CN101820921B - 一种抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA及组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA，其中，该siRNA具有TYRO-1、TYRO-2、TYRO-3、TYRO-4、TYRO-5、TYRO-6、TYRO-7或TYRO-8所示的核苷酸序列，或者具有对TYRO-1、TYRO-2、TYRO-3、TYRO-4、TYRO-5、TYRO-6、TYRO-7或TYRO-8所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列。本发明还提供了一种化妆品组合物及一种siRNA在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。本发明提供的siRNA对酪氨酸酶基因表达的抑制活性高，能够有效地抑制黑色素的生成和沉积。

Description

一种抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA及组合物和应用
技术领域
本发明是关于一种用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA及含有该siRNA的化妆品组合物和该siRNA在制备用于抑制或祛除黑色素生成和沉积的化妆品组合物中的应用。
背景技术
(1)关于黑色素
黑色素(melanin)是由黑素细胞合成的一种生物多聚体，由皮肤、毛囊、虹膜和视网膜的黑色素细胞产生。当受到紫外线等因素刺激时，黑素细胞能够大量的合成黑色素生物合成所必需的酪氨酸酶，在酪氨酸酶的催化下酪氨酸转化成多巴醌，多巴醌进一步氧化形成多巴色素，最后形成黑色素。
黑色素可分为两类，一是真黑色素，不含硫原子，呈棕色或黑色；二是脱黑色素，含硫原子，呈黄色或微红棕色。动物与人的皮肤和毛发颜色与黑素体的数目，大小，和分布等都有直接的关系。过量的黑色素会使皮肤变黑，而非均匀分布的黑色素会导致黄褐斑和祛斑的产生。
黑色素是由多个基因相互协调并经过一系列复杂的生理生化过程合成，这些与色素沉着相关的基因参与黑色素的合成、运输和分布。其中，酪氨酸酶基因就是黑色素生物合成的过程中的一个极为重要的基因，因此，通过RNA干扰而专一性地抑制酪氨酸酶基因的表达，从而沉默酪氨酸酶基因的活性，是抑制黑色素合成、改善皮肤颜色的有效途径。
(2)关于RNA干扰技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应基因的表达或使该基因沉默的过程。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，称为小分子干扰RNA(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的相应位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。
由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统的基因治疗方法如反义核酸技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争，整个流程的设计更简便，且作用迅速，效果明显。RNA干扰的这种特点为基因治疗开辟了新的，有力的工具。
例如，US2005/0137151A1公开了一种用于治疗色素沉着的组合物，该组合物含有一种或多种用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA，所述siRNA为具有下列核苷酸序列的siRNA中的一种或几种：
C1)5’-UAGGACCUGCCAGUGCUCUdTdT-3’
3’-dTdTAUCCUGGACGGUCACGAGA-5’；
C2)5’-UCCUGGAAACCAUGACAAAdTdT-3’
3’-dTdTAGGACCUUUGGUACUGUUU-5’；
C3)5’-CACACCUGUCUUUGUCUUAdTdT-3’
3’-dTdTGUGUGGACAGAAACAGAAU-5’。
但是，该siRNA存在的问题是，对酪氨酸酶基因表达的抑制活性较低。
因此，开发一种对酪氨酸酶基因表达的抑制活性较高的siRNA成为目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是克服现有的siRNA对酪氨酸酶基因表达的抑制活性较低的缺点，提供一种对酪氨酸酶基因表达的抑制活性较高的siRNA。
本发明的第二个目的是提供一种用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物。
本发明的第三个目的是提供一种siRNA在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。
本发明提供的用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA具有TYRO-1、TYRO-2、TYRO-3、TYRO-4、TYRO-5、TYRO-6、TYRO-7或TYRO-8所示的核苷酸序列，或者具有对TYRO-1、TYRO-2、TYRO-3、TYRO-4、TYRO-5、TYRO-6、TYRO-7或TYRO-8所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，
TYRO-1正义链：5’-GCAACUUCAUGGGAUUCAAdTdT-3’
反义链：5’-UUGAAUCCCAUGAAGUUGCdTdT-3’；
