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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Oligonukleotidsequenzen und
deren Derivate.
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Diese
neuen Oligonukleotidsequenzen können
mit dem Gen oder mit einem Produkt des Gens hybridisieren, das für eines
der essentiellen an der Synthese von Melaninpigmenten beteiligten
Enzyme kodiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser neuen
Oligonukleotidsequenzen als depigmentierende oder hautbleichende
Wirkstoffe in einer kosmetischen oder dermatologischen Zusammensetzung.
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Beim
Menschen ist die Pigmentierung Ergebnis der Synthese und Verteilung
der Melaninpigmente in der Haut, den Haarfollikeln oder den Augen.
Die Pigmentierung ist genetisch vorbestimmt, wird jedoch von zahlreichen
endogenen und exogenen Faktoren gesteuert. Die von den Melanozyten
produzierten Melanine sowie die Anzahl der Melanozyten, deren Tyrosinase-Aktivität und deren
Fähigkeit,
die Melanine zu den Keratinozyten zu exportieren, die Größe der Melanosomen,
welche Melaningranula enthalten, bestimmen die Farbe der menschlichen
Haut. Bei jeder Person variiert die Hautfarbe im Wesentlichen in
Abhängigkeit
von der mehr oder weniger starken Bestrahlung mit ultravioletten
(UV-)Strahlen. Mit anderen Worten existiert für jede Person eine Grundpigmentierung
der Haut, wenn sie der schwächsten
UV-Strahlung ausgesetzt ist, wobei diese Grundpigmentierung deren
hellster Hautfarbe entspricht, und eine intensivere Hautpigmentierung,
wenn sie einer stärkeren
UV-Strahlung ausgesetzt
ist, bis hin zu einer maximalen Pigmentierung, die derer dunkelster Hautfarbe
entspricht, wenn sie über
einen längeren
Zeitraum einer intensiven UV-Strahlung ausgesetzt ist, wie jener,
die in höheren
Lagen in den Bergen anzutreffen ist.
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Andererseits
existiert in der Weltbevölkerung
bekanntermaßen
eine sehr große
genetische Vielfalt hinsichtlich der Hautpigmentierung. So weist
die Hautfarbe, die der vorstehend definierten Grundpigmentierung entspricht,
je nach Population einen mehr oder weniger hellen Teint auf, der
zwischen den zwei Extremen „sehr hell" und „sehr dunkel" liegt. Je nach Population
ist außerdem
der Unterschied im Teint zwischen der Grundpigmentierung und der
maximalen Pigmentierung mehr oder weniger bedeutend. So reagieren
bekanntermaßen
Personen, die bestimmten hellhäutigen
(Grundpigmentierung) Bevölkerungen
angehören,
schnell und/oder stark auf die Wirkung der UV-Strahlen und können deshalb
leicht eine Haut mit dunklem Teint aufweisen, selbst wenn diese
Personen nicht bewusst und über
einen längeren
Zeitraum der Sonne ausgesetzt sind. Im nachfolgenden Text werden
diese Personen als „Personen,
die sehr empfindlich auf UV-Strahlung reagieren" bezeichnet. Dies trifft insbesondere
auf Bevölkerungen
asiatischer Herkunft oder auf bestimmte sogenannte Mischbevölkerungen
zu.
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Darüber hinaus
beobachten Personen, insbesondere im Bereich von Gesicht oder Händen, das
Auftreten von dunkleren oder farbigeren Stellen oder Flecken auf
ihrer Haut, die dieser ein ungleichmäßiges Aussehen verleihen. Diese
Flecken sind auf eine hohe Melaninkonzentration in den Hautkeratinozyten
zurückzuführen.
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Der
Mechanismus der Bildung der Hautpigmentierung umfasst die Melaninsynthese.
Dieser Mechanismus ist besonders komplex und beinhaltet schematisch
die folgenden wesentlichen Schritte:
Tyrosin ⇨ Dopa ⇨ Dopachinon ⇨ Dopachrom ⇨ Melanine
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Die
bekannten Enzyme, die an dieser Reaktionsfolge beteiligt sind, sind
im Wesentlichen die Tyrosinase und das Tyrosinase-verwandte-Protein
1 (TRP-1). Diese Enzyme katalysieren insbesondere die Reaktion der
Umwandlung von Tyrosin in Dopa (Dihydroxyphenylalanin) und die Reaktion
der Umwandlung von Dopa in Dopachinon, die zur Bildung der Melaninpigmente
führt.
Diese Enzyme greifen nicht getrennt in den Reaktionsmechanismus
der Melanogenese ein. Die Tyrosinase und TRP-1 bilden einen Enzymkomplex
(Winder et al. (1994) Cell. Mol. Biol. Res. 40: 7–8; Orlow
et al. (1994) J. of Investigative Dermatology 103: 196–211). Diese beiden
Enzyme wirken deshalb zusammen und es scheint, als würden diese
beiden Enzyme nie getrennt voneinander wirken. Bekanntermaßen wird
in einer TRP-1 depletierten Zelle eine Aktivitätsabnahme der Tyrosinase beobachtet
(Orlow et al. (1994)); dies bedeutet, dass die Tyrosinase die Anwesenheit
von TRP-1 erfordert, um aktiv zu sein (Zhao et al. (1996) J. of
Investigative Dermatology 106: 744–752).
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Diese
essentiellen Enzyme, die in den Melaninsyntheseweg eingreifen, werden
im nachfolgenden Text als „essentielle
Enzyme der Pigmentierung" bezeichnet.
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Ein
Molekül
gilt als depigmentierend, wenn es direkt auf die Melanozyten der
Epidermis wirkt, indem es die Aktivität dieser Zellen hemmt und/oder
wenn es einen der Schritte der Biosynthese der Melanine blockiert.
Dies ist insbesondere der Fall, wenn das Molekül eines der Enzyme hemmt, die
in die Melanogenese eingreifen, oder wenn es mit den chemischen
Verbindungen der Synthesekette der Melanine reagiert.
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Die
bekannten depigmentierenden Substanzen sind insbesondere Hydrochinon
und dessen Derivate, Ascorbinsäure
und deren Derivate, Plazentaextrakte, Kojisäure, Ferulasäure, Arbutin,
Dihydroxybenzol-Derivate (WO 00/47045), Guajacol-Derivate (WO 00/47179),
4-(2,3-Dihydroxyphenyl)cyclohexanol (WO 00/56279), Resorcin-Derivate
(WO 00/56702), Phenolamide (WO 99/32077). Diese Substanzen können bestimmte
Nachteile aufweisen. Sie können
instabil sein, eine Verwendung in erhöhten Konzentrationen erfordern,
eine mangelnde Wirkungsspezifität
oder eine zytotoxische oder reizende Wirkung aufweisen.
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Die
topische Verwendung von wirksamen und unschädlichen depigmentierenden Substanzen
ist besonders in der Kosmetik und Dermatologie gefragt. Diese Substanzen
werden insbesondere zur Behandlung von lokalen Hyperpigmentierungen,
die durch eine Hyperaktivität
der Melanozyten bedingt sind, wie idiopathischen Melasmen, von lokalen
Hyperpigmentierungen, die durch eine Hyperaktivität und eine
gutartige Proliferation der Melanozyten bedingt sind, wie Pigmentflecken
oder auch Altersflecken (lentigo senilis), von akzidentiellen Hyperpigmentierungen,
wie der Photosensibilisierung oder der Narbenhyperpigmentierung,
sowie von bestimmten Leukoderma, wie Vitiligo, verwendet. Da die
Haut in den letzteren Fällen
nicht repigmentiert werden kann, schwächt man die Pigmentierung der
Randzone der depigmentierten Bereiche ab, um der Haut eine einheitlichere
Farbe zu verleihen.
