KR100671533B1 - 탈색제로서 멜라닌 색소의 합성에 관계된 효소들의 발현을 조절하는 신종 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드들의 사용방법 - Google Patents

탈색제로서 멜라닌 색소의 합성에 관계된 효소들의 발현을 조절하는 신종 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드들의 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신종 올리고뉴클레오티드 서열 및 그 유도체에 관한 것이다.
이러한 신종 올리고뉴클레오티드 서열은 티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물, 또는 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP-1)을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성화할 수 있다.
본 발명은 또한 미용 조성물 또는 피부용 조성물에서 피부를 위한 탈색제 또는 표백제로서의 이러한 신종 올리고뉴클레오티드 서열의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

탈색제로서 멜라닌 색소의 합성에 관계된 효소들의 발현을 조절하는 신종 올리고뉴클레오티드들 및 올리고뉴클레오티드들의 사용방법{NOVEL OLIGONUCLEOTIDES AND USE OF OLIGONUCLEOTIDES MODULATING THE EXPRESSION OF ENZYMES INVOLVED IN THE SYNTHESIS OF MELANIC PIGMENTS, AS DEPIGMENTATION AGENTS}
본 발명은 신종 올리고뉴클레오티드 서열 및 그 유도체에 관한 것이다.
이러한 신종 올리고뉴클레오티드 서열은 멜라닌 색소의 합성 경로에 관계되는 필수 효소들 중 하나를 인코딩하는 유전자 또는 그 유전자의 생성물을 혼성화할 수 있다.
본 발명은 또한 미용 조성물 또는 피부용 조성물에서 피부를 위한 탈색제 또는 표백제로서의 이러한 신종 올리고뉴클레오티드 서열의 사용 방법에 관한 것이다.
인간에 있어, 색소 형성은 피부, 모근낭 또는 눈에서 멜라닌 색소의 합성 및 분포의 결과로서 생긴다. 색소 형성은 유전적으로 미리 결정되지만 많은 내부적 또는 외부적 요인들에 의해 조절된다. 멜라노사이트(melanocyte)에 의해 생성된 멜라닌과 멜라노사이트의 수, 그들의 티로시나아제(tyrosinase) 활성과 케라티노사이트(keratinocyte)에 멜라닌을 전송하는 능력 및 멜라닌 알갱이를 함유하는 멜라노좀(melanosome)들의 크기는 인간 피부색을 조절할 것이다. 각 개인에 있어서, 피부색은 다소 상당량의 자외선(UV) 복사에 따라서 변한다. 다시 말해서, 각 개인에 있어서 가장 약한 양의 UV 복사를 받을 때 가장 창백한 피부색에 대응하는 기본적인 색소 형성이 존재하고, 산의 고지에서 직면할 수 있는 것과 같은 강렬한 UV 복사에 지속적으로 노출될 때 그의 가장 어두운 피부색에 부합하는 최대한의 색소 형성에 도달하듯이 더 강한 양의 UV 복사를 받는다면 더욱 강한 피부 색소 형성이 존재한다.
또한, 잘 알려진 것처럼 지구 인종 집단에는 피부 색소 형성과 관련하여 매우 큰 유전적 다양성이 존재한다. 따라서, 집단에 따라 위에서 특정한 기본 색소 형성에 부합하는 피부색은 두 극단-매우 창백하고 매우 어두운-사이에 놓여있는 좀 더 창백하거나 또는 좀 더 어두운 얼굴빛을 보여준다. 또한, 집단에 따라 기본 색소 형성과 최대한의 색소 형성 사이의 피부색에서의 차이는 다소 의미가 있다. 따라서, 창백한 피부(기본적 색소 형성)를 가진 특정 집단에 속하는 개인들은 자외선 복사의 작용에 빠르게 및/또는 상당히 반응하여, 일부러 지속적인 기간 동안 태양에 노출하지 않더라도 쉽게 어두운 피부색을 가진다. 이하에서는, 이러한 개인들을 "UV 복사에 매우 민감한 개인들"이라고 표현할 것이다. 이것은 특히 아시아 기원의 집단이나 혼혈종 집단으로 칭해지는 특정 집단에 대한 경우이다.
또한, 개인들은 그들의 피부, 특히 얼굴이나 손에서 어떤 이질감을 주는 더 어둡거나 더 색이 짙은 영역 또는 결점의 출현을 목격한다. 이러한 결점들은 표피의 케라티노사이트(keratinocyte)에 멜라닌의 상당한 축적이 원인이다.
피부 색소 형성의 메커니즘은 멜라닌 합성과 연관이 있다. 이 메커니즘은 특별히 복잡하며 개략적으로 다음 주요 단계를 포함한다:
티로신(Tyrosine) --> 도파(Dopa) --> 도파퀴논(Dopaquinone) --> 도파크롬(Dopachrome) --> 멜라닌
이러한 일련의 반응에 관계가 있는 것으로 알려진 효소는 본질적으로 티로시나아제(tyrosinase) 및 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP-1)이다. 특히 이러한 효소들은 멜라닌 색소 형성에 이르는 티로신의 도파(디하이드록시페닐알라닌)로의 변환 및 도파의 도파퀴논으로의 변환을 촉진한다. 이러한 효소들은 멜라노지네시스(melanogenesis)의 반응 메카니즘 동안 개별적으로 관여하지 않는다. 사실상, 티로시나아제 및 TRP-1은 효소 착물을 형성한다(Winder et al. (1994) Cell. Mol. Biol. Res. 40: 7-8; Orlow et al. (1994) J. of Investigative Dermatology 103: 196-211). 따라서 이러한 두 효소들은 서로 협력하여 작용하고 상대방이 없을 때에는 결코 기능하지 않는 것으로 나타난다. 세포가 TRP-1이 고갈되었을 때, 티로시나아제 활성의 손실이 관측된다(Orlow et al. (1994)); 이것은 활성화를 위해서 티로시나아제(tyrosinase)는 TRP-1의 존재를 필요로 한다는 것을 의미한다(Zhao et al. (1996) J. of Investigative Dermatology 106: 744-752).
이하에서는, 멜라닌의 합성경로에 관계된 이러한 필수적인 효소들을 "색소 형성을 위해 필수적인 효소들"로 표현할 것이다.
만약 어떤 분자가 표피의 멜라노사이트의 활성을 억제함으로써 그 멜라노사이트에 직접적으로 작용하거나 및/또는 어떤 분자가 멜라닌 생합성의 단계들 중 어느 하나를 차단한다면 그 분자는 탈색 분자로 인정된다. 이것은 특히 분자가 멜라노지네시스에 관계된 효소들 중 어느 하나를 저해할 때 또는 멜라닌 합성 체인의 화학적 화합물과 반응할 때의 경우이다.
알려진 탈색 물질들은 특히 하이드로퀴논(hydroquinone) 및 그 유도체, 아스코르브산 및 그 유도체, 태반 추출물, 코직산, 페룰릭산, 알부틴, 디하이드록시벤젠 유도체(WO 00/47045), 구아이콜 유도체(WO 00/47179), 4-(2,3-디하이드록시페닐)시클로헥사놀(WO 00/56279), 레조키놀(resorcinol) 유도체(WO 00/56702) 및 페놀 아미드(phenol amide)(WO 99/32077)이다. 이러한 물질들은 특정한 결점을 가질 수 있다. 그것들은 불안정하거나, 고농도의 사용을 필요로 하거나, 그들의 활동 모드에 관계되는 특이성이 부족하거나 또는 세포독성 또는 자극적인 힘을 가질 수 있다.
효과적이면서 해가 없는 탈색 물질의 국소적 사용은 미용 및 피부과학에서 특히 요구된다. 이러한 물질들은 특히 특발성(idiopathic) 멜라즈마와 같은 멜라닌 세포성 과다 활동으로 인한 국부적인 과도한 색소형성, 노쇠 색소 결점으로 알려진색소 결점(노년의 모반)과 같은 악성 멜라닌 세포성 과다 활동 및 증식으로 인한 국지적인 과도한 색소형성, 광감작(光感作)이나 반흔(瘢痕) 모양의 과도한 색소형성과 같은 우연한 과도한 색소형성 및 백반(白斑)과 같은 어떤 백색피부증을 치료하기 위해 사용된다. 후자의 경우들에서, 피부의 색소 재형성은 불가능하기 때문에 탈색된 영역의 가장자리 주위의 색소 형성은 더욱 동질의 색상을 피부에 주기 위하여 약하게 된다.
탈색 물질은 또한 그 피부색, 특히 얼굴 및 손의 피부색을 밝게 하기 위하여, 가능한 한 창백하거나 동질의 피부색을 유지하기 위하여 또는 UV의 색소 형성 효과를 최소로 줄이기 위하여 특정한 개인, 특히 위에서 UV 복사에 민감하게 반응하는 개인으로 표현된 개인들의 피부를 위한 표백제로 사용된다.
따라서, 전문가가 직면하는 문제는 종래 물질들의 결점들을 가지지 않으며, 즉 피부에 비자극적이고, 비독성이며 및/또는 알레르기를 일으키지 않으며 조성물에서 안정한 인간 피부, 체모 또는 모발을 위한 새로운 탈색 물질 또는 새로운 표백제의 고안, 생산 또는 분리이다.
멜라노사이트 기능 이상으로 인한 질병, 특히 백반증 및 다른 탈색 질병을 치료하기 위한 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드의 사용은 WO 99/25819에 기술되어 있다. 이 병리학적 피부 증상에서, 색소침착저하증(hypopigmentation)은 비정상적으로 높은 테나신(tenascin) 함유량에 기인한다. 상기 문서에 표현되어 있는 올리고뉴클레오티드는 테나신 발현을 조절함으로써 색소침착저하증에 대응하여 행동한다.
