KR101320188B1 - 형질 전환 세포주와 백반증 마우스를 이용한 백모 방지 물질 스크리닝 방법 및 그 백모 방지 물질을 함유하는 백모방지용 조성물 - Google Patents

형질 전환 세포주와 백반증 마우스를 이용한 백모 방지 물질 스크리닝 방법 및 그 백모 방지 물질을 함유하는 백모방지용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멜라닌 합성과 멜라노사이트의 활성에 핵심적인 역할을 하는 MITF(Microphtalmia-associated factor), 티로시나제, TRP2(tyrosinase-related protein 2)의 발현을 모니터링 할 수 있도록 구축한 형질전환 세포주(stable cell line) 및 백모 발생이 촉진된 백반증 모델 마우스(C57bl/6-Mitf mi - vit )로 구성된 백모 방지 물질 스크리닝 방법 및 그 백모 방지 물질을 함유하는 백모방지용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 형질전환 세포주는 멜라노사이트의 일종인 Melan-a 세포의 염색체에 MITF, 티로시나제 및 TRP2 유전자의 발현 정도를 모니터링할 수 있는 플라스미드들을 안정적으로 도입(stable transfection)시켜서 얻은 세포주로써, 이 세포주들을 이용하면 MITF, 티로시나제 및 TRP2의 변화를 유전자, 단백질, 및 전체 멜라닌 양의 수준에서 동시에 파악 가능하다. 또한 상기 세포주들을 이용해서 도출된 백모 방지 후보 물질들을 백모 발생이 촉진된 백반증 마우스의 등에 도포하고 육안 평가 및 모발 내 멜라닌 양의 변화를 측정하는 방법으로 개체 수준에서의 백모 방지 효능 평가하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명의 스크리닝 방법은 형질 전환 세포주들을 이용한 생체 외(in vitro) 효능 평가와 백반증 마우스를 이용한 생체 내(in vivo) 효능 평가를 결합시킴으로써, 스크리닝의 정확도는 높이면서도 스크리닝에 소요되는 시간과 비용은 줄일 수 있다는 장점을 지닌다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 IBMX 또는 카페인(caffeine)을 비롯한 PDE(포스포디에스테라제) 억제제를 백모 방지제로 사용하면 탁월한 백모 방지 효과를 얻을 수 있다.

Description

형질 전환 세포주와 백반증 마우스를 이용한 백모 방지 물질 스크리닝 방법 및 그 백모 방지 물질을 함유하는 백모방지용 조성물{Method for screening anti-gray hair ingredient using stable cell lines and accelerated vitiligo mouse, and composition containing anti-gray hair ingredient detected thereby}
본 발명은 형질 전환 세포주와 백모발생이 촉진된 백반증 마우스를 이용한 백모 방지 물질 스크리닝 방법 및 그 백모 방지 물질을 함유하는 백모방지용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 멜라닌 합성과 멜라닌 세포의 생존에서 가장 중요한 역할을 하는 MITF, 티로시나제, TRP2의 발현 변화를 세포 수준에서 모니터링 할 수 있는 형질 전환 세포주, 및 생체 내에서 후보 물질들의 백모 발생 억제 효능을 측정할 수 있는 백반증 모델 마우스로 구성된 백모 방지 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 IBMX 또는 카페인(caffeine)을 비롯한 PDE(포스포디에스테라제) 억제제를 유효성분으로 함유하는 백모 방지용 조성물에 관한 것이다.
MITF는 멜라닌 형성 과정을 조절하는 전사 요소(transcription factor)로써 멜라닌 합성과 멜라노사이트의 생존에서 핵심적인 역할을 수행한다. MITF는 지금까지 A, B, C, D, H 그리고 M의 5종의 이소형태(isoform)들이 보고되어 있지만 멜라노사이트에서 멜라닌 합성을 주도하는 하는 것은 MITF-M이다. 따라서 본 연구는 MITF-M을 중심으로 이루어졌으며, 특별한 기재가 없는 한 본 특허의 MITF는 MITF-M을 지칭한다.
MITF는 활성화되면 멜라닌합성 효소인 티로시나제, TRP1(Tyrosinase-related protein 1) 및 TRP2의 전사(transcription)를 활성화시켜서 멜라닌 합성을 촉진한다. 또한 MITF는 세포 사멸(apoptosis)을 방지하는 역할을 하는 Bcl-2 단백질의 발현을 증가시켜서 멜라노사이트의 생장과 생존을 증가시키는 중요한 역할을 한다(Cell 109:707-718,2002).
대표적인 색소 침착 장애 질환인 WS2A(Waardenburg syndrome type 2A)와 TS(Tietz syndrome)는 MITF 유전자의 돌연변이에 의해서 발생하는 유전 질환으로써 모발과 피부의 색소 탈색, 청력 상실, 시각 상실 등의 증상이 나타난다(Physiol Rev 84:1155-1228,2004). 이상의 예들에서 MITF가 색소 형성 및 멜라노사이트의 활성화에 필수적인 요소란 것을 확인할 수 있다.
멜라닌은 L-티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀(melanosome)안에서 복잡한 여러 단계의 변환 과정을 통해서 생성된 최종 생산물이다. 티로시나제는 멜라닌 합성 조절의 중요 효소로써, L-티로신을 L-DOPA(L-dihydroxyphenylalanine)로 전환시켜서 멜라닌 합성을 시작시키는 역할을 한다. 이 과정은 멜라닌 합성의 속도 조절 단계(rate-limiting step)로써 생체 외나 생체 내에서의 멜라닌 합성에서 필수적인 단계이다.
