 레틴알데히드(retinaldehyde); 리포솜 조합제에 존재하거나 그렇지 않을 수 있는 팔미트산염(palmitate), 프로피온에스테르(propionate) 또는 아세테이트와 같은 레티놀과 그 유도체; 토코페롤과 그 유도체, 시오타우린(thiotaurine), 하이포타우린(hypotaurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 시아민 파이로인산염(thiamine pyrophosphate), 피리독스아민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 삼인산 아데노신, 스테아릴 글리시리티네이트(glycyrrhetinate)와 같은 소염제와 같은 조합 또는 홀로 쓰이는 안티글리케이션제 또는 산화 방지제; 안정제와 그 혼합물, 미소화된 아연산화물, 티타늄산화물, 부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane)과 옥틸메톡시시나메이트(octylmethoxycinnamate)와 같은 화학적 또는 물리적 태양광선 차단제; 그리고 디옥시리보핵산 또는 핵산이다. 만약 불화합성이라면, 이 다른 즉효제와/또는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 소구(小球)체로서 조합될 수도 있고, 특히 미국특허 4,508,703에 기술된 이온성 또는 비이온성의 양쪽 친매성의 지질로 만들어지는 소낭 또는 미세입자로 조합될 수 있다.

그러나, 다음 실시예들은 본 발명을 한정하지 않으며 본 발명에 대해 설명한다.

시험관 속의 배양 매개물에서 그리고 일반적인 실험에 맞춰 안정성의 이유로, 실시예 2부터 4는 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 유도체로 수행되었고, 실시예 5에서 12는 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 또는 포스포디에스테르(phosphodiester) 유도체로 동등하게 준비되었다.

다음 실시예들에서, 다른 서술이 없다면 모든 함량은 중량에 의한 것으로 주어진다.

실시예 1: 올리고뉴클레오티드 합성

실시예로써, 올리고뉴클레오티드는 제조자의 프로토콜을 이용하는 표준 포스포아미다이트(phosphoramidite) 유도체 화학에 의해 자동합성기(퍼셉티브 바이오시스템 신속 모델 8909)로 합성된다. β-사이아노에틸디이소필포스포아미다이트(phosphoramidite)는 퍼스펩티브 시스템사에 의해 제공된다. 포스포디에스테르(phosphodiester) 올리고뉴클레오티드를 위해, 포스파이트 산화 단계는 이오딘(iodine) 용매로 수행된다. 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 올리고뉴클레오티드와 관련해서, 포스파이트 산화 단계는 안하이드로스 아세토니트릴의 3H-1,2-벤조디시올-3-one 1,1-디옥사이드 0.05몰을 사용하여 수행된다. 컬럼(퍼셉티브 바이오시스템의 세공 유리에 의해 제어되는)으로 부터 분리와 33% 수성 암모니아 용액으로 섭씨 55도에서 18시간동안 처리에 의한 서열(sequence)의 전체 탈 보호 후에, 올리고뉴클레오티드는 소듐 아세테이트의 존재하의 에탄올 내에서의 침전에 의해 정제된다. 높음 압력의 액성 크래마토그래피 조작은 소듐 클로라이드 경사도를 사용한 용리로 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 그리고 트리에틸암모늄 아세테이트의 존재하의 아세토니트를의 경사도를 사용한 용리로 C18 역전상 크래마토그래피에 의해 수행된다.

합성된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 기술된다. 그들은 SEQ ID NO. 1로부터 SEQ ID NO. 11로 번호 매겨진 이 표의 첫번째 11 서열(sequence)들이다. 그들의 탈색 활동도가 다음 예들에서 보고된 연구들의 과제였다.

표 1에서, 서열(sequence)들의 각 마지막 아래에 주어진 숫자들은 기원의 서열(sequence)들에서 올리고뉴클레오티드의 위치를 나타낸다.

상대적으로 서열(sequence)들은 Thoku J. Exp. Med. 156: 403(1998), 시바하라 등에서 출간된 인간 티로시나아제(tyrosinase) cDNA의 "HUMTYRA"라 명명된 서열(sequence), Nucl. Acides Res. 18: 2807(1990)(Genbank 접근 번호 M 27160), 코엔 등에서 출간된 인간 TRP-1 cDNA의 "HSTYRRP"라 명명된 서열(sequence)과 Mamm. Genom 9: 50 (1998)(Genbank 접근 번호 AF 001295), 박스 등에서 출간된 "AF001295"라 명명된 또다른 TRP-1의 서열(sequence)로부터 비롯된다.

더욱이, 유전자들, 또는 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자들의 생성물에 관한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 특정성을 뒷받침하기 위한 비교로서, 본 발명의 서열(sequence) SEQ ID NO. 2에 기초한 두 올리고뉴클레오티드들은 다음과 같은 이름으로 합성된다:

* 서열(sequence) SEQ ID NO. 2의 기초들의 순서를 역전시켜 구성되는 표 1에서 SEQ ID NO. 12로 표시된 "센스 콘트롤"이라 명명된 서열(sequence)

* 서열(sequence) SEQ ID NO. 2의 기초들로서, 그러나 어떠한 순서로 위치하는 자연과 숫자에서 같은 기초들로 구성되는 역시 표 1에서 SEQ ID NO. 13으로 표시된 "스크램블드 콘트롤"이라 명명된 서열(sequence)

SEQ ID NO.	올리고뉴클레오티드 서열(sequence)	유전자 자리
1.	5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'111 92	HSTYRRP
2.	5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'102 83	HSTYRRP
3.	5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'127 108	HSTYRRP
4.	5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'53 34	HSTYRRP
5.	5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'141 122	HSTYRRP
6.	5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'475 457	HUMTYRA
7.	5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'485 466	HUMTYRA
8.	5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'490 471	HUMTYRA
9.	5'-CTAGACACAATCTGCCAAGA-3'1332 1313	HUMTYRA
10.	5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'506 487	HUMTYRA
11.	5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'5875 5856	AF001295
12.	5'-TTCTCGACGTTTGGTCCAGA-3'	센스 콘트롤SEQ ID NO.2
13.	5'-ACGTTTCTCGCCTAGTGATG-3'	스크램블드 콘트롤SEQ ID NO.2

실시예 2: 평범한 인간 멜라노사이트(melanocyte)(NHM들)에 대한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 탈색 효과

표 1과 실시예 1에 나타나는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11)는 멜라노지네시스(melanogenesis)에 대한 그들의 활동과 관련되어 연구되어지고, 따라서 멜라노사이트(melanocyte)에 의한 멜라닌 색소의 생성물을 조절하는 그들의 능력과 관련되어 연구되어진다. "센스 콘트롤"(SEQ ID NO. 12)과 "스크램블드 콘트롤"(SEQ ID NO. 13) 올리고뉴클레오티드는 또한 비교를 위한 요소로서 이 활동에 관련되어 연구되어 진다.