TYRO-2正义链：5’-GCACAGAGAGACGACUCUUdTdT-3’
反义链：5’-AAGAGUCGUCUCUCUGUGCdTdT-3’；
TYRO-3正义链：5’-GGAGGAGUACAACAGCCAUdTdT-3’
反义链：5’-AUGGCUGUUGUACUCCUCCdTdT-3’；
TYRO-4正义链：5’-GCCAUCAGUCUUUAUGCAAdTdT-3’
反义链：5’-UUGCAUAAAGACUGAUGGCdTdT-3’；
TYRO-5正义链：5’-CCAUCAGUCUUUAUGCAAUdTdT-3’
反义链：5’-AUUGCAUAAAGACUGAUGGdTdT-3’；
TYRO-6正义链：5’-GCGUAAUCCUGGAAACCAUdTdT-3’
反义链：5’-AUGGUUUCCAGGAUUACGCdTdT-3’；
TYRO-7正义链：5’-CCAGGUUCCCAGAGAAUAUdTdT-3’
反义链：5’-AUAUUCUCUGGGAACCUGGdTdT-3’；
TYRO-8正义链：5’-GGUAAUGAGGAACUGUUAUdTdT-3’
反义链：5’-AUAACAGUUCCUCAUUACCdTdT-3’。
本发明提供了一种化妆品组合物，该组合物含有本发明提供的siRNA作为活性成分。
本发明提供了一种siRNA在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的的化妆品组合物中的应用。
本发明提供了一种能够抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA，该siRNA对酪氨酸酶基因表达的抑制活性高，能够有效地抑制黑色素生成和沉积。例如，本发明提供的siRNA TYRO-1至TYRO-8能够高效地抑制酪氨酸酶基因的表达，特别是siRNA TYRO-1、TYRO-4和TYRO-5对酪氨酸酶基因的抑制活性分别达到81％、82％和87％，而参比siRNA C1-C3对酪氨酸酶基因的抑制活性分别为65％、58％和52％，说明与现有的用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA相比，本发明提供的siRNA用于抑制酪氨酸酶基因的表达时，对酪氨酸酶基因表达的抑制活性得到了大幅度的提高。
具体实施方式
本发明提供了一种用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA，其中，该siRNA具有TYRO-1、TYRO-2、TYRO-3、TYRO-4、TYRO-5、TYRO-6、TYRO-7或TYRO-8所示的核苷酸序列，或者具有对TYRO-1、TYRO-2、TYRO-3、TYRO-4、TYRO-5、TYRO-6、TYRO-7或TYRO-8所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，
TYRO-1正义链：5’-GCAACUUCAUGGGAUUCAAdTdT-3’
反义链：5’-UUGAAUCCCAUGAAGUUGCdTdT-3’；
TYRO-2正义链：5’-GCACAGAGAGACGACUCUUdTdT-3’
反义链：5’-AAGAGUCGUCUCUCUGUGCdTdT-3’；
TYRO-3正义链：5’-GGAGGAGUACAACAGCCAUdTdT-3’
反义链：5’-AUGGCUGUUGUACUCCUCCdTdT-3’；
TYRO-4正义链：5’-GCCAUCAGUCUUUAUGCAAdTdT-3’
反义链：5’-UUGCAUAAAGACUGAUGGCdTdT-3’；
TYRO-5正义链：5’-CCAUCAGUCUUUAUGCAAUdTdT-3’
反义链：5’-AUUGCAUAAAGACUGAUGGdTdT-3’；
TYRO-6正义链：5’-GCGUAAUCCUGGAAACCAUdTdT-3’
反义链：5’-AUGGUUUCCAGGAUUACGCdTdT-3’；
TYRO-7正义链：5’-CCAGGUUCCCAGAGAAUAUdTdT-3’
反义链：5’-AUAUUCUCUGGGAACCUGGdTdT-3’；
TYRO-8正义链：5’-GGUAAUGAGGAACUGUUAUdTdT-3’
反义链：5’-AUAACAGUUCCUCAUUACCdTdT-3’。
为了得到更好的抑制效果，优选情况下，所述siRNA具有TYRO-1、TYRO-4或TYRO-5所示的核苷酸序列；更优选的情况下，所述siRNA具有TYRO-5所示的核苷酸序列。
所述酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物中，在黑色素的合成过程中，有两个步骤均需要酪氨酸酶的催化，因此，酪氨酸酶在黑色素产生的过程中起到举足轻重的作用。
所述酪氨酸酶基因是指编码酪氨酸酶的核苷酸序列。人体酪氨酸酶基因长约35kb-70kb，位于第11号染色体，含有5个外显子和4个内含子，5个外显子的长度分别为919bp、135bp、150bp、183bp和219bp。
所述siRNA为双链RNA分子，包括正义链和反义链，且正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，所述正义链和反义链各自的3’端均为两个连续的脱氧胸苷酸，正义链和反义链除去3’端的两个连续的脱氧胸苷酸以外的19个核苷酸互补形成双链。
根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：
(1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰；
