JP2005526496A - 新規エロンガーゼ遺伝子および高度不飽和脂肪酸の生産方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、配列番号１の配列を有する新規エロンガーゼ遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体、該遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含有する遺伝子構築物、ならびにその使用に関する。本発明はまた、配列番号１の配列を有するエロンガーゼ遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含有するベクターまたは生物に関する。本発明はさらに、高度不飽和脂肪酸の生産方法、ならびに、多量の油（特に、不飽和脂肪酸含量の高い油）を産生する生物へのDNAの導入方法に関する。少なくとも２個の二重結合がある高度不飽和脂肪酸を高含量で含む油および／または脂肪酸組成物、および／または、少なくとも２個の二重結合がある高度不飽和脂肪酸を高含量で含むトリアシルグリセロール組成物も開示する。

Description

本発明は、配列番号１の配列を有する新規エロンガーゼ遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体、上記遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含む遺伝子構築物、ならびにその使用に関するものである。本発明はまた、配列番号１の配列を有するエロンガーゼ遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含有するベクターまたは生物にも関する。
さらに、本発明は、高度不飽和脂肪酸の生産方法、ならびに、大量の油（特に、高含量の不飽和脂肪酸を含む油）を産生する生物にDNAを導入する方法に関する。加えて、本発明は、少なくとも２個の二重結合がある高度不飽和脂肪酸をより高い含量で含む油および／または脂肪酸組成物、および／または、少なくとも２個の二重結合がある高度不飽和脂肪酸をより高い含量で含むトリアシルグリセロール組成物に関する。
微生物細胞または動物細胞、有利には植物細胞の天然の代謝過程で生じるいくつかの産物および副産物は、飼料、食品、化粧品、医薬品産業を含めて、様々な産業において使用されている。まとめて「ファインケミカル」(fine chemical)と呼ばれているこうした分子には、さらに脂質と脂肪酸が含まれ、そのうち高度不飽和脂肪酸が１つのクラスを構成している。例えば、高度不飽和脂肪酸(PUFA)は、小児用食品にその栄養価を高める目的で添加される。また、PUFAはヒトの血中コレステロールレベルを下げるように作用し、したがって心臓病の予防に有用である。高度不飽和脂肪酸(PUFA)のようなファインケミカルは、例えば、魚のような動物源から単離したり、１種以上の所望分子を多量に産生させ蓄積または分泌させることができるように開発された微生物を用いて大量生産したりすることができる。
PUFAの生産に特に適する微生物は、海洋性ケイ藻(Phaeodactylum tricornutum)またはクリプトコジニウム属(Crypthecodinium)のような藻類；スチロニキア属(Stylonychia)またはコルピディウム属(Colpidium)のような繊毛虫；糸状菌モルティエレラ属(Mortierella)、疫病菌エントモフトラ属(Entomophthora)またはケカビ属(Mucor)のような真菌である。PUFAをはじめとする一連の望ましい化合物を産生する各種微生物の突然変異株が、菌株選別によって数多く開発されてきた。しかし、特定の分子の生産が向上した菌株の選択には時間と手間がかかる。
代替法として、ファインケミカルの生産は、PUFAを産生するように開発された植物での大量生産により、好都合に実施することができる。この目的に特によく適合する植物は、多量の脂質化合物を含有する脂肪種子植物、例えば、アブラナ、キャノーラ、アマニ、ダイズ、ヒマワリ、ルリヂサ、アザミ、マツヨイグサなどである。しかし、本発明の詳細な説明で述べるように、油または脂質と脂肪酸を含むその他の作物もよく適合する。適当な植物の選別による通常の植物品種改良により、一連の望ましい脂質と脂肪酸、補因子と酵素を産生する多数の突然変異植物が開発されてきた。しかし、特定の分子の生産について改良された新規植物変種を選別するには時間と労力がかかり、そしてC20-、またはより長い炭素鎖をもつ高度不飽和脂肪酸の場合のように、その化合物が、対応する油脂植物中にもともと存在しない場合には不可能でさえある。
不飽和脂肪酸のはっきりとした有利な特性のため、不飽和脂肪酸含量を改変した油の各種生物による生産のために、脂肪酸またはトリグリセリドの合成に関与している遺伝子を利用しようとする試みが、これまで行われてきた。こうして、WO 91/13972およびその米国対応物はΔ-9デサチュラーゼを記載している。WO 93/11245はΔ-15デサチュラーゼをクレームしており、また、WO 94/11516はΔ-12デサチュラーゼをクレームしている。Δ-6デサチュラーゼはWO 93/06712、米国特許第5,614,393号、WO 96/21022およびWO 99/27111に記載されている。さらに別のデサチュラーゼは、例えば、EP-A-0 550 162、WO 94/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0 794 250、Stukeyら, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149、Wadaら, Nature 347, 1990: 200-203、またはHuangら, Lipids 34, 1999: 649-659に記載されている。WO 96/13591はΔ-6-パルミトイル-ACPデサチュラーゼを記載しクレームしている。しかしながら、各種デサチュラーゼはそれらの生化学に関してこれまで十分な特性決定がなされてこなかった。なぜなら、これらの酵素は膜結合型のタンパク質であり、それらを単離して特性決定するのに相当の困難性を伴うからである (McKeonら, Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147、Wangら, Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792)。
脂肪酸スペクトルを不飽和脂肪酸の方へシフトさせ、同時にその生産性を向上させることが酵母において検討された (Huangら, Lipids 34, 1999: 649-659、Napierら, Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614を参照されたい)。しかし、トランスジェニック植物における各種デサチュラーゼの発現は希望したほどには成功しなかった。脂肪酸スペクトルの不飽和脂肪酸へのへシフトは認められず、同時にトランスジェニック植物の合成生産性が非常に低下したこと、すなわち、出発植物に比べてほんの少量の油しか単離できないことが判明した。
エロンガーゼ（酵素反応の基質としての不飽和脂肪酸を２炭素原子以上伸長させる）のクローニングおよび発現は、これまで酵母についても植物についても報告されていない。
このことは、酵母も作物植物も、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和C20-および／またはC22-脂肪酸、例えば、アラキドン酸(ARA)および／またはエイコサペンタエン酸(EPA)および／またはヘキサドコサエン酸(DHA)を自然界では産生しないことを意味する。
したがって、不飽和脂肪酸の生合成に関与しておりかつ工業規模でのその生産を可能にする新規遺伝子に対する大きな要求が依然存在している。特に、不飽和脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるエロンガーゼの要求が高まっている。従来のバイオテクノロジー技術により高度不飽和脂肪酸の生産方法はどれも、経済的に利用可能な量の上記脂肪酸をもたらしていない。
改めてもう一度言うが、植物における遺伝子の発現は問題を抱えており、すなわち、その発現が有用な目的産物の生産量の期待された増加をもたらさない。
したがって、本発明の目的は、新規エロンガーゼ遺伝子を同定し、クローニングして発現させること、ならびに、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合がある高度不飽和C20-および／またはC22-脂肪酸のような不飽和脂肪酸、例えば、アラキドン酸(ARA)および／またはエイコサペンタエン酸(EPA)および／またはヘキサドコサエン酸(DHA)の合成のために前記遺伝子を提供することである。
この目的は、脂肪酸C18:3 Δ5t,9,12、C20:3 Δ8,11,14、C20:4 Δ5,8,11,14およびC20:5 Δ5,8,11,14,17は伸長させずに、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする本発明の単離された核酸により達成される。
上記目的は、有利には、
a）配列番号１に示した核酸配列、
b）遺伝暗号の縮重により配列番号２に示した配列から誘導される核酸配列、
c）配列番号１に示した配列の誘導体であって、配列番号２に示したアミノ酸配列をコードする配列に対して少なくとも50％の相同性を有するポリペプチドをコードしかつC16-またはC18-エロンガーゼとして機能する上記誘導体、
からなる群より選択される、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を伸長させるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸により達成される。
好ましくは、上記の群から選択されるヌクレオチド配列は、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるが、次の脂肪酸C18:3 Δ5t,9,12、C20:3 Δ8,11,14、C20:4 Δ5,8,11,14およびC20:5 Δ5,8,11,14,17は伸長させない。脂肪酸分子中に２個、３個または４個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を伸長させることが好ましい。C18:3 Δ5t,9,12、C20:3 Δ8,11,14、C20:4 Δ5,8,11,14およびC20:5 Δ5,8,11,14,17のような脂肪酸は伸長されないが、C18:2 Δ9,12、C18:3 Δ4,7,10、C18:3 Δ5,8,11、C18:3 Δ6,9,12、C18:3 Δ7,10,13、C18:3 Δ8,11,14、C18:3 Δ9,12,15、C18:4 Δ6,9,12,15、C18:3 Δ5c,9,12またはC16:3 Δ7,10,13からなる群より選択される脂肪酸は伸長される。本発明のエロンガーゼは、C18:3 Δ6,9,12-、C18:4 Δ6,9,12,15-およびC16:3 Δ7,10,13-脂肪酸を優先して伸長させ、その優先度は、C18:2 Δ9,12-、C18:3 Δ4,7,10-、C18:3 Δ5,8,11-、C18:3 Δ7,10,13-、C18:3 Δ8,11,14-、C18:3 Δ9,12,15-またはC18:3 Δ5,c9,12-脂肪酸のような不飽和脂肪酸に対してよりも、有利には少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも1.6倍、さらに好ましくは少なくとも1.7倍、特に好ましくは少なくとも1.8倍高い。
C16-またはC18-脂肪酸を伸長させる本発明の核酸配列は、もともと、有利には真菌由来であり、好ましくは卵菌綱(Oomycete)のような真菌に由来し、例えば、卵菌綱(Oomycete)のフィトフトラ属(Phytophthora)に由来し、特に好ましくは卵菌綱(Oomycete)のフィトフトラ属(Phytophthora)の菌種フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans：ジャガイモの胴枯れ病菌)に由来する。
本発明の核酸は、油、脂肪酸、脂質、脂質誘導化合物を改変するために使用することができ、最も好ましくは、高度不飽和脂肪酸の生産に使用される。
本発明の核酸に適している宿主生物は、様々なファインケミカルの大規模生産のために工場で使用される、ファエオダクチルム属(Phaeodactylum)、コルピジウム属(Colpidium)、モルティエレラ属(Mortierella)、エントモフィトラ属(Entomophthora)、ケカビ属(Mucor)、クリプトコジニウム属(Crypthecodinium)、その他の藻類や真菌のような微生物、ならびに植物（特に脂肪種子植物）である。
WO 98/01572に開示されるような上記微生物および繊毛虫の遺伝子操作のためのクローニングベクターおよびクローニング技術、またはFalciatoreら, 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251; Dunahayら, 1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol. 31:10004-1012 およびそこに引用される文献に記載される藻類および関連生物（例えば、Phaeodactylum tricornutum）のための方法およびベクターを用いることにより、本発明による核酸分子をこれらの生物の遺伝子操作に使用して、それらを１種以上のファインケミカルのより良好な、またはより効率的な生産体にすることができる。このファインケミカルの生産または生産効率の向上は、本発明核酸（有利には、全遺伝子の形態）の操作の直接的作用により、またはこの操作の間接的作用によりもたらされる。
コケ類と藻類は、相当量の高度不飽和脂肪酸、例えば、アラキドン酸（ARA）および／またはエイコサペンタエン酸（EPA）および／またはドコサヘキサエン酸（DHA）を産生する唯一知られた植物系である。卵菌綱(Oomycete)のような真菌系(Eukaryota/Stramenopiles/Oomycetes/Phythiales/Pythiaceaea)も上記脂肪酸を産生する。したがって、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)のような卵菌綱(Oomycete)に由来する核酸分子は、宿主、特に上記のような微生物、ならびに、アブラナ、キャノーラ、アマニ、ダイズ、ヒマワリ、ルリヂサといった脂肪種子植物のような植物において、脂質およびPUFA産生系を改変するのに特に適している。さらに、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)のような卵菌綱(Oomycete)に由来する核酸は、対象の生物におけるPUFA前駆体分子の生合成を改変するのに有用な、そのようなDNA配列および酵素を他の生物種において同定するために使用することができる。
真菌フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)は卵菌綱(Oomycete)に属している。これは光がなくても生育できる他の菌類の仲間である。フィトフトラ属のような真菌は、DNA配列およびポリペプチドレベルで互いに高度の相同性を有しており、他の真菌または生物に由来するプローブによる異種スクリーニングにDNA分子を供することを可能にすることから、異種スクリーニングに適した、または第三の生物種における遺伝子機能の機能的解釈および予測に適したコンセンサス配列を誘導することができる。しかし、該配列によりコードされるタンパク質または酵素の機能を予測することはまだ可能でない。したがって、これらの機能を同定できること、例えば、酵素の基質特異性を予測できることは非常に重要でありうる。さらに、これらの核酸分子は、他の菌類をマッピングするための、またはPCRプライマーを誘導するための基準配列としても役立ちうる。
さらに、機能的に活性なPSE遺伝子は、今回初めて、卵菌綱(Oomycete)のフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans) (Eukaryota/Stramenopiles, Oomycetes/Phythiales/Pythiaceaea)から単離された。この遺伝子は、長鎖の高度不飽和脂肪酸、好ましくは、脂肪酸の炭素骨格中に16個または18個より多い炭素原子を有しかつ／また炭素鎖中に少なくとも２個の二重結合を有する脂肪酸の生産に適しており、本発明の配列によりコードされる酵素は伸長過程において上記脂肪酸に対する優先性を有する。
新規核酸分子は、本明細書においてPUFA特異的エロンガーゼ（PSE）と称されるタンパク質をコードしている。これらのPSEは、例えば、脂質またはPUFAのような脂肪酸の生合成に必要とされる化合物の代謝（例えば、生合成もしくは分解）に関与する機能、あるいは１種以上の脂質／脂肪酸化合物の細胞内または細胞外への膜貫通輸送を補助する機能を果たすことができる。
本出願では、当該配列の機能について詳細に記載する。本発明者らは、長鎖の高度不飽和脂肪酸、好ましくは、脂肪酸の炭素骨格中に16個または18個より多い炭素原子を有しかつ／また炭素鎖中に少なくとも２個の二重結合を有する脂肪酸を生産するのに適している機能的に活性な卵菌綱(Oomycete)遺伝子を単離した。本発明の配列によりコードされる酵素は伸長段階において上記脂肪酸に対する優先性を示す。これはPSE遺伝子またはPSEタンパク質をさす。他の刊行物および特許は機能的に活性なPSE遺伝子をまったく開示していない。たとえ公知の特許出願がいくつかあるにしても、それらは短鎖または中等度鎖の飽和脂肪酸の伸長（WO 98/46776およびUS 5,475,099）、あるいは二重結合が１個だけであるかまたは長鎖脂肪酸ワックスエステルをもたらす長鎖脂肪酸の伸長または生産を示している（WO 98/54954、WO 96/13582、WO 95/15387を参照されたい）。
WO 99/64616、WO 98/46763、WO 98/46764およびWO 98/46765は、トランスジェニック植物によるPUFAの生産を開示して、特に真菌由来の、対応するデサチュラーゼ活性のクローニングおよび機能的発現を実証しているが、必須のPSEコード化遺伝子および機能的PSE活性についてはまったく示していない。C18-炭素鎖を有するトリエン酸の生産は、γ-リノレン酸に関して実証され、特許請求されているが、非常に長鎖の高度不飽和脂肪酸（C20-以上の炭素鎖を有するトリエン酸またはより高度の不飽和脂肪酸）の生産および該エロンガーゼの基質特異性についてはこれまで開示されていない。
長鎖PUFAを生産するには、高度不飽和C16-および／またはC18-脂肪酸をエロンガーゼの酵素活性により２炭素原子以上伸長させる必要がある。本発明による核酸配列は、脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させる能力を有する、真菌由来の最初のエロンガーゼをコードするものである。１回の伸長サイクル後、この酵素活性はC20-脂肪酸をもたらし、２回、３回および４回の伸長サイクル後には、C22-、C24-またはC26-脂肪酸をもたらす。本発明による酵素活性の利点は、すべての不飽和C20-脂肪酸が伸長されるわけではない点にある。このことは、個々の望ましい不飽和脂肪酸または脂肪酸混合物の特異的合成を可能にする。本発明のエロンガーゼを用いて、より長鎖のPUFAを合成することもできる。本発明によるエロンガーゼの活性は、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合（好ましくは、３個または４個の二重結合）があるC20-および／またはC22-脂肪酸をもたらすものが好ましい。伸長により得られる好ましい脂肪酸分子は、Δ6-位置に１個の二重結合を有する脂肪酸である。本発明の酵素による伸長反応を行った後、更なる脱飽和ステップを実施してもよい。従って、エロンガーゼ活性の産物および実施しうる更なる脱飽和の産物は、より高度に脱飽和された好ましいPUFA類、例えば、ドコサジエン酸、アラキドン酸、ω6-エイコサトリエン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ω3-エイコサトリエン酸、ω3-エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸である。本発明による酵素活性の基質は、例えば、タキソール酸、6,9-オクタデカジエン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、ピノレン酸、α-リノレン酸、またはステアリドン酸である。好ましい基質は、リノール酸、γ-リノレン酸、および／またはα−リノレン酸である。脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC16-および／またはC18-脂肪酸は、本発明の酵素活性により、遊離脂肪酸またはエステル（例えば、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロール）の形で伸長させることができる。
植物および植物形質転換体において使用しうるクローニングベクター、例えば、Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Kung & R. Wu編, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenesら, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Kung & R. Wu編, Academic Press,（1993）, 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 およびこれらの刊行物に引用された文献に発表されているクローニングベクターを利用することにより、本発明の核酸分子を多様な植物の組換え改変に用いて、それらの植物を、PUFAなどの１種以上の脂質誘導産物のより良好な、より効率的な生産体とすることができる。こうしたPUFAなどの脂質誘導産物の生産または生産効率の向上は、本発明の遺伝子操作の直接的作用または間接的作用によってもたらされる。
本発明によるPSEタンパク質の改変が、その改変されたタンパク質のため、脂肪種子植物または微生物からのファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接的に影響を及ぼしうる多数の作用機構が存在する。PSEタンパク質、PSE核酸またはPSE遺伝子の数または活性を増大させ、その結果として、より多量のこれらの化合物を新規に生産させることができるが、上記活性および生合成能は対象の核酸遺伝子の導入前にはこれらの生物に備わっていない。
本発明の核酸および／またはPSE遺伝子を生物または細胞に導入すると、最終産物へ向かう生合成の流れが増大するだけでなく、対応するトリアシルグリセロール組成物も増加するかまたは新規に生成される。同様に、１種以上のファインケミカル（例えば、脂肪酸、極性および中性脂質）の生合成に必要な栄養素の輸送に関与する他の遺伝子の数または活性を増大させ、その結果として、細胞または貯蔵コンパートメント内のこれらの前駆体、補因子または中間体化合物の濃度を高めてもよく、こうして、以下で述べるように、細胞のPUFA産生能が増加する。ファインケミカルとしては脂肪酸と脂質それ自体が好ましいが、これらの化合物の生合成に関与する１種以上のPSEの活性を最適化したり、その数を増加させたり、あるいはこれらの化合物の分解に関与する１種以上のPSEの活性を低下させたりすることで、植物または微生物からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、生産および／または生産効率を増加させることができる。
さらに、本発明によるPSE遺伝子または核酸の突然変異誘発は、１種以上の望ましいファインケミカルの生産に直接または間接的に影響を及ぼす、改変された活性を有するPSEタンパク質をもたらす可能性がある。例えば、本発明によるPSE遺伝子または核酸の数または活性を増大させて、細胞の通常の代謝老廃物または副産物（目的とするファインケミカルの過剰生産のため、その量が増加しうる）を、それらが細胞内で他の分子またはプロセスを破壊する（その結果、細胞の生存能を低下させる）前、あるいはファインケミカルの生合成経路を妨害する（それゆえに、目的のファインケミカルの収率、生産もしくは生産効率を低下させる）前に、効率的に排出するようにすることができる。さらに、目的のファインケミカルの比較的多い細胞内含量は、それ自体で細胞にとって毒性となることもあり、また、アロステリック調節のような酵素フィードバック機構を妨げることもある。例えば、PUFA経路の下流にある他の酵素または解毒酵素の活性または数を増大させることにより、それは、トリアシルグリセロール画分へのPUFAの配分を増加させ、種子細胞の生存能を高め、ひいては培養下の細胞の良好な発達へ導くか、または目的のファインケミカルを産生する種子をもたらす。また、種々の脂質分子および脂肪酸分子が対応する量で産生されるように、PSE遺伝子または本発明による核酸を操作することができる。これは細胞膜の脂質組成に重大な影響を及ぼし、新たに合成されたPUFAの存在に加えて新規な油をもたらす。それぞれのタイプの脂質は異なる物理的特性を示すので、膜の脂質組成の変化は膜の流動性を有意に変更しうる。膜の流動性の変化は膜を経由する分子の輸送および細胞の完全性に影響を与え、これらの両方がファインケミカルの生産に重大な影響を及ぼす。さらに、植物では、こうした変化が非生物的および生物的ストレス状況に対する耐性のような他の形質にも影響を及ぼすことがある。
生物的および非生物的ストレス耐性は、非常に多様な植物に遺伝させることが望ましい一般的形質であり、そのような植物として、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイ、ワタ、アブラナおよびキャノーラ、イモノキ属、コショウ、ヒマワリおよびセンジュギク、ナス科植物（例：ジャガイモ、タバコ、ナス、およびトマト）、ソラマメ属(Vicia species)、エンドウ、アルファルファ、低木植物（コーヒー、カカオ、チャ）、ヤナギ属(Salix species)、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）、ならびに、多年生植物および家畜のかいば作物が挙げられる。本発明の別の実施形態として、これらの作物は遺伝子操作のための好適な標的植物でもある。本発明に従う特に好ましい植物は脂肪種子植物であり、例えば、ダイズ、ラッカセイ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、サフラワー、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）、またはトウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、アルファルファ、低木植物（コーヒー、カカオ、チャ）などの作物がある。
したがって、本発明の一態様は、PSEまたはその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子（例えば、cDNA）、あるいはPSEをコードする核酸（例えば、DNAまたはmRNA）を検出または増幅するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適した核酸断片に関する。特に好ましい実施形態において、核酸分子は配列番号１に示したヌクレオチド配列の１つ、またはこれらのヌクレオチド配列の１つのコード領域もしくは相補体を含む。他の特に好ましい実施形態では、本発明による単離された核酸分子は、配列番号１に示したヌクレオチド配列またはその一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列、あるいは配列番号１に示したヌクレオチド配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む（本発明において相同性は同一性を意味する）。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２に示したアミノ酸配列の１つをコードする。本発明による好適なPSE遺伝子および本発明による核酸配列はまた、本明細書に記載したPSE活性を少なくとも１つ保持することが好ましい。