반면, 본 발명의 목적은 멜라노지네시스 과정에 작용하고, 첫 번째로 균질의 색소 형성의 경우에 피부, 체모 또는 모발을 표백하기 위한, 즉 그 색소 형성을 감소시키며, 두 번째로 피부가 비균질의 색소 형성을 보일 때 피부의 과다 색소 형성을 방지하기 위한 탈색제를 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자는 올리고뉴클레오티드가 색소 형성에 필수적인 효소를 인코딩하는 유전자 또는 (RNA와 같은)유전자의 생성물을 혼성화할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 멜라노사이트에서 색소형성을 위해 필수적인 효소의 발현을 조절하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 상기 멜라노지네시스 반응에 역행한다. 이러한 활성은 심지어 매우 낮은 농도에서도 존재하며, 이는 이러한 올리고뉴클레오티드의 이점을 증가시킨다. 게다가, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 세포 독성을 나타내지 않는다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 종래에 사용되던 물질에 의해 제기되는 문제들의 이상적인 해법을 제안한다. 티로시나아제 또는 TRP-1의 활동을 저해하는 알려진 물질들(특히 하이드로퀴논 및 그 유도체, 아스코르브산 및 그 유도체, 태반 추출물, 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin))은 그들의 불충분한 특이성으로 인해 받아들일 수 없는 많은 부작용을 가진다. 본 발명은 따라서 탈색 효과를 얻기 위해 효소를 직접적으로 저해하는 대신에 색소 형성을 위한 필수적 효소의 생성을 조절함으로써 앞선 연구자들이 직면한 문제들을 해결한다.
필수 효소들은 착물의 형태로 함께 기능하기 때문에, 본 발명자들은 제기된 문제를 풀기 위해 착물의 효소들 중 하나 또는 다른 것의 발현을 막는 신종의 올리고뉴클레오티드를 서술한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 새로운 것이며 의약품으로도 새로운 것이다.
본 발명은 7 내지 25개, 바람직하게는 9 내지 25개, 12 내지 25개, 15 내지 25개 또는 18 내지 25개, 더 바람직하게는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 그 올리고뉴클레오티드는 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 혼성화할 수 있다. 특히, 상기 올리고뉴클레오티드는 티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물, 또는 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP-1)을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 혼성화할 수 있다.
본 발명은 더 구체적으로 티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물, 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특이적으로 혼성화할 수 있는 위에서 언급한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
특히, 다음에 나타나는 서열 SEQ ID NO. 1에서 SEQ ID NO. 11로부터 선택되는 서열의 올리고뉴클레오티드이다.
- SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'
- SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'
- SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'
- SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'
- SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'
- SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'
- SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'
- SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'
- SEQ ID NO. 9 5'-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3'
- SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'
- SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'
본 발명의 대상은 또한 새로운 신종 생성물로서 위에서 서술한 서열(sequence) SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11 중 하나의 서열인 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 내용에서, "티로시나아제(tyrosinase)를 인코딩하는 유전자"라는 표현은 티로시나아제(tyrosinase) 유전자의 유전적 서열(sequence)을 의미하기 위한 것이다. 유사하게, "TRP-1을 인코딩하는 유전자"라는 표현은 TRP-1 유전자를 인코딩하는 유전적 서열(sequence)을 의미하기 위한 것이다.
멜라노지네시스(melanogenesis)에서 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1의 핵심 역할은 알려져 있다. 효소나 단백질의 발현을 조절하기 위해 그 효소나 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA에 직접적으로 대항하는 올리고뉴클레오티드의 사용 또한 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 발명자들에 의해 발전된 기술은 탈색의 수단으로서 결코 사용된 적이 없다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 메신저 RNA 또는 유전자를 직접적으로 혼성화하기 위하여 결정된다. 따라서, 그들은 유전자에 의해 생산되는 티로시나아제 또는 TRP-1의 양의 궁극적인 조절을 수행하는 것을 가능하게 한다.
본 문서에서, "혼성화(hybridization)"라는 용어는 왓슨-크릭 짝짓기로 알려진 것처럼, 이중 나선 형태의 두 가닥을 형성하기 위하여 핵산의 두 가닥에 존재하는 상보적인 염기들 사이의 수소 결합의 형성을 나타내기 위하여 사용된다.
동일한 길이의 두 핵산 사이의 상보성의 정도는 정렬 후에 첫 번째 서열을 두 번째 서열에 상보적인 서열과 비교함으로써 결정된다. 상보성의 정도는 이들 두 서열 사이의 상보성의 정도를 얻기 위하여 비교되는 두 서열 사이의 뉴클레오티드가 동일한 동등한 위치의 수를 결정하고, 이 동등한 위치의 수를 전체 위치의 수로 나누고 얻어진 결과에 100을 곱하는 것에 의해 계산된다.
"특정 혼성화"라는 용어는 특히 상보성의 정도가 특정 부착이 요구되는 조건하에서 표적이 아닌 서열에 올리고뉴클레오티드의 비특이적 부착을 방지하기에 충분할 정도로 존재하는 것을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 특정적으로 혼성화하기 위하여 표적 핵산의 서열에 100% 상보성을 가질 필요는 없다. 특히, 적어도 약 80%의 상보성 정도를 가진 올리고뉴클레오티드는 표적으로 선택된 핵산을 특정적으로 혼성화할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 색소 형성을 위해 필수적인 효소를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성화한다. 특히, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 티로시나아제를 인코딩하는 유전자의 DNA 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 DNA, 또는 선택적으로 이 유전자들의 하나 또는 다른 것으로부터 파생되는 mRNA를 혼성화할 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 동일성 및 수량면에서 특정적으로 혼성화하기에 충분한 다수의 뉴클레오티드를 포함한다. 이 특성은 일반적으로 "안티센스(antisense)"라고 불린다.
따라서, 본 발명의 대상은 관련된 유전자의 코딩 영역 또는 선택적으로 이러한 유전자의 번역을 위한 개시코돈을 제시하는 영역으로 특정적으로 역행하여 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 대상은 또한 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 DNA 또는 메신저 RNA를 특정적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 대상은 또한 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 비코딩 영역(비암호화 영역:noncoding region), 개시 코돈을 제시하는 영역, 코딩 영역 또는 3' 비코딩 영역을 특정적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 문맥에서, "티로시나아제를 인코딩하는 DNA" 또는 "TRP-1을 인코딩하는 DNA"라는 표현은 엑손(exon) 및 인트론(intron) 양쪽 모두를 의미하는 것으로 의도되고, 특히 엑손(exon)을 의미하는 것으로 의도된다.
이것은 다음과 같이 설명된다:
* SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 서열의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 비코딩 영역을 특정적으로 혼성화한다. .
* SEQ ID NO. 5 서열의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 개시 코돈을 제시하는 영역을 특정적으로 혼성화한다.
* SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8 서열의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 비코딩 영역을 특정적으로 혼성화한다.
* SEQ ID NO. 9 서열의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 코딩 영역을 특정적으로 혼성화한다.
* SEQ ID NO. 10 서열의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 개시 코돈을 제시하는 영역을 특정적으로 혼성화한다.
* SEQ ID NO. 11 서열의 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 비코딩 영역을 특정적으로 혼성화한다.
본 발명의 대상은 또한 상기 올리고뉴클레오티드의 당류 성분, 핵염기 성분 또는 인터뉴클레오티드(internucleotide) 골격(backbone)에 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 이러한 변형은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 생체 이용률 증가, 표적 서열에 대한 친화력의 증가, 세포의 내재화의 증가 또는 생물학적 안정성 향상 또는 세포의 뉴클레아제 존재시에 안정성의 증가와 같은 바람직한 물리화학적 특성을 부여한다.
일 예로서, 이러한 특성을 부여할 수 있는 변형은 뉴클레오시드의 당류 성분의 2'-O-알킬 및 2'-O-플루오르 유도체들 및 인터뉴클레오티드(internucleotide) 골격의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 유도체 또는 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 유도체들이다.
본 문서에서, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 천연 핵염기들 및 본래의 포스포디에스터(phosphodiester) 연결을 통해 서로 연결되는 뉴클레오시드를 형성하는 펜타푸라노사일(penatafuranosyle)(당)로부터 만들어지는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 따라서 "올리고뉴클레오티드"는 자연종 또는 자연 단위 또는 그 폐쇄 동족체로부터 만들어지는 합성종으로 언급한다.
"올리고뉴클레오티드"는 또한 천연 올리고뉴클레오티드와 유사한 기능을 가지지만 천연적이지 않은 부분을 포함할 수 있는 구성성분으로 언급된다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 당류 성분, 변형된 핵염기 성분 또는 변형된 인터뉴클레오티드(internucleotide) 결합을 가질 수 있다. 가능한 변형물 중에서, 바람직한 변형물은 당류 성분의 2'-O-알킬 유도체들이고, 특히 2'-O-에틸옥시-메틸 또는 2'-O-메틸 유도체, 또는 인터뉴클레오티드 골격에 대한 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate)들이다.
키메라 올리고뉴클레오티드(chimeric oligonucleotide)는 본 발명의 우선적인 변형물에 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 두 개의 화학적으로 서로 다른 영역을 포함하며, 각각은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 특히 하나 이상의 유익한 성질, 예를 들면 더 나은 생물학적 안정성, 증가된 생체 이용률, 세포의 내재화의 증가 또는 표적 RNA에 대한 친화력의 증가를 제공하는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 특히 하나 이상의 영역과 관계가 있다.