멜라노지네시스(melanogenesis)에 대한 반응 메카니즘 동안, 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1은 L-도파(Dopa)의 도파퀴논(Dopaquinone)으로의, 그리고 나서 도파크롬(Dopachrome)으로의 전환을 촉진시키는 효소 착물의 구실을 하는 것이 상기된다. 이 두 효소들은 일시에 작용하고, 그들은 결코 서로 상대방 없이는 기능하지 않는 것으로 나타난다. 사실, TRP-1에 대해 직접적으로 향하는 안티센(antisenese) 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 세포가 TRP-1이 고갈되었을 때, 티로시나아제(tyrosinase)(또한 "도파(Dopa) 산화 효소"라고도 불리는) 활동의 감소가 목격된다. 티로시나아제(tyrosinase)는 또한 그 다중 기능 성질 때문에 "도파(Dopa) 산화 효소" 라고도 불린다; 그것은 사실 티로신(Tyrosine)에서 도파(Dopa)로의 산화동안 도파(Dopa) 산화효소로서 동일한 기능을 수행한다.

본 분석의 원칙은 기질로서 사용되는 L-도하의 도파크롬(Dopachrome)으로의 전환에서 도파(Dopa) 산화효소에 대한 반응률을 측정하는 데에 기초한다. 도파크롬(Dopachrome)의 출현은 테스트 되는 올리고뉴클레오티드의 각각과 조작 분석에 대한 도파(Dopa) 산화효소에 대한 반응률을 계산하는 것을 가능하게 하는 주어진 시간에서의 광 밀도를 측정하는 것에 의해 정량화된다. 관측된 결과에 기초하여, 따라서 테스트된 올리고뉴클레오티드의, 멜라노지네시스(melanogenesis)에 대한 반응을 평가 판단하는 것이 가능해진다. 조작 분석에 비교되는 반응률에서 한방울은 효소 활동도에서의 감소와, 결국 멜라닌 색소의 형성의 감소와 일치하고 따라서 탈색 효과와 일치한다.

올리고뉴클레오티드로 멜라노사이트(melanocyte) 배양과 처리의 준비:

멜라노사이트(melanocyte)는 코카서스 인종 아이의 포피로부터 얻어진다. 피부 조각들은 PBS(Gibco, Paisley, GB)로 헹구어지고나서 70% 에탄올로 헹구어진다. PBS로의 마지막 헹굼 후, 피부는 최소한의 진피를 포함하는 정교한 1mm의 피부편으로 잘린다. 진피와 표피는 밤새 섭씨 4도에서 0.25% 트립신 용액(Gibco, Paisley, GB)에서 피부편을 배양함으로써 분리된다. 배양 후, 표피세포는 외과용 메스로 긁어서 회복된다. 트립신의 활동은 세포를 10%(V/V) 포에탈 카프 혈청(Foetal calf serum)(Gibco, Paisley, GB)을 포함하는 E-199 매질(Gibco, Paisley, GB)에 세포를 위치시킴으로써 정지된다. 균질화와 표면에서 떠다니는 코네오사이트(corneocyte)를 제거한 후에, 세포 현탁액은 필터링되고, 원심분리되고, 정제는 표피 성장 요인을 표시한 EGF가 있는 다음 표에서 주어지는 화합물인 부착 매질(매질1)에 흡수된다.

매질 1의 합성물
화합물	공급자, 참고문헌	매질에서 마지막 농도
-E-199 매질	Gibco, 31150-022	q.s. for 100% (v/v)
-포에탈 카프 혈청	Gibco, 10099-133	10% (v/v)
-히드로코르티손	Sigma, H-0135	0.4 ㎍/ml
-L-글루타민	Gibco, 25030-024	2 mM
-EGF	Sigma, E-4127	10 ng/ml

세포수를 센 후에, 200 000/cm²의 크기의 플라스크 안에 씨내려진다. 세포들은 습도로 포화된 환경에서 섭씨 37도로 5% CO₂로 유지된다. 세포들이 부착된 후, 부착 매질은 매 48시간 마다 재생되는 KSFM(Gibco, Paisley, GB)으로 대체된다.

배양기에 위치된 표피 세포는 따라서 케라티노사이트(keratinocyte)-멜라노사이트(melanocyte) 혼성 배양물을 얻을수 있도록 한다. 이 혼성 배양물이 약 70% 합류하자마자, KSFM 매질은 멜라노사이트(melanocyte)와, IBMX로 표시하는 3-이소부틸-1-메틸크산틴과 PMA로 표시하는 포볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트가 있는 밑의 표에 나타나는 합성물의 성장을 촉진하는 선택된 매질(매질 2)로 대체된다.

매질 2의 합성물
화합물	공급자, 참고문헌	매질에서 마지막 농도
-E-199 매질	Gibco, 31150-022	q.s. for 100% (v/v)
-포에탈 카프 혈청	Gibco, 10099-133	10% (v/v)
-L-글루타민	Gibco, 25030-024	0.4 ㎍/ml
-IBMX	Sigma, I-5879	2 mM
-PMA	Sigma, P-8139	10 ng/ml
-지네티신(Geneticin)	Gibco, 066-01811Y	100 ㎍/ml

48에서 72시간 후에, 세포들은 실온에서 1 에서 2분동안 0.1% 트립신-0.05% EDTA 혼합물(Gibco, Paisley, GB)을 사용하여 플라스크로부터 떼어진다. 얻어진 세포 현탁액은 선택된 매질에서 원심분리되고 부유시킨다. 세포들은 실온에서 1 에서 2분동안 트립신-EDTA(0.1%-0.05%)로 다시 24 에서 48시간 후에 처리되고, 그리고 나서 멜라노사이트(melanocyte)를 위해 특정되는 증식 매질(매질 3)에서 다시 심어진다.

