CN110643596A - 一种美白酵母dna原料的制法 - Google Patents
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Abstract
本发明美白酵母DNA原料的制法,其包括依序进行下述步骤:酵母菌菌体制备、菌体破碎及酵母DNA萃取、DNA酵素剪切、纯化小片段酵母DNA、单股酵母DNA制备、利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸、取得美白酵母DNA原料。通过本发明所取得的美白酵母DNA原料,能通过与酪胺酸酶基因的mRNA结合,使该基因失去作用,进而抑制黑色素形成,以达到美白效果的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种为美白酵母DNA原料的制法,尤其涉及一种美白核酸原料的制法,通过萃取剪切纯化筛选自酵母菌DNA的美白核酸原料制成技术。
背景技术
爱美是人的天性,时下人们对于外表的重视,也到了不分男女老少都相当重视的程度,毕竟拥有美丽顺眼的外表,对于人际关都有重大的影响。
俗话说一白遮三丑,一直以来美白保养品的市场都很大,虽然市面上已有很多美白相关产品,该些产品都是以抑制黑色素生成酵素的成分为基础,例如抑制酪胺酸酶;而这些成分大多来自化学合成或植物萃取,由于这些作用成分几乎是小分子,除了胜肽类的美白成分之外,这些来自化学合成或植物萃取的小分子,对人体细胞存有一定的毒性伤害,有些物质也会引发皮肤光敏感,因此美白产品所使用的浓度及时间会受到限制,太高的浓度或频率,反而会伤害肌肤。
由此可知,坊间现有美白产品,存在极待改善或取代的必要。发明人有鉴于此,遂特以研创成本发明,期能借本发明的提出,改进现有美白产品,使美白相关产品能在达成效果之外,也能兼顾安全。
发明内容
有鉴于现有坊间美白商品存有伤害细胞的缺点,发明人期能提供一种以美白酵母DNA为原料的美白产品供消费大众使用,借以能在不损伤人体皮肤细胞的前提下,达到皮肤美白的功效。
本发明的技术,主要是依序进行下述步骤:酵母菌菌体制备、菌体破碎及酵母DNA萃取、DNA酵素剪切、纯化小片段酵母DNA、单股酵母DNA制备、利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸,最后取得美白酵母DNA原料。
由于现今RNAi(RNA interference,缩写为RNAi)核酸干扰技术已相当发达且趋于成熟,开发原料本身无毒性的核酸美白成分,成为可能的事,其可用来替代目前毒性较高、来自化学合成或植物萃取的美白小分子,借以提升美白保养品的使用安全,以保障消费者健康。
至于酵母菌,其为一群圆形或椭圆形的单细胞,是具有细胞核的真核生物。在分类学上,酵母菌是真菌类,因不具有叶绿素,所以不能进行光合作用,须从周遭环境中摄取有机物质来进行其生理代谢。酵母菌是食品工业上应用最广泛的微生物菌种。酿酒、面包酦酵、食品香料制造都可以見到它们的踪迹。在一般的微生物培养上,酵母萃取液也是极佳的养分來源,它提供了大量的维他命及生长因子,在实验室中培养微生物的研究人员都少不了它。制造面包酵母的酵母菌种为真正酵母菌属中的一种,其名称为Saccharomycescereuisiae,其细胞呈现球形或卵形,其对于葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖皆有发酵力,但对乳糖不发酵;该酵母为制造啤酒、面包或酒精的主要菌种,亦是维生素B2 及消化剂的来源。面包酵母可使面包、馒头、包子等发酵食品,需经酵母发酵,使产品松软,同时产生特殊的风味。制造面包酵母的主要原料有甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、大麦、大麦根、无机盐等。本案中,将选取面包酵母当DNA原料来源的原因,正因它可以食用,若应用于美白皮肤的基础原料时,更能确保使用安全。
