KR20110068061A

KR20110068061A - 티로시나제의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110068061A
Application number: KR1020090124889A
Authority: KR
Inventors: 홍재화; 심성보; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2011-06-22
Also published as: KR101207561B1

Abstract

본 발명은 티로시나제의 발현을 저해하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 티로시나제의 발현을 저해하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 화장료 조성물을 피부에 적용하는 화장방법에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 피부 미백 효과가 우수할 뿐만 아니라, 이를 피부에 적용할 때 고용체 퍼포레이터(SSPP) 시스템 제형을 사용할 경우 자극 없이, 효과 높은 농도로 안정하게 침투시키는 효능이 있다.

siRNA, 올리고뉴클레오티드, 피부미백, 티로시나제 활성억제, 고용체 퍼포레이터, 마이크로 니들.

Description

티로시나제의 발현을 저해하는 ｓｉＲＮＡ 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물{siRNA oligonucleotide which inhibits Tryrosinase expression and Cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 티로시나제의 발현을 저해하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

색을 결정하는 색소에는 멜라닌, 헤모글로빈, 카로티노이드 등이 있으며, 피부, 모발 및 눈의 다양한 색깔이 이들 색소에 의해 결정된다. 이중 피부의 색을 결정하는 가장 중요한 색소는 멜라닌으로, 사람의 피부색은 유전적으로 엄격히 계획되고 조절되는 일련의 멜라닌 생합성 과정에 의해 결정된다. 그러나 자외선이나 화학 물질 등의 환경적 요인, 또는 스트레스나 피로 등의 생리적 요인에 의해 멜라닌이 과량 합성되고 축적되면 기미, 주근깨 등을 유발하게 된다.

멜라닌 색소는 멜라노사이트 (melanocyte)에서 생성되며, 이것은 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서 태양으로부터 조사되는 자외선에 의한 피부 손상 저해에 중요한 역할을 담당한다.

멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나아제 (tyrosinase)라는 효소의 작용에 의해 제조된다.

티로시나아제는 색소 세포인 멜라노사이트 내에서 배타적으로 발견된다. 멜라노사이트는 표피의 기부 층 및 모근에 위치한다. 멜라닌 색소는 멜라노솜 (melanosome)이라는 멜라노사이트-특이 기관에서 생성되어 침적되고, 그 후 멜라노사이트로부터 주위의 케라티노사이트 (keratinocyte)로 운반되어 피부 표피 또는 모공을 통해 널리 퍼진다.

티로시나아제는 멜라노솜에 있는 구리-결합 막 관통 당단백질로서, 티로신 히드록시화 및 뒤이은 산화를 촉매하기 때문에 멜라닌 합성에 있어서 주요한 속도 한계 효소 (rate limiting enzyme)가 된다. 티로시나아제가 단독으로 비-멜라닌 생성 세포로 하여금 멜라닌색소를 생성하도록 할 수 있는지에 관한 트랜스펙션 실험이 수행되었고 (Bouchard, B. et al., J. Exp. Med. 169:2029-2042(1989)); 인간 및 쥐의 티로시나아제 유전자의 클로닝을 통해 알비니즘을 초래하는 많은 돌연 변이가 매핑되었다 (King, R. A., Pigmentation and Pigmentary Disorders, Levine, N., (ed.), CRC Press, Boca Raton. Fla., 297-336(1993)).

멜라닌 생합성에 관여하는 몇몇 다른 효소가 알려져 있는데, TRP 1 (tyrosinase related protein 1) 및 TRP 2 (tyrosinase related protein 2)가 그것이다 (Cohen, T., et al. Nucleic Acids Res. 18:2807-2808(1990)); Jackson, I. J., et al., EMBO J., 11:327-535(1992)).

이들의 이름에서 알 수 있듯이, TRPs는 구조적으로 티로시나아제와 관련된 다. 특히, 이들의 유전자는 구조 및 기능에서 중요한 구리 결합 자리 및 시스테인-풍부 도메인 (cysteine-rich domains)을 모두 갖는다 (Hearing, V. J. and King, R. A., Pigmentation and Pigmentary Disorders, Levine, N., (ed.), CRC Press, Boca Raton. Fla., 3-32(1993)). 상기 TRPs의 상세한 기능은 알려져 있지 않지만, 최근 연구에 따르면 티로시나아제, TRP 1 및 TRP 2는 인 비보에서 상호 작용하여 복합체를 형성하고, 이들 복합체 내에서 티로시나아제의 활성이 감소되며, 따라서 상기 TRPs는 티로시나아제 활성의 억제자로 작용할 것으로 추측되고 있다 (Orlow, S. J., et al., J. Invest. Dermatol., 103:196-201(1994)).

멜라닌은 티로시나아제, TRP 1 및 TRP 2에 의해 아미노산의 일종인 티로신 (tyrosine)으로부터 도파 (DOPA), 도파퀴논 (dopaquinone)으로 전환된 후 비효소적인 산화 반응을 거쳐 생합성 된다. 생성된 멜라닌은 멜라노솜을 통해 케라티노사이트로 옮겨지고, 상기 케라티노사이트에서 28일간의 각화 과정 (keratinization)을 거쳐 피부 표면으로 나온다.

그러나 각화 과정에서 멜라닌이 어떤 요인에 의해 과량 생성되고, 각화에 의해 멜라닌 색소가 완전히 없어지지 않으면 색소 침착 (pigmentation)이 일어나게 된다.

한편, 미백 화장료 조성물에 사용되는 미백제의 작용은 여러 가지 방법으로 나타난다.

첫째, 자외선을 차단하여 멜라닌 생성 원인을 제거하는 방법으로서, 이 방법 은 광산란제나 광차단제를 사용한다. 둘째, 티로시나아제의 생합성을 억제하는 방법으로서, 이 방법은 신호 전달 과정 (signal transduction)을 차단하거나 유전자 발현을 억제하는 물질을 사용한다. 셋째, 티로시나아제의 기능을 저해하는 방법으로서, 이 방법은 상기 효소의 기질과 경쟁적으로 결합하는 물질 또는 상기 효소에 결합하여 그 구조를 변경시킴으로써 효소의 활성을 잃게 하는 물질을 사용한다. 넷째, 멜라노사이트에 특이적인 독성을 가진 물질을 사용하는 방법이다.

멜라닌형성 효소 중에서 티로시나제는 멜라닌 합성의 처음 두 단계를 촉매하는 중요 효소이다. 티로시나제의 동종접합 변이는 멜라닌 합성이 전혀 일어나지 않는 것을 특징으로 하는 눈 피부 백색증 타입 I 을 유발한다. (Toyofuku K, Wada　I, Spritz RA, Hearing VJ, The molecular basis of oculocutaneous albinism type 1 (OCA1): sorting failure and degradation of mutant tyrosinases results in a lack of pigmentation. Biochem J. 2001; 355: 259-269).

멜라닌형성의 과대한 증가로 인한 과색소침착의 질환은 티로시나제 활성을 억제함으로 예방할 수 있으며, 피부 미백 화합물에 포함되어 있는 페놀/카테콜은 티로시나제를 억제하지만 멜라닌세포에 대해 세포독성을 가지며 이는 피부의 영구적 탈색을 유발할 수 있다.

따라서, 인간에 적용함에 있어 매우 효과적이며 양호한 용인성을 나타내는 신규 티로시나제-억제 화합물 및 이를 이용한 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.

이러한 방법으로서, 화학적 치료방법과 같이 안티센스 핵산을 이용하거나, 간섭 RNA로 알려져 있는 방법을 사용하는 것으로 유전자 발현 억제를 가능하게 한다 (Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol.:4:457-67, 2003; Soutcheck J et al. Nature:432:174-8, 2004).

또 다른 예시로서, TRP-1 단백질(WO 01/58918)의 유전자 또는 티로시나제 인산화 과정에 관련된 PKC beta1 단백질 (WO 2005/060536)의 유전자에 직접적으로 연관된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 종래 기술이 제안되었으며 티로시나제 유전자를 표적으로 하는 siRNA의 사용 (WO 2005/060536)이 제시되었다.

인터페론 반응의 촉발 (Sledz CA 등, Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol. 2003; 9:834-9. Katalin Kariko 등, Small Interfering RNAs Mediate Sequence-Independent Gene Suppression and Induce Immune Activation by Signaling through Toll-Like Receptor 31. J.　Immunol. 2004; 172: 6545-6549. Judge AD 등 Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotechnol. 2005; 23:457-62) 및 siRNA의 표적이 아닌 유전자의 발현의 유발 또는 억제 (Jackson 등 Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 2003; 21:635-7)에 관한 두 가지 현상은 매우 바람직하지 않다.