매질 3은 10% 매질 2와 90% 매질 A로 구성된다. 매질 A는 케라티노사이트(keratinocyte) 매질 SFM(Gibco, 17005-034)이다.

이 단계에서, 얻어진 세포수는 순수하고, 전적으로 보통의 인간 멜라노사이트(melanocyte)(NHM들)로 구성된다.

연구 전에, 일주일 동안 NHM들은 포볼(phorbol) 에스테르 또는 IBMX(매질 4)와 같은 강력한 대사 활성제를 포함하지 않는 매질에 위치된다.

매질 4는 10% 매질 B와 90% 위에서 기술된 매질 A로 구성된다. 매질 B의 합성물은 다음 표에 기술된다.

매질 B의 합성물
화합물	공급자, 참고문헌	매질에서 마지막 농도
-E-199 매질	Gibco, 31150-022	q.s. for 100% (v/v)
-포에탈 카프 혈청	Gibco, 10099-133	10% (v/v)
-L-글루타민	Gibco, 25030-024	2 mM

NHM들은 매질 4의 200㎕에 골(well)당 10 000 세포들의 양으로 96-골 마이크로플레이트(Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 심어진다.

시험되어져야 하는 올리고뉴클레오티드들은 각각 10nM, 100nM, 250nM, 500nM과 1nM의 농도로 임시적으로 연구 매질 안에서 준비된다. 다양한 올리고뉴클레오티드들의 처리는 7일동안 매일 수행된다. 각각의 농도에서 3번의 분석이 수행된다.

도파(Dopa) 산화효소 활동도에 대한 반응률의 측정:

7일동안 나누어져 행하는 이 처리들의 마지막에, 티로시나아제(tyrosinase) 또는 "도파(Dopa) 산화효소" 활동도가 측정된다.

세포들은 PBS로 헹구어지고 나서, 50㎕ 세포용해 완충액(PBS(Gibco, 14190-094)내의 0.5% 트리톤 X100(Sigma, T-9284))이 골들에 첨가되고, 상기 플레이트는 섭씨 4도에서 한시간동안 섞인다. 반응은 각각의 골에 기질(10 mM L-도파(Dopa), Sigma) 50㎕ 를 첨가함으로써 개시된다. 도파크롬(Dopachrome)의 출현은 마이크로플레이트 판독기 340 ATTC(SLT-Labinstrument, Grodig/Salzburg, Austria)광밀도 판독기를 사용하여 규칙적으로 흔들면서 한시간동안 섭씨 37도에서 매 2분마다450nm에서 측정된다. 반응률은 10^-4OD 단위/분으로 계산되고 표현된다.

올리고뉴클레오티드로 처리되는 배양물들과 조작 배양물(처리되지 않는)에 대해 얻어지는 결과는 표 2에 주어진다.(σ:표준 편차)

테스트된 올리고뉴클레오티드들의 식별 번호 및 농도	반응률10^-6OD 단위/분	반응률(올리고뉴클레오티드 부재하의 조작)	조작에 비교되는변화%
SEQ ID NO. 1 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	21.8 σ= 1.023.3 σ= 0.420.3 σ= 0.319.5 σ= 2.923.9 σ= 1.4	26.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.8	-17.4-11.7-23.1-26.1-9.4
SEQ ID NO. 2 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	20.5 σ= 1.718.8 σ= 1.519.2 σ= 0.719.7 σ= 1.722.9 σ= 1.1	26.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.8	-22.3-28.8-27.3-25.4-13.3
SEQ ID NO. 3 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	23.7 σ= 3.120 σ= 0.721.1 σ= 0.619.9 σ= 1.723.6 σ= 0.6	26.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.8	-10.2-24.2-20.1-24.6-10.6
SEQ ID NO. 4 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	22.9 σ= 1.219.9 σ= 1.620.9 σ= 1.421.2 σ= 1.720 σ= 1.2	26.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.8	-13.3-24.6-20.8-19.7-24.2
SEQ ID NO. 5 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	23.5 σ= 0.719.3 σ= 0.917.9 σ= 1.720.5 σ= 0.621.3 σ= 0.8	26.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.8	-10.9-26.9-32.2-22.4-19.3
SEQ ID NO. 6 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	20.7 σ= 1.822.0 σ= 0.620.1 σ= 2.518.7 σ= 2.620.5 σ= 1.1	26.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.826.4 σ= 1.8	-21.6-16.7-23.9-29.2-22.4
SEQ ID NO. 7 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	26.6 σ= 2.225.3 σ= 1.123.8 σ= 1.321.7 σ= 0.922.6 σ= 0.7	25.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.9	+6.4+1.2-4.8-13.2-9.6
SEQ ID NO. 8 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	24.1 σ= 0.123.7 σ= 0.625.1 σ= 1.023.4 σ= 0.623.7 σ= 0.2	25.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.9	-3.6-2.5+0.4-6.4-5.2
SEQ ID NO. 9 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	27.1 σ= 0.722.3 σ= 0.622.6 σ= 0.223.2 σ= 0.525.0 σ= 0.7	25.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.9	+8.4-10.8-9.6-7.20

SEQ ID NO. 10 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	26.4 σ= 0.924.9 σ= 0.523.1 σ= 0.323.3 σ= 0.626.9 σ= 0.7	25.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.9	+5.6-0.4-7.6-6.8+7.6
SEQ ID NO. 11 10 nM100 nM250 nM500 nM1 μM	25.7 σ= 0.924.8 σ= 0.325.8 σ= 0.722.1 σ= 4.423.9 σ= 0.8	25.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.925.0 σ= 0.9	+2.8-0.8+3.2-11.6-4.4
SEQ ID NO. 1250 nM100 nM150 nM	34.6 σ= 1.033.2 σ= 0.733.9 σ= 0.7	32.5 σ= 1.432.5 σ= 1.432.5 σ= 1.4	+6.5+2.2+4.3
SEQ ID NO. 1350 nM100 nM150 nM	33.5 σ= 1.236.3 σ= 0.634.0 σ= 1.2	32.5 σ= 1.432.5 σ= 1.432.5 σ= 1.4	+3.1+11.7+4.6

본 발명의 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11)로 멜라노사이트(melanocyte) 배양균을 다루는 것은 도파(Dopa) 산화효소 활동도에 대한 반응률에서의 감소를 초래한다는 것이 표 2에 나타난 결과로부터 명백하게 나타난다. 이 감소는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 6에 대해 특히 명백하다.