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Depigmentierende
Substanzen werden auch von bestimmten Personen, insbesondere von
den vorstehend genannten, die sehr empfindlich auf UV-Strahlung reagieren,
als Mittel zur Bleichung der Haut verwendet, um den Teint, insbesondere
von Gesicht und Händen,
aufzuhellen, um eine Hautfarbe beizubehalten, die so hell oder einheitlich
wie möglich
ist, oder zumindest um die pigmentierende Wirkung der UV-Strahlung zu
schwächen.
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Das
Problem, das sich dem Fachmann stellt, ist somit die Entwicklung,
Herstellung oder Isolierung neuer depigmentierender Substanzen oder
neuer die menschliche Haut, Körperhaare
oder Haare bleichender Mittel, die nicht die Nachteile der bekannten
Substanzen aufweisen, das heißt
nicht reizend, nicht toxisch und/oder nicht hautallergisierend und
in einer Zusammensetzung stabil sind.
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Die
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids zur Behandlung von Krankheiten,
die durch eine Dysfunktion der Melanozyten bedingt sind, insbesondere
von Vitiligo und anderen depigmentierenden Krankheiten, wurde in
der WO 99/25819 beschrieben. Bei diesen Hauterkrankungen ist die
Hypopigmentierung auf einen anormal erhöhten Tenascin-Gehalt zurückzuführen. Die
in diesem Dokument beschriebenen Oligonukleotide wirken der Hypopigmentierung
entgegen, indem sie die Tenascin-Expression regulieren.
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht dagegen darin, ein
auf den Vorgang der Melanogenese einwirkendes depigmentierendes
Mittel bereitzustellen, welches einerseits im Fall einer annähernd einheitlichen
Pigmentierung dazu bestimmt ist, die Haut, die Körperhaare oder die Haare zu
bleichen, das heißt ihre
Pigmentierung zu verringern, und andererseits die Hyperpigmentierung
der Haut zu bekämpfen,
nämlich wenn
die Haut einer uneinheitliche Pigmentierung aufweist.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass Oligonukleotide
mit den Genen oder den Produkten der Gene (wie den RNAs), die für Tyrosinase
kodieren, hybridisieren können.
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So
greifen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide
durch Modulation der Expression der Tyrosinase in den Melanozyten
zu Beginn in die vorstehend dargestellte Melanogenesereaktion ein.
Diese Wirkung existiert selbst bei einer sehr geringen Konzentration,
was das Interesse an diesen Oligonukleotiden erhöht. Darüber hinaus weisen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide
keinerlei Zytotoxizität
auf.
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Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
bieten eine ideale Lösung
der Probleme, die sich durch die herkömmlicherweise verwendeten Substanzen
stellen. Die bekannten Substanzen, die die Aktivität der Tyrosinase
hemmen (insbesondere Hydrochinon und dessen Derivate, Ascorbinsäure und
deren Derivate, Plazentaextrakte, Kojisäure, Arbutin), weisen multiple
Nebenwirkungen auf, die aufgrund ihrer geringen Spezifität unakzeptabel
sind. Die vorliegende Erfindung löst somit die Probleme, die
sich den Forschern früher
stellten, indem sie die Produktion essentieller Enzyme der Pigmentierung
moduliert, statt direkt die Enzyme zu inhibieren, um die depigmentierende
Wirkung zu erhalten.
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Da
die essentiellen Enzyme in Form eines Komplexes zusammenwirken,
haben die Erfinder neue Oligonukleotide beschrieben, welche die
Expression eines der Enzyme des Komplexes inhibieren, um das gestellte
Problem zu lösen.
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Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
sind als solche und als Medikamente neu.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Oligonukleotid, das eine Zahl
von Nukleotiden, die zwischen 18 und 25 einschließlich liegt
und bevorzugt gleich 20 ist, umfasst, welches in der Lage ist, spezifisch
mit dem Gen oder einem Produkt des Gens, das für Tyrosinase kodiert, zu hybridisieren,
wobei das Oligonukleotid die Tyrosinase-Expression inhibiert und
mindestens 80% Identität
mit einer der Sequenzen SEQ ID N° 6
bis N° 10 aufweist,
welche die folgende Bedeutung haben:
-
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Oligonukleotid als
neues Produkt, dessen Sequenz eine der vorstehend beschriebenen
Sequenzen ID N° 6
bis N° 10
ist.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Gen, das für Tyrosinase
kodiert" die Genomsequenz
des Tyrosinase-Gens verstanden. Ebenso wird unter „Gen, das
für TRP-1
kodiert" die Genomsequenz des
TRP-1-Gens verstanden.
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Die
Schlüsselrollen
von Tyrosinase und TRP-1 in der Melanogenese sind bekannt. Die Verwendung von
Oligonukleotiden, die gegen eine Boten-RNA gerichtet sind, welche
für ein
Enzym oder ein Protein kodiert, um dessen Expression zu modulieren,
ist ebenso bekannt. Die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung entwickelte
Technik wurde jedoch noch nie als Mittel zur Depigmentierung eingesetzt.
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Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
sind so festgelegt, dass sie direkt mit der Boten-RNA oder dem Gen
hybridisieren. Sie ermöglichen
es somit, eine Endregulierung der Menge der von den Genen produzierten
Tyrosinase durchzuführen.
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In
dem vorliegenden Dokument wird der Begriff „Hybridisierung" zur Bezeichnung
der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen,
auch bekannt als Watson-Crick-Paarung, zwischen komplementären Basen, gewöhnlich auf
zwei Nukleinsäuresträngen, zur
Bildung eines Doppelhelix-Doppelstrangs verwendet.
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Der
Grad der Komplementarität
zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen
identischer Länge
wird durch Vergleich, nach Alignment, der ersten Sequenz mit der
komplementären
Sequenz der zweiten Sequenz bestimmt. Der Grad der Komplementarität wird durch
Bestimmen der Anzahl der identischen Positionen, für die das
Nukleotid zwischen den beiden auf diese Weise verglichenen Sequenzen
identisch ist, durch Teilen dieser Anzahl identischer Positionen
durch die Gesamtzahl an Positionen und durch Multiplizieren des
erhaltenen Ergebnis mit 100 berechnet, um den Grad der Komplementarität zwischen
diesen beiden Sequenzen zu erhalten.
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Der
Begriff „spezifische
Hybridisierung" bedeutet
insbesondere, dass es einen Grad der Komplementarität gibt,
der ausreicht, um die unspezifische Bindung des Oligonukleotids
an eine Nicht-Zielsequenz unter Bedingungen, in denen die spezifische
Bindung gewünscht
ist, zu verhindern. Es ist selbstverständlich, dass das Oligonukleotid
nicht eine 100%-ige Komplementarität mit der Sequenz der Zielnukleinsäure aufweisen muss,
um spezifisch zu hybridisieren. Insbesondere kann ein Oligonukleotid,
das eine Komplementarität von mindestens
ungefähr
80% aufweist, spezifisch mit der Nukleinsäure hybridisieren, die als
Ziel gewählt
wurde.
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Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
hybridisieren spezifisch mit dem Gen oder dem Produkt des Gens,
das für
Tyrosinase kodiert. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Oligonukleotide
entweder mit der DNA des Gens, das für Tyrosinase kodiert, oder
aber mit der mRNA, die von diesem Gen abstammt, hybridisieren. Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
umfassen eine bezüglich
Identität
und Anzahl ausreichende Nukleotidzahl, um spezifisch zu hybridisieren.
Diese Eigenschaft wird gewöhnlich „Antisense" genannt.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter „DNA, die für Tyrosinase
kodiert" sowohl
die Exone als auch die Introne, insbesondere die Exone, verstanden.