TRP1과 TRP2는 2004년 초까지는 티로시나제를 도와서 멜라닌 합성 과정의 속도를 조절하는 단백질로 생각되었다. 하지만 백모 발생 과정에 대한 연구 도중 피부와 달리 모낭의 멜라노사이트는 나이가 들면서 점차 사멸한다는 것이 밝혀졌으며, 피부와 백모 모낭 멜라노사이트의 결정적인 차이는 TRP2의 존재 유뮤라는 것이 발표되었다(로레알 모발 생물학팀, 대륙간 모발연구학회(IMHRS)). 이 연구에 따르면 멜라노사이트내의 TRP2의 쇠퇴가 모낭 멜라노사이트의 사멸로 진행되어 백모가 발생한다는 것을 알 수 있다. 따라서 TRP2는 모낭에서 멜라닌 합성과 더불어 멜라노사이트의 생존에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
백모는 모낭 내 멜라노사이트의 이상으로 멜라노사이트가 모발에 멜라닌을 전달하지 못해서 일어나는 현상이다. 백모의 원인으로 다양한 요인들이 제시되고 있지만, 지금까지 연구된 백모의 원인은 크게 첫째, 모낭 내 멜라노사이트 줄기 세포의 점진적인 사멸로 인한 모낭 멜라노 사이트의 감소; 둘째, 멜라노사이트 사멸 억제 단백질(Bcl-2)의 감소로 인한 모낭 멜라노사이트의 사멸; 셋째, 모낭 외근초(ORS: outer root sheat) 멜라노사이트의 이동 능력 및 활성도 감소의 세 가지로 정리할 수 있다.
이상의 연구 결과에서 알 수 있듯이 백모는 단지 모낭 멜라노사이트의 멜라닌 합성 능력 저하뿐만 아니라, 특정 요인에 의해서 모발 주기에 따른 모낭 멜라노사이트의 생존, 분화, 이동이 정상적으로 이루어지지 않아서 생성되는 것이다. 따라서 효과적인 백모 방지 물질이 되기 위해서는 단지 멜라닌합성을 증진시키는 효능뿐만 아니라 멜라노사이트의 전체적인 활성을 증가시켜서 사멸하지 않고 계속해서 멜라닌 합성을 유도할 수 있어야 한다. 또한, 효능 있는 백모 방지 원료의 개발을 위해서는 멜라노사이트 활성의 전체적인 조절자인 MITF, 멜라닌 합성의 주 효소인 티로시나제, 멜라닌 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 TRP2의 변화를 쉽고 빠르게 관찰할 수 있고, 후보 물질의 효능을 생체 내에서 검증할 수 있는 스크리닝 시스템이 필수적이다.
기존의 백모 방지 관련 특허들은 멜라닌 합성 촉진제 및 피부 외용제(JP, 공개 번호 2007-008888), 백발 개선용 건강보조식품 조성물 및 이를 함유한 건강 보조 식품(KR, 공개 번호 2005-0109345), 멜라닌 산생 촉진제 및 멜라닌 산생 촉진용 조성물(JP, 공개 번호 2004-345959), 한약재를 원료로 한 백발 치유 보조제(KR, 공개 번호 2002-0095855), 민들레 추출물을 함유하는 백발 생성 억제용 모발 화장료 조성물(KR, 공개 번호 2002-0068589)과 같이 단지 멜라노사이트의 멜라닌 합성을 증가시키는 물질에 초점을 맞춘 것들이 대부분이다. 또한 백모 방지 물질의 스크리닝 방법도 주로 멜라닌 합성을 증가시키는 티로시나제의 활성 정도를 측정하고 생성된 멜라닌의 양을 정량하거나, 육안으로 판정하는 방법에 국한되어 멜라노사이트의 활성도를 종합적으로 평가하려는 시도는 없었다(JP, 공개 번호 2002-212039 외).
작년 공개된 특허(일본특허출원, 공개 번호 2006-028143)는 백모 방지 물질 스크리닝의 지표로 MITF를 선정하고 MITF 유전자의 발현 변화를 실시간 연쇄 효소 중합 반응(real-time PCR)으로 측정하였으나, 단지 멜라노사이트 내의 메신저 RNA(mRNA)의 변화 하나로 백모 방지 물질을 찾으려는 생체 외(in vitro) 스크리닝 방법이라는 한계를 지닌다. 또 다른 특허(대한민국 특허출원, 공개 번호 2006-0134302)에서는 백모 방지 물질 평가를 위해서 백모를 유발한 마우스 모델과 인체 도포 실험을 진행하였으나, 백모 억제 효능이 육안 평가에 따른 점수 합산에 의해서 평가된다는 점에서 객관성을 지닐 수 없다는 문제가 있다.