반면, 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2, "센스 콘트롤"로 명명되는 SEQ ID NO.12와 "스크램블드 콘트롤"로 명명되는 SEQ ID NO. 13에 관한 비교로서 테스트되는 올리고뉴클레오티드에 대해, 도파(Dopa) 산화효소 활동도에 대한 반응률에서의 증가는 테스트된 농도들의 각각에서 표시된다. 예를들어, 100nM의 농도에서, 본 발명에 따른 안티센(antisenese) 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2의 경우에 28.8% 반응률이 감소하는 데 비하여, "센스 콘트롤"과 "스크램블드 콘트롤"에 대해 각각 2.2%와 11.7%로 증가한다.

마지막의 관측으로 부터 본 발명의 반응률을 감소시키는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 반응도는 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1을 인코딩하는 표적 메신저 RNA로 올리고뉴클레오티드의 특정한 합성에 기인한다는 것이 추측될 수 있다.

결과적으로, 이 올리고뉴클레오티드/mRNA 상호작용은 표적 메신저 RNA에 의해 운반된 자료의 번역을 막을 것이고, 따라서 세포 내에서의 사용된 안티센(antisenese) 서열(sequence)에 의존하는 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 발현에서의 감소를 초래한다. 다시 말해서, 이 상호작용은 티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 새로운 합성을 감소시킬 것이다. 이 효소들의 자연적 재생 때문에, 이것은 세포들에서의 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1 양의 감소를 초래할 것이고, 결국, 멜라닌의 합성으로 유지하는 이들 효소들의 활동도에서의 감소를 초래할 것이다. 사실, 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 멜라노사이트(melanocyte)들에서 이미 존재하는 티로시나아제(tyrosinase)에 대한 활동 대신에, 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1의 재생의 감소에 의해 활동한다.

멜라노사이트(melanocyte)에 대한 이 활동의 결과는 멜라닌을 합성하는 이 세포들의 능력이 감소하는 것이고, 따라서 상기 케이스와 관련된 개인들에 의존하는 표백 또는 탈색 효과의 생성물이다.

실시예 3: 물라토 성인 기증자로 부터의 일반 인간 멜라노사이트 (melanocyte)에 대한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 탈색효과

여기서 사용되는 멜라노사이트(melanocyte)는 물라토 성인 기증자의 대퇴부로부터의 피부로부터 얻어진다. 피부조각은 PBS로 헹구어지고, 그리고 나서 PBS에서 50%로 희석된 70%에탄올로 씻겨진다. PBS로 씻겨진 후, 콘 커터를 사용하여 긁어진다. 얻어진 조각들은 분리되도록 하기 위하여 섭씨 37도에서 한시간동안 0.05% 트립신(Difco Laboratories, West Molesy, GB)에서 긁어진다. 그리고나서 표피는 10%의 포에탈 카프 혈청(Foetal calf serum)(FCS, Gibco. Paisley, GB)을 함유하는 E-199 매질(Gibco, Pasley, GB)에서 회복된다. 균질화와 표면을 떠다니는 각질층의 조각들의 제거 후에, 세포 현탁액은 필터링되고 원심분리된다. 얻어진 세포 알갱이는 실시예 2에 기술된 매질 1에서 처리된다. 세포들은 세어지고, 세포들의 생존능력은 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 토마(Thoma)세포에 대해 측정된다. 표피 세포들은 마침내 플라스크 안에서 80 000 세포/cm²의 비율로 매질 1에 심어진다. 배양물들은 5% 의 CO₂로 습도로 포화된 환경에서 섭씨 37도로 유지된다.

매질 1은 B-FGF가 기본적인 결합 근원 세포 성장 요인으로 표시되고, PdBu가 포볼(phorbol) 12,13-디부타이리트로 표시되는 밑의 표에서 특정되는 합성물인 매질 6으로 대체된다.

매질 6의 합성물
화합물	공급자, 참조문헌	매질에서의 마지막 농도
- E-199 매질- 인슐린(Insulin)- EGF- B-FGF- PdBu- 칼슘 클로라이드(Calcium chloride)	Gibco, 31150-022Sigma, H-0888Sigma, E-4127Gibco, 13256-029Sigma, P-1269Prolabo, 22317297	q.s. for 100% (v/v)0.5 ㎍/ml10 ng/ml10 ng/ml0.25 ㎍/ml1.8 mM

이 매질은 1 또는 2주동안 매 48시간마다 재생된다.

멜라노사이트(melanocyte)들의 이 선택 후에, NHM 증식은 매질 6을 매질 7로 대체함으로써 촉진시킨다.

매질 7은 10%의 매질 C와 PdBu가 보충된, 매질안에서 0.25㎍/ml인 마지막 농도로 위에서 기술된 90%의 매질 A로 구성된다.

매질 C의 합성물
화합물	공급자, 참조문헌	매질에서의 마지막 농도
- E-199 매질- 포에탈 카프 혈청- L-글루타민(L-glutamine)- IBMX- Gemeticin	Gibco, 31150-022Gibco, 10099-133Gibvo, 25030-024Sigma, I-5879Gibco, 066-01811Y	q.s. for 100% (v/v)10% (v/v)2 mM10^-4M100 ㎍/ml

이 단계에서, 얻어진 세포수는 순수하다. 이것은 전적으로 NHM들로 구성된다.

NHM들은 매질 6에서 96-골 마이크로플레이트(Falcon, franklin Lakes, NJ, USA)에 심어진다. 24시간 후에 매질은 이 연구의 마지막까지 쓰여질 매질 8로 대체된다. 매질 8의 합성물은 밑에 나타나 있다.

매질 8의 합성물
화합물	공급자, 참조문헌	매질에서의 마지막 농도
- MCDB-153 매질- 포에탈 카프 혈청- 인슐린- 트랜스페린(Transferrin)- α-토코페롤- 페니실린/스트렙토미신(streptomycin)	Sigma, M-7403Gibco, 10099-133Sigma, I-6634SigmaSigma, T1157Sigma, P4333	q.s. for 100% (v/v)2% (v/v)5 ㎍/ml10 ㎍/ml1 ㎍/ml0.4% (v/v)

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2는 50nM, 100nM, 250nM, 500nM과 1μM의 농도로 임시적으로 본 연구 매질에 첨가된다. 처리는 7일동안 매일 수행된다. 각각의 농도에 대해, 6개의 분석이 수행된다.