(3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。
所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
Figure GPA00000722284900051
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式3所示；2’-氧甲基修饰，如式4所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4’-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’-氨基修饰，如式8所示；2’-脱氧修饰，如式9所示。
Figure GPA00000722284900061
所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式10所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2，6-二氨基嘌呤修饰，如式13所示。
Figure GPA00000722284900071
优选情况下，所述修饰使修饰后的siRNA在细胞内抵抗核酸酶水解的能力增强。
此外，为了促进siRNA进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在siRNA正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。
本发明提供的siRNA的制备方法包括siRNA序列的设计和siRNA序列的合成。
所述siRNA序列的设计是指：在酪氨酸酶基因cDNA序列(Genbank登记号为NM_000372)的1-2082bp的范围内选取19bp的核苷酸序列。选取所述19bp的核苷酸序列的原则为：(1)总的siRNA双键能量＜1；(2)反义链5’端结合能3-9；(3)正义链5’端结合能为5-9；(4)GC含量为36-53％之间；(5)反义链5’端和正义链5’之间的能量差为-1至0之间。根据上述原则选取之后，再通过BLAST分析，将候选siRNA靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同除了酪氨酸基因以外的其它人类基因序列具有较高序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选siRNA靶位点不会对其他人类基因发生抑制作用，而仅对酪氨酸酶基因具有特异的抑制作用。
最后将得到的19bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为siRNA序列的正义链，在此19bp核苷酸序列的互补序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为siRNA序列的反义链。
所述siRNA序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海GenePharma公司进行合成。
一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。
例如，具有TYRO-1所示核苷酸序列的siRNA化学合成的具体步骤如下：
(1)寡聚核糖核苷酸的合成：在自动DNA/RNA合成仪(例如，AppliedBiosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19＞n＞2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护
将连接有siRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到siRNA的粗产物。
(3)纯化分离
将得到的siRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的siRNA产物。
(4)脱盐
用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的siRNA产物2-4次(每次2毫升)，除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有siRNA的溶液。
根据本发明提供的用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，该化妆品组合物含有本发明提供的siRNA作为活性成分。
根据本发明，所述化妆品组合物还含有载体。
本发明中，所述siRNA与载体的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相对于100重量份的siRNA，所述载体的含量为1000-10000000重量份；进一步优选为，相对于100重量份的siRNA，所述载体的含量为2000-100000重量份。
本发明中，对所述载体没有特别的限制，可以是任何用于化妆品组合物的载体，例如可以为动植物油、烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种；例如，所述动植物油可以为貂油、鳖油、大豆油、芝麻油、玉米油、油菜籽油、棉籽油、橄榄油和蓖麻油中的一种或几种；所述烃油可以为石蜡油、异三十六烷和凡士林中的一种或几种；所述酯可以为棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、异壬酸异壬酯、2-乙基己基棕榈酸酯、2-己基癸基月桂酸酯和2-辛基十二烷基肉豆蔻酸酯中的一种或几种；所述高级脂肪酸可以为棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸中的一种或几种；高级脂肪醇可以为鲸蜡醇和/或十八烷醇。