Cell 109:707-718,2002 Physiol Rev 84:1155-1228,2004
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 멜라노사이트 생리적인 활성의 주 조절자인 MITF, 멜라닌 합성의 주 효소인 티로시나제, 그리고 멜라노사이트의 생존에 중요한 역할을 하는 TRP2의 발현 변화를 모니터링 할 수 있는 형질 전환 세포주들과, 후보 물질들의 생체 내에서의 백모 방지 효능을 평가 할 수 있는 백모 발생이 촉진된 백반증 마우스로 이루어진 백모 방지 물질 스크리닝 방법을 구축하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 형질 전환 세포주들을 이용한 생체 외(in vitro) 효능 평가와 백반증 마우스를 이용한 생체 내(in vivo) 효능 평가를 결합시킴으로써, 백모 방지 물질 스크리닝의 정확도는 높이면서도 스크리닝에 소요되는 시간과 비용은 줄일 수 있는 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법을 통하여 스크리닝된 백모 방지 물질을 함유하는 백모방지용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로프탈미아 연관 인자(microphtalmia-associated factor, MITF) 프로모터; 가우시아 루시퍼라제 유전자(GLuc); 및 네오마이신 저항성 유전자(NeoR) 및 암피실린 저항성 유전자(AmpR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pMITF-GLuc를 제공한다. 상기 발현벡터 pMITF-GLuc는 도 4의 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 티로시나제(Tyrosinase) 프로모터; 가우시아 루시퍼라제 유전자(GLuc); 및 네오마이신 저항성 유전자(NeoR) 및 암피실린 저항성 유전자(AmpR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pTyrosinase-GLuc를 제공한다. 상기 발현벡터 pTyrosinase-GLuc는 도 5의 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 티로시나제 연관 단백질 2(tyrosinase-related protein 2, TRP2) 프로모터; 가우시아 루시퍼라제 유전자(GLuc); 및 네오마이신 저항성 유전자(NeoR) 및 암피실린 저항성 유전자(AmpR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pTRP2-GLuc를 제공한다. 상기 발현벡터 pTRP2-GLuc는 도 6의 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 발현벡터 pMITF-GLuc로 형질전환된 Melan-a 멜라노사이트 세포주 MITF-GLuc (기탁번호: KCLRF-BP-00162); 발현벡터 pTyrosinase-GLuc로 형질전환된 Melan-a 멜라노사이트 세포주 Tyrosinase-GLuc(기탁번호: KCLRF-BP-00163); 및 발현벡터 pTRP2-GLuc로 형질전환된 Melan-a 멜라노사이트 세포주 TRP2-GLuc(기탁번호: KCLRF-BP-00161)를 제공한다.
본 발명은 상기 형질전환 세포주에 백모방지 후보물질을 처리하고 배지에서 배양시키는 단계; 상기 배지에 존재하는 GLuc의 생성량을 측정하는 단계; 등의 털을 뽑아 백모발생이 촉진된 백반증 마우스의 등에 상기 백모방지 후보물질을 도포하는 단계; 및 상기 백반증 마우스의 등에서 새로 자라난 털로부터 멜라닌의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백모 방지 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 백모 방지 물질 스크리닝 방법에 있어서, 상기 GLuc의 생성량을 측정하는 단계는, 세포를 파괴하지 않고 배지만을 측정플레이트에 옮겨서 상기 배지 내에 있는 GLuc을 기질과 반응시켜서 방출되는 빛의 양을 루미노미터로 측정하는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 백모 방지 물질 스크리닝 방법에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 상기 배지에 존재하는 GLuc의 생성량을 측정하는 단계 이후에, 상기 배양된 형질전환 세포주로부터 MITF, 티로시나제, 및 TRP2 단백질의 양을 정량하는 단계; 및 상기 배양된 형질전환 세포주로부터 전체 멜라닌 양을 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 스크리닝 방법을 통하여 스크리닝된 PDE(포스포디에스테라제) 억제제를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백모방지용 조성물을 제공한다. 본 발명의 백모방지용 조성물에 있어서, 상기 PDE(포스포디에스테라제) 억제제는 IBMX(3-이소부틸-1-메틸-잔틴) 또는 카페인(caffeine)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 백모 방지 물질 스크리닝 방법에 의하면, 형질전환 세포주를 통하여 멜라노사이트 활성을 조절하는 MITF, 티로시나제, TRP2를 어떻게 변화되는지 유전자, 단백질, 및 전체 멜라닌 양의 수준에서 동시에 파악할 수 있고, 백모 발생이 촉진된 백반증 마우스를 통하여 백모 방지 물질의 생체 내 효능을 평가할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 형질전환 세포주들을 이용한 생체 외(in vitro) 효능 평가와 백반증 마우스를 이용한 생체 내(in vivo) 효능 평가를 결합시킴으로써, 백모 방지 물질 스크리닝의 정확도를 높이고 스크리닝에 소요되는 시간과 비용을 줄일 수 있는 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝된 IBMX 또는 카페인을 비롯한 PDE(포스포디에스테라제)억제제를 백모 방지제로 사용하면 탁월한 백모 방지 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 세포 내에서 IBMX가 cAMP를 분해하는 PDE를 억제함으로써 세포내의 cAMP 레벨을 올리는 메커니즘을 나타내는 그림이다.
도 2는 세포내의 cAMP 가 MITF 활성을 조절하는 관계를 나타내는 그림이다.
도 3은 pGLuc-Basic의 플라스미드 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 pGLuc-Basic의 MCS 를 나타내는 도면이다.
도 5는 pCMV-GLuc 의 플라스미드 구조를 나타내는 도면이다.
도 6은 pMITF-GLuc의 플라스미드 구조를 나타내는 도면이다.
도 7은 pTyrosinase-GLuc의 플라스미드 구조를 나타내는 도면이다.
