JP2018075003A - 植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の産生 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】遺伝子組換セイヨウアブラナ又はシロイヌナズナの種子から抽出したオイルで、総脂肪酸含有量当たり、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)及びドコサペンタエン(DPA)並びに所望によりアラキドン酸(ARA)が7〜25%、パルミチン酸が2〜16%、オレイン酸が1〜30%、リノール酸(LA)が4〜35%、γ−リノレン酸(GLA)が4%未満、α−リノレン酸(ALA)が4〜40%、パルミチン酸及びミリスチン酸を含む総飽和脂肪酸が4〜40%、但し、ミリスチン酸が1%未満のレベル、LA及びGLA並びにARAを含む総ω6脂肪酸と、ALA,DHA,ステアリドン酸(SDA)、EPA,DPA及びエイコサテトラエン酸(ETA)と、の比が、0.1〜3.0である、オイル。
【選択図】なし
Description
を合成する方法に関する。
重要な化合物として現在広く認識されている。これらの脂肪酸は、食事供給源から、また
はその両方がヒトの食事において必須脂肪酸であるとされる、リノール酸(LA,18:
2ω6)もしくはα‐リノレン酸(ALA,18:3ω3)の脂肪酸の転換により得られ
るかもしれない。ヒトおよび多くの他の脊椎動物が植物源から得られたLAまたはALA
をC22に転換することができ、一方、それらは非常に低い割合でこの転換を行う。さら
に、最も現代的な社会では、理想であるとされるω6:ω3脂肪酸について4:1の比ま
たはそれ以下の代わりに、少なくとも90%の多価不飽和脂肪酸(PUFA)がω6脂肪
酸である、アンバランスな食事をしている(非特許文献1)。ヒトについてのエイコサペ
ンタエン酸(EPA,20:5ω3)およびドコサヘキサエン酸(DHA,22:6ω3
)のようなLC‐PUFAの即時の食事供給源は、大部分は魚および魚油である。健康の
専門家は、よって、ヒトの食事に、有意なレベルのLC‐PUFAを含む魚を規則的に含
めることを薦めている。ますます、魚由来のLC‐PUFAオイルは、食品生産物、例え
ば、調整粉乳に組み込まれている。しかしながら、グローバルなおよび国際的な水産業の
低下に起因し、これらの有益な健康増進オイルの代替的なソースが必要とされる。
酸を合成する性能を欠く。特に、他の被子植物とともに作物および園芸作物は、ALA由
来であるEPA、ドコサぺンタエン酸(DPA,22:5ω3)、およびDHAのような
より長い鎖のω3脂肪酸を合成するために必要とされる酵素を有していない。植物のバイ
オテクノロジーにおける重要なゴールは、よって、実質的な量のLC‐PUFAを産生し
、これによりこれらの化合物の代替的なソースを提供する作物植物のエンジニアリングで
ある。
微細藻類、蘚類、および真菌類のような、生物におけるLC‐PUFAの生合成は、通
常、一連の酸素依存的な不飽和化および鎖延長反応として生じる(図1)。これらの生物
において、EPAを産生する最も一般的な経路は、Δ6‐不飽和化、Δ6‐伸長およびΔ
5‐不飽和化(Δ6‐不飽和化経路と呼ばれる)を含み、一方、より一般的ではない経路
は、Δ9‐伸長、Δ8‐不飽和化、およびΔ5‐不飽和化(Δ9‐不飽和化経路とよばれ
る)を使用する。これらの連続的な不飽和化および鎖延長反応は、図1の左上に模式的に
示されるω6脂肪酸基質LA(ω6)または図1の右下に示されるEPAにたどり着くω
3基質ALA(ω3)のいずれかにより開始し得る。最初のΔ6‐不飽和化がω6基質L
Aで行われる場合、一連の3つの酵素のLC‐PUFA産生物は、ω6脂肪酸ARAであ
ろう。LC‐PUFA合成生物は、アラキドン酸(ARA,20:4ω6)のEPAへの
転換について、図1にΔ17‐デサチュラーゼ工程として示されるように、ω3‐デサチ
ュラーゼを用いて、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換することとしてもよい。ω3‐デサチ
ュラーゼファミリーのいくつかのメンバーは、LAからARAの範囲の種々の基質で作用
し得る。植物のω3‐デサチュラーゼはLAのALAへのΔ15‐不飽和化を特異的に触
媒することが多く、一方、真菌および酵母のω3‐デサチュラーゼは、ARAのEPAへ
のΔ17‐不飽和化に特異的であることとしてもよい(非特許文献2、非特許文献3)。
いくつかの報告は、多種多様なω6基質をそれらの対応するω3産生品に転換し得る非特
異的なω3‐デサチュラーゼが存在することを示唆する(非特許文献4)。
5‐伸長により生じ、その後、DHAを産生するためのΔ4‐不飽和化に続く(図1)。
対照的に、哺乳類は、Δ4‐デサチュラーゼとは独立した、3つの別個の反応により、D
PAをDHAに転換する、いわゆる「シュプレッヒャー(Sprecher)」経路を使用する(
非特許文献5)。
gans)のような下等動物に概してみられるフロントエンドのデサチュラーゼは、ホスファ
チジルコリン(PC)基質のsn‐2位置にエステル化された脂肪酸基質を主に受容する
。これらのデサチュラーゼは、よって、アシル‐PC、脂質‐結合フロントエンドデサチ
ュラーゼとして知られる(非特許文献6)。対照的に、高等動物のフロントエンドデサチ
ュラーゼは、概して、脂肪酸基質がPCよりもむしろCoAに結合するアシル‐CoA基
質を受容する(非特許文献7)。いくつかの微細藻類デサチュラーゼおよび1つの植物デ
サチュラーゼは、CoAへとエステル化される脂肪酸基質を使用することが知られる(表
2)。
らなり、まず、縮合反応が、マロニル‐CoAから脂肪酸に2Cユニットの追加をもたら
し、β‐ケトアシル中間物の形成をもたらす。次に、これがNADPHにより還元され、
その後エノイル中間物を産生するための脱水へと続いた。この中間物は、最後に、伸長さ
れた脂肪酸を産生するために2回目の還元がなされた。概して、これらの4つの反応の濃
縮工程は基質特異的であり、一方、他の工程はそうではないことが考えられる。実施にお
いては、このことは、天然の植物の伸長機構は、PUFAに特異的な濃縮酵素(概して「
エロンガーゼ(elongase)」と呼ばれる)が導入されることを提供するPUFAを伸長す
ることができるが、非天然PUFA基質を伸長することにおける、天然の植物伸長機構の
効率は、低いかもしれないことを意味する。2007年に、酵母の伸長サイクルデヒドラ
ターゼの同定および特徴づけが公開された(非特許文献8)。
る脂肪酸基質に対して主に天然に生じ、一方、伸長は、アシル‐CoAプールにおける基
質に対して生じる。アシル‐PC分子からCoA担体への脂肪酸の転移は、ホスホリパー
ゼ(PLA)により行われ、一方、アシル‐CoA脂肪酸からPC担体への転移は、リゾ
ホスファチジル‐コリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)により行われる(図2
1)(非特許文献9)。
ほとんどのLC‐PUFA代謝工学は、有酸素性のΔ6‐不飽和化/伸長経路を用いて
行われてきた。タバコにおけるγ‐リノレン酸(GLA、18:3ω6)の生合成が、シ
アノバクテリウムシネコシスティス由来のΔ6‐デサチュラーゼを用いて、1996年に
最初に報告された(非特許文献10)。より近年では、GLAがベニバナ(種子オイルに
おける73%GLA;非特許文献11)およびダイズ(28%GLA;非特許文献12)
のような作物植物において産生された。EPAおよびDHAのようなLC‐PUFAの産
生は、増加した数の不飽和化および関連する伸長工程に起因する、より複雑な工学を伴う
。陸上植物におけるEPAの産生は、イソクリシスガルバナ(Isochrysis galbana)由来
のΔ9‐エロンガーゼ、ユーグレナグラシリス由来のΔ8‐デサチュラーゼ、およびモル
ティエレラアルピナ由来のΔ5‐デサチュラーゼをコードする遺伝子をアラビドプシスに
導入し、3%までのEPAを産生した非特許文献13により最初に報告された。この研究
は、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来のΔ6‐デサチュラーゼおよびΔ
6‐エロンガーゼ、並びにフェオダクチラム(Phaeodactylum tricornutum)由来のΔ5
‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いる亜麻の種子において、0.8%までのEP
Aの産生を報告した非特許文献14により続けられた。
示すのが、種子ではなく、魚類の内臓真菌症菌(Saprolegnia diclina)のΔ6‐デサチ
ュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ6‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナの
Δ5‐デサチュラーゼ、魚類の内臓真菌症菌のΔ4‐デサチュラーゼ、魚類の内臓真菌症
菌のΔ17‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ6‐エロンガーゼおよびパブ
ロバルセリ(Pavlova lutheri)のΔ5‐エロンガーゼをコードする遺伝子を導入するこ
とにより、ダイズ胚における3%DHAの産生が記載される、特許文献1であった。また
、DHAをも産生する胚における最大のEPAのレベルは、EPAのDHAへの転換の効
率が乏しいことを示す、19.6%であった(特許文献2)。この発見は、非特許文献1
5により公開されたものと同様であり、EPAからDHAへの流動は低く、ゼブラフィッ
シュΔ5/6‐デサチュラーゼ、カエノラブディティスエレガンス(Caenorhabditis ele
gans)Δ6‐エロンガーゼ、並びにパブロバサリナ(Pavlova salina)Δ5‐エロンガー
ゼおよびΔ4‐デサチュラーゼを用いるアラビドプシスにおいて3%EPAおよび0.5
%DHAの産生であった。また、2005年には、Wu et al.が、ピティウムイレギュラ
レ(Pythium irregulare)のΔ6‐デサチュラーゼ、スラウストキトリッド(Thraustoch
ytrid)のΔ5‐デサチュラーゼ、ヒメツリガネゴケのΔ6‐エロンガーゼ、キンセンカ
(Calendula officianalis)のΔ12‐デサチュラーゼ、スラウストキトリッドのΔ5‐
エロンガーゼ、フィトフトラインフェスタンス(Phytophthora infestans)のΔ17‐デ
サチュラーゼ、ニジマス(Oncorhyncus mykiss)のLC‐PUFAエロンガーゼ、スラウ
ストキトリッドのΔ4‐デサチュラーゼ、およびスラウストキトリッドLPCATを用い
て、セイヨウカラシナにおける25%ARA、15%EPA、および1.5%DHAの産
生を公開した(非特許文献16)。ω3LC‐PUFAを合成する油料種子作物を産生す
るための試みの概要は、非特許文献17および非特許文献18で提供される。非特許文献
18により示されるように、トランスジェニック植物においてDHAの産生について示す
ための得られた結果は、魚油においてみられるレベルに近いものではなかった。
けるDHAのより効率的な産生の必要性が残る。
植物を有する。
ン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)
を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに、任意にステアリドン
酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およ
びエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸
含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である、抽出植物脂質を提供す
る。
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルは、約2%
から18%の間、または約2%から16%の間、または約2%から15%の間であり、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)の
レベルは、約6%未満、または約3%未満、または約2%未満、または約1%未満である
、
iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約1
%から約30%の間、約3%から約30%の間、約6%から約30%の間、1%から約2
0%の間、約30%から約60%の間、約45%から約60%、または約30%である、
iv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルは
、約4%から約35%の間、約4%から約20%の間、または約4%から17%の間であ
る、
v)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベ
ルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、
約20%から約35%の間、約4%から16%の間、または約2%から16%の間である
、
vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレ
ベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%
から約7%の間、0.05%から約4%の間、0.05%から約3%の間、または0.0
5%から約2%の間である、
vii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)の
レベルは、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%
の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約
3%の間、または0.05%から約2%の間である、
viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(E
TA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満
、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4%
の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
ix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA
)のレベルは、約4%未満、約2%未満、約1%未満、約0.05%から約4%の間、約
0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間、または約0.05%か
ら約1%の間である、
x)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)
のレベルは、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約0.05%から約10%の間、約
0.05%から約5%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2
%の間である、
xi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)
のレベルは、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約0.05%から約8%の間、約0
.05%から約5%の間、または約0.05%から約3%の間、または約0.05%から
約2%の間である、
xii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約8%、
約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約
17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20
%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
xiii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4
,7,10,13,16)を含む、
xiv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4
,7,10,13,16)を実質的に含まない、
xv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含
まない、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%
から約25%の間、約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、約4%から約6
0%の間、約30%から約60%の間、または約45%から約60%の間である、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは
、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、または8%から約22%の間であ
る、
xviii)記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは
、約20%から約75%の間、約50%から約75%の間、または約60%から約75%
の間である、
xix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35
%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から約20%の間、約20%未
満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、
または約4%から約10%の間である、
xx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%
未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10
%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
xxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%
から約65%の間、約40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%か
ら約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
xxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、約9
%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%
から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
xxiii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸
の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間
、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満
、約1.0、約0.1、または約0.2である、
xxiv)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の
比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、
約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、
約0.1、約0.2、または約1.0である、
xxv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少
なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約7
5%から約90%の間の、Δ12‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のLAへの転換の
効率に基づく、
xxvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、
少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%
の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の、Δ6‐デサチュ
ラーゼによる、ALAのSDAへの転換の効率に基づく、
xxvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%
、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または
約75%から約85%の間の、Δ6‐エロンガーゼによる、SDAのETA酸への転換の
効率に基づく、
xxviii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70
%、少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、また
は約75%から約98%の間の、Δ5‐デサチュラーゼによる、ETAのEPAへの転換
の効率に基づく、
xxix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、
少なくとも約90%、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、
Δ5‐エロンガーゼによる、EPAのDPAへの転換の効率に基づく、
xxx)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少
なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約8
5%から約95%の間の、Δ4‐デサチュラーゼによる、DPAのDHAへの転換の効率
に基づく、
xxxi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、
少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約
10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxxii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%
、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から
約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づ
く、
xxxiii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22
%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、また
は約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxxiv)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xxxv)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約
70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約
99%の間、または約90%から約99%の間であり、
xxxvi)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
xxxvii)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.0
01%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含み
、または、これらを実質的に含まない、
xxxviii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも70%または少
なくとも80%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
xxxix)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3
/18:3(TAG58:12)である、
xl)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
とも約90%、または少なくとも約95%、少なくとも約98%、または約95%から約
98%の間が前記脂質である。
徴を有する:前記脂質またはオイルにおける前記総脂肪酸含有量において、前記DHAの
レベルは約7%から20%の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約2%から約16%
の間であり、前記ミリスチン酸のレベルは6%未満であり、前記オレイン酸のレベルは約
1%から約30%の間であり、前記LAのレベルは約4%から約35%の間であり、AL
Aが存在し、GLAが存在し、前記SDAのレベルは約0.05%から約7%の間であり
、前記ETAのレベルは約4%未満であり、前記EPAのレベルは約0.05%から約1
0%の間であり、前記DPAのレベルは約0.05%から約8%の間であり、前記抽出脂
質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約4%から約25%の間で
あり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約
4%から約35%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不
飽和脂肪酸のレベルは約20%から約75%の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有
量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.05から約3.0の間であり、
前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は約0.0
3から約3.0の間、好ましくは約0.50未満であり、前記脂質の前記脂肪酸組成は、
少なくとも約60%のΔ12‐デサチュラーゼによるオレイン酸のLAへの転換の効率、
少なくとも約60%のΔ6‐エロンガーゼによるSDAのETA酸への転換の効率、約5
0%から約95%の間のΔ5‐エロンガーゼによるEPAのDPAへの転換の効率、約5
0%から約95%の間Δ4‐デサチュラーゼによるDPAのDHAへの転換の効率、少な
くとも約10%のオレイン酸のDHAへの転換の効率に基づき、および前記脂質の前記ト
リアシルグリセロール(TAG)含有量は少なくとも約70%であり、並びに、任意に、
前記脂質は、コレステロールを実質的に含まないおよび/または前記脂質がトリ‐DHA
TAG(TAG66:18)を含む。
の特徴を有する:前記脂質における前記総脂肪酸含有量において、前記DHAのレベルは
約7%から20%の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約2%から約16%の間であ
り、前記ミリスチン酸のレベルは2%未満であり、前記オレイン酸のレベルは約1%から
約30%の間であり、前記LAのレベルは約4%から約35%の間であり、前記ALAの
レベルは約7%から約40%の間であり、前記GLAのレベルは約4%未満であり、前記
SDAのレベルは約0.05%から約7%の間であり、前記ETAのレベルは約4%未満
であり、前記ETrAのレベルは約0.05%から約4%の間であり、前記EPAのレベ
ルは約0.05%から約10%の間であり、前記DPAのレベルは約0.05%から約8
%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは
約4%から約25%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価
不飽和脂肪酸のレベルは約4%から約35%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約20%から約75%の間であり、前記
抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω6脂肪酸のレベルは0.5%から約10
%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは36
%から約75%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω3脂肪
酸のレベルは約9%から約33%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけ
る、ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.05から約3.0の間であり、前記抽出脂
質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は約0.03から約3
.0の間であり、前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%のΔ12‐デサチュ
ラーゼによるオレイン酸のLAへの転換の効率、少なくとも約60%のΔ6‐エロンガー
ゼによるSDAのETA酸への転換の効率、少なくとも約60%のΔ5‐デサチュラーゼ
によるETAのEPAへの転換の効率、約50%から約95%の間のΔ5‐エロンガーゼ
によるEPAのDPAへの転換の効率、約50%から約95%の間Δ4‐デサチュラーゼ
によるDPAのDHAへの転換の効率、少なくとも約10%のオレイン酸のDHAへの転
換の効率、少なくとも約15%のLAのDHAへの転換の効率、少なくとも約17%のA
LAのDHAへの転換の効率に基づき、並びに、前記抽出脂質における前記脂肪酸含有量
が1%未満のC20:1であり、前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有
量は少なくとも約70%であり、前記脂質はコレステロールを実質的に含まず、および前
記脂質はトリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。好ましくは、前記脂質もし
くはオイルはキャノーラオイルであり、および/または前記植物または植物部分から抽出
された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。好ましい実施形態において
、前記脂質またはキャノーラオイルは、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエ
ステルへと前記オイルにおける前記脂肪酸を転換するためにその後に処理されることとし
てもよい。さらなる処理が、DHAについての前記脂質またはオイルを濃縮するために適
用されることとしてもよい。
る:前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、前記DHAのレベルは約7%から20%の
間であり、前記パルミチン酸のレベルは約2%から約16%の間であり、前記ミリスチン
酸のレベルは2%未満であり、前記オレイン酸のレベルは約30%から約60%の間、好
ましくは約45%から約60%の間であり、前記LAのレベルは約4%から約20%の間
であり、前記ALAのレベルは約2%から約16%の間であり、前記GLAのレベルは約
3%未満であり、前記SDAのレベルは約3%未満であり、前記ETAのレベルは約4%
未満であり、前記ETrAのレベルは約2%未満であり、前記EPAのレベルは約4%未
満であり、前記DPAのレベルは約4%未満であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量
における前記総飽和脂肪酸のレベルは約4%から約25%の間であり、前記抽出脂質の前
記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約30%から約60%の間
、または約40%から約60%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における
前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約20%から約75%の間であり、前記抽出脂質の前
記総脂肪酸含有量における前記新ω6脂肪酸のレベルは約0.5%から約10%の間であ
り、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは約10%から約
20%の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω3脂肪酸のレベ
ルは約9%から約20%の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6
脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.05から約3.0の間、好ましくは約0.50未満
であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は
約0.03から約3.0の間であり、前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)
含有量は少なくとも約70%であり、前記脂質はコレステロールを実質的に含まず、およ
び前記脂質はトリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。好ましくは、前記脂質
またはオイルは、SDA、EPA、およびETAを実質的に含まず、および/またはキャ
ノーラオイルであり、および/または前記植物または植物部分から抽出された後に、エス
テル交換反応プロセスにより処理されない。特定の実施形態では、前記脂質またはキャノ
ーラオイルは、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルへと前記オイルに
おける前記脂肪酸を転換するためにその後に処理されることとしてもよい。さらなる処理
が、DHAについての前記脂質またはオイルを濃縮するために適用されることとしてもよ
い。
の特徴を有する:前記脂質またはオイルの前記総脂肪酸含有量において、前記DHAのレ
ベルは約7%から20%の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約2%から約16%の
間であり、前記ミリスチン酸のレベルは6%未満であり、前記オレイン酸のレベルは約1
%から約30%の間であり、前記LAのレベルは約4%から約35%の間であり、ALA
が存在し、GLAが存在し、前記SDAのレベルは約0.05%から約7%の間であり、
前記ETAのレベルは約6%未満であり、前記EPAのレベルは約0.05%から約10
%の間であり、前記DPAのレベルは約0.05%から約8%の間である。
植物ステロールをさらに含む。
gのオイル未満、約7mgのステロール/gのオイル未満、約1.5mgから約10mg
の間のステロール/gのオイル、または約1.5mgから約7mgの間のステロール/g
のオイルを含む。
テロール、Δ5‐スチグマステロール、エブリコール(eburicol)、β‐シトステロール
/24‐エチルコレステロール、Δ5‐アベナステロール(avenasterol)/イソフコス
テロール、Δ7‐スチグマステロール/スティグマスト(stigmast)‐7‐エン‐3β‐
オール、およびΔ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上、または全てを含むが、必
ずしもこれらに限定されない。
、前記ステロールのレベルは、その特定の植物種について表26で挙げられたものとほぼ
同じである。
約0.25mgのコレステロール/gのオイル未満、約0mgから約0.5mgの間のコ
レステロール/gのオイル、もしくは約0mgから約0.25mgの間のコレステロール
/gのオイルを含む、またはコレステロールを実質的に含まない。
である。このようなオイルの例は、キャノーラオイルのようなアブラナ属種オイル、ワタ
オイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコ
シオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオイル、ソルガムブルガレ(Sorghum vulgar
e)オイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイスグイネエヌシス(E
laesis guineenis)オイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアン
グスティフォリウス(Lupinus angustifolius)オイル、イネオイル、アフリカイネオイ
ル、カメリナサティバ(Camelina sativa)オイル、クランベアビシニカ(Crambe abyssi
nica)オイル、ミスカンサスxギガンティウスオイル(Miscanthus x giganteus)、また
はススキオイルを含むが、これらに限定されない。
オイルもまた提供され、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)
を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエ
ン酸(DHA)、並びに任意に1またはそれ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサ
ペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸
(ETA)を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、脂質は以下の特徴を有する
:
i)前記DHAのレベルが、約3%、約4%、約5%、約6%、または約7%であり、
ii)前記パルミチン酸のレベルが、約2%から約16%の間であり、
iii)前記ミリスチン酸のレベルが、約2%未満であり、
iv)前記オレイン酸のレベルが、約30%から約60%の間、好ましくは約45%か
ら約60%の間であり、
v)前記LAのレベルが、約4%から約20%の間であり、
vi)前記ALAのレベルが、約2%から約16%の間であり、
vii)前記GLAのレベルが、約4%未満であり、
viii)前記SDAのレベルが、約6%未満、または約4%未満であり、
ix)前記ETAのレベルが、約6%未満、または約4%未満であり、
x)前記ETrAのレベルが、約1%未満であり、
xi)前記EPAのレベルが、約10%未満であり、および/または前記EPAのレベ
ルが、前記DHAのレベルの0.5から2.0倍であり、
xii)前記DPAのレベルが、約4%未満であり、
xiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルが、
約4%から約25%の間であり、
xiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベル
が、約30%から約70%の間であり、
xv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルが
、約15%から約75%の間、好ましくは約15%から約30%の間であり、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω6脂肪酸のレベルが、約
0.5%から約10%の間であり、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総ω3脂肪酸のレベルが、
約10%から約20%の間であり、
xviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω3脂肪酸のレベルが
、約3%から約20%の間であり、
xix)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は
、約0.05から約3.0の間、好ましくは約0.50未満であり、
xx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は
、約0.03から約3.0の間であり、
xxi)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約7
0%であり、および
xxii)前記脂質は、コレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂
質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。より好ましくは、前記脂質は
、SDAおよびETAを実質的に含まず、および/または前記植物または植物部分から抽
出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸
(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに1またはそ
れ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエ
ン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、(i)前記抽出脂質の
前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが7%から20%の間であり、(ii)
前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが2%から16%
の間であり、(iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(
C14:0)のレベルが6%未満であり、(iv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量に
おける前記オレイン酸のレベルが、1%から30%の間、好ましくは30%から60%の
間であり、(v)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)の
レベルが4%から35%の間であり、(vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけ
るαリノレン酸(ALA)のレベルが4%から40%の間であり、(vii)前記抽出脂
質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルが4%未
満であり、(viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸の
レベルが4%から25%の間であり、(ix)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における
総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比が、1.0から3.0の間、または0.1から1の間で
あり、(x)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は少なくとも70
%であり、および(xi)TAGの形態においてエステル化されたDHAの少なくとも7
0%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3位置にある。一実施形態では、1もしくは
それ以上のまたは全ての以下の特徴を有する:
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが約2%か
ら約15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)の
レベルが1%未満である、
iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約3
%から約30%の間、約6%から約30%の間、1%から約20%の間、約45%から約
60%の間、または約30%である、
iv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルが
、約4%から約20%の間、または約4%から17%の間である、
v)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベ
ルが、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約35%の間
、または約4%から約16%の間である、
vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレ
ベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%
から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、または0.
05%から約2%の間である、
vii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)の
レベルが、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約
4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(E
TA)のレベルが、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約5%
の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%
から約2%の間である、
ix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA
)のレベルが、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%
の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間である、
x)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)
のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05
%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間で
ある、
xi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)
のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.05%
から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であ
る、
xii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが、約8%、
約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約
17%、約18%,約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20
%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
xiii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4
,7,10,13,16)を含む、
xiv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4
,7,10,13,16)を実質的に含まない、
xv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含
まない、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%
から約20%の間、または約6%から約20%の間である、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは
、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、または8%から約22%の間であ
る、
xviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベル
は、約20%から約75%の間、約50%から約75%の間、または約60%から約75
%の間である、
xix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35
%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20%未満、
約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、また
は約4%から約10%の間である、
xx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%
未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10
%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
xxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%
から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%から
約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
xxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、9%
から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%か
ら約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
xxiii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸
の比は、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満
、約0.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
xxiv)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の
比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、
約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、
約0.1、約0.2、または約1.0である、
xxv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少
なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約1
0%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、
少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約
40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく
、
xxvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%
、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または
約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxviii)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xxix)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約
80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約
90%から約99%の間である、
xxx)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
xxxi)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、約0.001%から
約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含み、または、
これらを実質的に含まない、
xxxii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも80%が、TAGの
sn‐1またはsn‐3の位置にある、
xxxiii)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:
3/18:3(TAG58:12)である、および
xxxiv)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。
i)前記脂質がオイルの形態であり、該オイルが、カンペステロール、Δ5‐スチグマ
ステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ5‐アベナステロール、Δ7‐スチ
グマステロールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上のまたは全てのよ
うな、1もしくはそれ以上のステロールを含み、および、任意に、前記オイルは10mg
未満のステロール/gのオイルを含む、および/もしくは前記オイルはコレステロールを
実質的に含まず、並びに/または、
ii)前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子である
ような、油料種子由来のオイルの形態である。
i)脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含
み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α
‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並び
に、任意にエイコサペンタエン酸(EPA)、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタ
エン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、
前記植物部分における前記抽出可能な脂質の総脂肪酸含有量における前記DHAのレベル
は、約7%から20%である工程、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、を含む、抽出植物脂
質を産生するためのプロセスを提供する。
有する。
の例は、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ
、シロイヌナズナ(アラビドプシスタリアナ)、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク
、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ル
ピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクラン
ベアビシニカ、好ましくは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサテ
ィバ(C.サティバ)種子を含むが、これらに限定されない。
とも約22mg、少なくとも約26mg、約18mgから約100mgの間、約22mg
から約70mgの間、または約24mgから約50mgのDHAを含む。
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラー
ゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロ
ンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュ
ラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐
エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を
方向づけることが可能である、1またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される
。
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少な
くとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75
%から約90%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノ
ール酸に転換する、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少な
くとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約95%の間、または約80
%から約95%の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ω6脂肪酸をω3脂
肪酸に転換する、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少
なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の
間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、1またはそ
れ以上の植物の細胞において、ALAをSDAに転換する、
iv)前記Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0
.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の
間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転
換する、
v)前記Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくと
も約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%か
ら約85%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、SDAをETAに転
換する、
vi)前記Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少な
くとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約99%の間
、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間の効率で、1またはそれ
以上の植物の細胞において、ETAをEPAに転換する、
vii)前記Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少な
くとも約90%の間、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の効
率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、EPAをDPAに転換する、
viii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約90%、
少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約
85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、DPAをD
HAに転換する、
ix)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのオレイン酸の転換
の効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%か
ら約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間である、
x)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのLAの転換の効率が
、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%
、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%
の間である、
xi)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのALAの転換の効
率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約
55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間である、
xii)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠
いている対応する細胞よりも、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約15%から
約30%の間、または約22.5%から約27.5%の間で多いω3脂肪酸を含む、
xiii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、、リノール酸(LA)に対してα‐リノレン
酸(ALA)を優先的に不飽和化する、
xiv)前記Δ6‐エロンガーゼは、また、Δ9‐エロンガーゼ活性を有する、
xv)前記Δ12‐デサチュラーゼは、また、Δ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvi)前記Δ6‐デサチュラーゼは、また、Δ8‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvii)前記Δ8‐デサチュラーゼは、また、Δ6‐デサチュラーゼ活性を有し、ま
たはΔ6‐デサチュラーゼ活性を有していない、
xviii)前記Δ15‐デサチュラーゼは、また、GLAでω3‐デサチュラーゼ活
性を有する、
xix)前記ω3‐デサチュラーゼは、また、LAでΔ15‐デサチュラーゼ活性を有
する、
xx)前記ω3‐デサチュラーゼは、両方のLAおよび/またはGLAを不飽和化する
、
xxi)前記ω3‐デサチュラーゼは、、LAに対してGLAを優先的に不飽和化する
、
xxii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約10%、少なく
とも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約15%から約30%
の間、または約20%から約25%の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のDHAへ
の転換の効率に基づく、
xxiii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約15%、少な
くとも約20%、少なくとも約22%、約15%から約60%の間、約20%から約40
%の間、または約22%から約30%の間の、前記植物部分におけるLAのDHAへの転
換の効率に基づく、
xxiv)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約17%、少なく
とも約22%、少なくとも約24%、約17%から約65%の間、約22%から約35%
の間、または約24%から約35%の間の、前記植物部分におけるALAのDHAへの転
換の効率に基づく、
xxx)1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐
PC基質よりもアシル‐CoA基質で、より高い活性を有する、
xxxi)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、LAよりもALAで、
より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのPCのsn‐2位置に
結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高いΔ6‐デサチュ
ラーゼ活性を有する、
xxxiii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、基質としてのALAで、LAと比較して
、少なくとも約2倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくと
も4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有する、
xxxiv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に
結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高い活性を有する、
xxxv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結
合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、少なくとも約5倍高いΔ6
‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有する、
xxxvi)前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
xxxvii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、ETAで、検出可能なΔ5‐デサチュラ
ーゼ活性を有していない、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、配列番号10で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ
酸配列を含む、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、配列番号12で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ
酸配列を含む、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、配列番号16で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号16と少なくとも50%同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
iv)前記Δ6‐エロンガーゼが、配列番号25で規定される配列を有するアミノ酸、
配列番号26のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号25および/または配
列番号26と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
v)前記Δ5‐デサチュラーゼが、配列番号30で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号30と少なくとも50%同一であるアミノ酸
配列を含む、
vi)前記Δ5‐エロンガーゼが、配列番号37で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号37と少なくとも50%同一であるアミノ酸
配列を含む、
vii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、配列番号41で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号41と少なくとも50%同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
DGAT)、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、グリセロ
ール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(GPAT)、1‐アシル−グリセロ
ール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、好ましくはC22多
価不飽和脂肪族アシル‐CoA基質を使用し得るLPAAT、アシル‐CoA:リソホス
ファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスホリパーゼA2(PL
A2)、ホスホリパーゼC(PLC)、ホスホリパーゼD(PLD)、CDP‐コリンジ
アシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(CPT)、ホスファチジルコリ
ン(phoshatidylcholine)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)
、ホスファチジルコリン:ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(P
DCT)、アシル‐CoAシンターゼ(ACS)、または2つもしくはそれ以上のこれら
の組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
AAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、FATBのような
チオエステラーゼ、またはΔ12‐デサチュラーゼ、または2つもしくはそれ以上のこれ
らの組み合わせから選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および/
または活性を下方制御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに
含む。
ロモーターである。一実施形態では、少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが、
オイル生合成もしくはオレオシンのような蓄積遺伝子から、またはコンリニン(conlinin
)のような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られている。
する、外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の
種子の発生以前、またはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を
開始し、前記プロモーターが前記Δ12‐デサチュラーゼおよび前記ω3‐デサチュラー
ゼをコードする前記外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける。
に組込まれるDNA分子、好ましくはT‐DNA分子において共有結合で結合され、好ま
しくは前記植物部分の前記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなDNA分子の数は、
1、2もしくは3以下であり、または2もしくは3である。
デサチュラーゼをそれぞれコードする少なくとも2つの異なる外因性ポリヌクレオチドを
含む。
有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なく
とも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくと
も約70%、または約50%から約80%の間である。これらの実施形態において、最大
の前記オイル含有量は、対応する野生型の植物部分の前記オイル含有量の約100%であ
ることとしてもよい。
態であり、前記脂質の重量の少なくとも約90%、または少なくとも約95%、少なくと
も約98%、または約95%から約98%の間がトリアシルグリセロールである。
の前記DHAのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む。例えば
、前記処理がエステル交換反応である。例えば、キャノーラオイルのような前記脂質が、
前記オイルにおける前記脂肪酸を、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステ
ルに転換するために処理されることとしてもよく、その後、前記DHAについての前記脂
質またはオイルを濃縮するために分画することとしてもよい。
質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール
酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコ
サヘキサエン酸(DHA)、並びに任意に1またはそれ以上のエイコサペンタエン酸(E
PA)、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテ
トラエン酸(ETA)を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有
量における前記DHAのレベルは、約3%、約4%、約5%、約6%、または約7%であ
る工程、および
ii)前記植物部分から脂質を抽出する工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスがさらに提供され、
前記抽出脂質は、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、以下の特徴を有する:
i)前記DHAのレベルは約3%、約4%、約5%、約6%、または約7%であり、
ii)前記パルミチン酸のレベルは約2%から約16%の間であり、
iii)前記ミリスチン酸のレベルは2%未満であり、
iv)前記オレイン酸のレベルは約30%から約60%の間、好ましくは約45%から
約60%の間であり、
v)前記LAのレベルは約4%から約20%の間であり、
vi)前記ALAのレベルは約2%から約16%の間であり、
vii)前記GLAのレベルは約4%未満であり、
viii)前記SDAのレベルは、約6%未満、または約4%未満であり、
ix)前記ETAのレベルは、約6%未満、または約4%未満であり、
x)前記ETrAのレベルは約1%未満であり、
xi)前記EPAのレベルは約10%未満であり、および/または前記EPAのレベル
は前記DHAのレベルの0.5から2.0倍であり、
xii)前記DPAのレベルは約4%未満であり、
xiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約
4%から約25%の間であり、
xiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベル
は約30%から約70%の間であり、
xv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは
約15%から約75%の間、好ましくは、約15%から約30%の間であり、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω6脂肪酸のレベルは約0
.5%から約10%の間であり、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは約10
%から約20%の間であり、
xviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω3脂肪酸のレベルは
約3%から約20%の間であり、
xix)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比
は、約0.05から約3.0の間、好ましくは約0.50未満であり、
xx)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は
約0.03から約3.0の間であり、
xxi)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は少なくとも約70
%であり、および
xxii)前記脂質はコレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂質
はトリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。より好ましくは、前記脂質は、S
DAおよびETAを実質的に含まず、および/または前記植物または植物部分から抽出さ
れた後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α
‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並び
に、1またはそれ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、
ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、(i)
前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、7%から20%の間であ
り、(ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが、
2%から16%の間であり、(iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記
ミリスチン酸(C14:0)のレベルは、6%未満であり、(iv)前記抽出脂質の前記
総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、1%から30%の間または30%か
ら60%の間であり、(v)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸
(LA)のレベルは、4%から35%の間であり、(vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸
含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベルは、4%から40%の間であり、
(vii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETr
A)のレベルは、4%未満であり、(viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量にお
ける総飽和脂肪酸のレベルは、4%から25%の間であり、(ix)前記抽出脂質の前記
脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、1.0から3.0の間、ま
たは0.1から1の間であり、(x)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)
含有量は、少なくとも70%であり、および(xi)TAGの形態でエステル化されたD
HAの少なくとも70%が、TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある工程、
%、および、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスもまた提供される。
る。
スを提供し、該プロセスは、抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交
換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、
オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(A
LA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに任意に1または
それ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタ
エン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、前記抽出脂質の前記
総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが約7%から20%であり、これにより前記
エチルエステルを産生する。
スを提供し、該プロセスは、抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交
換することを含み、前記抽出植物脂質は、トリアシルグリセロールの形態でエステル化さ
れた脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含む
ω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(
DHA)、並びに1またはそれ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸
(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)を
含み、(i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約3%
、約4%、約5%、約6%、または7%から20%の間であり、(ii)前記抽出脂質の
前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが、2%から16%の間であり、
(iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)
のレベルは、6%未満であり、(iv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記
オレイン酸のレベルは、1%から30%の間または30%から60%の間であり、(v)
前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルは、4%か
ら35%の間であり、(vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノ
レン酸(ALA)のレベルは、4%から40%の間であり、(vii)前記抽出脂質の前
記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、4%未満で
あり、(viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは
、4%から25%の間であり、(ix)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω
6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、1.0から3.0の間、または0.1から1の間であり
、(x)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも70%
であり、および(xi)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも70%が、
TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にあり、これにより前記エチルエステルを産生す
る。一実施形態では、前記抽出植物脂質は、以下の特徴:
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが2%から
15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)の
レベルが1%未満である、
xxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約
3%から約30%の間、約6%から約30%の間、1%から約20%の間、約45%から
約60%の間、または約30%である、
xxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレ
ベルが、約4%から約20%の間、または約4%から17%である、
xxxvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(AL
A)のレベルが、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約
35%の間、または4%から16%の間である、
xxxviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(G
LA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、
0.05%から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、
または0.05%から約2%の間である、
xxxix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA
)のレベルが、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%か
ら約4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xl)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(ETA
)のレベルが、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約5%の間
、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から
約2%の間である、
xli)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETr
A)のレベルが、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3
%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間である、
xlii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(E
PA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0
.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%
の間である、
xliii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(D
PA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.