別の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつPSE活性を保持しているタンパク質またはその一部をコードしている（本発明において相同性は同一性を意味する）。好ましくは、核酸分子によりコードされるタンパク質またはその一部は、植物の細胞膜の合成に必要な化合物の代謝に関与することができるか、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与することができる。一実施形態において、核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有する。さらに好ましい実施形態では、該タンパク質は、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)の全長タンパク質であり、これは、配列番号２の完全なアミノ酸配列（これは配列番号１に示したオープンリーディングフレームのためである）と実質的に相同である。
別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)に由来するものであり、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約50％またはそれ以上の相同性を有し、かつ不飽和脂肪酸の合成に必要な化合物の真菌による代謝または膜を介した分子の輸送に関与することができるか、あるいは表１に示した活性の少なくとも１つを有する、生物学的に活性なドメインを含むタンパク質（例えば、PSE融合タンパク質）をコードする。該核酸分子はまた、異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列または調節領域も包含する。
本発明による核酸は、C18:2 Δ9,12、C18:3 Δ4,7,10、C18:3 Δ5,8,11、C18:3 Δ6,9,12、C18:3 Δ7,10,13、C18:3 Δ8,11,14、C18:3 Δ9,12,15、C18:4 Δ6,9,12,15、C18:3 Δ5c,9,12またはC16:3 Δ7,10,13からなる群より選択される脂肪酸を伸長させるタンパク質をコードし、C18:3 Δ5t,9,12、C20:3 Δ8,11,14、C20:4 Δ5,8,11,14およびC20:5 Δ5,8,11,14,17のような脂肪酸は伸長させない。PSE遺伝子を酵母において異種的に発現させた。各種の高度不飽和脂肪酸を個々に供給して、形質転換酵母により変換させた。トランスジェニック酵母の脂肪酸プロファイルをGLCにより分析した。供給され変換された脂肪酸のパーセンテージを次のような計算式で求めた：モル％(産物)×100／[モル％(出発物質)＋モル％(産物)]。
表１は、本発明の酵素により伸長される脂肪酸を示す。
Figure 2005526496
別の実施形態において、単離された核酸分子は、長さが少なくとも15ヌクレオチドであって、ストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド配列からなる核酸分子とハイブリダイズするものである。単離された核酸分子は、好ましくは、天然に存在する核酸分子に相当する。さらに好ましくは、単離された核酸分子は、天然に存在するフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)由来のPSE、またはその生物学的に活性な部分をコードする。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明によるヌクレオチド分子を含むベクター（例えば、組換え発現ベクター）、ならびに、これらのベクターが導入されている宿主細胞、特に、微生物、植物細胞、植物組織、植物器官、または完全な植物体に関する。線虫Caenorhabditis elegansのような非ヒト宿主細胞も有利に使用することができる。一つの実施形態において、このような宿主細胞は、ファインケミカル（特に、PUFA）を蓄える能力を有する細胞であり、所望の化合物を単離するために細胞を採取する。その後、化合物（油、脂質、トリアシルグリセリド、脂肪酸）またはPSEを、培地からまたは宿主細胞（植物の場合には、ファインケミカルを含有および貯蔵する細胞、最も好ましくは、種皮、塊茎などの貯蔵組織の細胞、表皮細胞および種子細胞）から単離することができる。
本発明のさらに別の態様は、PSE遺伝子、好ましくは、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)のような卵菌綱(Oomycete)由来のPSE遺伝子が導入されているか、またはPSE遺伝子が改変されている、遺伝的に改変された植物（＝トランスジェニック植物）、好ましくは、上記のような脂肪種子植物、または遺伝的に改変された真菌（＝トランスジェニック真菌）、特に好ましくは、フィトフトラ属(Phytophthora)の真菌に関する。一実施形態においては、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)のゲノムが、野生型または突然変異型PSE配列をコードする本発明の核酸分子をトランスジーンとして導入することによって改変されている。別の実施形態では、卵菌綱(Oomycete)のフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)のゲノム中の内在性PSE遺伝子が改変されており、すなわち、改変型PSE遺伝子との相同的組換えにより機能的に破壊されている。好ましい実施形態では、植物はフィスコミトレラ属(Physcomitrella)、セラトドン属(Ceratodon)またはフナリア属(Funaria)に属するものであり、フィスコミトレラ属(Physcomitrella)が好適である。好ましい実施形態では、脂質または脂肪酸のような所望の化合物（PUFAが特に好ましい）を生産するためにフィスコミトレラ属(Physcomitrella)の植物が使用される。
さらに別の実施形態において、卵菌綱(Oomycete)フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)は、本発明に記載の核酸に基づく相同的組換えを用いてコケ植物の機能を検証するために使用される。
本発明のさらに別の態様は、単離された核酸配列、PSE遺伝子またはその一部分（例えば、生物学的に活性な部分）に関する。好ましい実施形態では、単離された核酸配列、PSEまたはその一部分は、微生物もしくは植物細胞の細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、またはその細胞膜を介した分子の輸送に関与し得るものである。別の好ましい実施形態では、単離された核酸配列、PSEまたはその一部分は、配列番号２のアミノ酸配列に対して十分な相同性を有し、それによって、該タンパク質またはその一部分は、微生物もしくは植物細胞の細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、またはこれら細胞膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持する。
本発明はまた、PSE（PSEタンパク質）の単離された調製物を提供する。好ましい実施形態において、本発明のアミノ酸配列またはPSEタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる。さらに好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２の完全なアミノ酸配列（配列番号１に示したオープンリーディングフレームによりコードされる）に対して実質的に相同な単離された全長タンパク質に関する。さらなる実施形態において、該タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性（＝同一性）を有する。他の実施形態では、単離されたPSEは、配列番号２のアミノ酸配列のうちの１つに対して少なくとも約50％の相同性を有し、かつ微生物もしくは植物細胞中の脂肪酸の合成に必要な化合物の代謝、またはこれらの細胞膜を介した分子の輸送に関与する能力を有するか、あるいは１以上のPUFA伸長活性（有利には、脱飽和され、少なくとも２つの位置に二重結合を有するC16-および／またはC18-炭素鎖に関する伸長）を有するアミノ酸配列を含む。
あるいはまた、単離されたPSEタンパク質は、配列番号１のヌクレオチド配列と、例えばストリンジェント条件下で、ハイブリダイズするか、またはこれに対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。PSEの好ましい形態はまた、本明細書に記載するPSE活性のうちの１つをもつことが好適である。
PSEポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分は、非PSEポリペプチドと機能的に連結させて融合タンパク質を形成させることができる。好ましい実施形態では、この融合タンパク質はPSE単独の活性とは異なる活性を有する。他の好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、微生物もしくは植物中の脂質と脂肪酸、補因子と酵素の合成に必要な化合物の代謝、またはこれらの細胞膜を介した分子の輸送に関与する。特に好ましい実施形態では、宿主細胞へのこの融合タンパク質の組込みによって、該細胞からの所望の化合物の生産（有利には、PUFAの合成）がモジュレートされる。好ましい実施形態では、こうした融合タンパク質はまた、Δ4-、Δ5-またはΔ6-デサチュラーゼ活性を単独でまたは組合せで含む。
本発明の別の態様は、有利には不飽和脂肪酸および／または脂質不飽和脂肪酸からの、ファインケミカルの生産方法に関する。この方法は、ファインケミカルが産生されるように本発明のPSE核酸分子の発現をもたらす、配列番号１の本発明のヌクレオチド配列またはその相同体、誘導体もしくは類似体、あるいは配列番号１またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含む遺伝子構築物、あるいはこれらの配列または遺伝子構築物を含むベクターを含有する適当な微生物、または植物細胞、植物組織、植物器官もしくは完全な植物体を培養することを含んでなる。好ましい実施形態において、この方法はさらに、本発明によるエロンガーゼ核酸配列、本発明のPSE核酸分子の発現をもたらす遺伝子構築物またはベクターを含む細胞（細胞はエロンガーゼ核酸配列で形質転換されている）を取得するステップを含む。さらに好ましい実施形態では、この方法はさらに、培養物からファインケミカルを取得するステップを含む。特に好ましい実施形態では、該細胞は、繊毛虫綱（Ciliata）、真菌などの微生物、または植物界、特に脂肪種子植物に属するものであり、微生物または脂肪種子植物が特に好ましいものである。
本発明の別の態様は、微生物からの分子の生産をモジュレートする方法に関する。この方法は、細胞に、PSE活性またはPSE核酸の発現をモジュレートする物質を接触させて、細胞に関連した活性が、上記物質の非存在下での該活性と比較して改変されるようにすることを含んでなる。好ましい実施形態では、脂質と脂肪酸、補因子と酵素のための１つまたは２つの代謝経路、または細胞膜を介した化合物の輸送をモジュレートすることにより、微生物による所望のファインケミカルの生産高または生産率を向上させる。PSE活性をモジュレートする物質は、PSE活性またはPSE核酸の発現を刺激する物質、あるいは脂肪酸生合成における中間体として使用できる物質でありうる。PSE活性またはPSE核酸の発現を刺激する物質の例としては、とりわけ、小分子、活性PSE、および細胞に導入されているPSEをコードする核酸がある。PSE活性またはPSE発現を阻害する物質の例としては、小分子およびアンチセンスPSE核酸分子が挙げられる。
本発明の別の態様は、細胞からの所望の化合物の生産高をモジュレートする方法に関し、この方法は、細胞に野生型もしくは変異型PSE遺伝子または本発明の野生型もしくは変異型核酸（別個のプラスミド上に保持されるか、宿主細胞のゲノムに組み込まれる）を導入することを含んでなる。ゲノムへの組込みの場合には、その組込みは、ランダムであってもよいし、天然の遺伝子を導入用のコピーで置換して、該細胞からの所望の化合物の生産をモジュレートするように組換えにより行ってもよいし、あるいは、遺伝子が機能的な発現単位（遺伝子の発現を促進する少なくとも１つの配列と、機能的に転写された遺伝子のポリアデニル化を促進する少なくとも１つの配列とを含む）に機能的に連結されるように遺伝子をトランスで用いることにより行ってもよい。
好ましい実施形態においては、生産高（収率）が改変される。別の実施形態では、負の効果を有する不要な化合物は減少させながら、所望のファインケミカルを増加させる。特に好ましい実施形態では、所望のファインケミカルは脂質または脂肪酸、補因子または酵素である。特に好ましい実施形態では、このファインケミカルは高度不飽和脂肪酸である。より好ましくは、アラキドン酸（ARA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、またはドコサヘキサエン酸（DHA）から選択される。
本発明の詳細な説明
本発明は、卵菌綱(Oomycete)フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)における脂質と脂肪酸、PUFA補因子および酵素の代謝に関与するか、あるいは、膜を介した親油性化合物の輸送に関与するPSE核酸およびPSEタンパク質分子を提供する。本発明の化合物は、微生物、例えば、繊毛虫綱、真菌、酵母、細菌、藻類、および／または植物、例えば、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、ラッカセイ、ワタ、アブラナ、キャノーラおよびカブのようなアブラナ属の種、アマニ、コショウ、ヒマワリ、ルリヂサ、マツヨイグサおよびマンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトのようなナス科の植物、ソラマメ属の種、エンドウ、イモノキ属、アルファルファ、低木植物（コーヒー、カカオ、チャ）、ヤナギ属の種、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）ならびに、多年生草および飼料穀物などからのファインケミカルの生産を直接モジュレートする（例えば、脂肪酸生合成タンパク質の過剰発現または最適化が、改変された生物からの脂肪酸の収率、生産および／または生産効率に直接影響を及ぼす場合）のに使用するか、あるいは、間接的に影響を及ぼすこともでき、間接的影響によっても、所望の化合物の収率、生産および／または生産効率を高めたり、不要な化合物を減少させたりすることができる（例えば、脂質と脂肪酸、補因子と酵素の代謝のモジュレーションによって、細胞内の所望化合物の収率、生産および／または生産効率を変化させるか、もしくはその組成を変化させて、これにより、１種以上のファインケミカルの生産に影響を与える場合）。以下に本発明の態様について、さらに詳しく説明する。
Ｉ．ファインケミカルおよびPUFA
「ファインケミカル」という用語は、当技術分野では認識されており、生物によって生産された分子であって、例えば、限定するものではないが、製薬産業、農産業、食品および化粧品産業などの様々な産業界で用いられている分子を包含する。これらの化合物は、脂質、脂肪酸、補因子および酵素など（例えば、Biotechnology 第6巻、Rehmら編：VCH Weinheim 中のKuninaka, A.（1996）Nucleotides and related compounds, pp. 561-612、およびそこに引用された参照文献に記載されている）、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ビタミンおよび補因子（Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, Vitamins, pp. 443-613（1996）：VCH Weinheimおよびそこに引用された参照文献；ならびに、Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L.（1995）Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia、1994年９月１〜３日、マレーシア、ペナンで開催、AOCS Press（1995））、ならびに、Gutcho（1983）により、Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN：0818805086およびそこに引用された参照文献に記載された酵素およびその他のあらゆる化学物質を包含する。いくつかのファインケミカルの代謝および使用について、以下にさらに詳しく説明する。
各種前駆体分子と生合成酵素との組合せにより、膜組成に重大な影響を与える様々な脂肪酸分子が生産される。PUFAは、トリアシルグリセロールだけではなく、膜脂質にも組み込まれると想定することができる。
膜合成は、二分子膜の一部として、脂質を含む多数の構成要素が関与する、十分に特性化がなされたプロセスである。従って、PUFAのような新規の脂肪酸の生産により、細胞または生物内に膜機能の新たな特性を生み出すことができる。
細胞膜は、細胞において多様な機能を果たしている。最も重要なのは、膜が、周囲の環境から細胞の内容物を識別し、これによって、細胞に一体性を賦与することである。膜はまた、有害または不要な化合物の流入に対する、あるいは、所望の化合物の流出に対する障壁としての役割も果たしている。
膜の関与、および関連する機構についてさらに詳しくは、下記を参照にされたい：Bamberg, E.ら（1993）Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26:1-25；Gennis, R.B.（1989）Pores, Channels and Transporters, in： Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 270-322；およびNikaido, H.およびSaier, H.（1992）Transport proteins in bacteria：common themes in their design, Science 258:936-942、ならびに、これら参照文献に含まれる引用文献。
脂質合成は、２つの部分、すなわち、脂肪酸の合成およびそれらのsn-グリセロール-3-リン酸への結合と、極性頭部基（head group）の付加または修飾とに分けることができる。膜に用いられる典型的な脂質としては、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびホスホグリセリドが挙げられる。脂肪酸合成は、アセチル-CoAの、アセチル-CoAカルボキシラーゼによるマロニル-CoAへの変換、もしくはアセチルトランスアシラーゼによるアセチル-ACPへの変換のいずれかで開始する。縮合反応の後、これら２つの生成物分子が一緒になってアセトアセチル-ACPを形成し、これを縮合、還元および脱水の連続的反応により変換することによって、所望の鎖長を有する飽和脂肪酸分子が得られる。これら分子からの不飽和脂肪酸の生産は、分子状酸素を用いて好気的に、あるいは、嫌気的に、のいずれかで、特定のデサチュラーゼにより触媒される（微生物における脂肪酸合成については、F.C. Neidhardtら（1996）E. coli and Salmonella. ASM Press：Washington, D.C., p. 612-636、およびそこに含まれる参照文献；Lengelerら（編）（1999）Biology of Procaryotes. Thieme:Stuttgart, New York、およびそこに含まれる参照文献、ならびに、Magnuson, K.ら（1993）Microbiological Reviews 57:522-542、およびそこに含まれる参照文献を参照されたい）。
PUFA生合成のための前駆体の例として、パルミトレイン酸、リノール酸およびリノレン酸がある。これらのC16-および／またはC18-炭素脂肪酸は、エイコサ鎖およびドコサ鎖タイプの脂肪酸を得るために、C20およびC22まで伸長させなければならない。この伸長反応は、本発明による核酸またはこれらの核酸によりコードされるタンパク質を用いて行うことが好ましい。Δ6-デサチュラーゼ、Δ5-およびΔ4-デサチュラーゼ活性を有する酵素などの様々なデサチュラーゼにより、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸、ならびに、その他の各種長鎖PUFAを得ることができ、これらは、抽出した後、食品および飼料、化粧品または医薬品用途など、多様な目的に用いることができる。
長鎖PUFAを生産するためには、前述のように、高度不飽和C16-および／またはC18-脂肪酸をエロンガーゼの酵素活性により２炭素原子以上伸長させる必要がある。本発明に従う核酸配列は、最初の植物エロンガーゼをコードし、このエロンガーゼは、脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC16-および／またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させることができる。１回の伸長サイクル後、この酵素活性はC18-および／またはC20-脂肪酸をもたらし、２回、３回、４回または５回の伸長サイクル後にはC22-、C24-、またはC26-脂肪酸をもたらす。本発明のエロンガーゼを用いて、より長鎖のPUFAを合成することも可能である。本発明のエロンガーゼの活性は、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合、好ましくは、３個または４個の二重結合、特に好ましくは、脂肪酸分子中に３個の二重結合があるC20-および／またはC22-脂肪酸をもたらすことが好ましい。本発明の酵素による伸長反応後に、さらなる脱飽和工程を実施してもよい。かくして、エロンガーゼ活性と、場合により実施される脱飽和、の産物は、より高度の脱飽和を有する好適なPUFA、例えば、ドコサジエン酸、アラキドン酸、ω6-エイコサトリエンジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンテン酸、ω3-エイコサトリエン酸、ω3-エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸をもたらす。本発明のこの酵素活性の基質の例としては、タキソール酸、6,9-オクタデカジエン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、ピノレン酸、α-リノレン酸、またはステアリドン酸がある。好ましい基質はリノール酸、γ-リノレン酸、および／またはα-リノレン酸である。本発明の酵素活性により、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-および／またはC18-脂肪酸を遊離脂肪酸の形で、またはエステル（例えば、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロール）の形で伸長させることができる。
さらに、脂肪酸は、様々な修飾を受けた後、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に輸送され、そこに組み込まれねばならない。脂質合成におけるもう1つの重要な段階は、例えば、グリセロール脂肪酸アシルトランスフェラーゼによる、極性頭部基への脂肪酸の転移である（Frentzen, 1998, Lipid, 100（4-5）:161-166を参照）。
さらに、各種の宿主生物における本発明の核酸の発現は、全体としての膜脂質の組成を変化させるだけでなく、該核酸を含まないかまたは含むとしてもそのような量で含まないもとの宿主細胞に対して、宿主細胞内の不飽和脂肪酸を含む全ての化合物の組成を改変させる。かかる改変は、該核酸によりコードされるタンパク質つまり酵素をもともと含まない宿主生物（例えば、植物細胞）において、より顕著である。こうして、該核酸の発現により新規な脂質組成物が得られ、これらも本発明の別の態様を構成する。
植物の脂肪酸生合成、脱飽和、脂肪化合物の脂質代謝および膜輸送、β酸化、脂肪酸修飾および補因子、トリアシルグリセロール貯蔵および集合についての出版物（そこで引用される参照文献も含む）については、次の論文を参照されたい：Kinney, 1997, Genetic Engineering, JK Setlow編, 19:149-166；OhlroggeおよびBrowse, 1995, Plant Cell 7:957-970；ShanklinおよびCahoon, 1998, Annu, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641；Voelker, 1996, Genetic Engineering, JK Setlow編, 18:111-13；Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417；Guhnemann-Schafer & Kindl. 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186；Kunauら、1995、Prog. Lipid Res. 34:267-342；Stymneら、1993, Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, MurataおよびSomerville編, Rockville, Amecican Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1-16。
ビタミンや、補因子および「機能性食品」（nutraceuticals）、例えばPUFAは、たとえ細菌のような他の生物により容易に合成されるとしても、高等動物は合成する能力を失ったため、摂取しなければならない分子群、あるいは、高等動物がそれ自身で十分な程度まで産生することができないため、追加的に摂取しなければならない分子群を意味する。これら分子を生産することができる生物（例えば、細菌など）における上記分子の生合成については、多かれ少なかれ特性づけられている（Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, “Vitamins”, Vol. A27, p. 443-613, VCH：Weinheim, 1996；Michal, G.（1999）Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons；Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L.（1995）”Nutrition, Lipids, Health and Disease” Proceedings of UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia、1994年９月１〜３日に、マレーシア、ペナンで開催、AOCS Press, Champaign, IL X, 374 pp）。