그 이유로, 이중 가닥의 siRNA 중 오로지 안티센스 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드만이 사용예로 기재되어 있으며(예를 들어, 특허 출원 US 2004/0215006), 특히 안티센스 RNA와 유사한 siRNA가 효과적인 여부에 관하여는 증명되지 않았다. 일부 저자는 siRNA 와 같은 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 안티센스 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드가 서로 상이한 표적을 가지며, 안티센스 RNA의 활성을 동일 서열의 siRNA에 외삽할 수 없음을 강조하였다 (Xu 등, Effective small interfering RNAs and phosphorothioate antisense DNAs have different preferences for target sites in the luciferase mRNAs. BBRC 2003; 306:712-717).

한편, 국제출원번호 PCT/US2006/034606은 다양한 모양 및 크기로 제작될 수 있고, 각질층을 뚫어 기질 입자를 신속하게 전달가능한 치료, 예방 및/또는 화장용 화합물 전달용은 고체 약물 용액 퍼포레이터(solid solution perforator;SSPP) 시스템을 공지하고 있다.

이에 본 발명자들은 상술한 종래의 미백 물질이 갖는 문제점을 해결하기 위하여 노력하던 중, 왓슨-크릭 결합에 의해 쌍을 이루는 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 12내지 40개 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 가닥 RNA(dsRNA) 올리고뉴클레오티드인 신규한 서열의 siRNA 올리고뉴클레오티드가 멜라닌을 생성하는 효소인 티로시나제에 특이적으로 반응하여 단백질 발현을 억제함으로 탁월한 피부 미백 효과를 얻을 수 있다는 것을 발명함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 신규한 siRNA 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 피부에 침투시키기 위하여 마이크로 니들에 담아 피부에 적용하였으며, 이러한 신규한 siRNA 올리고뉴클레오티드을 함유하는 조성물을 마이크로 니들에 담아 적용할 경우, 피부 미백효과가 탁월하다.

따라서 본 발명의 목적은 티로시나제 활성을 억제하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 siRNA를 함유하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시 예 및 청구범위에 의해 보다 명 확하게 된다.

본 발명은 티로시나제의 발현을 저해하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 티로시나제의 발현을 저해하는 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 화장료 조성물을 피부에 적용하는 화장방법에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 피부 미백 효과가 우수할 뿐만 아니라, 이를 피부에 적용할 때 고용체 퍼포레이터(SSPP) 시스템 제형을 사용할 경우 자극 없이, 효과 높은 농도로 안정하게 침투시키는 효능이 있다.

본 발명은 티로시나제 활성을 억제하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로, 더 상세하게는 티로시나제 활성을 억제하기 위한 국소 적용 센스 RNA 가닥 및 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하는 짧은 이중나선 RNA 올리고뉴클레오티드 (이하, siRNA)에 관한 것으로, 12 내지 40개의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 단일 나선의 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 서로 염기쌍 결합에 의해 이중 나선을 형성한 것에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어, '짧은 이중나선 RNA 올리고뉴클레오티드', '짧은 이중 나선 RNA', 'siRNA 올리고뉴클레오타이드', 'siRNA(short interfering RNA 또는 small interfering RNA)', 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA ) 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA)는, 서로 교체하여 사용가능하며, 12 내지 40개의 뉴클레오타이드로 구성된 두 개의 짧은 단일 나선의 RNA 올리고뉴클레오티드 서열이 서로 염기쌍 결합에 의해 이중 나선(dsRNA)을 형성한 것을 의미한다.

또한, 용어 '간섭 RNA (RNA interference, 이하 RNAi)'센스 핵산 서열을 가진 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 서열 특이성이 높은 표적 핵산의 메신져 RNA(mRNA)와 결합하여 표적 단백질 발현을 억제하는 것으로, RNAi 과정은 작은 간섭 RNA (small interfering RNA 혹은 siRNA)를 이용함으로써 실현될 수 있다.

상기 siRNA는 이의 센스 서열 내에 상동성이 높고, 특히 표적 mRNA 단편에 대해 동일한 서열을 포함하는 12 내지 40개의 뉴클레오티드로 구성된 dsRNA이다. siRNA가 혈장막을 지나갈 때 세포의 반응이 이 siRNA 및 동일 또는 상동성이 높은 서열을 포함하는 모든 서열의 메신져 RNA를 파괴한다. 따라서 siRNA 서열에 대해 동일한 mRNA는 파괴될 것이며, 이 유전자의 발현은 억제될 것이다. 또한 siRNA는 표적 단백질을 인코딩하는 mRNA의 절단을 수행하게 되고 이는 표적 단백질의 합성을 특이적으로 제한하는 활성을 수행한다. 표적 mRNA의 분해는 dsRNA의 안티센스 가닥이 mRNA에 결합하여 mRNA의 절단을 유도하는 RISC 복합체 (RNA Induced Silencing Complex)의 활성에 의해 진행된다. (Tuschl T. Chem. Biochem. 2001; 2:239-245; Nykanen A & al, Cell 2001; 107:309-321; Dorsett Y. and Tuschl T. Nat Rev Drug Discov. 2004; 3:318-329; Downward J. BMJ. 2004; 328:1245-1248; Shanker P. 등, JAMA 2005; 293:1367-1373 참조).

따라서, 본 발명의 siRNA는 티로시나아제를 인코딩하는 mRNA와 특이적으로 결합하여 mRNA를 절단을 유도하고, 결과적으로 티로시나아제 발현 억제 효과를 수행하도록 설계할 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA는 인간의 티로시나제의 mRNA 서열에 대하여 상동 서열인 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 인간의 티로시나제의 mRNA 서열(GenBank 등록 번호:NM_000372)의 상동 서열인 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명의 siRNA는 각각의 단일가닥이 12 내지 40개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 25개 뉴클레오티드로 이루어진 이중 나선의 RNA 올리고뉴클레오티드 절편이다.

본 발명의 siRNA는 서열번호 1 내지 82로 구성된 군으로부터 선택된 두 가닥의 서열이 서로 상보적인 결합을 통해 이중 가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드이다. 상기 서로 상보적인 결합을 통해 이중 가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 1 - 서열번호 2, 서열번호 3 - 서열번호 4, 서열번호 5 - 서열번호 6, 서열번호 7 - 서열번호 8, 서열번호 9 - 서열번호 10, 서열번호 11 - 서열번호 12, 서열번호 13 - 서 열번호 14, 서열번호 15 - 서열번호 16, 서열번호 17 - 서열번호 18, 서열번호 19 - 서열번호 20, 서열번호 21 - 서열번호 22, 서열번호 23 - 서열번호 24, 서열번호 25 - 서열번호 26, 서열번호 27 - 서열번호 28, 서열번호 29 - 서열번호 30, 서열번호 31 - 서열번호 32, 서열번호 33 - 서열번호 34, 서열번호 35 - 서열번호 36, 서열번호 37 - 서열번호 38, 서열번호 39 - 서열번호 40, 서열번호 41 - 서열번호 42, 서열번호 43 - 서열번호 44, 서열번호 45 - 서열번호 46, 서열번호 47 - 서열번호 48, 서열번호 49 - 서열번호 50, 서열번호 51 - 서열번호 52, 서열번호 53 - 서열번호 54, 서열번호 55 - 서열번호 56, 서열번호 57 - 서열번호 58, 서열번호 59 - 서열번호 60, 서열번호 61 - 서열번호 62, 서열번호 63 - 서열번호 64, 서열번호 65 - 서열번호 66, 서열번호 67 - 서열번호 68, 서열번호 69 - 서열번호 70, 서열번호 71 - 서열번호 72, 서열번호 73 - 서열번호 74, 서열번호 75 - 서열번호 76, 서열번호 77 - 서열번호 78, 서열번호 79 - 서열번호 80, 및 서열번호 81 - 서열번호 82.

이중 가닥인 siRNA 올리고뉴클레오티드는 여러 수동 또는 자동으로 생체내에서 혹은 실험관내 합성 방법에 따라 합성이 가능하다.