05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の
間である、
xliv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが、約8%
、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、
約17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から2
0%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
xlv)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,
7,10,13,16)を含む、
xlvi)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ
4,7,10,13,16)を実質的に含まない、
xlvii)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質
的に含まない、
xlviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、
約4%から約20%の間、または約6%から約20%の間である、
xlix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは
、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、または8%から約22%の間であ
る、
l)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約2
0%から約75%の間、約50%から約75%の間、または約60%から約75%の間で
ある、
li)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35%
から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20%未満、約
16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または
約4%から約10%の間である、
lii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10
%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約1
0%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
liii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36
%から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%か
ら約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
liv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、9%か
ら約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%から
約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
lv)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は
、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0
.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
lvi)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比
は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約
0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約
0.1、約0.2、または約1.0である、
lvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、
少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約
10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
lviii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%
、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から
約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づ
く、
lix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少
なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約2
4%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
lx)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
lxi)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約8
0%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約9
0%から約99%の間である、
lxii)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
lxiii)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.00
1%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含む、
または、これらを実質的に含まない、
lxiv)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも80%が、前記TAG
のsn‐1またはsn‐3の位置にある、
lxv)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/1
8:3(TAG58:12)である、および
lxvi)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
i)前記脂質はオイルの形態であり、前記オイルは、カンペステロール、Δ5‐スチグ
マステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ5‐アベナステロール、Δ7‐ス
チグマステロールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上のまたは全ての
ような、1もしくはそれ以上のステロールを含み、並びに、任意に、前記オイルは約10
mg未満のステロール/gのオイルを含む、および/もしくは前記オイルはコレステロー
ルを実質的に含まない、
ii)前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子のよう
な、油料種子由来のオイルの形態である、
iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約3%、
約4%、約5%、約6%、または7%から20%である、
の1もしくはそれ以上、または全てが適用される。
1の遺伝子、第2の遺伝子、第3の遺伝子、第4の遺伝子、第5の遺伝子、および第6の
遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子構築物(コンストラクト)を提供し、第1、第2、およ
び第3の遺伝子が第1の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第4、第5、および第
6の遺伝子が第2の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび/また
はポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、およ
び転写ターミネーター、および/またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記DNA分子が3、4、5、または6つの異なるプロモーターを
含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、
1もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合される
コード領域に対して異種性であり、
前記第1の遺伝子の転写の方向が、前記第3の遺伝子から離れており、前記第3の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第4の遺伝子の転写の方向が、前記第6の遺伝子から離れており、前記第6の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第2の遺伝子の転写の方向が、前記第1の遺伝子または前記第3の遺伝子と同じで
あり、
前記第5の遺伝子の転写の方向が、前記第4の遺伝子または前記第6の遺伝子と同じで
あり、
前記第2の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約
0.2から約3.0キロベースの間の第1のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、前記第1または第3の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約1.0から約10.0キロベースの間の第2のスペーサー領域により前記第1の遺伝
子クラスターが第2の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第5の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約
0.2から約3.0キロベースの間の第3のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、第4または第6の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く。
サー領域により、より近いいずれかの、前記第1の遺伝子クラスターまたは前記第2の遺
伝子クラスターから間隔を置く第7の遺伝子を含む。
ーおよび/またはポリアデニル化領域を含む。
結合領域(MAR)を含む。
、かつT‐DNA分子である。
のである、または植物細胞のゲノムに組み込まれる。
脂肪酸エロンガーゼをコードする。
をコードする遺伝子、および/または本明細書に定義される酵素をコードする1またはそ
れ以上の遺伝子を含む。
i)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、ま
たは45のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、
または45に示される1またはそれ以上の配列と、少なくとも95%同一または99%同
一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および/または外因性ポリヌクレオチドを提供する。
i)配列番号2のヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号2に示される配列と、少なくとも95%同一または99%同一であるヌ
クレオチドの配列、
を含む。
子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクトを提供する。
もしくは45のいずれか1つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号1
1、14、18、22、23、28、34、35、39、もしくは45で示される1もし
くはそれ以上の前記配列と少なくとも95%同一もしくは99%同一である前記ヌクレオ
チドの配列は、プロモーターに操作可能に結合される。
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラー
ゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロ
ンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュ
ラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9−
エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができるように、1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
上のまたは全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、上記に定義される1また
はそれ以上の特徴を有する。
i)配列番号10に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ12‐デサチュラーゼを
コードする第1の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列と、
ii)配列番号12に規定される配列を有するアミノ酸を含むω3‐デサチュラーゼを
コードする第2の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列とを含む、宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができる1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
本発明の前記遺伝子コンストラクト、または本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンス
トラクトを含む、宿主細胞を提供する。
または成熟した植物種子の細胞である。
ある。
好ましくは、油料種子植物またはシロイヌナズナである。一実施形態では、前記植物は、
アブラナ属植物、好ましくは、セイヨウアブラナもしくはセイヨウカラシナ、またはシロ
イヌナズナ以外の他の植物である。
a)その種子における脂質であって、該脂質はエステル化形態における脂肪酸を含み、
および
b)以下のセットの酵素:
i)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌の
Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチ
ュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
ii)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌
のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサ
チュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、油料種子植物を提供し、各ポリヌ
クレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づ
けることができるように1またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合さ
れ、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン
酸(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリ
ドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)
、ならびに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)および/またはエイコサテトラエン酸
(ETA)を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは約7%
から20%である。
、トウモロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリ
ウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアング
スティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ
を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、前記油料種子植物は、キャノーラ、
ダイズ、カメリナサティバ、または シロイヌナズナ植物である。代替的な実施形態では
、前記油料種子植物は、シロイヌナズナ以外である。
用することができる。好ましい実施形態では、1またはそれ以上の前記Δ6‐デサチュラ
ーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼは、
もし存在する場合には、アシル‐CoA基質を用いることができ、好ましくは、i)Δ6
‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、およびΔ4‐デサチュラーゼ、またはii)
Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼのそれぞれ
は、アシル‐CoA基質を用いることができる。一実施形態では、Δ12‐デサチュラー
ゼおよび/またはω3‐デサチュラーゼは、アシル‐CoA基質を用いることができる。
アシル‐CoA基質は、好ましくは、ALA‐CoA、ETA‐CoA、DPA‐CoA
、ETrA‐CoA、LA‐CoA、GLA‐CoA、またはARA‐CoAである。
くとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの
種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好
ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少な
くとも約48mgのDHA含有量を有する。最大のDHA含有量は、1グラムの種子あた
り約80から約100mg、または1グラムの種子あたり約80mgもしくは約100m
gであることとしてもよい。
ラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物を提供し、前記植物の成熟した、
収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの
種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラ
ムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも
約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgのDHA含有量を有する
。最大のDHA含有量は、1グラムの種子あたり約80から約100mg、または1グラ
ムの種子あたり約80mgもしくは約100mgであることとしてもよい。
胞を提供する。
i)本発明の植物由来である、
ii)本明細書で定義される脂質を含む、
iii)本発明のプロセスで使用され得る、
iv)本発明の遺伝子コンストラクトを含む、または
v)本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の1またはそれ以上を有する。
有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリ
ナサティバ種子を提供し、前記種子の前記DHAの含有量は、1グラムの種子あたり少な
くとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの
種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好
ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少な
くとも約48mgである。最大のDHA含有量は、1グラムの種子あたり約80から約1
00mg、または1グラムの種子あたり約80mgもしくは約100mgであることとし
てもよい。
前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリ
ナサティバ植物、本発明の前記植物部分、または本発明の前記種子であって、本明細書で
定義される1もしくはそれ以上のまたは全ての特徴を含む抽出脂質を産生するために使用
され得るものがある。
、
a)前記細胞、好ましくは、LC‐PUFAを合成することができない細胞に、本発明
の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド
、本発明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書に定義される1またはそ
れ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
b)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
c)任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
d)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、
を含む。
れる特徴を有する。
ヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチ
ドの組み合わせは、前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる。
ら形質転換植物を再生する工程をさらに含む。
記細胞内に発現される。
a)好ましくは少なくとも1000のこのような植物の個体群の一部としてのフィール
ドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも1ヘクタールのエリアで、
本明細書の植物、または本明細書に定義される部分を産生する植物を成長させることと、
b)前記植物の1つまたは複数から種子を収穫することと、
c)任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgDHA/
ヘクタールの総DHA収率を有するオイルを産生することと、
を含む。
特徴:
i)前記オイルが本明細書に定義される、
ii)前記植物部分または種子が、本発明のプロセスで使用されることができる、
iii)前記外因性ポリヌクレオチドが、本発明の遺伝子コンストラクトに含まれる、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドは、本発明の外因性ポリヌクレオチドを含む、
v)前記植物細胞は、本発明の細胞である、
vi)前記種子は、本発明の方法で産生される、
の1またはそれ以上を有する。
は脂肪酸エロンガーゼ、または1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに1も
しくはそれ以上の脂肪酸エロンガーゼを産生する方法を提供し、該方法は、本発明の前記
遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド、本発
明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書で定義される1またはそれ以上
の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、好ましくは、前記フィールドで油料種子植物
に発生する油料種子において、細胞でまたは細胞フリーの発現システムで発現することを
含む。
記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ
、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の
前記種子、または本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生
されまたは得られる脂質またはオイルを提供する。
る。油料種子由来のオイルの例は、キャノーラオイル(セイヨウアブラナ、ブラッシカ・
ラパ亜種)、マスタードオイル(セイヨウカラシナ)、他のアブラナオイル、ヒマワリ油
(ヒマワリ)、亜麻仁油(アマ)、ダイズオイル(ダイズ)、ベニバナオイル(ベニバナ
)、コーンオイル(トウモロコシ)、タバコオイル(タバコ)、ピーナッツオイル(ピー
ナッツ)、パームオイル、綿実油(ワタ)、ココナッツオイル(ココヤシ)、アボカドオ
イル(アボカド)、オリーブオイル(オリーブ)、カシューオイル(カシューナッツ)、
マカダミアオイル(マカダミア)、アーモンドオイル(アーモンド)、またはシロイヌナ
ズナ種子オイル(シロイヌナズナ)を含むが、これらに限定されない。
記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ
、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の
前記種子、または本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生
されまたは得られる脂肪酸を提供する。好ましくは、前記脂肪酸はDHAである。前記脂
肪酸は、本明細書に記載される脂肪酸組成を有する脂肪酸の混合物であることとしてもよ
い。一実施形態では、前記脂肪酸は非エステル化である。
ヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、カメリナサティバ、またはダイズの種子ミールを含む
が、これらに限定されない。一実施形態では、前記種子ミールは、本明細書に定義される
外因性ポリヌクレオチドおよび/または遺伝子コンストラクトを含む。
発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/もし
くは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本
発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本
発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発
明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしく
は種子、または本発明の前記種子ミールを含む組成物を提供する。実施形態では、前記組
成物は、薬学的、食品、もしくは農業的使用に適する担体、種子処理化合物、肥料、他の
食品もしくは配合原料、または添加されたタンパク質もしくはビタミンを含む。
の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチ
ド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、本発明の
前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラ
ナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明
の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子
ミール、または本発明の組成物を含む、家畜飼料、化粧品、または化学物質もまた提供さ
れる。
以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コ
ンストラクト、本発明の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前
記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明に係る前記細胞、本発明の前記トラン
スジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨ
ウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子
、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子ミール、ま
たは本発明の前記組成物を、少なくとも1つの他の食品原料成分と混合することを含む。
提供し、該方法は、対象に、1またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本
発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/もし
くは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本
発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本
発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発
明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしく
は種子、本発明の前記種子ミール、本発明の前記組成物、または本発明の前記家畜飼料、
を投与することを含む。
鬆症、腎結石、AIDS、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、
胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単
極性うつ病、攻撃的な敵意(aggressive hostility)、副腎白質ジストロフィー(adreno
leukodystophy)、冠動脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞
性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出
血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼
性疾患を含むが、これらに限定されない。
たはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明のいず
れか1つの前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/もしくは外因性ポリヌ
クレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、
本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨ
ウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分
、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の
前記種子ミール、本発明の前記組成物、または本発明の前記家畜飼料、の使用もまた提供
される。前記薬剤の前記産生は、本明細書に記載される状態の治療のために、薬学的に受
容可能な担体と、本発明のオイルを混合することを含むこととしてもよい。前記方法は、
まず、前記DHAのレベルを増加させるために、前記オイルを精製することおよび/また
はエステル交換反応および/または前記オイルの分画を含むこととしてもよい。特定の実
施形態において、前記方法は、前記オイルにおける前記脂肪酸を、メチルまたはエチルエ
ステルのようなアルキルエステルに転換するために、キャノーラオイルのような前記オイ
ルまたは脂質を処理することを含む。さらに、分画または蒸留のような処理が、前記DH
Aについての前記オイルまたは脂質を濃縮するために適用されることとしてもよい。好ま
しい実施形態では、前記薬剤はDHAのエチルエステルを含む。さらにより好ましい実施
形態では、前記薬剤における前記DHAのエチルエステルのレベルは、30%から50%
の間である。例えば、前記薬剤における前記総脂肪酸含有量の30%から50%の間で、
前記薬剤はEPAのエチルエステルをさらに含むこととしてもよい。このような薬剤は、
本明細書に記載されるような医学的状態を治療するために、ヒトまたは動物の対象に投与
するのに適する。
記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法を提供する。
または前記植物から前記種子を収穫することを含む。
び/または前記種子を保存することをさらに含む。
らに含む。
場所に運ぶことをさらに含む。
て行われる。
a)本発明の種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および/または収穫するこ
とと、
b)前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し
、および/または選り分けることと、
c)工程b)で分離された前記種子をふるいにかけおよび/またはソートすること、お
よび容器内に前記ふるいにかけられたおよび/またはソートされた種子をロードすること
により、種子の入った容器を産生することと、
を含む、種子の入った容器を産生するプロセスを提供する。
は、本発明は、表16の種子14のような、実施例のセクションにおいて表で提供される
ものについての脂肪のレベルを有する。
に必要な変更を加えて適用すると解釈されるべきである。
示のみの目的を意図とされる。機能的に均等な産生物、組成物、および方法は、あきらか
に、本明細書に記載されるように、本発明の範囲内である。
程、組成物の材料、工程の群、組成物の材料の群への参照は、1つおよび複数(つまり、
1またはそれ以上の)のこれらの工程、組成物の材料、工程の群、組成物の材料の群を包
含すると解釈されるべきである。
に記載される。
配列番号1‐pJP3416‐GA7ヌクレオチド配列。
配列番号2‐pGA7‐mod_Bヌクレオチド配列。
配列番号3‐pGA7‐mod_Cヌクレオチド配列。
配列番号4‐pGA7‐mod_Dヌクレオチド配列。
配列番号5‐pGA7‐mod_Eヌクレオチド配列。
配列番号6‐pGA7‐mod_Fヌクレオチド配列。
配列番号7‐pGA7‐mod_Gヌクレオチド配列。
配列番号8‐pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_インサートヌ
クレオチド配列。
配列番号9‐植物におけるラカンセア・クルイベリ(Lachancea kluyveri)Δ12デサ
チュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号10‐ラカンセア・クルイベリΔ12‐デサチュラーゼ。
配列番号11‐植物におけるピキア・パストリスω3デサチュラーゼの発現についての
コドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号12‐ピキア・パストリスω3デサチュラーゼ。
配列番号13‐ミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼをコードするオープンリー
ディングフレーム。
配列番号14‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号15‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号16‐ミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼ。
配列番号17‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ6‐デサチュラーゼをコードするオ
ープンリーディングフレーム。
配列番号18‐植物におけるオストレオコッカスルシマリヌスΔ6‐デサチュラーゼの
発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号19‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ6‐デサチュラーゼ。
配列番号20‐オストレオコッカスタウリΔ6‐デサチュラーゼ。
配列番号21‐ピラミモナス・コルダタΔ6‐デサチュラーゼをコードするオープンリ
ーディングフレーム。
配列番号22‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で切断され、機能的なエロン
ガーゼをコードする)(バージョン1)。
配列番号23‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で切断され、機能的なエロン
ガーゼをコードする)(バージョン2)。
配列番号24‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で切断され、機能的なエロン
ガーゼをコードする)(バージョン3)。
配列番号25‐ピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼ。
配列番号26‐切断されたピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼ。
配列番号27‐パブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号28‐植物におけるパブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号29‐植物におけるパブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号30‐パブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼ。
配列番号31‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐デサチュラーゼをコードするオープンリ
ーディングフレーム。
配列番号32‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐デサチュラーゼ。
配列番号33‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼをコードするオープンリー
ディングフレーム。
配列番号34‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号35‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号36‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン3)。
配列番号37‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼ。
配列番号38‐パブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号39‐植物におけるパブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号40‐植物におけるパブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼの発現についてのコ
ドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号41‐パブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼ。
配列番号42‐イソクリシスガルバナΔ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーデ
ィングフレーム。
配列番号43‐イソクリシスガルバナΔ9‐エロンガーゼ。
配列番号44‐エミリアニアハクスレイCCMP1516Δ9‐エロンガーゼをコード
するオープンリーディングフレーム。
配列番号45‐植物におけるエミリアニアハクスレイΔ9‐エロンガーゼの発現につい
てのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号46‐エミリアニアハクスレイCCMP1516Δ9‐エロンガーゼ。
配列番号47‐パブロバピンギスΔ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号48‐パブロバピンギスΔ9‐エロンガーゼ。
配列番号49‐パブロバサリナΔ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーディング
フレーム。
配列番号50‐パブロバサリナΔ9‐エロンガーゼ。
配列番号51‐パブロバサリナΔ8‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディン
グフレーム。
配列番号52‐パブロバサリナΔ8‐デサチュラーゼ。
配列番号53‐P19ウイルスサプレッサー。
配列番号54‐V2ウイルスサプレッサー。
配列番号55‐P38ウイルスサプレッサー。
配列番号56‐Pe‐P0ウイルスサプレッサー。
配列番号57‐RPV‐P0ウイルスサプレッサー。
配列番号58‐P19ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレー
ム。
配列番号59‐V2ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム
。
配列番号60‐P38ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレー
ム。
配列番号61‐Pe‐P0ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフ
レーム。
配列番号62‐RPV‐P0ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディング
フレーム。
配列番号63‐シロイヌナズナLPAAT2。
配列番号64‐リムナンテスアルバLPAAT。
配列番号65‐サッカロマイセスセレビシエLPAAT。
配列番号66‐ミクロモナス・プシラLPAAT。
配列番号67‐モルティエレラアルピナLPAAT。
配列番号68‐セイヨウアブラナ(Braccisa napus)LPAAT。
配列番号69‐セイヨウアブラナLPAAT。
配列番号70‐フィトフトラインフェスタンスω3デサチュラーゼ。
配列番号71‐タラッシオシラシュードナナω3デサチュラーゼ。
配列番号72‐ピティウムイレギュラレω3デサチュラーゼ。
別途具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語
は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、タ
ンパク質化学、および生化学における)により一般的に理解されるのと同じ意味を有する
と解釈されるべきである。
免疫学的技術は、当業者によく知られる標準的な手順である。このような技術は、J. Per
bal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Samb
rook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laborat
ory Press (1989), T.A. Brown (エディター), Essential Molecular Biology: A Practi
cal Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (エ
ディター), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995および
1996), F.M. Ausubel et al. (エディター), Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までの全てのアップデー
トを含む), Ed Harlow and David Lane (エディター), Antibodies: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),および J.E. Coligan et al. (エディター
), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (現在までの全てのアップデ
ートを含む)のようなソースにおける文献を通じて記載され、および説明される。
「XまたはY」のいずれかを意味することが理解されるべきであり、両方の意味について
、または一方の意味について、明示的なサポートを提供すると解釈されるべきである。
0%、より好ましくは+/−5%、より好ましくは+/−1%を指す。
含んでいる(including)」のようなバリエーションは、1つの記載された要素、整数、
もしくは工程、または群の要素、整数、もしくは工程を含むが、あらゆる他の要素、整数
、もしくは工程、または群の要素、整数、もしくは工程を排除しないことを暗示すること
が理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、用語「抽出植物脂質」および「単離植物脂質」は、植物ま
たは種子のようなその植物部分を、例えば、破砕することにより、抽出形態である脂質組
成物を指す。抽出脂質は、例えば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然
の組成物、または全てではなくても、ほとんどの1もしくはそれ以上のもしくはそれぞれ
の、植物性物質由来の水、核酸、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製
された組成物、であり得る。精製方法の例が、以下に記載される。一実施形態では、抽出
または単離植物の脂質は、組成物の重量により、少なくとも約60%、少なくとも約70
%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%(w/w)脂
質を含む。脂質は、室温で固体または液体であることとしてもよく、液体である場合に、
オイルであることが考えられる。一実施形態では、本発明の抽出脂質は、別のソースによ
り産生されないDHAのような別の脂質(例えば、魚油由来のDHA)とブレンドされて
いない。一実施形態では、抽出後に、1もしくはそれ以上のまたは全ての、DHAに対す
るオレイン酸、DHAに対するパルミチン酸、DHAに対するリノール酸、および総ω6
脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有
意に変化していない(例えば、10%または5%以下の変化)。別の実施形態では、抽出
植物脂質は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、1もしくはそれ以上
のまたは全ての、DHAに対するオレイン酸、DHAに対するパルミチン酸、DHAに対
するリノール酸、および総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水
素化または分画法のような手順にさらされていない。本発明の抽出植物脂質がオイルにお
いて含まれる場合、オイルは、ステロールのような、非脂肪酸分子をさらに含むこととし
てもよい。
出植物脂質または単離植物脂質を含み、室温で液体である、物質または組成物を指す。オ
イルは、植物または種子のようなその一部から得られる。抽出または単離オイルは、例え
ば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然の組成物、または全てではなく
ても、ほとんどの1もしくはそれ以上のもしくはそれぞれの、植物性物質由来の水、核酸
、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製された組成物、であり得る。組
成物は、脂質または非脂質である他の成分を含むこととしてもよい。一実施形態では、オ
イル組成物は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なく
とも約90%、または少なくとも約95%(w/w)抽出植物脂質を含む。一実施形態で
は、本発明の抽出されたオイルは、別のソース(例えば、魚油由来のDHA)により産生
されていないDHAのような別のオイルによりブレンドされていない。一実施形態では、
抽出後に、1もしくはそれ以上のまたは全ての、DHAに対するオレイン酸、DHAに対
するパルミチン酸、DHAに対するリノール酸、および総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比
は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有意に変化していない(例え
ば、10%または5%以下の変化)。別の実施形態では、抽出植物オイルは、無傷の種子
または細胞における比と比較される場合に、1もしくはそれ以上のまたは全ての、DHA
に対するオレイン酸、DHAに対するパルミチン酸、DHAに対するリノール酸、および
総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水素化または分画法のよう
な手順にさらされていない。本発明の抽出植物オイルは、ステロールのような非脂肪酸分
子を含むこととしてもよい。
である。例えば、本発明のオイルは、好ましくは、重量により、少なくとも75%、少な
くとも80%、少なくとも85%、または少なくとも90%の脂質を含む。典型的には、
精製されたオイルは、オイルにおける脂質の重量による少なくとも90%トリアシルグリ
セロール(TAG)を含む。ジアシルグリセロール(DAG)、遊離脂肪酸(FFA)、
リン脂質、およびステロールのようなオイルの微量な成分は、本明細書に記載されるよう
に存在することとしてもよい。
有することが多い、カルボン酸(または、有機酸)を指す。典型的に、脂肪酸は、少なく
とも8炭素原子の長さ、より好ましくは少なくとも12炭素の長さの炭素‐炭素結合鎖を
有する。最も天然に発生する脂肪酸は、それらの生合成が2つの炭素原子を有するアセテ
ートを伴うため、同じ数の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態(非エステル化)にお
けるもの、またはトリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル
‐CoA(チオ‐エステル)結合、もしくは他の結合形態の一部ような、エステル化形態
におけるものであることとしてもよい。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチ
ジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール形態のような、リン脂質として
のエステル化であることとしてもよい。
飽和」は、水素を指し、全ての炭素(カルボン酸[‐COOH]基から離れてている)が
、できるだけ多くの水素を含む。つまり、オメガ(ω)端部は3つの水素(CH3‐)を
含み、鎖内の各炭素は2つの水素(‐CH2‐)を含む。
り、別の炭素に対して二重に結合された炭素)により、鎖の一重に結合された「‐CH2
‐CH2‐」部分を置換し、1またはそれ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在するこ
とを除いて、飽和脂肪酸に対して類似の形態である。二重結合の両側に結合された鎖にお
ける2つの隣の炭素原子は、シスまたはトランス構造で生じ得る。
とも12の炭素原子および鎖におけるただ1つのアルケン基(炭素‐炭素二重結合)を含
む、脂肪酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「多価不飽和脂肪酸」または「PU
FA」は、その炭素鎖において少なくとも12の炭素原子および少なくとも2つのアルケ
ン基(炭素‐炭素二重結合)を含む、脂肪酸を指す。
は、その炭素鎖において少なくとも20の炭素原子および少なくとも2つの炭素‐炭素二
重結合を含む、脂肪酸を指し、よって、VLC‐PUFAを含む。本明細書で使用される
場合、用語「非常に長い長鎖多価不飽和脂肪酸」および「VLC‐PUFA」は、その炭
素鎖において少なくとも22の炭素原子および少なくとも3つの炭素‐炭素二重結合を含
む、脂肪酸を指す。脂肪酸の炭素鎖における炭素原子の数は、通常、分岐していない炭素
鎖を指す。炭素鎖が分岐されている場合、炭素原子の数は、側鎖におけるものを除外する
。一実施形態において、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω3脂肪酸であり、つまり、脂肪酸の
メチル端部から3番目の炭素‐炭素結合において、不飽和化(炭素‐炭素二重結合)を有
する。別の実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω6脂肪酸であり、つまり、脂肪酸
のメチル端部から6番目の炭素‐炭素結合において、不飽和化(炭素‐炭素二重結合)を
有する。さらなる実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸(ARA、20
:4Δ5、8、11、14;ω6)、エイコサテトラエン酸(ETA、20:4Δ8、1
1、14、17、ω3)、エイコサペンタエン酸(EPA、20:5Δ5、8、11、1
4、17;ω3)、ドコサぺンタエン酸(DPA、22:5Δ7、10、13、16、1
9、ω3)、またはドコサヘキサエン酸(DHA,22:6Δ4、7、10、13、16
、19、ω3)からなる群から選択される。また、LC‐PUFAは、ジホモ‐γ‐リノ
ール酸(DGLA)またはエイコサトリエン酸(ETrA、20:3Δ11、14、17
、ω3)であることとしてもよい。本発明により産生されるLC‐PUFAは、上記のあ
らゆるまたは全ての混合物であることとしてもよく、他のLC‐PUFAまたはこれらの
LC‐PUFAのあらゆる誘導体を含むこととしてもよいことは、容易に明らかになるで
あろう。好ましい実施形態では、ω3脂肪酸は、少なくともDHA、好ましくは、DPA
およびDHA、またはEPA、DPA、およびDHAである。
い長鎖多価不飽和脂肪酸」は、遊離状態(非エステル化)における、または、トリグリセ
リド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル‐CoA結合、もしくは他の
結合形態の一部のようなエステル化形態におけるである脂肪酸を指す。脂肪酸は、ホスフ
ァチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリ
セロール形態のような、リン脂質としてエステル化されることとしてもよい。よって、L
C‐PUFAは、細胞の脂質、または細胞、組織、または生物から抽出された脂質もしく
は精製されたオイルにおける混合物の形態で存在することとしてもよい。好ましい実施形
態においては、本発明は、少なくとも75%または少なくとも85%のトリアシルグリセ
ロールを含み、LC‐PUFAを含む少なくとも前記のトリアシルグリセロールを有する
、言及したもののような他の形態の脂質として残りが存在する、オイルを提供する。後に
、オイルは、さらに精製され、または、例えば、遊離脂肪酸を放出するために強塩基での
加水分解により、もしくは蒸留等により処理されることとしてもよい。
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え(recombinanat)細胞、植物部分、または種子におけるエステル
化および非エステル化ω6脂肪酸の全ての合計を指す。これらのω6脂肪酸は、(もし存
在する場合には)LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、およびω6‐DPAを含み
、あらゆるω3脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子における、LAを除く、エステル化
および非エステル化ω6脂肪酸の全ての合計を指す。これらの新ω6脂肪酸は、細胞内に
導入される遺伝子コンストラクト(外因性ポリヌクレオチド)の発現による本発明の細胞
、植物、植物部分、および種子で産生される脂肪酸であり、(もし存在する場合には)G
LA、DGLA、ARA、EDAおよびω6‐DPAを含むが、LAおよびあらゆるω3
脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。例示的な総ω6脂肪酸含有量および新ω6脂
肪酸含有量は、実施例1に記載されるように、FAMEへのサンプルにおける脂肪酸の転
換およびGCによる分析により測定される。
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子におけるエステル化および非エステ
ル化ω3脂肪酸の全ての合計を指す。これらのω3脂肪酸は、(もし存在する場合には)
ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA、およびDHAを含み、あらゆるω
6脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。
の内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質
、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子における、ALAを除く、エステル
化および非エステル化ω3脂肪酸の全ての合計を指す。これらの新ω3脂肪酸は、細胞内
に導入される遺伝子コンストラクト(外因性ポリヌクレオチド)の発現による本発明の細
胞、植物、植物部分、および種子で産生される脂肪酸であり、(もし存在する場合には)
SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA、およびDHAを含むが、ALAおよびあら
ゆるω6脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。例示的な総ω3脂肪酸含有量および
新ω3脂肪酸含有量は、実施例1に記載されるように、FAMEへのサンプルにおける脂
肪酸の転換およびGCによる分析により測定される。
ゼタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子は、あらゆる当該技術分野で知られるも
の、または相同体、またはこれらの誘導体である。このような遺伝子およびコードされる
タンパク質サイズの例は、表1に挙げられる。LC‐PUFA生合成に関与することが示
されたデサチュラーゼ酵素は全て、いわゆる「フロントエンド」のデサチュラーゼの群に
属する。
に保存されたヒスチジンボックスを含む、典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインに沿っ
て、N末端シトクロムb5ドメインの存在により構造的に特徴づけられる、脂質のアシル
鎖の既存の不飽和部分とカルボキシル基との間の二重結合を導入するクラスの酵素のメン
バーを指す(Napier et al., 1997)。
えば、酵母細胞、植物細胞のような細胞における、または好ましくは体性の胚もしくはト
ランスジェニック植物における酵素をコードする遺伝子を発現することにより、および細
胞、胚、もしくは植物が、酵素が発現されない比較可能な細胞、胚、もしくは植物と比較
してLC‐PUFAを産生する性能を増加させたかどうかを測定することにより試験され
ることとしてもよい。
および/またはエロンガーゼは、微細藻類から精製され得、つまり、微細藻類から精製さ
れ得るポリペプチドと同じアミノ酸配列である。
がないことが、特定の酵素が具体的に定義される以外の活性を有しないことを暗示する必
要はない。
本明細書で使用される場合、用語「デサチュラーゼ」は、例えば、アシル‐CoAエス
テルのような、典型的にはエステル化形態におけるものである、脂肪酸基質のアシル基内
に炭素‐炭素二重結合を導入することが可能な酵素を指す。アシル基は、ホスファチジル
コリン(PC)のようなリン脂質に対して、またはアシル担体タンパク質(ACP)に対
して、または、好ましい実施形態ではCoAに対して、エステル化されることとしてもよ
い。よって、デサチュラーゼは、概して、3つのグループにカテゴライズされることとし
てもよい。一実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである
。
末端から4番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。「Δ4‐デサチュラーゼ」は、DPAをDHAに転換すること
が少なくとも可能である。DPAからDHAを産生するための不飽和化工程は、哺乳類以
外の生物におけるΔ4‐デサチュラーゼにより触媒され、この酵素をコードする遺伝子は
、淡水性の原生生物種ユーグレナグラシリスおよび海洋種スラウストキトリウム(Thraus
tochytrium)種から単離された(Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003)。一実施形態に
おいて、Δ4‐デサチュラーゼは、配列番号41に規定される配列を有するアミノ酸、も
しくはスラウストキトリウム種Δ4‐デサチュラーゼ、その生物学的に活性な断片、また
は配列番号41と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
末端から5番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。Δ5‐デサチュラーゼの例は、Ruiz-Lopez et al. (2012)およ
びPetrie et al. (2010a)および本明細書の表1に挙げられる。一実施形態において、Δ
5‐デサチュラーゼは、配列番号30に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的
に活性な断片、または配列番号30と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Δ5‐デサチュラーゼは、配列番号32に規定される配列を有するア
ミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号32と少なくとも53%同一である
アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ5‐デサチュラーゼは、スラウストキトリウ
ム種またはエミリアニアハクスレイ由来である。
末端から6番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。Δ6‐デサチュラーゼの例は、Ruiz-Lopez et al. (2012)およ
びPetrie et al. (2010a)および本明細書の表1に挙げられる。好ましいΔ6‐デサチュ
ラーゼは、ミクロモナス・プシラ、ピティウムイレギュラレ、またはオストレオコッカス
タウリ由来である。
の、および好ましくは植物細胞において、以下の事項:i)脂肪酸基質としてのリノール
酸(LA、18:2Δ9、12、ω6)よりも高いα‐リノレン酸(ALA、18:3Δ
9、12、15、ω3)でのΔ6‐デサチュラーゼ活性;ii)脂肪酸基質としてのPC
のSn‐2位置に結合するALAよりも高い脂肪酸基質としてのALA‐CoAでのΔ6
‐デサチュラーゼ活性;およびiii)ETrAでのΔ8‐デサチュラーゼ活性、を有す
ることによりさらに特徴づけられる。このようなΔ6‐デサチュラーゼの例は、表2に提
供される。
活性を有し、植物細胞のような遺伝子組換え細胞における外因性ポリヌクレオチドから発
現される場合には、少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、最も好ましく
は少なくとも50%、または、酵母細胞で発現される場合には、少なくとも35%、の効
率で、オクタデカテトラエン酸(ステアリドン酸、SDA、18:4Δ6、9、12、1
5、ω3)を産生するために、ALAで活性を有する。一実施形態において、Δ6‐デサ
チュラーゼは、より高い活性、例えば、脂肪酸基質としてのALAでLAよりも少なくと
も約2倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、Δ6‐デサチュラ
ーゼは、より高い活性、例えば、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、脂肪酸基質とし
てのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、少なくとも5倍のΔ6‐デサチュラー
ゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有する。さらなる実施形態では、Δ6‐デサチ
ュラーゼは、脂肪酸基質ALA‐CoAおよびPCのSn‐2位置に結合するALAの両
方で活性を有する。
ーゼ活性を有しない。別の実施形態では、Δ6‐デサチュラーゼは、配列番号16、配列
番号19、もしくは配列番号20で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活
性な断片、または配列番号16、配列番号19、もしくは配列番号20と少なくとも77
%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ6‐デサチュラーゼは、配列番
号19もしくは配列番号20で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な
断片、または配列番号19もしくは配列番号20の1つもしくは両方と少なくとも67%
同一であるアミノ酸配列を含む。また、Δ6‐デサチュラーゼは、Δ8‐デサチュラーゼ
活性を有することとしてもよい。
末端から8番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応
を行うタンパク質を指す。Δ8‐デサチュラーゼは、ETrAをETAに転換することが
少なくとも可能である。Δ8‐デサチュラーゼの例は、表1に挙げられる。一実施形態に
おいて、Δ8‐デサチュラーゼは、配列番号52に規定される配列を有するアミノ酸、そ
の生物学的に活性な断片、または配列番号52と少なくとも80%同一であるアミノ酸配
列を含む。
ら3番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行う
タンパク質を指す。よって、ω3‐デサチュラーゼは、LAをALAにおよびGLAをS
DAに(全てC18脂肪酸)、またはDGLAをETAにおよび/もしくはARAをEP
Aに(C20脂肪酸)転換することとしてもよい。いくつかのω3‐デサチュラーゼ(グ
ループI)は、植物およびラン藻のω3‐デサチュラーゼのような、C18基質でのみ活
性を有する。このようなω3‐デサチュラーゼは、Δ15‐デサチュラーゼでもある。他
のω3‐デサチュラーゼは、C20基質で活性を有し、C18基質で活性を有さず(グル
ープII)またはいくつかの活性を有する(グループIII)。このようなω3‐デサチ
ュラーゼは、Δ17‐デサチュラーゼでもある。好ましいω3‐デサチュラーゼは、ピキ
ア・パストリスω3‐デサチュラーゼ(配列番号12)のような、LAをALAに、GL
AをSDAに、DGLAをETAに、およびARAをEPAに転換するグループIIIタ
イプである。ω3‐デサチュラーゼの例は、Pereira et al. (2004a)(魚類の内臓真菌症
菌(Saprolegnia diclina)ω3‐デサチュラーゼ、グループII)、Horiguchi et al.