도파(Dopa) 산화효소 활동도에 대한 반응률의 측정:

7일간 나누어져 행해지는 이들 처리에 대한 마지막에, 도파(Dopa) 산화효소 활동도가 측정된다. 이 측정들은 실시예 2에서와 같은 방식으로 수행된다. 반응률은 10^-4OD 단위/분으로서 계산되로 표현된다.

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2로 처리되는 배양물들과 처리하지 않는 조절 배양물들에 대해 얻어지는 결과는 표 3에 주어진다.(σ:표준 편차)

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2의 농도	반응률	반응률(올리고뉴클레오티드 부재하 조작)	조작에 비교되는변화%
50 nM100 nM250 nM500 nM1 ㎛	33.8 σ= 3.429.8 σ= 1.329.6 σ= 2.228.3 σ= 1.527.6 σ= 2.9	33.0 σ= 3.533.0 σ= 3.533.0 σ= 3.533.0 σ= 3.533.0 σ= 3.5	+2.4-9.7-10.3-14.2-16.3

상기 결과에 따라, 매우 낮은 농도의 올리고뉴클레오티드(100nM)와 상기 이 농도로 부터, 도파(Dopa) 산화효소 활동도는 매우 충분히 감소되는 것이 관측된다.

따라서 실시예의 결론에서 이미 설명된 대로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드들은 멜라닌을 합성하는 멜라노사이트(melanocyte)의 능력을 감소시킨다. 이것은 본 분석에서 관련된 사람의 유전적 특성에 독립적이라는 것을 입증시킨다.

본 실시예에서, 이것이 어두운 피부 색에 일치하는 기본 색소형성을 갖는 물라토 기증자를 포함하기 때문에 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 사용이 표백의 효과, 예를 들면 피부 색의 밝게함을 초래할 것이다.

실시예 4: 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 의해 일반적 인간 멜라노사이트(melanocyte)들에 대한 UV-유발되는 멜라노지네시스(melanogenesis)의 저해에 대한 연구

상기 실시예에서의 결과에 뒤이은, 본 분석의 목적은 UVB 자외선 방사 (280-320nm)에 의한 이 조건 하에 멜라노사이트(melanocyte)들이 자극에 의해 활성화될 때 본 발명에 따른 올리고뉴클레오사이트들이 또한 활동하는가를 입증하는 것이다. 다시 말해서, 이것은 멜라노지네시스(melanogenesis)의 자극에 독립적으로 멜라노사이트(melanocyte)의 도파(Dopa) 산화효소 활동도를 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 능력의 평가를 포함한다.

이 효과에 대해, 본 분석은 코카서스 인종의 성인 기증자로부터의 멜라노사이트(melanocyte)에 관계된다. 여기서 사용되는 멜라노사이트(melanocyte)들은 유방형성으로부터의 피부로부터 얻어진다. 이 멜라노사이트(melanocyte)들을 얻는 기술은 실시예 3에서 기술되고 사용된 것과 동일하다.

실험은 35mm 접시에서 수행된다. 멜라노사이트(melanocyte)들은 접시마다 250 000 세포들과 2ml 의 매질 8의 비율로 35mm 접시(Falcon, Franklin Lakes, NJ. USA)들에 심어진다. 매질 8의 합성물은 표 3에 표현되어 있다. 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2로 처리와 8mJ/cm²에서 UVB 방사 또한 심어진 후 24시간에 시작한다.

각각의 UVB 방사 전에, NHM들은 PBS(2ml/접시)에 위치된다. 방사 후에, 세포들은 다시 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는2ml 매질 8에 위치된다.

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2는 100nM, 250nM 과 500nM의 농도로 임시적으로 연구 매질(실시예 3의 매질 7)에 첨가된다.

올리고뉴클레오티드로 이들 처리는 9일동안 매일 수행된다. 방사는 5일과 6일을 제외한 매일 수행한다. 각각의 농도에 대해 3개의 분석이 수행된다.

도파(Dopa) 산화효소 활동도에 대한 반응률의 측정:

이 처리들의 마지막에, 예를 들어 올리고뉴클레오티드로 처리의 8일째와 방사의 7회전에, 도파(Dopa) 산화효소 활동도는 측정된다.

이 효과에 대해, NHM들은 500㎕ 0.1% 트립신-0.05% EDTA를 사용하여 35mm 접시들로 부터 분리되고 나서, 페놀레드(Gibco)가 없고 10% 포에탈 카프 혈청(Foetal calf serum)이 보충되는 1.5ml E-199 매질안에서 처리된다. 이 세포 현탁액의 분리되는 부분은 세포수를 세는데 사용되고, 다른것은 원심분리되고, 얻어진 멜라노사이트(melanocyte) 알갱이는 실험예 2에서 기술된 대로 도파(Dopa) 산화효소에 대한 반응률을 측정하기 위해 50㎕의 세포용해 완충액에서 처리된다.

도파(Dopa) 산화효소 활동도에 대한 반응률은 10^-4OD 단위/분/10⁶NHM으로서 계산되고 표현된다. 얻어진 결과는 표 4에 주어진다.(σ:표준 편차)

세포 배양 처리: 자외선 방사/올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2의 농도	반응률	방사되지 않는 조작에 비교되는 변화%	방사되는 조작에 비교되는 변화%
방사없음/올리고뉴클레오티드 부재 (방사되지 않은 조작)방사/올리고뉴클레오티드 부재 (방사된 조작)방사/100 nM방사/250 nM방사/500 nM	368.2 σ= 19.9409.1 σ= 32.6328.1 σ= 44.8325.3 σ= 43.1327.4 σ= 49.5	0+11.1%	0-19.8%-20.5%-20%

상기 결과는 UVB 방사의 영향 하에 자극받는 멜라노사이트(melanocyte)의 경우에 본 발명에 관한 올리고뉴클레오티드들이 매우 현저하게 도파(Dopa) 산화효소의 활동도의 반응률을 감소시키는 것을 명백하게 입증한다.