限制酶(restriction enzyme)又称限制内切酶(restriction endonuclease),为限制性核酸内切酶,是一种能将双股DNA切开的酵素。切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断,进而于两条DNA链上各产生一个切口,且不破坏核苷酸与碱基。通过DNA限制酶处理,可将大片段酵母的DNA,切割成具有特定序列组合的小片段酵母DNA,进而取得不同序列组合的DNA片段,用于筛选与人类细胞特定基因mRNA结合的潜力,进而得到类似RNA干扰(RNA interference,RNAi)所诱发的基因沉默现象的小片段酵母DNA,做为美白原料来源。
以目前RNAi核酸生产的方式,是用有机化学合成而来,生产成本很高,且生产过程会产生有毒有机溶剂废弃物,工艺并不环保,另外RNA易被分解不易保存,因此我们利用面包酵母菌作为美白核酸原料来源,加上RNAi核酸抑制基因的概念,经过多种DNA限制酶剪切酵母DNA,管柱分离纯化小片段酵母DNA,高温解离出单股酵母DNA,再通过美白基因芯片筛选,得到具RNAi特性的小片段单股酵母DNA,用环保的工艺,制备相对安全稳定的美白成分。
本发明的主要目的,在于突破现今美白保养品成分的瓶颈,利用先进高端的生物技术,制备出安全稳定有效新颖的美白核酸原料,并改良现今美白RNAi核酸不稳定的特性,用环保的工艺,制备相对安全稳定创新的美白成分,发明人将此新颖美白核酸原料定名为酵母活性核糖核酸DNAic,酵母活性核糖核酸意思为具RNAi特性的DNA原料,因此酵母活性核糖核酸中所称的核糖核酸具有两种意义,一种是实质成分是DNA(脱氧核糖核酸),另一种意义为RNAi(本质为核糖核酸),而ic则为抑制色素(inhibit color)的意思。该酵母活性核糖核酸DNAic定义为一群经10种DNA限制酶剪切过的酵母菌DNA,经illustra Sephadex G-100 DNA Grade胶体过滤层析纯化胶体,纯化出的一群长度大于27 mer并经高温解离的单股酵母菌DNA。
综上所述,本发明提供了一种美白酵母DNA原料的制法,其包括依序进行下述步骤:
步骤一:酵母菌菌体制备;
步骤二:菌体破碎及酵母DNA萃取;
步骤三:DNA酵素剪切;
步骤四:纯化小片段酵母DNA;
步骤五:单股酵母DNA制备;
步骤六:利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸;
步骤七:取得美白酵母DNA原料;
其中,该步骤三的DNA酵素剪切,所使用的DNA限制酶种类包括:
AgeⅠ: A/CCGGT、
BamHⅠ: G/GATCC、
Csp6Ⅰ: G/TAC、
EcoRⅠ: G/AATTC、
Hind Ⅲ: A/AGCTT、
AccⅡ: CG/CG、
MamⅠ: GATNN/NNATC、
NruGⅠ: GACNNN/NNGTC、
PflMⅠ: CCANNNN/NTGG、
SfiⅠ: GGCCNNNN/NGGCC。
优选的,该步骤一的酵母菌菌体制备,以面包酵母菌为菌体制备菌种,用YPD培养基做为菌体培养基;以离心方式收取菌体。
进一步优选的,该菌体培养基配方为:0.5~1.5%酵母膏、1.5~2.5%蛋白胨、1.5~2.5%葡萄糖,未满100%的其它成份为水。
优选的,该菌体培养基的配制方法为:溶解该酵母膏、该蛋白胨于水中,高压灭菌,加入该葡萄糖;该菌体发酵放大工艺为:先小量培养菌种,用锥型瓶振荡培养1~2天,经振荡后接种到发酵槽中,经培养后进行离心,取得该菌体培养基。
优选的,该菌体培养基还在于溶解该酵母膏时,加入1.5~2.5%琼脂粉,以备制成固体培养基。
优选的,该步骤二的菌体破碎及酵母DNA萃取工艺,是将步骤一取得的该菌体加入缓冲液,置于离心管中利用超音波震碎法破菌,震破细胞及震断酵母基因组DNA,再经离心程序,去除上清液后自然干燥,经加入去离子水溶解离心物,再加入RNase A,经反应分解后去除RNA,再加入4M 醋酸铵和酒精混合均匀,离心后去除上清液,经自然干燥后,溶于去离子水。
优选的,该步骤三的DNA酵素剪切,将步骤二所完成的萃取物,以不同种类的DNA限制酶作专一性剪切,混合DNA限制酶反应缓冲液及去离子水,将溶液混合振荡均匀,于室温离心后,使溶液集中于离心管底部,置入干浴器中产生作用,再通过10种只辨认特定序列剪切限制酶,切出小片段酵母DNA;其中该限制酶中,“/”代表酵素切位,“N”代表A或T或C或G其中任一种。