바람직하게는, 인터뉴클레오티드 골격은 완전히 또는 부분적으로 포스포디에스터(phosphodiester), 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 또는 포스포디에스터 및/또는 포스포로티오에이트 및/또는 메틸 포스포네이트의 조합으로 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는 그것의 인터뉴클레오티드 골격의 포스포디에스터 그룹의 일부가 포스포로티오에이트 그룹 또는 메틸 포스포네이트 그룹으로 대체되는 것으로 특징으로 한다.
선택적으로, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는 모든 포스포디에스터 그룹이 포스포로티오에이트 그룹 또는 메틸 포스포네이트 그룹으로 대체되는 것을 특징으로 한다.
선택적으로, 포스포디에스터 그룹은 완전히 또는 부분적으로 포스포로티오에이트 그룹 및/또는 메틸 포스포네이트 그룹으로 대체된다.
"올리고뉴클레오티드"라는 용어는 또한 플라스미드 타입의 환형 투여 매개체 또는 핵산이나 펩티드 타입의 선형 투여 매개체로 이식되는 올리고뉴클레오티드를 언급한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 의약품으로서 새로운 것이다.
본 발명의 대상은 또한 상기에서 기술한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 미용적 또는 피부병학적으로 사용가능한 매질을 포함하는 미용 또는 피부용 조성물이다. 이러한 조성물은 또한 바라는 효과를 강화하도록 의도된 하나 또는 그 이상의 활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 대상은 또한 인간의 피부, 체모 또는 모발을 탈색하거나 표백하기 위한, 또는 인간 피부 위의 색소 결점을 제거하거나 희미하게 하기 위한 미용 또는 피부용 조성물의 제조에서 또는 제조를 위해, 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서열의 사용 방법이다.
본 발명은 또한 특히 인간의 피부, 체모 또는 모발을 탈색하거나 표백하고 인간 피부 위의 색소 결점을 희미하게 하기 위한 미용제로서, 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사용 방법이다.
본 발명의 대상은 또한 멜라닌 합성의 저해제로서 미용 또는 피부용 조성물의 제조에서 또는 제조를 위해, 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서열의 사용 방법이다.
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본 발명은 또한 국소적인 경로를 통해 티로시나아제 및/또는 TRP-1의 과도한 발현으로 초래되는 질병의 치료 또는 방지를 위한 의약품의 제조를 위한 상기한 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 사용 방법에 관한 것이다. 그 의약품은 멜라닌 합성을 저해하기 위해, 특히 피부를 탈색하거나 표백하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라 특발성(idiopathic) 멜라즈마와 같은 멜라닌 세포성 과다 활동으로 인한 국부적인 과도한 색소형성, 노쇠 색소 결점으로 알려진색소 결점(노년의 모반)과 같은 악성 멜라닌 세포성 과다 활동 및 증식으로 인한 국지적인 과도한 색소형성, 광감작(光感作)이나 반흔(瘢痕) 모양의 과도한 색소형성과 같은 우연한 과도한 색소형성 및 백반(白斑)과 같은 어떤 백색피부증을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 대상은 또한 인간 피부를 위한 탈색 또는 표백 미용 조성물에서 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서열의 사용 방법이다.
본 발명은 또한 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1의 발현을 조절하기 위한 상기한 올리고뉴클레오티드의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 대상은 또한 인간 피부를 위한 탈색 또는 표백 피부용 조성물의 제조를 위해 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서열의 사용 방법이다.
본 발명은 또한 색소가 형성된 피부에 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 미용 조성물을 적용하는 단계로 구성된 인간 피부를 탈색 또는 표백하기 위한 미용 또는 피부용 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 대상은 또한 미용적 또는 피부병학적으로 사용가능한 매질 및 색소 형성을 위해 필수적인 효소들 중 하나, 특히 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자의 전사 생성물에 직접적으로 대항하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈색 조성물이다.
앞서 언급된 조성물, 사용 방법 및 치료 방법에 대한 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 그 올리고뉴클레오티드는 이하에 한정된 서열들 중 하나의 서열이다:
- SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'
- SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'
- SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'
- SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'
- SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'
- SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'
본 발명에 따른 미용 또는 피부용 조성물은 국소적인 사용을 위해 적절하고 따라서 미용적 또는 피부병학적으로 사용가능한 매질, 즉 피부와 상호 양립할 수 있는 매질을 포함한다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 서열은 조성물의 전체 중량의 0.00001% 내지 10% 사이, 바람직하게는 0.0003% 내지 3% 사이의 범위의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 국소 적용을 위해 종래에 사용되는 모든 약제 형태, 특히 수성, 수성-알코올성 또는 유성 용액 형태, OW(oil-in-water)제형, W0(water-in-oil)제형 또는 복합 에멀젼 형태, 수성 또는 오일겔 형태, 액체, 풀 또는 고체 무수물 형태, 액상 또는 유상에 나노스피어 및 나노캡슐과 같은 폴리머 입자의 디스퍼젼 형태 또는 미국 특허 4,508,703에 기술된 것처럼 이온성 또는 비이온성 타입의 액체 소낭의 디스퍼젼 형태로 제공될 수 있다.
본 조성물은 다소 유체일 수 있고 백색 또는 색을 가진 크림, 연고, 유제, 겔, 로우션, 혈청제, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이것은 선택적으로 에어로졸의 형태로 피부에 적용될 수 있다. 이것은 또한 예를 들어 스틱이나 컴팩트 파우더의 형태로 분말이거나 그렇지 않은 고체의 형태로 제공될 수 있다. 이것은 또한 패치의 형태, 연필의 형태, 브러시 및 얼굴이나 손의 결점에 국소적으로 적용될 수 있는 솜막대의 형태로 제공될 수 있다. 이것은 치료용 생산품 또는 미용 생산품으로 사용될 수 있다.
알려진 방식으로, 본 발명의 조성물은 또한 친수성 또는 친유성 겔제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 산화방지제, 용매, 방향제, 충전재, 차단제, 안료, 악취 흡수제 및 색소와 같은 화장품 및 피부용제에 일반적인 보조제를 포함할 수 있다. 이러한 다양한 보조제의 양은 고려 중인 분야에서 종래에 사용되는 정도이다. 그 성질에 따라서, 이러한 보조제들은 지방상 , 액상, 지질소낭 또는 미세입자로 주입될 수 있다.
본 발명의 미용 또는 피부용 조성물이 에멀젼일 때, 지방상의 비율은 본 조성물의 전체 중량에 대하여 일반적으로 5에서 80 wt%, 바람직하게는 5에서 50 wt% 범위 일 수 있다. 에멀젼의 형태로 본 조성물에 사용되는 오일, 유화유(乳化油,emulsifiers) 및 혼성-유화유(co-emulsifiers)는 고려 중인 분야에서 종래에 사용되는 것들 중에서 선택된다. 유화유 및 혼성-유화유는 일반적으로 본 조성물의 전체 중량에 대하여 0.3%에서 30 wt%, 바람직하게는 0.5%에서 20 wt%의 비율로 존재한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있는 오일로서, 미네랄 오일(액상 석유 젤리), 식물성 오일(아보카도 오일, 콩기름), 동물성 오일(라놀린), 합성 오일(퍼하이드로스쿠알렌(perhydrosqualene)), 실리콘 오일(사이클로메티콘(cyclomethicone)) 및 플루오르 오일(퍼플루오르폴리에테르)를 언급할 수 있다. 지방성 알콜(세틸 알콜(cetyl alcohol)), 지방산 및 왁스들(카나바 왁스, 오조케리트(ozokerite))은 또한 지방성 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있는 유화유(emulsifiers) 및 혼성-유화유(co-emulsifiers)로서, 예를 들어 PEG-20 스테아르산염(stearate)과 같은 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르 및 글리세릴 스테아르산염(stearate)과 같은 글리세롤의 지방산 에스테르를 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있는 친수성 겔 제로서, 특히 카르복시비닐 폴리머(카보머(carbomer)), 아크릴산염(acrylate)/알킬아크릴산염(acrylate) 혼성 폴리머와 같은 아크릴 혼성 폴리머, 폴리아크릴아미드, 폴리사카라이드(polysaccharide), 천연 검과 점토를 언급할 수 있다. 친유성 겔 제로서, 벤톤(bentone)과 같은 변형된 점토, 지방산의 금속염, 소수성 실리카 및 폴리에틸렌을 언급할 수 있다.