根据本发明，所述化妆品组合物还含有其它用于化妆品组合物的成分。
本发明中，所述siRNA与其它用于化妆品组合物的成分的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相对于100重量份的siRNA，所述其它用于化妆品组合物的成分的含量为1000-10000000重量份；进一步优选为，相对于100重量份的siRNA，所述其它用于化妆品组合物的成分的含量为2000-100000重量份。
本发明中，对所述其它用于化妆品组合物的成分没有特别的限制，例如，可以为保湿剂、着色剂、防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、表面活性剂和佐剂中的一种或几种。
本发明中，对所述保湿剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的保湿剂，例如，所述保湿剂可以为丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨醇、己二醇、1，3-丁二醇、甘油、海藻提取物和透明质酸中的一种或几种。
本发明中，对所述着色剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的着色剂，例如，所述着色剂可以为胭脂红、滑石、云母、碳酸镁、碳酸钙、硅酸镁、二氧化硅、氧化锌和群青中的一种或几种。
本发明中，对所述增稠剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的增稠剂，例如，所述增稠剂可以为蜂蜡、小烛树蜡、鲸蜡、微晶蜡、淀粉、黄原胶、阿拉伯胶、瓜尔胶、果胶和膨润土中的一种或几种。
本发明中，对所述防腐剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的防腐剂，例如，所述防腐剂可以为苯甲酸、水杨酸、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、问苯二酚和双咪唑烷基脲中的一种或几种。
本发明中，对所述抗氧化剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的抗氧化剂，例如，所述抗氧化剂可以为抗坏血酸、维生素A、β-胡萝卜素、维生素B3、半胱氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢酶、柠檬酸和二茶酚中的一种或几种。
本发明中，对所述表面活性剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的表面活性剂，例如，所述表面活性剂可以为脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、烷基苯磺酸钠、磺基琥珀酸二烷基酯、N-酰基谷氨酸和聚氧乙烯烷基硫酸钠中的一种或几种。
所述佐剂的种类没有特别的限制，可以为各种能够用于化妆品组合物的佐剂，例如，所述佐剂可以为甘露醇、葡萄糖、白蛋白、精氨酸、氮酮和海藻糖中一种或几种。
所述化妆品组合物可以为各种常规的化妆品组合物的形式，例如，可以为乳剂、膏剂、液剂、气雾剂或粉剂。所述化妆品组合物为外用剂，可以用于身体各个部位的皮肤，例如脸部、颈部、手臂、躯干(胸部、腹部和背部)、腿部、手部和脚部。
本发明还提供了一种siRNA在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用，其中，所述siRNA为本发明提供的siRNA。
下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例1
siRNA的合成
在酪氨酸酶基因cDNA序列(Genbank登记号为NM_000372)的1-2082bp的范围内选取19bp的核苷酸序列。选取所述19bp的核苷酸序列的原则为：(1)总的siRNA双键能量＜1；(2)反义链5’端结合能3-9；(3)正义链5’端结合能为5-9；(4)GC含量为36-53％之间；(5)反义链5’端和正义链5’之间的能量差为-1至0之间。根据上述原则选取之后，再通过BLAST分析，将候选siRNA靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同除了酪氨酸基因以外的其它人类基因序列具有较高序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选siRNA靶位点不会对其他人类基因发生抑制作用，而仅对酪氨酸酶基因具有特异的抑制作用。
最后将得到的19bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为siRNA序列的正义链，在此19bp核苷酸序列的互补序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为siRNA序列的反义链。
设计好的siRNA经上海吉玛(GenePharma)公司进行化学合成，得到siRNA TYRO-1至TYRO-8，所述siRNA TYRO-1至TYRO-8的核苷酸序列如表1所示。
表1
Figure GPA00000722284900111
所述攻击范围是指该siRNA在序列表第1号序列中的相对应位置。
对比例1
经上海吉玛(GenePharma)公司化学合成得到具有如表2所示核苷酸序列的参比siRNA C1-C3。