优选的,该步骤四的纯化小片段酵母DNA,利用illustra Sephadex G-100 DNAGrade胶体过滤层析纯化胶体,纯化出不同群长度大于27 mer的酵母DNA群;利用该胶体过滤管柱依据胶球孔径大小做分离纯化,使该DNA分子会依照分子大小在不同时间点流出管柱,其中该相对较小分子由于会滞留于胶球中较久,会比相对较大分子更慢流出管柱,借此即可纯化与分离出所需的小片段酵母DNA。
优选的,该步骤五的单股酵母DNA制备,利用高温将步骤四所取得的该小片段酵母DNA经高温处理后,迅速置于冰桶内降温,以取得单股酵母DNA。
优选的,该步骤六的利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸,利用美白基因芯片筛选特定活性单股酵母DNA,将酪胺酸酶基因片段,一点一点的涂布在玻璃片基材上制成基因芯片,再用纯化出来的单股酵母核糖核酸样品,与基因芯片做杂合反应,通过杂合成功信号产生,筛选出一群具活性单股酵母核糖核酸,杂合成功代表单股酵母核糖核酸可与酪胺酸酶基因的mRNA结合,使该基因失去作用,进而抑制黑色素形成。
附图说明
图1为本发明的流程方块图。
附图标记说明
1 酵母菌菌体制备;
2 菌体破碎及酵母DNA萃取;
3 DNA酵素剪切;
4 纯化小片段酵母DNA;
5 单股酵母DNA制备;
6 利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸;
7 取得美白酵母DNA原料。
具体实施方式
现就本发明美白酵母DNA原料的制法,及其所产生的功效,配合说明书附图,举一本发明的较佳实施例详细说明如下。
首请参阅图1,本发明美白酵母DNA原料的制法,主要进行下述步骤:酵母菌菌体制备1、菌体破碎及酵母DNA萃取2、DNA酵素剪切3、纯化小片段酵母DNA4、单股酵母DNA制备5、利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸6、取得美白酵母DNA原料7。通过本发明所取得的美白酵母DNA原料,即能通过与酪胺酸酶基因的mRNA结合,使该基因失去作用,进而抑制黑色素形成,以达到美白效果。
其中,该步骤一的酵母菌菌体制备1,以面包酵母菌(Saccharomyces cereuisiae)为菌体制备菌种,用YPD培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)做为菌体培养基,培养基配方如下: 0.5~1.5%酵母膏、1.5~2.5%蛋白胨、1.5~2.5%葡萄糖,未满100%的其它成份为水(其中最佳比例为1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖);若制固体培养基,加入2%琼脂粉。配制方法如下:先溶解10g酵母膏, 20g蛋白胨于900ml水中,如制平板加入20g琼脂粉,再高压 121度20min灭菌,的后再加入100ml含20g的葡萄糖(葡萄糖溶液灭菌后加入)即可。菌体发酵放大工艺为,先小量培养菌种,用锥型瓶振荡培养2天,培养温度30℃,振荡转速150 rpm。再接种到5公升发酵槽,培养温度28℃,转速50 rpm,pH4.5,通气量0.1vvm,培养至对数期到静止期的间离心5000 rpm,4℃,20分钟收取菌备用。
该步骤二的菌体破碎及酵母DNA萃取2工艺,将步骤一的菌体利用超音波震碎法破菌,将菌体加入缓冲液(glycerol 10% ; Na2HPO4 46.6mM; NaH2PO4 3.4mM; NaCl 300 mM;1% Triton X-100 ),取菌液20 mL于50 mL 的离心管中,在冰浴下以超音波细胞破碎机(550Watts, 20KHz;Sonicator 3000, USA)震碎菌体细胞处理30分钟,以震碎60 秒,休息60 秒的间歇方式进行,彻底震破细胞及震断酵母基因组DNA。离心5分钟,取出水层溶液至另一个离心管,并加入66%体积的100%酒精,混合均匀,再离心两分钟,去除上清液,自然干燥后,加入去离子水溶解离心物,再加入0.3 mg/ml RNase A,置于37 ℃反应5 min分解去除RNA,再加入10 ml 4M ammonium acetate(醋酸铵) 和1 ml 100%酒精,混合均匀,离心两分钟,去除上清液,自然干燥后,溶于去离子水备用。