(1998)、Berberich et al. (1998)、およびSpychalla et al. (1997)(線虫ω3‐デサチ
ュラーゼ、グループIII)により記載されるものを含む。好ましい実施形態では、ω3
‐デサチュラーゼは、真菌のω3‐デサチュラーゼである。本明細書で使用される場合、
「真菌のω3‐デサチュラーゼ」は、卵菌ソースを含む真菌ソース由来、またはアミノ酸
配列がこれらに対して少なくとも95%同一であるこれらの変異体である、ω3‐デサチ
ュラーゼを指す。多数のω3‐デサチュラーゼをコードする遺伝子は、例えば、フィトフ
トラインフェスタンス(受入番号CAJ30870、国際公開第2005083053号
;配列番号70)、魚類の内臓真菌症菌(受入番号AAR20444,Pereira et al.,
2004a &米国特許第7211656号)、ピティウムイレギュラレ(国際公開第2008
022963号,グループII;配列番号72)、モルティエレラアルピナ(Sakuradani
et al., 2005;受入番号BAD91495;国際公開第2006019192号)、タ
ラッシオシラシュードナナ(Armbrust et al., 2004;受入番号XP_002291057
;国際公開第2005012316号、配列番号71)、ラカンセア・クルイベリ(サッ
カロマイセスクルイベリ(Saccharomyces kluyveri)としても知られる;Oura et al., 2
004;受入番号AB118663)由来の真菌ソースから単離された。Xue et al. (2012)
は、C20基質について好ましい、ω6脂肪酸基質を対応するω3脂肪酸に効率的に転換
することができた、つまり、それらはΔ15‐デサチュラーゼ活性よりも強いΔ17‐デ
サチュラーゼ活性を有した、卵菌ピティウムアファニデルマツム(Pythium aphanidermat
um)、フィトフトラソジャエ(Phytophthora sojae)、およびフィトフトララモラム(Ph
ytophthora ramorum)由来のω3‐デサチュラーゼを記載する。これらの酵素は、Δ12
‐デサチュラーゼ活性を欠くが、基質としてのアシル‐CoAおよびリン脂質フラクショ
ンの両方における脂肪酸を使用することができた。
ガタエラパストリス(Komagataella pastoris)としても知られる)ω3‐デサチュラー
ゼ/Δ15‐デサチュラーゼ(Zhang et al., 2008;受入番号EF116884;配列番
号12)、またはこれらと少なくとも95%同一であるポリペプチドである。
をETAに、GLAをSDAに、のうち1つを、ARAをEPAにおよびDGLAをET
Aに、の両方を、ARAをEPAにおよびGLAをSDAに、の両方を、またはこれら3
つの全てを転換することができる。
、好ましくはARAを有する、C20脂肪酸で、Δ17‐デサチュラーゼ活性を有する。
別の実施形態では、ω3‐デサチュラーゼは、3つの炭素‐炭素二重結合、好ましくはG
LAを有するC18脂肪酸で、Δ15‐デサチュラーゼ活性を有する。好ましくは、両方
の活性が存在する。
ル末端から12番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ
反応を行うタンパク質を指す。Δ12‐デサチュラーゼは、典型的には、オレオイル-ホ
スファチジルコリンまたはオレオイル‐CoAのいずれかを、リノレオイル−ホスファチ
ジルコリン(18:1‐PC)またはリノレオイル‐CoA(18:l‐CoA)にそれ
ぞれ転換する。基質に結合されたPCを用いるサブクラスは、リン脂質依存性のΔ12‐
デサチュラーゼを、後者のサブクラス(sublclass)はアシル−CoA依存性のΔ12‐
デサチュラーゼを指す。植物および真菌Δ12‐デサチュラーゼは、概して前者のサブク
ラスであるのに対して、動物のΔ12‐デサチュラーゼ、例えば、Zhou et al. (2008)に
よる昆虫からクローン化された遺伝子によりコードされるΔ12‐デサチュラーゼは後者
のサブクラスである。多くの他のΔ12‐デサチュラーゼ配列は、配列のデータベースを
サーチすることにより容易に同定され得る。
ル末端から15番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ
反応を行うタンパク質を指す。Δ15‐デサチュラーゼをコードする多数の遺伝子は、植
物および真菌の種からクローン化された。例えば、米国特許第5952544号は、植物
Δ15‐デサチュラーゼ(FAD3)をコードする核酸を記載する。これらの酵素は、植
物Δ15‐デサチュラーゼの特性であったアミノ酸モチーフを含む。国際公開第2001
14538号は、ダイズFAD3をコードする遺伝子を記載する。多くの他のΔ15‐デ
サチュラーゼ配列は、配列データベースをサーチすることにより、容易に同定され得る。
ル末端から17番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ
反応を行うタンパク質を指す。Δ17‐デサチュラーゼは、もしそれがω3結合で不飽和
化を導入するためにC20基質で作用する場合には、ω3‐デサチュラーゼであるとも考
えられる。
ゼは、真菌Δ12‐デサチュラーゼまたは真菌Δ15‐デサチュラーゼである。本明細書
で使用される場合、「真菌Δ12‐デサチュラーゼ」または「真菌のΔ15‐デサチュラ
ーゼ」は、卵菌ソースを含む真菌ソース、または、アミノ酸配列がこれらに対して少なく
とも95%同一である、これらの変異体由来である、Δ12‐デサチュラーゼまたはΔ1
5‐デサチュラーゼを指す。多数のデサチュラーゼをコードする遺伝子は、真菌のソース
から単離された。米国特許第7211656号は、魚類の内臓真菌症菌由来のΔ12デサ
チュラーゼを記載する。国際公開第2009016202号は、Helobdella robusta、オ
オキツネタケ(Laccaria bicolor)、ナスビカサガイ(Lottia gigantea)、ミクロコレ
スクソノプラステス(Microcoleus chthonoplastes)、モノシガブレビコリス(Monosiga
brevicollis)、マイコスファエレラフィジエンシス(Mycosphaerella fijiensis)、コ
ムギ葉枯病菌(Mycospaerella graminicola)、Naegleria gruben、ネクトリアヘマトコ
ッカ(Nectria haematococca)、ネマトステラベクテンシス(Nematostella vectensis)
、フィコマイセスブレイクスリーアヌス(Phycomyces blakesleeanus)、トリコデルマレ
シイ(Trichoderma resii)、ヒメツリガネゴケ、ポスティアプラセンタ(Postia placen
ta)、イヌカタヒバ(Selaginella moellendorffii)、およびミクロドキウムニバレ(Mi
crodochium nivale)由来の真菌のデサチュラーゼを記載する。国際公開第2005/0
12316号は、タラッシオシラシュードナナおよび他の真菌類由来のΔ12‐デサチュ
ラーゼを記載する。国際公開第2003/099216号は、アカパンカビ、アスペルギ
ルスニデュランス、灰色かび病菌およびモルティエレラアルピナから単離された真菌のΔ
12‐デサチュラーゼおよびΔ15‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を記載する。国
際公開第2007133425号は、サッカロマイセスクルイベリ、モルティエレラアル
ピナ、アスペルギルスニデュランス、アカパンカビ、フザリウムグラミニアラム(Fusari
um graminearum)、フザリウムモニリフォルメ(Fusarium moniliforme)、およびマグネ
ポルテグリセア(Magnaporthe grisea)から単離される真菌のΔ15デサチュラーゼを記
載する。好ましいΔ12デサチュラーゼは、フィトフトラソジャエ由来である(Ruiz-Lop
ez et al., 2012)。
スが、二機能性の真菌のΔ12/Δ15‐デサチュラーゼである。これらをコードする遺
伝子は、フザリウムモリノフォルメ(Fusarium monoliforme)(受入番号DQ27251
6、Damude et al., 2006)、アカントアメーバカステラーニ(Acanthamoeba castellanii
)(受入番号EF017656、Sayanova et al., 2006)、パーキンサスマリヌス(Perki
nsus marinus)(国際公開第2007042510号)、麦角病菌(Claviceps purpurea)
(受入番号EF536898、Meesapyodsuk et al., 2007)、およびネナガヒトヨタケ(C
oprinus cinereus)(受入番号AF269266、Zhang et al., 2007)からクローン化さ
れた。
‐PC基質と少なくとも同じ活性、好ましくはより高い活性を有する。本明細書で使用さ
れる場合、「対応するアシル‐PC基質」は、脂肪酸がアシル‐CoA基質におけるもの
と同じ脂肪酸である、ホスファチジルコリン(PC)のsn‐2位置でエステル化された
脂肪酸を指す。例えば、アシル‐CoA基質はARA‐CoAであることとしてもよく、
対応するアシル‐PC基質はsn‐2ARA−PCであることとしてもよい。一実施形態
では、活性は少なくとも2倍以上高い。好ましくは、ω3‐デサチュラーゼは、アシル‐
CoA基質とその対応するアシル‐PC基質の両方で少なくとも同じ活性を有し、C18
およびC20基質の両方で活性を有する。このようなω3‐デサチュラーゼの例は、上記
に挙げられたクローン化された真菌デサチュラーゼ間で知られる。
するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも60%同じ
である、好ましくは少なくとも90%、もしくは少なくとも95%配列番号12と同じで
あるアミノ酸配列を含む。
ル‐CoA基質で、対応するアシル‐PC基質よりも高い活性を有する。別の実施形態で
は、本発明における使用のためのデサチュラーゼは、アシル‐PC基質で、対応するアシ
ル‐CoA基質よりも高い活性を有するが、両方の基質でいくつかの活性を有する。上記
に概説したように、「対応するアシル‐PC基質」は、脂肪酸がアシル‐CoA基質にお
けるものと同じ脂肪酸である、ホスファチジルコリン(PC)のsn‐2位置でエステル
化された脂肪酸を指す。一実施形態では、より高い活性は少なくとも2倍以上高い。一実
施形態では、デサチュラーゼは、Δ5もしくはΔ6‐デサチュラーゼ、またはω3‐デサ
チュラーゼであって、その例が提供されるが、表2に挙げられたものに限定されない。ど
の基質でデサチュラーゼが作用するのかを、すわなち、アシル‐CoAまたはアシル‐P
C基質で、試験するために、分析が、Domergue et al. (2003)および(2005)に記載される
ように、酵母細胞で行われ得る。また、デサチュラーゼについてのアシル‐CoA基質性
能が、エロンガーゼの場合に推論され得、デサチュラーゼ(desturase)とともに発現さ
れる場合、エロンガーゼがデサチュラーゼの産生物の伸長を触媒する、少なくとも約90
%の植物細胞における酵素的な転換効率を有する。これに基づき、GA7コンストラクト
(実施例2および3)およびその変異体(実施例5)から発現されるΔ5‐デサチュラー
ゼおよびΔ4‐デサチュラーゼが、それらの個々のアシル‐CoA基質、ETA‐CoA
、およびDPA‐CoAを不飽和化することを可能にする。
生化学的証拠が、脂肪酸伸長が4つの工程:濃縮、還元、脱水、および第2の還元から
なることを示唆する。本発明の内容において、「エロンガーゼ」は、適切な生理的条件下
で、伸長複合体の他のメンバーの存在下で凝縮工程を触媒するポリペプチドを指す。伸長
タンパク質複合体の凝縮成分(「エロンガーゼ」)のみの細胞における異種性または相同
性発現が、個々のアシル鎖の伸長のために必要とされることが示された。よって、導入さ
れたエロンガーゼが、成功的なアシル伸長を行うためのトランスジェニック宿主からの還
元および脱水作業を成功的に採用することができる。鎖の長さに対する鎖延長反応の特異
性または脂肪酸基質の不飽和化の程度が、凝縮成分に存在することが考えられる。また、
この成分は、鎖延長反応において律速であることが考えられる。
とが少なくとも可能である。Δ5‐エロンガーゼの例は、国際公開第2005/1032
53号に開示されるものを含む。一実施形態において、Δ5‐エロンガーゼは、少なくと
も60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、または
最も好ましくは80%もしくは90%の効率でDPAを産生するために、EPAで活性を
有する。さらなる実施形態では、Δ5‐エロンガーゼは、配列番号37に規定されるアミ
ノ酸配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号37と少なくとも47%同一であ
るアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ6‐エロンガーゼは、オストレオコッ
カスタウリまたはオストレオコッカスルシマリヌス由来である(米国出願公開第2010
/088776号)。
転換することができる。Δ6‐エロンガーゼの例は、表1に挙げられるものを含む。一実
施形態において、エロンガーゼは、配列番号25に規定される配列を有するアミノ酸、そ
の生物学的に活性な断片(例えば、配列番号26に規定されるフラグメント)、または配
列番号25もしくは配列番号26の1つもしくは両方と少なくとも55%同一であるアミ
ノ酸配列を含む。一実施形態では、Δ6‐エロンガーゼは、ヒメツリガネゴケ(Zank et
al., 2002;受入番号AF428243)またはタラシオシラシュードナナ(Tlialassiosi
ra pseudonana)(Ruiz-Lopez et al., 2012)由来である。
も転換することができる。Δ9‐エロンガーゼの例は、表1にあげられるものを含む。一
実施形態において、Δ9‐エロンガーゼは、配列番号43に規定される配列を有するアミ
ノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号43と少なくとも80%同一であるア
ミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ9‐エロンガーゼは、配列番号46に規定され
る配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号46と少なくとも
81%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ9‐エロンガーゼは、配列
番号48に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番
号48と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ9‐エ
ロンガーゼは、配列番号50に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な
断片、または配列番号50と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる
実施形態では、Δ9‐エロンガーゼは、ω6基質で対応するω3基質よりも高い活性を有
し、またはその逆である。
る」は、ω3デサチュラーゼの作用により異なる基質での酵素の相対的な活性を指す。好
ましくは、ω6基質はLAであり、ω3基質はALAである。
DAをETAに転換すること、および(ii)ALAをETrAに変換することが少なく
とも可能であり、Δ9‐エロンガーゼ活性よりも高いΔ6‐エロンガーゼ活性を有する。
一実施形態において、エロンガーゼは、ETAを産生するために、SDAで、少なくとも
50%、より好ましくは少なくとも60%の転換の効率、および/またはETrAを産生
するために、ALAで、少なくとも6%もしくはより好ましくは少なくとも9%の転換の
効率を有する。別の実施形態では、エロンガーゼは、Δ9‐エロンガーゼ活性よりも少な
くとも約6.5倍高いΔ6‐エロンガーゼ活性を有する。さらなる実施形態では、エロン
ガーゼは、検出可能なΔ5‐エロンガーゼ活性を有していない。
本明細書で使用される場合、用語「1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェートアシ
ルトランスフェラーゼ」(LPAAT)は、リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェ
ラーゼまたはアシルCoA‐リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェラーゼともよば
れ、ホスファチド酸(PA)を形成するためにsn‐2位置でsn‐l‐アシル‐グリセ
ロール‐3‐ホスフェート(sn‐1 G‐3‐P)をアシル化するタンパク質を指す。
よって、用語「1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ
活性」は、PA(EC 2.3.1.51)を産生するための、sn‐2位置での(sn
‐1 G‐3‐P)のアシル化を指す。好ましいLPAATは、LPAのsn‐2位置に
多価不飽和C22アシル基を転移するために、基質として多価不飽和C22アシル‐Co
Aを使用し得るものであり、PAを形成する。このようなLPAATは、実施例13に例
示され、そこに記載されるように試験され得る。一実施形態では、本発明のために有用な
LPAATは、配列番号63から69のいずれか1つに規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または1もしくはそれ以上の配列番号63から69のいず
れか1つと少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本
発明について有用なLPAATは、配列番号64、65、および67のいずれか1つに規
定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または1もしくはそれ以上
の配列番号64、65、および67のいずれか1つと少なくとも40%同一であるアミノ
酸配列を含む。
(EC2.3.1.20;DGAT)は、トリアシルグリセロールを産生するために、ア
シル‐CoAからジアシルグリセロール基質へと脂肪族アシル基を転移するタンパク質を
指す。よって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」は、トリアシル
グリセロールを産生するための、ジアシルグリセロールへのアシル‐CoAの転移を指す
。DGAT1、DGAT2、およびDGAT3として言及される3つの既知のタイプのD
GATがある。DGAT1ポリペプチドは、典型的には、10の膜貫通ドメインを有し、
DGAT2は、典型的には、2の膜貫通ドメインを有し、一方、DGAT3は、典型的に
は可溶性である。DGAT1ポリペプチドの例は、アスペルギルスフミガーツス(受入番
号XP_755172)、シロイヌナズナ(CAB44774)、トウゴマ(AAR11
479)、オオアブラギリ(ABC94472)、ベルノニアガラメンシス(ABV21
945、ABV21946)、ニシキギ(AAV31083)、カエノラブディティスエ
レガンス(Caenorhabditis elegans)(AAF82410)、ドブネズミ(Rattus norve
gicus)(NP_445889)、ホモサピエンス(NP_036211)由来のDGA
T1遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および/または突然変異
体を含む。DGAT2ポリペプチドの例は、シロイヌナズナ (受入番号NP_5669
52)、トウゴマ(AAY16324)、オオアブラギリ(ABC94474)、モルテ
ィエレララマニアナ(AAK84179)、ホモサピエンス(Q96PD7、Q58HT
5)、ウシ(Bos taurus)(Q70VD8)、ハツカネズミ(Mus musculus)(AA84
175)、ミクロモナスCCMP1545由来のDGAT2遺伝子によりコードされるポ
リペプチド、並びにその変異体および/または突然変異体を含む。DGAT3ポリペプチ
ドの例は、ピーナッツ(peanut)(ピーナッツ(Arachis hypogaea), Saha, et al., 200
6)由来のDGAT3遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および/
または突然変異体を含む。
ポリペプチドの内容における用語「遺伝子組換え」は、それが天然に産生される場合の
その自然の状態と比較して、変化した量または変化した率で、細胞によりまたは細胞フリ
ーの発現システムにより産生される場合のポリペプチドを指す。一実施形態において、細
胞は、ポリペプチドを天然で産生しない細胞である。しかしながら、細胞は、産生される
ポリペプチドの変化した量を生じさせる非内因性遺伝子含む細胞であることとしてもよい
。本発明の遺伝子組換えポリペプチドは、それが産生される、細胞、組織、器官、もしく
は生物、または細胞フリー発現システムにおけるポリペプチド、つまり、それが産生され
たトランスジェニック(遺伝子組換え)細胞の他の成分から分離または精製されていない
ポリペプチド、および、その後、少なくともいくつかの他の成分から精製されるこのよう
な細胞または細胞フリーのシステムにおいて産生されるポリペプチドを含む。
酸配列の同一性の程度(%同一性)により、または1つの基準のアミノ酸配列に対して、
別に対するよりもより高い%同一性を有することにより、定義されることとしてもよい。
基準のアミノ酸配列に対するポリペプチドの%同一性は、典型的には、ギャップクリエー
ションペナルティ(gap creation penalty)=5、および、ギャップエクステンションペ
ナルティ(gap extension penalty)=0.3のパラメーターによってGAP分析(Needl
eman and Wunsch, 1970;GCGプログラム)により測定される。問い合わせ配列は、少
なくとも15アミノ酸の長さであり、GAP分析は、少なくとも15アミノ酸の領域にわ
たる2つの配列に照準を合わせる。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも50
アミノ酸の長さであり、GAP分析は、少なくとも50アミノ酸の領域にわたる2つの配
列に照準を合わせる。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも100アミノ酸の
長さであり、GAP分析は、少なくとも100アミノ酸の領域にわたる2つの配列に照準
を合わせる。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも250アミノ酸の長
さであり、GAP分析は、少なくとも250アミノ酸の領域にわたる2つの配列に照準を
合わせる。さらにより好ましくは、GAP分析は、それらの全体の長さにわたる2つの配
列に照準を合わせる。ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、基準ポリペプチドと
同じ酵素活性もしくは異なる活性を有し、またはその活性を欠くこととしてもよい。好ま
しくは、ポリペプチドが、基準ポリペプチドの活性の少なくとも10%、少なくとも50
%、少なくとも75%、または少なくとも90%の酵素的な活性を有する。
よび/またはエロンガーゼ活性、または他の酵素活性を有するような、全長基準ポリペプ
チドの定義された活性を維持する、本明細書に定義されるポリペプチドの一部である。本
明細書で使用される生物学的に活性な断片は、全長ポリペプチドを除外する。生物学的に
活性な断片は、それらが定義された活性を維持する限り、あらゆるサイズ部分であり得る
。好ましくは、生物学的に活性な断片は、全長タンパク質の少なくとも10%、少なくと
も50%、少なくとも75%、または少なくとも90%の活性を維持する。
%同一性の形態が、好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。よって、適
用できる場合、最小の%同一性の形態に照らして、ポリペプチド/酵素は、関連して挙げ
られる配列番号と、少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましく
は少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも76
%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましく
は少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92
%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましく
は少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97
%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましく
は少なくとも99.1%、より好ましくは少なくとも99.2%、より好ましくは少なく
とも99.3%、より好ましくは少なくとも99.4%、より好ましくは少なくとも99
.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、より好ましくは少なくとも99.7%、
より好ましくは少なくとも99.8%、およびさらにより好ましくは少なくとも99.9
%同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
定義される核酸に適切なヌクレオチドの変更を導入することにより、または所望のポリペ
プチドのインビトロ合成により調製され得る。このような変異体/突然変異体は、例えば
、アミノ酸内に、残基の欠失、挿入、または置換を含む。欠失、挿入、および置換の組み
合わせは、最終的なペプチド産生物が所望の酵素活性を有することを提供する、最終的な
コンストラクトに達するために作成され得る。
ば、本明細書に定義されるポリヌクレオチドは、Harayama (1998)により広く記載される
ように、インビトロで突然変異誘発またはDNAシャッフリング技術に供され得る。突然
変異/変更DNA由来の産生物は、例えば、それらがデサチュラーゼまたはエロンガーゼ
活性を有する場合に、測定を行うための、本明細書に記載される技術を用いて容易にスク
リーニングされ得る。
が、変更される特徴(複数を含む)に依存するであろう。突然変異の場所は、例えば、(
1)まず保守的なアミノ酸の選択により、その後の達成された結果による革新的な選択に
より置換し、(2)標的残基を欠失させ、または(3)位置される場所に隣り合う他の残
基を挿入することにより、個々にまたは連続して変更され得る。
および典型的には約1から5の連続する残基を欠失する。
基およびその場所に挿入される異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も高い関心の
場所は、天然に生じるデサチュラーゼまたはエロンガーゼの中で保存されない場所を含む
。これらの場所は、好ましくは、酵素活性を維持するために、比較的保守的な態様で置換
される。このような保守的な置換は、「例示的な置換」の項目のもとに、表3で示される
。
ドと比較される場合に、唯一、または、1もしくは2もしくは3もしくは4以下の保守的
なアミノ酸変更を有する。保守的なアミノ酸の変更の詳細は、表3に提供される。当業者
が認識しているように、このような微小な変更は、遺伝子組換え細胞で発現される場合に
、ポリペプチドの活性を変更しないことが合理的に予測され得る。
伝子組換えポリペプチドの産生および回収を含む、種々の方法で産生され得る。一実施形
態において、遺伝子組換えポリペプチドは、本明細書で定義される宿主細胞のような、ポ
リペプチドを産生するために有効な条件下でポリペプチドの発現を可能にする細胞を培養
することにより産生される。ポリペプチドを産生するためにより好ましい細胞は、植物に
おける細胞、特に、植物における種子である。
また、本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、T‐DNA分子のようなキ
メラ遺伝子構築物、またはキメラDNAであることとしてもよい、ポリヌクレオチドを提
供しおよび/または使用する。本明細書に定義される特定の活性を行うための、ゲノムま
たは合成の起源、二本鎖または一本鎖のDNAまたはRNAであり、炭水化物、脂質、タ
ンパク質、または他の材料との組み合わされることとしてもよい。用語「ポリヌクレオチ
ド」は、本明細書で、用語「核酸分子」と互換的に使用される。「単離ポリヌクレオチド
」で、天然のソースから得られる場合に、その天然状態で関連しもしくは結合されるポリ
ヌクレオチド配列、または非天然で生じるポリヌクレオチドで、ポリヌクレオチド配列か
ら分離された、ポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、天
然に関連する、他の成分から、少なくとも60%フリー、より好ましくは少なくとも75
%フリー、およびより好ましくは少なくとも90%フリーである。
クレオチドの例は、(本明細書に記載される方法を用いることによるような)突然変異さ
れたもの、およびタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、(本明細書
に記載されるコンストラクトにおけるような)天然に関連していないプロモーターに操作
可能に結合されるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
、転写領域および翻訳される場合にはタンパク質コード領域を含み、遺伝子の発現を伴う
、両端に少なくとも約2kbの距離でコード領域と5’および3’の端部の両方で隣り合
って配置される配列を含むデオキシリボヌクレオチド配列を含む。この点については、遺
伝子は、遺伝子が「キメラ遺伝子」を指す場合における、異種性の制御シグナル、または
所与の遺伝子と天然に関連する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーション、およ
び/またはポリアデニル化シグナルのような制御シグナルを含む。タンパク質コード領域
の5’に配置され、およびmRNAに存在する配列は、5’の非翻訳配列を指す。タンパ
ク質コード領域の下流または3’に配置され、およびmRNAに存在する配列は、3’の
非翻訳配列を指す。用語「遺伝子」は、cDNAおよび遺伝子のゲノムの形態の両方を包
含する。ゲノムの形態または遺伝子のクローンは、「イントロン」、または「介在領域」
、または「介在配列」とよばれる非コード配列により中断されるコード領域を含む。イン
トロンは、核のRNA(hnRNA)内に転写される遺伝子のセグメントである。イント
ロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含むこととしてもよい。イントロンは、
核または転写一次産物から取り除かれまたは「切り出され」、よって、イントロンはメッ
センジャーRNA(mRNA)転写物に存在しない。mRNAは、新生のポリペプチドに
おける配列またはアミノ酸の順序を特定するための翻訳中に機能する。用語「遺伝子」は
、本明細書に記載される本発明のタンパク質の全部または一部および上記のいずれか1つ
に対する相補的なヌクレオチド配列をコードする、合成または融合分子を含む。
ラクト)」は、その天然の位置において天然のDNA分子ではないあらゆるDNA分子を
指し、また、本明細書で「DNAコンストラクト」を指す。典型的には、キメラDNAま
たはキメラ遺伝子は、調節および転写され、または天然でともに操作可能に結合されたこ
とがみられない、つまり、互いに対して異種性である、タンパク質コード配列を含む。よ
って、キメラDNAまたはキメラ遺伝子は、異なるソース由来である調節配列およびコー
ド配列、または同じソース由来である調節配列およびコード配列を含むが、天然でみられ
るものと異なる態様で配列されることとしてもよい。
常存在しまたは産生される物質を指すために、本明細書で使用される。「内因性遺伝子」
は、生物のゲノムにおけるその天然の場所での天然の遺伝子を指す。本明細書で使用され
る場合、「遺伝子組換え核酸分子」、「遺伝子組換えポリヌクレオチド」、またはこれら
のバリエーションは、遺伝子組換えDNA技術により構成または変更された核酸分子を指
す。用語「外来性ポリヌクレオチド」または「外因性ポリヌクレオチド」または「異種性
ポリヌクレオチド」等は、実験的操作により、細胞のゲノム内に導入されたあらゆる核酸
を指す。外来性または外因性遺伝子は、非天然生物内に挿入される遺伝子、天然の宿主内
で新しい場所に導入される天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子であることとしてもよい。
「導入遺伝子」は、変換手順により、ゲノム内に導入された遺伝子である。用語「遺伝的
に変更された」、「トランスジェニック」、およびそのバリエーションは、変換または形
質導入により細胞内に遺伝子を導入すること、細胞における遺伝子を突然変異すること、
およびこれらの作用がなされる細胞もしくは生物またはこれらの後代における遺伝子の調
節の変更または調節することを含む。本明細書で使用される「ゲノム領域」は、導入遺伝
子、または導入遺伝子の群(本明細書ではクラスターとしても言及される)が、細胞また
はこれらの子孫内に導入された、ゲノム内の位置を指す。このような領域は、本明細書に
記載される方法によるような、人の干渉により組み込まれたヌクレオチドのみを含む。
た量における、細胞に存在する場合のポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、細
胞は、ポリヌクレオチドを天然で含まない細胞である。しかしながら、細胞は、コードさ
れたポリペプチドの変化した産生の量をもたらす、非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞
であることとしてもよい。本発明の外因性ポリヌクレオチドは、トランスジェニック(遺
伝子組換え)細胞、または存在する場合には、細胞フリーの発現システムの他の成分から
分離されていないポリヌクレオチド、および少なくともいくつかの他の成分からその後精
製されるこのような細胞または細胞フリーの発現システムで産生されるポリヌクレオチド
を含む。外因性ポリヌクレオチド(核酸)は、天然に存在するヌクレオチドの連続的な伸
展であり得、またはシングルポリヌクレオチドを形成するために結合される異なるソース
(天然由来および/または合成)由来の2つまたはそれ以上の連続的なヌクレオチドの伸
展を含む。典型的には、このようなキメラポリヌクレオチドは、関心細胞におけるオープ
ンリーディングフレームの転写を駆動するのに適するプロモーターに操作可能に結合する
、本発明のポリペプチドをコードする少なくともオープンリーディングフレームを含む。
ーションは、各ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、少なくとも1つ、好ましくはそ
れ以上のヌクレオチドにより異なることを意味する。ポリヌクレオチドは、細胞内のタン
パク質へと翻訳されるまたはされないこととしてもよい、RNAをコードする。実施例で
は、各ポリヌクレオチドは、異なる活性でタンパク質をコードすることが好ましい。別の
実施例では、各外因性ポリヌクレオチドは、他の外因性ポリヌクレオチドと95%未満、
90%未満、または80%未満同一である。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、機
能的なタンパク質/酵素をコードする。さらに、異なる外因性ポリヌクレオチドは非重複
であり、各ポリヌクレオチドは、例えば、別の外因性ポリヌクレオチドと重複しない染色
体外の転移核酸の別個の領域であることが好ましい。最小限で、各外因性ポリヌクレオチ
ドは、転写開始および停止部位、並びに、指定されたプロモーターを有する。個々の外因
性ポリヌクレオチドは、イントロンを含むこととしてもよく、または含まないこととして
もよい。
好ましい実施形態に包含されることが理解されるであろう。よって、適用可能である場合
には、最小の同一性%の数値に照らして、ポリヌクレオチドは、関連して挙げられる配列
番号の少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも
70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ま
しくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも
91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ま
しくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも
96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ま
しくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.1%、より好ましくは少なく
とも99.2%、より好ましくは少なくとも99.3%、より好ましくは少なくとも99
.4%、より好ましくは少なくとも99.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、
より好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%、およびさ
らにより好ましくは少なくとも99.9%同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが
好ましい。
対し、厳しい条件下で、選択的にハイブリダイズすることとしてもよい。本明細書で使用
される場合、厳しい条件は、(1)ホルムアミドのような変性剤、例えば、0.1%(w
/v)ウシ血清アルブミン、0.1%フィコール、0.1%ポリビニルピロリドン、75
0mM NaClでpH6.5とした50mMリン酸ナトリウムバッファ、75mMクエ
ン酸ナトリウム入りの50%(v/v)ホルムアミドを42℃でハイブリダイゼーション
中に採用する、または(2)50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、
0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1