表2
Figure GPA00000722284900121
所述攻击范围是指该参比siRNA在序列表第1号序列中的相对应位置。
实施例2
siRNA对酪氨酸酶基因表达的抑制活性检测
(1)黑素细胞的培养
用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，在六孔细胞培养板上以5×106个细胞/孔的密度接种SK-MEL-1黑色素肿瘤细胞(北京百星高科技术开发有限公司)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。
(2)siRNA的转染
使用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000脂质体对实施例1得到的siRNA TYRO-1至TYRO-8分别进行转染，以不添加siRNA作为对照。具体操作步骤如下：将siRNA溶解于无RNA酶的无菌水中，配制成浓度为20μmol/L的溶液。将SK-MEL-1黑色素瘤细胞接种至24孔板中，用OptiMEMI低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)稀释成浓度为8×105个细胞/ml，每孔500μl。分别将1.5μl siRNA(20μmol/L)稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，将1μl LipofectamineTM 2000脂质体稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，，然后将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合，混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl该混合溶液加到接种有细胞的所述24孔板中。siRNA的最终浓度是50nM。细胞37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，然后在37℃下再培养24小时。
(3)抑制活性检测
通过RT-PCR分别检测转染了siRNA TYRO-1至TYRO-8的SK-MEL-1黑色素瘤细胞中酪氨酸酶mRNA的表达量，具体步骤为：
用1ml Trizol(GIBCOL公司)裂解转染siRNA的SK-MEL-1黑色素瘤细胞，并提取总RNA，提取总RNA的具体步骤为：将转染后的细胞在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中培养24小时，然后离心收集细胞，并用预冷的2ml PBS洗一遍；所述PBS的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L；每孔加入1ml Trizol，室温放置5分钟，裂解细胞；将裂解物转移到1.5ml EP管中；加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15秒，室温放置3分钟；14000rpm 4℃离心15分钟；取液相上清约500μl放于一新的EP管中，加入500μl异丙醇，室温放置10分钟；12000rpm，4℃离心10分钟，除去上清，用1ml浓度为75％的乙醇将沉淀物洗一次；7600rpm，4℃离心5分钟；除去上清，室温干燥RNA沉淀10分钟；加入20μl ddH2O溶解RNA。
将2单位的DNase I(RNase-free)(TakaRa公司)加入至上述溶解有RNA的DEPC水中，并在37℃条件下静置30分钟，以除去总RNA中残留的DNA。经过DNase I处理后，采用Invitrogen公司PureLink Micro-to-Midi Total RNAPurification Kit对总RNA进行提纯，提纯的具体步骤为：在总RNA中加入20μl的浓度为70％的乙醇，振荡混合均匀，将混合物转移至纯化柱上，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，加入700μl清洗缓冲液I(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，加入500μl清洗缓冲液II(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，再加入500μl清洗缓冲液II(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃过滤液，室温12000rpm离心1分钟，将纯化柱转移至RNA收集管上，加入30μl DEPC水，室温放置1分钟，室温13000rpm离心2分钟，将RNA样品置于-80℃保存。
对提纯后得到的总RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为Promega公司的M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为：将1ug提纯后的总RNA与0.5ug的Oligo dT在试管中进行混合，用DEPC水将总体积补足至16.25μl，将试管进行加热，加热的条件包括加热温度为70℃，加热时间为5分钟；然后将试管迅速冷却至0℃，并加入缓冲液(5×MLVbuffer 5μl，10mM Dntp 1.25μl，RNasin 0.5μl，M-MLV 1μl)，在42℃条件下孵育1小时，得到cDNA。