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Es
wird präzisiert,
dass:
- – die
Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 und SEQ ID N° 4 spezifisch
mit dem nicht-kodierenden 5'-Bereich
des Gens oder der mRNA hybridisieren, die für TRP-1 kodieren,
- – das
Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID N° 5 spezifisch mit dem Bereich
hybridisiert, der das Startcodon des Gens oder der mRNA aufweist,
die für
TRP-1 kodieren,
- – die
Oligonukleotide der Erfindung mit den Sequenzen SEQ ID N° 6, SEQ ID
N° 7 und
SEQ ID N° 8
spezifisch mit dem nicht-kodierenden 5'-Bereich des Gens oder der mRNA hybridisieren,
die für
Tyrosinase kodieren,
- – das
Oligonukleotid der Erfindung mit der Sequenz SEQ ID N° 9 spezifisch
mit dem kodierenden Bereich des Gens oder der mRNA hybridisiert,
die für
Tyrosinase kodieren,
- – das
Oligonukleotid der Erfindung mit der Sequenz SEQ ID N° 10 spezifisch
mit dem Bereich hybridisiert, der das Startcodon des Gens oder der
mRNA aufweist, die für
Tyrosinase kodieren,
- – das
Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID N° 11 spezifisch mit dem nicht-kodierenden 5'-Bereich des Gens
oder der mRNA hybridisieren, die für TRP-1 kodieren,
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem Oligonukleotide, die
eine oder mehrere chemische Modifikationen in ihren Zuckerteilen,
ihren Nukleobasenteilen oder ihrem Internukleotid-Gerüsts umfassen,
welche den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden
wünschenswerte
physikochemische Eigenschaften verleihen, wie eine erhöhte Bioverfügbarkeit,
die Erhöhung
der Affinität
zu den Zielsequenzen, die Erhöhung
der zellulären Aufnahme
oder eine bessere biologische Stabilität oder die Erhöhung der
Stabilität
in Anwesenheit von zellulären
Nukleasen.
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Beispiele
für Modifikationen,
die diese Eigenschaften verleihen können, sind 2'-O-Alkyl- und 2'-O-Fluor-Derivate
am Zuckerteil des Nukleosids und Phosphorothioat-Derivate oder Methylphosphonat-Derivate beim
Internukleotid-Gerüsts.
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Im
vorliegenden Dokument bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf Polynukleotide,
die aus natürlich
vorkommenden Nukleobasen und Pentafuranosylgruppen (Zucker) gebildet
werden, welche Nukleoside bilden, die untereinander durch native
Phosphodiester-Bindungen verbunden sind. Der Begriff „Oligonukleotide" bezieht sich somit
auf die natürlich
vorkommenden Arten oder auf die synthetischen Arten, die aus natürlich vorkommenden
Untereinheiten oder deren verwandten Homologen gebildet werden.
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Der
Begriff „Oligonukleotide" kann sich auch auf
Teile beziehen, die ähnliche
Funktionen haben wie die natürlichen
Oligonukleotide, aber nicht-natürliche Anteile
aufweisen können.
Die Oligonukleotide können modifizierte
Zuckeranteile, Nukleobasenanteile oder Internukleotidverbindungen
aufweisen. Unter den möglichen
Modifikationen sind die bevorzugten Modifikationen die 2'-O-Alkylderivate am
Zuckeranteil, insbesondere die 2'-O-Ethyloxymethyl-
oder 2'-O-Methylderivate, oder
die Phosphorothioate oder Methylphosphonate beim Internukleotid-Gerüst.
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Chimäre Oligonukleotide
sind in den bevorzugten Modifikationen der Erfindung mit inbegriffen.
Die Oligonukleotide enthalten mindestens zwei chemisch unterschiedliche
Bereiche, die jeweils mindestens ein Nukleotid umfassen. Es handelt
sich insbesondere um einen oder mehrere Bereiche, die ein modifiziertes
Nukleotid enthalten, das eine oder mehrere vorteilhafte Eigenschaften
verleiht, wie zum Beispiel eine bessere biologische Stabilität, eine
erhöhte
Bioverfügbarkeit,
die Erhöhung
der zellulären
Aufnahme oder die Erhöhung der
Affinität
zur Ziel-RNA.
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Bevorzugt
kann das Internukleotid-Gerüst
ganz oder teilweise aus Phosphodiestern oder Phosphorothioaten oder
Methylphosphonaten oder aus Kombinationen von Phosphodiester- und/oder
Phosphorothioat- und/oder Methylphosphonat-Bbindungen bestehen.
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So
ist das erfindungsgemäße Oligonukleotid
dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil der Phosphodiestergruppen
seines Internukleotid-Gerüsts
durch Phosphorothioatgruppen und/oder Methylphosphonatgruppen ersetzt
ist.
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Alternativ
ist das erfindungsgemäße Oligonukleotid
dadurch gekenn zeichnet, dass alle Phosphodiestergruppen durch Phosphorothioatgruppen
oder Methylphosphonatgruppen ersetzt sind.
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Alternativ
sind die Phosphodiestergruppen ganz oder teilweise durch Phosphorothioatgruppen und/oder
Methylphosphonatgruppen ersetzt.
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Der
Begriff „Oligonukleotide" kann sich auch auf
Oligonukleotide beziehen, auf welche ein ringförmiger Verabreichungsvektor
der plasmidischen Art oder ein linearer Verabreichungsvektor vom
Typ Nuklein- oder Peptidsäure
gepfropft wurde.
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Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
sind als Medikamente neu.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine kosmetische oder
dermatologische Zusammensetzung, die mindestens ein vorstehend beschriebenes
Oligonukleotid und ein kosmetisch oder dermatologisch annehmbares
Medium enthält.
Eine derartige Zusammensetzung kann darüber hinaus einen oder mehrere Wirkstoffe
zur Verstärkung
der angestrebten Wirkungen enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von mindestens
einer Oligonukleotidsequenz, die gegen ein Transkriptionsprodukt
des Gens, das für
Tyrosinase kodiert, gerichtet ist, bei der oder für die Herstellung
einer kosmetischen oder dermatologischen Zusammensetzung, insbesondere
zur Depigmentierung oder Bleichung der menschlichen Haut, Körperhaare
oder Haare und zur Aufhellung von Pigmentflecken der menschlichen
Haut.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von mindestens
einem vorstehend beschriebenen Oligonukleotid zur Herstellung eines
Medikaments, das zur topischen Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten
bestimmt ist, die sich in der Überexpression
von Tyrosinase äußern. Dieses Medikament kann
zur Hemmung der Melaninsynthese, insbesondere zur Depigmentierung
oder Bleichung der Haut bestimmt sein, aber auch zur Behandlung
oder Vorbeugung von lokalen Hyperpigmentierungen, die durch eine Hyperaktivität der Melanozyten
bedingt sind, wie idiopathischen Melasmen, von lokalen Hyperpigmentierungen,
die durch eine Hyperaktivität
und eine gutartige Proliferation der Melanozyten bedingt sind, wie
Pigment-Altersflecken (lentigo senilis), von akzidentiellen Hyperpigmentierungen,
wie denen der Photosensibilisierung oder der postläsionellen
Vernarbung, und zur Behandlung von bestimmten Leukoderma, wie Vitiligo.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von mindestens
einer Oligonukleotidsequenz, die gegen ein Transkriptionsprodukt
des Gens, das für
Tyrosinase kodiert, gerichtet ist, in einer kosmetischen Zusammensetzung,
welche die menschliche Haut depigmentiert oder bleicht.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine depigmentierende
Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie in einem
kosmetisch oder dermatologisch annehmbaren Medium mindestens eine Oligonukleotidsequenz
enthält,
die gegen ein Transkriptionsprodukt des Gens gerichtet ist, das
für Tyrosinase kodiert.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung für
die obigen Zusammensetzungen, Verwendungen und das obige Behandlungsverfahren
ist das Oligonukleotid dasjenige, dessen Sequenz nachstehend definiert
ist:
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Die
kosmetische oder dermatologische Zusammensetzung gemäß der Erfindung
ist für
eine topische Anwendung geeignet und umfasst demgemäß ein kosmetisch
oder dermatologisch annehmbares, das heißt hautverträgliches
Medium. Die erfindungsgemäße Oligonukleotidsequenz
kann in einer Menge vorliegen, die von 0,00001% bis 10% und bevorzugt
0,0003% bis 3% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung reicht.