%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト液、超音波処理されたサーモンスパムのDNA
(50g/ml)、0.1%SDS、および10%硫酸デキストランを0.2×SSCお
よび0.1%SDSにおいて42℃で採用する、および/または(3)洗浄のための低イ
オン強度および高温、例えば、0.015M NaCl/0.0015Mクエン酸ナトリ
ウム/0.1%SDSを50℃で採用するものである。
基の欠失、挿入または置換である、1またはそれ以上の突然変異を有することとしてもよ
い。基準配列に対して突然変異を有するポリヌクレオチドは、天然起源(すなわち、天然
のソースからの単離)または合成(例えば、上記のような核酸で部位特異的突然変異誘発
またはDNAシャッフリングを行うことによる)のいずれかであり得る。よって、本発明
のポリヌクレオチドは、天然起源または遺伝子組換え由来のいずれかであり得ることは明
らかである。好ましいポリヌクレオチドは、公知技術で知られるような、植物細胞におけ
る翻訳のためにコドン最適化されるコード領域を有するものである。
本発明の一実施形態には、組み換えベクターが含まれ、これは、宿主細胞にポリヌクレ
オチド分子を導入するのが可能ないずれかのベクターに挿入された、本明細書で定義され
る少なくとも1つのポリヌクレオチド分子を含む。組み換えベクターには発現ベクターが
含まれる。組み換えベクターは、異種性ポリヌクレオチド配列、つまり、本明細書で定義
されるポリヌクレオチド分子に、自然には隣接して見つからず、好ましくは、該ポリヌク
レオチド分子(複数可)が由来した種以外の種由来であるヌクレオチド配列を含む。ベク
ターはRNAまたはDNAのいずれかであり得、一般的にプラスミドである。プラスミド
ベクターには通常、1つ以上のT−DNA領域を含む、たとえばpUC由来ベクター、p
SK由来ベクター、pGEM由来ベクター、pSP由来ベクター、pBS由来ベクターま
たは好ましくはバイナリーベクターといった、原核細胞における発現カセットの容易な選
択、増幅および形質転換を提供する追加の核酸配列を含む。追加の核酸配列には、ベクタ
ーの自律複製を提供する複製開始点、好ましくは抗生物質または除草剤耐性をコードする
選択マーカー遺伝子、核酸構築物にコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するための
複数の部位を提供する特有のマルチプルクローニング部位、および、原核および真核(特
に植物)細胞の形質転換を強化する配列が含まれる。組み換えベクターには、本明細書で
定義されるポリヌクレオチドを2つ以上、たとえば、3、4、5または6つの本明細書で
定義されるポリヌクレオチドを組み合わせて含み得、好ましくは、それぞれのポリヌクレ
オチドが、対象細胞で動作可能な発現制御配列に操作可能に結合している本発明のキメラ
遺伝子構築物を含み得る。本明細書で定義される2つ以上のポリヌクレオチド、たとえば
、3、4、5または6つのポリヌクレオチドは、好ましくは単一組み換えベクターと共有
結合し、好ましくは単一T−DNA分子内で共有結合し、これは、次いで、単一分子とし
て細胞に導入され、本発明に従った組み換え細胞を形成し得、好ましくは、たとえばトラ
ンスジェニック植物の組み換え細胞のゲノムに組み込まれ得る。したがって、そのように
結合したポリヌクレオチドは組み換え細胞または植物の子孫内に単一遺伝子座として一緒
に受け継がれる。組み換えベクターまたは植物は、たとえば、各組み換えベクターが3、
4、5または6つのポリヌクレオチドを含む、それぞれが複数のポリヌクレオチドを含む
そのような組み換えベクターを2つ以上含み得る。
片間の機能的な関係性を指す。通常、転写調整要素(プロモーター)の転写された配列に対
する機能的な関係性を指す。たとえば、プロモーターが適切な細胞でコード配列の転写を
刺激または調節する場合、プロモーターは本明細書で定義されるポリヌクレオチドといっ
たコード配列に操作可能に結合している。一般的に、転写配列に操作可能に結合するプロ
モーター転写調節要素は、転写配列に物理的に近接しており、すなわち、これらはシス作
用性である。しかし、エンハンサーといったいくつかの転写調節要素は、それらが強化す
る転写対象であるコード領域に物理的に近接または隣接して位置する必要はない。
てよい。
細書で定義するポリペプチドが、ポリペプチドを生産する細胞から分泌されるのを可能に
するシグナルペプチド配列をコードする、または、たとえば細胞の小胞体(ER)内での
ポリペプチドの保持もしくはプラスチドへの送達といった、発現ポリペプチドの局在化を
提供する、1つ以上の分泌シグナルを含み、ならびに/または(b)融合タンパク質とし
て核酸分子の発現を導く融合配列を含む。適切なシグナル断片の例には、本明細書で定義
されるポリペプチドの分泌または局在化を指示することが可能な、任意のシグナル断片が
含まれる。組み換え分子はまた、本明細書で定義される核酸分子の核酸配列を囲む、およ
び/または、本明細書で定義される核酸分子の核酸配列内に、介在および/または非翻訳
配列を含み得る。
ポリヌクレオチドとして、または、外来性または外因性ポリヌクレオチドに加えて、選択
またはスクリーンマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」は、マーカー遺伝子を発現
する細胞に特有の表現型を分け与え、したがってそのような形質転換細胞がマーカーを有
さない細胞から区別されることを可能にする遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子は、
選択剤(たとえば、除草剤、抗生物質、放射、熱または非形質転換細胞を傷つける他の処
理)に対する耐性に基づいて「選択」できる特色を提供する。スクリーンマーカー遺伝子
(またはレポーター遺伝子)は、観察または試験を通して、すなわち、「スクリーニング
」する(たとえば、非形質転換細胞には存在しないβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラー
ゼ、GFPまたは他の酵素活性)ことで、同定できる特色を提供する。マーカー遺伝子お
よび対象のヌクレオチド配列は結合していなくてもよい。植物細胞といった、選択した細
胞と組み合わせて機能的である(すなわち、選択的である)限り、マーカーの実際の選択
は重要ではない。
またはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性といった抗生物質耐性を与え
るマーカーが挙げられる。植物形質転換体の選択のための例示的選択マーカーには、ハイ
グロマイシンB耐性をコードするhyg遺伝子;カナマイシン、パロモマイシン、G41
8への耐性を与えるネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ(nptII)遺伝子;た
とえば欧州特許第256223号に記載されるような除草剤由来のグルタチオンへの耐性
を与えるラット肝臓のグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子;たとえば国際公開
第87/05327号に記載されるようなホスフィノトリシンといったグルタミンシンテ
ターゼインヒビターへの耐性を過剰発現の際に与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子、た
とえば欧州特許第275957号に記載されるような選択剤ホスフィノトリシンへの耐性
を与えるストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces vir
idochromogenes)由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、たとえばH
inchee et al.(1988)が説明するようなN−ホスホノメチルグリシン
への耐性を与える5−エノールシキメート−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)をコー
ドする遺伝子、たとえば国際公開第91/02071号に記載されるビアラホスに対する
耐性を与えるbar遺伝子;ブロモキシニルへの耐性を与える臭鼻菌由来のbxnといっ
たニトリラーゼ遺伝子(Stalker et al.、1988);メトトレキセーへ
の耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(Thillet et
al.、1988年);イミダゾリノン、スルホニルウレアもしくは他のALS阻害化学
物質への耐性を与える突然変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子(ALS)(欧州特許第1
54,204号);5−メチルトリプトファンへの耐性を与える突然変異したアントラニ
ル酸シンターゼ遺伝子;または除草剤への耐性を与えるダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が
含まれるが、これらに限定されない。
ーゼ(GUS)酵素をコードするuidA遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子(Nied
z et al.、1995)またはその誘導体;生物発光検知を可能にするルシフェラ
ーゼ(luc)遺伝子(Ow et al.、1986)、および、当該技術分野で知ら
れる他のものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「レポーター
分子」は、タンパク質産物への参照によってプロモーターの決定を助長する分析的に同定
可能なシグナルをその化学的性質で提供る分子を意味する。
たがって、核酸は、分子がゲノム、好ましくはT−DNA分子の右および左境界配列に取
り込まれることを可能にする適切な成分を含み得、または、構築物は、細胞の染色体に組
み込まれ得る適切なベクター内に配置される。
本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換する、および、1つ以上の
特定のポリヌクレオチド分子(複数可)の発現をもたらすことが可能なDNAベクターで
ある。本発明の好ましい発現ベクターは、酵母菌および/または植物細胞の遺伝子発現を
指示できる。本発明に有益な発現ベクターには、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始
点といった調整配列および組み換え細胞に適合し、本発明のポリヌクレオチド分子の発現
を制御する他の調整配列が含まれる。特に、本発明に有益なポリヌクレオチドまたはベク
ターには、転写制御配列が含まれる。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制
御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーターおよびエンハンサー配列と
いった、転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の組み換え細
胞の少なくとも1つで機能し得る、いずれかの転写制御配列が含まれる。使用される調整
配列の選択は、植物といった標的有機生物および/または対象の標的器官または組織によ
る。そのような調整配列は、植物または植物ウイルスといった任意の真核生物から得られ
得、または、化学的に合成され得る。そのような様々な転写制御配列が、当業者には公知
である。特に好ましい転写制御配列は、植物またはその部分の使用によって、恒常的、ま
たは発生段階および/もしくは組織特異的のいずれかで植物の転写を指示することにおい
て活性を有するプロモーターである。
が、たとえば、Pouwels et al.、Cloning Vectors:A
Laboratory Manual、1985,supp.1987;Weissba
chおよびWeissbach、Methods for Plant Molecul
ar Biology、アカデミック・プレス社(Academic Press)、1
989;ならびにGelvin et al.、Plant Molecular Bi
ology Manual、クルーヴァー・アカデミック・パブリッシャーズ社(Klu
wer Academic Publishers)、1990で説明されている。通常
、植物発現ベクターには、たとえば、5’および3’調整配列の転写制御下の、1つ以上
のクローニングされた植物遺伝子および優勢な選択マーカーが含まれる。そのような植物
発現ベクターには、プロモーター調整領域(たとえば、誘導性もしくは恒常的、環境的も
しくは発達的に調整される、または、細胞もしくは組織特異的発現を制御する調節領域)
、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシングシグナル、転写終結部位
、および/またはポリアデニル化シグナルも含まれ得る。
常的発現に適切なプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S
プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス(FMV)35S、サトウキビ桿状型ウイ
ルス(sugarcane bacilliform virus)プロモーター、ツユ
クサ黄色斑葉ウイルス(comellina yellow mottle)、リブロー
ス−1,5−ビス−リン酸カブロキシラーゼの小サブユニット由来の光誘導性プロモータ
ー、イネ細胞質トリオースリン酸イソメラーゼ(rice cytosolic tri
osephosphate isomerase)プロモーター、アラビドプシスのアデ
ニンホスホリポシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン1遺伝子プロモータ
ー、マンノピンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ad
hプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、R遺伝子複合プロモーターならび
にクロロフィルα/β結合タンパク質遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定さ
れない。
るプロモーターはこれらの特定の組織で比較的高発現を有することが好ましい。この目的
のために、組織または細胞特異的または強化性発現を伴う遺伝子のための複数のプロモー
ターから選択され得る。文献で報告されているそのようなプロモーターの例には、エンド
ウ由来の葉緑体グルタミンシンテターゼGS2プロモーター、コムギ由来の葉緑体フルク
トース−1,6−ビホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ST−LS
1プロモーター、シロイヌナズナ由来のセリン/トレオニンキナーゼプロモーターおよび
グルコアミラーゼ(CHS)プロモーターが含まれる。リブロース−1,5−ビスリン酸
カブロキシラーゼプロモーターおよびCabプロモーターも、光合成的に活発である組織
で活性を有すると報告されている。
な植物遺伝子プロモーターはまた、植物細胞での遺伝子発現のためにも使用され得、これ
には、(1)熱、(2)光(たとえば、エンドウRbcS−3Aプロモーター、トウモロ
コシRbcSプロモーター);(3)アブシジン酸といったホルモン、(4)傷をつける
こと(たとえば、WunI);または(5)メチルジャスモン酸、サリチル酸、ステロイ
ドホルモン、アルコール、Safeners(国際公開第97/06269号)といった
化学物質によって調製されるプロモーターを含み、また(6)器官特異的プロモーターを
利用するのも有益であり得る。
組織と比較した際、植物の発育中の種子での遺伝子転写を優先的に指示するプロモーター
を指す。ある実施形態では、種子特異的プロモーターは、植物の葉および/または茎と比
べて、植物の発育中の種子で少なくとも5倍強大に発現され、好ましくは、他の植物組織
と比較して発育中の種子の胚でより強大に発現される。好ましくは、プロモーターは発育
中の種子の対象遺伝子の発現を指示するのみであり、および/または、葉といった植物の
他の部分の対象遺伝子の発現はノーザンブロット分析および/またはRT−PCRでは検
知不可能である。通常プロモーターは、種子の成長および発育の間に、特に種子での貯蔵
化合物の合成および蓄積の段階の間に、遺伝子の発現を促進する。そのようなプロモータ
ーは植物貯蔵器官全体または種皮もしくは子葉(複数可)といったその一部分のみで遺伝
子発現を促進し得、好ましくは、胚、双子葉類植物の種子または単子葉類植物の種子の胚
乳もしくはアリューロン層で遺伝子発現を促進し得る。
ガーゼといった、種子での脂肪酸生合成および蓄積に関わる酵素をコードする遺伝子のプ
ロモーター、ii)種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、およびii
i)種子での炭水化物生合成および蓄積に関わる酵素をコードする遺伝子のプロモーター
が含まれる。適切な種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター(米
国第5,608,152号)、ビキア・ファバ(Vicia faba)USPプロモー
ター(Baumlein et al.、1991)、アラビドプシスオレオシンプロモ
ーター(国際公開第98/45461号)、ファセオルス・ヴルガリス(Phaseol
us vulgaris)ファゼオリンプロモーター(米国第5,504,200号)、
ブラシカBce4プロモーター(国際公開第91/13980号)またはビキア・ファバ
由来のレグミンLeB4プロモーター(Baumlein et al.、1992)お
よびトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネなどといった単子葉植物での種子
特異的発現を導くプロモーターである。注目すべき、適切なプロモーターは、オオムギl
pt2またはlpt1遺伝子プロモーター(国際公開第95/15389号および国際公
開第95/23230号)または国際公開第99/16890号に記載されるプロモータ
ー(オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロ
ラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン
遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、ソルガムカシリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝
子のプロモーター)である。他のプロモーターには、Broun et al.(199
8)、Potenza et al.(2004)、米国第20070192902号お
よび米国20030159173号によって説明されるものが含まれる。ある実施形態で
は、種子特異的プロモーターが、胚、子葉(複数可)または胚乳といった種子の定義した
部分で優先的に発現される。そのような特異的プロモーターの例には、FP1プロモータ
ー(Ellerstrom et al.、1996)、エンドウレグミンプロモーター
(Perrin et al.、2000)、マメフィトヘマグルチニンプロモーター(
Perrin et al.、2000)、アマ2S貯蔵タンパク質をコードする遺伝子
のためのコンリニン1およびコンリニン2プロモーター(Cheng et al.、2
010)、シロイヌナズナ由来のFAE1遺伝子のプロモーター、セイヨウアブラナのグ
ロブリン様タンパク質遺伝子のBnGLPプロモーター、リヌム・ウシタティスシムム由
来のペルオキシレドキシン遺伝子のLPXRプロモーターが含まれるがこれらに限定され
ない。
よう選択されたプロモーター由来であり得、または、好ましくは生産される酵素のコード
領域に関して異種性であり、および、所望される場合はmRNAの翻訳を増大するように
特定的に改変され得る。導入遺伝子の発現を最適化するレビューに関しては、Kozie
l et al.(1996)を参照されたい。5’非翻訳領域は、適切な真核生物遺伝
子、植物遺伝子(コムギおよびトウモロコシクロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子リ
ーダー)または合成遺伝子配列由来の植物ウイルスRNA(とりわけタバコモザイクウイ
ルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザ
イクウイルス)からも取得され得る。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列に付随
する5’非翻訳配列由来である構築物には制限されない。リーダー配列は、無関係のプロ
モーターまたはコード配列由来でもあり得る。本発明の文脈で役立つリーダー配列は、ト
ウモロコシHsp70リーダー(米国5,362,865号および米国5,859,34
7号)およびTMVオメガ成分を含む。
非翻訳DNA配列によって達成される。組み換えDNA分子の3’非翻訳領域は、アデニ
レートヌクレオチドのRNAの3’末端への添加を引き起こすように植物で機能するポリ
アデニル化シグナルを含む。3’非翻訳領域は、植物細胞で発現される様々な遺伝子から
取得され得る。一般的に、この能力において、ノパリンシンターゼ3’非翻訳領域、エン
ドウ小サブユニットRubisco遺伝子の3’非翻訳領域、ダイズ7S種子貯蔵タンパ
ク質遺伝子またはアマコンリニン遺伝子の3’非翻訳領域が使用される。アグロバクテリ
ウム腫瘍誘発(Ti)プラスミド遺伝子のポリアデニレートシグナルを含む3’転写、非
翻訳領域も適切である。
数、これらポリヌクレオチド分子が転写される効率、結果として得られる転写物が翻訳さ
れる効率、および翻訳後修飾の効率を操作することで、形質転換ポリヌクレオチド分子の
発現を向上し得る。本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子の発現を増大するのに役
立つ組み換え技術には、ポリヌクレオチド分子の1つ以上の宿主細胞染色体への組み込み
、mRNAへの安定配列の添加、転写制御シグナル(たとえば、プロモーター、オペレー
ター、エンハンサー)の置換または修飾、翻訳制御シグナル(たとえば、リボゾーム結合
部位、シャイン・ダルガノ配列)の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応す
るようにポリヌクレオチド分子を修飾すること、および転写物を不安定化する配列の欠失
が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、キメラ遺伝子構築物または組
み換えベクターといった1つ以上の組み換え分子で形質転換した宿主細胞である、組み換
え細胞、好ましくは組み換え植物細胞も提供する。組み換え細胞は、2または3つの組み
換えベクター、または組み換えベクターおよび1つ以上の追加ポリヌクレオチドもしくは
キメラDNAといった、その任意の組み合わせを含み得る。本発明の適切な細胞には、た
とえば本明細書に記載されるポリペプチドまたは酵素をコードする分子といった、本発明
のポリヌクレオチド、キメラDNAまたは組み換えベクターで形質転換され得る任意の細
胞が含まれる。細胞は好ましくは、それによってLC−PUFAを生産するために使用さ
れることができる細胞である。組み換え細胞は培養中の細胞、インビトロの細胞であり得
、または、たとえば植物といった有機生物内にあり得、もしくは、たとえば種子もしくは
葉といった器官内にあり得る。好ましくは細胞は、植物または植物部分内にあり、さらに
好ましくは植物の種子内にある。
も1つの核酸分子ですでに形質転換された細胞のいずれかであり得る。そのような核酸分
子は、LC−PUFA合成に関係し得、または無関係であり得る。本発明の宿主細胞は、
本明細書で定義されるタンパク質を内因的に(すなわち、自然に)生産することができる
か、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチドで形質転換された後にのみ、そのような
タンパク質を生産することができるかのいずれかであり得、前者の場合、そこから生じる
組み換え細胞は、ポリペプチドを生産する強化した能力を有する。ある実施形態では、発
明の組み換え細胞は、長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する強化した能力を有する。本明細書
で使用される語句「長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する強化された能力を伴う細胞」は、本
発明の組み換え細胞を本発明のポリヌクレオチド(複数可)を欠如する宿主細胞と比較し
、組み換え細胞が、天然の細胞よりも多くの長鎖多価不飽和脂肪酸脂肪酸を生産している
、または、天然の細胞よりも大きい濃度のDHAといったLC−PUFA(他の脂肪酸と
比べて)を生産している状態である、相対的な語句である。たとえば別の脂肪酸、脂質、
デンプンといった炭水化物、RNA分子、ポリペプチド、医薬品または他の生成物といっ
た、別の生成物を合成する強化した能力を伴う細胞は、対応する意味を有する。
のできる任意の細胞であり得、細菌、真菌(酵母菌を含む)、寄生虫、節足動物、動物お
よび植物細胞を含み得る。細胞は原核生物または真核生物の細胞であり得る。好まれる宿
主細胞は、酵母菌および植物細胞である。好ましい実施形態では、植物細胞は種子細胞で
あり、特に種子の子葉または胚乳内の細胞である。一実施形態では、細胞は動物細胞また
は藻細胞である。植物細胞は、たとえば非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺
乳動物細胞といった任意の種類の動物の細胞であり得、または、魚類、甲殻類、無脊椎動
物、昆虫などといった水生動物の細胞であり得る。細胞は発酵プロセスに適した有機生物
の細胞であり得る。本明細書で使用される「発酵プロセス」という語句は、任意の発酵プ
ロセスまたは発酵工程を含む任意のプロセスを指す。微生物の発酵の例としては、酵母菌
といった真菌生物が含まれる。本明細書で使用される「酵母菌」には、サッカロマイセス
(Saccharomyces)菌種、サッカロマイセス・セレビシエ(Sacchar
omyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールベルゲンシス、カン
ジダ(Candida)菌種、クルイベロミセス(Kluyveromyces)菌種、
ピキア(Pichia)菌種、ハンゼヌラ(Hansenula)菌種、トリコデルマ(
Trichoderma)菌種、リポミセス(lipomyces)菌種、リポマイセス
・スターケイ(Lipomyces starkey)およびヤロウイア・リポリティカ
(Yarrowia lipolytica)が含まれる。好ましい酵母菌には、サッカ
ロマイセス菌種の株、およびとりわけ、サッカロマイセス・セレビシエが含まれる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを1つ以上含むトランスジェニック植物とい
った、本発明の細胞を含む植物も提供する。本明細書で名詞として使用される「植物」と
いう語句は、全体の植物を指すが、形容詞として使用される場合は、たとえば植物器官(
たとえば、葉、茎、根、花)、単細胞(たとえば、花粉)、種子、植物細胞などといった
、植物に存在する、植物から得られる、植物由来の、または植物に関係する任意の物質を
指す。「植物部分」という語句は、その植物部分が本発明に従った脂質を合成する限り、
たとえば葉または茎といった植物構造、根、花器官または構造、花粉、種子、胚、胚乳、
胚盤または種皮といった種子部分、たとえば維管束組織といった組織、細胞および同植物
の子孫を含む、植物DNAを含む全植物部分を指す。
または品種の野生型植物には見つからない遺伝子構築物(「導入遺伝子」)を含む植物を
指す。本発明の文脈で定義されるトランスジェニック植物には、所望する植物または植物
器官に本明細書で定義する脂質または少なくとも1つのポリペプチドの生産を引き起こす
組み換え技術を用いて遺伝子的に改変した植物およびそれらの子孫が含まれる。トランス
ジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物部分は対応した意味を有する。本明細
書で言及される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの分野での通常の意味を有し、組
み換えDNAまたはRNA技術によって生産した、または変化させた遺伝子配列、および
、本発明の細胞、好ましくは植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子には、
導入遺伝子が導入された植物細胞と同一の種、変種もしくは品種であり得る、もしくは、
異なる種、変種もしくは品種であり得る植物由来の遺伝子配列、または、植物細胞以外の
細胞由来の遺伝子配列が含まれ得る。一般的に、導入遺伝子は、たとえば形質転換といっ
たヒトの操作によって植物といった細胞内に導入されるが、当業者が理解する通り、いか
なる方法を用いてもよい。
た穀粒といった成熟穀粒または植物上にまだあるが収穫される準備ができている穀粒を指
すが、文脈によっては吸水または発芽後の穀粒も指し得る。成熟した穀粒または種子は一
般的に、約18〜20%未満の含水量を有する。本明細書で使用される「発育中の種子」
は、通常受精または開花後の植物の生殖構造に見つかる成熟前の種子を指すが、植物から
単離された、成熟前のそのような種子も指し得る。
れ植物部分または種子を得る任意の方法を指し、野外または温室もしくは成長室といった
容器の植物から植物部分または種子を回収すること、または、植物部分または種子の供給
元からの購入もしくは受け取りを含む。種子は、植え付けに適切であり得、すなわち、発
芽して後代植物を生産でき、または、もう発芽できないように処理されており、たとえば
、食物もしくは飼料の適用または本発明の脂質の抽出に役立つ、粉砕、研磨または製粉し
た種子である。
、脂肪酸および/または油の形態での貯蔵エネルギーに特化した植物の一部分を指す。植
物貯蔵器官の例としては、種子、果実、塊根および塊茎が挙げられる。本発明の好ましい
植物貯蔵器官は種子である。
比較した際に、著しく低下した成長および生殖能力を有さない、本発明の遺伝子改変植物
または植物器官、特に種子、塊茎または果実といった貯蔵器官を指す。ある実施形態では
、表現型的に正常な遺伝子改変植物または植物器官は、植物貯蔵器官特異的プロモーター
に操作可能に結合したサイレンシング抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含
み、前記ポリヌクレオチドを含まない同質遺伝子植物または器官と実質的に同じである成
長または生殖能力を有する。好ましくは、バイオマス、成長速度、発芽速度、貯蔵器官サ
イズ、種子サイズおよび/または生産される生存種子の数は、同一条件下で成長した前記
外因性ポリヌクレオチドを有さない植物の90%未満である。この語句は、野生型植物と
は違い得るが、たとえば実生葉のバレリーナ表現型といった、商業上の目的のための植物
の有用性をもたらさない植物の特色は包含しない。
図される植物には、単子葉類および双子葉類の双方が含まれる。好ましい実施形態では、
本発明の植物は、農作物(たとえば、穀類および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイ
モ、タピオカ、イネ、ソルガム、雑穀、キャッサバ、オオムギもしくはエンドウ)または
他のマメ科植物である。植物を、食用根、塊茎、葉、茎、花または果実の生産のために成
長させ得る。植物は、野菜または観賞植物であり得る。本発明の植物は:トウモロコシ(
ゼア・メイズ)、キャノーラ(セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ種)、カラシナ(セ
イヨウカラシナ)、アマ(リヌム・ウシタティスシムム)、アルファルファ(メディカゴ
・サティバ(Medicago sativa))、イネ(オリザ・サティバ)、ライム
ギ(セカレ・セレアレ(Secale cerale))、ソルガム(ソルガム・ビカラ
ー、ソルガム・ヴルガレ)、ヒマワリ(ヘリアンタス・アヌス)、コムギ(トリチウム・
アエスチブム(Tritium aestivum))、ダイズ(グリシン・マックス)
、タバコ(ニコチアナ・タバカム)、ジャガイモ(ソラヌム・ツベロスム(Solanu
m tuberosum))、ピーナッツ(アラキス・ヒポゲア)、ワタ(ゴシピウム・
ヒルスツム)、サツマイモ(ロプモエア・バタツス(Lopmoea batatus)
)、キャッサバ(マニホト・エスクレンタ(Manihot esculenta))、
コーヒー(コフェア(Cofea)種)、ココナッツ(ココヤシ)、パイナップル(アナ
ナ・コモスス(Anana comosus))、柑橘類樹木(シトラス(Citrus
)種)、ココア(テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao))、茶(カメ
リア・セネンシス(Camellia senensis))、バナナ(ムサ(Musa
)種)、アボカド(ペルセア・アメリカナ)、イチジク(フィクス・カシカ(Ficus
casica))、グアバ(プシディウム・グアジャバ(Psidium guaja
va))、マンゴー(マンギフェラ・インディカ(Mangifer indica))
、オリーブ(オレア・エウロパエア)、パパイア(カリカ・パパヤ(Carica pa
paya))、カシュー(アナカルジウム・オクシデンタレ)、マカダミア(マカダミア
・インテルグリフォリア)、アーモンド(プルヌス・アミグダルス)、テンサイ(ベタ・
ブルガリス(Beta vulgaris))、オートムギまたはオオムギであり得る。
明細書で使用される「油料種子植物」は、植物の種子の油の商業的生産のために使用され
る植物種である。油料種子植物は、アブラナ(たとえばキャノーラ)、トウモロコシ、ヒ
マワリ、ダイズ、ソルガム、アマ(アマニ)またはテンサイであり得る。さらに、油料種
子植物は、他のブラシカ属、綿、ピーナッツ、ポピー、カラシナ、トウゴマ、ゴマ、ベニ
バナまたはナッツ生産植物であり得る。植物は、オリーブ、アブラヤシまたはココナッツ
といったその果実内で多量の油を生産する。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、
エンダイブまたはキャベツ、ブロッコリーまたはカリフラワーを含むブラシカ属の野菜で
ある。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、イチゴ、トマトまたコショウにも適用され得
る。
される非トランスジェニック植物は、特に種子内に、i)20%未満、10%未満または
5%未満の18:2脂肪酸および/またはii)10%未満または5%未満の18:3脂
肪酸を有する油を生産する。
て分離しないように、導入されたそれぞれおよび全ての遺伝子(導入遺伝子)に対してホ
モ接合である。トランスジェニック植物は、導入された導入遺伝子(複数可)に対してヘ
テロ接合でもあり得、好ましくは、たとえばハイブリッド種子から成長したF1種子にお
いて、導入遺伝子と均一にヘテロ接合であり得る。そのような植物は当該技術分野では良
く知られる雑種強勢といった利点を提供し得る。
9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ6エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、ω3デ
サチュラーゼ、Δ4デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ、ジアシルグリセロールアシルト
ランスフェラーゼ、LPAAT、Δ17デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼおよび/
またはΔ12デサチュラーゼといったLC−PUFAの生産に関わる酵素をコードする追
加の導入遺伝子も含み得る。これらの活性を1つ以上伴うそのような酵素の例は、当該技
術分野では知られており、本明細書に記載されるものが含まれる。特定の例では、トラン
スジェニック植物は;
a)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ
およびΔ6エロンガーゼ、
b)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ
およびΔ9エロンガーゼ、
c)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ
、Δ6エロンガーゼおよびΔ15デサチュラーゼ、
d)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ
、Δ9エロンガーゼおよびΔ15デサチュラーゼ
e)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ
、Δ6エロンガーゼおよびΔ17デサチュラーゼ、または、
f)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ
、Δ9エロンガーゼおよびΔ17デサチュラーゼ、をコードする外因性ポリヌクレオチド
を少なくとも含む。
ーゼ、スラウストキトリドΔ5デサチュラーゼまたはエミリアナ・ハックスレイ(Emi
liana huxleyi)Δ5デサチュラーゼ、フィスコミトレラ・パテンスΔ6エ
ロンガーゼ、スラウストキトリドΔ5エロンガーゼまたはオストレオコッカス・タウリ(
Ostreococcus tauri)Δ5エロンガーゼ、フィトフトラ・インフェス
タンスω3デサチュラーゼまたはピシウム・イレグラレω3デサチュラーゼおよびスラウ
ストキトリドΔ4デサチュラーゼである一連のポリペプチドをコードする。
0,000個の実質的に同じ植物群として野外で成長し、または、少なくとも1ヘクター
ルの面積内で成長する。植え付け密度は、植物種、植物変種、気候、土壌条件、肥料の割
合および当該技術分野で知られる他の要因によって異なる。たとえば、キャノーラは通常
1ヘクタールあたり120〜150万の植物の植え付け密度で成長する。植物は当該技術
分野で知られる通りに収穫され、これには植物の一刈り、地干し刈りおよび/または刈り
取り、次いで、植物材料を脱穀および/または吹き分けて、しばしばもみ殻の形態である
植物部分の残りの部分から種子を分離することが含まれ得る。または、種子は野外で単一
のプロセス、すなわちコンバイニングによって収穫され得る。
トランスジェニック植物を、A.Slater et al.、Plant Biot