도 8은 pTRP2-GLuc의 플라스미드 구조를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 발현벡터 플라스미드들로 형질전환된 세포주들(stable cell lines)에 α-MSH 10nM 및 IBMX 100uM 를 처리한 후 GLuc 분석결과(도 9a), 및 전체 멜라닌 양(도 9b)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 여러가지 PDE 억제제를 처리한 후 형질전환 세포주에서의 MITF 활성화 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 형질전환 세포주들에 MITF siRNA를 처리했을 때, MITF 뿐만 아니라 티로시나제 및 TRP2도 저해됨을 유전자수준(GLuc의 활성, 도 11a), 단백질수준(웨스턴 블롯 결과, 도 11b), 멜라닌 합성수준(도 11c)에서 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 12는 백모 발생이 촉진된 백반증 마우스 모델에 백모 방지 물질을 처리한 후의 마우스 사진(도 12a) 및 모발 내 멜라닌 정량 결과를 나타내는 그래프(도 12b)이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 의한 백모 방지 물질 스크리닝 방법은 백모 방지 후보 물질의 생체 외(in vitro) 효능 평가를 위한 형질전환된 세포주와 생체 내(in vivo) 효능 평가를 위한 백모발생이 촉진된 백반증 모델 마우스의 두 부분으로 구성되어 있다.
더욱 구체적으로는 특정 유전자 발현의 리포터 역할을 할 수 있는 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia Luciferase, 이하 GLuc)의 유전자 앞에 MITF의 프로모터(promoter)를 결합하여 MITF의 발현 변화를 모니터링할 수 있는 플라스미드, Gluc 유전자 앞에 티로시나제의 프로모터를 결합하여 티로시나제의 발현 변화를 모니터링할 수 있는 플라스미드, 그리고 Gluc 유전자 앞에 TRP2의 프로모터를 결합하여 TRP2의 발현 변화를 모니터링할 수 있는 플라스미드들을 제작하고, 이들 각각을 멜라노사이트의 일종인 Melan-a 세포의 염색체안으로 안정적으로 도입시켜서 MITF, 티로시나제, TRP2의 발현 변화를 모니터링할 수 있는 형질 전환 세포주들(이하 MITF-GLuc, Tyrosinase-GLuc, TRP2-GLuc 이라고 명명함)을 확립하였다. 상기 세포주들을 한국세포주 연구재단 에 2007년 6월 8일자로 기탁하여 그 수탁번호(순서대로 KCLRF-BP-00162, KCLRF-BP-00163, KCLRF-BP-00161)를 부여 받았다.
확립된 세포주들에서 각 유전자들의 활성 정도는 생성된 GLuc의 양과 비례하며, 일정한 양의 GLuc 기질(substrate)을 처리하였을 때 방출되는 빛의 양을 루미노미터(Luminometer)로 측정함으로써 각 유전자의 활성 정도를 비교할 수 있다.
GLuc은 기질과 반응하면 특정 파장의 빛을 낸다는 점에서는 기존의 루시퍼라아제들과 같지만, 생성되면 세포 밖으로 배출되어 배양 배지에서 안정하게 존재한다는 차이점이 있다. 따라서 본 발명의 형질전환 세포주들을 이용하면 세포 배양 중에 소량의 배지를 추출하고 기질과 반응시킴으로써 MITF, 티로시나제, TRP2의 발현 변화를 측정할 수 있다. 이 방법은 세포를 파괴해야만 하는 기존의 루시퍼라아제(반디, 레닐라(renilla)의 루시퍼라아제) 실험들과는 완전히 다른 것으로써, 세포의 생장에 영향을 주지 않으므로 원하는 시간에 실시간으로 이들의 발현을 모니터링 할 수 있다. 또한 남아있는 세포들을 이용하여 RNA, 단백질 등의 추출이 가능하므로 MITF, 티로시나제 및 TRP2의 변화를 단백질 및 전체 멜라닌 양의 수준에서도 모니터링할 수 있다.
백반증 마우스(C57bl/6-Mitf mi - vit )는 주령이 증가함에 따라 MITF 유전자에 자발적인 돌연변이가 일어나서 백모가 발생하는 마우스이다. 이 마우스 모델은 목 부위에서 백모 발생이 시작되어 주령이 증가하면 꼬리 부위까지 백모가 발생되는 특징을 지닌다. 약 12주령부터 모발에 멜라닌이 전달되지 못하여 목 부위에서 백모가 발생하여 꼬리 쪽으로 진행되는데, 등 부분(목 ~ 꼬리 전까지)에 완전히 백모가 진행되는 데는 약 30주 정도의 시간이 필요하다. 30주는 백모 방지 물질 스크리닝을 위해서는 너무 긴 시간이므로 본 발명자들은 등의 털을 뽑는 방법(depilation)으로 백모의 발생을 촉진시켰다. 마우스에서 털뽑기는 모낭의 모발성장 주기를 빠르게 돌려서 새로운 모발 성장을 촉진하고, 그에 의해 모낭 멜라노사이트의 MITF의 돌연변이가 촉진되며, 그 결과로 백모의 발생이 촉진된다(Journal of Investigative Dermatology 87:299-304,1986). 본 발명에서는 상기 특징들에 주목하여 백모 발생이 촉진된 백반증 마우스 모델을 확립하였으며, 물질 도포 후 자라난 모발 내의 멜라닌 함량을 측정하여 물질의 백모 방지 효능을 정량적으로 평가하였다.
