WO2012177008A2

WO2012177008A2 - 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 색소형성 조절용 조성물

Info

Publication number: WO2012177008A2
Application number: PCT/KR2012/004645
Authority: WO
Inventors: 김규한; 최현정; 빈범호; 이태룡
Original assignee: 주식회사 아모레퍼시픽
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2012-12-27
Also published as: CN104169420B; KR101938548B1; CN104169420A; KR20130001123A; US20140134636A1; WO2012177008A3; US9303261B2; HK1199063A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 miRNA. 또는 서열번호 1의 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖고 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 포함하는 미백효과 또는 백모 방지 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 시험물질에 대한 색소형성을 조절할 뿐만 아니라 색소형성 유전자의 발현 조절 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2인 안티센스 핵산 분자를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현을 억제하는지 또는 촉진하는지 여부를 확인하는 단계; 세포의 색이 변화하는지 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 스크리닝 방법은 미백효과 또는 백모 방지 효과를 위해 사용될 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

^' 마이크로 RNA를 포함하는 색소형성 조절용 조성물

【기술분야】

본 발명은 색소형성을 조절하고， 색소형성 유전자의 발현을 조절하는 마이크 로 RNA(microRNA: 이하 miRNA)인 hsaᅳ miR— 125b (이하 miR-125b)의 동정에 관한 것으 로， miRᅳ 125b 또는 그 모방체 (mimic)를 포함하는 미백용 화장료 또는 약학 조성물 및 miR-125b의 저해제 (inhibitor)를 포함하는 백모 방지 화장료 또는 약학 조성물 에 관한 것이다ᅳ

【배경기술】

miRNA는 세포 내에 존재하는 20-25 핵산 (nucleot ide) 길이의 작은 RNA (endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤 어핀 -구조 전사체 (hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' -UTR의 상보적인 서열에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하예 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서 (repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다.

현재 miRNA는 발달 시기， 세포사멸사, 지방 신진대사 및 조혈 세포 분화^ 조절을 포함하는 여러 생물학적 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐 에 따라 생명과학분야에서 매우 큰 관심을 받고 있다. 하지만 암 등의 질병이나 발 생 과정에서의 miRNA의 기능연구는 상당히 진행된 것에 비해 상대적으로 피부 과학 에서의 miRNA 역할에 대한 연구는 비교적 적은 상태이다. 최근 miR-203이 각질형성 세포 (keratinocyte)에서 p63 mRNA를 타겟팅함으로써 분화능력을 억제한다는 보고와 miR— 125b가 피부줄기세포꾀 분화를 억제하며 각질형성세포의 분열을 억제한다는 보 고는 있지만， 그 외의 피부관련 특이적 miRNA와 기능에 대해선 거의 알려져 있지 않다ᅳ 하지만 miRᅳ 203과 miR-125b 외에도 여러 특정 miRNA가 피부에서도 생물학적 으로 중요한 역할을 담당할 것으로 층분히 예측이 된다. 또한 miRNA는 생물학적 마 커 및 소재 등 다양한 분야에서 응용이 가능하기 때문에 피부에서 miRNA의 연구는 화장품 및 의약산업 등에 다양한 적용이 가능할 것^로 판단된다.

피부는 크게 표피층 (epidermis)과 진피층 (dermis)으로 나뉘는데, 표피층에 존재하는 색소형성세포 (melanocyte)은 색소 (melanin)를 합성하여 피부 고유의 색을 나타나게 한다. 피부 색소를 조절하는 생물학적 인자들을 크게 색소형성세포에서 멜라노좀 (melanosome)을 만드는 요소와 멜라노좀을 운반하는 요소로 크게 나뉠 수 있다. 멜라노좀을 만드는 요소에서 가장 잘 알려진 인자는 티로시나아제 (tyrosinase, TYR) 등이 있고 멜라노좀 운반에 관여하는 요소로는 Rab27a 등이 알 려져 있으며， 최근엔 PAX3, MITF 등의 전사인자들도 색소조절 과정에 참여하는 것 으로 알려져 있다. 따라서 이들 색소초절 인자들은 피부 미백， 혹모 생성 또는 백 모방지들의 중요한 타겟이 된다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명자들은 피부의 색소형성유전자들의 발현이 많은 WM266-4 혹색종 세포 에서 색소형성에 관여하는 miRNA을 찾는 연구를 진행하였고， 그 결과 hsaᅳ miR— 125b 가 티로시나아제 mRNA의 발현을 억제하고， 색소형성을 조절함을 밝혔다.