본 발명의 대상은 상기한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 다른 활성제를 포함하는 미용 또는 피부용 조성물이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 활성제와 조합으로 동시에 또는 분리되어 또는 시간에 걸쳐 나누어 투여되는 방식으로 투여되는 의약품의 제조를 위한 상기한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있고, 순수한 또는 이러한 분자를 포함하는 추출물로부터 기원되어 사용될 수 있는 상기 활성제는 특히 다음의 화합물이다: 엘라그산(ellagic acid) 및 그 유도체; 하이드로퀴논(hydroquinone); 알부틴(arbutin); 레조키놀(resorcinol) 및 그 유도체; 비타민 C및 그 유도체; 술폰산 판토텐염(pantothenate sulphonate) 및 그 유도체; 코직산(kojic acid); 태반 추출물; 알파-멜라노사이트-자극 호르몬(α-MSH) 또는 그 수용체 또는 부신 피질 자극 호르몬(ACTH)을 직접적 또는 간접적으로 방해하는 분자들; 글리세롤, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올(polyol); 비타민; 살리실산(salicylic acid) 및 그 유도체와 같은 각질용 또는 박리용제; 랙틱산(lactic acid) 또는 말릭산(malic acid)과 같은 단독 또는 이식된 α-하이드록시산(α-hydroxy acid); 아스코브산(ascorbic acid) 및 그 유도체; 레티노산(retinoic acid); 레틴알데히드(retin-aldehyde); 리포솜 조제품에 존재하거나 그렇지 않을 수 있는 팔미트산염(palmitate), 프로피온산염(propionate) 또는 아세트산염(acetate)과 같은 레티놀 및 그 유도체; 토코페롤 및 그 유도체, 시오타우린(thiotaurine), 하이포타우린(hypotaurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 시아민 파이로인산염(thiamine pyrophosphate), 피리독스아민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 삼인산 아데노신과 같은 단독 또는 조합으로 쓰이는 안티글리케이션제 또는 산화 방지제; 스테아릴 글리시리티네이트(glycyrrhetinate)와 같은 소염제; 안정제 및 그 혼합물, 미소화된 아연산화물, 티타늄산화물, 부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane) 및 옥틸메톡시시나메이트(octylmethoxycinnamate)와 같은 화학적 또는 물리적 태양광선 차단제; 및 디옥시리보핵산 또는 핵산. 만약 불화합성이라면, 이러한 다른 활성제 및/또는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 소구(小球)체, 특히 미국 특허 4,508,703에 기술된 이온성 또는 비이온성의 양쪽성 지질로 만들어진 소낭으로 혼합될 수 있다.
다음 예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
시험관 속의 배양 매개물 및 일반적인 실험에 따른 안정성의 이유로, 예 2 내지 예 4는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 유도체로 실행되었고, 예 5 내지 예 12는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 포스포디에스터(phosphodiester) 유도체로 동등하게 준비되었다.
다음 예들에서, 다른 설명이 없다면 모든 함량은 중량 함량을 나타낸다
예 1: 올리고뉴클레오티드 합성
일 예로써, 올리고뉴클레오티드는 제조자의 프로토콜을 이용하는 표준 포스포아미다이트(phosphoramidite) 유도체 화학에 의해 자동합성기(퍼셉티브 바이오시스템 신속 모델 8909)로 합성된다. β-사이아노에틸디이소필포스포아미다이트(phosphoramidite)는 퍼스펩티브 시스템사에 의해 제공된다. 포스포디에스터(phosphodiester) 올리고뉴클레오티드를 위해, 포스파이트 산화 단계는 이오딘(iodine) 용매로 수행된다. 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 올리고뉴클레오티드와 관련해서, 포스파이트 산화 단계는 안하이드로스 아세토니트릴의 3H-1,2-벤조디시올-3-one 1,1-디옥사이드 0.05몰을 사용하여 수행된다. 컬럼(퍼셉티브 바이오시스템의 세공 유리에 의해 제어되는)으로 부터 분리와 33% 수성 암모니아 용액으로 섭씨 55도에서 18시간동안 처리에 의한 서열(sequence)의 전체 탈 보호 후에, 올리고뉴클레오티드는 소듐 아세테이트의 존재하의 에탄올 내에서의 침전에 의해 정제된다. 높음 압력의 액성 크래마토그래피 조작은 소듐 클로라이드 경사도를 사용한 용리로 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 그리고 트리에틸암모늄 아세테이트의 존재하의 아세토니트를의 경사도를 사용한 용리로 C18 역전상 크래마토그래피에 의해 수행된다.
합성된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 기술된다. 그들은 SEQ ID NO. 1로부터 SEQ ID NO. 11로 번호 매겨진 이 표의 첫번째 11 서열(sequence)들이다. 그들의 탈색 활동도가 다음 예들에서 보고된 연구들의 과제였다.
표 1에서, 서열(sequence)들의 각 마지막 아래에 주어진 숫자들은 기원의 서열(sequence)들에서 올리고뉴클레오티드의 위치를 나타낸다.
제 각기의 서열(sequence)들은 Thoku J. Exp. Med. 156: 403(1998), 시바하라 등에서 출간된 인간 티로시나아제(tyrosinase) cDNA의 "HUMTYRA"라 명명된 서열(sequence), Nucl. Acides Res. 18: 2807(1990)(Genbank 접근 번호 M 27160), 코엔 등에서 출간된 인간 TRP-1 cDNA의 "HSTYRRP"라 명명된 서열(sequence)과 Mamm. Genom 9: 50 (1998)(Genbank 접근 번호 AF 001295), 박스 등에서 출간된 "AF001295"라 명명된 또다른 TRP-1의 서열(sequence)로부터 비롯된다.
또한, 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물에 대하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 특이성을 확인하기 위한 비교를 위하여 본 발명의 서열 SEQ ID NO. 2에 기초한 두 올리고뉴클레오티드들:
* 서열 SEQ ID NO. 2의 염기 순서를 역전시켜 구성되는 표 1에서 SEQ ID NO. 12로 표시된 "센스 콘트롤(sense control)"이라 명명된 서열;
* 서열(sequence) SEQ ID NO. 2의 염기들과 순서는 다르지만 그 성질 및 수는 같은 염기를 포함하는 역시 표 1에서 SEQ ID NO. 13으로 표시된 "스크램블드 콘트롤(scrambled control)"이라 명명된 서열(sequence);이 합성되었다.
SEQ ID NO. 올리고뉴클레오티드 서열(sequence) 유전자 자리
1. 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3' 111 92 HSTYRRP
2. 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3' 102 83 HSTYRRP
3. 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3' 127 108 HSTYRRP
4. 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3' 53 34 HSTYRRP
5. 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3' 141 122 HSTYRRP
6. 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3' 475 457 HUMTYRA
7. 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3' 485 466 HUMTYRA
8. 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3' 490 471 HUMTYRA
9. 5'-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3' 1332 1313 HUMTYRA
10. 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3' 506 487 HUMTYRA
11. 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3' 5875 5856 AF001295
12. 5'-TTCTCGACGTTTGGTCCAGA-3' 센스 콘트롤 SEQ ID NO.2
13. 5'-ACGTTTCTCGCCTAGTGATG-3' 스크램블드 콘트롤 SEQ ID NO.2
예 2: 평범한 인간 멜라노사이트(melanocyte)(NHM들)에 대한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 탈색 효과
표 1과 예 1에 나타나는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11)는 멜라노지네시스(melanogenesis)에 대한 그들의 활동 및 멜라노사이트(melanocyte)에 의한 멜라닌 색소의 생성을 조절하는 그들의 능력에 대하여 연구된다. "센스 콘트롤"(SEQ ID NO. 12)과 "스크램블드 콘트롤"(SEQ ID NO. 13) 올리고뉴클레오티드는 또한 비교를 위한 요소로서 그 활동에 대하여 연구된다.
멜라노지네시스를 위한 반응 메카니즘 동안에, 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1은 L-도파의 도파퀴논으로의 전환 그리고 나서 도파크롬으로의 전환을 촉진시키는 효소 착물을 형성한다. 이러한 두 효소들은 함께 작용하고 어느 하나가 없으면 결코 기능하지 않는 것으로 나타난다. 사실상, 세포가 TRP-1에 대해 직접적으로 향하는 안티센스(antisenese) 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 TRP-1이 고갈되었을 때, 티로시나아제(또한 "도파 산화효소"라고 불림) 활성의 감소가 관찰된다. 티로시나아제는 또한 그 다중 기능 성질 때문에 "도파 산화효소" 라고도 불린다; 티로시나아제는 사실상 티로신에서 도파로의 산화 동안 도파 산화효소처럼 같은 기능을 실행한다.
본 분석의 원칙은 기질로서 사용되는 L-도하의 도파크롬으로의 전환에서 도파 산화효소에 대한 반응률을 측정하는 것에 기초한다. 도파크롬의 출현은 주어진 시간 간격에서 광밀도를 측정함으로써 정량되고, 이는 실험되는 각각의 올리고뉴클레오티드에 대한 도파 산화효소 및 대조 분석을 위한 반응률을 계산하는 것을 가능하게 한다. 관측된 결과에 기초하여 테스트된 올리고뉴클레오티드의 멜라노지네시스(melanogenesis)에 대한 반응을 평가 판단하는 것이 가능해진다. 대조 분석과 비교되는 반응률의 하락은 효소 활성의 감소에 대응할 것이고, 결과적으로 멜라닌 색소 형성의 감소 및 따라서 탈색 효과에 대응한다.
멜라노사이트(melanocyte) 배양의 준비 및 올리고뉴클레오티드로의 처리:
멜라노사이트(melanocyte)는 코카서스 인종 아이의 포피로부터 얻어진다. 피부 조각들은 PBS(Gibco, Paisley, GB)로 헹구어지고나서 70% 에탄올로 헹구어진다. PBS로 마지막 헹굼 후, 피부는 최소한의 진피를 포함하는 정교한 1mm의 피부편으로 잘린다. 진피와 표피는 밤새 섭씨 4도에서 0.25% 트립신 용액(Gibco, Paisley, GB)에서 피부편을 배양함으로써 분리된다. 배양 후, 표피세포는 외과용 메스로 긁어서 회복된다. 트립신의 활동은 세포를 10%(V/V) 포에탈 카프 혈청(Foetal calf serum)(Gibco, Paisley, GB)을 포함하는 E-199 매질(Gibco, Paisley, GB)에 세포를 위치시킴으로써 정지된다. 균질화 및 표면에서 떠다니는 코네오사이트(corneocyte)를 제거한 후에, 세포 현탁액은 필터링되고 원심분리되며 펠릿(pellet)은 EGF가 표피 성장 인자를 나타내는 이하의 표에 주어진 조성물의 부착 매질(매질 1)에 흡수된다.