한편, 본 발명자들은 본 발명의 스크리닝 방법으로 IBMX 또는 카페인(caffeine)을 비롯한 PDE(포스포디에스테라제)억제제가 백모 방지 효능을 가진다는 사실을 최초로 밝혀내었다. 특히 IBMX는 비특이적인 PDE(Phosphodiesterase) 억제제로서, 도 1에서 설명되는 바와 같이 세포내의 cAMP를 분해하는 역할을 하는 PDE를 억제함으로써 세포내의 cAMP 레벨을 올리는 역할을 한다. 본 발명자들은 IBMX를 비롯한 PDE(포스포디에스테라제) 억제제에 의해서 세포내의 cAMP 레벨이 증가하면 도 2에서 나타나는 cAMP-MITF 조절관계(up-regulation)와 같이 MITF의 활성도 증가할 것이라는 가설을 세우고, 본 발명의 스크리닝 방법으로 백모 방지 효능을 확인하였다.
도 2의 분홍색으로 표시된 것은 cAMP⇒PKA & p70⇒⇒⇒MAPK 경로로서, 인산화를 통한 MITF의 활성화를 나타내고, 파란색으로 표시된 것은 cAMP⇒⇒⇒CREB 경로로서, MITF 전사 활성화를 나타낸다. 즉, "IBMX⇒cAMP 레벨 증가⇒MITF 단백질 양 및 활성 증가"가 된다.
이하, 하기 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[시험예 1] MITF, 티로시나제, TRP-2 발현량 변화 관찰용 플라스미드의 구축
pGLuc-basic(New England Biolab, 이하 NEB)의 MCS(multi-cloning site)에 게노믹 DNA에서 PCR로 추출한 각 유전자의 프로모터를 결합하는 방법으로 각각의 플라스미드들을 제작하였다. 이 작업은 뉴로제넥스(Neurogenex Co. Ltd)에 의뢰하여 진행되었으며 구축된 플라스미드들의 세부적인 정보는 다음과 같다.
1)pGluc-Basic: 특정한 프로모터를 갖고 있지 않는 GLuc을 발현하는 플라스미드로서, 다른 플라스미드들의 제작을 위한 모벡터(mother vector)로 사용하였다. NEB에서 구입하였다. 플라스미드 구조는 도 3과 같고, pGLuc-Basic의 MCS 는 도 4의 파란 화살표 표시부분이다.
2)pCMV-GLuc: 항상 발현되는 유니버설 프로모터(universal promoter)인 CMV 프로모터를 갖고 있는 GLuc 발현 플라스미드로서, 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. NEB에서 구입하였다. 플라스미드 구조는 도 5와 같다.
3)pMITF-GLuc : pGLuc-Basic의 MCS에 있는 EcoRI과 BamHI 사이트를 이용하여 MITF 프로모터 (GenBank seq. ID: D82874)의 PCR 산물을 라이게이션(ligation)하는 방법으로 제작하였다. PCR 은 EcoRI/MITF-정방향 프라이머로 5'-GGC GAA TTC CTG CAG TCG GAA GTG GCA GTT A-3' (서열번호 1), BamHI/MITF-역방향 프라이머로 5'-GGC GGA TCC AGA CTA TCC CTC CCT CTA CTT TC-3' (서열번호 2)를 사용하여 502bp의 산물을 얻었다. 플라스미드 구조는 도 6과 같다.
4)pTyrosinase-GLuc: pGLuc-Basic의 MCS에 있는 EcoRI과 BamHI 사이트를 이용하여 티로시나제(Tyrosinase) 프로모터 (GenBank seq. ID: M27160)의 PCR 산물을 라이게이션(ligation)하는 방법으로 제작하였다. PCR 은 EcoRI/Tyrosinase-정방향 프라이머로 5'-GGC GAA TTC CTC TCA TTT GCA AGG TCA AAT CA-3' (서열번호 3), BamHI/Tyrosinase-역방향 프라이머로 5'-GGC GGA TCC TTC CTC TAG TCC TCA CAA GGT C-3' (서열번호 4) 를 사용하여 398bp의 산물을 얻었다. 플라스미드 구조는 도 7과 같다.
5)pTRP2-GLuc: pGLuc-Basic의 MCS에 있는 EcoRI과 BamHI 사이트를 이용하여 TRP2 프로모터 (GenBank seq. ID: L38953)의 PCR 산물을 라이게이션(ligation)하는 방법으로 제작하였다. PCR 은 EcoRI/TRP2-정방향 프라이머로 5'-GGC GAA TTC GAG CTC ACT GCA TCT ACT GAC T-3' (서열번호 5), BamHI/TRP2-역방향 프라이머로 5'-GGC GGA TCC GAG CTC TCT CTC TCT CTT ACT TT-3' (서열번호 6)를 사용하여 701bp의 산물을 얻었다. 플라스미드 구조는 도 8과 같다.
[시험예 2] Melan-a 세포를 이용한 형질전환 세포주(stable cell line) 구축
일반적으로, 형질전환 세포주를 구축하는 과정은 사용할 선택약물(selection drug)의 종류와 농도를 결정하는 단계; 세포 내부로 플라스미드 도입(transfection) 및 일차적으로 콜로니 선택하는 단계; 그리고 최종 콜로니를 선택하는 단계로 나뉜다. 본 발명에서는 멜라노사이트의 일종인 Melan-a세포와 선택약물로서 네오마이신인 G418(Gibco)을 사용하여 형질전환 세포주를 구축하였다.