실험관내 합성은 화학적 방법과 효소적 방법을 둘 다 사용 가능하며, 선택한 DNA 또는 cDNA 서열 모델을 전사하는 RNA 중합효소 (예를 들면 T3, T7 혹은 SP6)를 사용할 수 있다.

이중 가닥 RNA의 생체내 합성의 방법은 하기의 방법을 참조 할 수 있다:(Sambrook 등 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제2판 (1989), DNA cloning, volume I and II, D.N.　Glover (ed. 1985), oligonucleotide Synthesis, M.J. Gaits (ed. 1984), Nucleic Acid Hybridation, B.D. Hames and S.J.　Higgins (ed. 1984), Transcription and Translation B.D. Hames and S.J. Higgins (ed. 1984), Animal Cell Culture, R.I.　Freshney (ed. 1986), Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986), B. Pertal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.H.　Miller 및 M.P.　Calos, Cold Spring Harbor Laboratory (ed. 1987), Methods in Enzymology, vol.　154, Wu and Grossman, and 155, Wu, Mayer and Walker (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, Scopes (1987), Protein Purification: Principle and Practice, 2nd ed., Springer-Verlag, N.-Y. and Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV, C.D. Weir 및 C.C.　Blackwell (1986)). 또한, 특허 출원 WO 01/36646, WO 01/75164 및 US 2003/0088087에 기재의 합성 방법을 참조할 수 있으며, 문헌 US 2004/014956에 기재된 바와 같이 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 다양하게 변형시킬 수 있다.

몇몇의 기관은 인터넷에서 siRNA 디자인으로 무료로 이용할 수 있는 다양한 툴을 제공한다.

인터넷 주소

Ambion http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_design.html

Dharmacon http://www.dharmacon.com/sidesign/

Qiagen http://www1.qiagen.com/Products/GeneSilencing/

CustomSiRna/siRNADesigner.aspx/

Emboss http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sirna.html

Tuschl Laboratory http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html

The Whitehead http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/

siRNA를 합성하는 회사들은 siRNA의 효율을 높일 수 있는 부분을 디자인한다. 이러한 siRNA는 유효성을 테스트를 통해 검증 될 수 있다.

30 내지 70%의 구아닌 및 시토신으로 구성되는 서열을 가지는 siRNA는 구아닌과 시토신 함량이 높은 서열에 비해 훨씬 효과적인 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA는 30 내지 70%의 구아닌과 시토신으로 이루어진 서열을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 구아닌 및 시토신 함량비가 30 내지 70%이며, 바람직하게는 40 내지 58%이다. 이때, 30% 미만의 경우 서열 비특이적인 결합에 문제가 야기될 수 있으며, 70% 초과의 경우에는 RISC complex를 형성하는데 어려움이 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 siRNA는 2개의 상보적 단일 가닥 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 상기 2개의 상보적 부분은 헤어핀 타입 구조(short hairpin RNA; shRNA)에 의해 한쪽 면에 공유 결합하는데, 이것은 siRNA에 포함되는 현상으로 간주한다. 전체적으로 명세서에서 용어 siRNA는 다르게 표시되지 않는 한 shRNA를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 siRNA는 센스 및/또는 안티센스 RNA 가닥에 추가적으로 2 내지 4개 뉴클레오타이드의 3'오버행 (overhang) 단편을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 표현 "2 내지 4개 뉴클레오타이드의 3' 오버행 단편"은 한 가닥의 3' 원위 말단에 있는 상보적 가닥과 쌍을 이루지 않는 2 내지 4개 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스의 최소한 한 개의 가닥에 존재하는 것으로 이해된다. 3' 오버행 단편에 사용된 뉴클레오타이드는 자연상태의 뉴클레오타이드(리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드), 또는 리보오스의 2' 및 4' 포지션 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 LNA(Locked Nucleic Acid)와 같은 변형된 뉴클레오타이드가 될 수 있다(Soutschek J. et al. Nature. 2004 Nov 11;432(7014):173-8). 또한, 3'오버행 단편은 본 발명에 따른 siRNA의 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA 가닥에 관한 문단에서 기술된 모든 형태의 화학적 변형을 가질 수 있다. 3' 오버행 단편에 대한 바람직한 서열은 T(여기서 T는 데옥시티미딘) 또는 U(여기서 U는 우라실)의 연속적인 서열로 이루어지며, 바람직하게는 T의 연속적인 서열이다. 또한 3'오버행 단편 의 서열 길이는 연속적인 2개의 뉴클레오타이드 염기이며, 바람직하게는 "TT" 또는 "UU"(여기서 U는 우라실)이다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 siRNA의 상보적 가닥 모두는 3' 오버행 단편을 포함한다. 이 경우, 2개의 3' 오버행 단편의 길이와 서열은 동일하거나 다를 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 siRNA의 상보적 가닥 모두는 서열 "TT"를 가진 2개 뉴클레오타이드의 동일한 3' 오버행 단편을 포함할 수 있다. 상기와 같은 3' 오버행 단편은 타겟 서열과의 결합을 방해하지 않으면서, cell conjugation에 유리한 추가구성이 된다.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA 가닥은 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함한다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서, 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-티오, 또는 2'-O-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2', 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-OH 그룹을 대체하는 2'-O-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우, 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N 3 -메틸-유리딘, 2,6-디아미노퓨린(DAP, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시-유리딘(pdU), 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테롤과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로, 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트, 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신(PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형(염기, 당, 골격)은 몰포리노(morpholino) 타입의 변형된 핵산(몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA(펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA는 "분리된 것"이며 이는 자연 상태에서 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 이는 이미 존재하는 siRNA를 화학적 합성, 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 필요로하는 뉴클레오티드의 서열을 증폭, 정제하여 얻을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

티로시나제에 특이적으로 작용하는 siRNA는 일단 침투하면 활성화되며, 침투된 siRNA는 부착된 형광 표지로 측정이 가능하며, 그 활성은 PCR 혹은 단백질 검정(assay)를 통해 확인 가능하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 티로시나제를 특이 적으로 억제하고, 인터페론을 유발하지 않는 siRNA를 선별하였다. 이 때, 본 발명의 siRNA는 RISC와 반응할 수 없도록 변형된 센스 서열을 가져서 인터페론 반응에 관한 부작용을 유발 할 수 없으며, 1nM 이하의 용량으로도 효과가 탁월하다.

매우 바람직하게 1μM 이하의 농도로 존재하며 광범위하게 인체의 표면인 피부와 외피에 적용하기에 적합하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 티로시나아제의 발현을 저해하여 탁월한 피부 미백효과를 달성한다.

본 명세서에서 용어 "미백'은 멜라닌 색소의 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하여 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미한다.

또한, 본 발명은 티로시나아제 활성을 억제하는 siRNA를 함유하는 피부 외용 조성물에 관한 것이다.

여기에서 언급하고 있는 siRNA는 상기 '티로시나제 활성을 억제하는 신규한 siRNA 올리고뉴클레오타이드'에서 기재된 내용과 동일하다.

또한, 여기에서 언급한 피부 외용 조성물은 화장료 조성물, 약학 조성물 및 치료학적 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 피부 외용 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 siRNA 이외 에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 예컨대 보존제, 삼투제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 계면활성제, 리포솜, 증점제, 등 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 피부 외용 조성물은 유효 성분으로서 siRNA 이외에 siRNA 흡착용 불활성 입자를 포함할 수도 있다. 이러한 siRNA 흡착용 불활성 입자로는 ZnO2, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 및 다른 생체고분자 입자, 금 입자, 알륨(수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄), 나노 입자, 인산칼슘, 및 나트륨 벤토나이트, 칼슘 벤토나이트, 나트륨 클로지트 및 카올린과 같은 다른 점토 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 흡착용 불활성 입자는 본 발명의 유효성분인 siRNA와 흡착함으로써, 본 발명의 유효성분인 siRNA를 입자 성질, 크기 및 무게에 의해 침강시키거나, 선택할 수 있게 한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 입자는 과포화상태의 기질로부터 침전되는 siRNA 입자 자신이다. siRNA 입자는 기질 내 siRNA와 다른 용해속도를 나타낼 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운 데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방 족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 피부 외용 조성물은 siRNA을 함유하는 고용체 퍼포레이트(SSPP)의 제형으로 제조되며, 이때 피부 침투력이 가장 우수하여 siRNA의 효과를 극대화시킨다. 본 발명의 더 구체적인 구현예에 따르면, 고용체 퍼포레이트 제형은 본 발명의 siRNA, 가용성 기질 물질 및 불활성 입자를 포함하는 현탁액(서스펜션 겔)으로 제조된다. 제조된 현탁액은 적당한 고용체 퍼포레이트 몰드에 채워진 후 압축 또는 건조를 통하여 제형이 완성된다. 또한 상기 제형은 피부 침투력을 더 증강시키기 위해 원심분리 방법 등의 다양한 제조 방법과 파라미터에 의해 본 발명의 siRNA를 피부와 접촉하는 팁 끝 쪽 또는 표면으로 이동시킬 수 있다.