将得到的cDNA作为PCR反应的模板，进行Real-time PCR反应。Real-time PCR反应体系为：ddH2O 17.5μl，10mM Dntp 0.5μl，10×Taq buffer2.5μl，Taq 0.5μl，F primer 0.5μl，R primer 0.5μl，Syber Green I 1μl，cDNA 2μl；PCR反应的条件为：94℃2分钟，94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。根据以下公式计算siRNA的抑制活性，结果如表3所示。
siRNA抑制活性＝[1-(siRNA转染后的酪氨酸酶基因的拷贝数/siRNA转染后的GAPDH拷贝数)/(对照孔酪氨酸酶基因的拷贝数/对照孔GAPDH拷贝数)]×100％。
GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶基因。3-磷酸甘油醛脱氢酶基因是细胞中的看家基因，在细胞中稳定表达，不受其他外加因素的影响，因此作为荧光定量PCR反应的内参照。
对比例2
按照实施例2所示的方法检测siRNA对酪氨酸酶mRNA表达的抑制活性，不同在于所用siRNA为对比例1得到的参比siRNA C1-C3，结果如表3所示。
表3
Figure GPA00000722284900141
从表3可以看出，本发明提供的siRNA TYRO-1至TYRO-8能够高效的抑制酪氨酸酶基因的表达，特别是siRNA TYRO-1、TYRO-4和TYRO-5对酪氨酸酶基因的抑制活性达到81％、82％和87％，而参比siRNA C1-C3对酪氨酸酶基因的抑制活性分别为65％、58％和52％，说明与现有的用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA相比，本发明提供的siRNA用于抑制酪氨酸酶基因的表达时，对酪氨酸酶基因表达的抑制活性较高。
实施例3
siRNA对酪氨酸酶蛋白的抑制活性检测
(1)黑素细胞的培养
用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，在六孔细胞培养板上以5×106个细胞/孔的密度接种SK-MEL-1黑色素肿瘤细胞(北京百星高科技术开发有限公司)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。
(2)抑制活性检测
分别检测siRNA TYRO-1至TYRO-8对酪氨酸酶蛋白的抑制活性，在96孔培养板中加入SK-MEL-1黑色素瘤细胞悬液(8×105个细胞/ml)，每孔100ul，然后加入siRNA和LipofectamineTM2000脂质体(Invitrogen公司)进行转染，以不添加siRNA作为对照。siRNA的最终浓度为50nM。转染后72小时离心收集细胞，用pH7.4的PBS洗涤2次，所述PBS的组成为NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L；每孔加50μL浓度为1重量％的TritonX-100溶液，所述TritonX-100溶液的组成为99ml的水和1ml的TritonX-100；迅速放置于-80℃中，冻存30分钟；随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温后加入10μL浓度为2mg/ml的L-多巴溶液，并在37℃条件下反应2小时，测定475nm的吸光度值，结果如表4所示。
酪氨酸酶蛋白的抑制活性＝[1-[(siRNA转染后的孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]]×100％
对比例3
按照实施例3所示的方法检测siRNA抑制酪氨酸酶蛋白的活性，不同在于所用siRNA为对比例1得到的参比siRNA C1-C3，结果如表4所示。
表4
Figure GPA00000722284900161
从表4可以看出，本发明提供的siRNA TYRO-1至TYRO-8能够高效的抑制酪氨酸酶蛋白的活性，特别是通过TYRO-1、TYRO-4和TYRO-5对酪氨酸酶蛋白的抑制活性分别为46％、42％和56％，而参比siRNA C1-C3对酪氨酸酶蛋白的抑制活性分别为21％、18％和20％，说明本发明提供的siRNA能够有效的抑制酪氨酸酶的活性。
实施例4
siRNA对黑素细胞内黑色素含量的抑制
(1)黑素细胞的培养
用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，在六孔细胞培养板上以5×106个细胞/孔的密度接种SK-MEL-1黑色素肿瘤细胞(北京百星高科技术开发有限公司)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。
(2)黑色素含量检测
分别检测siRNA TYRO-1至TYRO-8对黑色素含量的抑制效果，具体步骤如下：
以每孔1.6×106个细胞接种于6孔培养板，每孔分别加入siRNA和LipofectamineTM2000脂质体(Invitrogen)进行转染，以不添加siRNA作为对照。siRNA的最终浓度为50nM。转染后72小时离心收集细胞，用pH7.4的PBS洗涤2次(每次2ml)，所述PBS的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L；然后每孔加500μL浓度为1重量％的TritonX-100溶液，所述TritonX-100溶液的组成为99ml水、1ml TritonX-100；迅速放置于-80℃中，冻存30分钟；随后室温融化使细胞完全破裂，离心，沉淀依次用浓度为10重量％的三氯乙酸(2ml)和无水乙醇(2ml)各洗涤1次，12000rpm离心5分钟，弃去上清液，在沉淀物中加入2N NaOH(含20重量％DMSO)在80℃水浴保温2小时后于475nm测吸光度值并计算黑色素含量的抑制率，结果如表5所示。