echnology−The Genetic Manipulation of Pl
ants、オックスフォード大学出版局(2003)およびP.Christouおよび
H.Klee、Handbook of Plant Biotechnology、ジ
ョン・ワイリー&サンズ社(2004)で広く説明されるものといった、当該技術では公
知の技術を用いて生産できる。
句およびそれの変化形は、外因性核酸分子の存在を積極的に選択する必要なく、外因性核
酸分子が細胞分裂の間に後代細胞へ移されるように、外因性核酸分子を細胞のゲノムに組
み込むことを指す。安定的形質転換体またはその子孫は、染色体DNA上のサザンブロッ
トまたはゲノムDNAのインサイツハイブリダイゼーションといった、当該技術分野では
公知の任意の方法によって選択され得る。
システムであり、なぜなら、全体の植物組織もしくは植物器官または組織培養の外植片の
細胞に、植物細胞ゲノムのDNAの一過性発現または安定的組み込みのいずれかで、DN
Aを導入することができるからである。DNAを植物細胞に導入する、アグロバクテリウ
ム媒介性植物組み込みベクターの使用は、当該技術分野では良く知られており(たとえば
、米国第5177010号、米国第5104310号、米国第5004863号または米
国第5159135号を参照)、DNAを植物細胞に導入できるアグロバクテリウムまた
は他の細菌を用いたフローラルディップ方法が含まれる。導入されるDNAの領域は境界
配列によって定義され、介在DNA(T−DNA)が通常植物ゲノムに挿入される。さら
に、T−DNAの組み込みは、ほとんど再配列をもたらさない比較的正確なプロセスであ
る。アグロバクテリウム媒介性形質転換が効率的であるこれらの植物変種において、トラ
ンスジェニックの容易な、および、定義された性質のために、最善の方法である。好まし
いアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌ならびにアグロバクテリウムでの複製
が可能であり、説明される好都合な操作を可能にする(Klee et al.、In:
Plant DNA Infectious Agents、HohnおよびSchel
l編集、シュプリンガー・フェアラーク社(Springer−Verlag)、ニュー
ヨーク、pp.179−203(1985)。
する核酸分子を送達するための方法の一例が、微粒子銃である。この方法は、Yang
et al.、Particle Bombardment Technology f
or Gene Transfer、オックスフォード大学出版局、英国、オックスフォ
ード(1994)によって評論されている。核酸で覆われ、推進力によって細胞内に送達
され得る非生物粒子(微粒子)である。例示的な粒子には、タングステン、金、プラチナ
などから成るものが含まれる。微粒子銃の特徴的な利点は、それが再現可能的に単子葉類
を形質転換する効果的な方法であることに加え、プロトプラストの単離またはアグロバク
テリウム感染の感受性のいずれも必要でないことである。
るプラスチド形質転換に関して開示される方法には、選択マーカーを含むDNAのパーテ
ィクル・ガン・デリバリーおよび相同組み換えを通してDNAをプラスミドゲノムに標的
すること(米国第5,451,513号、米国第5,545,818号、米国第5,87
7,402号、米国第5,932479号および国際公開第99/05265号)が含ま
れる。
器官へのDNAの直接注入、または、未成熟胚の細胞へのDNAの直接注入に続く乾燥し
た胚の再水和による、DNAの植物への導入が含まれるがこれらに限定はされない。
発育および栽培は当該技術分野では良く知られている(Weissbach et al
.、In:Methods for Plant Molecular Biology
、アカデミック・プレス社、カリフォルニア、サンディエゴ(1988)。この再生およ
び成長プロセスには通常、これらの個別化した細胞を、根付いた小植物の段階の一般的な
胚発育の段階を通して培養し、形質転換細胞を選択する工程が含まれる。トランスジェニ
ック胚および種子は同様に再生される。その後、得られる根付いたトランスジェニック芽
を、土壌といった適切な植物成長培地に播く。
。好ましくは、再生される植物は自家受粉してホモ接合トランスジェニック植物を提供す
る。そうでなければ、再生した植物から得られる花粉を、作物栽培学的に重要な系統の、
種子から成長した植物に交雑させる。逆に、これらの重要な系統の植物の花粉を用いて、
再生植物を受粉させる。当業者には良く知られている方法を用いて、所望する外因性核酸
を含む本発明の導入遺伝子植物を栽培する。
公知の方法を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅またはサザンブロット分析を実
施し得る。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質によって様々な方法のいずれかで検知さ
れ得、ウェスタンブロットおよび酵素アッセイを含む。トランスジェニック植物が一度得
られたら、それらは成長して所望する表現型を有する植物組織または部分を生産し得る。
植物組織または植物部分を、収穫および/または種子を回収し得る。種子は、所望する特
徴を有する組織または部分を有する追加の植物を成長させるための供給源として役立ち得
る。
は通常、1つの染色体上に単一遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物を、
添加した遺伝子(複数可)に対してヘミ接合であると呼び得る。さらに好ましいのは、添
加した遺伝子(複数可)に対してホモ接合であるトランスジェニック植物であり;すなわ
ち、染色体ペアの各染色体上の同一座に1つの遺伝子である、2つの添加遺伝子を含むト
ランスジェニック植物である。ホモ接合トランスジェニック植物は、ヘミ接合トランスジ
ェニック植物を自家受精させ、生産された種子のいくつかを発芽させ、得られた植物を対
象遺伝子に関して分析することで、得ることができる。
ク植物も交雑(交配)して双方の遺伝子または座のセットを含む子孫を生産し得るという
ことも理解される。適切なF1子孫の自家受粉は、双方の外来性遺伝子または座に対して
ホモ接合な植物を生産し得る。親植物とのもどし交雑および非トランスジェニック植物と
の外交配も、栄養繁殖と同様に、企図される。異なる特質および作物に一般的に使用され
る他の交雑方法の記述がFehr、In:Breeding Methods for
Cultivar Development、Wilcox J.編集、米国農学会(A
merican Society of Agronomy)、ウィスコンシン、マディ
ソン(1987)に見られる。
サイレンシング抑制因子
ある実施形態では、本発明の細胞、植物または植物部分は、サイレンシング抑制因子タ
ンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
解のためにターゲットし得る、ヌクレオチド配列特異的防御メカニズムである。PTGS
は、外来性(異種性)または内因性DNAで安定にまたは一過性に形質転換した植物また
は真菌で起こり、導入した核酸との配列相同性を有するRNA分子の蓄積の低下につなが
る。
た細胞内に存在するRNAの量を増大することが広く企図されている。このことがインビ
トロの細胞に関して正しいと証明されている一方で、多くの全植物同時発現実験では顕著
な副作用が観察されている。さらに具体的には、Mallory et al.(200
2)、Chapman et al.(2004)、Chen et al.(2004
)、Dunoyer et al.(2004)、Zhang et al.(2006
)、Lewsey et al.(2007)およびMeng et al.(2008
)が説明する通り、サイレンシング抑制因子を発現する植物は、一般的に恒常的プロモー
ター下では、それらが商業上の生産には有効ではない程度まで、しばしば表現型的に異常
である。
、RNA分子量が増大し得、および/またはRNA分子量が多くの世代にわたって安定化
し得ることが発見されている(国際公開第2010/057246号)。本明細書で使用
される「サイレンシング抑制因子タンパク質」、つまりSSPは、特に初めに形質転換し
た植物から繰り返された世代にわたって、植物細胞の異なる導入遺伝子からの発現産物の
量を強化する植物細胞で発現され得る任意のポリペプチドである。ある実施形態では、S
SPはウイルス性サイレンシング抑制因子またはその変異体である。多くの数のウイルス
性サイレンシング抑制因子が当該技術分野で知られており、P19、V2、P38、Pe
−PoおよびRPV−P0を含むがこれらに限定しない。ある実施形態では、ウイルス性
サイレンシング抑制因子は、配列番号53から57のいずれか1つで提供される配列、そ
の生物学的に活性な断片、または、配列番号53から57のうち1つ以上に少なくとも5
0%相同であり、サイレンシング抑制因子としての活性を有するアミノ酸配列を有するア
ミノ酸を含む。
びそれらの変化形は、繰り返される世代、たとえば少なくとも3、少なくとも5または少
なくとも10の世代にわたって、サイレンシング抑制因子をコードする外因性ポリヌクレ
オチドを欠如する同質遺伝子植物と比較した際に、RNA分子の量が後代植物において実
質的に同じまたはより高いことを指す。しかし、この語句(複数可)は、繰り返される世
代にわたって、以前の世代と比較してRNA分子量の多少の損失、たとえば1世代あたり
少なくとも10%の損失がある可能性を排除しない。
である。抑制因子が得られるウイルスおよびそれぞれの特定ウイルスからの抑制因子に関
するタンパク質(たとえばB2、P14など)またはコード領域指定の一覧表に関しては
国際公開第2010/057246号を参照されたい。抑制因子の複数のコピーが使用さ
れ得る。異なる抑制因子が一緒に使用され得る(たとえば、タンデムで)。
植物種子に発現されることが望ましいRNA分子は実質的にどれもサイレンシング抑制
因子と同時発現され得る。コードされたポリペプチドは、油、デンプン、炭水化物、栄養
素などの代謝に関連し得、または、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ろう、油、デ
ンプン、砂糖、炭水化物、風味、匂い、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラ
ボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン酸、セル
ロース、糖タンパク質、糖脂質などの合成、好ましくはTAGの生合成または構築に関与
し得る。
シカ属、ベニバナ、アマ、綿、ダイズ、カメリナまたはトウモロコシといった植物での油
生産のための酵素の量を増大した。
組み換え細胞または種子といった植物部分で生産されるLC−PUFAまたはLC−P
UFA(複数)の組み合わせの量は重要である。量は、特定のLC−PUFA、または、
たとえば、ω3LC−PUFAもしくはω6LC−PUFAもしくはVLC−PUFAと
いった関連LC−PUFAのグループ、または、当該技術分野で知られる方法によって決
定され得る他のものである脂肪酸の合計の組成(パーセントで)として表され得る。量は
、LC−PUFA含有量としても表され得、たとえば、組み換え細胞を含む材料の乾燥重
量におけるLC−PUFAのパーセンテージ、たとえば、LC−PUFAである種子の重
量のパーセンテージである。油料種子で生産されるLC−PUFAは、LC−PUFA含
有量の面で見れば、油生産のためには育てられない野菜または穀物においてよりも著しく
高い可能性があることがわかるが、双方は類似したLC−PUFA組成を有し得、双方は
ヒトまたは動物の消費のためのLC−PUFAの供給源として使用され得る。
では、総脂質を細胞、組織または有機生物から抽出し、ガスクロマトグラフィー(GC)
による分析の前に脂肪酸をメチルエステルに変換する。そのような技術は実施例1にて説
明される。クロマトグラムでのピーク位置を使用して、それぞれの特定の脂肪酸を同定し
得、各ピーク下の面積を積分して量を測定する。別で指示されない限り、本明細書で使用
される、試料中の特定の脂肪酸のパーセンテージは、クロマトグラムでの脂肪酸の合計面
積のパーセンテージとして、その脂肪酸のピーク下の面積として決定される。これは、実
質的に重量パーセンテージ(w/w)に対応する。脂肪酸の同一性をGC−MSで確認し
得る。総脂肪酸を、当該技術分野で知られる技術で分離し、TAG分画といった分画を精
製し得る。たとえば、薄膜クロマトグラフィー(TLC)を分析的規模で実施し、特にT
AGの脂肪酸組成を決定するために、DAG、アシル−CoAまたはリン脂質といった他
の脂質分画からTAGを分離し得る。
量は、細胞の総脂肪酸の約7%と約25%との間である。さらなる実施形態では、細胞の
総脂肪酸は、1%未満のC20:1を有する。好ましい実施形態では、細胞の抽出可能T
AGは、本明細書で言及される量で脂肪酸を含む。本明細書に記載される脂質を定義する
特色の可能な組み合わせもそれぞれ包含される。
細書で「転換効率」または「酵素的効率」とも呼ばれる、特定の基質脂肪酸から1つ以上
の産物脂肪酸への転換パーセンテージとしても表され得る。このパラメーターは、細胞、
植物、植物部分または種子から抽出される脂質における脂肪酸組成に基づいており、すな
わち、1つ以上の基質脂肪酸(それから生じる他の脂肪酸全てを含む)として形成された
LC−PUFA(それから生じる他のLC−PUFAを含む)の量である。転換パーセン
テージの一般式は:100×(産物LC−PUFAをおよびそれから生じる全ての産物の
パーセンテージの合計)/(基質脂肪酸およびそれから生じる全ての産物のパーセンテー
ジの合計)である。たとえばDHAに関しては、これはDHAの量(脂質の総脂肪酸含有
量におけるパーセンテージとして)の、基質脂肪酸(たとえば、OA、LA、ALA、S
DA、ETAまたはEPA)およびその基質から生じたDHA以外の全ての産物の量に対
する比として表され得る。転換パーセンテージまたは転換の効率は、経路での単一の酵素
的工程、または、経路の一部分もしくは全体に関して表され得る。
1.OAからDHA=100×(%DHA)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA
、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)
。
2.LAからDHA=100×(%DHA)/( LA、GLA、DGLA、ARA、E
DA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
3.ALAからDHA=100×(%DHA)/ ALA、SDA、ETrA、ETA、
EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
4.EPAからDHA=100×(%DHA)/(EPA、DPAおよびDHAの合計%
)。
5.DPAからDHA(Δ4デサチュラーゼ効率)=100×(%DHA)/(DPAお
よびDHAの合計%)。
6.Δ12デサチュラーゼ効率=100×(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、
ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(OA、
LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA
、DPAおよびDHAの合計%)。
7.ω3デサチュラーゼ効率=100×(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、
DPAおよびDHAの合計%)/(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、
SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
8.OAからALA=100×(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAお
よびDHAの合計%)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、S
DA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
9.Δ6デサチュラーゼ効率(ω3基質ALA上)=100×(SDA、ETA、EPA
、DPAおよびDHAの合計%)/(%ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、D
PAおよびDHA)。
10.Δ6エロンガーゼ効率(ω3基質SDA上)=100×(ETA、EPA、DPA
およびDHAの合計%)/(SDA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
11.Δ5デサチュラーゼ効率(ω3基質ETA上)=100×(EPA、DPAおよび
DHAの合計%)/(ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
12.Δ5エロンガーゼ効率(ω3基質EPA上)=100×(DPAおよびDHAの合
計%)/(EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸のいずれかに関する、総脂肪酸含有量のω6脂肪酸:ω3脂
肪酸の比によっても特徴づける。総ω6脂肪酸、総ω3脂肪酸、新ω6脂肪酸および新ω
3脂肪酸という語句は、本明細書で定義される意味を有する。本明細書で例証する方法で
、細胞、植物、植物部分または種子から抽出された脂質での脂肪酸組成から比を算出する
。脂質においてω6脂肪酸よりもω3脂肪酸の量を多く有することが望まれ、したがって
、1.0未満のω6:ω3比が好まれる。0.0の比は、定義されるω6脂肪酸の完全な
不在を示し;0.03の比が実施例6に記載される通り、達成された。そのような低い比
は、ω3デサチュラーゼ、特に、本明細書で例示されるピキア・パストリスω3デサチュ
ラーゼといった真菌ω3デサチュラーゼと、ω3基質に好みを示すΔ6デサチュラーゼと
の併合使用を通して達成され得る。
Aに基づいて算出され得る。たとえば、キャノーラ種子の油含有量が約40%(w/w)
で、油の総脂肪酸含有量の約12%がDHAである場合、種子のDHA含有量は、約4.
8%または種子1グラムあたり約48mgである。実施例2で説明する通り、約9%のD
HAを有し、キャノーラよりも低い油含有量を有するアラビドプシス種子のDHA含有量
は、1g種子あたり約25mgであった。約7%のDHA含有量では、キャノーラ種子ま
たはカメリナ・サティバ種子は種子1グラムあたり約28mgのDHA含有量を有する。
したがって、本発明は1グラム種子あたり約28mgのDHAを少なくとも含む、セイヨ
ウアブラナ、セイヨウカラシナおよびカメリナ・サティバ植物ならびにそれらから得られ
る種子を提供する。種子は、ドライダウンした後の収穫した成熟種子の標準通りの含水量
を有する(4〜15%水分)。本発明はまた、種子を得ることおよびその種子から油を抽
出することを含む、油を得るためのプロセス、ならびに、その油の使用、ならびに、本発
明に従う植物から種子を収穫することを含む、種子を得る方法も提供する。
ていれば、算出可能であり、または、推定可能である。たとえば、オーストラリアのキャ
ノーラは通常、1ヘクタールあたり約2.5トンの種子をもたらし、これは、40%の油
含有量では約1000kgの油をもたらす。総油中12%のDHAでは、これは、1ヘク
タールあたり約120kgのDHAを提供する。油含有量が50%減った場合でも、1ヘ
クタールあたり約60kgのDHAを提供する。
ラーゼは、いくつかのエロンガーゼとの組み合わせで比較的低い活性を有することが提唱
されている。LC−PUFA合成における基質として脂肪酸のアシル−CoA形態を使用
する能力を有するデサチュラーゼを提供することで、これを緩和し得、これは、組み換え
細胞、特に植物細胞で、好都合であると考えられる。効率的なDHA合成に特に好都合な
組み合わせは、たとえばピキア・パストリスω3デサチュラーゼ(配列番号12)といっ
た真菌ω3デサチュラーゼと、たとえば、ミクロモナス・プシラΔ6デサチュラーゼ(配
列番号13)または少なくとも95%のアミノ酸配列相同性を有するその変異形といった
、ω3アシル基質に対して好みを有するΔ6デサチュラーゼとの組み合わせである。
質または油)が、定義される成分をほとんど(たとえば、約0.5%未満、約0.25%
未満、約0.1%未満もしくは約0.01%未満)または一切含まないことを意味する。
ある実施形態では、「実質的に含まない」は、その成分が、通例の分析的技術を用いて検
知不能であること意味し、たとえば、特定の脂肪酸(ω6ドコサペンタエン酸といった)
は実施例1で説明されるガスクロマトグラフィーを用いて検知され得ない。
当該技術分野で日常的に実施される技術を用いて、本発明の細胞、植物、種子などによっ
て生産される油を抽出、プロセスおよび分析し得る。通常、植物種子を、調理、プレスお
よび抽出して、粗油を生産し、これを次いで、脱ガム、精製、脱色、脱臭する。一般的に
、種子を粉砕する技術は当該技術分野では公知である。たとえば、油料種子に水をスプレ
ーして含水量をたとえば8.5%まで上げることで油料種子を和らげ得、隙間設定が0.
23から0.27mmの滑らかなローラーを用いてフレーク状にし得る。種子の種類によ
っては、粉砕前に水を加えない可能性がある。熱の適用は酵素を非活性化させ、細胞破裂
を助長し、油の液滴を合体させ、タンパク質粒子を凝集し、これらはすべて抽出プロセス
を助長する。
る。スクリュープレスから排除されたケイクを次いで、たとえばヘキサンと一緒に、熱ト
レーシングカラムを用いて溶媒抽出する。または、プレス操作によって生産された粗油を
、溝付きのワイヤー排水蓋を有する沈殿タンクを通過させ、プレス操作の間に油と一緒に
現れた固体を除き得る。精製油をプレートおよびフレームフィルターを通過させて、いず
れの残存している固体微粒子を除去し得る。望ましい場合は、抽出プロセスから回収され
る油を精製油と一緒にまとめて、混合粗油を生産し得る。
シング手順に供する。本明細書で使用される「精製」という語句は、本発明の脂質または
油との関連で使用される際は、抽出した脂質または油が、脂質/油成分の純度を高める1
つ以上のプロセシング工程に供せられることを通常意味する。たとえば精製工程には、抽
出した油を:脱ガム、脱臭、脱色、乾燥および/または分画化することから成る群のうち
1つ以上または全てが含まれ得る。しかし、本明細書で使用される「精製」という語句に
は、総脂肪酸含有量のパーセンテージとしてのDHA含有量を増大するための、エステル
交換反応プロセスまたは本発明の脂質または油の脂肪酸組成を変化する他のプロセスは含
まれない。つまり、精製脂質または油の脂肪酸組成は、実質的に非精製脂質または油の脂
肪酸組成と実質的に同じである。
脱ガムは、油の精製において初期の工程であり、その第1の目的は抽出した総脂質のう
ちおよそ1〜2%で存在し得るリン脂質の大部分を油から取り除くことである。通常リン
酸を含む約2%の水を70〜80℃で粗油に添加すると、微量金属および色素を伴う、大
部分のリン脂質の分離につながる。取り除かれた難溶性物質は、主にリン脂質およびトリ
アシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしても知られる。濃縮したリン酸を粗種
子油に添加することで脱ガムを実施し、非水和性ホスファチドを水和性形態に変換し得、
および、存在する少量の金属をキレート化し得る。遠心分離によって、ガムを種子油から
分離する。
アルカリ精製は、粗油を処理するための精製プロセスの1つであり、時折中和とも呼ば
れる。アルカリ精製は、通常脱ガムに続き、脱色の前に行われる。脱ガムに続いて、種子
油を十分な量のアルカリ溶液の添加によって処理し、全ての脂肪酸およびリン酸を滴定し
、こうして形成されたセッケンを取り除く。適切なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシ
ウムおよび水酸化アンモニアが含まれる。このプロセスは通常室温で実行され、遊離脂肪
酸分画を取り除く。セッケンを遠心分離またはセッケンのための溶媒への抽出によって取
り除いて、中和した油を水で洗う。必要であれば、油中の任意の余分なアルカリを、塩酸
または硫酸といった適切な酸で中和し得る。
脱色は、窒素もしくは蒸気と、または、真空で作用させることで、漂白土(0.2〜2
.0%)の存在下および酸素の不在下で、油を90〜120℃で10〜30分間加熱する
精製プロセスである。油プロセシングにおけるこの工程は、所望しない色素(カロテノイ
ド、クロロフィル、ゴシポールなど)を取り除くように設計され、該プロセスはまた、酸
化産物、微量金属、硫黄化合物および微量のセッケンも取り除く。
脱臭は、高温度(200〜260℃)および低圧(0.1〜1mmHg)での油および
脂肪の処理である。これは通常、蒸気を、種子油100mlあたり、約0.1ml/分の
速度で種子油に導入することで達成される。30分のスパージング後、種子油を真空下で
放冷する。通常、種子油をガラス容器に移し、冷蔵下で保管する前に、アルゴンで洗い流
す。この処理によって、種子油の色が改善され、任意の残存している遊離脂肪酸、モノア
シルグリセロールおよび酸化産物を含む、揮発性物質または臭気化合物の大部分が取り除
かれる。
脱ろうは、周囲以下の温度での結晶化によって、油および脂肪を固体(ステアリン)お
よび液体(オレイン)分画に分離するために、油の商業上の生産において時折使用される
プロセスである。これは本来、固体フリー生成物を生産するために綿実油に適用された。
通常は油の飽和脂肪酸含有量を低下するために使用される。
エステル交換反応は、初めに脂肪酸をTAGから自由脂肪酸または脂肪酸エステルのい
ずれか、通常は脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルとして放出することで、脂肪
酸をTAG内または間で交換する、または、その脂肪酸を別のアルコールに移してエステ
ルを形成するプロセスである。分画化プロセスと組み合わせる場合、エステル交換反応を
用いて脂質の脂肪酸組成を改変し得る(Marangoni et al.、1995)
。セステル交換は、化学的(たとえば、強酸または塩基触媒性)または酵素的方法のいず
れかを用い得、後者はTAG上の脂肪酸に関して位置特異的(sn−1/3またはsn−
2特異的)であり得るリパーゼを用い、または、他よりもいくつかの脂肪酸に対して好み
を有する(Speranza et al.、2012)。油中のLC−PUFAの濃度
を増大するための脂肪酸分画化は、たとえば、冷凍結晶化、尿素を用いた複合体形成、分
子蒸留、超臨界流体抽出および銀イオン錯体形成といった、当該技術で公知の方法のいず
れかによって達成され得る。尿素との複合体結成はその油中の飽和および一価不飽和脂肪
酸の量を減らす際の単純性および効率性のために好ましい方法である(Gamez et
al.、2003)。始めに、酸または塩基触媒性反応条件下での加水分解によって、
油のTAGを、しばしば脂肪酸エステルの形態であるそれらを構成する脂肪酸に分け、そ
れによって、過剰なアルコールが用いられ、形成されたアルキルエステルおよび、さらに
形成されたグリセロールの分離を可能にする、1molのTAGが少なくとも3molの
アルコール(たとえば、エチルエステルにはエタノール、メチルエステルにはメタノール
)と反応し、または、リパーゼによって、油のTAGを、しばしば脂肪酸エステルの形態
であるそれらを構成する脂肪酸に分ける。その処理によって脂肪酸組成が通常は改変した
、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを次いで、複合体形成のための尿素のエタノ
ール溶液と混合する。飽和および一価不飽和脂肪酸は容易に尿素と複合体形成し、冷却の
際に結晶化し、続いて濾過によって取り除かれ得る。非尿素と複合した分画はこうしてL
C−PUFAに富んでいる。
本発明には、家畜飼料として使用され得る組成物を含む。本発明のために、「家畜飼料
」には、体内に取り込まれた際に(a)組織に栄養分を与え、もしくは組織を築く、また
はエネルギーを供給するために役立つ;および/または(b)十分な栄養状態または代謝
機能を維持、再建または支持する、ヒトまたは動物の消費のための任意の食物または調製
物が含まれる。本発明の家畜飼料には、たとえば、本発明の調製粉乳および種子ミールと
いった、乳児および/または小さな子供にとって栄養のある組成物が含まれる。
発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の生成物、本発明の発酵プロセスの産物、ま
たは適切な担体(複数可)を伴う組成物を含む。「担体」という語句は、その広義で使用
され、栄養価を含み得るまたは含み得ない任意の成分を包含する。当業者には理解される
通り、担体は、家畜飼料を消費する有機生物に有害な影響を有さないような、家畜飼料で
の使用に適している(または十分低い濃度で使用される)必要がある。
は間接的に生産される油、脂肪酸エステルもしくは脂肪酸を含む。組成物は、固体または
液体の形態のいずれかであり得る。さらに、組成物には、食用多量養素、タンパク質、炭
水化物、ビタミンおよび/またはミネラルが、特定の使用に望ましい量で含まれ得る。こ
れら成分の量は、組成物が、正常な個体への使用を意図されているのか、または代謝疾患
などを患う個体など、特化したニーズを有する個体への使用を意図されているのかによっ
て、異なるであろう。
素が含まれるが、これらに限定されない。そのような食用脂の例には、ココナッツ油、ル
リジサ油、真菌油、黒潮(black current)油、ダイズ油ならびにモノおよ
びジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。そのような炭水化物の例には:グ
ルコース、食用ラクトースおよび加水分解デンプンが含まれる(がこれらに限定されない
)。さらに、本発明の栄養組成物で使用され得るタンパク質の例には、ダイズタンパク質
、電気透析乳漿、電気透析脱脂乳、牛乳の乳漿またはこれらタンパク質の加水分解物が含
まれる(が、これらに限定されない)。
され得る:カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガ
ン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素およびビタミンA、E、D、CおよびB群。他のその
ようなビタミンおよびミネラルも添加され得る。
製または精製とは、天然材料の精製または新規合成によって調製された物質を指す。
よい。たとえば、組成物をいかなる種類の植物にも添加してよく、それには:マーガリン
、改変バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック食品、
サラダ油、調理油、調理脂、肉、魚および飲み物が含まれる(がこれらに限定されない)
。
特にパンを焼く際に作用剤としても使用される。たとえばヤロウイア種を含む油性酵母菌
といった他の酵母菌もLC−PUFA生産に役立つ。酵母菌は、養殖漁業といった動物試
料での添加剤としても使用され得る。本明細書で説明されるようにLC−PUFAを合成
するよう適合された、遺伝子操作した酵母菌株が提供され得ることは明らかになるであろ
う。これら酵母菌株またはそれらで生産されるLC−PUFAを、次いで、食料品ならび
にワインおよびビール作りで使用し、強化した脂肪酸含有量を有する製品を提供し得る。
発現する宿主細胞を、動物の栄養補助食品としても使用し、動物の組織、卵または牛乳の
脂肪酸組成を、ヒトまたは動物の消費により望ましいものに変え得る。そのような動物の
例には、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリといった家禽類などが含まれる。
は、たとえばエビといった甲殻類の脂肪酸量を増大し得る。好ましい魚はサケである。
され得る、植物、種子ならびに葉および茎といった他の植物部分である。たとえば、動物
は野外で成長したそのような植物を直接食べ得、または、制御した餌やりの中で測定され
た量を与えられ得る。本発明には、そのような植物および植物部分を、ヒトおよび他の動
物のLC−PUFA量を増大するための摂食としての使用が含まれる。
また、本発明には、本発明の方法を用いて生産される1つ以上の脂肪酸および/または
結果として得られる油を含む組成物、具体的には医薬組成物も包含される。
または水/油乳濁液といった乳濁液のような、標準的で、良く知られる、非毒性の薬剤的
に許容される担体、補助剤または媒体と組み合わせた、1つ以上の脂肪酸および/または
油を含み得る。組成物は液体または固体のいずれかの形態であり得る。たとえば、組成物
は、錠剤、カプセル、経口摂取可能液体または粉末、注射可能または局所軟膏またはクリ
ームの形態であり得る。たとえば、分散液の場合は必要な粒径の維持、および、界面活性
剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。たとえば、糖、塩化ナトリウムなどの
等張剤を含むことも望まれ得る。そのような不活性希釈剤に加え、組成物はまた、湿潤剤
、乳濁および懸濁剤、甘味料、風味料および芳香剤といった補助剤も含み得る。
レンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒ
ドロキシド、ベントナイト、寒天、ならびにトラガントまたはこれら物質の混合物といっ
た懸濁剤を含み得る。
形を調製し得る。たとえば、本発明にしたがって生産した脂肪酸を、アカシア、コーンス
ターチまたはゼラチンといった結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸といった崩
壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤と組み合わせ
て、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチといった従来の錠剤ベースで錠剤化し
得る。これら賦形剤を抗酸化剤および関連脂肪酸と一緒にゼラチンカプセルに組み込むこ
とで、カプセルを調製し得る。
組み込んでもよい。
摂取(1日最大100gまで)であり、好ましくは、1日約10mgから約1、2、5ま
たは10gの範囲である(1または複数の服用)。当該技術分野で知られる通り、最小限
である、約300mg/日の脂肪酸、特にLC−PUFA、が望ましい。しかし、任意の
量の脂肪酸も対象には有益であることが理解されるであろう。
び経直腸)および非経口が含まれる。たとえば、液体調製物は経口または経直腸投与され
得る。さらに、均質な混合物を水に完全に分散させ、生理学的に許容される希釈剤、保存
剤、緩衝剤または噴霧剤と滅菌条件下で混合し、スプレーまたは吸入剤を形成し得る。
患者の年齢、患者の全体的な健康状態、患者の過去の経歴、患者の免疫状態などといった
様々な要因次第である。
明の組成物を既存の美容組成物に添加し得、また、本発明に従って生産された脂肪酸を、
美容組成物における唯一の「活性」成分として使用し得る。
一過性発現系での植物細胞の遺伝子発現
外因性遺伝子構築物を、基本的にVoinnet et al.(2003)およびW
ood et al.(2009)が説明する通りに、一過性発現系で植物細胞に発現さ
せた。CaMV 35Sプロモーターといった強度の恒常的プロモーターから発現される
コード領域を含むプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に導
入した。国際公開第2010/057246号に記載される通り、p19ウイルス性サイ
レンシング抑制因子発現のためのキメラ遺伝子35S:p19を別でAGL1内に導入し
た。組み換えアグロバクテリウム細胞を、50mg/Lカナマイシンおよび50mg/L
リファンピシンを添加したLBブロス内で、28℃で静止期まで成長させた。次いで、1
0mMのMES pH5.7、10mMのMgCl2および100μΜアセトシリンゴン
を含む浸潤緩衝液内でOD600=1.0まで再懸濁する前に、室温で15分間、500
0gでの遠心分離によって細菌をペレット状にした。次いで、35S:p19および対象
の試験キメラ構築物(複数可)を含む同じ体積のアグロバクテリウム培養物を、葉の組織
への浸潤に先立って混合する前に、細胞を振動させながら28℃で3時間インキュベート
した。一般的に、浸潤後、葉のディスクを脂肪酸のGC分析のために取り出して凍結乾燥
させる前に、植物をさらに5日間成長させた。
/HCl/ジクロロメタン(10/1/1 v/v)溶液中試料をインキュベートするこ
とで、凍結乾燥試料における全ての葉脂質の脂肪酸メチルエステル(FAME)を作製し
た。FAMEをヘキサン/DCMで抽出し、ヘキサン中、小体積まで濃縮し、GCに注入
した。脂質分画に存在する各および総脂肪酸の量を内部標準の既知の量をもとに定量化し
た。
30mのSGE−BPX70カラム(70%シアノプロピルポリシルフェニレン−シロ
キサン、0.25mmの内部直径、0.25mmのフィルムの厚さ)、FID、分割/非
分割注入器ならびにアジレント・テクノロジー社7693シリーズ自動回収装置および注
入器を備えたアジレント・テクノロジー社7890A GC(米国、カリフォルニア州、
パロアルト)を用いたガスクロマトグラフィーによって、FAMEを分析した。ヘリウム
をキャリアガスとして用いた。150℃のオーブン温度で試料を分割モード(50:1比
)で注入した。注入後、オーブン温度を150℃で1分間維持し、次いで、1分あたり3
℃ずつ210℃まで上げ、再度1分あたり50℃ずつ240℃まで上げ、最終的に、24
0℃で1.4分間維持した。アジレント・テクノロジー社ChemStationソフト
ウェア(Rev B.04.03(16)、米国、カリフォルニア州、パロアルト)で、
既知の量である外部標準GLC−411(Nucheck)およびC17:0−ME内部
標準の反応をもとにピークを定量化した。
内部定量化標準として既知の量のtri−C17:0−TAGを添加した後、開花から
12日後(daf)の、凍結乾燥した発育中の種子および成熟した種子から全ての脂質を
抽出した。5mgの乾燥材料あたりで、抽出した脂質をブタノール:エタノール(1:1
v/v)中10mMのブチル化ヒドロキシトルエン1mLに溶解し、アジレント社12
00シリーズLCおよび6410bエレクトロスプレーイオン化3連4重極LC−MSを
用いて分析した。0.2mL/分のフロー速度でバイナリ勾配を操作するAscenti
s Express RP−Amideカラム(50mm×2.1mm、2.7μm、S
upelco)を用いて、脂質をクロマトグラフィーによって分離した。移動相は:A.