본 명세서에서 언급한 '고용체 퍼포레이터(solid solution perforator ; 이하 "SSPP")'는 경피 기질 전달의 한 방법으로, 상기 고용체 퍼포레이터에 유효물질을 담아 피부에 적용 시 표피에서 진피로 유효물질이 효과적으로 침투되도록 하는 시스템이며, 정밀가공기, 마이크로-가공기, 또는 레이저-기반 또는 방전 가공을 사 용하여 몰드를 제조할 수 있다. 그 형태로는 예를 들어, 마이크로 니들 등이 포함된다. 유효성분의 추가 적용은 퍼포레이터의 삽입에 의해 만들어진 피부 구멍을 통해 패치 저장소로부터 선택적으로 전달될 수도 있다. 또한 SSPP 시스템은 공지의 기술에 따라 다양한 모양 및 크기로 제조될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 함유 마이크로 니들 조성물은 하기의 방법으로 제조된다. 본 발명의 유효성분인 siRNA를 흡착용 입자 및 기질 물질과 혼합하여 현탁액을 제조한 후, 흡착된 입자를 건조시키고 마이크로 니들 몰드에 충전하여 제작된다. 또한 기질 분말의 과립 형태를 마이크로 니들 몰드 내 입자에 채운 후, 압축과 열을 가하고, 제조된 마이크로 니들을 건조/냉각시켜 몰드로 분리하여 패치 성분으로 사용한다. 본 발명에서, siRNA 함유 현탁액(서스펜션 겔의 혼합물)은 다양한 제조 방법을 사용함으로써, 거의 최소한 하나의 몰드 벽을 가지는 마이크로 니들을 충전하기 위해 침적된다. 쉬링키지의 양이 가득 찬 건조를 위한 몰드와 부분적으로 말린 마이크로 니들을 분리시키는 겔화제 그리고/또는 타임의 성질과 양에 의해 제어된 곳에서, 액체의 부분은 ( 즉, 증착 그리고/또는 확산에 의해 ) 혼합물로부터 벗어나게 허용됨으로써 몰드에 있는 혼합물이 전체적인 부피에서 수축되고 최소한 하나의 몰드 벽으로부터 바꾸어놓게 된다. 이 쉬링키지는 마이크로 니들 팁의 각도와 높은 종횡비의 모양을 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, siRNA는 마이크로 니들의 뾰족 단부를 형성하는 부분의 최저 1/4 이하에서 1/3 하측 에서 결집될 것이다. 이렇게 제작된 조성물을 보존하도록 하여 조성물의 전달에 효율적이고 경제적인 방법을 제공하기 때 문에, 기질 함유 입자와 마이크로 니들 말단에 농축된 siRNA은 피부 미백을 위한 전달에 매우 유익하다.

또한, 본 발명의 유효물질인 siRNA가 침투되도록 고용체 퍼포레이터 시스템이 용해 또는 생체 분해되는 기질 물질을 이용할 수도 있다. 이때, 유효물질의 침투를 더 효과적으로 수행하게 하기 위하여 친수성 기질보다는 소수성 기질을 사용할 수도 있다.

본 발명에서, 고용체 퍼포레이트(SSPP)의 적당한 기질 물질로는 카르복실메틸셀룰로오스나트륨(SCMC), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 말토덱스트린, 폴리아크릴산, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리펩티드, 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 히드록시에틸 셀룰로오스(HEC), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 덱스트린, 덱스트란, 단당류 및 다당류, 폴리알코올, 젤라틴, 아라비아 고무, 알기네이트, 키토산, 사이클로덱스트린 및 다른 수용성 천연 및 합성 중합체, 또는 상기의 조합을 포함하는 중합체 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 고용체 퍼포레이트 제형은 상기 siRNA, 가용성 기질 물질 및 불활성 입자 이외에 당 유도체와 같은 탄수화물 유도체를 더 포함할 수도 있으며, 트레할로스, 글루코오스, 말토오스, 락토오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락툴로오스, 프룩토오스, 투라노오스, 멜리토스, 만노오스, 멜레치토오스, 덱스트란, 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이노시톨, 팔라티니트 및 만니톨이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

이외에도, 인산염, 질산염 및 카르복실산염 유리, 염화 칼륨 및 염화 칼슘과 같은 수용성 성분을 단독으로 또는 기질 중합체와 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA를 함유하는 조성물(siRNA 함유 조성물)은 조성물의 총량에 대하여 siRNA 올리고 뉴클레오타이드를 0.1nM 내지 100uM, 바람직하게는 0.1nM 내지 100nM로 함유된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 탁월한 미백 효과가 있는 본 발명의 siRNA를 함유하는 조성물 또한 피부 미백 효과가 탁월하다.

또한, 본 발명은 siRNA를 함유하는 고용체 퍼포레이터 시스템을 피부에 적용하여 피부미백을 달성하는 미용방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 티로시나제에 특이적으로 작용하는 siRNA를 함유하는 고용체 퍼포레이터 시스템을 피부에 적용하는 시간은, 기계적 침투를 가한 후 1분 내지 24시간, 바람직하게는 5분 내지 10시간, 가장 바람직하게는 10분 내지 5시간 동안 실시될 수 있으며, 이 과정동안 비교적 신속하게 본 발명의 유효물질인 siRNA가 침투되도록 고용체 퍼포레이터 시스템이 용해 또는 생체 분해될 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 함유 고용체 퍼포레이터 시스템(예컨 대, 마이크로 니들)은, 바람직하게는 200 내지 300 μm의 깊이로 피부에 적용될 때 피부 침투 효과가 우수하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 함유 조성물(예컨대, siRNA 함유 고용체 퍼포레이터)를 1회 또는 2회 내지 수회 반복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 적용하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용된 고용체 퍼포레이터를 피부에 적용하면 피부 속에 침투하여 모두 흡수된다. 또한 본 발명의 미용방법을 1회 적용 후, 일반적인 화장료 도포방법을 추가로 적용할 수도 있으며, 2회 이상의 적용에서는 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수 및 도포 방법을 다양하게 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화학박피, 기계적 박피술 또는 탈지(defatting) 효과를 가진 하나 이상의 용매의 적용 후 본 발명의 미용방법을 실시하거나, 또는 세정제 거품 제품을 이용한 피부 클렌징 후 본 발명의 미용방법을 실시할 때 미백 효과가 더 탁월하게 나타난다. 따라서, 화학박피, 기계적 박피술 또는 탈지(defatting) 효과를 가진 하나 이상의 용매의 적용, 및 세정제 거품 제품을 이용한 피부 클렌징을 본 발명의 미용방법을 실시하기 전에 전처리하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 티로시나아제 siRNA 검색

염기 서열은 미국 국립생물정보센터(<http://www.ncbi.nim.nih.gov>)에서 검색 가능하며, 공식 심볼(TYR)과 전체 공식 명식으로 tyrosinase (oculocutaneous albinism 1A)로 기재되며 승인번호 NM_000372의 인간 서열을 사용하여 총 2082개의 뉴클레오티드(nucleotide)로 구성된 인간 티로시나아제에 대한 siRNA 서열을 디자인하였다.

siRNA design을 제공하는 인터넷 사이트 중 Ambion(<http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_design.html>)에서 siRNA Target Finer(<http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html>) 서비스를 통해 siRNA를 디자인 하였다. 이 때, 디자인한 DNA 절편 중 타겟 서열의 GC 함량이 30% 내지 75% 사이인 siRNA 서열 41개를 최종 선별 하였다. 선별된 41개의 siRNA는 바이오니아(<http://www.bioneer.co.kr>)에 주문 의뢰하여 제조하였다. 이 때, siRNA 제조를 위하여 티로시나아제에 대한 41개의 타겟 서열에 대한 센스 서열 및 안티센스 서열을 각각 디자인하였으며, 각각의 단일 서열 3'쪽에는 2개의 티민 데옥시뉴클레오타이드를 추가하여 제조하였다. 또한 각각의 단일 서열인 센스 서열과 안티 센스서열을 특이적인 염기쌍 결합에 의하여 이중 나선의 siRNA를 제작하였다. 이때 제작된 siRNA는 3' 말단에 2개의 티민이 추가되어 오버행 구조를 보였다.