따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드들은 앞선 실시예들에서 입증된 바와 같이 멜라닌을 합성하는 근본적인 활동도의 상황에서 멜라노사이트(melanocyte)의 능력을 감소시키는 것 뿐만 아니라, 그들은 또한 활성화된 상황 하에서도 멜라노사이트(melanocyte)에 대한 능력을 감소시키는 것이다. 따라서 이들 뉴클레오티드들은 특히 태양광에 존재하는 자외선 방사에 의해 유인되는 색소형성을 막거나 희석시키는데에 사용될 수 있다.

실시예 5: 얼굴 피부색을 밝게하는 파우더

마이크로셀룰로오스(microcellulose)20.00%

소듐 라우릴 설포아세테이트(sodium lauryl sulphoacetate)15.00%

올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO. 5)

(포스포디에스테르(phosphodiester)) 1.00%

방향, 착색, 보존제들 q.s.

탈크 100%에 대한 q.s.

이 파우더는 이중 작용이다. 이것은 피부를 깨끗이 할 수도 있고, 추가해서, 몇일 동안 규칙적으로 사용될 때, 피부색을 밝게할 수 있다. 이것은 하루에 한번에서 두번 얼굴의 피부에 적용될 수 있다.

실시예 6: 얼굴을 위한 탈색 데이 에멀전-겔

글리세롤5.00%

카프릴산(caprylic)/카프릭산(capric)/숙신산 트리글리세리드5.00%

옥틸 메톡시시나미트(octyl methoxycinnamate)1.00%

디메티콘 코폴리올(dimethicone copolymer)0.50%

아크릴리트(acrylate)/C₁₀-C₃₀알킬아크릴리트 크로스폴리머0.50%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 3

(포스포디에스테르(phosphodiester))0.01%

중화제q.s.

보존제, 방향, 착색제q.s.

물100%에 대한 q.s.

일광으로부터,또는 심지어 직접적인 태양광으로부터의 강렬한 방사에 더 또는 덜 지배되는 특정 개인은 밝은 피부색을 보호하기를 희망하고, 색소형성된 결점의 출현을 피하기를 희망한다. 상기 에멀전-겔의 사용은 이 목표를 달성하는 것을 가능하게 한다. 이 합성물은 일반적으로 아침에 얼굴에 적용된다. 이것은 색소형성에 대해 얼굴의 보호용과 치료용 양쪽으로 동등하게 또는 동등하지 않게 작용한다.

실시예 7: 색소 결점을 막기 위한 SPF 30 보호용 유체

볼라틸 펜타사이클로메티콘(volatile pentacyclomethicone)49.00%

티타늄 디옥사이드(titanium dioxide)15.00%

옥틸 메톡시시나미트 7.50%

글리세롤 5.00%

페닐트리메티콘(phenyltrimethicone) 5.00%

디메티콘 코폴리올(dimethicone copolyol) 3.00%

폴리메틸 메타크릴리트(polymethyl methaacrylate) 2.50%

부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane) 1.00%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2(포스포디에스테르) 0.1%

중화제, 방향,보호제, 산화방지제 q.s.

물 100%에 대한 q.s.

이 합성물은 태양으로부터의 강렬한 방사에 노출되기 전에 색소 결점 현상이 일어나기 쉬운 개인에서의 색소결점의 출현을 막기 위해 사용되는 것이다. 태양광선차단제의 높은 농도의 존재는 멜라닌 레벨에서 드롭의 결과인 자연적 보호에서의 감소에 대한 상쇄를 가능하게 한다는 것이 주목되어야 한다.

실시예 8: 탈색 얼굴 크림

글리세릴 스테아리트(glyceryl stearate)+Peg-100 스테아리트5.00%

마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate)3.30%

글리세릴 카프릴리트/카프리트3.00%

스쿠알렌3.00%

글리세롤2.00%

비스왁스1.50%

세틸 알콜(cetyl alcohol)1.00%

스테아릴 알콜(stearyl alcohol)1.00%

디메티콘(dimethicone)1.00%

크산탄(xanthan) 검0.30%

에틸렌디아민테트라세틱산(ethylenediaminetetraacetic acid)0.20%

시트르 산(citric acid)0.10%

소듐 시트레이트(sodium citrate)0.10%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 6(포스포디에스테르)0.10%

중화제, 방향, 보존제들q.s.

물100%에 대한 q.s.

이 크림의 사용은 노년의 색소 결점들이나 화학적 색소 결점들을 희석하거나 제거함으로써 피부 색소형성의 불균일성을 처리하는 것을 가능하게 한다. 이것은 피부색을 동일하게 하고 밝게한다.

실시예 9: 피부색을 밝게하는 얼굴 로우션

에틸 알콜30.00%

PPG-3 미리스틸 에테르(myristyl ether) 5.00%

글리세롤 2.00%

카보머(carbomer) 0.20%

폴리소베이트(polysorbate) 20 0.20%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 4(포스포로시오에이트) 0.01%

중화제, 방향, 보존제들 q.s.

물 100%에 대한 q.s.

피부색을 밝게 하는 이 로우션은 화장이 제거되고 피부가 깨끗해 진 후에 사용된다.

실시예 10: 피부색을 밝게하는 얼굴 혈청

물100%에 대한 q.s.

글리세롤2%

테트라소듐 EDTA)

시트르산)ph 6에 대한 q.s.

트리소듐 시트레이트)

크산탄 검0.25%

폴리아크릴아미드, C₁₃/C₁₄이소파라핀, 라우레스-7 0.5%

디메티콘 코폴리올0.25%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2(포스포디에스테르) 0.1%

방향, 착색, 보존제q.s.

이 매우 진한 혈청 합성물의 한방울은 일반적으로 얼굴 크림을 적용하기 전에 얼굴에 적용된다. 이 혈청은 전통적으로 피부색의 밝음을 얻거나 유지하기 위해서 일, 이주 동안의 처리로 사용된다.

실시예 11: 두발의 머리를 밝게하기 위한 두발 로우션

물100%에 대한 q.s.

알콜 50%

팬더닐에틸 에테르(panthenylethyl ether)0.5%

DL-α-토코페롤 아세테이트0.2%

폴리소베이트 60 1%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 1(포스포시오에이트) 0.01%

방향제0.2%

글리세롤0.5%

착색제q.s.