[2-1] Melan-a 세포의 배양 및 선택약물의 적정 농도 결정
Melan-a 세포는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, 이하 FBS), 100unit/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 0.1uM TPA(Sigma)가 들어 있는 RPMI 1640 배지에서 37℃, 10% CO2 조건으로 배양하였다. 일반적으로 형질전환 세포주 제작을 위한 선택약물의 농도는, 2주간의 약물 처리 후에 약 80~90%의 세포가 사멸하는 농도로 결정한다. Melan-a 세포에 G418을 처리하고 관찰한 결과 400ug/ml의 농도면 2주 정도에 약 90% 정도의 세포가 사멸하였다. 이를 근거로 G418의 농도는 400ug/ml로 결정하였다.
[2-2] 플라스미드 도입(transfection)과 G418에 의한 일차 콜로니 선택
플라스미드 도입은 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Lipo2000, Invitrogen)을 이용하고 제조사가 제공하는 실험 방법을 참조하여 진행하였다. 간략히 설명하면 Melan-a 세포를 6 웰에 2x105 셀/웰의 농도로 분주하고 인큐베이터에서 하루 밤 동안 배양한다. Opti-MEM(Gibco)에 1ug의 플라스미드와 2ul의 Lipo2000을 섞어 주어 DNA-Lipo 복합체(complex)를 형성시킨 후, 세포 위에 뿌려주는 방식으로 세포 내에 플라스미드를 도입시켰다. 단, 트랜스펙션의 효율성을 높이기 위해서 세포 배지를 완전히 제거하고 상기 Opti-DNA-Lipo 혼합물을 뿌려주는 방법을 사용했고, 4~6시간 후에 PBS로 두 번 세척하고 원래의 배양 배지로 교체하여 인큐베이터에서 하루 밤 동안 배양하였다. 플라스미드를 도입시키고 약 24시간 정도 경과했을 때 배지에 G418을 400ug/ml의 농도로 처리하고, 3일에 한번씩 배지를 갈아주어서 플라스미드가 도입되지 않은 세포들의 사멸을 유도한다. 약 2주 정도의 기간이 지나면 살아남은 세포들이 성장/분열하여 콜로니를 형성한 것이 관찰되고, 트립신을 이용해서 각각의 콜로니들을 48 웰 디쉬로 옮겨서 배양한다. 이후 배양 과정에서는 항상 400ug/ml의 농도의 G418이 첨가된 배지를 사용한다.
[2-3] 최종 콜로니 선택 및 백모 방지 후보 물질 처리
일차 선택된 콜로니들이 성장해서 디쉬 면적의 60% 정도를 차지하면, 배지에서 GLuc값을 측정해서 GLuc값이 나타나지 않는 콜로니들은 폐기하고, 나머지 콜로니들을 GLuc값의 강도에 따라 강/중/약으로 분리한 후 계속 배양한다.
이렇게 분리된 콜로니들에게 멜라닌 합성을 증가시킨다고 알려져 있는 α-MSH(α-멜라노사이트 자극 호르몬, α-Melanocyte Stimulating Hormone, Sigma)와 IBMX(3-isobutyl-1-methyl-xanthine, Sigma)를 처리하여 원래의 Melan-a와 유사한 특성을 보이는 콜로니들만을 최종 선택, 적합하지 않은 콜로니들은 폐기한다.
이상의 과정을 통해서 선택된 콜로니들은 13cm T-flask까지 계속 스케일업(scale-up)해서 배양하고, 각 단계마다 GLuc 값을 측정하며 세포의 특성이 변하는지를 확인하였다. 세포에 대한 검증이 끝나면 G418의 농도를 100ug/ml로 낮추어 배양하며 백모 방지 후보 물질 처리 실험에 사용한다. 100ug/ml의 농도에서도 세포의 특성이나 동질성은 손상되지 않는다. IBMX 또는 카페인(caffeine)을 비롯한 PDE(포스포디에스테라제) 억제제에 의해서 세포내의 cAMP 레벨이 증가하면 MITF의 활성도 증가할 것이라는 가설 하에 백모 방지 후보 물질로 여러 가지 PDE(포스포디에스테라제) 억제제를 사용하였다. PDE 억제제로는 비특이적(non-selective) PDE 억제제로서, IBMX; 카페인(Caffeine); 테오필린(Theophylline); 및 펜톡시필린(Pentoxifylline), 특이적(selective) PDE 억제제로서, PDE1 특이적 억제제인 8-메톡시메틸-3-이소부틸-1-메틸잔틴(이하 8-Meth-OH); PDE2 특이적 억제제인 EHNA,HCl; PDE3 특이적 억제제인 콰지논(Quazinone); PDE4 특이적 억제제인 Ro-20-1724; 및 PDE5 특이적 억제제인 자프리나스트(Zaprinast) 등이 있다. 본 시험예에서는 IBMX 및 카페인(Caffeine)을 Sigma에서 구입하여 100uM의 농도로 사용하였다.
[시험예 3] GLuc(가우시아 루시퍼라제, Gaussian Luciferase) 분석
백모 방지 후보 물질 처리 후 GLuc의 양을 정량하기 위해서는 세포가 자라고 있는 상태에서 소량의 배지만 측정 플레이트로 옮겨 기질과 반응 시킴으로써 GLuc 양의 변화를 측정할 수 있다. 구체적으로는 세포 배양 접시에서 소량의 배지를 따서 측정 플레이트로 옮긴 후, 이 배지에 1X GLuc asssy working solution(NEB)을 4:1의 비율로 넣고 루미노미터를 이용해서 470nM에서 발생하는 빛의 양을 측정하였다.