따라서， 본 발명은 miR-125b 또는 그 모방체 (mimic)를 포함하는 미백효과를 가지는 조성물을 제공하는 것올 목적으로 한다.

또한， 본 발명은 miR-125b의 저해제 (inhibitor)를 포함하는 백모 방지 효과 를 가지는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하예 본 발명은 서열번호 1의 rruRNA를 유효성분으 로 포함하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다. 또한， 서열번호 1의 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖고 상기 miRNA에 하이브 리드될 수 있는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 유효성분 으로 포함하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 시험물질에 대한 색소형성 유전자 발현 조절하고， 색소형성 을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a) 서열번호 1의 miRNA 또는 서열 번호 2의 안티센스 핵산 분자를 세포에 트랜스펙션 (transfection)시키는 단계; (b) 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 색소형성 유전자 의 발현을 억제하는지 또는 촉진하는지 여부를 확인하는 단계; (d) 세포의 색이 변 화하는지 확인하는 단계;를 포함하는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절 물질 을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

【유리한 효과】

본 발명의 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 포 함하는 조성물은 색소형성 유전자인 티로시나아제 mRNA의 발현을 조절하고, 색소형 성을 조절함으로써 미백효과 또는 백모 방지효과를 가진 조성물을 제공할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은 hsa-miR-125b와 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 (ol igonucleot ide)을 세포 내로 트랜스펙션하여 hsa-miR_125b의 과발현 현상 (overexpression)을 유도하 고ᅳ 실시간 (real-time) PCR을 수행하여 티로시나아제 mRNA 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다 (TYR: 티로시나아제).

도 2는 hsa-miR-125b와 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 (ol igonucleotide)을 세포 내로 트랜스펙션하여 hsa-miR-125b의 과발현 현상 (overexpression)을 유도하 고， 웨스턴 블럿 (immune blot)을 수행하여 티로시나아제 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다 (TYR: 티로시나아제).

도 3은 hsa-iniR-125b와 상보적인 서열을 갖는 올리고핵산 (oligonucleotide) 을 트랜스펙션하여 세포 내에 존재하는 miR-125b에 결합시켜 그 기능을 억제하고， 실시간 (realtime) PCR을 수행하여 티로시나아제 mRNA 발현량을 확인한 결과를 나 타낸 것이다 (TYR: 티로시나아제).

도 4는 WM266-4 세포주에 색소형성관련 유전자들의 발현을 증가시킨다고 알 려진 포르스콜린 (forskolin)을 처리하여 색소형성관련 유전자들의 발현의 증가를 유도하고, miR-125b의 발현량을 측정할 수 있는 miRNA 실시간 (real-t ime) PCR을 수 행하여 포르스콜린 처리농도의 증가에 따른 niR-125b 발현량을 확인한 결과를 나타 낸 것이다.

도 5는 인간유래 색소형성세포 (human primary melanocyte)에 hsa-miR— 125b와 동일한 서열을 _ᅵ갖는 올리고핵산 (oligonucleotide)을 세포 내로 트랜스펙션하여 hsa-miRᅳ 125b의 과발현 현상 (overexpression)을 유도하고， 세포를 원심분리법을 통하여 세포알갱이 (cell pellet)를 만든 뒤 그 색깔을 관찰하여 세포 색소형성의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 색소형성을 조절하며 색소형성유전자의 발현을 조절하는 서열번호 1의 miRNA를 제공한다.