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Die
Zusammensetzung der Erfindung kann in allen galenischen Formen vorliegen,
die üblicherweise für eine topische
Anwendung verwendet werden, insbesondere in Form einer wässrigen,
wässrig-alkoholischen
oder öligen
Lösung,
einer Öl-in-Wasser-
oder Wasser-in-Öl-
oder Mehrfach-Emulsion, eines wässrigen oder öligen Gels,
eines flüssigen,
pastenartigen oder festen wasserfreien Produkts, einer Dispersion
von Polymerpartikeln, wie Nanokügelchen
und Nanokapseln, in einer wässrigen
oder öligen
Phase oder auch einer Dispersion von Lipidvesikeln der ionischen
oder nichtionischen Art, wie sie in dem US-Patent 4,508,703 beschrieben
ist.
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Diese
Zusammensetzung kann mehr oder weniger dünnflüssig sein und das Aussehen
einer weißen oder
farbigen Creme, einer Salbe, einer Milch, eines Gels, einer Lotion,
eines Serums, einer Paste oder eines Schaums aufweisen. Sie kann
gegebenenfalls in Form eines Aerosols auf die Haut aufgetragen werden.
Sie kann auch in pulverförmiger
oder nicht pulverförmiger
fester Form, zum Beispiel in Form eines Stifts oder eines Kompaktpuders,
vorliegen. Sie kann außerdem
in Form von Pflastern, Stiften, Pinseln und Applikatoren vorliegen,
die ein lokales Auftragen auf Flecken im Gesicht und an den Händen zulassen.
Sie kann als Pflegeprodukt oder als Make-up verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
kann bekanntermaßen
auch die in der Kosmetik und Dermatologie üblichen Zusatzstoffe enthalten,
wie hydrophile oder lipophile Geliermittel, hydrophile oder lipophile Wirkstoffe,
Konservierungsmittel, Antioxidantien, Lösungsmittel, Parfüm, Füllstoffe,
Filter, Pigmente, Geschmacksabsorptiosmittel und Farbstoffe. Die
Mengen dieser verschiedenen Zusatzstoffe sind die üblicherweise
in den betreffenden Gebieten verwendeten. Je nach ihrer Art können diese
Zusatzstoffe in die Fettphase, in die wässrige Phase, in die Lipidvesikel
oder in die Nanopartikel eingeführt
werden.
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Ist
die kosmetische oder dermatologische Zusammensetzung der Erfindung
eine Emulsion, so kann der Anteil der Fettphase im Allgemeinen von
5 bis 80 Gew.-% und bevorzugt von 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das
Gesamtgewicht der Zusammensetzung, betragen. Die in der Zusammensetzung
in Emulsionsform verwendeten Öle,
Emulgatoren und Coemulgatoren werden aus denjenigen ausgewählt, die üblicherweise
in dem betreffenden Bereich verwendet werden. Der Emulgator und
der Coemulgator liegen in der Zusammensetzung in einem Anteil vor,
der im Allgemeinen zwischen 0,3 und 30 Gew.-% und bevorzugt zwischen
0,5 und 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung,
liegt.
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Als Öle, die
in Assoziation mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden verwendet
werden können, können Mineralöle (Vaselinöl), pflanzliche Öle (Avokadoöl, Sojaöl), tierische Öle (Lanolin),
synthetische Öle (Perhydrosqualen),
Silikonöle
(Cyclomethicon) und fluorierte Öle
(Perfluoropolyether) genannt werden. Als Fett können auch Fettalkohole (Cetylalkohol),
Fettsäuren,
Wachse (Canaubawachs, Ozokerit) verwendet werden.
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Als
Emulgatoren und Coemulgatoren, die in Assoziation mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden verwendet
werden können,
können
zum Beispiel Fettsäurepolyethylenglycolester,
wie PEG 20-Stearat, und Fettsäureglycerinester,
wie Glycerinstearat, genannt werden.
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Als
hydrophile Geliermittel, die in Assoziation mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden
verwendet werden können,
können
insbesondere Carboxyvinylpolymere (Carbomer), Acrylcopolymere, wie
Acrylat-Alkylacrylat-Copolymere, Polyacrylamide, Polysaccharide,
natürliche
Gummis und Tone genannt werden. Als lipophile Geliermittel können modifizierte
Tone, wie Bentone, metallische Fettsäuresalze, hydrophobes Siliciumdioxid
und Polyethylene genannt werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine kosmetische oder dermatologische
Zusammensetzung, welche mindestens ein vorstehend beschriebenes
Oligonukleotid und einen oder mehrere andere Wirkstoffe enthält.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von mindestens
einem Oligonukleotid, wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung
eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, gleichzeitig, getrennt oder
gestaffelt in Verbindung mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen
verabreicht zu werden.
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Diese
in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden verwendbaren
Wirkstoffe, die in reiner Form verwendet werden oder aus Extrakten
stammen, die diese Moleküle
umfassen, sind insbesondere die folgenden Verbindungen: Ellagsäure und
deren Derivate; Hydrochinon; Arbutin; Resorcin und dessen Derivate;
Vitamin C und dessen Derivate; Pantothenatsulfonat und dessen Derivate;
Kojisäure;
Plazentaextrakte; Moleküle,
die direkt oder indirekt mit alpha-Melanozyten-stimulierendem Hormon
(α-MSH)
oder dessen Rezeptor oder adrenokortikotropem Hormon (ACTH) wechselwirken;
Polyole, wie Glycerin, Glycol oder Propylenglycol; Vitamine; keratolytische
oder schuppenlösende
Wirkstoffe, wie Salicylsäure
und deren Derivate; alpha-Hydroxysäuren, wie Milchsäure oder Äpfelsäure, einzeln
oder gepfropft; Ascorbinsäure
und deren Derivate; Retinoesäure;
Retinaldehyd; Retinol und dessen Derivate, wie das Palmitat, Propionat
oder Acetat, in Form eines liposomalen oder nicht-liposomalen Präparates;
Antiglykierungsmittel oder Antioxidantien, einzeln oder kombiniert,
wie Tocopherol und dessen Derivate, Thiotaurin, Hypotaurin, Aminoguanidin,
Thiaminpyrophosphat, Pyridoxamin, Lysin, Histidin, Arginin, Phenylalanin,
Pyridoxin, Adenosintriphosphat; entzündungshemmende Mittel, wie
Stearylglycyrrhetinat; beruhigende Mittel und deren Mischungen,
chemische oder physikalische Sonnenfilter, wie Octylmethoxycinnamat,
Butylmethoxydibenzoylmethan, mikronisiertes Titandioxid und Zinkoxid;
und Desoxyribonukleinsäuren
oder Nukleinsäuren.
Im Fall der Inkompatibilität
können
diese anderen Wirkstoffe und/oder die Oligonukleotide der Erfindung
in Kügelchen
eingeschlossen werden, insbesondere in Vesikel, die von ionischen
oder nichtionischen amphiphilen Lipiden gebildet werden, wie im
US-Patent Nr. 4,508,703 beschrieben, oder in Nanopartikeln.
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Die
nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne jedoch
deren Schutzbereich einzuschränken.
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Aus
Gründen
der Stabilität
in den in-vitro-Kulturmedien und bestimmungsgemäß wurden die Beispiele 2 bis
4 mit Phosphorothioatderivaten und die Beispiele 5 bis 12 gleicherweise
mit Phosphorothioat- und Phosphodiesterderivaten durchgeführt.
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In
den nachfolgenden Beispielen sind alle Prozentangaben in Gewicht
angegeben, außer
bei gegenteiliger Angabe.