매질 1의 조성물
화합물 공급자, 참고문헌 매질에서 마지막 농도
- E-199 매질 Gibco, 31150-022 q.s. for 100% (v/v)
- 포에탈 카프 혈청 Gibco, 10099-133 10% (v/v)
- 히드로코르티손 Sigma, H-0135 0.4 ㎍/ml
- L-글루타민 Gibco, 25030-024 2 mM
- EGF Sigma, E-4127 10 ng/ml
세포 집단을 센 후에, 세포들은 200 000/cm2의 비율로 플라스크 안에 뿌려진다. 세포들은 습기 및 5% CO2 포화된 대기에서 37℃로 유지된다. 세포들이 부착된 후, 부착 매질은 매 48시간 마다 KSFM 매질(Gibco, Paisley, GB)로 교환된다.
따라서, 배양기에 위치된 표피 세포는 케라티노사이트(keratinocyte)-멜라노사이트(melanocyte) 혼성 배양물을 획득하는 것을 가능하게 한다. 이러한 혼성 배양물이 약 70% 합류하자마자, KSFM 매질은 멜라노사이트의 성장을 촉진하고 그 조성물이 이하의 표에 주어진 선택 매질(매질 2)로 교환되며, 그 표에서 IBMX는 3-이소부틸-1-메틸크산틴을 나타내고 PMA는 포볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트를 나타낸다.
매질 2의 조성물
화합물 공급자, 참고문헌 매질에서 마지막 농도
- E-199 매질 Gibco, 31150-022 q.s. for 100% (v/v)
- 포에탈 카프 혈청 Gibco, 10099-133 10% (v/v)
- L-글루타민 Gibco, 25030-024 0.4 ㎍/ml
- IBMX Sigma, I-5879 2 mM
- PMA Sigma, P-8139 10 ng/ml
- 지네티신(Geneticin) Gibco, 066-01811Y 100 ㎍/ml
48에서 72시간 후에, 세포들은 실온에서 1 에서 2분동안 0.1% 트립신-0.05% EDTA 혼합물(Gibco, Paisley, GB)을 사용하여 플라스크로부터 떼어진다. 얻어진 세포 현탁액은 원심 분리되고 선택된 매질에서 다시 부유시킨다. 그 세포들은 24에서 48시간 후 다시 실온에서 1에서 2분 동안 트립신-EDTA(0.1%-0.05%) 혼합물로 다시 처리되고, 그런 다음 멜라노사이트에 특정한 증식 매질(매질 3)에서 다시 뿌려진다.
매질 3은 매질 2 10% 및 매질 A 90%로 구성된다. 매질 A는 케라티노사이트(keratinocyte) 매질 SFM(Gibco, 17005-034)이다.
이 단계에서, 얻어진 세포 집단은 순수하고 전적으로 보통의 인간 멜라노사이트(NHMs)로 구성된다.
연구 전에, NHM은 일주일 동안 포볼(phorbol) 에스테르 또는 IBMX(매질 4)와 같은 강력한 대사 활성제를 포함하지 않는 매질에 위치된다.
매질 4는 매질 B 10% 및 상기한 매질 A 90%로 구성된다. 매질 B의 조성물은 다음 표에 기술된다.
매질 B의 조성물
화합물 공급자, 참고문헌 매질에서 마지막 농도
- E-199 매질 Gibco, 31150-022 q.s. for 100% (v/v)
- 포에탈 카프 혈청 Gibco, 10099-133 10% (v/v)
- L-글루타민 Gibco, 25030-024 2 mM
NHM들은 매질 4의 200㎕에서 웰(well)당 10 000 세포들의 양으로 96-웰 마이크로플레이트(Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 뿌려진다.
시험될 올리고뉴클레오티드들은 각각 10nM, 100nM, 250nM, 500nM 및 1nM의 농도로 임시적으로 연구 매질에서 준비된다. 여러 가지 올리고뉴클레오티드들의 처리는 7일 동안 매일 수행된다. 각각의 농도에서 3번의 분석이 수행된다.
도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률의 측정:
7일 동안 나누어져 행하는 이 처리들의 마지막에, 티로시나아제 또는 "도파(Dopa) 산화효소" 활성이 측정된다.
세포들은 PBS로 헹구어지고 나서, 50㎕ 세포용해 완충액(PBS(Gibco, 14190-094)내의 0.5% 트리톤 X100(Sigma, T-9284))이 웰들에 첨가되고, 상기 플레이트는 섭씨 4도에서 한 시간 동안 흔들린다. 반응은 각각의 웰에 기질(10　mM L-도파(Dopa), Sigma) 50㎕를 첨가함으로써 개시된다. 도파크롬(Dopachrome)의 출현은 마이크로플레이트 판독기 340 ATTC(SLT-Labinstrument, Grodig/Salzburg, Austria)광밀도 판독기를 사용하여 규칙적으로 흔들면서 한 시간 동안 섭씨 37도에서 매 2분마다 450nm에서 측정된다. 반응률은 10-4OD 단위/분으로 계산되고 표현된다.
올리고뉴클레오티드로 처리된 배지 및 대조(처리되지 않는) 배지에서 얻어진 결과는 표 2에 주어진다.(σ: 표준 편차)
테스트된 올리고뉴클레오티드들의 식별 번호 및 농도 반응률 10-4OD 단위/분 반응률 (올리고뉴클레오티드 부재하의 대조구) 대조구와 비교되는 변화%
SEQ ID NO. 1 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 21.8 σ= 1.0 23.3 σ= 0.4 20.3 σ= 0.3 19.5 σ= 2.9 23.9 σ= 1.4 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 -17.4 -11.7 -23.1 -26.1 -9.4
SEQ ID NO. 2 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 20.5 σ= 1.7 18.8 σ= 1.5 19.2 σ= 0.7 19.7 σ= 1.7 22.9 σ= 1.1 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 -22.3 -28.8 -27.3 -25.4 -13.3
SEQ ID NO. 3 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 23.7 σ= 3.1 20 σ= 0.7 21.1 σ= 0.6 19.9 σ= 1.7 23.6 σ= 0.6 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 -10.2 -24.2 -20.1 -24.6 -10.6
SEQ ID NO. 4 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 22.9 σ= 1.2 19.9 σ= 1.6 20.9 σ= 1.4 21.2 σ= 1.7 20 σ= 1.2 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 -13.3 -24.6 -20.8 -19.7 -24.2
SEQ ID NO. 5 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 23.5 σ= 0.7 19.3 σ= 0.9 17.9 σ= 1.7 20.5 σ= 0.6 21.3 σ= 0.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 -10.9 -26.9 -32.2 -22.4 -19.3
SEQ ID NO. 6 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 20.7 σ= 1.8 22.0 σ= 0.6 20.1 σ= 2.5 18.7 σ= 2.6 20.5 σ= 1.1 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 26.4 σ= 1.8 -21.6 -16.7 -23.9 -29.2 -22.4
SEQ ID NO. 7 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 26.6 σ= 2.2 25.3 σ= 1.1 23.8 σ= 1.3 21.7 σ= 0.9 22.6 σ= 0.7 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 +6.4 +1.2 -4.8 -13.2 -9.6
SEQ ID NO. 8 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 24.1 σ= 0.1 23.7 σ= 0.6 25.1 σ= 1.0 23.4 σ= 0.6 23.7 σ= 0.2 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 -3.6 -2.5 +0.4 -6.4 -5.2
SEQ ID NO. 9 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 27.1 σ= 0.7 22.3 σ= 0.6 22.6 σ= 0.2 23.2 σ= 0.5 25.0 σ= 0.7 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 +8.4 -10.8 -9.6 -7.2 0
SEQ ID NO. 10 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 26.4 σ= 0.9 24.9 σ= 0.5 23.1 σ= 0.3 23.3 σ= 0.6 26.9 σ= 0.7 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 +5.6 -0.4 -7.6 -6.8 +7.6
SEQ ID NO. 11 10 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 μM 25.7 σ= 0.9 24.8 σ= 0.3 25.8 σ= 0.7 22.1 σ= 4.4 23.9 σ= 0.8 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 25.0 σ= 0.9 +2.8 -0.8 +3.2 -11.6 -4.4
SEQ ID NO. 12 50 nM 100 nM 150 nM 34.6 σ= 1.0 33.2 σ= 0.7 33.9 σ= 0.7 32.5 σ= 1.4 32.5 σ= 1.4 32.5 σ= 1.4 +6.5 +2.2 +4.3
SEQ ID NO. 13 50 nM 100 nM 150 nM 33.5 σ= 1.2 36.3 σ= 0.6 34.0 σ= 1.2 32.5 σ= 1.4 32.5 σ= 1.4 32.5 σ= 1.4 +3.1 +11.7 +4.6
본 발명의 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO. 1 에서 SEQ ID NO. 11)로 멜라노사이트(melanocyte) 배지를 처리하는 것은 도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률의 감소를 초래한다는 것이 표 2에 나타난 결과로부터 명백하게 나타난다. 이러한 감소는 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 1에서 SEQ ID NO. 6에 대해 특히 명백하다.
반면, 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2에 대하여 비교를 위해 테스트된 올리고뉴클레오티드, 즉 "센스 콘트롤"로 명명되는 SEQ ID NO.12 및 "스크램블드 콘트롤"로 명명되는 SEQ ID NO. 13에 대하여, 도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률에서의 증가가 테스트된 각각의 농도에서 나타났다. 예를 들어, 100nM의 농도에서, 본 발명에 따른 안티센스(antisenese) 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2의 경우에 28.8% 반응률이 감소하는 데 비하여, "센스 콘트롤" 및 "스크램블드 콘트롤"에 대해 반응률이 각각 2.2% 및 11.7%로 증가한다.