이 로우션은 두발의 머리에 점진적인 밝음을 얻기 위하여 필요한 가능한 한 길게 아침과 저녁에 두발에 적용된다. 이 기간은 일반적으로 몇 주일이다.

실시예 12:

실시예 12: 손 크림(결점 방지 겔-크림)

카프릴릭/카프릭 디글리세릴 숙시네이트(diglyceryl succinate) 6%

옥틸 옥타노에이트(octyl octanoate)2.5%

옥틸 메톡시시나메이트(octyl methoxicinnamate) 6%

올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 5 (포스포디에스테르) 0.001%

페닐트리메티콘(phenyltrimethicone)2.5%

벤조페논(benzophenone)-30.5%

소듐 하이알루로네이트(sodium hyaluronate) 0.05%

크산탄 검0.2%

아크릴리트/C-C 알킬 아크릴리트 혼성 폴리머0.5%

글리세롤 2%

PEG 150 3%

중화제, 착색제, 방향제, 보존제들q.s.

정수된 물 100% 에 대한 q.s.

이 크림은 그 착색을 희박하게 하기 위해 손의 노년의 결점들(노년의 모반)에 직접적으로 적용되어야 한다.

Claims

멜라닌에 대한 합성 경로와 관계되는 필수 효소들의 하나를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 혼성시킬 수 있는 7과 25의 사이, 특히 20의 번호를 갖는 뉴클레오티드들로 구성되고;

상기 효소들은 티로시나아제(tyrosinase)와 티로시나아제(tyrosinase)-연관-단백질 1(TRP-1)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,

티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 DNA 또는 mRNA를 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,

TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성할 수 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 또는 제 3 항에 있어서,

TRP-1을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA를 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서,

티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 개시 코돈을 드러내는 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서,

티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 코딩 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서,

티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 3' 코딩되지 않는 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항의 어느 한 항에 있어서,

TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 코딩되지 않는 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항의 어느 한 항에 있어서,

TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 개시 코돈을 드러내는 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항의 어느 한 항에 있어서,

TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 코딩 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항의 어느 한 항에 있어서,

TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 3' 코딩되지 않는 영역을 특정적으로 혼성할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
제 6 항에 있어서,

다음을 나타내는 서열(sequence) SEQ ID NO. 6 내지 SEQ ID NO. 8의 하나의 서열(sequence)인 올리고뉴클레오티드.

- SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'

- SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'

- SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'
제 7 항에 있어서,

다음을 나타내는 서열(sequence) SEQ ID NO. 10의 서열(sequence)인 올리고뉴클레오티드.

- SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'
제 8 항에 있어서,

다음을 나타내는 서열(sequence) SEQ ID NO. 9의 서열(sequence)인 올리고뉴클레오티드.

- SEQ ID NO. 9 5'-CTAGACACAATCTGCCAAGA-3'
제 10 항에 있어서

다음을 나타내는 서열(sequence) SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 4 또는 서열(sequence) SEQ ID NO. 11의 하나의 서열(sequence)인 올리고뉴클레오티드.

- SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'

- SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'

- SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'

- SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'

- SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'
제 11 항에 있어서,

다음을 나타내는 서열(sequence) SEQ ID NO. 5의 서열(sequence)인 올리고뉴클레오티드.

- SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'
신종 생성물로서, 다음을 나타내는 서열(sequence) SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 11의 하나의 서열(sequence)인 올리고뉴클레오티드.

- SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'

- SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'

- SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'

- SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'

- SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'

- SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'

- SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'

- SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'

- SEQ ID NO. 9 5'-CTAGACACAATCTGCCAAGA-3'

- SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'

- SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 당 성분들, 핵염기 성분들 또는 인터뉴클레오티드(internucleotide) 주요 요소로의 화학적 변형물로 구성되고, 상기 변형물은 생체 이용률의 증가, 표적 서열(sequence)들에 대한 친화도의 증가, 세포의 내면화의 증가, 또는 향상된 생물학적 안정성 또는 세포의 뉴클라아제들의 존재 하에 안정성의 증가와 같은 물리화학적 특성들을 제공하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 19 항에 있어서,

상기 당 성분은 2'-O-플루오로 또는 2'-O-알킬 치환기로 구성되고, 특히 2'-O-에틸옥시메틸 또는 2'-O-메틸 치환기로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,

상기 인터뉴클레오티드(internucleotide) 주요 요소의 포스포디에스테르 (phosphodiester) 그룹들의 일부가 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 그룹들과 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,

상기 인터뉴클레오티드(internucleotide) 주요 요소의 상기 포스포디에스테르(phosphodiester) 그룹들의 일부가 메틸인산(methyl phosphonate) 그룹들과 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,

모든 상기 포스포디에스테르(phosphodiester) 그룹들이 포스포로시오에이트 (phosphorothioate) 그룹들과 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 19 또는 20 항에 있어서,

모든 상기 포스포디에스테르(phosphodiester) 그룹들이 메틸인산(methyl phosphonate) 그룹들과 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 19 항 과 제 20 항에 있어서,

상기 포스포디에스테르(phosphodiester) 또는 부분적으로 포스포로시오에이트(phosphorothioate) 그룹들과/또는 메틸인산(methyl phosphonate) 그룹들과 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 있어서,

펩티드 타입 또는 핵산 타입의 선형 투여 담체 또는 플라스미드 타입의 환형 투여 담체 위로 이식되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 26 항의 어느 한 항에 있어서,

의약용 생산물인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 27 항의 어느 한 항에 일치하는 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와 미용적 또는 피부병학적으로 받아들일 수 있는 매질을 포함하는 미용 또는 피부병학용 합성물.
제 28 항에 있어서,