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Beispiel 1: Synthese der
Oligonukleotide
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Beispielsweise
wurden Oligonukleotide mit einem Syntheseautomaten (Expedite Model
8909 von Perseptive Biosystems) unter Verwendung der Standardchemie
von Phosphoramidit-Derivaten gemäß den Herstellerprotokollen
synthetisiert. Die β-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite
wurden von der Firma Perseptive Biosystems bereitgestellt. Für die Phosphodiesteroligonukleotide
wurde der Schritt der Phosphitoxidation mit einer Iodlösung durchgeführt. Was
die Phosphorothioatoligonukleotide betrifft, wurde der Schritt der
Phosphitoxidation unter Verwendung einer Lösung von 0,05 M 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid
in wasserfreiem Acetonitril durchgeführt. Nach Abspalten von der
Säule (Controlled
Pore Glass, Perseptive Biosystems) und vollständiger Schutzgruppenentfernung
von der Sequenz durch eine 18-stündige
Behandlung bei 55°C
mit einer 33%-igen Ammoniaklösung
wurden die Oligonukleotide durch Ethanolfällung in Anwesenheit von Natriumacetat
gereinigt. Anschließend
wurden Kontrollen durch Ho chdruckflüssigkeitschromatographie, durch
Ionenaustauschchromatographie mit Elution durch einen Natriumchlorid-Gradienten
und durch C18-Umkehrphasenchromatographie
mit Elution durch einen Acetonitril-Gradienten in Anwesenheit von
Triethylammoniumacetat durchgeführt.
-
Die
synthetisierten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 beschrieben. Es
handelt sich um die ersten 11 Sequenzen dieser Tabelle mit den Nummern
SEQ ID N° 1
bis SEQ ID N° 11.
Ihre depigmentierende Wirkung war Gegenstand von Untersuchungen,
die in den folgenden Beispielen dargestellt sind.
-
Die
in Tabelle 1 unter jedem Sequenzende angegebenen Nummern geben die
Position des Oligonukleotids in den Ausgangssequenzen an.
-
Die
Sequenzen stammen von der sogenannten „HUMTYRA"-Sequenz der cDNA der menschlichen Tyrosinase,
die von Shibahara et al., Tohoku J. Exp. Med. 156: 403 (1988) (Genbank-Zugriffsnummer
M 27160) veröffentlicht
wurde, von der sogenannten „HSTYRRP"-Sequenz der cDNA
des menschlichen TRP-1, die von Cohen et al., Nucl. Acides Res.
18: 2807 (1990) (Genbank-Zugriffsnummer
X 51420) veröffentlicht
wurde, und von einer anderen Sequenz des TRP-1, genannt „AF001295", die von Box et
al., Mamm. Genome 9: 50 (1998) (Genbank-Zugriffsnummer AF 001295)
veröffentlicht
wurde, ab.
-
Darüber hinaus
wurden zum Vergleich, um die Spezifität der erfindungsgemäßen Oligonukleotide
gegenüber
den Genen oder den Produkten der Gene, die für Tyrosinase und TRP-1 kodieren,
zu bestätigen,
zwei Oligonukleotide synthetisiert, die auf der Sequenz SEQ ID N° 2 der Erfindung
basieren, nämlich:
- – eine
in Tabelle mit SEQ ID N° 12
bezeichnete Sequenz, als „Sense-Kontrolle", die darin besteht,
die Abfolge der Basen der Sequenz SED ID N° 2 umzukehren,
- – eine
in Tabelle mit SEQ ID N° 13
bezeichnete Sequenz, als „Srambled-Kontrolle" bezeichnet, welche
hinsichtlich der Art und Anzahl die gleichen Basen enthält wie die
der SED ID N° 2,
aber in willkürlicher
Abfolge.
-
-
Beispiel 2: Depigmentierende
Wirkung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide
auf normale humane Melanozyten (NHM)
-
Die
in der Tabelle 1 des Beispiels 1 dargestellten erfindungsgemäßen Oligonukleotide
(SEQ ID N° 1 bis
SEQ ID N° 11)
werden hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Melanogenese untersucht
und somit hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
die Produktion von Melaninpigmenten durch die Melanozyten zu modifizieren.
Als Vergleichselemente werden außerdem die Oligonukleotide „Sense-Kontrolle" (SEQ ID N° 12) und „Scrambled-Kontrolle" (SEQ ID N° 13) hinsichtlich
dieser Wirkung untersucht.
-
Es
sei daran erinnert, dass die Tyrosinase und das TRP-1 im Verlauf
des Reaktionsmechanismus der Melanogenese einen Enzymkomplex bilden,
der die Umwandlung von L-Dopa in Dopachinon und dann in Dopachrom
katalysiert. Diese beiden Enzyme wirken zusammen und es scheint,
als würden
sie nie getrennt voneinander wirken. Ist eine Zelle durch die Verwendung
von Antisense-Oligonukleotiden,
die gegen TRP-1 gerichtet sind, TRP-1 depletiert, so wird eine Aktivitätsabnahme
der Tyrosinase, auch als „Dopaoxidase" bezeichnet, beobachtet.
Die Tyrosinase wird aufgrund ihrer multifunktionellen Natur auch
als „Dopaoxidase" bezeichnet; sie
erfüllt
die gleiche Funktion wie die Dopaoxidase im Verlauf der Oxidation
von Tyrosinase in Dopa.
-
Das
Prinzip des vorliegenden Tests beruht auf der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit
der Dopaoxidase bei der Umwandlung von L-Dopa, das als Substrat
verwendet wird, in Dopachrom. Das Auftreten von Dopachrom wird durch
die Messung der optischen Dichte in definierten Zeitabständen quantitativ
bestimmt, was es ermöglicht,
für jedes
der getesteten Oligonukleotide und für den Kontrolltest die Reaktionsgeschwindigkeit
der Dopaoxidase zu berechnen. Ausgehend von den erhaltenen Ergebnissen
ist es dann möglich,
die Wirkung der getesteten Oligonukleotide auf die Melanogenese
zu bewerten. Ein Rückgang
der Reaktionsgeschwindigkeit im Vergleich zum Kontrolltest entspricht
einer Abnahme der Enzymaktivität
und folglich der Reduzierung der Bildung von Melaninpigmenten und
demgemäß einer
depigmentierenden Wirkung.
-
Herstellung von Melanozytenkulturen
und Behandlungen mit den Oligonukleotiden
-
Die
Melanozyten werden aus der Vorhaut eines weißen Kindes gewonnen. Die Hautfragmente
werden mit PBS (Gibco, Paisley, GB) und anschließend mit 70%-igem Ethanol gewaschen.
Nach einem letzten Waschschritt mit PBS wird die Haut in feine Streifchen
von 1 mm zerschnitten, die ein Minimum an Lederhaut enthalten. Die
Lederhaut und die Epidermis werden durch Inkubation der Streifchen
bei 4°C über Nacht
in einer 0,25%-igen Trypsinlösung
(Gibco, Paisley, GB) dissoziiert. Nach Inkubation werden die Epidermiszellen
durch Abschaben der Zellen mit dem Skalpell gesammelt. Die Wirkung
des Trypsins wird gestoppt, indem die Zellen in ein E-199-Medium
(Gibco, Paisley, GB) gebracht werden, welches 10% (Vol./Vol.) fötales Kälberserum
(Gibco, Paisley, GB) enthält.
Nach Homogenisierung und Eliminierung der auf der Oberfläche schwimmenden
Korneozyten wird die Zellsuspension filtriert, zentrifugiert, und
das Pellet wird in einem Adhäsionsmedium
(Medium 1) aufgenommen, dessen Zusammensetzung in der nachfolgenden
Tabelle angegeben ist, in der EGF für einen epidermalen Wachstumsfaktor
steht.
-
-
Nach
Zählung
der Zellpopulation werden die Zellen in Kulturflaschen zu 200000/cm2 ausgesät.
Die Kulturen werden bei 37°C
in feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre
mit 5% CO2 gehalten. Nach Adhäsion der Zellen
wird das Adhäsionsmedium
durch KSFM-Medium (Gibco, Paisley, GB) ersetzt, das alle 48 h erneuert wird.