인간 티로시나제 유전자 서열 내 siRNA의 위치와 특이 서열.

Target sequence 1: AAGGAAUGCUGUCCACCGUGG(SeqID.83)	Target sequence 22: AAGAUUCAGACCCAGACUCUU(SeqID.104)
Position in gene sequence: 179	Position in gene sequence: 1440
GC content: 57.1%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: GGAAUGCUGUCCACCGUGGtt	Sense strand siRNA: GAUUCAGACCCAGACUCUUtt
Antisense strand siRNA: CCACGGUGGACAGCAUUCCtt	Antisense strand siRNA: AAGAGUCUGGGUCUGAAUCtt

Target sequence 2: AAUGCUGUCCACCGUGGAGCG(SeqID.84)	Target sequence 23: AAGUCCUAUUUGGAACAAGCG(SeqID.105)
Position in gene sequence: 183	Position in gene sequence: 1475
GC content: 61.9%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: UGCUGUCCACCGUGGAGCGtt	Sense strand siRNA: GUCCUAUUUGGAACAAGCGtt
Antisense strand siRNA: CGCUCCACGGUGGACAGCAtt	Antisense strand siRNA: CGCUUGUUCCAAAUAGGACtt

Target sequence 3: AAUAGGACCUGCCAGUGCUCU(SeqID.85)	Target sequence 24: AACAAGCGAGUCGGAUCUGGU(SeqID.106)
Position in gene sequence: 338	Position in gene sequence: 1488
GC content: 52.4%	GC content: 52.4%
Sense strand siRNA: UAGGACCUGCCAGUGCUCUtt	Sense strand siRNA: CAAGCGAGUCGGAUCUGGUtt
Antisense strand siRNA: AGAGCACUGGCAGGUCCUAtt	Antisense strand siRNA: ACCAGAUCCGACUCGCUUGtt

Target sequence 4: AACUUCAUGGGAUUCAACUGU(SeqID.86)	Target sequence 25:AAGCGAGUCGGAUCUGGUCAU(SeqID.107)
Position in gene sequence: 362	Position in gene sequence: 1491
GC content: 38.1%	GC content: 52.4%
Sense strand siRNA: CUUCAUGGGAUUCAACUGUtt	Sense strand siRNA: GCGAGUCGGAUCUGGUCAUtt
Antisense strand siRNA: ACAGUUGAAUCCCAUGAAGtt	Antisense strand siRNA: AUGACCAGAUCCGACUCGCtt

Target sequence 5: AACUGUGGAAACUGCAAGUUU(SeqID.87)	Target sequence 26: AAGAGAAAGCAGCUUCCUGAA(SeqID.108)
Position in gene sequence: 377	Position in gene sequence: 1589
GC content: 38.1%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: CUGUGGAAACUGCAAGUUUtt	Sense strand siRNA: GAGAAAGCAGCUUCCUGAAtt
Antisense strand siRNA: AAACUUGCAGUUUCCACAGtt	Antisense strand siRNA: UUCAGGAAGCUGCUUUCUCtt

Target sequence 6: AAGGCUCCCCUCUUCAGCUGA(SeqID.88)	Target sequence 27: AAGCAGCCACUCCUCAUGGAG(SeqID.109)
Position in gene sequence: 1012	Position in gene sequence: 1613
GC content: 57.1%	GC content: 57.1%
Sense strand siRNA: GGCUCCCCUCUUCAGCUGAtt	Sense strand siRNA: GCAGCCACUCCUCAUGGAGtt
Antisense strand siRNA: UCAGCUGAAGAGGGGAGCCtt	Antisense strand siRNA: CUCCAUGAGGAGUGGCUGCtt

Target sequence 7: AAAUACACUGGAAGGAUUUGC(SeqID.89)	Target sequence 28: AAAGAGGAUUACCACAGCUUG(SeqID.110)
Position in gene sequence: 1105	Position in gene sequence: 1634
GC content: 38.1%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: AUACACUGGAAGGAUUUGCtt	Sense strand siRNA: AGAGGAUUACCACAGCUUGtt
Antisense strand siRNA: GCAAAUCCUUCCAGUGUAUtt	Antisense strand siRNA: CAAGCUGUGGUAAUCCUCUtt

Target sequence 8: AAGGAUUUGCUAGUCCACUUA(SeqID.90)	Target sequence 29:AAGGCUUAGGCAAUAGAGUAG(SeqID.111)
Position in gene sequence: 1116	Position in gene sequence: 1673
GC content: 38.1%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: GGAUUUGCUAGUCCACUUAtt	Sense strand siRNA: GGCUUAGGCAAUAGAGUAGtt
Antisense strand siRNA: UAAGUGGACUAGCAAAUCCtt	Antisense strand siRNA: CUACUCUAUUGCCUAAGCCtt

Target sequence 9: AAAGCAGCAUGCACAAUGCCU(SeqID.91)	Target sequence 30: AAAGCCUGACCUCACUCUAAC(SeqID.112)
Position in gene sequence: 1158	Position in gene sequence: 1700
GC content: 47.6%	GC content: 47.6%
Sense strand siRNA: AGCAGCAUGCACAAUGCCUtt	Sense strand siRNA: AGCCUGACCUCACUCUAACtt
Antisense strand siRNA: AGGCAUUGUGCAUGCUGCUtt	Antisense strand siRNA: GUUAGAGUGAGGUCAGGCUtt

Target sequence 10: AAUGCCUUGCACAUCUAUAUG(SeqID.92)	Target sequence 31:AACUCAAAGUAAUGUCCAGGU(SeqID.113)
Position in gene sequence: 1172	Position in gene sequence: 1718
GC content: 38.1%	GC content: 38.1%
Sense strand siRNA: UGCCUUGCACAUCUAUAUGtt	Sense strand siRNA: CUCAAAGUAAUGUCCAGGUtt
Antisense strand siRNA: CAUAUAGAUGUGCAAGGCAtt	Antisense strand siRNA: ACCUGGACAUUACUUUGAGtt

Target sequence 11: AAUGGAACAAUGUCCCAGGUA(SeqID.93)	Target sequence 32: AAAGUAAUGUCCAGGUUCCCA(SeqID.114)
Position in gene sequence: 1193	Position in gene sequence: 1723
GC content: 42.9%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: UGGAACAAUGUCCCAGGUAtt	Sense strand siRNA: AGUAAUGUCCAGGUUCCCAtt
Antisense strand siRNA: UACCUGGGACAUUGUUCCAtt	Antisense strand siRNA: UGGGAACCUGGACAUUACUtt

Target sequence 12: AACAAUGUCCCAGGUACAGGG(SeqID.94)	Target sequence 33:AAUGUCCAGGUUCCCAGAGAA(SeqID.115)
Position in gene sequence: 1198	Position in gene sequence: 1728
GC content: 52.4%	GC content: 47.6%
Sense strand siRNA: CAAUGUCCCAGGUACAGGGtt	Sense strand siRNA: UGUCCAGGUUCCCAGAGAAtt
Antisense strand siRNA: CCCUGUACCUGGGACAUUGtt	Antisense strand siRNA: UUCUCUGGGAACCUGGACAtt

Target sequence 13: AAUGUCCCAGGUACAGGGAUC(SeqID.95)	Target sequence 34: AACCUAAUACAAAGUGUAGCC(SeqID.116)
Position in gene sequence: 1201	Position in gene sequence: 1791
GC content: 52.4%	GC content: 38.1%
Sense strand siRNA: UGUCCCAGGUACAGGGAUCtt	Sense strand siRNA: CCUAAUACAAAGUGUAGCCtt
Antisense strand siRNA: GAUCCCUGUACCUGGGACAtt	Antisense strand siRNA: GGCUACACUUUGUAUUAGGtt

Target sequence 14: AACGAUCCUAUCUUCCUUCUU(SeqID.96)	Target sequence 35: AAUACAAAGUGUAGCCUUCUU(SeqID.117)
Position in gene sequence: 1226	Position in gene sequence: 1796
GC content: 38.1%	GC content: 33.3%
Sense strand siRNA: CGAUCCUAUCUUCCUUCUUtt	Sense strand siRNA: UACAAAGUGUAGCCUUCUUtt
Antisense strand siRNA: AAGAAGGAAGAUAGGAUCGtt	Antisense strand siRNA: AAGAAGGCUACACUUUGUAtt