본 발명의 상기 색소형성 유전자는 티로시나아제 mRNA이다.

5' - ucccugagacccuaacuuguga 一 3' (서열번호 1)

본 발명에서 사용되는 r RNA는 상기 서열번호 1의 염기서열을 가지며， cccugag를 포함하는 22개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 을리고핵산 분자이다. 또한， 서열번호 1의 염기서열을 포함하몌 색소형성을 조절하며 색소형성 유전자들 의 발현을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.

상기 miRNA는 색소형성을 억제하며， 색소형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에세 서열번호 1의 miRNA를 이용하여 hsa-miRᅳ 125b 의 모방체 (mimic)로 hsa_miR-125b와 동일한 서열올 갖는 올리고핵산 분자 (oligonucleotide)를 제작할 수 있다. 또한, hsa-miR-125b의 모방체 (mimic)는 상기 hsa-miRᅳ 125b 염기서열을 포함하고 색소형성을 조절하며 색소형성 유전자들의 발현 을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예는, 서열번호 1의 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖고 상 기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 제공한다. 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자는 miR-125b의 저해제 (inhibitor)로서 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것이다. 또한， miR-125b의 저 해제인 하기 서열번호 2의 염기서열을 포함하며 상기 miRNA에 하이브리드 될 수 있 는 것들을 포함할 수 있다.

5 ' -Licacaaguuagggucucaggga—3' (서열번호 2)

본 발명은 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 유 효성분으로 포함하는 색소 형성 조절 및 색소형성 조절 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 색소형성 유전자들의 발현을 억제 또는 촉진시키는 조성 물이고, 상기 색소형성 유전자들은 티로시나아제 mRNA이다.

본 발명의 조성물은 색소형성을 억제 또는 촉진시키며， 상기 miRNA는 서열번 호 1의 염기서열 중에서 선택되며 cccugag를 포함하는 22개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자 중에서 선택되는 것을 유효성분으로 포함한다ᅳ 또한， 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 색소형성을 조절하며 색소형성 유전자들의 발현 을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 안티센스 핵산 분자는 서열번호 2의 염기서열 중에 서 선택되는 22개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자 중에서 선택 된 것을 유효성분으로 포함한다. 상기 안티센스 핵산 분자는 miR-125b의 저해제 (inhibitor)로 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것이다. 또한 miR_125b의 저해 제로 상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하며 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것들을 포함할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 miRNA, 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자， 또는 서 열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 올리고핵산 분자는 조성물 총 중량에 대하 여 0.00001~30.0중량 %의 양으로 사용될 수 있다.

구체적으로， 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 1의 염기서열을 유효성분으 로 포함하는 올리고핵산올 포함하는 조성물은 색소 형성 유전자， 특히 티로시나아 제 mRNA의 발현을 억제함으로써 피부 미백효과를 제공할 수 있다. .

또한， 서열번호 2의 안티센스 핵산분자 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함 하는 올리고 핵산을 포함하는 조성물은 색소형성 유전자， 특히 티로시나아제 mRNA 의 발현을 촉진함으로써 백모 방지 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 제형의 형태가 특별히 한정되지 않지만， 바람직하게는 화장료 조성물 또는 약학 조성물 등의 형태로 제형화 될 수 있다.