-
Die
Epidermiszellen, die auf diese Weise in Kultur gebracht werden,
ermöglichen
den Erhalt einer Keratinozyten-Melanozyten-Cokultur. Sobald diese Cokultur
ungefähr
70% Konfluenz erreicht hat, wird das KSFM-Medium durch ein Selektivmedium
(Medium 2) ersetzt, welches das Wachstum der Melanozyten begünstigt,
und dessen Zusammensetzung in der nachfolgenden Tabelle angegeben
ist, in welcher IBMX für
3-Isobutyl-1-methylxanthin und PMA für Phorbol-12-myristat-13-acetat
steht.
-
-
48
bis 72 h später
werden die Zellen bei Umgebungstemperatur 1 bis 2 Minuten mit einer
Mischung 0,1% Trypsin–0,05%
EDTA (Gibco, Paisley, GB) von der Kulturflasche abgelöst. Die
erhaltene Zellsuspension wird zentrifugiert und erneut in Selektivmedium
gebracht. Die Zellen werden 24 bis 48 h später erneut bei Umgebungstemperatur
1 bis 2 Minuten mit der Trypsin-EDTA-Mischung (0,1%–0,05%)
behandelt und dann erneut in einem Proliferationsmedium (Medium
3) ausgesät,
das spezifisch für
Melanozyten ist.
-
Das
Medium 3 besteht zu 10% aus Medium 2 und zu 90% aus Medium A. Das
Medium A ist Keratinozyten-SFM-Medium (Gibco, 17005-034).
-
In
diesem Stadium ist die erhaltene Zellpopulation rein und besteht
ausschließlich
aus normalen humanen Melanozyten (NHM).
-
Vor
der Studie werden die NHM eine Woche lang in ein Medium gegeben,
das keinerlei starken Stoffwechselaktivator, wie Phorbolester oder
IBMX, enthält
(Medium 4).
-
Das
Medium 4 besteht zu 10% aus Medium B und zu 90% aus dem vorstehen
beschriebenen Medium A. Die Zusammensetzung des Mediums B ist in
der nachfolgenden Tabelle beschrieben.
-
-
Die
NHM werden in 96-Loch-Mikrotiterplatten (Falcon, Franklin Lakes,
NJ, USA) mit jeweils 10000 Zellen in 200 μl Medium 4 pro Loch ausgesät.
-
Die
zu testenden Oligonukleotide werden in dem Testmedium in Konzentrationen
von 10 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM beziehungsweise 1 μM frisch
hergestellt. Die Behandlungen mit den verschiedenen Oligonukleotiden
werden 7 Tage lang täglich
durchgeführt.
Für jede
Konzentration werden 3 Tests durchgeführt.
-
Messung der Reaktionsgeschwindigkeit
der Dopaoxidase-Aktivität
-
Am
Ende dieser Behandlungen über
7 Tage werden Messungen der Tyrosinase- oder „Dopaoxidase"-Aktivität durchgeführt.
-
Die
Zellen werden mit PBS gewaschen, woraufhin 50 μl eines 0,5%-igen Lysepuffers
(Triton 100X Sigma, T-9284) in PBS (Gibco, 14190-094) in die Löcher gegeben
werden und die Platte 1 Stunde bei 4°C geschüttelt wird. Die Reaktion wird
durch Zugabe von 50 μl
Substrat (10 nm L-DOPA, Sigma) pro Loch ausgelöst. Das Auftreten von Dopachrom
wird 1 Stunde lang und bei 37°C
unter regelmäßigem Schütteln alle
2 Minuten mittels eines Photometers, eines Mikrotiterplattenphotometers
340 ATTC (SLT-Labinstrument, Grödig/Salzburg, Österreich)
bei 450 nm gemessen. Die Reaktionsgeschwindigkeiten werden gemessen
und in 10–4 DO-Einheiten/min
angegeben.
-
Die
Ergebnisse, die für
die mit den Oligonukleotiden behandelten Kulturen und für die (nicht
behandelten) Kontrollkulturen erhalten wurden, sind in Tabelle 2
dargestellt (σ:
Standardabweichung).
-
-
-
-
Aus
den Ergebnissen in Tabelle 2 geht deutlich hervor, dass die Behandlung
der Melanozytenkulturen mit den Oligonukleotiden der Erfindung (SEQ
ID N° 1
bis SEQ ID N° 11)
zu einer Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit der Dopaoxidase-Aktivität führt. Diese
Abnahme ist besonders deutlich bei den Oligonukleotide SEQ ID N° 1 bis SEQ
ID N° 6.
-
Hingegen
ist bei den Oligonukleotide, die zum Vergleich gegenüber dem
Oligonukleotid SEQ ID N° 2 getestet
wurden, nämlich
der „Sense-Kontrolle" SEQ ID N° 12 und der „Scrambled
Kontrolle" SEQ ID
N° 13, bei
allen getesteten Konzentrationen eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit
der Dopaoxidase-Aktivität festzustellen.
Zum Beispiel erhöht
sich bei der Konzentration 100 nM die Reaktionsgeschwindigkeit der „Sense-Kontrolle" und der „Scrambled-Kontrolle" um 2,2% beziehungsweise
um 11,7%, während
sie im Fall des erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotids
SEQ ID N° 2
um 28,8% abnimmt.
-
Aus
dieser letzten Beobachtung kann geschlossen werden, dass die Aktivität der Oligonukleotide
der Erfindung, welche die Reaktionsgeschwindigkeit der Dopaoxidase-Aktivität verringern,
zwangsläufig
auf die spezifische Hybridisierung des Oligonukleotids mit der für Tyrosinase
kodierenden oder der für
TRP-1 kodierenden Ziel-Boten-RNA zurückzuführen ist.
-
Deshalb
verhindert diese Oligonukleotid-mRNA-Wechselwirkung die Übersetzung
der von der Ziel-Boten-RNA getragenen Information und bewirkt somit
eine Abnahme der intrazellulären
Tyrosinase- oder TRP-1-Expression, je nach dem, welche Antisense-Sequenz
verwendet wird. Mit anderen Worten verringert diese Wechselwirkung
die Neusynthese der Tyrosinase oder des TRP-1. Aufgrund der natürlichen
Erneuerung dieser Enzyme bewirkt dies eine Abnahme der Tyrosinase-
und TRP-1-Menge in den Zellen und folglich eine Abnahme der Aktivität dieser
Enzyme bezüglich
der Melaninsynthese. Somit wirken die Oligonukleotide der Erfindung,
indem sie die Erneuerung der Tyrosinase und des TRP-1 reduzieren,
statt auf die bereits in den Melanozyten vorhandene Tyrosinase einzuwirken.
-
Die
Folge dieser Wirkung auf Ebene der Melanozyten ist die Abnahme der
Fähigkeit
dieser Zellen zur Melaninsynthese, was, je nach Fall und betroffener
Person, die Produktion einer bleichenden oder depigmentierenden
Wirkung erklärt.
-
Beispiel 3: Depigmentierende
Wirkung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids
auf normale humane Melanozyten eines erwachsenen Spenders mit afrikanisch-europäischer Abstammung
-
Die
Melanozyten, die hier verwendet werden, werden von der Schenkelhaut
eines erwachsenen Spenders mit afrikanisch-europäischer Abstammung gewonnen.
Die Hautfragmente werden mit PBS (Gibco, Paisley, GB) gespült und dann
mit 70%-igem Ethanol (Vol./Vol.), das in PBS auf 50% verdünnt ist,
gewaschen. Nach dem Waschen mit PBS werden die Hautfragmente mit
Hilfe eines Hühneraugenmessers
geschabt. Die erhaltenen Fragmente werden eine Stunde bei 37°C in 0,05%-igem
Trypsin (Difco Laboratories, West Molesy, GB) gekratzt, um ihre
Dissoziation zu ermöglichen.
Die Epidermis wird dann in E-199-Medium
(Gibco, Paisley, GB) aufgenommen, welches 10% fötales Kälberserum (FKS, Gibco, Paisley,
GB) enthält.
Nach Homogenisierung und Eliminierung der auf der Oberfläche schwimmenden
Hornhautfragmente wird die Zellsuspension filtriert und zentrifugiert.