Target sequence 15: AAGGCACCGUCCUCUUCAAGA(SeqID.97)	Target sequence 36: AAAGUGUAGCCUUCUUCCAAC(SeqID.118)
Position in gene sequence: 1288	Position in gene sequence: 1801
GC content: 52.4%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: GGCACCGUCCUCUUCAAGAtt	Sense strand siRNA: AGUGUAGCCUUCUUCCAACtt
Antisense strand siRNA: UCUUGAAGAGGACGGUGCCtt	Antisense strand siRNA: GUUGGAAGAAGGCUACACUtt

Target sequence 16: AAGAAGUUUAUCCAGAAGCCA(SeqID.98)	Target sequence 37: AACUCAGGUAGAACACACCUG(SeqID.119)
Position in gene sequence: 1305	Position in gene sequence: 1819
GC content: 38.1%	GC content: 47.6%
Sense strand siRNA: GAAGUUUAUCCAGAAGCCAtt	Sense strand siRNA: CUCAGGUAGAACACACCUGtt
Antisense strand siRNA: UGGCUUCUGGAUAAACUUCtt	Antisense strand siRNA: CAGGUGUGUUCUACCUGAGtt

Target sequence 17: AAGUUUAUCCAGAAGCCAAUG(SeqID.99)	Target sequence 38: AACACACCUGUCUUUGUCUUG(SeqID.120)
Position in gene sequence: 1308	Position in gene sequence: 1830
GC content: 38.1%	GC content: 42.9%
Sense strand siRNA: GUUUAUCCAGAAGCCAAUGtt	Sense strand siRNA: CACACCUGUCUUUGUCUUGtt
Antisense strand siRNA: CAUUGGCUUCUGGAUAAACtt	Antisense strand siRNA: CAAGACAAAGACAGGUGUGtt

Target sequence 18: AAGCCAAUGCACCCAUUGGAC(SeqID.100)	Target sequence 39: AAGCCCAUAUGUCUAAGGAAA(SeqID.121)
Position in gene sequence: 1320	Position in gene sequence: 1885
GC content: 52.4%	GC content: 38.1%
Sense strand siRNA: GCCAAUGCACCCAUUGGACtt	Sense strand siRNA: GCCCAUAUGUCUAAGGAAAtt
Antisense strand siRNA: GUCCAAUGGGUGCAUUGGCtt	Antisense strand siRNA: UUUCCUUAGACAUAUGGGCtt

Target sequence 19: AAUGCACCCAUUGGACAUAAC(SeqID.101)	Target sequence 40: AAGGAAAGGAUGCUAUUUGGU(SeqID.122)
Position in gene sequence: 1325	Position in gene sequence: 1899
GC content: 42.9%	GC content: 38.1%
Sense strand siRNA: UGCACCCAUUGGACAUAACtt	Sense strand siRNA: GGAAAGGAUGCUAUUUGGUtt
Antisense strand siRNA: GUUAUGUCCAAUGGGUGCAtt	Antisense strand siRNA: ACCAAAUAGCAUCCUUUCCtt

Target sequence 20: AACCGGGAAUCCUACAUGGUU(SeqID.102)	Target sequence 41: AAAGGAUGCUAUUUGGUAAUG(SeqID.123)
Position in gene sequence: 1343	Position in gene sequence: 1903
GC content: 47.6%	GC content: 33.3%
Sense strand siRNA: CCGGGAAUCCUACAUGGUUtt	Sense strand siRNA: AGGAUGCUAUUUGGUAAUGtt
Antisense strand siRNA: AACCAUGUAGGAUUCCCGGtt	Antisense strand siRNA: CAUUACCAAAUAGCAUCCUtt

Target sequence 21: AAAGAUCUGGGCUAUGACUAU(SeqID.103)
Position in gene sequence: 1409
GC content: 38.1%
Sense strand siRNA: AGAUCUGGGCUAUGACUAUtt
Antisense strand siRNA: AUAGUCAUAGCCCAGAUCUtt

실험예 2. 티로시나아제 발현 분석 (Real-Time RT-PCR)

HM3KO 인간 멜라노마 세포주(한국세포주은행)에 siRNA를 형질전환시킨 후 48시간동안 배양하여 TRIzol LS 용액(Invitrogen)을 이용하여 mRNA를 분리하였다. 인간 티로시나제 세포주의 티로시나아제 mRNA의 양을 측정하기 위해 DyNAmo Probe 2-step qRT-PCR kit (Finnzymes)를 사용하였다. 1 μg의 RNA는 안티센스 프라이머, 5'-ggattcaact gtggaaactg caagtttggc-3'(서열번호 124), DyNAmo Probe 2-step qRT-PCR kit을 이용하였고 70℃에서 5분, 4℃에서 5분, 25℃ 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분 동안 처리하였다.

HM3KO 인간 멜라노마 세포주에 특이적으로 결합하는 프라이머와 탐침 서열은 센스 5'-GGCCAATGAAAAATGGATCAACACCCATG-3'(서열번호 125) 안티센스 5'-GGCGTTCCATTGCATAAGTCTGATGGCTC-3'(서열번호 126), 이중 형광 탐침의 서열은 5'-FAM(6-carboxylfluorescein)-TTGCCCCATGAAGCACCAGCTTTTCT-TAMRA(6-carboxyltetramethylrhodamine)-3'(서열번호 127)을 사용하였다. 50℃에서 2분간 전 처리한 후, 90℃에서 15분간 처리한 후, 95℃ 15초 및 62℃ 1분을 한 주기로 하여 총 44회 반복하였다. 결과는 크로모 4TM 연속 형광 검출기(Chromo 4TM continuous fluorescence detector system, Bio-Rad Laboratories, USA)을 이용하여 측정하였으며, 측정 결과는 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다.

실험예 3. 티로시나아제 발현 분석 (Western-blot)

실험예 2에서 티로시나제 mRNA 발현 억제율이 가장 좋은 10종의 siRNA(Target sequence #3, #9, #12, #13, #18, #20, #24, #25, #30, #33)(도 2 참조)를 사용하여(도 2 참조) HM3KO 인간 멜라노마 세포주(한국세포주은행)에 siRNA를 형질전환 시킨 후 48시간 동안 배양하여 수득한 샘플을 12% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)에서 전기영동법으로 분리하였고, 분리된 단백질은 TRANS-BLOT^® SD(Bio-Rad)를 이용하여 니트로셀롤로즈 멤브레인(Hybond™ ECL™, Amersham Biosciences)으로 옮기고 ECL 킷(Amersham Biosciences)으로 분석하였다. 티로시나아제 발현을 확인하기 위해 안티-티로시나아제 안티바디 (1:1,000, Abcam), 단백질 정량을 위해 안티-튜블린 안티바디 (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology)를 1차 안티바디로 사용하고, 페록시다아제가 연결되어 있는 안티-마우스-IgG 안티바디(1:5,000, Sigma)를 2차 안티바디로 사용하였다. 티로시나아제 발현분석의 결과는 도 3에 나타내었다.

실시예 1. 본 발명의 siRNA를 포함하는 마이크로 니들(Microneedle)의 제조

마이크로 니들을 제조시 몰드는 레이저-기반 가공기를 사용하여 제조하였다. 마이크로 니들은 수산화 알루미늄(흡착용 불활성 입자), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 텍스트린, 말토오스, 인산염, 카리복실산염, 염화 마그네슘을 혼합한 후, 실험예 1의 target sequence #13의 siRNA 함유 용액(10 nM의 용액으로 3%)을 첨가하여 siRNA 함유 현탁액을 제조하였다. 상기 현탁액을 건조시켜 마이크로 니들 몰드에 채운 후, 압축과 열을 가하여 마이크로 니들을 제조하였다. 제조된 마이크로 니들은 건조/냉각시켜 몰드에서 분리한 다음 피부 적용 제형으로 사용하였다.

실시예 2. 본 발명의 siRNA를 포함하는 에멀션 제조

실리콘 계면활성제, 폴리올, 지방성 및 당의 에스테르, 지방 알코올 및 당의 에테르, 글리세롤 지방 에스테르, 증류수, 보존제를 강하게 교반하여 에멀션을 제조하였다. 이후 실험예 1의 #13의 siRNA 함유 용액(10 nM의 용액으로 3%)을 첨가하여 만들었다.