본 .발명의 조성물이 화장품 제형인 경우에는, 화장품학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다.^.이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로， 예를 들면 용 액， 겔， 고체 또는 반죽 무수 생성물， 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀견， 현탁 액 /마이크로에멀젼， 마이크로캡술， 미세과립구 또는 이온형 (리포좀) 및 /또는 비이 온형의 소낭 분산제의 형태로， 또는 크림， 스킨， 로션, 파우더 연고, 스프레이 또 는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방¾ 에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우에는, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2인 안티센스 핵산 분자， 또는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 올리고핵산을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유 기의 담체를 가하여 고체， 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제 (주사, 경피 투여 또는 외용 도포)로 제형화할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 국소 주 사용 제제， 연고， 로션, 스프레이， 현탁제 등이 포함된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 유효성분을 제제화하기 위해서는 통상 의 방법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제， 착 색료， 향신료, 보존료， 안정제， 완충제， 현탁제， 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA의 투여량은 치료받을 대상의 연령， 성별, 체중과， 치료할 특정 질환 또는 병리 상태， 질환 또는 병리 상태의 심각도， 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정 은 당업자의 수준 내에 있으며 주사제를 제외한 제재에 대해서는 색소가 침착된 부 위에 외용 도포하는 식으로 당업자의 수준에서 적용할 수 있고， 주사제의 경우에는 색소가 침착된 부위에 국소적으로 주사할 수 있다. 본 발명의 miRNA는， 변형된 핵산 분자로 이루어질 수도 있다. 예컨대， 2'-0一 알킬 (예: 메틸， 에틸), 2'-0_알릴, 2'-0-알릴과 같은 2¹-치환된 라이보스를 포함하 는 핵산 분자를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수 있다. 또한， 치환된 염기를 갖는 핵산 분자를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예는， 시험물질에 대한 색소형성유전자의 발현을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서， (a) 서열번호 1의 miRNA또는 서열번호 2의 안티 센스 핵산 분자를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; (b) 상기 세포에 시험 물질을 처 리하는 단계; (c) 상기 시험물질이 색소형성유전자들의 발현을 억제하는지 또는 촉 진하는지 여부를 확인하는 단계; (d) 세포의 색이 변화하는지 확인하는 단계;를 포 함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 ^절 및 색^형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 세포에 트랜스펙션시키는 단계에 있어서， 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이 트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등올 이용하여 실시할 수 있으 나， 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 색소형성 유전자의 발현을 조절하는지 여부는 당업계에 널리 공지된 방법인 RT-PCR또는 ELISA 및 웨스턴블럿 (i醒 uno blot)을 이용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 색소형성 유전자들의 발현 정도를 이용한 발현 조절 물질 스크리닝은 시험 물질이 색소형성 유전자의 발현을 억제 혹은 촉진하는 지를 면역검정법 (예를 들어 ELISA 또는 I瞧 unoblot)으로 확인하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서， 상기 확인 결과 상기 시험물질이 세포의 색소형성 을 증가시키거나 색소형성 유전자의 발현, 활성 또는 기능을 증가시키는 경우 색소 형성 유전자의 촉진제로 판정하고， 상기 시험물질이 세포의 색소형성을 감소시키거 나 색소형성 유전자의 발현， 활성 또는 기능을 감소시키는 경우 색소형성 유전자 억제제로 판정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한 다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다. [시험예 1] hsa-miR-125b 에 모방체 (mimic)에 의한 티로시나아제 mRNA의 감소 본 발명자들은 hsa-miR-125b의 획득기능적 연구 (gain-of-funct ional study) 를 위하여 hsaᅳ miR-125b의 모방체를 이용하였는데， hsa-miR— 125b의 모방체는 hsa miR— 125b와 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 (ol igonucleotide)으로서 세포 내로 트 랜스펙션하여 hsaᅳ miR-125b의 과발현 현상 (overexpression)을 유도할 수 있다.