H2O:メタノール:テトラヒドロフラン(50:20:30 v/v/v)中10mM
の蟻酸アンモニウム;B.H2O:メタノール:テトラヒドロフラン(5:20:75、
v/v/v)中10mMの蟻酸アンモニウムであった。マルチプルリアクションモニタリ
ング(MRM)リストは、30Vの衝突エネルギーおよび60Vのフラグメンターを用い
て、次の主要な脂肪酸をもとにした:16:0、18:0、18:1、18:2、18:
3、18:4、20:1、20:2、20:3、20:4、20:5、22:4、22:
5、22:6。アンモニア化合プリカーサーイオンおよび22:6のニュートラルロスに
よるプロダクトイオンをもとに、各MRM TAGを同定した。10μΜのトリステアリ
ン外部標準を用いてTAGを定量化した。
種子油含有量を測定する予定であった場合、種子を24時間デシケーター内で乾燥させ
、およそ4mgの種子を、テフロン加工のねじ口を含む2mlのガラス小瓶に移した。0
.1mlトルエン中に溶解した0.05mgトリヘプタデカノインを内部標準として小瓶
に添加した。
することで、種子FAMEを調製し、簡単に撹拌し、80℃で2時間インキュベートした
。室温まで下げた後、0.3mlの0.9%NaCl(w/v)および0.1mlヘキサ
ンを小瓶に添加し、10分間、Heidolph Vibramax110でよく混合し
た。FAMEを0.3mlのガラス製インサートに集め、水素炎イオン化検出器(FID
)を伴うGCで、前記した通りに分析した。
,INC.,)、米国)に存在する同じFAMEの既知の量のピーク面積反応をもとに、
各FAMEのピーク面積をまず校正した。GLC−411は、C8:0からC22:6に
及ぶ、同量の31個の脂肪酸(重量%)を含む。標準に存在しなかった脂肪酸の場合、発
明者らは最も類似したFAMEのピーク面積反応を取り出した。たとえば、16:ld9
のFAMEのピーク面積反応を16:ld7に関して使用し、C22:6のFAME反応
をC22:5に関して使用した。校正した面積を用いて、内部標準質量との比較によって
、試料中の各FAMEの質量を算出した。油はTAGの形態で主に保存され、その重量を
、FAME重量をもとに算出した。各FAMESのモルを算出し、FAMEの合計モルを
3で割ることで、グリセロールの合計モルを算出した。41および15がそれぞれグリセ
ロール部分およびメチル基の分子量である、重量%油=100×((41×合計モルFA
ME/3)+(合計gFAME−(15×合計モルFAME)))/g種子という関係を
用いて、グリセロールおよび脂肪アシル部分の合計としてTAGを算出した。
およそ10mgの油の試料を、内部標準として添加した一定分量のC24:0モノオー
ルと一緒に、80%MeOH中4mLの5%KOHを用い、テフロン加工のねじ口のガラ
ス管内で80℃にて2時間加熱し、けん化した。反応混合物を冷やした後、2mLのMi
lli−Q水を添加し、振動および撹拌することで、ステロールを2mLのヘキサン:ジ
クロロメタン(4:1 v/v)に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を
取り除き、2mLのMilli−Q水で洗浄した。振動および遠心分離のあと、ステロー
ル抽出物を次いで除去した。窒素ガスの流れを利用して抽出物を蒸発させ、200mLの
BSTFAを用い、および80℃で2時間加熱して、ステロールをシリル化した。
のヒートブロック上の窒素ガスの流れ下で乾燥し、次いで、GC/GC−MS分析の直前
にクロロホルムまたはヘキサンに再溶解した。ステロール−OTMS誘導体を、Supe
rlco Equity(商標)−1溶融石英キャピラリーカラム(15m×0.1mm
内部直径、0.1μmのフィルムの厚さ)、FID、分割/非分割注入器ならびにアジレ
ント・テクノロジー社7683Bシリーズ自動回収装置および注入器が取り付けられたア
ジレント・テクノロジー社6890A GC(米国、カリフォルニア州、パロアルト)を
用いたガスクロマトグラフィー(GC)によって分析した。ヘリウムをキャリアガスとし
て使用した。120℃のオープン温度で、非分割モードで試料を注入した。注入後、オー
ブン温度を1分あたり10℃ずつ270℃まで上げ、最終的に1分あたり5℃ずつ300
℃まで上げた。アジレント・テクノロジー社ChemStationソフトウェア(米国
、カリフォルニア州、パロアルト)でピークを定量化した。GC結果は各成分の面積の±
5%のエラーに影響される。
GCQ GC−MSおよびFinnigan Thermo Electron Cor
poration GC−MS上で実施した;双方のシステムにカラム上注入器およびT
hermoquest Xcaliburソフトウェア(米国、テキサス州、オースティ
ン)を取り付けた。各GCに、上記したものと類似した極性のキャピラリーカラムを取り
付けた。質量スペクトルデータを用いて、保持時間データを、信憑性のある実験室標準に
関して得られた保持時間データと比較することで、それぞれの成分を同定した。試料バッ
チと同時に、完全な手続き上のブランク分析を実施した。
逆転写PCR(RT−PCR)増幅は、一般的に、製造業者の説明にしたがって10p
molのフォワードプライマーおよび30pmolのリバースプライマー、2.5mMの
最終濃度までのMgSC4、緩衝液を伴う400ngの全RNAならびにヌクレオチド成
分を用いた、体積25μLのSuperscript III One−Step RT
−PCRシステム(インビトロゲン社(Invitrogen))を使用して実行された
。典型的な温度レジームは:逆転写が起こるために30分間45℃で1サイクル;次いで
、2分間94℃で1サイクル、引き続き、30秒間94℃、30秒間52℃、1分間70
℃の40サイクル;次いで、反応混合物を5℃に冷やす前に2分間72℃の1サイクルで
あった。
l.、2007)が説明する通り、塩素ガスを用いて滅菌した。滅菌した種子を、pH5
.8に調節した0.8%寒天を伴う1/2強度のMS培地(MurashigeおよびS
koog、1962)上で発芽させ、6〜7日間、24℃にて、18/6時間(明/暗)
の光周期を伴う蛍光灯(50μΕ/m2s)下で成長させた。2〜4mmの柄の長さであ
る子葉柄(Cotyledonary petioles)をこれら実生から無菌的に単
離し、外植片として使用した。1つは種子特異的バイナリーベクターを保有し、2つ目は
35S−LEC2構築物を伴う、形質転換したA.ツメファシエンス株AGL1の培養物
を新しいプレートの単一コロニーから接種し、適切な抗生物質を伴う10mLのLB培地
内で成長させ、28℃で、150rpmの撹拌を伴いながら一晩成長させた。細菌細胞を
5分間の4000rpmの遠心分離で回収し、2%スクロースを含むMS培地で洗浄し、
10mLの同じ培地内に再懸濁し、100μMまでアセトシリンゴンを添加した後、4時
間、必要に応じて選択のための抗生物質と成長させた。植物組織への添加の2時間前に、
スペルミジンを1.5mMの最終濃度まで添加し、細菌の最終密度を新しい培地でOD6
00nm=0.4まで調節した。1つは種子特異的構築物を保有し、もう一方は35S−
AtLEC2を保有する、2つの細菌培養物を、1:1から1:1.5比で混合した。
感染させた。子葉柄を滅菌フィルター紙上にブロットして余分なA.ツメファシエンスを
除去し、次いで、同時培養培地(1mg/LのTDZ、0.1mg/LのNAA、L−シ
ステイン(50mg/L)を添加した100μΜアセトシリンゴン、アスコルビン酸(1
5mg/L)およびMES(250mg/1)を有するMS培地)に移した。プレートを
微小孔テープで密封し、24℃で48時間、暗所でインキュベートした。同時培養した外
植片を事前選択培地(1mg/LのTDZ、0.1mg/LのNAA、3mg/LのAg
NO3、250mg/Lセフォタキシムおよび50mg/Lチメンチンを含むMS)に移
し、4〜5日間、24℃で、16時間/8時間の光周期を伴って培養した。種子特異的ベ
クター上の選択マーカー遺伝子にしたがって、外植片を次いで選択培地(1mg/LのT
DZ、0.1mg/LのNAA、3mg/LのAgNO3、250mg/Lセフォタキシ
ムおよび50mg/Lチメンチンを含むMS)に移し、2〜3週間、24℃で、16時間
/8時間の光周期を伴って培養した。緑色の胚形成カルスを伴う外植片をホルモンフリー
MS培地(3mg/LのAgNO3、250mg/Lセフォタキシム、50mg/Lチメ
ンチンおよび選択剤を伴うMS)に移し、もう2〜3週間培養した。選択培地上で生き残
った外植片から単離した魚雷または子葉期の胚を、GCを使って、それらの全ての脂質の
脂肪酸組成に関して分析した。
バイナリーベクターpJP3416−GA7およびpJP3404はそれぞれ、5つの
デサチュラーゼおよび2つのエロンガーゼをコードする7つの異種性脂肪酸生合成遺伝子
、ならびに、各ベクターに存在するT−DNAの左境界と右境界の反復の間に植物選択マ
ーカーを含んでいた(図2および3)。配列番号1は、右境界から左境界の配列のpJP
3416−GA7のT−DNA領域のヌクレオチド配列を提供する。双方の遺伝子構築物
は、ラカンセア・クルイベリΔ12−デサチュラーゼ(配列番号1のヌクレオチド141
43〜16648を含む)、ピキア・パストリスω3デサチュラーゼ(配列番号1のヌク
レオチド7654〜10156を含む)、ミクロモナス・プシラΔ6デサチュラーゼ(配
列番号1のヌクレオチド226〜2309を含む)、パブロバ・サリナΔ5およびΔ4デ
サチュラーゼ(それぞれ配列番号1のヌクレオチド4524〜6485および10157
〜14142を含む)およびピラミモナス・コルダタΔ6およびΔ5エロンガーゼ(それ
ぞれ配列番号1のヌクレオチド2310〜4523および17825〜19967を含む
)をコードする、植物コドン最適化遺伝子を含んでいた。配列番号1に対して、バイナリ
ーベクターpJP3416−GA7のT−DNA(方向:右境界から左境界の配列)領域
の特定の領域は次の通りである:
ヌクレオチド1〜163:右境界;480〜226、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスノパリンシンターゼターミネーター(TER_NOS);1883〜489、ミクロ
モナス・プシラΔ6デサチュラーゼ;2309〜1952、セイヨウアブラナ切断ナピン
プロモーター(PRO_FPl);2310〜3243、シロイヌナズナFAE1プロモ
ーター(PRO_FAE1);3312〜4181、ピラミモナス・コルダタΔ6エロン
ガーゼ;4190〜4523、グリシンマックスレクチンターミネーター(TER_レク
チン);4524〜4881、PRO_FPl;4950〜6230:パブロバ・サリナ
Δ5デサチュラーゼ;6231〜6485:TER_NOS;7653〜6486、ニコ
チアナ・タバカムRb7マトリックス付着領域(MAR);8387〜7654、リヌム
・ウシタティスシムムコンリニン1ターミネーター(TER_Cnl1);9638〜8
388、ピキア・パストリスω3デサチュラーゼ;10156〜9707、リヌム・ウシ
タティスシムムコンリニン1プロモーター(PRO_Cnl1);10157〜1218
9、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン1プロモーター;12258〜13604、
パブロバ・サリナΔ4デサチュラーゼ;13605〜14142、リヌム・ウシタティス
シムムコンリニン2ターミネーター;14143〜14592、PRO_Cnl1;14
661〜15914、ラカンセア・クルイベリΔ12デサチュラーゼ;15915〜16
648、TER_Cnl1;17816〜16649、MAR;17825〜18758
、PRO_FAE1;18827〜19633、ピラミモナス・コルダタΔ5エロンガー
ゼ;19634〜19967、TER_レクチン;19990〜20527、複製エンハ
ンサー領域を伴うカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター;20537〜21
088、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスホスフィノトリシン−N−アセチルト
ランスフェラーゼ;21097〜21349、TER_NOS;21367〜21527
、左境界。
つの異なるプロモーター、すなわち、切断セイヨウアブラナナピンプロモーター(pBn
FP1)、シロイヌナズナFAE1プロモーター(pAtFAE1)およびリヌム・ウシ
タティスシムムコンリニン1プロモーター(pLuCnl1)が使用された。7つの脂肪
酸生合成遺伝子は、一緒に、18:1Δ9(オレイン酸)から22:6Δ4、7、10、
13、16、19(DHA)に変換するよう設計された全体のDHA合成経路をコードし
ていた。双方のバイナリーベクターは、複製エンハンサー領域を伴うカリフラワーモザイ
クウイルス(CaMV)35SプロモーターおよびA.ツメファシエンスnos3’ポリ
アデニル化領域−転写ターミネーターに操作可能に結合した領域をコードするBAR植物
選択マーカーを含んでいた。植物選択マーカーはT−DNA領域の左境界に隣接して配置
され、したがって、植物細胞へのT−DNA導入の方向に関して、T−DNA上で遠位に
位置した。これは、選択マーカー遺伝子を含まない可能性が高いT−DNAの部分的導入
が選択されない可能性を増大した。pJP3416−GA7およびpJP3404はそれ
ぞれアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogen
es)由来のRiA4複製開始点を含んだ(Hamilton、1997)。
合成し、この領域をPspOMI部位の受容バイナリーベクターpJP3416に挿入す
ることで、pJP3416−GA7を作製した。GA7上の各脂肪酸生合成遺伝子は、プ
ロモーターと翻訳開始ATGとの間に、各コード領域と操作可能に結合して遺伝子から生
成されるmRNAの翻訳効率を最大化するタバコモザイクウイルス5’非翻訳領域(5’
UTR)配列を含んでいた。GA7構築物はまた、Hall et al.(1991)
が説明する通り、2つのニコチアナ・タバカムRb7マトリックス付着領域(MAR)配
列を含んでいた。核付着領域と時折呼ばれるMAR配列は、インビトロで核マトリックス
に特異的に結合すると知られており、インビボでクロマチンの核マトリックスへの結合を
媒介し得る。MARは、トランスジェニックサイレンシングを緩和するように機能すると
考えられている。pJP3416−GA7において、トランスジェニック発現カセットを
遮断するDNAスペーサーとして作用するために、MARも、T−DNA領域内に挿入お
よび配置される。GA7領域の挿入前のpJP3416ベクターは、境界間に植物選択マ
ーカーカセットしか含んでいなかった。
子カセットが添加される、制限酵素をもとにした順次挿入によって、遺伝子構築物pJP
3404を作製した。この構築物は、双方ともB.ナプス切断ナピンプロモーター(FP
1)によって発現されるL.クルイベリΔ12デサチュラーゼおよびP.パストリス(P
.pastoris)ω3デサチュラーゼ、ならびに、A.タリアナFAE1プロモータ
ーに発現されるM.プシラΔ6デサチュラーゼを含んでいた(図4)。はじめに、A.タ
リアナFAD2イントロンをEcoRI部位に隣接させ、pJP3367MfeI部位に
クローニングしてpJP3395を作製した。それぞれFAE1およびFP1プロモータ
ーによって促進されるP.コルダタΔ6およびΔ5エロンガーゼカセットを含む断片を、
pJP3395のKasI部位にクローニングして、pJP3398を作製した。次いで
、pJP3398のRK2複製開始点をRiA4複製開始点で置き換えることで、pJP
3399を作製した。それぞれFP1およびFAE1プロモーターによって促進されるP
.サリナΔ5およびΔ4デサチュラーゼカセットを含むSbfI隣接断片をpJP339
9のSbfI部位にクローニングすることで、最終バイナリーベクター、pJP3404
を作製した。
キメラベクターをA.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換したアグロバク
テリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を利用
してA.タリアナ(シロイヌナズナ)(生態型コロンビアおよびfad2変異体)植物を
処理した(CloughおよびBent、1998)。成熟後、処理した植物からのT1
種子を回収しBAR選択マーカー遺伝子を含む植物の選択のためにPPTを含むMSプレ
ート上に播いた。生き残った、健康なT1実生を土壌に移した。植物が成熟まで成長し、
自家受精が可能にした後、これら植物からのT2種子を回収し、それらの種子脂質の脂肪
酸組成を実施例1で記載する通りにGC分析によって分析した。
fad2変異体を使用した6個の形質転換体に関して、種子脂質のDHA量のデータが図
5に示される(T2と標識されたレーン)。pJP3416−GA7構築物は、総脂肪酸
含有量のパーセンテージとして表されるDHA量の、pJP3404構築物よりも平均的
に少しだけ高い生産につながった。表4は、最も高いDHA量を伴うT2系統からの総種
子脂質の脂肪酸組成を示す。同一種子のオレイン酸からのDHAの生産における各酵素的
工程に関して算出された転換効率が表5に示される。転換効率は、(%産物×100)/
(%残存基質+%産物)で算出され、したがってパーセンテージで表される。
量は6.2%であり、さらに、0.5%EPAおよび0.2%DPA(系統#14)を伴
った。これらのT2種子は、導入遺伝子に対して依然と分離しており、すなわち、均一し
てホモ接合ではなかった。独立トランスジェニック種子の総種子脂質のプロフィール(表
4)のまとめたデータが表6に示される。これらの種子の導入遺伝子の結果生産されたω
3脂肪酸の量(コロンビア背景で内因的に生産されたALAの量を除外した全ての新ω3
脂肪酸)が10.7%である一方で、ω6脂肪酸の量(18:2Δ9、12を除外した全
ての新ω6脂肪酸)は1.5%であった。これは、新ω3脂肪酸:新ω6脂肪酸の極端に
有利な比、すなわち、7.3:1を意味する。
0、14、22および34と指定された系統ならびにfad2変異体背景の18、21お
よび25と指定された系統のT2種子を、インビトロのトランスジェニック実生の選択の
ためにPPTを含むMS培地上に播いた。各系統に対して20個のPPT耐性実生が土壌
に移され、自家受精後成熟するまで成長させた。これらの植物は、選択マーカー遺伝子、
および、したがって、植物ゲノムの少なくとも1つのT−DNA挿入物にとって、ホモ接
合である傾向が非常に高かった。これら植物のT3種子を回収し、それらの種子油の脂肪
酸組成を、GCによって分析した。データは表7に表される。この分析によって、pJP
3416−GA7構築物は、ホモ接合植物のT3種子で、分離するT2種子よりも高い量
のω3LC−PUFA DHAを生産することが明らかになった。最大約13.9%のD
HAがコロンビア背景で22.2と指定されたT3のpJP3416−GA7形質転換系
統で観察され、これは、ヘミ接合T2種子における約5.5%から増加し、種子脂質含有
量における総脂肪酸のパーセンテージとして、約24.3%の新ω3脂肪酸の合計量を伴
った。新ω6脂肪酸は、総脂肪酸の1.1%の量であり、新ω3脂肪酸:新ω6脂肪酸の
大変有利な比、すなわち約22:1を意味する。同様に、fad2変異体背景での形質転
換は、種子脂質含有量における総脂肪酸のパーセンテージとして、11.5%のDHAを
含む、20.6%の新ω3脂肪酸の合計をもたらした。
より高いDHA量を有するT3種子に関して表8に示される。系統22.2の種子におけ
るΔ12デサチュラーゼ転換効率は81.6%で、ω3デサチュラーゼ効率は89.1%
であり、双方とも著しく高く、これらの真菌(酵母菌)酵素は発育中の種子で良く機能で
きたことを示す。DHA経路における他の外因性酵素の活性はω3基質に対して同様に高
く、Δ6デサチュラーゼは42.2%効率、Δ6エロンガーゼは76.8%、Δ5デサチ
ュラーゼは95.0%、Δ5エロンガーゼは88.7%およびΔ4デサチュラーゼは93
.3%効率で作用した。ω6基質LA上のΔ6デサチュラーゼ活性はもっと低く、Δ6デ
サチュラーゼはLA上でたった0.7%の転換効率で作用した。GLAはたった0.4%
の量で存在し、最も高いDHA含有量を伴うT3種子で検知された20:2ω6を除いて
、唯一の新ω6産物であった。独立トランスジェニック種子の総種子脂質プロフィール(
表7)のまとめたデータが表9で示される。最も高いDHA量を有する系統に関するこの
データは、総ω6 FA(LAを含む)の総ω3 FA(ALAを含む)に対する0.1
0の比を含んだ。この系統の脂質における、新ω6 FA(LAを含まない)の新ω3
FA(ALAを含まない)に対する比は、0.05であった。総多価不飽和脂肪酸量は、
これらの系統で50%超であり、少なくとも4つの系統で60%超であった。全体的な転
換効率は次のように算出された:OAからEPA=21.8%、OAからDHA=18.
0%、LAからEPA=26.9%、LAからDHA=22.2%、ALAからEPA=
30.1%、ALAからDHA=24.9%。
らのT3種子を土壌に直接播き、得られたT3植物の成熟種子の脂肪酸組成をGCで分析
した。これらの種子の平均DHA量は、種子脂質の総脂肪酸のパーセンテージとして、1
3.3%±1.6(n=10)であった。表6で示される通り(右側の柱)、最も高い量
のDHAを有する系統は、種子脂質の総脂肪酸において15.1%のDHAを含んでいた
。酵素的転換効率が、オレイン酸からのDHA生産の各工程に関して、表8に示される。
む)に対する比は、0.102であった。最も高いDHA量を有する系統での新ω6 F
A(LAを含まない)の新ω3 FA(ALAを含まない)に対する比は、0.053で
あった。総飽和脂肪酸の量は約17.8%であり、一価不飽和脂肪酸の量は約18.1%
であった。総ω6脂肪酸の量は約5.7%であり、ω3脂肪酸の量は約55.9%であっ
た。全体的な転換効率は次のように算出された:OAからEPA=24.5%、OAから
DHA=20.1%、LAからEPA=29.9%、LAからDHA=24.5%、AL
AからEPA=32.9%、ALAからDHA=27.0%。総オメガ3脂肪酸は総脂肪
酸の55.9%まで蓄積することが発見された一方で、オメガ6脂肪酸は総プロフィール
の5.7%であった。
pJP3416−GA7構築物のT−DNAの単一または重複コピーのいずれかであった
が、トランスジェニック系統コロンビア#22は例外で、これは、アラビドプシス植物の
ゲノムに3つのT−DNA挿入を有した。T5世代種子もまた分析し、総種子脂質におい
て最大13.6%のDHAを有することが分かった。GA7構築物は、DHA生産能力の
観点からは、複数の世代を超えて安定であることが分かった。
様々な量のDHAを有するトランスジェニックA.タリアナ種子の油含有量を実施例1
で説明した通りGCで測定した。データは図6に示され、油含有量(種子の重量%油)を
DHA含有量(総脂肪酸のパーセンテージとして)に対してグラフ化している。種子1グ
ラムあたり最大26.5mgのDHAが観察された(表10)。トランスジェニックアラ
ビドプシスの油含有量は、DHA含有量と負で相関していることが分かった。種子の重量
あたりのDHA量は、約14%DHAを有する種子と比較して、約9%のDHA量を有す
る形質転換種子でより高かった。これがアラビドプシス以外の種子にもあてはまるかどう
かはまだ測定されていない。
上記のバイナリーベクターpJP3416−GA7を、A.ツメファシエンス株AGL
1に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換の
ためにフローラルディップ方法を用いてC.サティバ(カメリナサティバ)顕花植物を処
理した(LuおよびKang、2008)。植物の成長および成熟後、処理した植物のT
1種子を回収し、土壌に播き、得られた植物を除草剤BASTAで噴霧することで処理し
、pJP3416−GA7のT−DNA上に存在するbar選択マーカー遺伝子のトラン
スジェニックであり、pJP3416−GA7のT−DNA上に存在するbar選択マー
カー遺伝子を発現していた植物を選択した。除草剤に耐性を持ち、生き残ったT1植物を
、自家受精させた後に成熟するまで成長させ、得られたT2種子を回収した。5つのトラ
ンスジェニック植物が得られ、そのうち3つのみが全体のT−DNAを含んでいた。
ら脂質を抽出した。プール化した試料のうち2つは、大変低い、ほとんど検知できない量
のDHAを含んでいたが、3つ目のプールは約4.7%のDHAを含んでいた(表12)
。したがって、この植物の10個の各T2種子から脂質を抽出し、脂肪酸組成をGCで分
析した。この形質転換系統の各種子の脂肪酸組成データも表11に示される。総種子脂質
プロフィール(表11)をまとめたデータは表12に示される。
有さず、親植物のT−DNA挿入のヘミ接合性をもとに、T−DNAを有さなかった無効
分離体であると推定された。最も高い量のDHAを有する単一種子から抽出された脂質は
9.0%のDHAを有し、一方で、EPA、DPAおよびDHAの合計パーセンテージは
11.4%であった。形質転換の結果この種子で生産された新ω3脂肪酸(SDA、ET
rA、ETA、EPA、DPA、DHA)の合計パーセンテージは19.3%であり、一
方で、新ω6脂肪酸(GLA、EDA、DGLA、ARAおよびいずれかのω6伸長産物
)の対応する合計は、2.2%であり、GLAおよびEDAのみが新ω6脂肪酸として検
知された。総ω6FA(LAを含む)のω3FA(ALAを含む)に対する比は、0.4
4だと分かった。最も高いDHA量を有する種子の新ω6FA(LAを含まない)の新ω
3FA(ALAを含まない)に対する比は、0.12であった。総飽和脂肪酸の量は約1
7.8%であり、一価不飽和脂肪酸の量は約15.5%であった。総ω6脂肪酸の量は、
約20.4%であり、ω3脂肪酸の量は約46%であった。全体の転換効率は次のように
算出された:OAからEPA=15.6%、OAからDHA=12.3%、LAからEP
A=17.2%、LAからDHA=13.6%、ALAからEPA=24.8%、ALA
からDHA=19.6%。
のDHAを有するFD5−46−18−110事象で、最大10.3%のDHAが生産さ
れた。
クスレー、アセトンおよびヘキサン抽出を含む様々な方法を使用して、種子から油を抽出
している。
C.サティバをpJP3416−GA7で形質転換するさらなる実験を実施する。発明者
らは、種子油中の総脂肪酸のパーセンテージで10%超のDHA量が、さらに形質転換さ
れた系統およびで達成され、T−DNAに対してホモ接合である植物は20%のDHAま
で達成される推測する。20個のC.サティバGA7_modH事象を作製し、種子のD
HA含有量を分析している。3つのGA7_modB事象作製し、事象CMD17.1か
らのT1種子の分析は、9.8%のプール化種子DHA含有量を明らかにした。最も高い
単一種子DHA値は13.5%であることがわかった。
単一ベクターを用いたB.ナプス(セイヨウアブラナ)形質転換および脂肪酸組成の分析
バイナリーベクターpJP3416−GA7を使用して、形質転換セイヨウアブラナ植
物およびその植物からの種子を作製した。標準的なエレクトロポレーション手法を介して
、上記のベクターpJP3416−GA7をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株A
GL1に導入した。トランスジェニックアグロバクテリウム細胞の培養物を、150rp
mでの振動を伴って、28℃のLB培地で一晩成長させた。細菌細胞を5分間の4000
rpmでの遠心分離によって回収し、Winans AB培地(Winans、1988
)で洗浄し、10mLのWinans AB培地(pH5.2)に再懸濁し、カナマイシ
ン(50mg/L)、リファンピシン(25mg/L)および100μΜアセトシリンゴ
ンの存在下で一晩成長を続けた。ブラシカ細胞の感染の2時間前に、スペルミジン(12
0mg/L)を添加し、細菌の最終密度を新しいAB培地で0.3〜0.4のOD600
nmまで調節した。1/2MS(MurashigeおよびSkoog、1962)で成
長した8日目のセイヨウアブラナ実生から新たに単離した子葉柄または1mg/Lのチジ
アズロン(TDZ)および0.1mg/Lのα−ナフタレン酢酸(NAA)を伴うMS培
地上で3〜4日で事前に条件を整えた胚軸断片を、10mLのアグロバクテリウム培養物
で5分間感染した。アグロバクテリウムで感染した外植片を次いで滅菌フィルター紙にブ
ロットして余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤(L−システイン50m
g/Lおよびアスコルビン15mg/L)を添加した、または添加していない、同時培養
培地(1mg/LのTDZ、0.1mg/LのNAAおよび100μΜアセトシリンゴン
を伴うMS培地)に移した。全プレートをパラフィルムで密封し、23〜24℃の暗所で
48時間インキュベートした。
ンを含む滅菌蒸留水で10分間洗浄し、滅菌蒸留水で10分間すすぎ、滅菌フィルター紙
上にブロットして乾燥し、事前選択培地(1mg/LのTDZ、0.1mg/LのNAA
、20mg/Lの硫酸アデニン(ADS)、1.5mg/LのAgNO3、250mg/
Lのセフォタキシムおよび50mg/Lチメンチンを含むMS)に移し、16時間/8時
間の光周期で、5日間24℃で培養した。次いで、形質転換細胞の選択のための作用剤と
して1.5mg/Lのグルフォシネートアンモニウムを伴う選択培地(1mg/LのTD
Z、0.1mg/LのNAA、20mg/LのADS、1.5mg/LのAgNO3、2
50mg/Lのセフォタキシムおよび50mg/Lのチメンチンを含むMS)にそれらを
移し、同じ培地上で、隔週で継代培養しながら、16時間/8時間の光周期で、24℃に
て4週間培養した。緑色のカルスを伴う外植片を発芽開始培地(1mg/Lのキネチン、
20mg/LのADS、1.5mg/LのAgNO3、250mg/Lのセフォタキシム
、50mg/Lのチメンチンおよび1.5mg/Lのグルフォシネートアンモニウムを含
むMS)に移し、もう2〜3週間培養した。耐性外植片から生まれた芽を芽伸長培地(0
.1mg/Lのジベレリン酸、20mg/LのADS、1.5mg/LのAgNO3、2
50mg/Lのセフォタキシムおよび1.5mg/Lのグルフォシネートアンモニウムを
含むMS培地)に移し、もう2週間培養した。2〜3cmの長さの健康的な芽を選択し、
発根培地(1mg/LのNAA、20mg/LのADS、1.5mg/LのAgNO3お
よび250mg/Lのセフォタキシムを含む1/2MS)に移し、2〜3週間培養した。
根を伴う良く確立された芽を、実生成長ミックスを含むポットに移し、2週間成長キャビ
ネットで成長させ、引き続き、温室に移した。この方法で、GA7構築物で形質転換した
およそ40(T0)の植物を得た。
を、実施例1に記載される通り、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。最も高
いDHA量を有する形質転換系統に関するデータが表13で示される。平均的なDHA量
は、pJP3416−GA7のT−DNAで形質転換したB.ナプス種子の種子油におい
て、同じ構築物で形質転換したA.タリアナ種子(実施例2)またはカメリナ種子(実施
例3)よりも、著しく低かった。およそ40の系統の中で最も高い量のDHAは1.52
%であり、トランスジェニック系統の大部分は検知可能なDHAを有した。これらの種子
のなかに、総脂肪酸の約35%である相当な蓄積のALAがあり、これはSDAまたは経
路で続く産物に効率的に変換されていなかったことが留意された。
して、トランスジェニック種子で生産されたDHAの量をより良く測定した。種子は、0
%(無効種子)と8.5%の間のDHAを含むことがわかった(表13)。
子をいくつか播いて、後代植物を作製した。GA7構築物が、同一構築物を有するトラン
スジェニックA.タリアナおよびC.サティバと比較して、なぜDHA生産に関して不十
分に作用し、および、pJP3115およびpJP3116上の遺伝子の組み合わせと比
較してなぜ不十分に作用したのかを決定するために、これら植物の発育中の胚から単離し
た総RNAに対してRT−PCRを実施した(下)。一段階RT−PCRキット(インビ
トロゲン社)および各導入遺伝子を標的する遺伝子特異的プライマーを用いて、RT−P
CRを総RNAに対して行った。これによって、GA7構築物の各遺伝子は、形質転換種
子の大部分で不十分に発現したΔ6デサチュラーゼを除いて、B.ナプス形質転換体で良
好に発現することが確認された。この構築物からの他の遺伝子は、B.ナプスおよびA.
タリアナ種子の双方で良く機能し、たとえば、Δ12およびΔ15デサチュラーゼはオレ
イン酸量を減らす一方で種子のLAおよびALAの増加した量を生産するように機能した
。代表的なRT−PCRゲルは、図7に示され、これは、pJP3416−GA7の他の
導入遺伝子と比較して、Δ6デサチュラーゼの低発現を明らかに示す。
有する系統の後代を植え付けることで、作製する。
B.ナプスの別の実験において、および、導入遺伝子を導入するための代替形式として
、国際公開第2010/057246号に記載されるバイナリーベクターpJP3115
およびpJP3116を使用して、形質転換B.ナプス植物を別々に作製し、形質転換種
子をその植物から得た。pJP3115上のT−DNAは、クレピス・パレスチナ(Cr
epis palestina)Δ12デサチュラーゼ、ミクロモナス・プシラΔ6デサ
チュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ6エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ5デサ
チュラーゼをコードするキメラ遺伝子を含み、pJP3116上のT−DNAはペルリア
・フルテスケンス(Perilla frutescens)Δ15デサチュラーゼ、ピ
ラミモナス・コルダタΔ5エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ4デサチュラーゼを含
んでいた。2つのT−DNAは、一緒に存在し、発育中の種子に発現された場合、内因的
に生産されたオレイン酸からDHAを生産するための7遺伝子経路を形成した。これらの
ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に、標準的なエレクトロポ
レーション手法で導入し、形質転換した細胞を独立して使用し、上記の方法を用いてB.