엘라그 산과 그 유도체와; 레조키놀(resorcinol)과 그 유도체들과; 비타민 C와 그 유도체들과; 술폰산 판토텐염(pantothenate sulphonate)과 그 유도체들과; 알파-멜라노사이트(melanocyte)-자극 호르몬(α-MSH) 또는 그 수용기 또는 아드레노-코디코트로픽 호르몬(ACTH)을 직접 또는 간접적으로 저해하는 분자들과; 글리세롤, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올(polyol)들과; 비타민들과; 살리실산(salicylic acid)과 그 유도체와 같은 각질용 또는 박리용제들과; 랙틱(lactic)산 또는 말릭(malic)산과 같은 혼자 또는 이식되는 α-하이드록산(α-hydroxy acid); 아스코빅(ascorbic)산과 그 유도체들과; 레티노 산(retinoic acid)과; 레틴알데히드(retinaldehyde)와; 리포솜 조합제에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 팔미트산염(palmitate), 프로피온에스테르(propionate) 또는 아세테이트와 같은 레티놀과 그 유도체들과; 토코페롤과 그 유도체, 시오타우린(thiotaurine), 하이포타우린(hypotaurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 시아민 파이로인산염(thiamine pyrophosphate), 피리독스아민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 삼인산 아데노신, 스테아릴 글리시리티네이트(glycyrrhetinate)와 같은 소염제와 같은 조합 또는 홀로 쓰이는 안티글리케이션제 또는 산화 방지제들과; 안정제와 그 혼합물, 미소화된 아연산화물, 티타늄산화물, 부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane)과 옥틸메톡시시나메이트(octylmethoxycinnamate)와 같은 화학적 또는 물리적 태양광선 차단제들과; 그리고 디옥시리보핵산들 또는 핵산들로 부터 선택된 하나 또는 그 이상의 즉효제를 포함하는 미용 또는 피부병학용 합성물.
제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,

전체 중량에서 올리고뉴클레오티드가 0.00001% 에서 10%, 특히 0.0003% 에서 3% 를 나타내는 것을 특징으로 하는 합성물.
제 28 항 내지 제 30 항의 어느 한 항에 있어서,

논제의 적용에 대해 사용되는 전통적인 형태로 제공되고, 특히 기름-포함-물 또는 물-포함-기름의 수성, 수성-알콜성 또는 유성 용매의 형태로, 수성 또는 오일 겔의 액상의 다중 에멀젼의 형태로, 수성 또는 유성 상에서 나노스피어(nanosphere)와 나노캡슐(nanocapsule)과 같은 폴리머 입자의 디스퍼젼의 형태로, 또는 이온성 또는 이온성이 아닌 타입의 지질 소낭들의 디스퍼젼의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 미용의 피부병학용 합성물.
티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1에서 선택되는 멜라닌을 위한 합성 경로에 포함되는 필수적인 효소들 중의 하나를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 혼성할 수 있는 7과 25의 사이, 특히 20의 번호를 갖는 뉴클레오티드들로 구성되는, 미용 약제로서의 뉴클레오티드의 사용방법.
제 32 항에 있어서,

인간 피부, 체모 도는 모발을 탈색하거나 표백하기 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.
제 1 항 내지 제 27 항의 어느 한 항에 있어서,

논제의 루트를 경유하여, 티로시나아제(tyrosinase)와/또는 TRP-1의 과도한 발현으로 초래되는 질병을 처리하거나 막기 위해 의도된 의약용 생산물의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.
제 1 항 내지 제 27 항의 어느 한 항에 있어서,

멜라닌 합성을 저해하기 위해 의도된 의약용 생산물의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.
제 35 항에 있어서,

독자 경로의 멜라즈마들과 같은 멜라노사이트(melanocyte)의 과도 반응에서 기인하는 국부적인 과도 색소형성의 처리 또는 방지를 위한, 노년의 색소 결점(노년의 모반)과 같은 양성의 멜라노사이트(melanocyte) 과도반응과 증식에 기인하는 국지화된 과도 색소형성의 처리 또는 방지를 위한, 그리고 광감작(光感作) 또는 상처 반흔 모양의 과도한 색소형성과 같은 우연한 과도 색소형성들의 처리 또는 방지를 위한, 그리고 백납과 같은 특정 백반의 처리를 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.
제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 피부를 탈색하거나 표백하기 위해 의도된 의약용 생산물의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.
제 1 항 내지 제 27 항의 어느 한 항에 있어서,

티로시나아제(tyrosinase) 또는 TRP-1의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.
제 35 항 내지 제 38 항의 어느 한 항에 있어서,

엘라그산(ellagic acid)과 그 유도체들과; 하이드로퀴논(hydroquinone)과; 알부틴(arbutin)과; 레조키놀(resorcinol)과 그 유도체들과; 비타민 C와 그 유도체들과; 술폰산 판토텐염(pantothenate sulphonate)과 그 유도체들과; 코직(kojic)산과; 태반 추출물들과; 알파-멜라노사이트(melanocyte)-자극 호르몬(α-MSH) 또는 그 수용기 또는 아드레노-코디코트로픽 호르몬(ACTH)을 직접 또는 간접적으로 방해하는 분자들과; 글리세롤, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올(polyol)들과; 비타민들과; 살리실산(salicylic acid)과 그 유도체들과 같은 각질용 또는 박리용제들과; 랙틱(lactic)산 또는 말릭(malic)산과 같은 혼자 또는 이식되는 α-하이드록산(α-hydroxy acid)들과; 아스코빅(ascorbic) 유도체들과; 레티노 산(retinoic acid)과; 레틴알데히드(retinaldehyde)와; 리포솜 조합제에 존재하거나 그렇지 않을 수 있는 팔미트산염(palmitate), 프로피온에스테르(propionate) 또는 아세테이트와 같은 레티놀과 그 유도체들과; 토코페롤과 그 유도체, 시오타우린(thiotaurine), 하이포타우린(hypotaurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 시아민 파이로인산염(thiamine pyrophosphate), 피리독스아민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 삼인산 아데노신과 같은 조합 또는 홀로 쓰이는 안티글리케이션제 또는 산화 방지제와; 스테아릴 글리시리티네이트(glycyrrhetinate)와 같은 소염제와; 안정제와 그 혼합물, 미소화된 아연산화물, 티타늄산화물, 부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane)과 옥틸메톡시시나메이트(octylmethoxycinnamate)와 같은 화학적 또는 물리적 태양광선 차단제들과; 그리고 디옥시리보핵산 또는 핵산들로 부터 선택된 하나 또는 그 이상의 즉효제로서 조합되어, 동시에 또는 분리되어 또는 시간에 걸쳐 사용되는 방식으로 투여되도록 의도된 의약용 생산물의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드의 사용방법.