前記分子は、それ自体が生物活性物質であるか、あるいは、多様な代謝経路における電子担体または中間体として作用しうる生物活性物質の前駆体である。上記化合物は、その栄養的価値以外にも、着色剤、酸化防止剤および触媒もしくはその他の処理加工用補助剤として重要な工業的価値を有する（上記化合物の構造、活性および工業用途についての詳細は、例えば、Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, “Vitamins”, Vol. A27, p. 443-613, VCH：Weinheim, 1996を参照のこと）。高度不飽和脂肪酸は、例えば、冠動脈性心疾患、炎症機構、小児の栄養などの場合に、様々な機能および健康促進効果を有する。関連出版物および参照文献（そこに引用されている文献を含む）については、下記を参照されたい：Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70（3rd Suppl.）:560-569, Takahataら、Biosc. Biotechnol. Biochem, 1998, 62（11）:2079-2085, WillichおよびWinther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120（7）:229以下参照。それらはさらに、生物内の重要な生物学的プロセスを調節する化合物を合成するための重要な出発物質である。したがって、それらは例えば各種ダイエット食品または医薬品において使用される。
II．本発明のエレメントおよび方法
本発明は、少なくとも部分的に、本明細書でPSE核酸およびPSEタンパク質分子と称する新規分子の発見に基づくものであり、該分子は、例えばフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)、セラトドン・パープレウス(Ceratodon purpureus)および／またはフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)における細胞膜または脂肪酸の生産に影響を及ぼし、例えば、このような膜を介した分子の移動に影響を与える。一実施形態では、PSE分子は、微生物や植物のような生物における細胞膜および／または脂肪酸の合成に必要な化合物の代謝に関与したり、あるいは、これら膜を介した分子の輸送に間接的に影響したりする。好ましい実施形態では、膜成分の生産および膜輸送を調節する、本発明のPSE分子の活性は、この生物による所望のファインケミカルの生産に影響を与える。特に好ましい実施形態では、本発明に従うPSE分子の活性をモジュレートすることにより、本発明のPSEが調節する微生物または植物の代謝経路の収率、生産および／または生産効率がモジュレートされ、膜を介した化合物の輸送効率が改変され、これによって、微生物および植物による所望のファインケミカルの収率、生産および／または生産効率を直接的または間接的にモジュレートするようにする。
PSEまたはPSEポリペプチドという用語は、微生物や植物のような生物における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与するタンパク質を意味する。PSEの例として、配列番号１に示したもの、またはその相同体、誘導体もしくは類似体が挙げられる。PSE遺伝子またはPSE核酸配列という用語は、PSEをコードする核酸配列を含み、これは、コード領域と、対応する5’-および3’-非翻訳配列領域とからなる。PSE遺伝子の例は配列番号１に示した配列である。生産および生産性という用語は、当業界で知られており、所定期間内に、所定発酵容量において形成される発酵産物（例えば、所望のファインケミカル）の濃度（例えば、kg(産物)／時／リットル）を包含する。生産効率という用語は、特定の産物量を達成するのに要する時間（例えば、細胞が、ファインケミカルの特定の処理量を達成するのに要する時間）を意味する。収率または製品／炭素収率という用語は、当業界で知られており、炭素源が製品（すなわち、ファインケミカル）に変換される効率を意味する。これは、通常、炭素源１kg当たりの製品のkg数として表される。化合物の収率または生産が増加すると、得られる分子、すなわち、一定期間にわたる所与量の培養物において回収される上記化合物の有用な分子の量が増加する。生合成または生合成経路という用語は、当業界で知られており、例えば、強度の調節を受ける多段階工程での、中間化合物からの細胞による化合物（好ましくは、有機化合物）の合成を意味する。分解代謝もしくは分解代謝経路という用語は、当業界で知られており、例えば、強度の調節を受ける多段階工程での、細胞による分解代謝産物（一般には、より小さいまたは比較的複雑でない分子）への化合物（好ましくは、有機化合物）の開裂を意味する。代謝という用語は、当業界で知られており、生物において起こる生化学反応のすべてを包含する。特定の化合物の代謝（例えば、脂肪酸の代謝）は、従って、この化合物に関連する、細胞内での該化合物の生合成、修飾および分解代謝経路のすべてを包含する。
別の実施形態では、本発明に従うPSE分子は、微生物または植物におけるファインケミカルのような所望の分子の生産をモジュレートすることができる。本発明のPSEの改変が、この改変タンパク質を組み込んだ微生物株または植物株からのファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接影響を与える作用機構が多数存在する。細胞内での、または細胞からの、ファインケミカル分子の輸送に関与するPSEの数または活性を増加させることにより、膜を介して輸送される上記化合物の量を増加させ、これから、該化合物を容易に回収して相互に変換することができる。さらに、脂肪酸、トリアシルグリセロールおよび／または脂質は、それ自体が望ましいファインケミカルであり、これら化合物の生合成に関与する本発明の１種以上のPSEの活性を最適化するか、もしくはその数を増加させるか、あるいは、上記化合物の分解代謝に関与する１種以上のPSEの活性を妨げることにより、微生物または植物のような生物からの脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または生産効率を高めることができる。
本発明に従う核酸またはPSE遺伝子の突然変異誘発によって、活性が改変されたPSEを生じさせることができ、この改変された活性は、微生物または植物からの１種以上の所望のファインケミカルの生産に間接的に影響する。例えば、老廃物の輸送に関与する本発明のPSEは、これまでより数が多いか、もしくは活性が高いため、細胞の正常な代謝老廃物（その量は、所望のファインケミカルの過剰生産により恐らく増加している）は、それらが細胞内の分子を損なったり（これにより、細胞の生存能力が低下する）、あるいは、ファインケミカルの生合成経路を妨害したりする（これにより、所望のファインケミカルの収率、生産または生産効率が低下する）前に、効率的に膜外に輸送することができる。所望のファインケミカルの細胞内の量が比較的多い場合には、それ自体で細胞に有毒となる恐れがあるため、上記化合物を細胞から送り出すことができる輸送体の活性または数の増加によって、培養中の細胞の生存能力を高め、ひいては、所望のファインケミカルを生産する培養中の細胞数を増加させることができる。また、本発明のPSEを操作して、対応する量の様々な脂質分子および脂肪酸分子を生産することも可能である。これは、細胞膜の脂質組成に重大な影響を与える。脂質は、種類によって、異なる物理的特性を有することから、膜の脂質組成の改変により、膜の流動性を有意に改変することができる。膜流動性の改変により、膜を介した分子の輸送および細胞の完全性に影響を与えることができ、それらの各々が、大規模発酵培養における微生物および植物からのファインケミカルの生産に重大な影響を及ぼす。植物の膜は、高温および低温、塩分、渇水に対する耐性、ならびに、細菌や真菌のような病原体に対する耐性などの特定の性質を賦与する。従って、膜成分をモジュレートすることは、植物が、前述のストレスパラメーターの下で生存する能力に重大な影響を与えうる。これは、シグナルカスケードの変化を介して起こり、すなわち、改変された膜組成（例えば、Chapman, 1998, Trends in Plant Science, 3(11):419-426を参照）およびシグナルカスケード（Wang 1999, Plant Physiology, 120:645-651を参照）を介して直接起こるか、またはWO 95/18222に開示されているように、低温耐性に影響を与えうる。
本発明の単離された核酸配列は、例えば、コレクションATCCまたはDSMから入手できるフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)株のゲノム中に存在する。単離されたフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)cDNAのヌクレオチド配列およびフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)PSEの誘導されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。コンピュータ解析を実施して、これらのヌクレオチド配列を、細胞膜成分の代謝に関与するか、または細胞膜もしくは脂肪酸を介した化合物の輸送に関与するタンパク質をコードする配列として分類し、かつ／または同定した。データベース入力番号08_ck19_b07を有する本発明のESTは、配列番号１に示した配列の一部分である。ところで、これらのESTは新しい名称がつけられ、pp001019019fと改名された。同様に、部分ポリペプチドはpp001019019fと命名された。このEST pp001019019fの完全な断片インサートの配列決定を行ったところ、配列番号１に示した結果となり、これはpp001019019fの完全な配列を示す。これは機能的に活性である完全なクローンを含み、酵母において特異的に発現させた後、実施例の項で示すように所望の基質特異性をもつことが明らかになった。酵母もまた、例えば、本発明の遺伝子、遺伝子構築物またはベクターの宿主細胞として適している生物である。
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と実質的に相同（同一）のアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書で用いる「選択されたアミノ酸配列と実質的に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質」は、選択されたアミノ酸配列、例えば、選択された完全なアミノ酸配列に対して少なくとも約50％の相同性を有する。また、選択されたアミノ酸配列と実質的に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質は、選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも約50〜60％、好ましくは、少なくとも約60〜70％、さらに好ましくは、少なくとも約70〜80％、80〜90％または90〜95％、最も好ましくは、少なくとも96％、97％、98％、99％以上の相同性を有するものである。
本発明のPSE、またはそれらの生物学的に活性な部分もしくは断片は、微生物または植物における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、もしくはこれらの膜を介した分子の輸送に関与することができるか、あるいは、C22-またはC24-PUFAおよび近縁のPUFAが得られるようにC18-PUFAの伸長に必要とされる活性を１以上備えている。
本発明の様々な態様について以下の項でさらに詳しく説明する。
Ａ．単離された核酸分子
本発明の一実施形態は、脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC16-および／またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする卵菌綱(Oomycete)由来の単離された核酸を含む。
本発明の別の実施形態は、脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC16-および／またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、
a）配列番号１に示した核酸配列、
b）遺伝暗号の縮重により配列番号１に示した配列から誘導される核酸配列、
c）配列番号１に示した配列の誘導体であって、配列番号２に示したアミノ酸配列をコードする配列に対して少なくとも50％の相同性を有するポリペプチドをコードしかつC16-またはC18-エロンガーゼとして機能する上記誘導体、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。
上記の核酸は、好ましくは植物または真菌由来の、特に好ましくはフィトフトラ属(Phytophthora)由来の、最も好ましくはフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)由来のPUFAを合成することができる繊毛虫、真菌、藻類または渦鞭毛虫のような生物に由来するものである。
本発明の一態様は、PSEポリペプチドまたはその生物学的に活性の部分をコードする単離された核酸分子、ならびに、PSEコード化核酸（例えば、PSE DNA）の同定または増幅用のハイブリダイゼーションプローブもしくはプライマーとして使用するのに十分な核酸断片に関する。本明細書で用いる「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（例えば、mRNA）、ならびに、ヌクレオチド類似体を用いて作製されるDNAまたはRNA類似体、あるいはDNA/RNAハイブリッドを意味する。この用語はまた、遺伝子のコード領域の3’および5’末端に位置する非翻訳配列、すなわち、上記コード領域の5’末端から上流の少なくとも約100ヌクレオチドの配列、および上記遺伝子のコード領域の3’末端から下流の少なくとも約20ヌクレオチドの配列も包含する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれでもよいが、好ましくは、二本鎖DNAである。「単離された」核酸分子とは、その核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、該核酸の起源である生物のゲノムDNAにおいて、該核酸ともともと隣接している配列（例えば、核酸の5’および3’末端に位置する配列）を含まない。様々な実施形態では、単離されたPSE核酸分子は、例えば、その核酸の起源である細胞（例えば、Physcomitrella patens細胞）のゲノムDNAにおいて、該核酸ともともと隣接している、約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、0.5kbまたは0.1kbより小さいヌクレオチドを含んでいてもよい。さらには、cDNA分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技法により生産される場合には他の細胞性物質もしくは培地を、あるいは、化学的に合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本発明に従う核酸分子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその部分を含む核酸分子は、分子生物学の標準的技法、ならびに、本明細書に記載する配列情報を用いて、単離することができる。例えば、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)cDNAは、配列番号１の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用い、標準的ハイブリダイゼーション技法（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo, NY, 1989に記載されているものなど）により、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)ライブラリーから単離することができる。さらに、配列番号１の配列の全部または一部を含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができ、その際、この配列またはその一部、特に、ヒスチジンボックス（His-box）モチーフ周辺の領域、に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマー（Shanklinら（1994）Biochemistry 33, 12787-12794を参照）を用いて、単離することができる（例えば、配列番号１の配列の全部または一部を含む核酸分子は、配列番号１の同じ配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる）。例えば、mRNAは卵菌綱(Oomycete)細胞から単離することができ（例えば、Chirgwinら（1979）Biochemistry 18：5294-5299によるグアニジウムチオシアネート抽出法による）、また、cDNAは逆転写酵素（例えば、メリーランド州ベセスダのGibco/BRLから入手可能なモロニーMLV逆転写酵素；または、フロリダ州セントピーターズバーグのSeikagaku America, Inc.から入手可能なAMV逆転写酵素）を用いて作製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応で増幅するための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１に示したヌクレオチド配列の１つに基づいて設計することができる。本発明の核酸は、標準的PCR増幅法に従い、鋳型としてのcDNAまたはゲノムDNAおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅することができる。このようにして増幅された核酸は、適当なベクターにクローニングした後、DNA配列分析により特性決定することができる。さらに、PSEヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を用いて、標準的合成方法により作製することができる。
配列番号１に示したcDNAは、PSEをコードする配列（すなわち、「コード領域」）、さらには、5’-非翻訳配列および3’-非翻訳配列情報をコードする配列を包含する。あるいはまた、上記核酸分子は、配列番号１に示した配列のうち１つのコード領域だけを含んでいてもよいし、ゲノムDNAから単離された完全なゲノム断片を含んでいてもよい。
別の好ましい実施形態では、本発明に従う単離された核酸分子は、配列番号１に示すヌクレオチド配列のうち１つの相補体である核酸分子、またはその一部分を含む。配列番号１に示すヌクレオチド配列の１つに相補的な核酸は、それが、配列番号１に示したヌクレオチド配列の１つとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成できるように、配列番号１に示したヌクレオチドの配列の１つに対し十分な相補性を有するものである。
配列番号１の配列を有する新規エロンガーゼ核酸配列の相同体とは、例えば、配列番号１に示したヌクレオチド配列と、少なくとも約50〜60％、好ましくは約60〜70％、さらに好ましくは少なくとも約70〜80％、80〜90％、または90〜95％、またさらに好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％以上の相同性を有する対立遺伝子変異体、あるいは、その相同体、誘導体または類似体もしくは一部分を意味する（本発明において、相同性は同一性を意味する）。さらに好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に示すヌクレオチド配列もしくはその一部分の１つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。対立遺伝子変異体は、特に、配列番号１に示した配列からの／へのヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって得ることができる機能的変異体を包含する。しかしながら、合成して得られたタンパク質の酵素活性は、１個以上の遺伝子の挿入に対して有利に保持されるものとする。エロンガーゼの酵素活性を保持するタンパク質とは、配列番号２によりコードされたタンパク質と比較して、本来の酵素活性の少なくとも10％、好ましくは20％、特に好ましくは30％、最も好ましくは40％を保持するタンパク質を意味する。
配列番号１の相同体とは、例えば、コードおよび非コードDNA配列の細菌、真菌または植物の相同体、トランケート型配列、一本鎖DNAまたはRNAも意味する。
配列番号１の相同体はまた、例えば、プロモーター変異体のような誘導体も意味する。前記ヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターは、１以上のヌクレオチド置換、挿入および／または欠失により修飾することができるが、その際、プロモーターの機能性または活性は損なわれない。さらに、プロモーターの活性を、その配列の改変により増加させたり、あるいは、より活性の高いプロモーター（異種生物由来のものでもよい）によってこれらのプロモーターを完全に置換したりすることも可能である。
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１に示した配列の１つのコード領域の一部分、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることができる断片、またはPSEの生物学的に活性な部分をコードする断片を包含するだけの場合もある。フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)由来のPSE遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列によって、プローブおよびプライマーの作製が可能になり、これらは、他の細胞型および生物におけるPSE相同体、ならびに、卵菌綱(Oomycete)または近縁の種由来のPSE相同体を同定し、かつ／またはクローニングするために設計される。プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを包含する。このオリゴヌクレオチドは、典型的に、配列番号１に示した配列のうち１つのセンス鎖、もしくは、配列番号１に示した配列のうち１つのアンチセンス鎖の少なくとも約12個、好ましくは約16個、さらに好ましくは25、40、50または75個連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域、またはそれらの相同体、誘導体および類似体、または天然の突然変異体を包含する。配列番号１のヌクレオチド配列に基づくプライマーをPCR反応で用いることにより、PSE相同体をクローニングすることができる。PSEヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、同一または同種タンパク質をコードする転写産物もしくはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、上記プローブは、さらに、そこに結合した標識基も含み、例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子でよい。これらのプローブは、細胞サンプル中のPSEコード核酸のレベルを測定することにより、例えば、PSE mRNAレベルを検出することにより、またはゲノムPSE遺伝子が突然変異を起こしているかまたは欠失されているかを調べることにより、PSEを誤って発現する細胞を同定するための、ゲノムマーカー試験キットの一部として用いることができる。
一実施形態では、本発明の核酸分子は、タンパク質もしくはその一部分が微生物または植物内で細胞膜の合成に必要な化合物の代謝に関与するか、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持するのに十分な、配列番号２のアミノ酸配列との相同性を有するアミノ酸配列を含む上記タンパク質もしくはその一部分をコードする。本明細書で用いる用語「十分な相同性」とは、タンパク質またはその一部分のアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列と同一であるかまたは同等である最小数のアミノ酸残基（例えば、配列番号２の配列の１つに含まれるアミノ酸残基のような、類似した側鎖を有するアミノ酸残基）を有し、これによって、該タンパク質またはその一部分が微生物もしくは植物内で細胞膜の合成に必要な化合物の代謝に、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与できるようになることを意味する。本明細書に記載するように、膜成分の代謝経路または膜輸送系のタンパク質成分は、１種以上のファインケミカルの生産および分泌に役立つことができる。これら活性の例も本明細書に記載する。従って、「PSEの機能」は、１種以上のファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接的もしくは間接的に貢献する。この触媒活性のPSE基質特異性の例を表１に示す。
別の実施形態では、本発明に従う核酸分子の誘導体は、配列番号２の完全アミノ酸配列に対し、少なくとも約50〜60％、好ましくは少なくとも約60〜70％、さらに好ましくは少なくとも約70〜80％、約80〜90％または90〜95％、最も好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％以上の相同性を有するタンパク質をコードする。
本発明のPSE核酸分子によってコードされるタンパク質の一部分は、好ましくはPSEの生物学的に活性な部分である。本明細書で用いる用語「PSEの生物学的に活性な部分」とは、微生物または植物における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝に、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与するか、または脂肪酸合成に関与するか、あるいは、表１に記載した活性を有する、PSEのセグメント、例えばドメイン／モチーフ、を包含するものとする。PSEまたはその生物学的に活性な部分が、微生物または植物における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝に、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与できるか否かを決定するためには、酵素活性のアッセイを実施することができる。これらのアッセイ方法は、実施例の項の実施例８で詳しく説明するが、当業者には公知である。
PSEの生物学的に活性な部分をコードするその他の核酸断片は、配列番号２に示した配列のうち１つの一部分を単離し、PSEまたはペプチドのコード化部分を発現させた（例えば、in vitroでの組換え発現による）後、PSEまたはペプチドのコード化部分の活性を確認することにより作製することができる。
さらに、本発明は、遺伝暗号の縮重のために、配列番号１に示すヌクレオチド配列（およびその部分）の１つとは異なり、配列番号１に示すヌクレオチド配列によってコードされたものと同じPSEをコードする核酸分子も包含する。別の実施形態では、本発明に従う単離された核酸分子は、配列番号２に示したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、本発明に従う核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列（配列番号１に示すオープンリーディングフレームによってコードされる）と実質的に相同である、全長フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)タンパク質をコードする。
配列番号１に示したフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)PSEヌクレオチド配列以外にも、当業者であれば、集団（例えば、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)集団）内に、PSEのアミノ酸配列の変化を引き起こすDNA配列多型が存在することを認識するだろう。PSE遺伝子におけるこのような遺伝的多型は、自然突然変異により、集団内の個体間に存在しうる。本明細書で用いる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、PSE、好ましくは、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)PSEをコードするオープンリーディングフレームを有する核酸分子を意味する。このような自然突然変異は、通常、PSE遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の変化を生じさせる。このようなヌクレオチド変異、ならびに、その結果起こったPSE中のアミノ酸多型はすべて、自然突然変異の結果であり、PSEの機能活性を改変せず、これらも本発明の範囲に含まれるものとする。