후자의 관측으로부터 도파 산화효소 활성의 반응률을 감소시키는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 활성은 티로시나아제 또는 TRP-1을 인코딩하는 표적 메신저 RNA와 그 올리고뉴클레오티드의 특정 혼성화에 의한 것임을 유추할 수 있다.
결과적으로, 이러한 올리고뉴클레오티드/mRNA 상호작용은 표적화된 메신저 RNA에 의해 운반된 정보의 번역을 방지할 것이고 따라서 사용되는 안티센스(antisense) 서열에 따라 티로시나아제 또는 TRP-1의 세포내 발현에서의 감소를 초래한다. 다시 말해서, 이러한 상호작용은 티로시나아제 또는 TRP-1의 새로운 합성을 감소시킬 것이다. 이러한 효소들의 자연적 재생 때문에, 세포에서 티로시나아제 및 TRP-1 양의 감소를 초래할 것이고, 결국 멜라닌의 합성을 유지하는 이들 효소들의 활성에서의 감소를 초래할 것이다. 사실상, 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 멜라노사이트에서 이미 존재하는 티로시나아제에 작용하는 대신에, 티로시나아제 및 TRP-1의 재생을 감소시킴으로써 작용한다.
멜라노사이트에 대한 이러한 작용의 결과는 멜라닌을 합성하는 이러한 세포들의 능력이 감소하는 것이고, 따라서 관계가 있는 경우 및 개인에 따라 표백 또는 탈색 효과가 나타난다.
예 3: 물라토 성인 기증자로 부터의 일반 인간 멜라노사이트 (melanocyte)에 대한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 탈색효과
여기서 사용되는 멜라노사이트(melanocyte)는 물라토 성인 기증자의 대퇴부로부터의 피부로부터 얻어진다. 피부조각은 PBS로 헹구어지고, 그리고 나서 PBS에서 50%로 희석된 70%에탄올로 씻겨진다. PBS로 씻겨진 후, 콘 커터를 사용하여 긁어진다. 얻어진 조각들은 분리되도록 하기 위하여 섭씨 37도에서 한 시간 동안 0.05% 트립신(Difco Laboratories, West Molesy, GB)에서 긁어진다. 그리고 나서 표피는 10%의 포에탈 카프 혈청(Foetal calf serum)(FCS, Gibco. Paisley, GB)을 함유하는 E-199 매질(Gibco, Pasley, GB)에서 회복된다. 균질화 및 표면을 떠다니는 각질층의 조각들의 제거 후에, 세포 현탁액은 필터링되고 원심분리된다. 얻어진 세포 펠릿은 예 2에 기술된 매질 1에서 흡수된다. 세포들은 세어지고, 세포들의 생존능력은 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 토마(Thoma)세포에 대해 측정된다. 표피 세포들은 마지막으로 80 000 세포/cm2의 비율로 플라스크에서 매질 1에 뿌려진다. 배지들은 습기 및 CO2 5%로 포화된 대기에서 37℃로 유지된다.
매질 1은 매질 6로 대체되고, 그 매질 6의 조성물은 B-FGF가 기본적인 섬유아세포 성장 인자를 나타내고 PdBu가 포볼(phorbol) 12,13-디부티레이트를 나타내는 이하의 표에서 구체화된다.
매질 6의 조성물
화합물 공급자, 참조문헌 매질에서의 마지막 농도
- E-199 매질 - 인슐린(Insulin) - EGF - B-FGF - PdBu - 염화 칼슘(Calcium chloride) Gibco, 31150-022 Sigma, H-0888 Sigma, E-4127 Gibco, 13256-029 Sigma, P-1269 Prolabo, 22317297 q.s. for 100% (v/v) 0.5 ㎍/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 0.25 ㎍/ml 1.8 mM
이 매질은 1 또는 2주동안 매 48시간마다 재생된다.
멜라노사이트들의 이러한 선택 후에, NHM 증식은 매질 6을 매질 7로 대체함으로써 촉진된다.
매질 7은 매질 C 10% 및 PdBu가 보충되어 매질에서 최종 농도가 0.25㎍/ml인 상기 매질 A 90%로 구성된다.
매질 C의 합성물
화합물 공급자, 참조문헌 매질에서의 마지막 농도
- E-199 매질 - 포에탈 카프 혈청 - L-글루타민(L-glutamine) - IBMX - 지네티신(Geneticin) Gibco, 31150-022 Gibco, 10099-133 Gibco, 25030-024 Sigma, I-5879 Gibco, 066-01811Y q.s. for 100% (v/v) 10% (v/v) 2 mM 10-4 M 100 ㎍/ml
이 단계에서, 얻어진 세포 집단은 순수하다. 그 세포 집단은 전적으로 NHM들로 구성된다.
NHM들은 매질 6에서 96-웰 마이크로플레이트(Falcon, franklin Lakes, NJ, USA)에 뿌려진다. 24시간 후에 상기 매질은 본 연구의 마지막까지 사용될 매질 8로 대체된다. 매질 8의 조성물은 이하에 기술된다.
매질 8의 조성물
화합물 공급자, 참조문헌 매질에서의 마지막 농도
- MCDB-153 매질 - 포에탈 카프 혈청 - 인슐린 - 트랜스페린(Transferrin) - α-토코페롤 - 페니실린/스트렙토미신 (streptomycin) Sigma, M-7403 Gibco, 10099-133 Sigma, I-6634 Sigma Sigma, T1157 Sigma, P4333 q.s. for 100% (v/v) 2% (v/v) 5 ㎍/ml 10 ㎍/ml 1 ㎍/ml 0.4% (v/v)
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2는 50nM, 100nM, 250nM, 500nM 및 1μM의 농도로 임시적으로 본 연구 매질에 첨가된다. 처리는 7일동안 매일 수행된다. 각각의 농도에 대해, 6개의 분석이 수행된다.
도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률의 측정:
7일간 나누어져 행해지는 이들 처리의 마지막에, 도파(Dopa) 산화효소 활성이 측정된다. 이러한 측정들은 예 2에서와 같은 방식으로 수행된다. 반응률은 10-4OD 단위/분으로서 계산되로 표현된다.
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2로 처리되는 배양물들과 처리하지 않는 조절 배양물들에 대해 얻어지는 결과는 표 3에 주어진다.(σ:표준 편차)
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2의 농도 반응률 반응률(올리고뉴클레오티드 부재하의 대조구) 대조구에 비교되는 변화%
50 nM 100 nM 250 nM 500 nM 1 ㎛ 33.8 σ= 3.4 29.8 σ= 1.3 29.6 σ= 2.2 28.3 σ= 1.5 27.6 σ= 2.9 33.0 σ= 3.5 33.0 σ= 3.5 33.0 σ= 3.5 33.0 σ= 3.5 33.0 σ= 3.5 +2.4 -9.7 -10.3 -14.2 -16.3
상기 결과에 따르면, 매우 낮은 농도의 올리고뉴클레오티드(100nM) 및 이보다 높은 농도에서 도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률은 상당히 감소하는 것이 관측된다.
따라서, 예 2의 결론에서 이미 설명된 대로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드들은 멜라닌을 합성하는 멜라노사이트(melanocyte)의 능력을 감소시킨다. 이것은 본 분석에서 이러한 감소가 관련된 사람의 유전적 특성에 독립적이라는 것이 증명된다.
본 예에서, 어두운 피부 색에 상응하는 기본적인 색소 형성을 가진 물라토 기증자를 참여시키기 때문에 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 사용은 표백 효과, 즉 피부 색을 밝게 할 것이다.
예 4: 일반적인 인간 멜라노사이트에서 UV에 의해 유발된 멜라노지네시스(melanogenesis)에 대한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 의한 저해 연구
상기 예의 결과에 이어서, 본 분석의 목적은 멜라노사이트들이 UVB 자외선 복사(280-320nm)에 의해 활성화될 때 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 또한 활성을 나타내는지를 증명하는 것이다. 다시 말해서, 이것은 멜라노지네시스의 자극과 독립적으로 멜라노사이트의 도파(Dopa) 산화효소 활성을 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가하는 것과 관련이 있다.
이러한 결과를 위하여, 본 분석은 코카서스 인종의 성인 기증자로부터의 멜라노사이트(melanocyte)에 관계된다. 여기서 사용되는 멜라노사이트(melanocyte)들은 유방형성술로 피부에서 얻어진다. 이러한 멜라노사이트를 얻는 기술은 예 3에서 사용되고 기술된 것과 동일하다.
실험은 35mm 접시에서 수행된다. 멜라노사이트들은 접시마다 250 000 세포 및 매질 8 2㎖의 비율로 35mm 접시(Falcon, Franklin Lakes, NJ. USA)에 뿌려진다. 매질 8의 조성물은 표 3에 기술되어 있다. 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2 및 8 mJ/cm2의 UVB 복사(Bio-Energie, Vilbert-Lourmat, Marne-la-Vallee, 프랑스) 처리는 뿌려진 후 24시간에 시작한다.
각각의 UVB 복사 전에, NHM들은 PBS(2ml/접시)에 위치된다. 복사 후에, 세포들은 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 2ml 매질 8에 위치된다.
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2는 100nM, 250nM 과 500nM의 농도로 임시적으로 연구 매질(예 3의 매질 7)에 첨가된다.
올리고뉴클레오티드를 사용하는 이러한 처리는 9일 동안 매일 수행된다. 복사는 5일과 6일을 제외한 매일 수행한다. 각각의 농도에 대해 3개의 분석이 수행된다.