혹색종 세포주인 丽 266ᅳ 4에 hsa-miR-125b의 모방체 (상품명: 0300595—03- 0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-125b M I MAT0000423 /M 10000446 ( hs a-m i R- 125b), 5 nmol, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 1)를 농도가 20uM가 되도록 리포좀 (liposome)을 이용하여 트랜 펙션하여 세포 안⁰^ 이동시켰다. 대조군온 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플 (비교예 1)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되 지 않는 올리고핵산 (상품명: CN-001000-01-05, miRIDIAN microR A Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품)을 .트랜스펙션시킨 샘플 (비교예 2)를 이용하였 다. 트랜스펙션 후 세포는 37^°C 5% C0₂인큐베이터에서 약 60시간 정도 배양한 후 H 리졸 (Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. Triz이을 이용하여 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리， 이소프로판올 (isopropanol) 0.35ml를 넣어 핵산의 펠¾을 형성시키고， 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 lug의 RNA를 을리고 디티 (oligo dT) 및 역전사 효소 (reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤， 티로시나아제 mRNA에 특이적인 프라이 머 (assay ID: Hs01099965_ml)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 실시간 (real time) PCR을 95^°C에서 10분 반웅시키고， 95^°C에서 10초， 60^°C에서 1분 반웅을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 mRNA 발현량은 하우스키핑 (housekeeping) 유전자인 GAPDH의 mRNA 발현량 (assay ID: 4333764F)으로 정규화 (normalization) 하였으며， 그 결과는 도 1에 나타내었다.

이 결과， hsa— miR-125b 모방체를 트랜스펙션한 경우에 (실시예 1) 티로시나아 제 mRNA의 발현량이 비교예 1 및 2에 비해 현저히 감소함을 알 수 있었다 (도 1).

[시험예 2] hsa_miR-125b에 모방체 (mimic)에 의한 티로시나아제 단백질의 감소

본 발명자들은 hsa— miR-125b의 획득기능적 연구 (gain-ofᅳ funct ional study) 를 위하여 hsaᅳ miR-125b의 모방체를 이용하였는데， hsa-miR— 125b의 모방체는 hsaᅳ miRᅳ 125b와 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 (oligonucleotide)으로 세포 내로 트랜 스펙션하여 hsa-miR-125b의 과발현 현상 (overexpression)을 유도할 수 있다. 흑색종 세포주인 WM266-4에 hsaᅳ miR-125b의 모방체 (상품명: 0300595—03一 0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-125b M I MAT0000423 /M 10000446 ( hs a-m i - 125b) , 5 匪 ol, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 1)를 농도가 20uM가 되도록 리포좀 을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시킨다. 대조군은 어떠한 을리고핵산 도 넣지 않은 샘플 (비교예 1)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올 리고핵산 (상품명: CNᅳ 001000-01ᅳ 05， miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품)을 트랜스펙션시킨 샘플 (비교예 2)를 이용하였다. 트랜 스펙션 후 약 60 시간 후 RIPA buffer를 이용하여 세포막을 깨고 원심분리기를 이 용하여 단백질이 포함된 상층액을 추출한 뒤， BCA방식을 이용하여 약 10ug그램의 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질로 웨스턴 블럿 실험을 수행하며, 이때 티로시 나아제에 특이적인 항체 (upstate사의 05-647)를 이용하여 티로시나아제 단백질의 양을 관찰하였다. 티로시나아제 단백질 발현량은 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 단 백질 발현량으로 정규화하였으며， 그 결과는 도 2에 나타내었다.

이 결과, hsa-miR-125b 모방체를 트랜스펙션한 경우에 (실시예 1) 티로시나아 제 단백질의 발현량이 비교예 1 및 2에 비해 현저히 감소함을 알 수 있었다 (도 2).

[시험예 3] hsa-miR-125b 억제제 (inhibitor)에 의한 티로시나아제 niRNA의 증가

본 발명자들은 miR-125b의 억제 기능적 연구 ( loss— of— funct ional study)f- 위하여 miR-124b의 저해제를 이용하였는데 miR-125b의 저해제는 miRᅳ 125b의 상보 적인 서열을 갖는 을리고핵산으로 세포 내에 존재하는 miR-125b에 결합하여 그 기 능을 억제할 수 있다.