本発明のフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)PSE cDNAの自然変異体ならびに非フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)相同体、誘導体および類似体に対応する核酸分子は、本明細書に開示したフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)PSE核酸に対するその相同性に基づき、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション法に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)cDNAもしくはその一部分を用いて、単離することができる。別の実施形態では、本発明に従う単離された核酸分子は、少なくとも15ヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする。別の実施形態では、核酸は、25、50、100、250以上のヌクレオチドの長さである。本明細書で用いる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、互いに少なくとも60％の相同性を有するヌクレオチド配列が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままの状態で残っているハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を表すものとする。好ましくは、このような条件は、互いに少なくとも約65％、さらに好ましくは少なくとも約70％、さらにまた好ましくは少なくとも約75％以上の相同性を有する配列が、典型的には、互いにハイブリダイズされたままの状態で残っているような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. N.Y.（1989）、6.3.1-6.3.6に見出すことができる。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、約45℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中でハイブリダイズさせた後、50〜65℃で、0.2×SSC、0.1% SDS中で１回以上洗浄する段階からなる。当業者であれば、こうしたハイブリダイゼーション条件がバッファーの温度および濃度に関して、核酸のタイプに応じて、また、例えば有機溶媒が存在するときに、異なってくることを理解している。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」においては、核酸のタイプに応じて、0.1〜5×SSC (pH7.2)の濃度の水性バッファー中、42℃〜58℃の間で温度が変化する。上記のバッファー中に有機溶媒（例えば、50％ホルムアミド）が存在する場合は、標準条件下での温度は約42℃となる。DNA：DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば0.1×SSCおよび20℃〜45℃、好ましくは30℃〜45℃である。DNA：RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば0.1×SSCおよび30℃〜55℃、好ましくは45℃〜55℃である。上記のハイブリダイゼーション温度は、例えば、長さが約100 bp（＝塩基対）、G+C含量が50％で、ホルムアミドが存在しないときの核酸に対して決定されたものである。当業者は、必要となるハイブリダイゼーション条件をどのように決定するかを熟知しており、例えば上記したような参考文献または次の文献：Sambrookら, ”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; HamesおよびHiggins (編) 1985, ”Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press, Oxford University Press, Oxford; Brown (編) 1991, ”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press, Oxford University Press, Oxfordを参考にすることができる。当業者は、ハイブリダイゼーションの展開のタイプおよび時間がハイブリダイゼーションの結果に影響することを知っている。当業者であれば、上記ハイブリダイゼーションがあいまいでない信頼性のある結果を与えるように、展開条件を簡便な実験で最適化することができる。
好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号１の配列とハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書で用いる「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然タンパク質をコードする）RNAまたはDNA分子を意味する。一実施形態では、かかる核酸は、天然のフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)PSEをコードする。
集団内に存在しうるPSE配列の天然に存在する変異体の他に、当業者であれば、さらに、突然変異による変化を配列番号１のヌクレオチド配列に導入することによって、PSEの機能性に悪影響を及ぼすことなく、コードされたPSEのアミノ酸配列に変化を起こすことができることがわかるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換を起こすヌクレオチド置換を、配列番号１の配列に生じさせることができる。「非必須」アミノ酸残基は、PSEの活性を改変することなく、PSE（配列番号２）のうちの１つの野生型配列において改変され得る残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、PSE活性に必要な残基である。しかし、その他のアミノ酸残基（例えば、PSE活性を有するドメインに、保存されていないもの、または半保存しかされていないもの）は、活性に必須ではないと考えられることから、恐らく、PSE活性を変えずに、改変することができるであろう。
従って、本発明のさらに別の態様は、PSE活性に必須ではない、改変されたアミノ酸残基を含むPSEをコードする核酸分子に関する。このようなPSEは、アミノ酸配列に関して、配列番号２に示した配列とは異なるが、本明細書に記載したPSE活性の少なくとも１つは保持している。一実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約50％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、もしくはこれらの膜を介した分子の輸送に関与することができるか、または脂肪酸代謝に関与しているか、あるいは表１に記載した１以上の活性を有する。好ましくは、上記核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号２の配列の１つに対して少なくとも約50〜60％の相同性を有し、好ましくは、配列番号２の配列の１つに対して少なくとも約60〜70％の相同性を有し、さらに好ましくは、配列番号２の配列の１つに対して少なくとも約70〜80％、80〜90％、90〜95％の相同性を有し、最も好ましくは、配列番号２の配列の１つに対して少なくとも約96％、97％、98％もしくは99％の相同性を有する。
２つのアミノ酸配列（例えば、配列番号２の配列の１つと、それらの変異型の１つ）間または２つの核酸間の相同性％を決定するためには、最適な比較（例えば、一方のタンパク質または核酸の配列にギャップを導入することにより、他方のタンパク質または核酸との最適なアラインメントを達成するなど）が可能なように、両配列を並べて記載する。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置に存在するアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。一方の配列（例えば、配列番号２の配列の１つ）内の位置に、他方の配列（例えば、配列番号２から選択された形態の突然変異形態）内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在する場合、これらの分子は、この位置で相同である（すなわち、本明細書で用いるアミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」に相当する）。両配列間の相同性％は、両配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×100）。
配列番号２のタンパク質配列と相同であるPSEをコードする単離された核酸分子は、１以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、配列番号１のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作製することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような標準的技法により、配列番号１の配列の１つに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、１つ以上の推定上の非必須アミノ酸残基で実施するのが好ましい。「保存的アミノ酸置換」では、上記アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖（例えば、トリオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。従って、PSEにおける推定上の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換するのが好ましい。これ以外にも、別の実施形態では、例えば、飽和突然変異誘発により、PSEコード配列の全部または一部分にわたって、ランダムに突然変異を導入した後、得られた突然変異体を、本明細書に記載したPSE活性についてスクリーニングすることによって、PSE活性を保持する突然変異体を同定することができる。配列番号１の配列の１つに突然変異誘発を起こした後、コードされたタンパク質を組換えにより発現させ、例えば、本明細書に記載するアッセイ（実施例を参照）を用いて、該タンパク質の活性を決定することができる。
前記PSEをコードする核酸分子の他に、本発明のさらに別の態様は、前記核酸分子に対して「アンチセンス」である単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な、またはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は水素結合を介してセンス核酸と結合することができる。アンチセンス核酸は完全なPSEコード鎖に相補的であっても、その一部分にのみ相補的であってもよい。一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、PSEをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対して「アンチセンス」である。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域（例えば、開始コドンで開始し、停止コドン、すなわち、停止コドンの直前のコドンで終わる全コード領域）を意味する。さらに別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、PSEをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対して「アンチセンス」である。「非コード領域」という用語は、コード領域と隣接し、かつ、アミノ酸に翻訳されない5’および3’配列（従って、5’-および3’-非翻訳領域とも呼ばれる）を意味する。
本明細書に開示するPSEをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１に示した配列）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合の法則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、PSE mRNAの全コード領域に相補的であってもよいが、PSE mRNAのコード領域または非コード領域の一部分だけに「アンチセンス」であるオリゴヌクレオチドの方が好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PSE mRNAの翻訳開始部位周辺の領域に相補的でありうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが、例えば、約５、10、15、20、25、30、35、40、45または50以上のヌクレオチドのものでよい。本発明のアンチセンス核酸は、化学的合成および酵素的連結反応を用いて、当業者には公知の方法により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドまたは様々な修飾ヌクレオチドを用いて、化学的に合成することができる。この修飾ヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を高めたり、あるいは、アンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重らせんの物理的安定性を高めたりするものであり、例えば、ホスホロチオエート誘導体や、アクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる修飾ヌクレオチドの例として、下記のものを挙げることができる：5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンチルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジアミノプリン。あるいは、核酸をアンチセンス配向にサブクローニングした発現ベクターを用いて、アンチセンス核酸を生物学的に産生させることができる（すなわち、挿入した核酸から転写されるRNAは、目的とする標的核酸に対してアンチセンス配向にあり、これについては、以下の項でさらに詳しく説明する）。
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、これら分子がPSEをコードする細胞性mRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズまたは結合するように、細胞に投与されるか、またはin situで産生され、その結果、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、当該タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重らせんを形成する通常のヌクレオチド相補性により、あるいは、例えば、DNA二重らせんと結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの大きな間隙内での特異的相互作用によって行われる。例えば、上記アンチセンス核酸分子は、それが受容体または所定の細胞表面に発現される抗原と特異的に結合するような様式で、例えば、アンチセンス核酸分子をペプチドまたは抗体（それぞれが細胞表面受容体または抗原と結合する）に結合させることにより、修飾することができる。また、本明細書に記載するベクターを用いて、上記細胞にアンチセンス核酸分子を送達することも可能である。上記アンチセンス核酸分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、該アンチセンス核酸分子が、強力な原核性、ウイルス性または真核性プロモーター（植物プロモーターを含む）の制御下にあるベクター構築物が好ましい。
別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、その鎖は、通常のβユニットとは対照的に、互いに平行である（Gaultierら（1987）Nucleic Acids Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた、2’-o-メチルリボヌクレオチド（Inoueら（1987）Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら（1987）FEBS Lett. 215:327-330）を包含しうる。
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それに対し相補的な領域を有する一本鎖核酸（mRNAなど）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（HaselhoffおよびGerlach（1988）Nature 334：585-591））をPSE mRNA転写物の触媒切断に用いて、PSE mRNAの翻訳を阻害することができる。PSEをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書において開示するPSE cDNAのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１に示した38 CK21 g07fwd）に基づき、あるいは、本発明に教示する方法に従って単離される異種配列に基づいて設計することができる。例えば、テトラヒメナ-L-19-IVS RNAの誘導体を構築することができ、その際、活性部位のヌクレオチド配列は、PSEをコードするmRNA中の切断しようとするヌクレオチド配列と相補的である。例えば、Cechら、米国特許第4,987,071号およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照されたい。この他に、PSE mRNAを用いて、RNA分子のプールの中から、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択することができる（例えば、Bartel, D.およびSzostak, J.W.（1993）Science 261：1411-1418を参照されたい）。
この他に、PSEヌクレオチド配列の調節領域（例えば、PSEプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を、三重らせん構造（標的細胞におけるPSE遺伝子の転写を阻止する）が形成されるように指令することによって、PSE遺伝子発現を阻害することができる。概要については、Helene, C.（1991）Anticancer Drug Res. 6（6） 569-84；Helene, C.ら（1992）Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36；およびMaher. L.J.（1992）Bioassays 14（12）：807-815を参照されたい。
あるいはまた、PSE遺伝子発現を共抑制によって阻害することもできる；アンチセンス鎖／センス鎖の組合せの同時発現（RNAi技法）も有利であると考えられる。
Ｂ．遺伝子構築物
本発明の別の実施形態は、新規遺伝子構築物であり、該構築物は、脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC16-および／またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする植物または真菌由来の単離された核酸、または配列番号１の遺伝子配列、その相同体、誘導体もしくは類似体が、有利には遺伝子発現を高めるために、１以上の調節シグナルに機能的に連結されている。これら調節配列の例として、インデューサーまたはリプレッサーに結合することによって核酸の発現を調節する配列がある。これら新規の調節配列以外にも、これらの配列の自然調節が実際の構造遺伝子の前にまだ存在し、適宜、遺伝子的に改変されており、その結果、自然調節がオフに切り替えられて、遺伝子の発現が増強されている。しかし、遺伝子構築物は、これより単純な構造を有するものであってもよく、すなわち、配列番号１の配列またはその相同体の前には追加の調節シグナルがまったく挿入されておらず、その調節をつかさどる天然プロモーターが欠失されていないものであってよい。これに代わり、天然調節配列は、調節がもはや起きないようにして、遺伝子発現が増強されるように、突然変異を起こさせたものであってもよい。上記遺伝子構築物はさらに、プロモーターに機能的に連結され、核酸配列の発現を高めることができる１以上のいわゆるエンハンサー配列を含有すれば有利である。また、DNA配列の3’末端に有利な配列（例えば、さらに別の調節エレメントまたはターミネーター）を挿入することも可能である。エロンガーゼ遺伝子は、遺伝子構築物において１以上のコピーで存在することができる。生物にさらに別の遺伝子を挿入する場合には、挿入しようとする別の遺伝子が上記遺伝子構築物に存在するのが有利である。
上記新規の方法に有利な調節配列は、例えば、下記のようなプロモーター：cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRまたはλ-PLプロモーターに存在し、グラム陰性菌で用いるのが有利である。別の有利な調節配列は、例えば、下記のプロモーターに存在する：グラム陽性プロモーターamyおよびSPO2；酵母もしくは真菌プロモーターADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH；または植物プロモーターCaMV/35S［Franckら、Cell 21（1980）285-294］、PRP1［Wardら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）］、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos、または、ユビキチンもしくはファセオリンプロモーター。本発明では、下記のような誘導プロモーターも有利である：例えば、EP-A-0 388 186（ベンゼンスルホンアミド誘導性）、Plant J. 2、1992:397-404（Gatzら、テトラサイクリン−誘導性）、EP-A-0 335 528（アブシジン酸誘導性）またはWO 93/21334（エタノールまたはシクロヘキセノール誘導性）に記載されている各種プロモーター。その他の有用な植物プロモーターとして、細胞質ゾルのFBPaseプロモーターまたはジャガイモのST-LSIプロモーター（Stockhausら、EMBO J. 8, 1989, 2445）、ダイズ（Glysine max）のホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼプロモーター（GenBank登録番号U87999）または、EP-A-0 249 676に記載された節(node)特異的プロモーターがある。特に有利なプロモーターは、脂肪酸生合成に関与する組織での発現を可能にするプロモーターである。非常に有利なものは、usp、LEB4、ファセオリンまたはナピンプロモーターなどの種子特異的プロモーターである。これ以外の特に有利なプロモーターは、単子葉植物または双子葉植物に用いることができる種子特異的プロモーターであり、米国特許第5,608,152号（アブラナ由来のナピンプロモーター）、WO 98/45461（シロイヌナズナ由来のファセオリンプロモーター）、米国特許第5,504,200号（インゲンマメ由来のファセオリンプロモーター）、WO 91/13980（アブラナ由来のBce4プロモーター）、Baeumleinら、Plant J., 2, 2, 1992:233-239（マメ科由来のLEB4プロモーター）に記載されているが、これらのプロモーターは双子葉植物に適している。下記のプロモーターは、例えば、単子葉植物に適している：オオムギ由来のlpt-2またはlpt-1プロモーター（WO 95/15389およびWO 95/23230）、オオムギ由来のホルデインプロモーター、ならびに、WO 99/16890に記載されたその他の有用なプロモーター。
原則として、新規の方法には、上記のようなすべての天然プロモーターをそれらの調節配列と共に使用することが可能である。また、さらに、合成プロモーターを用いることも可能であり、有利でもある。
前述のように、遺伝子構築物は、生物に導入しようとする別の遺伝子を含んでいてもよい。インデューサー、リプレッサーまたは酵素の遺伝子（その酵素活性によって、生合成経路の１以上の遺伝子の調節に介入する）のような調節遺伝子を宿主生物に挿入し、そこで発現させることが可能であり、しかも有利である。これらの遺伝子は、異種または同種いずれの供給源に由来するものでもよい。挿入された遺伝子は、それ自身のプロモーターを持っているか、あるいは、配列番号１の配列のプロモーターまたはその相同体の制御下においてもよい。
存在するその他の遺伝子を発現させるためには、上記遺伝子構築物に、発現を増強する3’-および／または5’-末端調節配列をさらに含有させれば有利であり、これらは、選択した宿主生物および遺伝子に応じて、最適な発現を達成すべく選択される。
前述のように、これらの調節配列は、遺伝子およびタンパク質発現の特異的発現を可能にすることを目的とする。宿主生物によっては、これは、例えば、遺伝子が誘導後に初めて発現または過剰発現するか、あるいは、直ちに発現および／または過剰発現することを意味する場合もある。
さらに、調節配列または調節因子は、好ましくは、導入された遺伝子の発現に有利な作用を及ぼし、これによって発現を増強することができる。このように、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いて、調節エレメントを転写レベルで有利に増強することが可能である。しかし、例えば、mRNA安定性を高めることにより、翻訳を増強することも可能である。