도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률의 측정:
이러한 처리 마지막에, 즉 올리고뉴클레오티드로 처리의 9일째와 복사의 7회전에, 도파(Dopa) 산화효소 활성이 측정된다.
이러한 결과를 위하여, NHM들은 500㎕ 0.1% 트립신-0.05% EDTA를 사용하여 35mm 접시들로 부터 분리되고 나서, 페놀레드(Gibco)가 없고 10% 포에탈 카프 혈청(Foetal calf serum)이 보충되는 1.5ml E-199 매질에 흡수된다. 이러한 세포 현탁액의 분리되는 부분은 세포수를 세는데 사용되고, 다른 것은 원심분리되며 얻어진 멜라노사이트 펠릿은 예 2에서 기술된 것처럼 도파(Dopa) 산화효소의 반응률을 측정하기 위하여 50㎕의 세포 용해 완충액에서 흡수된다.
도파(Dopa) 산화효소 활성에 대한 반응률은 10-4OD 단위/분/106 NHM으로서 계산되고 표현된다. 얻어진 결과는 표 4에 주어진다.(σ:표준 편차)
세포 배양 처리: 자외선 복사/ 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2의 농도 반응률 비복사된 대조구에 비교되는 변화% 복사된 대조구에 비교되는 변화%
복사 없음/올리고뉴클레오티드 부재 (비복사된 대조) 복사/올리고뉴클레오티드 부재 (복사된 대조구) 복사/100 nM 복사/250 nM 복사/500 nM 368.2 σ= 19.9 409.1 σ= 32.6 328.1 σ= 44.8 325.3 σ= 43.1 327.4 σ= 49.5 0 +11.1% 0 -19.8% -20.5% -20%
상기 결과는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 UVB 복사의 영향 하에 자극된 멜라노사이트의 경우 도파(Dopa) 산화효소의 활성에 대한 반응률을 실질적으로 감소시키는 것을 명백하게 입증한다.
따라서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 앞선 예들에서 입증된 바와 같이 멜라닌을 합성하는 기초적인 활성 상태에서의 멜라노사이트의 능력을 감소시킬 뿐만 아니라 활성화된 상태에서의 멜라노사이트의 능력을 감소시킨다. 따라서, 이러한 뉴클레오티드들은 특히 태양광에 존재하는 자외선 복사에 의해 유발되는 색소형성을 방지하거나 약화시키기 위해 사용될 수 있다.
예 5: 얼굴 피부색을 밝게하는 파우더
마이크로셀룰로오스(microcellulose) 20.00%
소듐 라우릴 설포아세테이트(sodium lauryl sulphoacetate) 15.00%
올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO. 5)
(포스포디에스터(phosphodiester)) 1.00%
방향, 착색, 보존제들 q.s.
탈크 100%에 대한 q.s.
상기 파우더는 이중 작용을 가진다. 이것은 피부를 깨끗이 할 수도 있고, 또한 몇일 동안 규칙적으로 사용할 때 피부색을 밝게 할 수 있다. 이것은 하루에 한번에서 두번 얼굴의 피부에 적용될 수 있다.
예 6: 얼굴을 위한 탈색 데이 에멀전-겔
글리세롤 5.00%
카프릴산(caprylic)/카프릭산(capric)/숙신산 트리글리세리드 5.00%
옥틸 메톡시시나미트(octyl methoxycinnamate) 1.00%
디메티콘 코폴리올(dimethicone copolymer) 0.50%
아크릴리트(acrylate)/C10-C30 알킬아크릴리트 크로스폴리머 0.50%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 3
(포스포디에스터(phosphodiester)) 0.01%
중화제 q.s.
보존제, 방향, 착색제 q.s.
물 100%에 대한 q.s.
일광으로부터 또는 심지어 직접적인 태양광으로부터의 다소 강한 복사를 받는 특정 개인은 밝은 피부색을 유지하고 색소 형성된 결점의 출현을 방지하기를 희망한다. 상기 에멀전-겔의 사용은 이러한 목표를 달성하는 것을 가능하게 한다. 상기 조성물은 일반적으로 아침에 얼굴에 적용된다. 그것은 얼굴에 있거나 그렇지 않을 수 있는 색소 형성에 대하여 보호적 및 치료적인 둘 다의 역할을 한다.
예 7: 색소 결점을 막기 위한 SPF 30 보호용 유체
볼라틸 펜타사이클로메티콘(volatile pentacyclomethicone) 49.00%
티타늄 디옥사이드(titanium dioxide) 15.00%
옥틸 메톡시시나미트 7.50%
글리세롤 5.00%
페닐트리메티콘(phenyltrimethicone) 5.00%
디메티콘 코폴리올 (dimethicone copolyol) 3.00%
폴리메틸 메타크릴리트(polymethyl methaacrylate) 2.50%
부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane) 1.00%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2(포스포디에스터) 0.1%
중화제, 방향,보호제, 산화방지제 q.s.
물 100%에 대한 q.s.
상기 조성물은 태양의 강렬한 복사에 노출되기 전에 색소 결점 현상이 일어나기 쉬운 개인에서의 색소결점의 출현을 막기 위해 사용되는 것이다. 높은 농도로 존재하는 태양광 차단제는 멜라닌 수준의 감소 결과인 자연적인 보호의 감소를 보정하는 것이 가능하다.
예 8: 탈색 얼굴 크림
글리세릴 스테아리트(glyceryl stearate)+Peg-100 스테아리트 5.00%
하이드로제네이티드 폴리이소부텐(hydrogenated polyisobutene) 4.00%
마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate) 3.30%
글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 3.00%
스쿠알렌 3.00%
글리세롤 2.00%
벌꿀왁스 1.50%
세티아릴 옥타노에이트(Cetearyl octanoate) 1.50%
세틸 알콜(cetyl alcohol) 1.00%
삭제
스테아릴 알콜(stearyl alcohol) 1.00%
디메티콘(dimethicone) 1.00%
크산탄(xanthan) 검 0.30%
에틸렌디아민테트라세틱산(ethylenediaminetetraacetic acid) 0.20%
시트르 산(citric acid) 0.10%
소듐 시트레이트(sodium citrate) 0.10%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 6(포스포디에스터) 0.10%
중화제, 방향, 보존제들 q.s.
물 100%에 대한 q.s.
상기 크림의 사용은 노년의 색소 결점들이나 화학적 색소 결점들을 약하게 하거나 제거함으로써 피부 색소형성의 불균일성을 처리하는 것을 가능하게 한다. 이것은 피부색을 동일하게 하고 밝게한다.
예 9: 피부색을 밝게하는 얼굴 로우션
에틸 알콜 30.00%
PPG-3 미리스틸 에테르(myristyl ether) 5.00%
글리세롤 2.00%
카보머(carbomer) 0.20%
폴리소베이트(polysorbate) 20 0.20%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 4(포스포로티오에이트) 0.01%
중화제, 방향, 보존제들 q.s.
물 100%에 대한 q.s.
피부색을 밝게 하는 상기 로우션은 화장이 제거되고 피부가 깨끗해 진 후에 사용된다.
예 10: 피부색을 밝게하는 얼굴 혈청
물 100%에 대한 q.s.
글리세롤 2%
테트라소듐 EDTA )
시트르산 ) pH 6에 대한 q.s.
트리소듐 시트레이트 )
크산탄 검 0.25%
폴리아크릴아미드, C13/C14 이소파라핀, 라우레스-7 0.5%
디메티콘 코폴리올 0.25%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 2(포스포디에스터) 0.1%
방향, 착색, 보존제 q.s.
이러한 매우 농축된 혈청 조성물의 한방울은 일반적으로 얼굴 크림을 적용하기 전에 얼굴에 적용된다. 상기 혈청은 전통적으로 피부색의 밝게 하거나 밝게 유지하기 위하여 1에서 2주 동안 사용된다.
예 11: 두발의 머리를 밝게하기 위한 두발 로우션
물 100%에 대한 q.s.
알콜 50%
팬더닐에틸 에테르(panthenylethyl ether) 0.5%
DL-α-토코페롤 아세테이트 0.2%
폴리소베이트 60 1%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 1(포스포로티오에이트) 0.01%
방향제 0.2%
글리세롤 0.5%
착색제 q.s.
상기 로우션은 두발의 머리에 점진적인 밝음을 얻는 것을 필요로 하는 한 아침과 저녁에 두발에 적용된다. 그 기간은 일반적으로 몇 주이다.
삭제
예 12: 손 크림(결점 방지 겔-크림)
카프릴릭/카프릭 디글리세릴 숙시네이트(diglyceryl succinate) 6%
옥틸 옥타노에이트(octyl octanoate) 2.5%
옥틸 메톡시시나메이트(octyl methoxicinnamate) 6%
올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO. 5 (포스포디에스터) 0.001%
페닐트리메티콘(phenyltrimethicone) 2.5%
벤조페논(benzophenone)-3 0.5%
소듐 하이알루로네이트(sodium hyaluronate) 0.05%
크산탄 검 0.2%
아크릴레이트/C10-C30 알킬 아크릴레이트 혼성 폴리머 0.5%
글리세롤 2%
PEG 150 3%
중화제, 착색제, 방향제, 보존제들 q.s.
정수된 물 100% 에 대한 q.s.