혹색종 세포주인 丽 115에 miR-125b 저해제 (상품명: IH-300595-05ᅳ 0005, miRIDIAN Hairpin Inhibitor, Human hsa-miR-125b MIMAT0000423/MI0000446(hsa- mi -125b), Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 2)를 농도가 75uM가 되도록 리포좀 (liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 본 발명 의 miRNA의 저해제와는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산 (상품명 : CN-001000— 01-05， miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품)을 트랜스펙 션시킨 샘플 (비교예 2)과 어떠한 을리고핵산도 넣지 않은 샘플 (비교예 1)을 이용하 였다. 트랜스펙션 후 세포는 37^°C, 5%, C0₂인큐베이터에서 약 60 시간 정도 배양한 후 트리졸 (Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세 포를 녹인 뒤， 원심분리기를 이용하여 상층액올 분리， 이소프로판올 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고， 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하 였다. 약 lug의 RNA를 을리고 디티 (oligo dT) 및 역전사 효소 (reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤, 티로시나아제 mRNA에 특이적인 프라이 머 (assay ID: Hs01099965_ml)를 이용하여 Applied biosystems사의 tacpan 방식의 실시간 (real time) PCR을 95^°C에서 10분 반웅한 뒤， 95^°C에서 10초， 60^°C에서 1분 반웅을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 mRNA 발현량은 하우스키핑 (housekeeping) 유전자인 GAPDH의 mRNA 발현량 (assay ID: 4333764F) 으로 정규화 (normalization)하였으며 그 결과는 도 3에 나타내었다.

이 결과， hsa-miR-125b 억제제를 트랜스펙션한 경우에 (실시예 2) 티로시나아 제 mRNA의 발현량이 비교예 1 및 2에 비해 현저히 증가함을 알 수 있었다 (도 3).

[시험예 4] 포르스콜린 (forskolin) 처리에 의한 hsa-miR-125b의 발현량 감소

본 발명자들은 색소형성 유전자들의 발현량을 증가시킨다고 알려진 포르스콜 린을 처리하여 포르스콜린에 의한 색소형성 유전자들의 발현량이 증가시키는 조건 을 유도한 뒤， 세포 내에 존재하는 hsa-miR-125b의 기본적인 발현량이 변하는지 확 인하였다.

혹색종 세포주인 丽 266-4를 FBS가 없는 배지에 하룻밤 동안 키운 뒤， 포르스 콜린을 배지 내에서 25uM와 50uM의 농도가 되도록 각각 유도하였다. 그리고 약 0시 간 후 트리졸 (Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세포를 녹인 뒤， 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리， 이소프로판올 0.35ml를 넣 어 핵산의 펠렛을 형성시키고 70% EtOH로 세척한 후 펠뻣을 물에 녹여 R A를 분리 하였다. 다음으로 어플라이드 바이오시스템즈 (applied biosystems)사의 태크맨 (taqman)방식을 이용한 hsa-miR-125b 특이적인 프라이머 (assay ID: 000449)를 이용 하여 실시간 (real time) PCR을 수행하였다. hsaᅳ miR-125b에 특이적인 스템 -루프 프 라이머 (stem-loop primer)와 역전사 효소를 이용하여 hsa—miR— 125b에 특이적인 cDNA를 만들고， hsaᅳ mR-125b에 특이적인 프라이머를 이용하여 hsa-miR-125b mRNA 발현량을 관찰하였다. hsa-miR-125b mRNA 발현량은 하우스키큉 유전자인 rnu6b의 small RNA 발현 양으로 정규화하였으며， 그 결과는 도 4에 나타내었다.

이 결과, 포르스콜린을 처리한 경우에 세포 내 존재하는 has-miR— 125b의 발 현량이 포르스콜린의 처리 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다 (도 4).

[시험예 5] hsa— miR-125b에 모방체 (mimic)에 의한 색소형성 감소

본 발명자들은 hsa-miR-125b의 획득기능적 연구 (gain-of-funct ional study) 를 위하여 hsa-miR-125b의 모방체를 이용하였는데， hsa-miR— 125b의 모방체는 hsa_ miR_125b와 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 (ol igonucleot ide)으로 세포 내로 트랜 스펙션하여 hsa_miR-125b의 과발현 현상 (overexpression)을 유도할 수 있다.