Ｃ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のさらに別の態様は、PSE（またはその一部分）をコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、別の核酸に結合し、これを輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの一タイプとして、「プラスミド」があり、これは、環状の二本鎖DNAループを意味し、そこに、別のDNAセグメントを連結することができる。ベクターのさらに別のタイプは、ウイルスベクターであり、別のDNAセグメントを該ウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、ならびに、エピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれるため、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を指令することができる。本明細書では、このようなベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えDNA技法に有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をしていることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、置き換え可能に用いることができる。というのは、プラスミドは、ベクターの形態で用いられることが最も多いからである。しかし、本発明は、同様の機能を有するウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ近縁ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも包含するものとする。さらに、用語「ベクター」は、当業者に公知のその他のベクターも包含するものとする。かかるベクターの例としては、ファージ、ウイルス（例えば、SV40、CMV、バキュロウイルス、およびアデノウイルス）、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、ならびに線状または環状DNAを挙げることができる。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸を発現するのに適した形態をした、本発明の核酸、または本発明の遺伝子構築物を含む。すなわち、上記組換え発現ベクターは、発現に用いようとする宿主細胞に基づいて選択され、かつ、発現させようとする核酸配列に機能的に連結した１以上の調節配列を包含する。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結した」とは、目的とするヌクレオチド配列が、調節配列に結合し、これによって、ヌクレオチド配列の発現が可能になり、相互に結合することにより、両配列が、それぞれに特有とみなされる、予想される機能を果たすようにすることを意味する（例えば、ベクターを宿主細胞に導入する場合には、in vitro転写／翻訳系または宿主細胞において機能を果たす）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel：Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）に記載されている。また、下記文献も参照されたい：GruberおよびCrosby、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton、Florida編：GlickおよびThompson、第７章、89-108（その中の参照文献も含む）。調節配列は、多種の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を制御するもの、ならびに、特定の条件下で、特定の宿主細胞でしか、ヌクレオチド配列の直接発現を制御しないものを包含する。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子によって違ってくることがわかるだろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載した核酸（例えば、PSE、変異型PSE、融合タンパク質など）によりコードされる、融合タンパク質もしくは融合ペプチドなどのタンパク質またはペプチドを生産することができる。
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核生物細胞においてPSEを発現させるために設計することができる。例えば、PSE遺伝子は、C.グルタミクム（C. glutamicum）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母およびその他の真菌細胞（Romanos, M. A.ら、（1992）”Foreign gene expression in yeast：a review”, Yeast 8:423-488；van den Hondel, C.A.M.J.J.ら（1991）”Heterologous gene expression in filamentous fungi”：More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure編, p. 396-428：Academic Press：San Diego；およびvan den Hondel, C.A.M.J.J.およびPunt, P. J.（1991）”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi：Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.ら、編、p. 1-28、Cambridge University Press：Cambridge）、藻類（Falciatoreら、1999、Marine Biotechnology. 1, 3:239-251）、以下のタイプの繊毛虫：全毛亜綱（Holotrichia）、周毛亜綱（Peritrichia）、旋毛亜綱（Spirotrichia）、吸滴虫綱（Suctoria）、テトラヒメナ属（Tetrahymena）、ゾウリムシ属（Paramecium）、コルピディウム属（Colpidium）、グラウコマ属（Glaucoma）、フクロミズケムシ属（Platyophrya）、ポトマカス（Potomacus）、シュードコニレンバス属（ASEudocohnilembus）、ユープロテス属（Euprotes）、エンゲルマニエラ属（Engelmaniella）およびスチロニキア属（Stylonichia）、特に、スチロニキア・レムネ（Stylonychia lemnae）属の繊毛虫、ならびに、多細胞植物の細胞（Schmidt, R.およびWillmitzer, L.（1988）”High efficiency Agrobacterium tumefacians-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.：583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton、Florida、第6／7章、p.71-119（1993）；F.F. White, B. Jenesら、Techniques for Gene Transfer：Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, KungおよびR. Wu編, Academic Press（1993）、128-43；Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42（1991）、205-225（およびその中の参照文献）を参照）または非ヒト哺乳動物細胞において、ベクターを用い、WO 98/01572に記載されているような形質転換方法を用いて、発現させることができる。適した宿主細胞については、Goeddel, Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）にさらに詳しく記載されている。この他に、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、組換え発現ベクターをin vitroで転写および翻訳させることもできる。
原核生物におけるタンパク質の発現は、通常、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を制御する構成または誘導プロモーターを含むベクターを用いて、実施されている。融合ベクターは、一連のアミノ酸を、そこにコードされているタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に付加するが、C末端に付加することもあれば、タンパク質中の適した領域内に融合することもある。このような融合ベクターは、通常、３つの働き、すなわち、1）組換えタンパク質の発現を増強すること；2）組換えタンパク質の溶解性を高めること；3）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を容易にすること、を果たす。融合発現ベクターの場合には、タンパク質加水分解による切断部位は、融合単位と組換えタンパク質の連結部位で、導入されることが多く、これにより、融合タンパク質の精製後に、組換えタンパク質を融合単位から分離することができる。これら酵素とそれらのコグネート認識配列は、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。
典型的な融合発現ベクターとしては、特に、pGEX（Pharmacia Biotech Inc； Smith, D. B.およびJohnson, K. S. （1988）Gene 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs、マサチューセッツ州バーバーリー）およびpRIT5（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられ、これらのベクターは、それぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース-E-結合タンパク質またはプロテインAを、組換え標的タンパク質に融合させる。一実施形態では、PSEのコード配列をpGEX発現ベクターにクローニングすることにより、融合タンパク質をコードするベクターを作製する。ここで、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、GST-トロンビン切断部位-X-タンパク質を含む。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。GSTと融合していない組換えPSEは、トロンビンを用いて融合タンパク質を切断することによって回収することができる。
好適な誘導非融合大腸菌発現ベクターの例として、特に、pTrc（Amannら（1988）Gene 69：301-315）およびpET 11d（Studierら、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）60-89）が挙げられる。pTrcベクター由来の標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼによる転写に基づいて起こる。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、T7-gn10-lac融合プロモーターからの転写に基づいて起こり、この転写は、共発現したウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって媒介される。上記ウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写制御下でT7 gn1遺伝子を保有する常在性λプロファージから、宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により提供される。
原核生物で有用なその他のベクターは、当業者には公知であり、このようなベクターは、例えば、下記のものに存在する：大腸菌pLG338、pACYC184、pBR322のようなpBRシリーズ、pUC18またはpUC19のようなpUCシリーズ、M113mpシリーズ、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11またはpBdCI；ストレプトミセス属pIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361；バチルス属pUB110、pC194またはpBD214、コリネバクテリウム属pSA77またはpAJ667。
組換えタンパク質の発現を最大限にする戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する能力が損なわれている宿主細菌においてタンパク質を発現させるというものである（Gottesman, S.、Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）119-128）。さらに別の戦略によれば、発現ベクターに挿入しようとする核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸の個々のコドンが、C.グルタミクム（C. glutamicum）のように、発現のために選択した細菌において優先的に用いられるようにする（Wadaら（1992）Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。本発明のこのような核酸配列の改変は、標準的DNA合成方法により実施される。
さらに別の実施形態では、PSE発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母菌サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）における発現のためのベクターの例として、pYeASec1（Baldariら、（1987）Embo J.6:229-234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz、（1982）Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら（1987）Gene 54:113-123）およびpYES2（Invitrogen Corporation、カリフォルニア州サンディエゴ）が挙げられる。糸状菌のようなその他の真菌で用いるのに適したベクターを構築するためのベクターおよび方法として、下記に詳しく記載されたものが挙げられる：van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J.（1991）”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi：Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdyら編、p. 1-28、Cambridge University Press：ケンブリッジ、もしくは：More Gene Manipulations in Fungi（J.W. Bennet & L.L. Lasure編、p. 396-428：Academic Press：サンディエゴ）。さらに好適な酵母ベクターとして、例えば、2μM、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMLYe23が挙げられる。
上記以外に、本発明のPSEは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞で発現させてもよい。培養した昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）においてタンパク質を発現させるのに使用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ（Smithら（1983）Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers（1989）Virology 170:31-39）が挙げられる。
前記ベクターは、考えられる好適なベクターのほんの一部を挙げたものにすぎない。その他のプラスミドは、当業者には公知であり、例えば、下記に記載されている：Cloning Vectors（Pouwels, P.H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018）。
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞において発現させる。哺乳動物発現ベクターの例として、pCDM8（Seed, B.（1987）Nature 329:840）およびpMT2PC（Kaufmanら（1987）EMBO J. 6:187-195）が挙げられる。哺乳動物細胞に用いる場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントにより賦与されることが多い。通常用いられるプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来するものである。原核および真核細胞に適したその他の発現系については、下記の文献を参照されたい：Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T., Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版の第16および17章、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、1989）。
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、好ましくは特定の細胞型において、核酸の発現を指令することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを用いて核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当業者には公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、下記のものが挙げられる：アルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkertら（1987）Gene Dev. 1：268-277）、リンパ球特異的プロモーター（CalameおよびEaton（1988）Adv. Immunol. 43：235-275）、特に、T-細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（1989）EMBO J. 8:729-733）およびイムノグロブリン（Banerjiら（1983）Cell 33:729-740；QueenおよびBaltimore（1983）Cell 33:741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（1989）PNAS 86:5473-5477）、膵特異的プロモーター（Edlundら（1985）Science 230:912-916）および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4, 873, 316号および欧州特許出願公開番号264,166）。また、発生調節プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター（KesselおよびGruss（1990）Science 249:374-379）およびフェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（1989）Genes Dev. 3:537-546）も含まれる。
別の実施形態では、本発明のPSEは、単細胞植物細胞（藻類など）（Falciatoreら、1999、Marine Biotechnology 1（３）：239-251およびそこで引用される参照文献を参照）、ならびに、それより高等の植物（例えば、穀物のような種子植物）由来の植物細胞において発現させることができる。植物発現ベクターの例として、下記の文献に詳しく記載されているものが挙げられる：Becker, D., Kemper, E., Schell, J.およびMasterson, R.（1992）”New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20：1195-1197；ならびに、Bevan, M.W.（1984）”Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants：Transgenic Plants、第１巻、Engineering and Utilization、KungおよびR. Wu編、Academic Press, 1993, pp. 15-38。
植物発現カセットは、好ましくは、植物細胞における遺伝子発現を駆動することができ、かつ、機能的に連結された調節配列を含み、これによって、各配列は、転写終結、例えば、ポリアデニル化シグナルなどの機能を果たすことができる。好ましいポリアデニル化シグナルは、オクトピンシンターゼとして知られる、Ti プラスミドpTiACH5の遺伝子３（Gielenら、EMBO J. 3（1984）835以下参照）、またはその機能的同等物のようなアグロバクテリウム・ツメファシエンスT-DNAに由来するものであるが、その他、植物において機能的に活性なターミネーターもすべて適している。
非常に多くの場合、植物遺伝子発現は、転写レベルに限定されないことから、植物発現カセットは、翻訳エンハンサー（例えば、オーバードライブ配列）のような機能的に連結された別の配列を含むのが好ましい。このオーバードライブ配列は、タバコモザイクウイルス由来の5’-非翻訳リーダー配列を含み、この配列が、タンパク質／RNA比を高める（Gallieら、1987、Nucl. Acids Research 15:8693-8711）。
植物遺伝子発現は、適したプロモーターに機能的に連結させて、このプロモーターが、細胞または組織特異的に、適正なタイミングで、遺伝子発現をもたらすようにしなければならない。好ましいものとして、構成的発現を駆動するプロモーター（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）2195-2202）、例えば、35S CaMV（Franckら、Cell 21（1980）285-294）、19S CaMV（米国特許第5,352,605号およびWO 84/02913も参照）のような植物ウイルス由来のプロモーター、または、米国特許第4,962,028号に記載されているRubisco小サブユニット由来のプロモーターのような植物プロモーターがある。
植物遺伝子発現カセットにおける機能的連結に用いるのに好ましいその他の配列は、ターゲッティング配列であり、これは、遺伝子産物を、その適切な細胞小器官、例えば、液胞、核、アミロプラスト、葉緑体および有色体のようなあらゆる種類の色素体、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、エライオプラスト、ペロキシソームおよびその他の植物細胞小器官に、指令するのに必要である（詳しくは、Kermode、Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4（1996）285-423およびそこに引用された参照文献を参照）。
植物遺伝子発現はまた、化学的に誘導可能なプロモーター（詳しくは、Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108を参照）を介して促進することも可能である。遺伝子発現が、適正なタイミングで特異的に起こるようにしたい場合には、化学的に誘導可能なプロモーターが特に適している。このようなプロモーターの例として、サリチル酸誘導プロモーター（WO 95/19443）、テトラサイクリン−誘導プロモーター（Gatzら（1992）Plant J. 2, 397-404）およびエタノール誘導性プロモーター（WO 93/21334）が挙げられる。
また、生物または非生物的ストレス条件に応答するプロモーターも好適なプロモーターであり、例えば、病原体誘導性PRP1遺伝子プロモーター（Wardら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）361-366）、トマト由来の熱誘導性hsp80プロモーター（米国特許第5,187,267号）、ジャガイモ由来の低温誘導性αアミラーゼプロモーター（WO 96/12814）または損傷誘導性pinIIプロモーター（EP-A-0 375 091）が挙げられる。
特に、脂質および油生合成が行われる組織および器官や、内乳および発生過程にある胚の細胞のような種子細胞において、遺伝子発現をもたらすプロモーターが好ましい。好適なプロモーターとして、下記を挙げることができる：アブラナ由来のナピン（napin）遺伝子プロモーター（米国特許第5,608,152号）、ソラマメ由来のUSPプロモーター（Baeumleinら、Mol Gen Genet, 1991, 225（３）：459-67）、シロイヌナズナ由来のオレオシンプロモーター（WO 98/45461）、インゲンマメ由来のファセオリンプロモーター（米国特許第5,504,200号）、アブラナ由来のBce4プロモーター（WO 91/13980）またはレグミンB4プロモーター（LeB4；Baeumleinら、1992、Plant Journal, 2（２）：233-9）、ならびに、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物に種子特異的発現をもたらすプロモーター。好適な注目すべきプロモーターとして、オオムギ由来のlpt2もしくはlpt1遺伝子プロモーター（WO 95/15389およびWO 95/23230）、または、WO 99/16890に記載されたプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、コメグルテリン遺伝子、コメオリジン（oryzin）遺伝子、コメプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカジリン遺伝子、およびライムギセカリン遺伝子に由来するプロモーター）がある。
また、色素体特異的遺伝子発現を起こすプロモーターも特に適している。というのは、色素体は、脂質生合成の前駆体、およびいくつかの最終産物が合成される細胞小器官だからである。ウイルスRNAポリメラーゼプロモーターのような好適なプロモーターは、WO 95/16783およびWO 97/06250に、また、シロイヌナズナ由来のclpPプロモーターについては、WO 99/46394に記載されている。
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングした、本発明のDNA分子を包含する組換え発現ベクターを提供する。すなわち、PSE mRNAに対して「アンチセンス」のRNA分子の発現（DNA分子の転写により発現される）が可能になるように、DNA分子を調節配列に機能的に連結する。調節配列は、アンチセンス配向でクローニングされた核酸に機能的に連結され、かつ、様々な細胞型においてアンチセンスRNA分子の連続的発現を指令するもの、例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択するか、あるいは、アンチセンスRNAの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指令する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が、非常に効率的な調節領域の制御下で生産される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態で存在することができ、該領域の活性は、ベクターが導入された細胞型により決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節について詳しくは、Weintraub, H.ら、Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics、第１巻（１）1986を参照されたい。
本発明のさらに別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「トランスジェニック宿主細胞」という用語は、本明細書では置き換え可能に用いる。当然、これらの用語が、特定の対象細胞だけを指すものではなく、この細胞の子孫または潜在的子孫も意味することは理解されよう。特定の改変は、突然変異または環境影響により、後の世代で起こる可能性もあるため、この子孫は、必ずしも母細胞と同じわけではないが、本明細書で用いる用語が意味する範囲に含まれる。
宿主細胞は、原核または真核生物いずれの細胞でもよい。例えば、PSEは、C.グルタミクム（C. glutamicum）のような細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞など）、藻類、繊毛虫、植物細胞、真核、またはC.グルタミクム（C. glutamicum）のようなその他の微生物において発現させることができる。その他の好適な宿主細胞は、当業者には公知である。