该步骤三的DNA酵素剪切3,将萃取出的酵母大片段DNA,用不同种类的DNA限制酶作专一性剪切,混合DNA限制酶反应缓冲液及去离子水,将溶液混合振荡均匀,于室温6000rpm离心10秒钟使溶液集中于离心管底部后,置入干浴器中于37℃作用16小时。通过10种只辨认特定序列剪切限制酶,切出小片段酵母DNA的多样性,增加美白基因芯片筛选成功的机会。该步骤中,使用的DNA限制酶种类如下:
AgeⅠ: A/CCGGT
BamHⅠ: G/GATCC
Csp6Ⅰ: G/TAC
EcoRⅠ: G/AATTC
HindⅢ: A/AGCTT
AccⅡ: CG/CG
MamⅠ: GATNN/NNATC
NruGⅠ: GACNNN/NNGTC
PflMⅠ: CCANNNN/NTGG
SfiⅠ: GGCCNNNN/NGGCC
注: / : 代表酵素切位
N = A或T或C或G其中一种
该步骤四的纯化小片段酵母DNA4,利用illustra Sephadex G-100 DNA Grade胶体过滤层析纯化胶体,纯化出不同群长度大于27 mer的酵母DNA群。利用胶体过滤管柱依据胶球孔径大小做分离纯化,样品液中的DNA分子会依照分子大小在不同时间点流出管柱,其中小分子由于会滞留于胶球中较久,因此会比较大分子更慢流出管柱,利用这种原理即可将一成分复杂的样品液依照分子大小进行纯化与分离出小片段酵母DNA。
该步骤五的单股酵母DNA制备5,利用高温可使双股DNA变性,解离成单股DNA,先将小片段酵母DNA经95℃处理20分钟,再迅速置于冰桶内降温,得到单股酵母DNA。
该步骤六的利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸6,利用美白基因芯片筛选特定活性单股酵母DNA,将酪胺酸酶(Tyrosinase)基因片段,一点一点的涂布在玻璃片基材上制成基因芯片,再用纯化出来的单股酵母核糖核酸样品,与基因芯片做杂合反应,通过杂合成功信号产生,筛选出一群具活性单股酵母核糖核酸(即酵母活性核糖核酸DNAic),杂合成功代表单股酵母核糖核酸可与酪胺酸酶基因的mRNA结合,使该基因失去作用,进而抑制黑色素形成,以达到美白效果。
最后该步骤七,即能用以取得美白酵母DNA原料7。
实施时,将筛选出的单股小片段美白酵母DNA原料7 (即酵母活性核糖核酸DNAic),直接用于人体皮肤进行美白效果测试。由于DNA分子较大,即便是小片段酵母DNA也很大,因此,利用基因枪(Bio-Jet分子雾化仪)将美白酵母DNA原料7(即酵母活性核糖核酸DNAic)打入皮肤做效果测试,通过高速喷流,带动液体瞬间雾化,达到最佳投递效果,使用低压(50psi)氦气加速,非侵入性施打,不对组织跟肌肤造成伤害。经发明人自行选择数十位健康年龄在20~70岁之间自愿者,不分男女,直接在受试者脸上,以基因枪(Bio-Jet分子雾化仪)将该美白酵母DNA原料7 (酵母活性核糖核酸DNAic)打入受测者皮肤做测试,每次每人全脸施打2ml,每发施打20μl共100发,全脸施打,每隔7天施打2ml,总共施打4次,第28天结束实验,施打后第28天即可明显看出肤色变白,显见本发明确实具有美白作用。
综上所述,本发明美白酵母DNA原料的制法,其所制成的美白酵母DNA原料 (即酵母活性核糖核酸DNAic),确实具有美白的作用。本发明在产业上确实得以利用,于申请前未曾见于刊物或公开使用,且非为公众所知悉的技术。再者,本案有效解决先前技术中长期存在的问题并达成相关使用者与消费者长期的需求,得左证本发明并非能轻易完成。
显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,包括依序进行下述步骤:
步骤一:酵母菌菌体制备;
步骤二:菌体破碎及酵母DNA萃取;
步骤三:DNA酵素剪切;
步骤四:纯化小片段酵母DNA;
步骤五:单股酵母DNA制备;
步骤六:利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸;
步骤七:取得美白酵母DNA原料;
其中,该步骤三的DNA酵素剪切,所使用的DNA限制酶种类包括:
AgeⅠ: A/CCGGT、
BamHⅠ: G/GATCC、