Das erhaltene Zellpellet wird in dem in Beispiel 2 beschriebenen
Medium 1 aufgenommen. Die Zellen werden gezählt und eine Messung der Zellvitalität wird mittels
Trypanblau-Ausschluß in
einer Thoma-Zählkammer
durchgeführt.
Die Epidermiszellen werden schließlich in Kulturflaschen in
Medium 1 zu 80000 Zellen/cm2 ausgesät. Die Kulturen
werden bei 37°C
in feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre
mit 5% CO2 gehalten.
-
Das
Medium 1 wird durch ein Medium 6 ersetzt, dessen Zusammensetzung
in der nachfolgenden Tabelle dargestellt ist, in welcher B-FGF für einen
basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor und PdBu für Phorbol-12,13-dibutyrat
steht.
-
-
Dieses
Medium wird ein bis zwei Wochen lang alle 48 Stunden erneuert.
-
Nach
dieser Melanozytenselektion begünstigt
man die Proliferation der NHM, indem man das Medium 6 durch das
Medium 7 ersetzt.
-
Das
Medium 7 besteht zu 10% aus Medium C und zu 90% aus dem vorstehend
beschriebenen Medium A, komplementiert mit PdBu (Sigma, P-1269),
dessen Endkonzentration in dem Medium 0,25 μg/ml beträgt.
-
-
In
diesem Stadium ist die erhaltene Zellpopulation rein. Sie besteht
ausschließlich
aus NHM.
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Die
NHM werden in 96-Loch-Mikrotiterplatten (Falcon, Franklin Lakes,
NJ, USA) in Medium 6 ausgesät.
Nach 24 h wird das Medium durch Medium 8 ersetzt, das während der
restlichen Dauer dieser Studie verwendet wird. Die Zusammensetzung
des Mediums 8 ist nachstehend beschrieben.
-
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Das
Oligonukleotid SEQ ID N° 2
wird dem Testmedium in Konzentrationen von 50 nM, 100 nM, 250 nM,
500 nM, 1 μM
frisch zugesetzt. Die Behandlungen werden 7 Tage lang täglich durchgeführt. Bei
jeder Konzentration werden 6 Tests durchgeführt.
-
Messung der Reaktionsgeschwindigkeiten
der Dopaoxidase-Aktivität
-
Am
Ende dieser Behandlungen über
7 Tage werden Messungen der Dopaoxidase-Aktivität durchgeführt. Diese Messungen werden
auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 vorgenommen. Die Reaktionsgeschwindigkeiten
werden gemessen und in 10–4 OD-Einheiten/min angegeben.
-
Die
Ergebnisse, die für
die mit dem Oligonukleotid SEQ ID N° 2 behandelten Kulturen und
für die
nicht behandelten Kontrollkulturen erhalten wurden, sind in Tabelle
3 dargestellt (σ:
Standardabweichung).
-
-
Den
vorstehenden Ergebnissen ist zu entnehmen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit
der Dopaoxidase ab einer recht geringen Oligonukleotidkonzentration
(100 nM) und über
dieser Konzentration sehr merklich abnimmt.
-
Demgemäß reduzieren
die erfindungsgemäßen Oligonukleotide,
wie dies bereits in der Schlussfolgerung des Beispiels 2 erklärt wurde,
die Fähigkeit
der Melanozyten zur Melaninsynthese. In dem vorliegenden Test wird
gezeigt, dass diese Abnahme unabhängig von den genetischen Eigenschaften
der betroffenen Person ist.
-
Dadurch,
dass es sich um einen Spender mit afrikanisch-europäischer Abstammung
handelt, der eine Grundpigmentierung aufweist, die einer dunklen
Hautfarbe entspricht, führt
die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids in dem
vorliegenden Beispiel zu einer bleichenden Wirkung, das heißt zu einer
Aufhellung des Teints.
-
Beispiel 4: Untersuchung
der Hemmung der UV-induzierten Melanogenese an normalen humanen
Melanozyten durch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid
-
Im
Anschluss an die Ergebnisse der vorangehenden Beispiele ist es Ziel
des vorliegenden Tests, zu prüfen,
ob die Oligonukleotide der Erfindung auch in dem Fall aktiv sind,
in dem die Melanozyten durch eine Stimulation, in diesem Fall durch
eine ultraviolette UVB-Bestrahlung (280–320 nm), aktiviert werden.
Mit anderen Worten geht es darum, die Fähigkeit der Oligonukleotide
zu bewerten, die Dopaoxidase-Aktivität von Melanozyten unabhängig von
der Stimulation der Melanogenese zu reduzieren.
-
Hierfür wird der
Test an Melanozyten eines erwachsenen weißen Spenders durchgeführt. Die
hier verwendeten Melanozyten werden aus Haut gewonnen, die Brustplastiken
entstammt. Die Technik zur Gewinnung dieser Melanozyten ist die
gleiche wie diejenige, die in Beispiel 3 verwendet und beschrieben
wurde.
-
Der
Versuch wird in 35-mm-Schalen durchgeführt. Die Melanozyten werden
in 35-mm-Schalen (Falcon, Franklin Lakes, NY, USA) mit jeweils 250000
Zellen und 2 ml Medium 8 pro Schale ausgesät. Die Zusammensetzung des
Mediums 8 ist in Beispiel 3 beschrieben. Die Behandlungen mit dem
Oligonukleotid SEQ ID N° 2
sowie die UVB-Bestrahlungen (Bio-Energie, Vilbert-Lourmat, Marne-la-Vallée, Frankreich)
mit 8 mJ/cm2 beginnen 24 h nach dem Aussäen.
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Vor
jeder UVB-Bestrahlung werden die NHM in PBS (2 ml/Schale) gebracht.
Nach der Bestrahlung werden die Zellen wieder in 2 ml Medium 8 gebracht,
welches das Oligonukleotid SEQ ID N° 2 enthält oder nicht.
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Das
Oligonukleotid SEQ ID N° 2
wird dem Testmedium (Medium 7 aus Beispiel 3) in Konzentrationen von
100 nM, 250 nM und 500 nM frisch zugesetzt.
-
Diese
Behandlungen mit dem Oligonukleotid werden 9 Tage lang täglich durchgeführt. Die
Bestrahlungen erfolgen täglich,
außer
an den Tagen 5 und 6. Bei jeder Konzentration werden 3 Tests durchgeführt.
-
Messung der Reaktionsgeschwindigkeiten
der Dopaoxidase-Aktivität
-
Am
Ende dieser Behandlungen, nämlich
der 9 Tage Behandlung mit dem Oligonukleotid und der 7 Bestrahlungen,
werden Messungen der Dopaoxidase-Aktivität durchgeführt.
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Hierfür werden
die NHM mit Hilfe von 500 μl
0,1%-igem Trypsin/0,05%-igem
EDTA von den 35-mm-Schalen gelöst
und dann in 1,5 ml E-199-Medium ohne Phenolrot (Gibco) aufgenommen
und mit 10% fötalem
Kälberserum
supplementiert. Eine Allquote dieser Zellsuspension wird für eine Zellzählung verwendet, eine
andere wird zentrifugiert und das erhaltene Melanozytenpellet wird
zur Messung der Reaktionsgeschwindigkeit der Dopaoxidase wie in
Beispiel 2 beschrieben in 50 μl
Lysepuffer aufgenommen.
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Die
Reaktionsgeschwindigkeiten der Dopaoxidaseaktivität werden
berechnet und in 10–4 OD-Einheiten/min/106 NHM angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle 4 aufgeführt
(σ: Standardabweichung).
-
-
-
Die
vorstehenden Ergebnisse zeigen deutlich, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide
die Reaktionsgeschwindigkeit der Dopaoxidaseaktivität im Fall
von Melanozyten, die durch die Wirkung einer UVB-Strahlung stimuliert
werden, sehr merklich verringern.