ベクターDNAは、通常の形質転換またはトランスフェクション方法により、原核または真核生物細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」、接合および形質導入は、宿主細胞に外来核酸（例えば、DNA）を導入するための、当業界で認識される様々な方法を意味し、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然受容能、化学的媒介導入、エレクトロポレーションまたは粒子射撃法などが挙げられる。植物細胞を含む、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、下記の文献にみいだすことができる：Sambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual.、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、1989）およびその他の研究室マニュアル、例えば、Methods in Molecular Biology, 1995、第44巻、Agrobacterium protocols、GartlandおよびDavey編、Humana Press、ニュージャージー州トトワ。
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションについては、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション方法によっては、小さい画分の細胞しか、外来DNAをそのゲノムに組み込めないことが知られている。これらの組込み体（integrants）を同定および選択するためには、一般に、選択マーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質に対する耐性）を、目的とする遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは、G418、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬剤に耐性を賦与するもの、あるいは、植物では、グリホスフェート（glyphosphate）またはグルホシネート（glufosinate）のような除草剤に対する耐性を賦与するものを包含する。さらなる好適なマーカーは、例えば、β-ガラクトシダーゼ、ura3またはilv2のような糖類またはアミノ酸等の生合成経路に関わる遺伝子をコードするマーカーである。ルシフェラーゼ、gfpまたは他の蛍光遺伝子等の遺伝子をコードするマーカーも好適である。これらの遺伝子が、例えば従来からある方法により、欠失されていることから該遺伝子が機能していない突然変異体において、これらのマーカーを使用することができる。さらにまた、選択マーカーをコードする核酸を、PSEをコードするのと同じベクター上で宿主細胞に導入する、あるいは、別のベクター上で導入することもできる。導入した核酸により安定してトランスフェクションされた細胞は、例えば、薬剤選択（例えば、選択マーカーを組み込んだ細胞は生存するのに対し、他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
相同的な組換え微生物を生産するためには、PSE遺伝子の少なくとも一部分を含むベクターを作製する。その際、この遺伝子に、欠失、付加または置換を導入することにより、PSE遺伝子を改変する、例えば、該遺伝子を機能的に破壊しておく。好ましくは、このPSE遺伝子は、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)またはフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)のPSE遺伝子であるが、その他の生物由来の相同体または類似体、例えば哺乳動物、真菌もしくは昆虫由来のものでさえも使用することができる。好ましい実施形態では、相同的組換え時に、内在性PSE遺伝子が機能的に破壊されるようにベクター（すなわち、機能タンパク質をそれ以上コードしない：ノックアウトベクターともよばれる）を設計する。これ以外にも、相同的組換え時に、内在性PSE遺伝子を突然変異させる、あるいは、改変するが、依然として機能タンパク質をコードする（例えば、上流調節領域を改変することにより、内在性PSEの発現を改変する）ように、ベクターを設計することもできる。相同的組換えによって点突然変異を発生させるためには、キメラ形成法としても知られ、Cole-Straussら、1999、Nucleic Acids Research 27（5）：1323-1330およびKmiec, Gene Therapy, 1999, American Scientist, 87（3）：240-247に記載されている、DNA-RNAハイブリッドを用いることもできる。
相同的組換え用のベクターでは、PSE遺伝子の改変部分には、PSE遺伝子の別の核酸が、その5’および3’末端に隣接しているため、ベクター上に存在する外因性PSE遺伝子と、微生物または植物中の内在性PSE遺伝子との間で、相同的組換えが可能である。隣接する別のPSE核酸は、内在性遺伝子との相同的組換えを達成するのに十分な長さを有する。典型的には、数百塩基対からキロベースの隣接DNA（5’および3’末端の両方で）が、ベクターに含まれる（相同的組換えベクターについては、例えば、Thomas, K. R.およびCapecchi, M. R.（1987）Cell 51:503を、また、cDNAに基づくフィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)における組換えに関しては、Streppら、1998、PNAS, 95（8）：4368-4373を参照のこと）。上記ベクターは、微生物または植物細胞に導入し（例えば、ポリエチレングリコール媒介DNAによる）、次に、導入されたPSE遺伝子が、内在性PSE遺伝子で相同的に組換えられている細胞を、当業者には公知の方法を用いて選択する。
別の実施形態では、導入された遺伝子の調節発現を可能にする選択された系を含む、微生物のような組換え生物を産生することができる。例えば、Lac-オペロンの制御下に置いたベクターにPSE遺伝子を含有させることにより、IPTGの存在下でのみPSE遺伝子の発現が可能となる。このような調節系は、当業者には公知である。
培養下でまたはフィールドで生育されている原核または真核宿主細胞などの、本発明の宿主細胞を用いて、PSEを生産する（すなわち、発現させる）ことができる。植物では、エレクトロポレーションまたはアグロバクテリウム媒介の遺伝子導入により、発育中の花にDNAを直接導入することからなる、さらに別の方法を用いることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてPSEを生産する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、本発明の宿主細胞（そこに、PSEをコードする組換え発現ベクターが導入されているか、または、そのゲノムに、野生型もしくは改変型PSEが導入されている）を適当な培地で培養し、PSEを生産することからなる。別の実施形態では、この方法は、培地または宿主細胞からPSEを単離することをさらに含む。
本発明の核酸を取り込むのに一般的に適した宿主細胞、本発明の新規な遺伝子産物、または本発明のベクターは、いずれの原核または真核生物であってもよい。有利に用いられる宿主生物は、細菌、真菌、酵母などの生物、非ヒト動物細胞または植物細胞である。これ以外に有利な生物は、非ヒト動物、あるいは、好ましくは、植物またはそれらの一部分である。真菌、酵母または植物を用いるのが好ましいが、特に、多量の脂質化合物を含有する脂肪種子植物などの植物、例えば、アブラナ、マツヨイグサ、キャノーラ、ラッカセイ、アマニ、ダイズ、アザミ、ヒマワリ、ルリヂサ；あるいは、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、コメ、オオムギ、ワタ、キャッサバ、コショウ、マンジュギクなどの植物；ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトなどのナス科植物；ソラマメ属種、エンドウ、アルファルファ、低木植物（コーヒー、カカオ、チャ）、ヤナギ属種、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）ならびに、多年生草および飼料穀物が非常に好ましい。本発明において、特に好ましい植物は、ダイズ、ラッカセイ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）などの脂肪種子植物である。
例えば、本発明の核酸配列、該核酸配列を含む発現カセット(=遺伝子構築物)もしくはベクター、または本発明の核酸配列、発現カセットもしくはベクターを用いて形質転換した生物に関して、「トランスジェニック」とは、
a) 本発明の核酸配列、または
b) 本発明の核酸配列と機能的に結合された遺伝子制御配列（例：プロモーター）、または
c) (a)および(b)、
がそれらの天然の遺伝子環境にないか、または組換え法により改変されている、組換え法によりもたらされた全ての構築物をさす。考えられる改変の例は、１個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位または挿入である。「天然の遺伝子環境」とは、供給源生物における天然の染色体位置をさすか、またはゲノムライブラリーにおける存在をさす。ゲノムライブラリーの場合には、核酸配列の天然の遺伝子環境が少なくとも一部保持されていることが好ましい。前記環境は少なくとも一方の側面に該核酸配列が隣接し、少なくとも50 bp、好ましくは少なくとも500 bp、特に好ましくは少なくとも1000 bp、最も好ましくは少なくとも5000 bpの長さの配列を有する。天然の発現カセット、例えば、本発明の核酸配列の天然のプロモーターと当該PSE遺伝子との天然に存在する組合せは、当該PSE遺伝子が非天然の合成（「人工」）方法（例：突然変異誘発処理）により改変されている場合、トランスジェニック発現カセットとなる。かかる方法は、例えば、米国特許第5,565,350号または国際公開WO 00/15815中に記載されている。
さらに、本発明は、本発明の核酸配列、発現カセットもしくはベクターの少なくとも１つで形質転換されたトランスジェニック生物、ならびに、かかる生物に由来する細胞、細胞培養物、組織、部分（例えば、植物体の場合、葉、根など）、もしくは増殖材料に関する。
Ｄ．単離されたPSE
本発明のさらに別の態様は、単離されたPSEおよびその生物学的に活性な部分に関する。「単離された」または「精製された」タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分とは、組換えDNA方法により生産された場合には細胞材料を実質的に含まず、また、化学的に合成された場合には化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という表現は、タンパク質が、それが天然にもしくは組換えにより生産される細胞の細胞成分から分離されたPSE調製物を意味する。一実施形態では、「細胞材料を本質的に含まない」という表現は、非PSE（本明細書では、「汚染タンパク質」とも呼ぶ）の含有率が、約30％（乾量に基づく）より少ない、さらに好ましくは約20％より少ない、さらにまた好ましくは約10％より少ない、最も好ましくは約５％より少ないPSE調製物を意味する。PSEまたはその生物学的に活性な部分が、組換え方法によって生産される場合には、これも、培地を実質的に含まない、すなわち、培地の量が、タンパク質調製物の量の約20％より少ない、さらに好ましくは約10％より少ない、最も好ましくは約５％より少ない。「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という表現は、タンパク質が、その合成に関与する化学的前駆体またはその他の化学物質から分離されたPSE調製物を意味する。一実施形態では、「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という表現は、化学的前駆体または非PSE化学物質の含有率が、約30％（乾量に基づく）より少ない、さらに好ましくは約20％より少ない、さらにまた好ましくは約10％より少ない、最も好ましくは約５％より少ないPSE調製物を意味する。好ましい実施形態では、単離されたタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、PSEが由来する同じ生物からの汚染タンパク質を含まない。これらのタンパク質は、通常、その他の真菌、植物または微生物、例えばC. グルタミクム（C. glutamicum）などの細菌、モルティエレラ属（Mortierella）などの真菌、サッカロミセス属（Saccharomyces）などの酵母、繊毛虫、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）などのコケ植物、または油料作物における、例えば、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）PSEの組換え発現により生産される。
本発明の単離されたPSEまたはその一部分は、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、もしくは、これらの膜を介した分子の輸送に関与しているか、または、脂肪酸代謝に関与しているか、または、表１に示した１以上の活性を有している。好ましい実施形態では、上記タンパク質またはその一部分は、これらが、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、もしくは、これらの膜を介した分子の輸送、または、脂肪酸代謝に関与する能力を保持する上で、配列番号２のアミノ酸配列と十分な相同性を有するアミノ酸配列を含む。上記タンパク質の一部分は、好ましくは、本明細書に記載されている生物学的に活性な部分である。別の好ましい実施形態では、本発明のPSEは、配列番号２に示す１つのアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、上記PSEは、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する。さらに別の好ましい実施形態では、上記PSEは、配列番号２のアミノ酸配列の１つと、少なくとも約50〜60％、好ましくは少なくとも約60〜70％、より好ましくは少なくとも約70〜80％、80〜90％、90％〜95％、さらに好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％以上の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有する。また、本発明の好ましいPSEは、本明細書に記載したPSE活性の少なくとも１つを有するのが好ましい。例えば、本発明の好ましいPSEは、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつ、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）における細胞膜の構築に必要な化合物の代謝、もしくは、これらの膜を介した分子の輸送に関与するか、または、脂肪酸代謝に関与するか、または、表１に示した１種以上の活性を有する、ヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、PSEは、配列番号２に示すアミノ酸配列と実質的に相同であり、配列番号２の配列のうち１配列のタンパク質の機能的活性を保持するが、それらのアミノ酸配列は、前記の第Ｉ項で詳しく記載したように、自然突然変異または突然変異誘発のために異なっている。従って、別の実施形態では、上記PSEは、配列番号２の完全アミノ酸配列と、少なくとも約50〜60％、好ましくは少なくとも約60〜70％、さらに好ましくは少なくとも約70〜80％、80〜90％、90％〜95％、最も好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％以上の相同性を有し、かつ、本明細書に記載したPSE活性の少なくとも１種を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。別の実施形態では、本発明は、配列番号２の完全アミノ酸配列と実質的に相同的な、完全なフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）タンパク質に関する。
PSEの生物学的に活性な部分とは、PSEのアミノ酸配列、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列、または、PSEと相同なタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを意味し、このようなペプチドは、PSEと相同な全長タンパク質の全長アミノ酸配列より少ないアミノ酸を含み、かつPSEの少なくとも１種の活性を呈示する。典型的には、生物学的に活性な部分（ペプチド、例えば、長さが、例えば、５、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100以上のアミノ酸であるペプチド）は、PSEの少なくとも１種の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、これ以外にも、上記タンパク質の他の領域が欠失した、生物学的に活性な部分を組換え方法により生産し、前記活性の１以上に関して評価することができる。好ましくは、PSEの生物学的に活性な部分は、生物学的活性を有する１以上の選択されたドメイン／モチーフまたはそれらの一部分を含む。
PSEは、組換えDNA方法により生産されるのが好ましい。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングした（前記のように行う）後、発現ベクターを宿主細胞に導入し（前記のように行う）、PSEを宿主細胞で発現させる。次に、適切な精製スキームにより、標準的タンパク質精製法を用いて、その細胞からPSEを単離することができる。組換え発現に代わる方法として、標準的ペプチド合成法により、PSE、ポリペプチド、またはペプチドを化学的に合成することができる。さらに、例えば、本発明のPSEまたはその断片を用いて、標準的技法により作製することができる抗PSE抗体を用いて、天然PSEを細胞（例えば、内皮細胞）から単離することができる。
本発明は、キメラPSEタンパク質またはPSE融合タンパク質も提供する。本明細書で用いる「キメラPSEタンパク質」または「PSE融合タンパク質」は、非PSEポリペプチドと機能的に結合されたPSEポリペプチドを包含する。「PSEポリペプチド」とは、PSEに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するのに対し、「非PSE ポリペプチド」は、PSE と実質的に相同でないタンパク質（例えば、PSE とは異なり、かつ、同じまたは別の生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。融合タンパク質の範囲内で、「機能的に結合された」という用語は、PSE ポリペプチドと非PSE ポリペプチドが、互いに融合し、これによって、両配列が、使用した配列に特有とみなされる推定機能を果たす、という意味である。非PSE ポリペプチドは、PSE ポリペプチドのN末端またはC末端に融合することができる。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、PSE 配列がGST配列のC末端に融合したGST- PSE 融合タンパク質である。これらの融合タンパク質は、組換えPSE の精製を促進することができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのN末端で、異種シグナル配列を有するPSE である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）では、異種シグナル配列を用いることにより、PSEの発現および／または分泌を高めることができる。
本発明のキメラPSEタンパク質またはPSE融合タンパク質は標準的組換えDNA法により生産される。例えば、様々なポリペプチド配列をコードするDNA断片は、通常の技法を用いて、適正なリーディングフレーム内で互いに連結させる。このような技法には、例えば、平滑末端または付着末端を用いた連結、制限酵素切断による適切な末端の賦与、必要に応じた付着末端の充填、アルカリホスファターゼを用いた処理による不要な連結の除去、ならびに、酵素連結などがある。別の実施形態では、融合遺伝子は、DNA合成装置などの通常の技法により、合成することができる。この他にも、アンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を実施することができる。このアンカープライマーは、連続する遺伝子断片の間に、相補的突出部を形成した後、これを互いにハイブリダイズさせてから、再増幅することにより、キメラ遺伝子配列を産生する（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons：1992を参照）。さらに、融合単位（例えば、GSTポリペプチド）をすでにコードする多数の発現ベクターが市販されている。PSE をコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングすることにより、融合単位を適正なリーディングフレーム内でPSEタンパク質に連結させることができる。
PSE相同体は、PSEの突然変異誘発、例えば、個別の点突然変異、または切断により産生することができる。本明細書で用いる「相同体」とは、PSE 活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するPSE の変異型を意味する。PSE アゴニストは、PSE と同じ生物学的活性、もしくはそれらの活性のいくつかを実質的に保持することができる。PSE アンタゴニストは、例えば、PSEを含む細胞膜成分代謝カスケードの上流または下流メンバーとの競合的結合により、あるいは、細胞膜を介した化合物の輸送を媒介するPSEと結合し、これによってトランスロケーションが起こるのを阻止することにより、天然に存在するPSE形態の１種以上の活性を阻害することができる。
別の実施形態では、PSE相同体は、PSEアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して、PSEの突然変異体、例えば、切断型突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、同定することができる。一実施形態では、コンビナトリアル突然変異誘発により核酸レベルでPSE変異体の多様性ライブラリーを産生した後、これを多様性遺伝子ライブラリーによりコードする。PSE変異型の多様性ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素連結することにより、潜在的PSE配列の縮重セットを個々のポリペプチドとして、あるいは、このPSE配列セットを含むさらに大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として、発現させることができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的PSE相同体のライブラリーを産生するのに用いることができる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成をDNA合成装置において実施した後、合成遺伝子を、適した発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを用いることにより、潜在的PSE配列の所望のセットをコードする全配列を混合物中に提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者には公知である（例えば、Narang, S.A.（1983）Tetrahedron 39：3；Itakuraら（1984）Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakuraら（1984）Science 198:1056；Ikeら（1983）Nucleic Acids Res.11：477を参照）。
さらに、PSE断片のライブラリーを用いて、PSE断片の多様性集団を産生し、PSEの相同体のスクリーニングおよび後の選択に使用することができる。一実施形態では、二本鎖切断が１分子につき約1回しか発生しない条件下で、ヌクレアーゼでPSEコード配列の二本鎖PCR断片を処理して、二本鎖DNAを変性し、上記DNAを再生して二本鎖DNA（様々な二本鎖切断産物からのセンス／アンチセンス対を含む）を形成し、再形成された二重らせんから一本鎖部分をSIヌクレアーゼ処理により除去した後、得られた断片ライブラリーを発現ベクターと連結することにより、コード配列の断片のライブラリーを産生することができる。この方法により、様々な大きさのPSEのN末端、C末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
点突然変異または切断により産生されたコンビナトリアルライブラリー中の遺伝子産物をスクリーニングする技法、ならびに、選択した特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングする技法は、当業者には複数知られている。これらの技法は、PSE相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により、産生した遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適応させることができる。ハイスループット分析に適した、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに、最も広範に用いられる技法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換した後、所望の活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現することを含んでなる。逐次全体突然変異誘発（REM：recursive ensemble mutagenese）、すなわち、ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を増加させる新規の技法を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いることにより、PSE相同体を同定することができる（ArkinおよびYourvan（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7811-7815；Delgraveら（1993）Protein Engineering 6（3）：327-331）。
別の実施形態では、細胞に基づくアッセイを用いて、当業者には公知のさらに別の方法により、多様性PSEライブラリーを分析することも可能である。
Ｅ．本発明の使用および方法