상기 형질전환된 세포주들(stable cell lines) 에 α-MSH 10nM 및 IBMX 100uM 를 처리하고 24, 48시간에 GLuc 분석을 실시하였다. 도 9는 본 발명에서 구축된 형질전환 세포주에서의 MITF, 티로시나제, TRP2의 발현에 대한 GLuc 분석 결과(도 9a)가 처리 48시간 후의 형질전환 세포주들의 멜라닌 합성량(도 9b)과 비례함을 보여준다.
도 9a의 첫번째 그래프에서 α-MSH 24시간 처리한 것보다 48시간 처리한 것이 더 활성이 낮은 이유는 α-MSH(α-Melanocyte Stimulating Hormone)는 단백질이기 때문에 배지 내에서 서서히 분해/변성되기 때문이다. 반면 IBMX는 합성된 케미칼이기 때문에 48시간까지 효능이 지속된다.
도 10은 상기 시험예 2에서 설명한 여러가지 PDE 억제제를 처리한 후 형질전환 세포주에서의 MITF 활성화 정도를 측정한 결과이다. 도 10에 나타난 바와 같이, PDE 억제제들은 세포내의 cAMP 레벨을 증가시켜 MITF의 활성도 증가시켰다.
[시험예 4] MITF siRNA를 이용한 유전자 발현 저해 실험
MITF 유전자의 발현을 저해 하여, MITF 와 티로시나제, TRP2 의 관계를 알아보기 위하여 siRNA(small interferencing RNA)를 합성하였으며, 각각의 염기 서열은 아래와 같다(Bioneer).
센스: CCA GCA GCU UCA AAA ACA AGC AGC CAG (서열번호 7)
안티센스: GGC UGC UUG UUU UUG AAG CUC CUG GAU(서열번호 8)
siRNA는 HiPerFect Transfection Reagent(Qiagen)를 사용하여 세포 내부로 도입하였으며, 제조사가 제공하는 실험 방법을 따라 진행하였다.
상기 구축된 형질전환 세포주를 6 웰 플레이트에 웰당 부피는 2.3ml, 세포수는 1x105 이 되게 분주한다. 다음날 세럼이 없는 배양 배지 100ul에 siRNA 37.5ng 을 희석하여 최종 농도가 5nM이 되게 한 후, 여기에 hiPerFect reagent 3ul를 넣고 상온에서 약 5-10분 동안 반응시켜 siRNA 트랜스펙션 복합체를 형성시킨다. 이렇게 만들어진 트랜스펙션 복합체를 세포에 떨어뜨린 후 부드럽게 플레이트를 흔들어 주고 인큐베이터에서 배양한다.
siRNA 도입 3일 후에 세포를 PBS로 두 번 세척하고 라이시스 버퍼로 세포를 파괴한다. MITF 유전자의 발현 저해정도를 측정하기 위하여, GLuc의 활성을 측정하고, 멜라닌 펠렛은 1N NaOH를 이용하여 녹인 후 404 nm에서 흡광도를 측정해서 전체적인 멜라닌양을 측정하였으며, 상층액은 Lowry 방법을 이용하여 정량한 후에 웨스턴 블롯을 수행하였다. MITF, 티로시나제(α-PEP7), TRP2(α-PEP8) 항체는 모두 calbiochem제품을 사용하였으며, MITF는 1:500으로 티로시나제 및 TRP2는 1:1000으로 희석하여 사용하였다.
도 11은 형질전환 세포주들에 MITF siRNA를 처리했을 때, MITF 뿐만 아니라 티로시나제 및 TRP2도 저해됨을 유전자수준(GLuc의 활성), 단백질수준(웨스턴 블롯 결과), 멜라닌 합성수준에서 동시에 보여준다. 도 11a 및 도 11b는 MITF siRNA 처리에 의해서 티로시나제 및 TRP2의 발현이 유전자와 단백질 수준에서 모두 저해됨을 보여주고 있다. 도 11c는 MITF siRNA에 의해서 멜라닌 합성이 저해됨을 보여준다. 상기 결과는 MITF가 멜라노사이트 활성의 주 조절자로서 중요하다는 사실을 다시 한번 확인시켜주었다.
[시험예 5] 백모발생이 촉진된 백반증 마우스를 이용한 생체 내 백모 방지 효능 평가
백반증 마우스(C57bl/6-Mitf mi - vit )는 미국의 The Jackson Lab에서 구입하여 사용하였다. 상기 백모발생이 촉진된 마우스를 이용한 백모 방지 물질 스크리닝 방법은 다음과 같다. 12주령된 마우스의 등쪽 털을 depilation으로 제거한다. 단, 털을 제거하는 부위의 넓이는 각 개체마다 동일하게 조절한다. 털을 뽑은 다음날부터 하루에 두 번씩 백모 방지 후보 물질들을 털을 뽑은 부위에 발라준다. 약 3주가 지난 후 후보 물질들 간의 백모 방지 효능 차이가 육안으로 식별되면, 새로 자라난 털들을 수집하고 모발 내 멜라닌 양을 측정한다. 모발 내 멜라닌 양은 단백질 가수분해 효소인 에스페라제(Esperase, Novozyme)을 이용하여 측정한다. 버퍼(50mM Tris-HCl, 5mM DTT, pH 9.3)에 에스페라제를 1NPU/ml의 농도가 되게 녹여서 반응버퍼를 제조한다. 반응버퍼 1ml에 마우스 모발 5mg을 넣고 37℃에서 1,000rpm의 속도로 흔들어 주면서 13시간 동안 반응 시킨 후, 순간적인 원심 분리로 모발과 반응액을 분리한다. 이렇게 얻어진 반응액을 96 웰플레이트에 담고, 405nM 파장에서 흡광도를 측정하면 반응액 내의 멜라닌 양을 측정할 수 있다.