인간유래 색소형성세포 (human primary melanocyte)에 hsa-miR-125b의 모방체 (상품명: C— 300595-03-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR- 125b MIMAT0000423/MI0000446(hsa-miR-125b), 5 nmol, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 1) 를 농도가 20uM가 되도톡 리포좀을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시킨 다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플 (비교예 1)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산 (상품명: CN-001000— 01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1， Dharmacon, Inc. 제품)을 트랜스펙션시 ^ᅵ 샘 플 (비교예 2)를 이용하였다. 트랜스펙션 후 7일 후 세포를 PBS 완층액 5ml을 이용 하여 두번 워싱 (washing) 한 뒤, PBS 완층액 1ml를 넣어준 뒤 스크리퍼 (scripper) 를 이용하여 세포를 모두 긁어 모은 뒤 13000 rpm으로 5분간 원심 분리 (centrifugation) 하여 세포 알갱이 (cell pellet)를 만들고 그 세포 알갱이의 색깔 을 관찰하여 색소 형성정도를 비교하였다. 그리고 그 관찰 결과는 도 5에 나타내었 다.

이 결과， 비교예 1 및 2의 경우 색소가 형성되어 세포 알갱이의 색깔이 짙은 갈색을 나타내었다ᅳ 이에 반해， hsa— miR-125b 모방체를 트랜스펙션한 경우 (실시예 1)에는 색소 형성 정도가 현저히 억제되어 열은 노란색을 나타내었다 (도 5).

따라서， 상기 결과를 통하여 hsa-miR-125b 및 이의 모방체가 색소형성을 조 절함을 확인할 수 있다.

본 발명에 의한 서열번호 1의 miRNA를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은 하기의 제형예와 같이 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[제형예 1] 영양화장수

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.

【표 1】

[제형예 2] 영양로션

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.

【표 2】

[제형예 3] 영양크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림올 제조할 수 있다. 【표 3】

[제형예 4] 마사지 크림

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 마사지 크림을 제조할 수 있다.

IS. 4】

I 5] 팩

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조할 수 있다. 【표 5]

[제형예 6] 연고

하기 표 6에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.

【표 6】

본 발명에 의한 서열번호 2의 miRNA를 유효성분으로 함유하는 백모 방지용 모발용 조성물은 하기의 제형예와 같이 제조될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아 니다.

[제형예 7] 모발샴푸 하기 표 7에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 모발 샴푸를 제조할 수 있다.

【표 7]

[제형예 8] 모발 컨디셔닝

하기 표 8에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 모발 컨디셔닝을 제조할 수 있다.

【표 8】

[제형예 9] 두피 헤어토닉

하기 표 9에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 두피 헤어토닉을 제조할 수 있다.

【표 9】 워료명 함량 (중량 %ᅳ)

메롬 0.1

D-판테놀 0.6

삼리심산 0.05

글리세린 1.0

리옥시에팀렌경화피마자유 0.8

초산토코페롤 0.03

조합향 적량

서염^호 2의 miRNA 0.1

에탄올 30.0

정제수 잔량

[제형예 10] 두피 에센스 ·

하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법

수 있다.

【표 10]

워료명 함량 (중량

에탄올 30.0

폴리솜베이트 60 1.5

글리세린 3.0

카르복시비닐폴리머 0.1

트리에탄올아민 0.2

서염버호 2의 miRNA 0.1

방부제 적량

향료 및 색소 적량

정제수 잔량

[제형예 11] 주사제 '

하기 표 11에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있 다.

【표 11】

[제형예 12] 연고

하기 표 12에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있 【표 12]

[제형예 13] 로션

하기 표 13에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 로션을 제조할 수 있 다.

【표 13】

[제형예 14] 스프레이

하기 표 14에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 스프레이를 제조할 수 있다.