本明細書に記載する核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、融合タンパク質、プライマー、ベクターおよび宿主細胞は、以下に挙げる方法の１つ以上に用いることができる：フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）および近縁生物の同定；フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）の近縁生物のゲノムのマッピング；目的とするフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）配列の同定および局在化；進化研究；当該機能に必要なPSEタンパク質領域の決定；PSE活性のモジュレーション；１以上の細胞膜成分の代謝のモジュレーション；１以上の化合物の膜透過輸送のモジュレーション；ならびに、ファインケミカルのような所望の化合物の細胞による生産のモジュレーション。本発明のPSE核酸分子には、多様な用途がある。まず、上記核酸分子は、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）、またはこれらに近縁の系統として、生物を同定するのに用いることができる。また、上記核酸分子を用いて、微生物の混合集団におけるフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）もしくはこれらの近縁系統の存在を確認することができる。本発明は、多数のフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）遺伝子の核酸配列を提供する。フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）に特有な該生物の遺伝子の領域をカバーするプローブを用いて、ストリンジェントな条件下で、微生物の均質または混合集団の培養物の抽出ゲノムDNAをスクリーニングすることにより、この生物が存在するか否かを確認することができる。フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）自体は高度不飽和酸の商業的生産のために用いられていないが、卵菌綱(Oomycete)は原理的にはPUFAの生産に適している。このことが、PSE関連DNA配列が他の生物でのPUFA生産に使用するのに特に適している理由である。
さらに、本発明の核酸およびタンパク質分子は、ゲノムの特定領域についてのマーカーとして働くことができる。これは、ゲノムのマッピングに有用であるだけではなく、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）タンパク質の機能研究にも適している。例えば、特定のフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）のDNA結合タンパク質が結合するゲノム領域を同定するためには、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）ゲノムを消化し、得られた断片をDNA結合タンパク質と一緒にインキュベートすることができる。このタンパク質と結合するものは、さらに、本発明の核酸分子、好ましくは、容易に検出可能な標識を用いて、スクリーニングすることができる。このような核酸分子とゲノム断片との結合により、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）のゲノムマップでの断片の局在化が可能になり、これを様々な酵素で繰り返し実施すれば、タンパク質が結合する核酸配列の迅速な決定が容易に行われる。さらに、本発明の核酸分子は、これら核酸分子が、関連する真菌のゲノムマップ構築用のマーカーとして働くのに、近縁種の配列と十分な相同性を有することができる。
本発明のPSE核酸分子は、進化研究、ならびに、タンパク質構造の研究にも好適である。本発明の分子が関与する代謝および輸送工程は、非常に多様な原核および真核生物細胞によって使用されている。本発明の核酸分子の配列と、他の生物由来の類似酵素をコードする配列とを比較することにより、該生物の進化上の近縁度を評価することができる。したがって、このような比較により、配列の領域が保存されているもの、保存されてないものの決定が可能になり、酵素機能に必須のタンパク質の領域を決定する上で役立つと思われる。このタイプの決定は、タンパク質工学研究に有用であり、タンパク質が、突然変異誘発に関して、その機能を欠失せずに、どれくらい許容できるのかを知ることができる。
本発明のPSE核酸分子の操作により、野生型PSEとは機能が異なるPSEの生産が可能になる。これらタンパク質の効率または活性を高める；これらを通常より多数、細胞に存在させる；あるいは、それらの効率または活性を低下させることが可能である。「効率または活性が高められる」とは、例えば、上記酵素が、本来の酵素より、高い選択性および／または活性、好ましくは、少なくとも10％高い活性、特に好ましくは、少なくとも20％高い活性、極めて好ましくは、少なくとも30％高い活性を有することを意味する。
本発明のPSEの改変が、このような改変タンパク質を含むファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接影響を与え得る一連の機構が存在する。ラージスケールでの繊毛虫、藻類、植物または真菌の培養物からのファインケミカル化合物の回収は、細胞が所望の化合物を分泌すれば、有意に改善される。なぜならば、このような化合物は、培地から容易に単離することができるからである（培養細胞のバイオマスからの抽出とは対照的に）。あるいは、好都合に、細胞が、一種の濃縮機構を備えた専門化細胞小器官中にin vivoで化合物を貯蔵すれば、精製を改善することができる。また、PSEを発現する植物では、輸送が増加すると、植物組織および植物器官内での配分が改善されると考えられる。細胞からファインケミカルを膜外へ輸送する輸送体分子の数または活性が増加すると、生産されるファインケミカル（細胞外培地に存在する）の量を増加させることができ、これによって、回収および精製が大幅に容易になり、また、植物の場合には、配分がより効率的になる。反対に、１以上のファインケミカルを効率的に過剰生産するためには、好適な生合成経路用の補因子、前駆体分子および中間体量の増加が必要である。炭素源（すなわち、糖）、窒素源（すなわち、アミノ酸、アンモニウム塩）、リン酸塩および硫黄などの栄養素の膜内への輸送に関与する輸送体タンパク質の数および／または活性が増加すると、生合成工程での栄養素供給に関するあらゆる制限事項が排除されるため、ファインケミカルの生産を改善することができる。PUFAのような脂肪酸や、PUFAを含む脂質は、それ自体が望ましいファインケミカルである。従って、これら化合物の生合成に関与する本発明の１以上のPSEの活性を最適化する、またはその数を増加する、あるいは、これら化合物の分解に関与する１以上のPSEの活性を低下させることにより、繊毛虫、藻類、植物、真菌、酵母またはその他の微生物における脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または生産効率を高めることができる。
本発明に従う１以上のPSE遺伝子の操作によって、活性が改変されたPSEを得ることもでき、この改変された活性は、藻類、植物、繊毛虫または真菌に由来する１以上の所望のファインケミカルの生産に間接的に影響を与える。例えば、代謝の正常な生化学的過程により、様々な老廃物（例えば、過酸化水素およびその他の反応性酸素種）が生産され、これら老廃物は、上記代謝過程を活発に妨害しうる（例えば、ペルオキシナイトライト(peroxynitrite)は、チロシン側鎖を硝化し、これによって、活性中心にチロシンを含む酵素を不活性化することが知られている（Groves, J.T.（1999）Curr. Opin. Chem. Biol. 3（2）；226-235）。これらの老廃物は、通常排泄されるが、ラージスケールでの発酵生産に用いられる細胞は、１以上のファインケミカルを過剰生産すべく最適化されていることから、野生型細胞が通常生産するのより多くの老廃物を生産する。老廃物分子の排出に関与する本発明のPSEの１種以上の活性を最適化することにより、細胞の生存能力を高めると同時に、効率的な代謝活性の維持が可能になる。また、所望のファインケミカルが細胞内に多量に存在すると、実際に細胞に対して有毒となる恐れがあるため、細胞がこれら化合物を分泌する能力を高めることにより、細胞の生存能力を高めることができる。
さらに、本発明のPSEを操作して、様々な脂質および脂肪酸分子の相対量を改変することもできる。このことにより、細胞膜の脂質組成に重大な影響を及ぼしうる。脂質は種類に応じて、それぞれ異なる物理的特性を有するため、膜の脂質組成の改変は、膜の流動性を有意に改変することができる。膜の流動性における変化は、膜を介した分子の輸送に影響を与え、これによって、既に説明したように、老廃物や、生産されたファインケミカルの膜外への輸送、または必要な栄養素の膜内への輸送を改変することができる。このような膜の流動性の変化はまた、細胞の完全性にも重大な影響を及ぼし、比較的弱い膜を有する細胞は、非生物性および生物性ストレス状態を被りやすくなり、これによって、細胞は損傷もしくは死滅することもある。膜合成用の脂肪酸および脂質の生産に関与し、得られた膜が、ファインケミカルの生産に用いられる培養物を占める環境状態を被りやすい膜組成になるようなPSEの場合には、このPSEを操作することによって、より高い比率の細胞が、生存および増殖できるようにしなければならない。生産細胞の数が多いほど、培養物からのファインケミカルの収率、生産または生産効率が高くなるはずである。
ファインケミカルの収率を高くすることを目的とする、PSEに対する上記突然変異誘発戦略は、制限的と解釈すべきではなく、これら戦略の変形は、当業者には容易に明らかであろう。このような戦略を用いて、かつ、本明細書に開示した機構を組み込み、本発明の核酸分子およびタンパク質分子を用いることにより、突然変異したPSE核酸およびタンパク質分子を発現する、組換えまたはトランスジェニック藻類、繊毛虫、植物、非ヒト動物、真菌もしくは、C. glutamicumなどその他の微生物を産生し、これによって、所望の化合物の収率、生産および／または生産効率を高くすることができる。この所望の化合物は、藻類、繊毛虫、植物、動物、真菌またはC. glutamicum由来のあらゆる天然産物でよく、生合成経路の最終産物、ならびに、天然に存在する代謝経路の中間体、さらには、これら細胞の代謝では天然に存在しないが、本発明の細胞により生産される分子も包含される。
本発明の別の実施形態は、PUFAの生産方法であり、この方法は、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合を有するC16-および／またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、または本発明のベクターを含有する生物を、PUFAが該生物において産生される条件下で生育させることを含んでなる。この方法により生産されたPUFAは、生育させていた培地もしくはフィールドから該生物を回収し、破砕し、かつ／または有機溶媒を用いて回収した物質を抽出することにより、単離することができる。PUFA含有量の多い脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、トリアシルグリセロールおよび／または遊離脂肪酸を含む油は、この溶媒から単離することができる。PUFAの含有量が多い遊離脂肪酸は、脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、およびトリアシルグリセロールの酸または塩基による加水分解によって単離することができる。PUFAの含有量が多いとは、本発明のエロンガーゼをコードする追加の核酸を有しない元の生物（例えば、フィトフトラ属(Phytophthora)などの卵菌綱(Oomycete)または油料作物などの植物）よりも、少なくとも5%、好ましくは10%、特に好ましくは20%、極めて好ましくは40％多いPUFAを有することである。さらに、上記したPUFA含有量の多い油、脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、トリアシルグリセロールおよび／または遊離脂肪酸は、出発生物の組成とは異なる組成を有する。このことは、特に、DHA、EPAまたはARAなどの長鎖C20-またはC22-高度不飽和脂肪酸を自然界では含まない植物についてあてはまる。
本発明の方法により生産されるPUFAは、好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合、好ましくは、３〜４個の二重結合、特に好ましくは、３個の二重結合があるC20-またはC22-脂肪酸分子である。このようなC20-またはC22-脂肪酸分子は、油、脂質または遊離脂肪酸の形態で、生物から単離することができる。有用な生物は、例えば、前述した生物である。好ましい生物は、トランスジェニック植物である。
本発明の実施形態は、前記方法により生産される油、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの画分であり、特に好ましくは、トランスジェニック植物に由来するPUFAを含む油、脂質または脂肪酸組成物である。
本発明のさらに別の実施形態は、飼料、食物、化粧品または医薬品における上記油、脂質または脂肪酸組成物の使用である。
以下に示す実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、これらを制限的なものと解釈すべきではない。本明細書に引用する参照文献、特許出願、特許および公開特許出願のすべての内容は、本明細書に参照として組み込むものとする。
実施例１：一般的方法
a）一般的クローニング方法
例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転写、DNA断片の連結、大腸菌および酵母細胞の形質転換、細菌の培養、ならびに、組換えDNAの配列分析などのクローニング方法は、Sambrookら（1989）（Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6）またはKaiser, MichaelisおよびMitchell(1994)、”Methods in Yeast Genetics”（Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-451-3）に記載されているように実施した。
b）化学物質
本明細書に特に記載のない限り、用いられる化学物質は、Fluka（Neu-Ulm）、Merck（Darmstadt）、Roth（Karlsruhe）、Serva（Heidelberg）およびSigma（Deisenhofen）から、分析用グレードの品質のものを取得した。溶液は、Milli-Q水システム水精製ユニット（Millipore、Eschborn）から得た発熱物質を含まない精製水（本書では以後H2Oと称する）を用いて、調製した。制限エンドヌクレアーゼ、DNA修飾酵素および分子生物学キットは、AGS（Heidelberg）、Amersham（Brunswick）、Biometra（Gottingen）、Boehringer（Mannheim）、Genomed（Bad Oeynhausen）、New England Biolabs（Schwalbach/Taunus）、Novagen（Madison, Wisconsin, USA）、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen（Hilden）およびStratagene（Amsterdam, Netherlands）の各社から取得した。特に記載のない限り、これらは、製造者の指示に従って使用した。
実施例２：cDNAライブラリーの構築
cDNAライブラリーを構築するために、第１鎖合成を、マウス白血病ウイルス逆転写酵素(Roche, Mannheim, ドイツ)およびオリゴ-d(T)プライマーを用いて行い、一方、第２鎖合成を、DNAポリメラーゼI、Klenow酵素とのインキュベーションおよびRNAse Hによる12℃ (2 時間)、16℃ (1 時間)および22℃ (1 時間)での切断を行うことにより実施した。65℃ (10分)のインキュベーションにより反応を停止させ、次いで氷浴中へ移した。二本鎖DNA分子をT4 DNAポリメラーゼ(Roche, Mannheim)により37℃ (30 分)で平滑末端化した。ヌクレオチドをフェノール／クロロホルムで抽出して、Sephadex G50スピンカラムで分離した。EcoRIアダプター(Pharmacia, Freiburg, ドイツ)をT4 DNAリガーゼ(Roche, 12℃, 一晩)を用いてcDNAの両末端に連結し、ポリヌクレオチドキナーゼ(Roche, 37℃, 30分)と一緒にインキュベーションすることによりリン酸化した。この混合物を低融点アガロースゲル上での分離に供した。300塩基対を超えるDNA分子をゲルから溶出し、フェノール抽出し、Elutip Dカラム(Schleicher and Schull, Dassel, ドイツ)で濃縮し、ベクターアームに連結し、次に、Gigapack Goldキット(Stratagene, Amsterdam, オランダ)を製造業者の材料を使用しその説明書にしたがって用いて、ラムダ-ZAPIIファージまたはラムダ-ZAP-発現ファージ中にパッケージングした。
実施例３：DNA配列決定およびコンピューター分析
実施例４に記載したcDNAライブラリーを用いて、標準的方法、特に、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer, Weiterstadt, ドイツ）を用いた連鎖終結反応法により、DNA配列決定を実施した。cDNAライブラリーからプラスミドを調製した後、in vivoマス切除および寒天プレート上でのDH10Bの再形質転換により、クローンのランダム配列決定を実施した（材料およびプロトコルについての詳細：Stratagene, Amsterdam, オランダ）。アンピシリンを含有するルリアブロス［Sambrookら（1989）（Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6）を参照］中で一晩生育させた大腸菌培養物から、Qiagen DNA 調製ロボット(Qiagen, Hilden)を製造業者のプロトコルに従い使用してプラスミドDNAを調製した。下記のヌクレオチド配列を有する配列決定用プライマーを用いた：
5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
5’-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3’
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
Bio-Max (Munich, ドイツ)から市販されているEST-MAX標準ソフトウェアパッケージを用いて配列を処理し評価した。公知のエロンガーゼに対して低い相同性を示す１つのクローンについて、さらに詳細な特性決定を行った。
実施例４：フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans） PSE1遺伝子の同定およびcDNAクローン PiPSE1の分析
候補遺伝子はほかにもあるが、公知のエロンガーゼ遺伝子との低い相同性ゆえに、EST配列(データベースエントリー: PI001002014r)を標的遺伝子とみなした。
BESTFITプログラム（すなわち、BLOSUMアミノ酸置換マトリックス）を配列アラインメントのために使用した。Henikoff, S.およびHenikoff. J.G. (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい。
データベースNo. PI001002014r を有するクローンの配列を酵母elo1ペプチド配列とのアラインメントのために使用した。新規P. infestansクローンは完全ではないので、P. infestans cDNAライブラリーから出発して、対応する全長クローン(PiPSEI)を分離した。この目的のため、PCR DIG 合成キット(Roche)を用いたPCRによってジゴキシゲニン標識プローブを作製した。このとき、PI001002014を鋳型として使用した。以下のプライマーをPCRに使用した:
PI-DIGf: cacaccatcatgtacacttactac
PI-DIGr: caacttcttcttcgattcctccac
単離された標識プローブを、P. infestans cDNAライブラリーのスクリーニングに(製造業者Stratageneにしたがって)使用した。1046 bpの断片を単離し、PiPSE1と名付けた。このオープンリーディングフレームは、長さが837 bpあり、計算上の分子量が32.1 kDaの278アミノ酸からなるタンパク質をコードする。配列アラインメントから、以下の配列同一性および配列類似性がそれぞれ明らかとなった： 26%/43%（Physcomitrella patens PSE1pに対して）、23%/37%（ヒトHELOpに対して）、21%/41%（Mortierella alpina GLELOpに対して）、および17%/36% （C. elegansエロンガーゼに対して）。
実施例５：ハイブリダイゼーションによる遺伝子の同定
遺伝子配列を用いて、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから、相同または異種遺伝子を同定することができる。
相同遺伝子（すなわち、相同である全長cDNAクローン、つまりホモログ）は、例えばcDNAライブラリーを用いた、核酸ハイブリダイゼーションにより単離することができる。目的とする遺伝子の頻度に応じて、100,000から1,000,000個の組換えバクテリオファージを培養し、ナイロン膜に移す。アルカリによる変性の後、例えばUV架橋により、DNAを膜の上に固定化した。高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを実施した。イオン強度が1 M NaCl、温度68℃の水溶液中でハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップを実施した。例えば、放射性（32P）ニック転写を用いた標識付け（High Prime, Roche、ドイツ、マンハイム）により、ハイブリダイゼーションプローブを作製した。オートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて、前記方法と同様に、近縁ではあるが、同一ではない、部分的に相同または異種の遺伝子を同定することができる。水性ハイブリダイゼーションの場合は、イオン強度を通常1M NaClに維持し、温度を68℃から42℃へと徐々に下げた。
個々のドメイン（例えば、10〜20アミノ酸）に対してのみ相同性を示す遺伝子配列の単離は、合成の放射性標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて実施することができる。放射性標識オリゴヌクレオチドは、T4ポリヌクレオチドキナーゼで２つの相補的オリゴヌクレオチドの5’末端をリン酸化することにより、作製した。相補的オリゴヌクレオチド同士をハイブリダイズさせ、連結させることにより、コンカテマーを生成させた。次に、二本鎖コンカテマーを、例えばニック転写により、放射性標識した。ハイブリダイゼーションは、通常、高いオリゴヌクレオチド濃度を用いて、低ストリンジェンシー条件下で実施した。
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション溶液：
６×SSC
0.01 M リン酸ナトリウム
１mM EDTA（pH 8）
0.5% SDS
100μg／ml変性サケ精子DNA
0.1％低脂肪粉ミルク
ハイブリダイゼーションの間、温度を、計算したオリゴヌクレオチド温度より５〜10℃低い温度または室温（特に明記しない限り、全ての実験において室温とは約23℃である）まで段階的に下げた後、洗浄ステップおよびオートラジオグラフィーを実施した。洗浄は、極めて低いストリンジェンシーで実施され、例えば４×SSCを用いて３回実施した。さらに詳しくは、下記に記載されている：Sambrook, J.ら（1989）“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratoy Press、もしくはAusubel, F.M.ら（1994）”Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons。
実施例６：ノーザンハイブリダイゼーション
RNAハイブリダイゼーションのため、20μgの全RNAまたは1μgのポリ(A)+-RNAを、Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304)により記載されるようにして、ホルムアルデヒドを用いて濃度1.25%のアガロースゲルでのゲル電気泳動により分離し、正に荷電したナイロン膜(Hybond N+, Amersham, Brunswick)に10 x SSCを用いて毛細管吸引力により移行させた。次いで、これを、UV光により固定化し、ハイブリダイゼーションバッファー(10% w/v 硫酸デキストラン、1M NaCl、1% SDS、および100mg ニシン精子DNA)を用いて3時間、68℃にてプレハイブリダイズさせた。DNAプローブは、α-32P-dCTP (Amersham, Brunswick, ドイツ)を用いてプレハイブリダイゼーション段階中に、Highprime DNA 標識キット(Roche, Mannheim, ドイツ)により標識しておいた。標識DNAプローブを添加した後、同じバッファー中で68℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った。洗浄ステップは、2 × SSCを用いて15分を2回、1 × SSCおよび1% SDSを用いて30分を2回、68℃で行った。密封したフィルターを1〜14日間、-70℃で感光した。
実施例７：植物形質転換用のプラスミド
植物形質転換には、pBinARのようなバイナリーベクターを用いることができる（HofgenおよびWillmitzer, Plant Science 66（1990）221-230）。バイナリーベクターは、センスまたはアンチセンス配向のcDNAをT-DNAに連結することにより、構築することができる。cDNAの5’側にある植物プロモーターは、cDNAの転写を活性化する。ポリアデニル化配列は、cDNAの3’側に位置する。
組織特異的発現は、組織特異的プロモーターを用いて達成することができる。例えば、種子特異的発現は、cDNAの5’側のナピン(napin)またはLeB4またはUSPプロモーターにクローニングすることにより達成することができる。その他のどんな種子特異的プロモーターエレメントを用いてもよい。全ての植物における構成的発現には、CaMV 35Sプロモーターを用いることができる。
発現されたタンパク質は、例えば、色素体、ミトコンドリアまたは小胞体用のシグナルペプチドを用いて、細胞コンパートメントにターゲッティングすることができる（Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4（1996）285-423）。シグナルペプチドを適正なリーディングフレームでcDNAの5’側にクローニングすることにより、融合タンパク質の細胞下局在を達成する。
実施例８：アグロバクテリウムの形質転換
アグロバクテリウム媒介による植物形質転換は、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株（pMP90）（KonczおよびSchell, Mol. Gen. Genet. 204（1986）383-396）もしくはLBA4404（Clontech）を用いて、実施することができる。形質転換は、標準的形質転換方法（Deblaereら、Nucl. Acids. Tes. 13（1984）, 4777-4788）により実施することができる。
実施例９：植物の形質転換
アグロバクテリウム媒介による植物形質転換は、標準的形質転換および再生方法を用いて、実施することができる（Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual、第２版、Dordrecht： Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuch Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton：CRC Press, 1993, 360 pp. ISBN 0-8493-5164-2）。