ナプスを形質転換し、安定的に形質転換したT0植物を作製した。29のpJP3115
および19のpJP3116形質転換体を得て、これらの植物を成熟するまで成長させ、
自家受精の後に得られた種子を、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。pJP
3115のT−DNAでの形質転換は、内因的に生産されたALAからのEPA生産につ
ながると予測された一方で、pJP3116のT−DNAでの形質転換はLAからのAL
A生産増大につながると予測された。これらの表現型を示す植物を複数同定した。事象の
大部分は、低量のEPA生産を伴うΔ12不飽和化のために、低下したOA/増大したL
A表現型を示した。最大2.6%のEPAがpJP31115トランスジェニック種子プ
ールで観察された。同様に、pJP3116事象の大部分はΔ15デサチュラーゼ活性の
ために増大したALA表現型を有することが分かった。最大18.5%のALAがpJP
3116のT−DNAで形質転換したプール種子で発見された。
た事象の後代種子(F1)のDHA含有量を分析した。DHAは、これらの事象のうち1
7個で発見され、最大1.9%のDHAがこれらの事象のプール種子で発見された。単一
種子分析を実施して、DHA生産の範囲を決定し、そのデータが表14に示される。広い
範囲のDHA量が交雑子孫で観察され、おそらく、親植物でのT−DNAのヘミ接合性質
のためであり、その結果、いくつかの種子は双方のT−DNAを受け取らなかった。最大
6.7%のDHAが全種子脂質で観察された。
によると、最も高い量のDHAを有する種子での全ω6FA(LAを含む)のω3FA(
ALAを含む)に対する比は、3.34であった。新ω6FA(LAを含まない)の新ω
3FA(ALAを含まない)に対する比は1.39であった。総飽和脂肪酸の量は、約1
3.7%であり、一価不飽和脂肪酸の量は約21.8%であった。総ω6脂肪酸の量は4
6.4%であり、ω3脂肪酸の量は約14.8%であった。全体の転換効率は次のように
算出された:OAからEPA=12.8%、OAからDHA=8.5%、LAからEPA
=15.7%、LAからDHA=10.4%、ALAからEPA=72.1%、ALAか
らDHA=47.9%。pJP3115およびpJP3116の組み合わせでの本実験で
観察されたω6脂肪酸からω3脂肪酸の転換の効率の低下は、ALAからDHAの転換の
ための遺伝子と組み合わせた場合、真菌Δ15/ω3デサチュラーゼと比較して、植物Δ
15デサチュラーゼの効率がより低い(実施例2および3)ためであると考えられた。
製する。
B.ナプスでのDHA生産量を実施例4に記載される量を超えて改善するために、バイ
ナリーベクターpJP3416−GA7−modA、pJP3416−GA7−modB
、pJP3416−GA7−modC、pJP3416−GA7−modD、pJP34
16−GA7−modEおよびpJP3416−GA7−modFを次のように作製した
。これらのバイナリーベクターは、実施例2に記載されたpJP3416−GA7構築物
の変異形であり、特にΔ6デサチュラーゼおよびΔ6エロンガーゼ機能を改善することで
、植物種子でのDHAの合成をさらに増大するように設計した。Δ5エロンガーゼと比べ
て比較的低い伸長効率のために、GA7構築物で形質転換したある種子では、SDAが蓄
積されるのが観察されていたので、他の改変の中で、2つのエロンガーゼ遺伝子配置をT
−DNAで交換した。
SbfI部位間にクローニングし、P.コルダタΔ5エロンガーゼカセットと取り換える
ことで、pJP3416−GA7における2つのエロンガーゼコード配列を、T−DNA
上でのそれらの配置を交換し、pJP3416−GA7−modAを得た。M.プシラΔ
6デサチュラーゼを促進するFP1プロモーターをコンリニンCnl2プロモーター(p
LuCnl2)と交換することで、この構築物をさらに改変し、pJP3416−GA7
−modBを得た。Δ6デサチュラーゼ発現を増大、それによって酵素効率を増大させる
試みの中でこの改変を行った。Cnl2プロモーターは、切断ナピンプロモーターよりも
より高い導入遺伝子の発現をB.ナプスにもたらし得ると考えられた。少し異なるコドン
使用頻度を伴う第2のM.プシラΔ6デサチュラーゼカセット(配列番号15)を添加す
ることにより、pJP3416−GA7−modCを作製し、pJP3416−GA7−
modBの右境界のちょうど内側のPmeI部位に挿入したFP1プロモーターで促進し
た。Δ6デサチュラーゼ発現量を増大し、複数のプロモーターの使用によってΔ6デサチ
ュラーゼの発現のための種子発育間の期間を延ばすために、第2のΔ6デサチュラーゼカ
セットを双方のpJP3416−GA7−modBおよびpJP3416−GA7−mo
dFに添加した。2つの核配列で異なるコドン使用頻度を使用して、同一T−DNA内で
の類似したコード領域の同時抑制の恐れのない、同一タンパク質配列の翻訳につながった
。pJP3416−GA7−modDおよびpJP3416−GA7−modEは、配列
番号1のヌクレオチド16649〜17816に対応する3番目のMAR配列がPmeI
部位にてそれぞれpJP3416−GA7およびpJP3416−GA7−modBに添
加された類似変異形であった。天然Δ6デサチュラーゼヌクレオチド配列を含む第2のM
.プシラΔ6デサチュラーゼカセットを添加することで、pJP3416−GA7−mo
dFを作製し、pJP3416−GA7−modBの右境界のPmeI部位にあるFP1
プロモーターで促進した。pJP3416−GA7−modGを、まず始めにAscI−
PacI部位での制限クローニングによってM.プシラΔ6デサチュラーゼカセットをC
nl2:P.コルダタΔ5エロンガーゼカセットで置き換えることで作製した。次いで、
SbfI部位での制限クローニングによって本来のFAE1:P.コルダタΔ5エロンガ
ーゼカセットをFAE1:M.プシラΔ6デサチュラーゼカセットで交換することで、p
JP3416−GA7−modGを作製した。これらの遺伝子構築物のそれぞれのT−D
NAのヌクレオチド配列は、次のように示される:pJP3416−GA7−modB(
配列番号2)、pJP3416−GA7−modC(配列番号3)、pJP3416−G
A7−modD(配列番号4)、pJP3416−GA7−modE(配列番号5)、p
JP3416−GA7−modF(配列番号6)およびpJP3416−GA7−mod
G(配列番号7)。
odC、pJP3416−GA7−modD、pJP3416−GA7−modE、pJ
P3416−GA7−modFおよびpJP3416−GA7−modGを使用して形質
転換したブラシカ体細胞胚ならびにセイヨウアブラナ、カメリナ・サティバおよびシロイ
ヌナズナ植物および後代種子を作製する。pJP3416−GA7−modBに関するデ
ータが次の実施例で示される。
び15個のトランスジェニックpJP3416−GA7−modG A.タリアナ事象を
作製した。プール化したpJP3416−GA7−modB種子において3.4%と7.
2%との間のDHAが観察され、プール化したT2 pJP3416−GA7−modG
種子において0.6と4.1%との間のDHAが観察された。最も高いpJP3416−
GA7−modB事象のいくつかを選択培地上に播き、生き残った実生を次の世代まで持
って行った。種子のDHA含有量が分析されている。プール化したT1種子は導入遺伝子
に対して分離している群を示し、いずれかの無効分離体を含んでいたので、後代植物のホ
モ接合種子は種々油中最大20%の総脂肪酸含有量である増大した量のDHAを有するで
あろうと予測される。他の改変構築物を使ってA.タリアナを形質転換した。ほんの少数
の形質転換系統しか得られなかったが、どれもmodB構築物よりも高い量のDHAをも
たらさなかった。
005と呼ばれる育種系統の形質転換B.ナプス植物を作製した。Oscar形質転換に
関しては10個の独立形質転換植物(T0)を、NX005に関しては20個の独立系統
をこれまでに得た。種子(T1種子)をこれらのトランスジェニック系統から回収した。
種子のプールを、種子油中DHA量に関して試験し、最も高い量を示した2つの系統を選
択し、これらを系統CT132.5(品種Oscarで)およびCT133.15(NX
005で)と名付けた。CT132.5から20個の種子およびCT133.15から1
1個の種子を水に浸し、2日後、各種子それぞれの子葉半分から油を抽出した。胚軸を伴
うもう片方の子葉を培地上で維持および培養し、特定の後代系統を維持した。油中脂肪酸
組成を決定した;CT132.5に関するデータが表16に示される。分析した20の種
子のうちの10個におけるDHA量は、GC分析で測定された総脂肪酸含有量の7〜20
%の範囲にあった。他の種子は7%未満のDHAを有し、pJP3416−GA7−mo
dB由来のT−DNAの部分(不完全)コピーを含み得た。トランスジェニック系統は遺
伝子的に結合していない複数の導入遺伝子挿入を含んでいるように見えた。トランスジェ
ニック系統CT133.15の種子は、0〜5%の範囲のDHA量を示した。DHAを有
さない種子は無効分離体になる可能性が高かった。これらのデータによって、modB構
築物はキャノーラ種のDHA生産に関して良好に働くことが確認された。
築物を使って形質転換したカメリナ・サティバ植物を作製した。少なくとも24個の独立
形質転換植物(T0)を得、後代分析によってさらに細かく調査した。種子(T1種子)
をこれらのトランスジェニック系統から回収した。種子のプールを種子油中DHA量に関
して試験し、最も高いDHA量(6%と9%との間)を示す6個の系統を選択した。各系
統からの20個のT1種子のDHA量を分析し、多くの種子はGC分析で測定された総脂
肪酸含有量の6〜14%の範囲でDHAを示した。油中脂肪酸組成を決定した;複数のト
ランスジェニック種子に関するデータが表17に示される。これらのデータによって、m
odBおよびmodF構築物は双方ともカメリナ属でのDHA生産に関して良好に働くこ
とが確認された。
転換体に比べて複数コピーT−DNA形質転換体においてより活発であり得、また、経路
で制限している可能性がある酵素をコードする複数の遺伝子をT−DNAに挿入すること
で増大し得ることを企図した。複数コピー形質転換体の可能性のある重要性の証拠はGA
7構築物で形質転換したアラビドプシス種子(実施例2)に見られ、ここでは、最も多収
性であるDHA事象は、宿主ゲノムに挿入された3つのT−DNAを有した。複数の遺伝
子は同一であり得、または、好ましくは、同一のポリペプチドをコードする異なる変異形
であり、または、重複した発現パターンを有する異なるプロモーターの制御下にある。た
とえば、増加した発現は、同一タンパク質が生産される場合でも、複数のΔ6デサチュラ
ーゼコード領域の発現によって達成され得る。pJP3416−GA7−modFおよび
pJP3416−0A7−modCでは、たとえば、M.プシラΔ6デサチュラーゼの2
つのバージョンが存在し、異なるプロモーターによって発現された。コード配列は異なる
コドン使用頻度を有し、したがって、異なるヌクレオチド配列を有して、可能性のあるサ
イレンシングまたは同時抑制効果を軽減したが、同一タンパク質の生産につながった。
種子特異的プロモーターの制御下である種子中の遺伝子構築物の発現を予測する迅速ア
ッセイシステムを作るために、体細胞胚システムをセイヨウアブラナに準備した。これに
は、体細胞胚形成の開始に関わるLEC2転写因子を発現するベクターが使用された。実
演として、バイナリーベクター35S:LEC2およびpJP107(Petrie e
t al.、2010aおよびb)をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1
に標準的なエレクトロポレーションを介して導入し、そのアグロバクテリウム形質転換体
を使用して同時培養によってセイヨウアブラナを同時形質転換した。pJP107のT−
DNA領域はイソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)Δ9エ
ロンガーゼ、P.サリナΔ8デサチュラーゼおよびP.サリナΔ5デサチュラーゼをコー
ドする遺伝子を含んでおり、各遺伝子は種子特異的プロモーターによって発現された。対
照形質転換には35S:LEC2ベクターが単独で用いられた。35S:LEC2発現は
、実施例1に記載される形質転換B.ナプスカルス組織に直接由来する組織培養物での体
細胞胚の形成につながった。
形質転換LEC2遺伝子の存在下でトランスジェニック体細胞胚に発現され、機能してL
AからARA(20:4Δ5、8、11、14)およびALAからEPA(20:5Δ5
、8、11、14、17)を生産することが示された。3つの同時形質移転間体細胞胚に
関するデータが表18に示され、それぞれの脂肪酸組成を、pJP107のT−DNAの
遺伝子を導入し、pJP107のT−DNAを発現したセイヨウアブラナ種子の種子油の
脂肪酸組成と比較した(Petrie et al.、2010aおよびb)。安定的に
形質転換した種子プロフィールと比較した場合、ARAならびに中間脂肪酸EDA(20
:2ω6)およびDGLA(20:3ω6)の類似した総パーセンテージおよび転換効率
が体細胞胚組織で観察された。安定なT2トランスジェニック種子および体細胞胚の脂肪
酸組成において類似した結果が観察された:ω6脂肪酸はそれぞれ26.6%および25
.6%(平均)の量である一方で、ARA量はそれぞれ9.7%および10.6%(平均
)であることが分かった。
ィールは、逆相関して減少する18:3Δ9、12、15および増加する18:1Δ9を
伴う、さらに胚様であるプロフィールに変化することが発見された(図8)。これらの結
果によって、体細胞胚は確実に性質上種子のようになっており、pJP107のT−DN
Aの上の遺伝子は発現されたことが示された。これは、体細胞胚システムが、トランスジ
ェニック植物およびそれからの成熟種子を作製する全プロセスを必要とせずに、B.ナプ
スのトランスジェニック種子特異的構築物の迅速な性質決定を可能にすることを示した。
JP3416−GA7−modBおよびpJP3416−GA7−modDで形質転換し
た。modBからは18個、modDからは24個である、42個の胚を得た。全ての脂
質を胚から抽出し、脂肪酸組成を分析した。胚は、0%と最大16.9%との間のDHA
を含んでいた(表19)。0%のDHAの結果は、部分的T−DNAのみの組込みまたは
ゲノムの転写的に不活動な領域への挿入のためであると推定された。総ω3FA(ALA
を含む)の総ω6FA(LAを含む)に対する比は胚#270に関しては2.3、胚#2
84に関しては11.96であることが分かった。総ω6FA(LAを含む)の総ω3F
A(ALAを含む)に対する比は#284に関して0.08であった。新ω6FA(LA
を含まない)の新ω3FA(ALAを含まない)に対する比は、#284に関しては0.
03であった。全体の転換効率は次のように算出された:(胚#270、#284に関し
て)OAからEPA=14.0%、29.8%;OAからDHA=9.7%、24.2%
;LAからEPA=15.4%、30.7%;LAからDHA=10.7%、25.0%
;ALAからEPA=22.1%、33.3%;ALAからDHA=15.3%、27.
0%。これらの効率は、pJP3416−GA7−modBベクターがB.ナプス細胞で
良好に機能できることを示したT3 pJP3416−GA7アラビドプシス系統に関し
て観察されたものに類似しており、または、#284の場合は、pJP3416−GA7
−modBベクターがB.ナプス細胞で良く機能できることが示されたT3 pJP34
16−GA7アラビドプシス系統に関して観察されたものよりも大きかった。SDA量は
3.0%未満であり、Δ6エロンガーゼはGA7構築物よりもさらに良好に作用していた
ことを示す。#284で達成されたそれぞれの酵素効率は次の通りであった:Δl2デサ
チュラーゼ、97.4%;ω3−デサチュラーゼ、92.3%;Δ6デサチュラーゼ、3
8.2%;Δ6エロンガーゼ、88.2%;Δ5デサチュラーゼ、98.8%;Δ5エロ
ンガーゼ、94.1%;およびΔ4デサチュラーゼ、86.3%。総飽和脂肪酸は21.
2%であり、総一価不飽和脂肪酸は10.2%であり、総多価不飽和脂肪酸は68.6%
であった。
されたなかで、これは一番高い量のDHAであったと考える。これによって、pJP34
16−GA7−modBにおける改変は、pJP3416−GA7と比較して、Δ6デサ
チュラーゼ遺伝子の発現量を増大するのに効果的であることも実証された。上記のバイナ
リーベクターpJP3416−GA7、pJP3416−GA7−modA、pJP34
16−GA7−modC、pJP3416−GA7−modD、pJP3416−GA7
−modEおよびpJP3416−GA7−modFを35S:LEC2と同時形質転換
し、形質転換B.ナプス体細胞胚を作製する。modD胚では最大7.0%のDHA、m
odE胚では9.9%のDHA、modF胚では8.3%のDHA、少数のmodG胚で
は3.6%のDHAが観察された。
形質転換A.タリアナ種子のTAG上のDHAの位置分布をNMRで決定した。およそ
200mgの種子から、初めにそれらをヘキサン下でつぶし、つぶした種子を、10mL
ヘキサンを含むガラス管に移すことで、全ての脂質を抽出した。管をおよそ55℃の水浴
内で温め、次いで撹拌および遠心分離した。ヘキサン溶液を除去し、その手順をさらに4
×10mLで繰り返した。抽出物を1つにまとめ、ロータリーエバポレーションによって
濃縮し、ヘキサン中20mLの7%ジエチルエーテルを用いた短いシリカカラムを通過さ
せることで、抽出脂質内のTAGを極性脂質から精製した。精製TAG上のアシル基の位
置分布を以前に説明された通り量的に決定した(Petrie et al.、2010
aおよびb)。
sn−2位置にはほとんど発見されないことが示された(図9)。これは、50%のAR
A(20:4Δ5、8、11、14)がトランスジェニックキャノーラ油のsn−2位置
に位置する一方で、33%のみが無作為な分布であると予測されることを示したARA生
産種子のTAGとは対照的である(Petrie et al.、2012)。
質転換したB.ナプス種子のTAGにおけるDHAの位置分布は基本的に同じ方法で決定
される。
って分析し、主要なDHA含有トリアシルグリセロール(TAG)種を決定した(図10
)。最も多くDHAを含むTAG種は、DHA−18:3−18:3(TAG58:12
;位置分布を説明しない命名法)であり、2番目に多いのはDHA−18:3−18:2
(TAG58:11)であることが分かった。低いが検知可能な量ではあるが、Tri−
DHA TAG(TAG66:18)が総種子油に観察された。他の主要なDHA含有T
AG種には、DHA−34:3(TAG56:9)、DHA−36:3(TAG58:9
)、DHA−36:4(TAG58:10)、DHA−36:7(TAG58:13)お
よびDHA−38:4(TAG60:10)が含まれていた。2つの主要なDHA含有T
AGの同一性は、Q−TOF MS/MSによってさらに確認された。
GA7遺伝子構築物を用いた、15%量でのアラビドプシス種子のDHAの効率的な生
産を実施例2で実証した。セイヨウアブラナ種子における同じ構築物は、主にこの種のG
A7のΔ6でサンチュラーゼ遺伝子の不十分な発現のために、形質転換体の多く(全てで
はない)で約1.5%のDHAしか生産しなかった(実施例4)。GA7構築物の改変は
Δ6デサチュラーゼ遺伝子発現問題を克服するであろうという認識に基づいて(実施例5
を参照、実施例6で実証された)、計算を実施し、JP3416−GA7の変異形から遺
伝子を発現すし、ここで、各導入遺伝子をコードした酵素が、GA7構築物を有するA.
タリアナで観察されたのと同じくらい効率的に作用していたB.ナプストランスジェニッ
ク種子の、あり得る脂肪酸プロフィールを決定した。3つの計算に対して予測される脂肪
酸組成(#1、#2、#3)が表20に示される。これは、59%オレイン酸、20%L
Aおよび8%ALAを含んでいたB.ナプスに関する野生型(非形質転換)脂肪酸組成に
基づいた。表の下半分に示される3つの予測された部分的脂肪酸プロフィールは、表の上
半分で示される各酵素的工程の転換効率に基づいた。予測#2では、75%効率のΔ12
不飽和化、75%のΔ15不飽和化、35%のΔ6不飽和化、80%のΔ6伸長化、90
%のΔ5不飽和化、90%のΔ5伸長化および90%のΔ4不飽和化の組み合わせが、一
般的なキャノーラトランスジェニック種子でのおよそ10%のDHAの生産につながるで
あろう。これらの効率は全て、アラビドプシスで見られるそれぞれの効率より低いまたは
ほぼ同じであったため、予測#2は控えめな推定を意味した。#3に列挙される転換効率
は、pJP3416−GA7で形質転換したA.タリアナで見られる効率的な転換に基づ
いた概算である。DHAは、B.ナプスで生産される種子油の総脂肪酸含有量の約15%
で生産されると予測され、A.タリアナで観察された最も効率的な生産量を反映した結果
であった。ホモ接合状態での複数のT−DNAの挿入は、B.ナプスでDHA量を20%
まで増やすと期待される。
バイナリーベクター構築
葉組織でのEPAの合成のための植物へのT−DNA導入のために、バイナリーベクタ
ーpORE04+11ABGBEC_ササゲ_EPA_挿入断片(配列番号8)を設計し
た。このバイナリーベクターは、酵素:M.プシラΔ6デサチュラーゼ(配列番号16)
、P.コルダタΔ6エロンガーゼ(配列番号:25)およびP.サリナΔ5デサチュラー
ゼ(配列番号30)をコードするキメラ遺伝子を含んでおり、それぞれは、CaMV35
SおよびA.タリアナRubisco小サブユニット(SSU)プロモーターの制御下で
あった(図9)。配列番号2の領域199〜10878を合成し、これをBsiWIおよ
びKasI部位で受容バイナリーベクターpORE04(Coutu et al.、1
997)内にクローニングすることで、バイナリーベクターを作製した。3つの脂肪酸生
合成遺伝子は、ALA、18:3Δ9、12、15からEPA、20:5Δ5、8、11
、14、17に変換するのに必要な酵素をコードした。
構築物が正しく、葉組織で効率的に遺伝子を発現することを試験するために、キメラベ
クターpORE04+11ABGBEC_ササゲ_EPA_挿入断片をA.ツメファシエ
ンス株AGL1に導入した。キメラベクター35S:p19もA.ツメファシエンス株A
GL1に実施例1で説明された通り導入した。これらの培養物からの細胞を、24℃の成
長室でベンサミアナタバコ植物の葉組織内に浸潤させた。同じ葉の両面に位置する比較中
の試料に、複数の直接比較物を湿潤させた。実験は3通りで実施された。浸潤に続いて、
実施例1に説明されるGCによる脂肪酸プロフィール分析のために葉ディスクを取り出す
前に、植物をさらに5日間成長させた。GC分析によって、EPAベクターはベンサミア
ナタバコ葉で機能してEPAを生産し(表21)、最も高い量のEPAは総葉脂質の10
.7%であったことが明らかになった。
キメラベクターpORE04+11ABGBEC_ササゲ_EPA_挿入断片を使って
、ニコチアナ・タバカムを安定に形質転換した。ベクターをA.ツメファシエンス株AG
L1に標準的なエレクトロポレーション手法を介して導入した。形質転換した細胞を、カ
ナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(25mg/L)を添加した固相LB
培地で成長させ、28℃で2日間インキュベートした。単一のコロニーを用いて新しい培
養を開始した。48時間の活発な培養に続いて、細胞を2,000x gでの遠心分離に
よって回収し、上澄みを除去した。細胞を50%LBおよび50%MS培地をOD600
=0.5の密度で含む新しい溶液に再懸濁した。
約0.5〜1cm2の正方形の断片に切り、一方でA.ツメファシエンス溶液に浸した。
A.ツメファシエンスに浸した、傷をつけたN.タバカム葉断片を、滅菌フィルター紙上
にブロットして乾燥し、および添加物なしのMSプレートに移動する前に、室温で10分
間放置させた。24℃での2日間の同時培養期間に続いて、外植片を滅菌の液体MS培地
で3回洗浄し、次いで滅菌フィルター紙でブロットして乾燥し、1.0mg/Lベンジル
アミノプリン(BAP)、0.25mg/Lインドール酢酸(IAA)、50mg/Lカ
ナマイシンおよび250mg/Lセフォタキシムを添加した選択MS寒天上に置いた。プ
レートを24℃で2週間インキュベートし、形質転換N.タバカム葉断片を発芽させた。
25μg/LのIAA、50mg/Lノカナマイシンおよび250mg/Lのセフォタキ
シムを添加したMS寒天培地を含む200mLの組織培養ポットに移した。トランスジェ
ニック芽を室温で根付かせ成熟するまで成長させた後、土壌に移した。十分大きな葉ディ
スクを21個の成熟トランスジェニック植物から取り、実施例1に記載される通りに脂肪
酸プロフィールを分析した。全てのトランスジェニック試料がEPAを含むことが分かり
(表21)、ヘミ接合の1次形質転換体で最も高い量のEPAは総葉脂質の12.1%で
あることが分かった。葉試料は、それらの脂質の中に少量(0.5%未満)のDPAも含
み、これは、Δ6エロンガーゼの低量のΔ5伸長活性によるEPAの伸長に起因した。総
ω3FA(ALAを含む)のω6FA(LAを含む)に対する比は、2.7であることが
分かった。全体的な転換効率は次のように算出された:OAからEPA=18.4%、L
AからEPA=18.9%、ALAからEPA=25.9%。12.1%のEPAの生産
は、特にその事象がヘミ接合の1次転換体であったため、注目すべきである。特にALA
からEPAへの効率は、安定種子形質転換体で観察されたものに近い。構築物がΔ12ま
たはΔ15デサチュラーゼを含んでおらず、OAおよびLAからALAへの転換を増大し
たのは注目に値する。増加した効率はこれらの活性の加算で予測される。
いる。
は良く発芽し、T2世代を確立した。EPAの無効(EPA無し)系統に対する比は、事
象#28が単一遺伝子座であることを示し、したがってこの系統のT3世代も確立した。
T3群の脂肪酸プロフィール分析は、導入遺伝子が、無効事象は一切見つからず、安定し
た量のEPAを伴ったホモ接合であったことを示した。全体のT3群の総葉脂質における
EPAの平均量は、9.4%±0.3(表22)であることが分かった。
結乾燥した葉材料から抽出し、薄膜クロマトグラフィー(TLC)によって分画化した。
EPAはN.タバカムTAGに最大30.1%で、ならびに、極性脂質に6.3%で存在
したことが分かった(表23)。トランスジェニック経路によって生産されるEPAが、
TAG、MGDG、DGDG、SQDG、PG、PC、PE、PIおよびPSを含む評価
された総脂質分画に存在したことに留意するのは興味深い。総脂質プールは、低量の新規
中間体またはω6LC−PUFA脂肪酸を、新規ω3のω6脂肪酸に対するTAG比が1
0:1の状態で含んでいた。
キメラベクターpORE04+11AB GBEC−ササゲ−EPA−挿入断片をササ
ゲ(ビグナ・ウンギクラタ)に次の通りに形質転換した。成熟した乾燥種子が好ましい出
発材料であるが、種子が最大新鮮重量である未熟なさやから回収した種子を使用してもよ
い。乾燥種子を手で脱穀し、種子の皮が破けるのを避け、したがって、微生物との混入を
低減する。
漂白剤(8.4g/Lの次亜塩素ナトリウム最終濃度)で30分間処理する。種子を次い
で滅菌水で複数回洗浄する。未熟な種子をさやから無菌的に取り除き、一方で成熟種子を
一晩水に浸した。2つの異なる外植片を、複数の芽作製のために使用し得、すなわち、胚
軸および子葉そのもの、好ましくは二分した胚軸が付着した子葉である。芽および根端を
、子葉節、すなわち、軸の子葉への付着点に傷をつける前に、軸から取り除く。19個の
品種および系統の初期比較から、ササゲのほとんどの系統は形質転換され得ることが現在
明確であり、唯一の注意は異なる組織培養条件が各系統のために最適化される必要がある
ということである。
ロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1はササゲ形質転換に好ましい株である。p
ORE04+11ABGBEC−ササゲ−EPA−挿入断片ベクターを含むアグロバクテ
リウムを180rpmの振とう器で28℃にて一晩培養し、懸濁物を8000gで10分
間遠心分離にかけ、培地1(10分の1に希釈し、30g/lのスクロース、加圧滅菌の
前にpH5.6に調節し、フィルターを滅菌したMS−ビタミンを添加した20mMの2
−MES、100mg/lのミオイノシトール、1.7mg/lのBAP、0.25mg
/lのGA3、0.2mMのアセトシリンゴン、250mg/lの
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、150mg/lのジチオスレイトールおよび0.4g/lのL−システインを含むMS
塩基性培地)に再懸濁する。メスで分裂領域に傷をつけてから、外植片を振らずに細菌懸
濁物に1時間浸す。処理した外植片を次いで滅菌フィルター紙上にブロットし、フィルタ
ー紙をかけた固定培地2(0.8%寒天を含む培地1)に移す。同時培養の4日後、発芽
および形質転換した芽の選択のために、外植片を培地3(100mg/lのミオイノシト
ール、150mg/lのチメンチン、30g/Lのスクロース、3mMのMES、1.7
mg/LのBAP、5mg/LのPPTまたは25〜50mg/Lのジェネテシンまたは
150mg/Lのカナマイシン、0.8g/Lの寒天を添加し、pH5.6に調節した全
強度MS培地)に移す。2週間後、初めの芽が見られる。子葉を子葉節領域から取り除き
、培養物を新しい培地3に移す。死組織および瀕死の組織の除去に続いて、2週間ごとに
培養物を新しい培地3に移す。初めの4つの継代培養物はカナマイシン選択上にあり、続
いてジェネテシンおよびカナマイシンと交互にする。6継代培養後、生き残った若芽を、
芽伸長のために、培地4(BAPを含まないが0.5mg/lのGA3、50mg/lの
アスパラギン、0.1mg/lの3−インドール酢酸(IAA)、150mg/lのチメ
ンチンおよびPPT(10mg/1)、ジェネテシン(50mg/L)またはカナマイシ
ン(150mg/L)のいずれかを添加した培地3)に移す。それぞれの芽が1cmの長
さを超えるまで芽を2週間ごとに継代培養する。選択下でのさらなる成長のために、より
大きなこれらの芽をペトリ皿から培養瓶(高さ80mm)に移す。
囲室温条件に移す前に14〜21日間高湿度室で根付かせた。
−システイン、ジチオスレイトールおよびチオ硫酸ナトリウムの添加によって傷をつけた
組織の褐色化を緩和する。
は次の工程から成る:滅菌化成熟種子を一晩水に浸す、その結果、その種子を縦に二分化
することで外植片を導く、割れた胚軸(芽および根尖部は取り除かれている)は子葉にま
だ付着している、分裂領域を局所的に傷つけることで補助されるアグロバクテリウム株A
GL1との感染、チオール化合物を含む培地上で25℃にて光をうけて4日間にわたる同
時培養、選択剤を含む培地上での発芽および芽の伸長、芽はインビトロで根付き、開花お
よび結実のために室温条件へ移す、推定トランスジェニック植物のPCRまたは酵素分析
、ならびに、PCRまたは酵素活性による次世代子孫のスクリーニング。
え、ホモ接合T2植物を、それらのT3子孫を酵素活性に関してまたはPCRによってス
クリーニングすることで同定する。
植物を作製し、これは、他のマメ科植物の形質転換頻度に類似している。形質転換される
品種または系統によって、このプロトコルは、外植片調製からT1種子回収まで、5〜8
か月を必要とする。
片バイナリーベクターを再生、形質転換ササゲ植物に導入する。
し、Δ5エロンガーゼおよびΔ4デサチュラーゼをコードする遺伝子を加える修飾を行い
、生産したEPAをDHAにさらに変換する能力を与える遺伝子構築物を提供する。栄養
組織でのDHAの生産のために、構築物を植物へ形質転換する。
は、総葉脂質中7.1%±0.2のEPA含んでいた。形質転換の速度は、6つの系統の
みトランスジェニックが確認されたササゲに関して普段経験されるよりも低かった。何が
この結果をもたらしたのかは今のところはまだ分からないが、普段の大きさよりも大きい
トランスジェニック事象が、不完全なT−DNA領域を含んでいたことに留意するのは興
味深い。大きな構築物のサイズが効率の低下に寄与した可能性がある。3つの各トランス
ジェニック酵素の見かけの転換効率も算出した(表22)。天然ALAの初期Δ6不飽和
化後のEPAへの良好な転換を伴い、結果は全3つの種においておおむね類似した。特定
のΔ5エロンガーゼの不在にもかかわらず、EPAからDPAへのΔ5伸長が多少あった
ことが留意された。P.コルダタΔ6エロンガーゼは以前、低量のΔ9エロンガーゼ活性
(すなわち、18:3Δ9、12、15から20:3Δ11、14、17への転換)を有
すると示されてきたが、酵母菌アッセイではΔ5エロンガーゼ活性は一切検知されなかっ
た。
バイナリーベクター作製
一連のキメラΔ12デサチュラーゼ遺伝子を試験および比較する試みとして、複数のバ
イナリーベクターを作り、これらを使用してA.タリアナおよびB.ナプスを形質転換し
た。バイナリーベクターpJP3365、pJP3366、pJP3367、pJP33
68およびpJP3369はそれぞれ、P.パストリスω3デサチュラーゼ(配列番号1
2)およびM.プシラΔ6デサチュラーゼ(配列番号16)酵素、および一連のΔ12デ
サチュラーゼの1つを含んでいた。Δ12デサチュラーゼはクリプトコッカス・ネオフォ
ルマンス(Cryptococcusneoformans)(pJP3365において
受託番号XP_570226)由来であり、遺伝子活性を増大する試みとしてL151M
突然異変(pJP3366において)、ラカンセア・クルイベリ(pJP3367におい
て配列番号10)、シネコシスティスPCC6803(pJP3368において受託番号
BAA18169)およびクレピス・パラエスチナ(Crepis palaestin
a)(pJP3369において受託番号CAA76157、Lee et al.、19
98)を含んだクリプトコッカス・ネオフォルマンスΔ12デサチュラーゼのバージョン
である。クレピスデサチュラーゼはこの一連の中で唯一の植物デサチュラーゼであり;他
は真菌酵素であった。野生型であったクレピス・パレスチナΔ12デサチュラーゼを除い
た、各Δ12デサチュラーゼのための植物コドン最適化タンパク質コード領域を、FP1
プロモーターに操作可能に結合して各デサチュラーゼの種子特異的発現を提供する配向で
、ベクターpJP3364のNotI部位に挿入することで、ベクターを作った(図12
参照)。ベクターpJP3364は、それぞれが種子特異的プロモーターの制御下にある
P.パストリスω3デサチュラーゼおよびM.プシラΔ6デサチュラーゼをコードするキ
メラ遺伝子をすでに含んでいた(図12)。3つの脂肪酸生合成酵素、すなわちΔ12デ
サチュラーゼ、ω3デサチュラーゼおよびΔ6デサチュラーゼの組み合わせを、オレイン
酸(18:1Δ9)からSDA(18:4Δ6、9、12、15)に変換する経路を構築
するよう設計した。したがって、アッセイを実行し、形質転換種子のSDA生産量を測定
した。
キメラバイナリーベクターをA.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換した
アグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ
方法を利用してfad2変異体A.タリアナ植物を形質転換した(CloughおよびB
ent、1998)。成熟後、処理した植物のT1種子を回収し、各キメラベクターのT
−DNA上に存在するNptII選択マーカー遺伝子を有する小植物の選択のために、カ
ナマイシンを含むMSプレート上にプレート化した。生き残ったT1実生を土壌に移した
。植物を自家受精させ、成熟するまで成長させた後、これらの植物からのT2種子を回収
し、種子脂質の脂肪酸組成をGCによって分析した。
形質転換し、12個のトランスジェニック事象を作製した。SDAは、植物のプール化し
た種子のうち0.6%から2.2%の範囲で見つかり、最も高いSDAトランスジェニッ
ク植物を有するトランスジェニック植物から、9個の別個の種子を脂肪酸組成に関して分
析した。そのような分析の脂肪酸組成データは表24に示される。
から発現されるΔ12デサチュラーゼ活性は、予想に反して低く、GA7構築物の同じ発
現カセットで見られた70〜80%(実施例2および3)ではなく約20%の酵素転換効
率をもたらしたことが示された。これらのベクターからのΔ12デサチュラーゼ遺伝子の
比較的不十分な発現の理由は不明であるが、全体の構築物での遺伝子の位置に関連し得る
。
ゼおよびM.プシラΔ6デサチュラーゼ遺伝子は形質転換種子で比較的良好に発現された
ことを示した。表24には、形質転換種子のΔ6デサチュラーゼ転換効率が含まれ、これ
は、あるB.ナプス形質転換系統では約11%〜約25%の範囲であった。これは、GA
7構築物で形質転換したB.ナプス種子で見られた約7%のΔ6デサチュラーゼの転換効
率よりも著しく高かった(実施例4)。
ラーゼ転換効率を活用するために、このT−DNAで形質転換されたB.ナプス植物をp
JP3416−GA7のT−DNAで形質転換した植物(実施例4)と交雑させ、双方の
T−DNAを保有する後代植物および種子を作製した。F1種子から抽出された油の脂肪
酸組成を、DHA含有量および他の脂肪酸含有量に関してGCで分析する。増加したDH
A量が、Δ6デサチュラーゼの増加した発現の結果として観察される。双方のT−DNA
にとってホモ接合である植物を作製し、該植物はより高い量のDHAを生産するはずであ
る。
大
バイナリーベクターの構築
国際公開第2010/057246号で、植物の種子における導入遺伝子発現を増大させ
るためのサイレンシング抑制因子タンパク質(SSP)の使用が説明される。そのような
タンパク質が、複数の世代にわたって
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のLC−PUFAの生産を強化および安定させ得ることを実証するために、複数のSSP
、すなわち、V2(受託番号GU178820.1)、p19(受託番号AJ28894
3.1)、p38(受託番号DQ286869.1)およびP0PE(受託番号L045
73.1)を試験のために選択した。p19は、トマトブッシースタントウイルス(TB
SV)由来の抑制因子タンパク質であり、これは、21個のヌクレオチドの長さのsiR
NAが相同RNAのアルゴノート誘導切断を誘導する前に、21個のヌクレオチドの長さ
のsiRNAに結合する(Voinnet et al.、2003)。トマト黄化葉巻
ウイルス(TYLCV)由来の抑制因子タンパク質であるV2は、ssRNA基質から二
本鎖RNA中間体を生成するのに必要であると考えられるタンパク質である(Becli
n et al.、2002)、植物タンパク質SGS3に結合し(Glick et
al.、2008)、または、5’オーバーハングを有するdsRNA構造に結合する(
Fukunaga et al.、2009)。p38は、ダイサーまたはアルゴノート
タンパク質に結合することによって植物サイレンシングメカニズムに干渉する、ターニッ
プクリンクルウィルス(TCV)由来の抑制因子タンパク質である(Azevedo e
t al.、2010)。ポレロウイルス由来の、P0PEおよびRPV−P0といった
P0タンパク質は、強化した分解のためにアルゴノートタンパク質を標的とする(Bau
mberger et al.、2007;Bortolamiol et al.、2
007、Fusaro et al.、2012)。したがって、LA(18:1Δ9、
12)からARA(20:4Δ5、8、11、14)への生産のための一連の脂肪酸生合
成遺伝子と組み合わせて、植物種子でのこれらSSPの発現のために、遺伝子構築物を次
のように調製した。
チュラーゼをコードする脂肪酸生合成遺伝子および細菌選択マーカーを、9560bp断
片を生じるPmeiおよびAvrIIでの消化によって、pJP3010の単一DNA断
片上で得た。この断片上のΔ9エロンガーゼコード領域をA.タリアナFAE1プロモー
ター(pAtFAE1)およびコンリニン転写終結/ポリアデニル化領域(LuCnl2
−3’)に結合させた。デサチュラーゼコード領域をそれぞれ切断ナピンFP1プロモー
ター(pBnFP1)およびnos3’転写終結/ポリアデニル化領域に結合させた。こ
の断片上の3つの脂肪酸生合成遺伝子をpJP107と同じ方法で方向付けおよびスペー
ス配置し(Petrie et al.、2012)、pJP107と同じタンパク質を
コードさせた。DNA断片はまた、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするpCW1
41(国際公報第2010/057246号を参照)のpFP1:GFiP:nos3’
遺伝子を含んでいた。このスクリーニング可能なマーカー遺伝子を、視覚的な種子特異的
マーカーとして使用し、単純および非破壊的な同定が可能になり、それによって、その遺
伝子を含み発現するトランスジェニック種子の選択が可能になった。
57246号)のそれぞれのPmeI−AvrII部位にPmeI−AvrII断片を挿
入し、pFN045、pFN046、pFN047、pFN048およびpFN049と
指定した遺伝子構築物をもたらした。これらは、SSPのP0PE、p38、p19、3
5S:V2およびV2をそれぞれコードする遺伝子を含む。各SSP遺伝子は、V2コー
ド領域が恒常的CaMV35Sプロモーターの制御下である構築物pFN048を除いて
、FP1プロモーターおよびocs3’転写終結/ポリアデニル化領域の制御下にあった
。各例のSSP遺伝子は構築物のT−DNA領域内にあり、T−DNAの右境界(RB)
に隣接した。pFN045をAhdIおよびNheIで消化し、続いてDNAリガーゼで
再環状化してFP1:P0PE遺伝子を欠失することによって、いずれのSSPコード配
列も欠如した第6の構築物、pFN050を作った。6つの各構築物は、T−DNA内お
よびT−DNAの左境界に隣接したNptII選択マーカー遺伝子を含んだ。構築物は全
てアグロバクテリウムのプラスミドの維持のためのRK2複製開始点を有した。
その種子脂質において高いリノール酸量を有するfad2/fae1二重変異体である
、アラビドプシスの遺伝子型MC49を形質転換するために、フローラルディップ方法に
よって(CloughおよびBent、1998)、6つの各構築体pFN045〜pF
N050で個別に形質転換したA.ツメファシエンス株GV3101で、植物を処理した
。処理した植物を成熟するまで成長させ、それらから回収したT1種子を、カナマイシン
を含むMS培地上にプレートし、形質転換したT1種子を選択した。種子のGFP発現の
スクリーニングも、形質転換T1種子のための視覚的なマーカーとして使用した。MS/
Kanプレート上に生き残った、または、GFP陽性種子から得た実生を土壌に移し、T
2種子のために成熟まで成長させた。得られた形質転換植物の数は、pFN045、pF
N046、pFN047、pFN048、pFN049およびpFN050との形質転換
でそれぞれ5、14、32、8、23および24であった。この段階で、pFN046に
p38をコードする遺伝子は機能的ではないことが分かり、したがって、ベクターpFN
046で形質転換した植物を追加対照、すなわち、pFN050と基本的に同じであると
見なした。
物から約100個のプール化したT2種子を取り出した。各トランスジェニック系統から
の6つのT2実生も成長させ、T3種子を作製した。
によって、ある範囲のARAならびにT2群の中間体EDA(20:2ω6)およびDG
LA(20:3ω6)の量が示された。ARAに関するデータが図13および14に示さ
れる。
A生合成遺伝子に加えてFP1:p19および35S:V2遺伝子を含む種子群のARA
の中央(50パーセンタイル)値は、SSP遺伝子を含まないpFP050の欠陥FP1
:p38遺伝子または対照T−DNA含む種子よりも、著しく高かった。p19およびV