【표 14] 워료명 함량 (중량 )

서염버호 2의 miRNA 0.1

에타올 80

Tween 80 5

금리세린 5

초산토코페롬 1

방부제. 색소 및 향료 적량

정체수 잔량

【서열목록 프리텍스트】

서열목록 1은 본 발명에서 사용되는 색소형성 유전자의 발현을 조절하는 miRNA의 염기서열로서， cccugag를 포함하는 22개의 연속적인 염기서열로 이루어진 다ᅳ

서열목록 2는 본 발명에서 사용되는 miR-125b의 저해제로서 본 발명에서 사 용되는 miR-125b에 하이브리드될 수 있는 것이다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 11

서열번호 1의 _miRNA를 유효성분으로 포함하는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물.

【청구항 2]

제 1항에 있어서，

상기 miRNA는 서열번호 1의 염기서열 중에서 선택되며， cccugag를 포함하는 22개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자 중에서 선택된 것을 특징 으로 하는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물.

【청 ^"7힝- 3】

제 1항 또는 제 2항에 있어서,

상기 색소형성 유전자는 티로시나아제 (Tyrosinase) mRNA인 것을 특징으로 하 는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물.

【청구항 4】

제 1항 또는 제 2항에 있어서，

상기 miRNA는 티로시나아제 mRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물.

【청구항 5】

제 1항 또는 제 2항에 있어서，

상기 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소형성유전자 발현조절용 조성물.

【청구항 6]

제 1항 또는 제 2항에 있어서，

상기 조성물은 미백용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소 형성유전자 발현조절용 조성물.

【청구항 7】

서열번호 1의 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖고， 상기 miRNA에 하이브리드 될 수 있는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 색소형성 및 색소형성유전자 발현조절용 조성물.

【청구항 8】

제 7항에 있어서，

상기 안티센스 핵산분자는 서열번호 2의 염기서열 중에서 선택되는 22개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자 중에서 선택된 것으로, 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소형성유전자 발 현조절용 조성물.

【청구항 9】

제 7항 또는 제 8항에 있어서，

상기 색소형성 유전자는 티로시나아제 niRNA인 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물.

【청구항 10]

제 7항 또는 제 8항에 있어서，

상기 색소형성 유전자는 티로시나아제 mRNA익 발현을 촉진시키는 것을 특징 으로 하는 색소형성 및 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물.

【청구항 11]

제 7항 또는 제 8항에 있어서,

상기 조성물은 백모 방지용 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소형성유전자 발현조절용 조성물.

【청구항 12】

제 7항 또는 제 8항에 있어서ᅳ

상기 조성물은 백모 방지용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 색소형성 및 색소형성유전자 발현조절용 조성물.

【청구항 13】

시험물질에 대한 색소형성 유전자의 발현 조절 물질을 스크리닝하는 방법으 로서，

(a)서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 세포에 트 랜스펙션시키는 단계 ;

(b)상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계;

(c)상기 시험물질이 색소형성유전자의 발현을 억제하는지 또는 촉진하는지 여부를 확인하는 단계; 및

(d) 세포의 색이 변화하는지 확인하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법 .

【청구항 14】

제 13항에 있어서， 상기 (C) 단계의 확인 결과， 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현， 활성 또는 기능을 증가시키는 경우 색소형성 유전자의 촉진제로 판정하는 단계를 더 포 함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법.

【청구항 15]

제 13항에 있어서,

^• 상기 (c) 단계의 확인 결과， 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현， 활성 또는 기능을 감소시키는 경우 색소형성 유전자의 발현 억제제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자 발현 조절 물 질 스그리닝 방법 .

【청구항 16】

제 13항에 있어서，

상기 (d) 단계의 확인 결과， 상기 세포의 색소가 증가된 경우 상기 시험물질 을 색소형성 촉진제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특정으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 조절 물질 스크리닝 방법.

【청구항 17】

제 13항에 있어서,

상기 (d) 단계의 확인 결과， 상기 세포의 색소가 감소된 경우 상기 시험물질 을 색소형성 유전자의 발현 억제제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 조절 및 색소형성 유전자 발현 조절 물질 스크리닝 방법.