黑色素含量的抑制率＝[1-[(siRNA转染后的孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]]×100％
对比例4
按照实施例4所述的方法检测siRNA抑制SK-MEL-1黑色素肿瘤细胞内的黑色素含量，不同在于所用siRNA为对比例1得到的参比siRNA C1-C3，结果如表5所示。
表5
Figure GPA00000722284900171
从表5可以看出，本发明提供的siRNA TYRO-1至TYRO-8能够显著的提高黑色素含量的抑制率，特别是通过TYRO-1、TYRO-4和TYRO-5的抑制，黑素细胞内黑色素含量的抑制率达到35％以上，而通过参比siRNAC1-C3的抑制，黑素细胞内黑色素含量的抑制率分别为19％、18％和21％，说明本发明提供的siRNA能够显著的提高黑色素含量的抑制率。
实施例5
人体皮肤的美白效果检验
为了增强siRNA的稳定性，委托上海吉玛公司合成化学修饰的siRNATYRO-1至siRNA TYRO-8，其中，化学修饰的siRNA TYRO-1至siRNATYRO-8正义链所有的U和C核苷酸戊糖的2’-OH进行了2’-氟代修饰，反义链所有的U和C核苷酸戊糖的2’-OH进行了2’-氧甲基修饰。然后按表6所示的组成将各组分混合，然后搅拌均匀得到组合物1-8，以评价含有本发明提供的siRNA作为活性成分的组合物的临床美白效果。
选择20名健康的年龄在18-55岁之间的女性志愿者，在志愿者的臀部利用GS2006型日光模拟器(中国北京奥华设备有限公司)诱导皮肤的黑化，诱导黑化的时间为1小时，形成直径1.0cm的黑化斑点，明显黑于未黑化皮肤的肤色；之后，分别使用组合物1-8施用于黑化的皮肤，早、晚各一次，每次用量为0.5ml，并在施用后每一个月的最后一天观察黑化皮肤颜色的变化，结果如表8所示。
表6
Figure GPA00000722284900181
对比例5
按照实施例5所述的方法对参比siRNA C1-C3进行化学修饰后，按同样的方法进行人体皮肤的美白效果检验。，不同在于，按下表7所示的组成将各组分混合，然后搅拌均匀得到参比组合物D1-D3，结果如表8所示。
表7
Figure GPA00000722284900191
表8
Figure GPA00000722284900192
美白效果评价标准：
无效果：无任何变化；
轻微效果：黑化皮肤的肤色略微变白，但仍比未黑化皮肤的肤色略黑；
显著效果：黑化皮肤的肤色明显变白与未黑化皮肤的肤色基本一致。
从表8可以看出，含有本发明提供的siRNA TYRO-1至TYRO-8的组合物在使用5个月后，对黑化皮肤具有显著的美白效果，特别是通过含有TYRO-1、TYRO-4和TYRO-5的组合物在使用1个月后，对黑化皮肤具有轻微美白效果，使用3个月后，对黑化皮肤具有显著的美白效果，而含有参比siRNA C1-C3的参比组合物D1-D3，在使用四个月后，才呈现轻微的美白效果，使用六个月后美白效果并没有显著的增加，说明含有本发明提供的siRNA的组合物的美白效果更加显著。

Claims (10)

1.一种用于抑制酪氨酸酶基因表达的siRNA，其特征在于，该siRNA的序列为TYRO-5所示的核苷酸序列，或者为对TYRO-5所示的核苷酸序列进行化学修饰所得到的核苷酸序列，其中，
TYRO-5正义链：5’-CCAUCAGUCUUUAUGCAAUdTdT-3’
反义链：5’-AUUGCAUAAAGACUGAUGGdTdT-3’。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：
(1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰；
(3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其中，所述化学修饰使修饰后的siRNA在细胞内抵抗核酸酶水解的能力增强。
4.一种用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，其特征在于，该化妆品组合物含有权利要求1-3中任意一项所述的siRNA作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还含有载体，所述载体选自烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其中，相对于100重量份的siRNA，所述载体的含量为1000-10000000重量份。
7.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还含其它用于化妆品组合物的成分，所述其它用于化妆品组合物的成分选自保湿剂、着色剂、防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、表面活性剂和佐剂中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其中，相对于100重量份的siRNA，所述其它用于化妆品组合物的成分的含量为1000-10000000重量份。
9.根据权利要求4所述的化妆品组合物，其中，该化妆品组合物为膏剂、液剂、气雾剂或粉剂。
10.权利要求1-3中任意一项所述的siRNA在制备用于抑制或祛除黑色素生成和沉积的化妆品组合物中的应用。
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