Csp6Ⅰ: G/TAC、
EcoRⅠ: G/AATTC、
Hind Ⅲ: A/AGCTT、
AccⅡ: CG/CG、
MamⅠ: GATNN/NNATC、
NruGⅠ: GACNNN/NNGTC、
PflMⅠ: CCANNNN/NTGG、
SfiⅠ: GGCCNNNN/NGGCC。
2.如权利要求1所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该步骤一的酵母菌菌体制备,以面包酵母菌为菌体制备菌种,用YPD培养基做为菌体培养基;以离心方式收取菌体。
3.如权利要求2所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该菌体培养基配方为:0.5~1.5%酵母膏、1.5~2.5%蛋白胨、1.5~2.5%葡萄糖,未满100%的其它成份为水。
4.如权利要求3所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该菌体培养基的配制方法为:溶解该酵母膏、该蛋白胨于水中,高压灭菌,加入该葡萄糖;该菌体发酵放大工艺为:先小量培养菌种,用锥型瓶振荡培养1~2天,经振荡后接种到发酵槽中,经培养后进行离心,取得该菌体培养基。
5.如权利要求3所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该菌体培养基还在于溶解该酵母膏时,加入1.5~2.5%琼脂粉,以备制成固体培养基。
6.如权利要求1所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该步骤二的菌体破碎及酵母DNA萃取工艺,是将步骤一取得的该菌体加入缓冲液,置于离心管中利用超音波震碎法破菌,震破细胞及震断酵母基因组DNA,再经离心程序,去除上清液后自然干燥,经加入去离子水溶解离心物,再加入RNase A,经反应分解后去除RNA,再加入4M 醋酸铵和酒精混合均匀,离心后去除上清液,经自然干燥后,溶于去离子水。
7.如权利要求1所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该步骤三的DNA酵素剪切,将步骤二所完成的萃取物,以不同种类的DNA限制酶作专一性剪切,混合DNA限制酶反应缓冲液及去离子水,将溶液混合振荡均匀,于室温离心后,使溶液集中于离心管底部,置入干浴器中产生作用,再通过10种只辨认特定序列剪切限制酶,切出小片段酵母DNA;其中该限制酶中,“/”代表酵素切位,“N”代表A或T或C或G其中任一种。
8.如权利要求1所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该步骤四的纯化小片段酵母DNA,利用illustra Sephadex G-100 DNA Grade胶体过滤层析纯化胶体,纯化出不同群长度大于27 mer的酵母DNA群;利用该胶体过滤管柱依据胶球孔径大小做分离纯化,使该DNA分子会依照分子大小在不同时间点流出管柱,其中该相对较小分子由于会滞留于胶球中较久,会比相对较大分子更慢流出管柱,借此即可纯化与分离出所需的小片段酵母DNA。
9.如权利要求1所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该步骤五的单股酵母DNA制备,利用高温将步骤四所取得的该小片段酵母DNA经高温处理后,迅速置于冰桶内降温,以取得单股酵母DNA。
10.如权利要求1所述的美白酵母DNA原料的制法,其特征在于,该步骤六的利用美白基因芯片筛选活性单股酵母核糖核酸,利用美白基因芯片筛选特定活性单股酵母DNA,将酪胺酸酶基因片段,一点一点的涂布在玻璃片基材上制成基因芯片,再用纯化出来的单股酵母核糖核酸样品,与基因芯片做杂合反应,通过杂合成功信号产生,筛选出一群具活性单股酵母核糖核酸,杂合成功代表单股酵母核糖核酸可与酪胺酸酶基因的mRNA结合,使该基因失去作用,进而抑制黑色素形成。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20200103 |
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