상기 크림은 그 착색을 엷게 하기 위하여 손의 노년의 결점들(노년의 모반)에 직접적으로 적용되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (39)

  1. 7 내지 25개, 바람직하게는 20개의 뉴클레오티드를 포함하고, 멜라닌의 합성 경로에 관계되는 필수 효소들 중 하나를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 있어서,
    상기 효소들은 티로시나아제 및 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP-1)에서 선택되며, 이하의 서열들 중 하나의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'
    - SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'
    - SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'
    - SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'
    - SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'
    - SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'
    - SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'
    - SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'
    - SEQ ID NO. 9 5'-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3'
    - SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'
    - SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'
  2. 제1항에 있어서,
    티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성화할 수 있으며, 이하의 서열들 중 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'
    - SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'
    - SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'
    - SEQ ID NO. 9 5'-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3'
    - SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'
  3. 제1항에 있어서,
    TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 생성물을 특정적으로 혼성화할 수 있으며, 이하의 서열들 중 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'
    - SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'
    - SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'
    - SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'
    - SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'
    - SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 개시 코돈을 제시하는 영역을 특정적으로 혼성할 수 있으며, 이하의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 10 5'-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3'
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 코딩 영역을 특정적으로 혼성화할 수 있으며, 이하의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 9 5'-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3'
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    티로시나아제를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 비코딩 영역(noncoding region)을 특정적으로 혼성화 할 수 있으며, 이하의 서열들 중 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 6 5'-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3'
    - SEQ ID NO. 7 5'-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3'
    - SEQ ID NO. 8 5'-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3'
  7. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 5' 비코딩 영역(noncoding region)을 특정적으로 혼성화할 수 있으며, 이하의 서열들 중 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 1 5'-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3'
    - SEQ ID NO. 2 5'-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3'
    - SEQ ID NO. 3 5'-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3'
    - SEQ ID NO. 4 5'-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3'
    - SEQ ID NO. 11 5'-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3'
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    TRP-1을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 개시 코돈을 제시하는 영역을 특정적으로 혼성화할 수 있으며, 이하의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
    - SEQ ID NO. 5 5'-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3'
  9. 제1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 당류 성분, 핵염기 성분 또는 인터뉴클레오티드 골격(internucleotide backbone)에 하나 이상의 화학적 변형이 존재하고, 상기 변형에 의해 생체 이용률 증가, 표적 서열에 대한 친화력의 증가, 세포의 내재화의 증가 또는 생물학적 안정성 향상 또는 세포의 뉴클레아제 존재시에 안정성의 증가와 같은 바람직한 물리화학적 특성이 제공되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 당류 성분은 2'-O-플루오로 또는 2'-O-알킬 치환기, 바람직하게는 2'-O-에틸옥시메틸 또는 2'-O-메틸 치환기를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 인터뉴클레오티드 골격의 포스포디에스터 (phosphodiester) 그룹들의 일부가 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 그룹들로 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 인터뉴클레오티드(internucleotide) 골격의 포스포디에스터(phosphodiester) 그룹들의 일부가 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 그룹들로 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 모든 포스포디에스터(phosphodiester) 그룹들이 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 그룹들로 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 모든 포스포디에스터(phosphodiester) 그룹들이 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 그룹들로 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 포스포디에스터(phosphodiester) 그룹들이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 그룹들 및/또는 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 그룹들로 전체적으로 또는 부분적으로 대체되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제1항에 있어서,
    핵산이나 펩티드 타입의 선형 투여 매개체 또는 플라스미드 타입의 환형 투여 매개체로 이식되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제1항에 있어서,
    의약품으로 사용되는 올리고뉴클레오티드.
  18. 제1항에 따른 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 미용적 또는 피부병학적으로 사용가능한 매질을 포함하는 미용 또는 피부용 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    엘라그산(ellagic acid) 및 그 유도체; 하이드로퀴논(hydroquinone); 알부틴(arbutin); 레조키놀(resorcinol) 및 그 유도체; 비타민 C및 그 유도체; 술폰산 판토텐염(pantothenate sulphonate) 및 그 유도체; 코직산(kojic acid); 태반 추출물; 알파-멜라노사이트-자극 호르몬(α-MSH) 또는 그 수용체 또는 부신 피질 자극 호르몬(ACTH)을 직접적 또는 간접적으로 방해하는 분자들; 글리세롤, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올(polyol); 비타민; 살리실산(salicylic acid) 및 그 유도체와 같은 각질용 또는 박리용제; 랙틱산(lactic acid) 또는 말릭산(malic acid)과 같은 단독 또는 이식된 α-하이드록시산(α-hydroxy acid); 아스코브산(ascorbic acid) 및 그 유도체; 레티노산(retinoic acid); 레틴알데히드(retin-aldehyde); 리포솜 조제품에 존재하거나 그렇지 않을 수 있는 팔미트산염(palmitate), 프로피온산염(propionate) 또는 아세트산염(acetate)과 같은 레티놀 및 그 유도체; 토코페롤 및 그 유도체, 시오타우린(thiotaurine), 하이포타우린(hypotaurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 시아민 파이로인산염(thiamine pyrophosphate), 피리독스아민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 삼인산 아데노신과 같은 단독 또는 조합으로 쓰이는 안티글리케이션제 또는 산화 방지제; 스테아릴 글리시리티네이트(glycyrrhetinate)와 같은 소염제; 안정제 및 그 혼합물, 미소화된 아연산화물, 티타늄산화물, 부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane) 및 옥틸메톡시시나메이트(octylmethoxycinnamate)와 같은 화학적 또는 물리적 태양광선 차단제; 및 디옥시리보핵산 또는 핵산에서 선택된 하나 이상의 활성제를 포함하는 미용 또는 피부용 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드(들)는 상기 조성물의 전체 중량의 0.00001% 내지 10%를 나타내는 것을 특징으로 하는 미용 또는 피부용 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드(들)는 상기 조성물의 전체 중량의 0.0003% 내지 3%를 나타내는 것을 특징으로 하는 미용 또는 피부용 조성물.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    국소 적용을 위해 종래에 사용되는 형태, 및 특히 수성, 수성-알코올성 또는 유성 용액 형태, OW(oil-in-water)제형, W0(water-in-oil)제형 또는 복합 에멀젼 형태, 수성 또는 오일겔 형태, 액체, 풀 또는 고체 무수물 형태, 액상 또는 유상에 나노스피어 및 나노캡슐과 같은 폴리머 입자의 디스퍼젼 형태 또는 이온성 또는 비이온성 타입의 액체 소낭의 디스퍼젼 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 미용 또는 피부용 조성물.
  23. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를 미용제로 사용하는 방법.
  24. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를 인간 피부, 체모 또는 모발을 탈색하거나 표백하는데 사용하는 방법.
  25. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를, 국소적인 경로를 통해, 티로시나아제 또는 TRP-1의 과도한 발현으로 초래되는 질병의 치료 또는 방지를 위한 의약품의 제조에 사용하는 방법.
  26. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를 멜라닌 합성을 저해하는 의약품의 제조에 사용하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드를, 특발성(idiopathic) 멜라즈마와 같은 멜라닌 세포성 과다 활동으로 인한 국부적인 과도한 색소형성, 노쇠 색소 결점으로 알려진 색소 결점(노년의 모반)과 같은 악성 멜라닌 세포성 과다 활동 및 증식으로 인한 국지적인 과도한 색소형성, 광감작(光感作)이나 반흔(瘢痕) 모양의 과도한 색소형성과 같은 우연한 과도한 색소형성을 치료하고 예방하며, 백반(白斑)과 같은 특정 백색피부증을 치료하기 위한 의약품의 제조에 사용하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드를, 피부를 탈색하거나 표백하는 의약품의 제조에 사용하는 방법.
  29. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를 티로시나아제 또는 TRP-1의 발현을 조절하는데 사용하는 방법.
  30. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드를, 엘라그산(ellagic acid) 및 그 유도체; 하이드로퀴논(hydroquinone); 알부틴(arbutin); 레조키놀(resorcinol) 및 그 유도체; 비타민 C및 그 유도체; 술폰산 판토텐염(pantothenate sulphonate) 및 그 유도체; 코직산(kojic acid); 태반 추출물; 알파-멜라노사이트-자극 호르몬(α-MSH) 또는 그 수용체 또는 부신 피질 자극 호르몬(ACTH)을 직접적 또는 간접적으로 방해하는 분자들; 글리세롤, 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올(polyol); 비타민; 살리실산(salicylic acid) 및 그 유도체와 같은 각질용 또는 박리용제; 랙틱산(lactic acid) 또는 말릭산(malic acid)과 같은 단독 또는 이식된 α-하이드록시산(α-hydroxy acid); 아스코브산(ascorbic acid) 및 그 유도체; 레티노산(retinoic acid); 레틴알데히드(retin-aldehyde); 리포솜 조제품에 존재하거나 그렇지 않을 수 있는 팔미트산염(palmitate), 프로피온산염(propionate) 또는 아세트산염(acetate)과 같은 레티놀 및 그 유도체; 토코페롤 및 그 유도체, 시오타우린(thiotaurine), 하이포타우린(hypotaurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 시아민 파이로인산염(thiamine pyrophosphate), 피리독스아민, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 페닐알라닌, 피리독신, 삼인산 아데노신과 같은 단독 또는 조합으로 쓰이는 안티글리케이션제 또는 산화 방지제; 스테아릴 글리시리티네이트(glycyrrhetinate)와 같은 소염제; 안정제 및 그 혼합물, 미소화된 아연산화물, 티타늄산화물, 부틸메톡시디벤조일메탄(butylmethoxydibenzoylmethane) 및 옥틸메톡시시나메이트(octylmethoxycinnamate)와 같은 화학적 또는 물리적 태양광선 차단제; 및 디옥시리보핵산 또는 핵산에서 선택된 하나 이상의 활성제와 조합하여 동시에 또는 분리되어 또는 시간에 걸쳐 나누어 투여되는 의약품의 제조에 사용하는 방법.
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