도 12는 백모 발생이 촉진된 백반증 마우스 모델에 백모 방지 물질을 처리하였을 경우, 그 효능을 육안 관찰과 모발 내 멜라닌 정량을 통해서 측정한 결과를 보여주는 사진 및 그래프이다. 도 12a는 백모 방지 후보 물질을 3주간 도포하였을 때의 자라난 모발의 모습을 촬영한 사진이고, 도 12b는 자라난 모발의 멜라닌 양을 측정한 그래프이다. 실험의 vehicle로는 EtOH:1,3-BG:DW = 3:2:5(부피비)의 혼합물, 백모 방지 후보 물질로는 형질전환 세포주를 통한 스크리닝에서 가장 뛰어난 활성 증진 효능을 보여준 IBMX를 사용하였고, 실험의 양성 대조군(C57CTL)으로는 검은털을 가진 C57bl/6 마우스를 사용하였다.
하기에 본 발명의 백모방지용 조성물의 제형예를 설명하나, 이는 발명을 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 헤어 토닉
성분 중량비(%)
에탄올 50
멘톨 0.02
글리세린 3
살리실산 0.05
IBMX 0.1 ~ 5
향료 및 색소 적당량
정제수 잔액 (to 100)
[제형예 2] 헤어 로션
성분 중량비(%)
세토스테아릴알코올 2.0
EDTA 2Na 0.2
히드록시에틸셀룰로오즈 0.5
미네랄오일 5.0
IBMX 0.1 ~ 5
방부제 적당량
향료 및 색소 적당량
정제수 잔액 (to 100)
[제형예 3] 모발 영양화장수
성분 중량비(%)
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 0.7
미네랄 오일 10.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
IBMX 0.1 ~ 5
방부제 적당량
향료 및 색소 적당량
정제수 잔액 (to 100)
[제형예 4] 헤어샴푸
성분 중량%
정제수 잔액 (To 100)
IBMX 0.1 ~ 5
소디윰라우릴설파이트 36.0
코카미도프로필베타인 8.0
팔미티딘말레이트 2.0
글라이콜스테아레이트 1.5
폴리쿼터니윰 10 0.5
사이트릭애씨드 0.1
글리세린 2.0
방부제, 색소 및 향료 적량
[제형예 5] 헤어린스 및 트리트먼트
성분 중량%
정제수 잔액 (To 100)
IBMX 0.1 ~ 5
프로필렌글라이콜 2.0
세틸트리메칠암모늄클로라이드 1.0
세틸알코올 3.0
스테아릴알코올 3.0
미네랄오일 0.5
사이트릭애씨드 0.2
폴리디메칠실록산 1.0
방부제, 색소 및 향료 적량
한국세포주연구재단 KCLRFBP00161 20070608 한국세포주연구재단 KCLRFBP00162 20070608 한국세포주연구재단 KCLRFBP00163 20070608
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 티로시나제 연관 단백질 2(tyrosinase-related protein 2, TRP2) 프로모터;
    가우시아 루시퍼라제 유전자(GLuc); 및
    네오마이신 저항성 유전자(NeoR) 및 암피실린 저항성 유전자(AmpR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pTRP2-GLuc로 형질전환된 Melan-a 멜라노사이트 세포주 TRP2-GLuc (KCLRF-BP-00161).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터 pTRP2-GLuc는 도 6의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 발현벡터 pTRP2-GLuc로 형질전환된 Melan-a 멜라노사이트 세포주 TRP2-GLuc (KCLRF-BP-00161).


  3. 삭제
  4. 제1항의 형질전환 세포주에 백모방지 후보물질을 처리하고 배지에서 배양시키는 단계;
    상기 배지에 존재하는 GLuc의 생성량을 측정하는 단계;
    등의 털을 뽑아 백모발생이 촉진된 백반증 마우스의 등에 상기 백모방지 후보물질을 도포하는 단계; 및
    상기 백반증 마우스의 등에서 새로 자라난 털로부터 멜라닌의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백모 방지 물질 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 GLuc의 생성량을 측정하는 단계는, 세포를 파괴하지 않고 배지만을 측정플레이트에 옮겨서 상기 배지 내에 있는 GLuc을 기질과 반응시켜서 방출되는 빛의 양을 루미노미터로 측정하는 것임을 특징으로 하는 백모 방지 물질 스크리닝 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 스크리닝 방법은 상기 배지에 존재하는 GLuc의 생성량을 측정하는 단계 이후에, 상기 배양된 형질전환 세포주로부터 MITF, 티로시나제, 및 TRP2 단백질의 양을 정량하는 단계; 및
    상기 배양된 형질전환 세포주로부터 전체 멜라닌 양을 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백모 방지 물질 스크리닝 방법.
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