실시예 3. 본 발명의 siRNA를 포함하는 양이온성 나노에멀션

PEG-8 리치놀레이트(ricinoleate), 베헤닐트리암모늄 클로라이드, 아보카도유, 호호바유, 시클로펜타메틸실록산, 증류수, 보존제를 매우 강하게 교반하여 오일과 증류수를 분산시켜 에멀션을 제조하였다. 이후 수득한 현탁액을 초고압 균질화기를 사용하여 수차례 균질화시켰다. 이후 실험예 1의 #13의 siRNA 함유 용액(10 nM의 용액으로 3%)을 첨가하여 만들었다.

실험예 4. siRNA를 포함한 제형의 피부 투과도

변형 프란즈 디퓨전 세포(Modified Franz diffusion cell)를 사용하여 상기 실시예 1, 2 및 3으로부터의 약물의 방출량을 구하였다. 4cm²의 적출 피부에 각각의 실시예 1, 2 및 3을 적용하고, 적출 피부를 donor와 receptor phase 사이에 고정시킨 후 receptor phase로는 실험 전 미리 37℃로 가온하여 준비한 pH 5.8 인산완충액에 DEPC (DiethylenePyrocarbonate; RNA분해효소 저해제)를 0.2% 첨가하여 사용하였다. 셀의 부피는 11 mL, 실험 중 온도는 37 ㅁ 0.5℃, 교반 속도는 600rpm으로 일정하게 유지하였다. 2시간 후 마이크로 피펫을 이용하여 1mL씩 정확히 채취하여 DEPC로 10배 희석 (DEPC 9mL + sample 1mL)하여 Spectrophotometer를 nucleic acid mode에 설정하고 260 nm에서 OD값을 측정하였다. RNA의 농도는 측정된 OD값을 기준으로 하여 하기 수학식 1에 따라 결정하였다.

RNA 농도 = (OD₂₆₀ X 40 μg/ml) X 10 (희석배수)

상기 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 siRNA를 마이크로 니들에 포접하여 안정화시키고 침투효율을 높인 실시예 1은, 본 발명의 siRNA를 포함하는 일반 에멀션 제형의 실시예 2 및 본 발명의 siRNA를 포함하는 양이온성 나노 에멀션 제형의 실시예 3에 비해 피부 침투 효율이 월등히 뛰어났다.

실험예 5. 본 발명의 siRNA를 포함한 제형의 피부색 개선 효과

상기 실험예 1에서 제조한 각 화장료(실시예 1, 2 및 3)의 피부결 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 36명의 여성을 대상으로 얼굴의 한쪽 면에는 실시예 1 제품을 사용하고, 다른 쪽 면에는 실시예 2 및 3의 제품을 각각 사용하여 8주 후의 피부결 개선 효과를 Chromameter (Minolta CR-300, Japan)에서 측정한 값을 이용하여 피부색 개선 정도를 평가하였다. 그 결과는 하기 표 2 및 도 6에 표기하였다. 또한 전문가의 육안 평가를 이용하여 피부색 개선 정도도 평가하였다. 그 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.

본 발명의 siRNA를 포함한 화장료 제형의 피부색 개선 효과(기기평가)

	사용 전	4주	8주
실시예 1	61.8	62.7	63.3
실시예 2	61.3	61.9	61.8
실시예 3	61.6	61.8	62.1

본 발명의 siRNA를 포함한 화장료 제형의 피부색 개선 효과(육안평가)

제품	우수	약간	없음	유효율
실시예 1	21	11	4	88.9%
실시예 2	8	8	20	44.4%
실시예 3	18	10	8	77.8%

상기 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 siRNA를 마이크로 니들에 포접하여 안정화시키고 침투효율을 높인 경우인 실시예 1은, 본 발명의 siRNA를 포함하는 일반 에멀션 제형의 실시예 2 및 본 발명의 siRNA를 포함하는 양이온성 나노 에멀션 제형의 실시예 3에 비해 피험자의 피부색 개선 효과가 월등히 뛰어났다.

이상 실험예의 결과들을 종합하자면, 본 발명의 siRNA들은 티로시나제 mRNA의 발현을 억제시키는 능력을 갖고 있고(도 1a-d, 도 2), 그에 따라 티로시나제 단백질 수준의 발현 자체를 낮춰주는 효과를 나타낸다(도 3, 도 4). 또한, 본 발명의siRNA는 일반 에멀션이나 양이온성 나노 에멀션에 포접하기 보다는 마이크로 니들에 포접하여 안정화시킬 때 피부 침투효율(실험예 4)이나 피부색 개선(실험예 5)에 더욱 효능을 잘 나타나게 할 수 있음을 보여주었으며, 본 화장료를 피부에 도포한 대부분의 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a-c는 본 발명의 siRNA를 형질 전환시킨 인간 멜라노마 세포의 티로시나제의 발현율을 나타낸 것이고,

도 2는 도 1a-c의 결과 중 우수한 효과를 나타내는 본 발명의 siRNA의 번호를 다시 요약하여 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 siRNA 형질 전환시킨 인간 멜라노마 세포의 티로시나아제 발현율(Protein/Western Blot)을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 siRNA 형질 전환시킨 인간 멜라노마 세포의 티로시나아제 발현비율(Protein)을 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 siRNA를 포함한 일반 제형, 양이온 제형 및 마이크로 니들제형의 피부 투과도를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 siRNA를 포함한 일반 제형, 양이온 제형 및 마이크로 니들 제형의 피부 개선효과(기기평가)를 그래프로 나타낸 것이다.