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Somit
verringern die Oligonukleotide der Erfindung nicht nur die Fähigkeit
der Melanozyten im Zustand ihrer Grundaktivität, Melanin zu synthetisieren,
wie dies in den vorstehenden Beispielen gezeigt wurde, sondern sie
verringern auch diese Fähigkeit
bei Melanozyten im aktivierten Zustand. Diese Oligonukleotide können demnach
auch verwendet werden, um insbesondere einer Pigmentierung, die
durch die im Sonnenlicht vorhandene ultraviolette Strahlung hervorgerufen
wird, vorzubeugen oder diese zu vermindern. Beispiel
5: Puder zum Aufhellen des Gesichtsteints
| Microcellulose | 20,00% |
| Natriumlaurylsulfoacetat | 15,00% |
| Oligonukleotid
(SEQ ID N° 5)
(Phosphodiester) | 1,00% |
| Parfüm, Farbstoffe,
Konservierungsmittel | qs |
| Talkum | qsp
100% |
-
Dieser
Puder weist eine zweifache Wirkung auf. Er ermöglicht eine Reinigung der Haut
und ermöglicht zudem
durch eine regelmäßige Anwendung über einige
Tage hinweg eine Aufhellung des Teints. Er kann ein- bis zweimal
täglich
auf die Gesichtshaut aufgetragen werden. Beispiel
6: depigmentierendes Tages-Emulsionsgel für das Gesicht
| Capryl/Caprin/Succinyl-Triglyceride | 5,00% |
| Octylmethoxycinnamat | 1,00% |
| Dimethiconcopolyol | 0,50% |
| Acrylat/C10-30-Alkylacrylat-Copolymer | 0,50% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 3
(Phosphodiester) | 0,01% |
| Neutralisationsmittel | qs |
| Konservierungsmittel,
Parfüm,
Farbstoffe | qs |
| Wasser | qsp
100% |
-
Bestimmte
Personen, die der mehr oder weniger intensiver Strahlung des Tageslichts
oder direkt der Sonne ausgesetzt sind, wollen einen hellen Teint
bewahren und das Auftreten von Pigmentflecken verhindern. Die Verwendung
des vorstehenden Emulsionsgels ermöglicht es, dies zu erreichen.
Diese Zusammensetzung wird im Allgemeinen morgens auf das Gesicht
aufgetragen.
-
Sie
wirkt sowohl vorbeugend als auch heilend auf die regelmäßige oder
unregelmäßige Pigmentierung des
Gesichts. Beispiel
7: Schützendes,
Pigmentflecken vorbeugendes Fluid SPF 30
| Flüchtiges
Pentacyclomethicon | 49,00% |
| Titandioxid | 15,00% |
| Octylmethoxycinnamat | 7,50% |
| Glycerin | 5,00% |
| Phenyltrimethicon | 5,00% |
| Dimethiconcopolyol | 3,00% |
| Polymethylmethacrylat | 2,50% |
| Butylmethoxydibenzoylmethan | 1,00% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 2
(Phosphodiester) | 0,1% |
| Neutralisationsmittel,
Parfüm,
Konservierungsmittel, Antioxidantien | qs |
| Wasser | qsp
100% |
-
Diese
Zusammensetzung ist zu verwenden, um bei prädisponierten Personen das Auftreten
von Pigmentflecken bei der Einwirkung intensiver Sonnenstrahlung
zu verhindern. Es sei bemerkt, dass es das Vorliegen einer erhöhten Konzentration
an Sonnenfilter ermöglicht,
die Verringerung des natürlichen
Schutzes, Folge der Abnahme des Melaningehalts, auszugleichen. Beispiel
8: depigmentierende Gesichtscreme
| Glycerylstearat
+ PEG 100-Stearat | 5,00% |
| Wasserstoffhaltiges
Polyisobuten | 4,00% |
| Magnesiumascorbylphosphat | 3,30% |
| Glycerintricaprylat/caprat | 3,00% |
| Squalan | 3,00% |
| Glycerin | 2,00% |
| Bienenwachs | 1,50% |
| Cetearyloctanoat | 1,50% |
| Cetylalkohol | 1,00% |
| Stearylalkohol | 1,00% |
| Dimethicon | 1,00% |
| Xanthangummi | 0,30% |
| Ethylendiamintetraessigsäure | 0,20% |
| Zitronensäure | 0,10% |
| Natriumcitrat | 0,10% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 6
(Phosphodiester) | 0,10% |
| Neutralisationsmittel,
Parfüm,
Konservierungsmittel | qs |
| Wasser | qsp
100% |
-
Die
Verwendung dieser Creme ermöglicht
es, die Unregelmäßigkeiten
der Hautpigmentierung zu behandeln, indem sie Altersflecken oder
aktinische Pigmentflecken abschwächt
oder beseitigt. Sie homogenisiert die Färbung der Haut und hellt den
Teint auf. Beispiel
9: Gesichtslotion zur Aufhellung des Teints
| Ethylalkohol | 30,00% |
| PPG
3-Myristylether | 5,00% |
| Glycerin | 2,00 |
| Carbomer | 0,20% |
| Polysorbat
20 | 0,20% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 4
(Phosphorothioat) | 0,01% |
| Neutralisationsmittel,
Parfüm,
Konservierungsmittel | qs |
| Wasser | qsp
100% |
-
Diese
Lotion zur Aufhellung des Teints wird nach dem Abschminken und Reinigen
der Haut verwendet. Beispiel
10: aufhellendes Gesichtsserum
| Wasser | qsp
100% |
| Glycerin | 2% |
| Tetranatrium-EDTA | qsp
pH 6 |
| Zitronensäure | qsp
pH 6 |
| Trinatriumcitrat | qsp
pH 6 |
| Xanthangummi | 0,25% |
| Polyacrylamid,
C13,14-Isoparaffin, Laureth-7 | 0,5% |
| Dimethiconcopolyol | 0,25% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 2
(Phosphodiester) | 0,1% |
| Parfüm, Farbstoff,
Konservierungsmittel | qs |
-
Ein
Tropfen dieser sehr konzentrierten Serumzusammensetzung wird im
Allgemeinen vor Auftragen einer Gesichtscreme auf das Gesicht aufgetragen. Dieses
Serum wird gewöhnlich
als ein- bis zweiwöchige
Kur verwendet, um eine Aufhellung des Teints zu erhalten oder zu
pflegen. Beispiel
11: Haarlotion zur Aufhellung der Haare
| Wasser | qsp
100% |
| Alkohol | 50% |
| Panthenylethylether | 0,5% |
| DL-α-Tocopherolacetat | 0,2% |
| Polysorbat
60 | 1% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 1
(Phosphorothioat) | 0,01% |
| Parfüm | 0,2% |
| Glycerin | 0,5% |
| Farbstoff | qs |
-
Diese
Lotion wird während
der zum Erreichen einer schrittweisen Aufhellung der Haare notwendigen Dauer
morgens und abends auf das Haar aufgetragen. Diese Dauer beträgt im Allgemeinen
mehrere Wochen. Beispiel
12: Handcreme (Cremegel gegen Flecken) für die Hände
| Capryl/Caprin-Diglycerylsuccinat | 6% |
| Octyloctanoat | 2,5% |
| Octylmethoxycinnamat | 6% |
| Oligonukleotid
SEQ ID N° 5
(Phosphodiester) | 0,001% |
| Phenyltrimethicon | 2,5% |
| Benzophenon-3 | 0,5% |
| Natriumhyaluronat | 0,05% |
| Xanthangummi | 0,2% |
| Acrylat/C10-30-Alkylacrylat-Copolymer | 0,5% |
| PEG
150 | 3% |
| Neutralisationsmittel,
Farbstoffe, Parfüm,
Konservierungsmittel | qs |
| reines
Wasser | qsp
100% |
-
Diese
Creme muss direkt auf die Altersflecken (Lentigo senilis) auf den
Händen
aufgetragen werden, um deren Färbung
aufzuhellen.
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-
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