例えば、子葉または胚軸（hypocotyledon）形質転換（Moloneyら、Plant Cell Report 8（1989）238-242；De Blockら、Plant Physiol. 91（1989）694-701）によって、アブラナを形質転換することができる。アグロバクテリウムおよび植物を選択するための抗生物質の使用は、形質転換に用いるバイナリーベクターおよびアグロバクテリウム株に応じて違ってくる。アブラナの選択は、通常、選択植物マーカーとしてカナマイシンを用いて実施する。
アマ（flax）へのアグロバクテリウム媒介による遺伝子導入は、例えば、Mlynarovaら（1994）Plant Cell Report 13：282-285により記載された技法を用いて、実施することができる。
ダイズの形質転換は、例えば、EP-A-0 424 047（Pioneer Hi-Bred International）またはEP-A-0 397 687、米国特許第5,376,543号、米国特許第5,169,770号（トレド大学）に記載された技法を用いて、実施することができる。
粒子射撃法、ポリエチレングリコール媒介DNA取込みを用いた、あるいは、シリコンカーボネートファイバー技法による植物形質転換については、例えば、FreelingおよびWalbot （“The maize handbook”（1993）ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York）により記載されている。
実施例10：in vivo突然変異誘発
微生物のin vivo突然変異誘発は、大腸菌またはその他の微生物（例えば、バチルス属、もしくはサッカロミセス・セレビシエのような酵母）を用いて、プラスミドDNA（またはその他のベクターDNA）を継代し、そこで、それらの遺伝情報の完全性を保持する能力を損傷させることにより、実施することができる。典型的なミューテーター株は、DNA修復系用の遺伝子に突然変異を有する（例えば、mutHLS、mutD、mutTなど；参考として、Rupp, W.D.（1996）DNA repair mechanism：Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM：ワシントンを参照）。これらの株は、当業者には公知である。これらの株の使用については、例えば、Greener, A.およびCallahan, M.（1994）Strategies 7：32-34に説明されている。突然変異したDNA分子は、微生物を選択して試験した後、植物に導入するのが好ましい。本明細書の実施例の項にある様々な実施例に従い、トランスジェニック植物を作出する。
実施例11：形質転換生物における組換え遺伝子産物の発現の研究
形質転換した宿主生物における組換え遺伝子産物の活性を、転写レベルおよび／または翻訳レベルで測定した。
遺伝子の転写レベル（これは、当該遺伝子産物の翻訳に使用可能なmRNAの量を示す）を測定するのに好適な方法は、ノーザンブロットを実施することである（参考として、例えば、Ausubelら（1988）Current Protocols in Molecular Biology, Wiley：ニューヨーク、または前記の実施例の項を参照）。この方法では、目的の遺伝子と結合するように設計されたプライマーを、検出可能な標識（通常、放射能または化学発光）で標識付けし、これによって、生物の培養物から全RNAを抽出し、これをゲル上で分離し、安定マトリックスに移行させた後、このプローブと一緒にインキュベートする。上記プローブの結合および結合量が、上記遺伝子のmRNAの存在および量を示す。この情報から、形質転換した遺伝子の転写度がわかる。全細胞RNAは、細胞、組織または器官から、複数の方法によって調製することができ、これら方法はすべて、当業者には公知であり、例えば、Bormann, E.R.ら（1992, Mol. Microbiol. 6：317-326）の方法がある。
このmRNAにより翻訳されたタンパク質の存在または相対量を調べるために、ウェスタンブロットのような標準的方法を用いることができる（例えば、Ausubelら（1988）Current Protocols in Molecular Biology, Wiley：ニューヨークを参照）。この方法では、全細胞タンパク質を抽出し、ゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースのようなマトリックスに移した後、所望のタンパク質と特異的に結合する抗体のようなプローブと一緒にインキュベートする。このプローブには、一般に、容易に検出が可能な化学発光または比色分析標識を付ける。観察された標識の存在および量は、細胞に存在する所望の突然変異タンパク質の存在および量を示す。
実施例12：所望の産物の生産に対する組換えタンパク質の影響の分析
所望の化合物（脂肪酸など）の生産に対する植物、真菌、藻類、繊毛虫における遺伝子改変の影響は、適した条件（前述したものなど）下で、改変微生物または植物を生育させ、所望の産物（すなわち、脂質または脂肪酸）の生産増加について培地および／または細胞成分を分析することにより、調べることができる。これらの分析方法は、当業者には公知であり、分光学、薄層クロマトグラフィー、各種染色方法、酵素および微生物学的方法、ならびに、高性能液体クロマトグラフィーのような分析クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, P. 89-90およびp. 443-613, VCH Weinheim（1985）；Fallon, A.ら（1987）”Applications of HPLC in Biochemistry”：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 第17巻；Rehmら（1993）Biotechnology、第３巻、第III章、”Product recovery and purification”, 第469-714頁, VCH Weinheim；Belter, P.A.ら（1988）Bioseparations：downstream processing for Biotechnology, John Wiely and Sons；Kennedy, J.F.、ならびに、Cabral, J.M.S.（1992）Recovery processes for biological materials, John Wiely and Sons；Shaeiwitz, J.A.およびHenry, J.D. （1988）Biochemical separations：Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3；第11章、第1-27頁、VCH Weinheim；ならびに、Dechow, F.J.（1989）Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications）。
前記の方法の他に、Cahoonら（1999） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96（22）：12935-12940、ならびに、Browseら（1986）Analytic Biochemistry 152:141-145に記載されているように、植物材料から植物脂質を抽出する。定量および定性脂質または脂肪酸分析については、下記に記載されている：Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/スコットランド：Oily Press（Oily Press Lipid Library；2）；Christie, William W., Gas Choromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland：Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 第307頁（Oily Press Lipid Library；1）；”Progress in Lipid Research, Oxford：Pergamon Press, 1（1952）-16（1977）題名：Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN。
発酵の最終産物を測定する以外に、所望の化合物を生産するのに用いられる代謝経路の他の成分（中間体および副産物など）を分析することにより、化合物の全体的な生産効率を決定することも可能である。分析方法としては、培地の栄養素レベル（例えば、糖、炭水化物、窒素源、リン酸イオンおよびその他のイオン）の測定、バイオマス組成および成長測定、生合成経路の通常の代謝物の生産の分析、ならびに、発酵中に発生したガスの測定などが挙げられる。これら測定の標準的方法については、下記に概要が記載されている：Applied Microbial Physiology；A Practical Approach, P.M. Rhodes およびP.F. Stanbury編、IRL Press, pp. 131-163および165-192（ISBN：0199635773）ならびに、そこに引用されている参照文献。
一例は、脂肪酸の分析である（略語：FAME、脂肪酸メチルエステル；GC-MS、気液クロマトグラフィー／質量分析法；TAG、トリアシルグリセロール；TLC、薄層クロマトグラフィー）。
脂肪酸産物の存在の決定的な証拠は、標準的分析方法：GC、GC-MSまたはTLCに従い、組換え生物を分析することにより獲得することができ、これらの方法は、Christieにより、またその引用参照文献に、多種が記載されている（1997：Advances on Lipid Methodology、第４版：Christie, Oily Press, Dundee, 119-169；1998, gas chromatography/mass spectrometry methods, Lipids 33:343-353）。
分析しようとする材料は、音波破砕、ガラスミルでの磨砕、液体窒素および粉砕、あるいは、その他の適用可能な方法により破砕することができる。破砕後、材料を遠心分離しなければならない。沈降物を蒸留水中に再懸濁させ、100℃で10分加熱し、氷冷して再遠心分離させた後、２％ジメトキシプロパンを含むメタノール中の0.5 M硫酸において90℃で１時間抽出する。これにより、加水分解された油および脂質化合物が得られ、これは、メチル基転移脂質をもたらす。これらの脂肪酸メチルエステルを石油エーテルで抽出し、最終的に、毛管カラム（Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m、0.32 mm）を用いて、170〜240℃の温度勾配で20分および240℃で５分のGC分析を実施する。得られた脂肪酸メチルエステルの正体は、使用可能な形態の市販の標準溶液（すなわち、Sigma）を用いて、決定しなければならない。
使用できる標準溶液がない脂肪酸については、誘導体化の後、GC-MS分析を実施することにより、その分子の正体を証明しなければならない。例えば、三重結合を有する脂肪酸の局在化は、4,4-ジメトキシオキサゾリン誘導体（Christie, 1998, 前記参照）を用いた誘導体化の後GC-MSにより証明しなければならない。
実施例13：異種微生物系における発現構築物
株、生育条件およびプラスミド
大腸菌株XL1 Blue MRF’kan（Stratagene）を用いて、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）由来の新規のエロンガーゼPiPSE1をサブクローニングした。この遺伝子を機能的に発現させるため、サッカロミセス・セレビシエ菌株INVSc 1（Invitrogen Co.）を用いた。ルリア-ベルティニ(Luria-Bertini)ブロス（LB、Duchefa、オランダ、ハールレム）において、大腸菌を37℃で培養した。必要であれば、アンピシリン（100 mg／リットル）を添加し、1.5％（w/v）の寒天（Difco）を含有させて、固体LB培地を得る。サッカロミセス・セレビシエ菌を、YPG培地、またはウラシルを含まない完全最少培地（CMdum；Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.B., Coen, D.M.およびVarki, A.（1995）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク）のいずれかにおいて、２％（w/v）のラフィノースまたはグルコースのいずれかを添加して、30℃で培養した。固体培地を得るために、２％（w/v）のBacto（商標）寒天（Difco）を含有させた。クローニングおよび発現に用いるプラスミドは、pUC18（Pharmacia）およびｐYES2（Invitrogen Co.）であった。
フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）由来のPUFA特異的エロンガーゼのクローニングおよび発現
酵母における発現のために、PUFA特異的エロンガーゼ (PSE1)遺伝子をコードするフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）cDNAクローンpiPSE1をまず修飾することにより、KpnI制限部位と、高度に効率的な翻訳のための酵母コンセンサス配列とが開始コドンの隣に得られ、XbaI制限部位が終止コドンに隣接して得られるようにした（Kozak, M., 1986）「点突然変異は真核生物リボソームによる翻訳をモジュレートするAUG開始コドンに隣接する配列を画定する」Cell 44, 283-292）。オープンリーディングフレームを増幅するために、その5’および3’末端に相補的なプライマー対を合成した。
ppex1f: cggggtaccacataatgtcgactgagctactgcag
ppex1r: cactagtctagattccaacttcttcttcgattcc
Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）および下記の温度プログラムを用いたサーモサイクラー（Biometra）中で、鋳型としてプラスミドDNAを用いてPCR反応を実施した：96℃で３分の後、96℃で30秒、55℃で30秒および72℃で２分を30サイクル、そして72℃で10分を１サイクルの後、4℃で停止。
883 bpの適正サイズの増幅DNA断片をアガロースTBEゲル電気泳動により確認した。QIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）を用いて増幅DNAをゲルから抽出した後、Sure Clone Ligation Kit（Pharmacia）を用いて脱リン酸化ベクターpUC18のSmaI制限部位に連結すると、pUCPSE1が得られた。大腸菌XL1 Blue MRF’kanの形質転換の後、24個のアンピシリン耐性菌に対して形質転換体のDNAミニプレップ（Riggs, M.G.およびMcLachlan, A.（1986）A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313）を実施し、陽性クローンをBamHI制限分析により同定した。ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer、Weiterstadt）を用いた再配列決定により、クローン化PCR産物の配列を確認した。
pUC-PSE1のプラスミド-DNAをKpnI/XbaIでさらに制限し、得られた約900bpの断片を脱リン酸化酵母−大腸菌シャトルベクターpYES2のKpnI/XbaI制限部位に連結させることにより、pY2PSE1を得た。大腸菌の形質転換および形質転換体からのDNAミニプレップを実施した後、ベクター内のDNA断片の配向をHindIIIによる切断によって調べた。１個のクローンを増殖させて、Nucleobond（登録商標）AX 500プラスミドDNA抽出キット（Macherey-Nagel、ゾーリンゲン）を用いて、DNAマキシプレップを実施した。
改変PEG／酢酸リチウムプロトコル（Ausubelら、1995）を用いて、サッカロミセスINVSc1をpY2PSE1およびpYES2で形質転換した。２％グルコースを添加したCMdum寒天プレート上での選択後、それぞれの場合に、４個のpY2PSE1形質転換体(pY2PSE1a-d)と１個のpYES2形質転換体をさらなる培養および機能発現のために選択した。
酵母におけるエロンガーゼ活性の機能的発現
前培養物：
２％（w/v）ラフィノースを含む20 mlのCMdum液体培地にトランスジェニック酵母クローン（pY2PSE1a-d、pYES2）を接種し、600 nm（OD600）での光学濃度が1.5〜2に達するまで、30℃および200 rpmで３日間培養した。
主培養物：
発現のために、２％ラフィノースと１％（v/v）Tergitol NP-40を含む20 mlのCMdum液体培地に、γ-リノレン酸(γ-18:3)を補充して、最終濃度を0.003％（w/v）とした。この培地に、上記前培養物を0.05のOD600まで接種した。２％（w/v）ガラクトースを用いて、0.2のOD600で16時間発現を誘導し、0.8〜1.2のOD600で培養物を回収した。
脂肪酸分析：
全脂肪酸を酵母培養物から抽出し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。このため、５mlの培養物の細胞を遠心分離（1,000×g、10分、4℃）により回収し、100mM NaHCO3、pH 8.0で１回洗浄して、残留培地および脂肪酸を除去した。脂肪酸メチルエステル（FAME）を調製するために、細胞沈殿物を、1Mメタノール性H2SO4および２％（v/v）ジメトキシプロパンで、80℃にて１時間処理した。このFAMEを２mlの石油エーテルで２回抽出し、100mM NaHCO3、pH 8.0で１回洗浄し、蒸留水で1回洗浄した後、Na2SO4で乾燥した。アルゴン流の下で、有機溶剤を蒸発させ、上記FAMEを50μlの石油エーテルに溶解させた。フレームイオン化検出器を備えたヒューレットパッカード6850ガスクロマトグラフ内のZEBRON ZB-Wax毛管カラム（30ｍ、0.32 mm、0.25μm；Phenomenex）上で、上記サンプルを分離した。オーブン温度は、20℃／分の速度で70℃（１分間保持する）から200℃まで、次に、５℃／分の速度で250℃（５分間保持する）まで、最後に５℃／分の速度で260℃までプログラム化した。窒素をキャリアーガス（70℃で4.5ml／分）として用いた。脂肪酸は、FAME標準物（SIGMA）の保持時間との比較により同定した。
発現分析：
５個のトランスジェニック酵母株の脂肪酸パターンを表１にモル％で示す。
添加して取り込まれたγ-リノレン酸の比率を太字の数字によって、伸長された産物の比率を赤色の数字によって、そして伸長されたγ-リノレン酸の比率を太字の数字（最終行）によって強調してある。
pYES2 (対照)およびpY2PSE1でそれぞれ形質転換した酵母の全脂質からのFAMEのGC分析を図１に示す。この分析のため、トランスジェニック酵母をγ-18:3の存在下で培養した。
結果から、γ-18:3が全てのトランスジェニック酵母に大量に取り込まれていることが示される。pY2PSE1で形質転換された４個のトランスジェニック酵母クローンの全てが、ガスクロマトグラムにおいてさらなるピークを示し、該ピークは、保持時間の比較により20:3 Δ8,11,14と同定された。ガスクロマトグラフィー／質量分析が、この素性を確認するためのさらなる証拠をもたらしうる。
同定された産物から、PiPSE1のヌクレオチド配列がコケ植物フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)由来のΔ6-選択的脂肪酸エロンガーゼをコードし、その結果、トランスジェニック酵母において新規の脂肪酸が形成されることがわかった。
広範なその他の脂肪酸(例えば、リノール酸 (18:2 Δ9, 12)、ステアリドン酸 (18:4 Δ6,9,12,15))を用いた別の供給実験を実施して、このエロンガーゼの基質選択性をさらに詳細に確認することができる。
実施例14：形質転換生物からの所望の産物の一般的な単離
植物材料または真菌、藻類、繊毛虫もしくは動物細胞から、または前記培養物の上清からの所望の産物の回収は、当業者には公知の各種方法により、実施することができる。所望の産物が細胞から分泌されない場合には、低速遠心分離により、培養物から細胞を回収し、機械力または音波破砕などの標準的技法により、細胞を溶解することができる。植物の器官を他の組織または器官から機械的に分離することができる。ホモジナイズした後、遠心分離により細胞破片を除去し、可溶性タンパク質を含む上清画分を残して、所望の化合物をさらに単離する。産物が所望の細胞から分泌される場合には、低速遠心分離により培養物から細胞を除去し、上清画分を残して、さらなる単離を実施する。
各単離方法から得た上清画分を、適当な樹脂を含むクロマトグラフィーに付す。その際、所望の分子はクロマトグラフィー樹脂に残るのに対し、サンプル中の不純物の多くは残らないか、あるいは、樹脂上に不純物は残るが、サンプルは残らないかのいずれかである。これらのクロマトグラフィー段階は、必要に応じて、同じまたは異なるクロマトグラフィー樹脂のいずれかを用いて繰り返すことができる。当業者であれば、好適なクロマトグラフィー樹脂の選択や、単離しようとする特定の分子の最も効果的な使用について、熟知している。単離された産物は、ろ過または限外ろ過により濃縮し、産物の安定性が最も高い温度で保存することができる。
非常に多様な単離方法が当業者には知られており、前述した単離方法は、制限を意図するものではない。これらの単離方法は、例えば、Bailey, J.E. & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill：New York（1986）に記載されている。
単離した化合物の正体（素性）および純度は、当業者には公知の標準的技法により測定することができる。このような技法として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイまたは微生物法が挙げられる。これらの分析方法については、下記を参照されたい：Patekら（1994）Appl. Environ. Microbiol. 60：133-140；Malakhovaら（1996）Biotekhnologiya 11：27-32；ならびに、Schmidtら（1998）Bioprocess Engineer. 19：67-70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry（1996）vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, p. 575-581およびp.581-587；Michal, G（1999）Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons；Fallon, A.ら（1987）Applications of HPLC in Biochemistry：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17。
均等物
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書中にこれまで述べてきた本発明の特定の実施形態についての多数の均等物を知っているか、あるいは、確認することができる。これらの均等物は、本発明の特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
Figure 2005526496
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Figure 2005526496

Claims (21)

  1. C18:3 Δ5t,9,12、C20:3 Δ8,11,14、C20:4 Δ5,8,11,14およびC20:5 Δ5,8,11,14,17は伸長させずに、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする単離された核酸。
  2. 脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を伸長させるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸であって、該配列が、
    a）配列番号１に示した核酸配列、
    b）遺伝暗号の縮重により配列番号２に示した配列から誘導される核酸配列、
    c）配列番号１に示した配列の誘導体であって、配列番号２に示したアミノ酸配列をコードする配列に対して少なくとも50％の相同性を有するポリペプチドをコードしかつC16-またはC18-エロンガーゼとして機能する上記誘導体、
    からなる群より選択される、上記単離された核酸。
  3. 前記配列が卵菌綱(Oomycete)に由来するものである、請求項２に記載の単離された核酸。
  4. 前記配列がフィトフトラ属(Phytophthora)に由来するものである、請求項２または３に記載の単離された核酸。
  5. 請求項２〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸配列から誘導されるアミノ酸配列。
  6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む遺伝子構築物であって、該核酸が１以上の調節シグナルに機能的に連結されている、上記遺伝子構築物。
  7. 遺伝子発現が前記調節シグナルにより増強される、請求項６に記載の遺伝子構築物。
  8. 請求項２に記載の核酸または請求項６に記載の遺伝子構築物を含有するベクター。
  9. 少なくとも１つの請求項２に記載の核酸、請求項６に記載の遺伝子構築物、または請求項８に記載のベクターを含有する生物。
  10. 前記生物が微生物、非ヒト動物または植物である、請求項９に記載の生物。
  11. 前記生物がトランスジェニック植物である、請求項９または１０に記載の生物。
  12. 脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC16-またはC18-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする請求項２に記載の核酸、請求項６に記載の遺伝子構築物、または請求項８に記載のベクターを含有する生物を、高度不飽和脂肪酸(PUFA)が該生物において産生される条件下で生育させることを含んでなる、高度不飽和脂肪酸（PUFA）の生産方法。
  13. 前記方法により生産されるPUFAが、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC20-またはC22-脂肪酸分子である、請求項１２に記載の方法。
  14. C20-またはC22-脂肪酸分子を油、脂質または遊離脂肪酸の形態で前記生物から単離する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記生物が微生物、非ヒト動物または植物である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記生物がトランスジェニック植物である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記C16-またはC18-脂肪酸が分子中に３個の二重結合をもつ脂肪酸である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法により生産される油、脂質もしくは脂肪酸、またはその画分。
  19. トランスジェニック植物に由来するPUFAを含有する油、脂質または脂肪酸組成物。
  20. PUFAが請求項２に記載のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物に由来する、請求項１９に記載の油、脂質または脂肪酸組成物。
  21. 飼料、食品、化粧品または医薬品における請求項１９または２０に記載の油、脂質または脂肪酸組成物の使用。
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