<110> COREANA COSMETICS CO., LTD. <120> siRNA oligonucleotide which inhibits Tryrosinase expression and Cosmetic composition comprising the same <130> dp-2009-0194 <160> 127 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 1 ggaaugcugu ccaccgugg 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 2 ccacggugga cagcauucc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 3 ugcuguccac cguggagcg 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 4 cgcuccacgg uggacagca 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 5 uaggaccugc cagugcucu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 6 agagcacugg cagguccua 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 7 cuucauggga uucaacugu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 8 acaguugaau cccaugaag 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 9 cuguggaaac ugcaaguuu 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 10 aaacuugcag uuuccacag 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 11 ggcuccccuc uucagcuga 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 12 ucagcugaag aggggagcc 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 13 auacacugga aggauuugc 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 14 gcaaauccuu ccaguguau 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 15 ggauuugcua guccacuua 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 16 uaaguggacu agcaaaucc 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 17 agcagcaugc acaaugccu 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 18 aggcauugug caugcugcu 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 19 ugccuugcac aucuauaug 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 20 cauauagaug ugcaaggca 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 21 uggaacaaug ucccaggua 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 22 uaccugggac auuguucca 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 23 caauguccca gguacaggg 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 24 cccuguaccu gggacauug 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 25 ugucccaggu acagggauc 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 26 gaucccugua ccugggaca 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 27 cgauccuauc uuccuucuu 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 28 aagaaggaag auaggaucg 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 29 ggcaccgucc ucuucaaga 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 30 ucuugaagag gacggugcc 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 31 gaaguuuauc cagaagcca 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 32 uggcuucugg auaaacuuc 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 33 guuuauccag aagccaaug 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 34 cauuggcuuc uggauaaac 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 35 gccaaugcac ccauuggac 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 36 guccaauggg ugcauuggc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 37 ugcacccauu ggacauaac 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 38 guuaugucca augggugca 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 39 ccgggaaucc uacaugguu 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 40 aaccauguag gauucccgg 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 41 agaucugggc uaugacuau 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 42 auagucauag cccagaucu 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 43 gauucagacc cagacucuu 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 44 aagagucugg gucugaauc 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 45 guccuauuug gaacaagcg 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 46 cgcuuguucc aaauaggac 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 47 caagcgaguc ggaucuggu 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 48 accagauccg acucgcuug 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 49 gcgagucgga ucuggucau 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 50 augaccagau ccgacucgc 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 51 gagaaagcag cuuccugaa 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 52 uucaggaagc ugcuuucuc 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 53 gcagccacuc cucauggag 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 54 cuccaugagg aguggcugc 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 55 agaggauuac cacagcuug 19 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 56 caagcugugg uaauccucu 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 57 ggcuuaggca auagaguag 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 58 cuacucuauu gccuaagcc 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 59 agccugaccu cacucuaac 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 60 guuagaguga ggucaggcu 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 61 cucaaaguaa uguccaggu 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 62 accuggacau uacuuugag 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 63 aguaaugucc agguuccca 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 64 ugggaaccug gacauuacu 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 65 uguccagguu cccagagaa 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 66 uucucuggga accuggaca 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 67 ccuaauacaa aguguagcc 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 68 ggcuacacuu uguauuagg 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 69 uacaaagugu agccuucuu 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 70 aagaaggcua cacuuugua 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 71 aguguagccu ucuuccaac 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 72 guuggaagaa ggcuacacu 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 73 cucagguaga acacaccug 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 74 cagguguguu cuaccugag 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 75 cacaccuguc uuugucuug 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 76 caagacaaag acaggugug 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 77 gcccauaugu cuaaggaaa 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 78 uuuccuuaga cauaugggc 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 79 ggaaaggaug cuauuuggu 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 80 accaaauagc auccuuucc 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 81 aggaugcuau uugguaaug 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 82 cauuaccaaa uagcauccu 19 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 83 aaggaaugcu guccaccgug g 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 84 aaugcugucc accguggagc g 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 85 aauaggaccu gccagugcuc u 21 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 86 aacuucaugg gauucaacug u 21 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 87 aacuguggaa acugcaaguu u 21 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 88 aaggcucccc ucuucagcug a 21 <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 89 aaauacacug gaaggauuug c 21 <210> 90 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 90 aaggauuugc uaguccacuu a 21 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 91 aaagcagcau gcacaaugcc u 21 <210> 92 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 92 aaugccuugc acaucuauau g 21 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 93 aauggaacaa ugucccaggu a 21 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 94 aacaaugucc cagguacagg g 21 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 95 aaugucccag guacagggau c 21 <210> 96 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 96 aacgauccua ucuuccuucu u 21 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 97 aaggcaccgu ccucuucaag a 21 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 98 aagaaguuua uccagaagcc a 21 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 99 aaguuuaucc agaagccaau g 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 100 aagccaaugc acccauugga c 21 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 101 aaugcaccca uuggacauaa c 21 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 102 aaccgggaau ccuacauggu u 21 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 103 aaagaucugg gcuaugacua u 21 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 104 aagauucaga cccagacucu u 21 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 105 aaguccuauu uggaacaagc g 21 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 106 aacaagcgag ucggaucugg u 21 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 107 aagcgagucg gaucugguca u 21 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 108 aagagaaagc agcuuccuga a 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 109 aagcagccac uccucaugga g 21 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 110 aaagaggauu accacagcuu g 21 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 111 aaggcuuagg caauagagua g 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 112 aaagccugac cucacucuaa c 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 113 aacucaaagu aauguccagg u 21 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 114 aaaguaaugu ccagguuccc a 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 115 aauguccagg uucccagaga a 21 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 116 aaccuaauac aaaguguagc c 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 117 aauacaaagu guagccuucu u 21 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 118 aaaguguagc cuucuuccaa c 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 119 aacucaggua gaacacaccu g 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 120 aacacaccug ucuuugucuu g 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 121 aagcccauau gucuaaggaa a 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 122 aaggaaagga ugcuauuugg u 21 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 123 aaaggaugcu auuugguaau g 21 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DyNAmo Probe sense primer <400> 124 ggattcaact gtggaaactg caagtttggc 30 <210> 125 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM3KO sense primer <400> 125 ggccaatgaa aaatggatca acacccatg 29 <210> 126 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HM3KO antisense primer <400> 126 ggcgttccat tgcataagtc tgatggctc 29 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fluorescence probe <400> 127 ttgccccatg aagcaccagc ttttct 26

Claims

서열번호 1 내지 82로 구성된 군으로부터 선택된 두 가닥의 서열이 서로 상보적인 결합을 통해 이중 가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드.
제 1항에 있어서, 상기 siRNA 올리고뉴클레오티드는 티로시나제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 siRNA 올리고뉴클레오티드.
제 1항에 있어서, 상기 서로 상보적인 결합을 통해 이중 가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 siRNA 올리고뉴클레오티드:

서열번호 1 - 서열번호 2, 서열번호 3 - 서열번호 4, 서열번호 5 - 서열번호 6, 서열번호 7 - 서열번호 8, 서열번호 9 - 서열번호 10, 서열번호 11 - 서열번호 12, 서열번호 13 - 서열번호 14, 서열번호 15 - 서열번호 16, 서열번호 17 - 서열번호 18, 서열번호 19 - 서열번호 20, 서열번호 21 - 서열번호 22, 서열번호 23 - 서열번호 24, 서열번호 25 - 서열번호 26, 서열번호 27 - 서열번호 28, 서열번호 29 - 서열번호 30, 서열번호 31 - 서열번호 32, 서열번호 33 - 서열번호 34, 서열번호 35 - 서열번호 36, 서열번호 37 - 서열번호 38, 서열번호 39 - 서열번호 40, 서열번호 41 - 서열번호 42, 서열번호 43 - 서열번호 44, 서열번호 45 - 서열번호 46, 서열번호 47 - 서열번호 48, 서열번호 49 - 서열번호 50, 서열번호 51 - 서열번호 52, 서열번호 53 - 서열번호 54, 서열번호 55 - 서열번호 56, 서열번호 57 - 서열번호 58, 서열번호 59 - 서열번호 60, 서열번호 61 - 서열번호 62, 서열번호 63 - 서열번호 64, 서열번호 65 - 서열번호 66, 서열번호 67 - 서열번호 68, 서열번호 69 - 서열번호 70, 서열번호 71 - 서열번호 72, 서열번호 73 - 서열번호 74, 서열번호 75 - 서열번호 76, 서열번호 77 - 서열번호 78, 서열번호 79 - 서열번호 80, 및 서열번호 81 - 서열번호 82.
제 1 항에 있어서, 상기 siRNA 올리고뉴클레오티드는 3'에 오버행 TT 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA 올리고뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 siRNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 외용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 피부 외용 조성물은 미백용 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 siRNA 올리고뉴클레오티드는 조성물 총량에 대하여 0.1nM 내지 100μM의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 외용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 고용체 퍼포레이터 제형인 것을 특징으로 하는 피부 외용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 카르복실메틸셀룰로오스나트륨(SCMC), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 말토덱스트린, 폴리아크릴산, 폴리스티렌 설포네이트, 폴리펩티드, 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 히드록시에틸 셀룰로오스(HEC), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC),폴리아크릴산, 덱스트린, 덱스트란, 단당류 및 다당류, 폴리알코올, 젤라틴, 아라비아 고무, 알기네이트, 키토산, 사이클로덱스트린 및 다른 수용성 천연 및 합성 중합체, 또는 상기의 조합을 포함하는 중합체로 이루어지는 기질 물질; 트레할로스, 글루코오스, 말토오스, 락토오스, 말투로오스, 이소-말투로오스, 락툴로오스, 프룩토오스, 투라노오스, 멜리토스, 만노오스, 멜레치토오스, 덱스트란, 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이노시톨, 팔라티니트 및 만니톨로 구성된 군으로부터 선택되는 탄수화물 유도체; 및 인산염, 질산염 및 카르복실산염 유리, 염화칼륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 외용 조성물.
서열번호 1 내지 82로 구성된 군으로부터 선택된 두 가닥의 서열이 서로 상보적인 결합을 통해 이중 가닥을 형성하는 siRNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고용체 퍼포레이터를 피부에 적용하여 피부미백을 달성하는 피부 미용방법.
제 10항에 있어서, 상기 siRNA 올리고뉴클레오티드는 3'에 오버행 TT 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미용방법.
제 10항에 있어서, 상기 고용체 퍼포레이터는 마이크로 니들인 것을 특징으로 하는 피부 미용방법.
제 10 항에 있어서, 상기 고용체 퍼포레이터의 피부 적용 깊이는 200 내지 300 um인 것을 특징으로 하는 피부 미용방법.
제 10 항에 있어서, 상기 미용 방법은 화학박피, 기계적 박피술 또는 탈지(defatting) 효과를 가진 하나 이상의 용매의 적용, 및 세정제 거품 제품을 이용한 피부 클렌징 중에서 선택되는 피부에 대한 전처리 후에 적용되는 것을 특징으로 하는 피부 미용 방법.