2をコードする遺伝子で形質転換した種子に関する平均ARA量は、p38遺伝子で形質
転換した種子またはSSPを持たない種子に関してよりも多かった(図14)。1つのF
P1:p19およぶ2つのFP1:V2系統は、約19%、20%および23%のARA
をそれぞれ示した。これらは異常値であり、したがって、ボックスプロット分析の計算に
は含まれなかった。遺伝子FP1:P0PEおよび35S:V2を含むT−DNAで形質
転換した植物は、他の構築物と比べてより少ない数で生き残った;これらの遺伝子はMC
49背景では植物の健康に有害であり得ると考えられる。
体、すなわちEDA(20:2ω6)の種子脂質における量もV2またはp19を発現す
る系統において、SSPを欠如するまたはp38構築物を含む種子よりも低く観察された
(図15)。T3種子では、p19を発現する構築物を含む1つの群は種子脂質中の総脂
肪酸のパーセンテージとしての38%のARAを示した。
種子のARAの量は、前の世代に比べて同じであるか、または、それらのT3親に比べて
増加した量を確実に示すかのいずれかであった(図16)。p19を発現する系統は、さ
らにばらつきのあるARA量を示した。ARA量はいくつかの系統では低下した一方で、
他ではT3親と比較して同じまたは増加していた。対照的に、欠陥p38遺伝子を含む、
または、SSPを欠如する系統は、一般的にARAの量の低下および中間体の量の増加を
示した(図18)。これらの系統のいくつかでは、ARAは約1%まで低下し、EDAの
量は約20%まで増加した。T4種子のARAの平均量は、p38を発現する、または、
SSPを欠如する系統と比べて、p19およびV2を発現する系統に関してより高かった
(図17)。
ンスジェニック植物の種子におけるSSPの発現は、子孫の第1世代にて所望する脂肪酸
の生産量を増加しただけでなく、子孫の第3または第4世代といった後代の世代での脂肪
酸生産量を安定させた。増加した脂肪酸生産は、生合成経路での中間脂肪酸の量の低下を
伴った。種子特異的プロモーターから発現されるSSPのp19およびV2が好ましかっ
た。p38 SSPを発現するように設計された構築物は欠陥であり、この構築物では有
効なデータは一切得られなかった。他のウイルス由来のV2 SSPおよびそのホモログ
は、特に好ましいと考えられ、なぜなら、これらは生合成経路遺伝子の最大発現および発
育中の種子の同一細胞内での他の遺伝子の同時サイレンシングを可能にするからである。
オーストラリアの商業的供給源から購入した12個の植物油試料の植物ステロールを、
実施例1に記載される通り、GCおよびGC−MS分析によってO−トリメチルシリルエ
ーテル(OTMSi−エーテル)として特徴づけた。保持データ、質量スペクトルの解釈
ならびに文献および実験室標準質量スペクトルとの比較によってステロールを同定した。
ステロールを、5β(H)−コラン−24−オール内部標準の使用によって定量化した。
基本的な植物ステロール構造および同定ステロールのいくつかの化学構造が図19および
表25に示される。
))、オリーブ(オレア・エウロパエア)、ヒマワリ(ヘリアンサス・アヌス)、トウゴ
マ(リシヌス・コムニス(Ricinus communis))、キャノーラ(セイヨ
ウアブラナ)、ベニバナ(カーサマス・ティンクトリアス(Carthamus tin
ctorius))、ピーナッツ(アラキス・ヒポガエア(Arachis hypog
aea))、アマ(リヌム・ウシタティスシムム)およびダイズ(グリシン・マックス)
由来である。全油試料のうち、主要な植物ステロールは相対存在量が多い順で:β−シト
ステロール(総ステロール含有量の28〜55%に及ぶ)、Δ5−アベナステロール(イ
ソフコステロール)(3〜24%)、カンペステロール(2〜33%)、Δ5−スチグマ
ステロール(0.7〜18%)、Δ7−スチグマステロール(1〜18%)およびΔ7−
アベナステロール(0.1〜5%)であった。他のマイナーな複数のステロールを同定し
、それらは:コレステロール、ブラシカステロール、カリナステロール、カンペスタノー
ルおよびエブリコールであった。4つのC29:2および2つのC30:2ステロールも
検知されたが、これらのマイナーな成分の同定を完成するには研究がさらに必要である。
加えて、油のいくつかには他の同定されなかったステロールが複数存在したが、それらの
大変低い存在量のために、質量スペクトルはそれらの構造の同定が可能になるほど十分強
くなかった。
8mg/g)、ゴマ油(5.8mg/g)、アマ油(4.8〜5.2mg/g)、ヒマワ
リ油(3.7〜4.1mg/g)、ピーナッツ油(3.2mg/g)、ベニバナ油(3.
0mg/g)、ダイズ油(3.0mg/g)、オリーブ油(2.4mg/g)、トウゴマ
油(1.9mg/g)であった。%ステロール組成および総ステロール含有量が表26に
示される。
ール含有量の30〜57%に及ぶ)であった。他の主要なステロールの割合では、油間で
大きな幅があった:カンペステロール(2〜17%)、Δ5−スチグマステロール(0.
7〜18%)、Δ5−アベナステロール(4〜23%)、Δ7−スチグマステロール(1
〜18%)。異なる種の油は異なるステロールプロフィールを有し、いくつかは大変特徴
的なプロフィールを有していた。キャノーラ油の場合、キャノーラ油は一番大きな割合の
カンペステロール(33.6%)を有し、一方で、他の種の試料は一般的により低い量を
有し、たとえば、ピーナッツ油では最大17%であった。ベニバナ油は比較的大きな割合
のΔ7−スチグマステロール(18%)を有する一方で、このステロールは通常他の種の
油では低く、ヒマワリ油では最大9%である。ステロールプロフィールは各種に対して特
有であるので、したがって、ステロールプロフィールを使用して特定の野菜または植物油
の同定を助け、および、純種性および他の油との不純物混和を確認し得る。
よって作製し、精製しておらず、一方で、他方は冷圧せず、精製した。いくつか違いが観
察されたものの、2つの油の源は類似したステロール組成および総ステロール含有量を有
し、処理および生産はこれら2つのパラメーターには効果をほとんど有さなかったことを
示している。試料間のステロール含有量は3倍ばらつき、1.9mg/gから6.8mg
/gに及んだ。キャノーラ油は一番高いステロール含有量を有し、トウゴマ油は一番少な
いステロール含有量を有した。
本発明者らは、TAGのsn−2位置でのDHA蓄積は、1−アシル−グリセロール−
3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)をGA7構築物またはその変異形に
よって提供されるようなDHA生合成経路と一緒に同時発現することで増加し得ることを
考察した。好ましいLPAATは、多価不飽和C22脂肪アシル−CoAに基質として作
用するものであり、内因性LPAATに比べ、PAを形成するLPAのsn−2位置での
多価不飽和C22鎖の挿入の増加につながる。細胞質LPAAT酵素はしばしば、特にそ
の種がTAGにて異常な脂肪酸を合成および蓄積する場合、様々な基質の好みを示す。リ
ムナンテス・ダグラシー(Limnanthes douglasii)由来のLPAA
T2は、PA合成のためにエルコイル−CoA(C22:1−CoA)を基質として用い
ることが示され、これは、C22基質を使用し得ない同じ種由来のLPAAT1とは対照
的であった(Brown et al.、2002)。
込みを増加することが期待されないものがいくつか対照として含まれた。公知のLPAA
Tには:シロイヌナズナLPAAT2:(配列番号63、受託番号ABG48392、K
im et al.、2005)、リムナンテス・アルバLPAAT(配列番号64、受
託番号AAC49185、Lassner et al.、1995)、サッカロマイセ
ス・セレビシエSlclp(配列番号65、受託番号NP010231、Zou et
al.、1997)、モルティエレラ・アルピナLPAAT1(配列番号67、受託番号
AED33305;米国特許第7879591号)およびB.ナプスLPAAT(配列番
号68および配列番号69、それぞれ受託番号ADC97479およびADC97478
)が含まれた。これらを選択してLPAAT酵素の3つのグループを包含した:1)異常
な長鎖多価不飽和脂肪酸に対して通常低活性を有する対照植物種子LPAAT(アラビド
プシスおよびブラシカLPAATを含む)、2.基質としてC22アシル−CoA、この
場合エルカ酸C22:1を用いることでC22脂肪酸に作用することが以前に実証された
LPAAT(リムナンテスおよびサッカロマイセスLPAATを含む)、3.EPAおよ
びDHAといった長鎖多価不飽和脂肪酸を基質として使用できる可能性が高いと発明者ら
が考えるLPAAT(モルティエレラLPAATを含む)。
対して活性を有することが示される、小胞体に局在した酵素であるが、C20またはC2
2基質に対する活性は試験されなかった(Kim et al.、2005)。リムナン
テス・アルバLPAAT2は、C22:1アシル鎖をPAのsn−2位置に挿入すること
が実証されたが、DHAを基質として使用する能力は試験されなかった(Lassner
et al.、1995)。選択されたS.セレビシエLPAAT Slclpは、1
8:1−CoAに加えて22:1−CoAを基質として使用して活性を有することが示さ
れ、鎖長に関する幅広い基質特異性を示唆する(Zou et al.、1997)。再
び、DHA−CoAおよび他のLC−PUFAは基質として試験されなかった。モルティ
エレラLPAATは、トランスジェニックヤロウイア・リポリティカのEPAおよびDH
A脂肪酸基質に対して活性を有することが以前に示された(米国7879591)。
G上のDHAの分布は確認されていないが、その油中にDHAを生産および蓄積する微細
藻類である。アラビドプシスLPAAT2をBLAST問い合わせ配列として使用してミ
クロモナス・プシラゲノム配列を調査することで、ミクロモナス・プシラLPAAT(配
列番号66、受託番号XP_002501997)を同定した。候補配列が複数生じ、配
列XP_002501997を、C22 LC−PUFAに対する活性を伴う可能性の高
いLPAAT酵素として試験するために合成した。リシヌス・コムニスLPAATをトウ
ゴマゲノム配列の推定LPAATとして注釈した(Chan et al.、2010)
。トウゴマゲノム由来の4つの候補LPAATを合成し、浸潤したN.ベンサミアナ葉組
織の粗葉可溶化物で試験した。ここに記載される候補配列はLPAAT活性を示した。
推定ミクロモナスLPAATは推定C22 LPAATとクラスター化しなかったが、分
岐配列であったことが留意された。
メラ遺伝子構築物を、N.ベンサミアナ葉における外因性LPAATの恒常的発現のため
に作製し、それぞれは次の通りに、35Sプロモーターの制御下にある:35S:Ara
th−LPAAT2(アラビドプシスER LPAAT);35S:Ricco−LPA
AT2;35S:Limal−LPAAT(リムナンテス・アルバLPAAT);35S
:Sacce−Slclp(S.セレビシエLPAAT);35S:Micpu−LPA
AT(ミクロモナス・プシラLPAAT);35S:Moral−LPAAT1(モルテ
ィエレラ・アルピナLPAAT)。外因性LPAATを欠如する35S:p19構築物を
対照として実験で用いる。これら構築物をそれぞれ、実施例1で記載される通りにアグロ
バクテリウム経由でN.ベンサミアナ葉に導入し、浸潤から5日後、処理した葉の区域を
切断し、すりつぶして葉可溶化物を作る。各可溶化物には、LPAを合成するための外因
性LPAATならびに内因性酵素が含まれる。14Cで標識したOA、LAまたはALA
(C18基質)、ARA(C20基質)およびDHA(C22)を可溶化物に別々に添加
することで、インビトロの反応を3通りで準備する。反応を25℃でインキュベートし、
14Cで標識した脂肪酸のPAへの取り込みの量をTLCで測定する。ARAおよびC1
8脂肪酸と比較して、各LPAATのDHAを用いる能力を算出する。メドウフォーム、
モルティエレラおよびサッカロマイセスLPAATは、DHA基質に活性を有することが
発見され、放射標識したPAはこれらに関しては現れたが、他のLPAATに関しては現
れなかった。全LPAATは、類似したオレイン酸供給によって活性であると確認された
。
数コンリニン(pLuCnl1)プロモーターの制御下でバイナリーベクターに挿入する
。次いで、キメラ遺伝子、Cnl1:Arath−LPAAT(陰性対照)、Cnl1:
Limal−LPAAT、Cnl:Sacce−SlclpおよびCnl1:Moral
−LPAATをそれぞれ含む、結果として得られた遺伝子構築物を用いてB.ナプスおよ
びA.タリアナ植物を形質転換し、種子特異的な方法でLPAATを発現する安定した形
質転換体を作製する。Cnl1:LPAAT構築物を有する形質転換植物を、種子でDH
Aを生産するGA7構築物またはその変異形を発現する植物(実施例5)と交雑し、TA
Gのsn−2位置でのDHAの取り込みの増加につながる。また、構築物を用いて、GA
7構築物およびその変異形をすでに含むB.ナプス、C.サティバおよびA.タリアナ植
物(実施例2から5)を形質転換して親およびLPAAT遺伝子構築物の双方を保有する
子孫を作製する。TAGのsn−2位置でのDHAの取り込みの増加は、LPAATコー
ド導入遺伝子を欠如する植物での取り込みに相対的であると予想される。油含有量も種子
で改善され、特に、より多い量のDHAを生産する種子に関して改善され、実施例2で説
明されるアラビドプシス種子で見られる傾向を相殺する。
よび/または修正が特定の実施形態で示される本発明品になされ得ることが、当業者には
理解されるだろう。したがって、本実施形態は全ての点において例示的であり制限的では
ないと見なされる。
2年6月22日に出願された米国第US61/663,344号、2012年9月6日に
出願された米国第61/697,676号、2013年3月14日に出願された米国第6
1/782,680号からの優先権を主張し、それぞれの全体の内容が参照により本明細
書に組み込まれる。
まれる。
2年6月22日に出願された米国第61/663,344号および2012年9月6日に
出願された米国第61/697,676号を、参照により本明細書に組み込む。
の文脈を提供する目的のためのみである。これらの事柄のいずれかまたは全てが先行技術
の基盤の一部を形成する、または、本出願の各請求項の優先日以前に存在した通り、本発
明に関連した当該分野では共通の常識であったということが承認としては見なされない。
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本発明は、以下の態様を含む。
[1]
エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに、任意にステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である、抽出植物脂質。
[2]
以下の特徴:
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約2%から18%の間、または約2%から16%の間、または約2%から15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)のレベルは、6%未満、または3%未満、または2%未満、または1%未満である、
lxvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約1%から約30%の間、約3%から約30%の間、または約6%から約30%の間、または1%から約20%の間、または約30%から約60%の間、または約45%から約60%、または約30%である、
lxviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルは、約4%から約35%の間、または約4%から約20%の間、または約4%から17%の間である、
lxix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、または約10%から約35%の間、または約20%から約35%の間、または約4%から16%の間、または約2%から16%の間である、
lxx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)のレベルは、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(ETA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
lxxiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、4%未満、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間である、
lxxiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
lxxvii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5 Δ4,7,10,13,16 )を含む、
lxxviii)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5 Δ4,7,10,13,16 )を実質的に含まない、
lxxix)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含まない、
lxxx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約25%の間、または約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、約4%から約60%の間、約30%から約60%の間、または約45%から約60%の間である、
lxxxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約35%の間、または約8%から約25%の間、または8%から約22%の間である、
lxxxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約20%から約75%の間、または約50%から約75%の間、または約60%から約75%の間である、
lxxxiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間である、
lxxxiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
lxxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%から約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
lxxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、9%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
lxxxvii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
lxxxviii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.1、約0.2、または約1.0である、
lxxxix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約90%の間の、Δ12‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のLAへの転換の効率に基づく、
xc)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の、Δ6‐デサチュラーゼによる、ALAのSDAへの転換の効率に基づく、
xxci)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%から約85%の間の、Δ6‐エロンガーゼによる、SDAのETA酸への転換の効率に基づく、
xcii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間の、Δ5‐デサチュラーゼによる、ETAのEPAへの転換の効率に基づく、
xciii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、Δ5‐エロンガーゼによる、EPAのDPAへの転換の効率に基づく、
xciv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、Δ4‐デサチュラーゼによる、DPAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xcvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcviii)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xcix)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間であり、
c)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
ci)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.001%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
cii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも70%または少なくとも80%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
ciii)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/18:3(TAG58:12)である、
civ)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、の1もしくはそれ以上、または全てを有する[1]の脂質。
[3]
オイルの形態であって、該オイルの重量の少なくとも約90%、または少なくとも約95%、少なくとも約98%、または約95%から約98%の間が前記脂質である、[1]または[2]の脂質。
[4]
1またはそれ以上のステロールをさらに含む、[1]から[3]のいずれか1つの脂質。
[5]
オイルの形態であって、約10mgのステロール/gのオイル未満、約7mgのステロール/gのオイル未満、約1.5mgから約10mgの間のステロール/gのオイル、または約1.5mgから約7mgの間のステロール/gのオイルを含む[4]の脂質。
[6]
カンペステロール/24‐メチルコレステロール、Δ5‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール/24‐エチルコレステロール、Δ5‐アベナステロール/イソフコステロール、Δ7‐スチグマステロール/スティグマスト‐7‐エン‐3β‐オールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上、または全てを含む[4]または[5]の脂質。
[7]
約0.5mgのコレステロール/gのオイル未満、約0.25mgのコレステロール/gのオイル未満、約0mgから約0.5mgの間のコレステロール/gのオイル、もしくは約0mgから約0.25mgの間のコレステロール/gのオイルを含む、またはコレステロールを実質的に含まない、[4]から[6]のいずれか1つの脂質。
[8]
前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイルである、[1]から[7]のいずれか1つの脂質。
[9]
前記脂質は、アブラナ属種オイル、ワタオイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコシオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオイル、ソルガムブルガレオイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイスグイネエヌシスオイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアングスティフォリウスオイル、イネオイル、アフリカイネオイル、カメリナサティバオイル、クランベアビシニカオイル、ミスカンサスxギガンティウスオイル、またはススキオイルである、[8]の脂質。
[10]
i)脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)およびエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセス。
[11]
前記抽出脂質は、[2]から[9]に定義される1またはそれ以上の特徴を有する、[10]のプロセス。
[12]
前記植物部分が、種子、好ましくは油料種子である、[10]または[11]のプロセス。
[13]
前記種子が、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ、好ましくは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバの種子である、[12]のプロセス。
[14]
種子1グラム当たり、少なくとも約18mg、少なくとも約22mg、少なくとも約26mg、約18mgから約100mgの間、約22mgから約70mgの間、または約24mgから約50mgの間のDHAを、前記種子が含む、[12]または[13]のプロセス。
[15]
前記植物部分は、以下のセットの酵素:
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードし、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、1またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される、外因性ポリヌクレオチドを含む、[10]から[14]のいずれか1つのプロセス。
[16]
前記植物部分が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約95%の間、約70%から約90%の間、または約75%から約85%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約91%の間、または約80%から約91%の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換する、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ALAをSDAに転換する、
iv)前記Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
v)前記Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約80%の間、または約75%から約80%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、SDAをETAに転換する、
vi)前記Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約95%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ETAをEPAに転換する、
vii)前記Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の間、約50%から約90%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、EPAをDPAに転換する、
viii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、DPAをDHAに転換する、
ix)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間である、
x)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのLAの転換の効率が、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間である、
xi)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのALAの転換の効率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間である、
xii)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約15%から約30%の間、または約22.5%から約27.5%の間で多いω3脂肪酸を含む、
xiii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、、リノール酸(LA)に対してα‐リノレン酸(ALA)を優先的に不飽和化する、
xiv)前記Δ6‐エロンガーゼは、また、Δ9‐エロンガーゼ活性を有する、
xv)前記Δ12‐デサチュラーゼは、また、Δ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvi)前記Δ6‐デサチュラーゼは、また、Δ8‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvii)前記Δ8‐デサチュラーゼは、また、Δ6‐デサチュラーゼ活性を有する、またはΔ6‐デサチュラーゼ活性を有していない、
xviii)前記Δ15‐デサチュラーゼは、また、GLAでω3‐デサチュラーゼ活性を有し、
xix)前記ω3‐デサチュラーゼは、また、LAでΔ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xx)前記ω3‐デサチュラーゼは、両方のLAおよび/またはGLAを不飽和化する、
xxi)前記ω3‐デサチュラーゼは、、LAに対してGLAを優先的に不飽和化する、
xxii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約15%から約30%の間、または約20%から約25%の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxiii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、約15%から約60%の間、約20%から約40%の間、または約22%から約30%の間の、前記植物部分におけるLAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxiv)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約65%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間の、前記植物部分におけるALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxx)1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐PC基質よりもアシル‐CoA基質で、より高い活性を有する、
xxxi)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、LAよりもALAで、より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxiii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、基質としてのALAで、LAと比較して、少なくとも約2倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくとも4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有する、
xxxiv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高い活性を有する、
xxxv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、少なくとも約5倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有する、
xxxvi)前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
xxxvii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、ETAで、検出可能なΔ5‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する[15]のプロセス。
[17]
前記植物部分が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、配列番号10で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、配列番号12で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、配列番号16で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号16と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
iv)前記Δ6‐エロンガーゼが、配列番号25で規定される配列を有するアミノ酸、配列番号26のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号25および/または配列番号26と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
v)前記Δ5‐デサチュラーゼが、配列番号30で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号30と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
vi)前記Δ5‐エロンガーゼが、配列番号37で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号37と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
vii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、配列番号41で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号41と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する、[15]または[16]のプロセス。
[18]
前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(GPAT)、1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(LPAAT)好ましくはC22多価不飽和脂肪族アシル‐CoA基質を使用し得るLPAAT、アシル‐CoA:リソホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスホリパーゼA 2 (PLA 2 )、ホスホリパーゼC(PLC)、ホスホリパーゼD(PLD)、CDP‐コリンジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(CPT)、ホスファチジル(phoshatidyl)コリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)、ホスファチジルコリン:ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(PDCT)、アシル‐CoAシンターゼ(ACS)、または2つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、[15]から[17]のいずれか1つのプロセス。
[19]
前記植物部分が、FAE1、DGAT、MGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA 2 、PLC、PLD、CPT、PDAT、FATBのようなチオエステラーゼ、またはΔ12‐デサチュラーゼ、または2つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせから選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および/または活性を下方制御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、[10]から[18]のいずれか1つのプロセス。
[20]
少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、[15]から[19]のいずれか1つのプロセス。
[21]
少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが、オイル生合成もしくはオレオシンのような蓄積遺伝子から、またはコンリニンのような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られた、[20]のプロセス。
[22]
前記Δ4‐デサチュラーゼおよび前記Δ5‐エロンガーゼをコードする、外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の種子の発生以前、またはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を開始し、前記プロモーターが前記Δ12‐デサチュラーゼおよび前記ω3‐デサチュラーゼをコードする前記外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける、[15]から[21]のいずれか1つのプロセス。
[23]
前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるDNA分子、好ましくはT‐DNA分子において共有結合で結合され、好ましくは前記植物部分の前記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなDNA分子の数は、1、2もしくは3以下であり、または2もしくは3である、[15]から[22]のいずれか1つのプロセス。
[24]
前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ6‐デサチュラーゼをそれぞれコードする少なくとも2つの異なる外因性ポリヌクレオチドを含む、[23]のプロセス。
[25]
前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または約50%から約80%の間である、[15]から[24]のいずれか1つのプロセス。
[26]
前記脂質は、オイル、好ましくは油料種子由来の種子オイルの形態であり、前記脂質の重量の少なくとも約90%、または少なくとも約95%、少なくとも約98%、または約95%から約98%の間がトリアシルグリセロールである、[10]から[25]のいずれか1つのプロセス。
[27]
前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記DHAのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む、[10]から[26]のいずれか1つのプロセス。
[28]
前記処理がエステル交換反応である、[27]のプロセス。
[29]
[10]から[28]のいずれか1つのプロセスを用いて産生された、脂質または該脂質を含むオイル。
[30]
単一のDNA分子に全て共有結合で結合される、第1の遺伝子、第2の遺伝子、第3の遺伝子、第4の遺伝子、第5の遺伝子、および第6の遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子コンストラクトであって、
第1、第2、および第3の遺伝子が第1の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第4、第5、および第6の遺伝子が第2の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、および転写ターミネーター、および/またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記DNA分子が3、4、5、または6つの異なるプロモーターを含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、1もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性であり、
前記第1の遺伝子の転写の方向が、前記第3の遺伝子から離れており、前記第3の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第4の遺伝子の転写の方向が、前記第6の遺伝子から離れており、前記第6の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第2の遺伝子の転写の方向が、前記第1の遺伝子または前記第3の遺伝子と同じであり、
前記第5の遺伝子の転写の方向が、前記第4の遺伝子または前記第6の遺伝子と同じであり、
前記第2の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約0.2から約3.0キロベースの間の第1のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第1または第3の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約1.0から約10.0キロベースの間の第2のスペーサー領域により前記第1の遺伝子クラスターが第2の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第5の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約0.2から約3.0キロベースの間の第3のスペーサー領域により、より近いいずれかの、第4または第6の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く、キメラ遺伝子コンストラクト。
[31]
前記DNA分子が、約1.0から約10.0キロベースの間のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第1の遺伝子クラスターまたは前記第2の遺伝子クラスターから間隔を置く第7の遺伝子を含む、[30]の遺伝子コンストラクト。
[32]
前記DNA分子が、2つまたはそれ以上の異なる転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域を含む、[30]または[31]の遺伝子コンストラクト。
[33]
少なくとも1つの前記スペーサー領域がマトリックス結合領域(MAR)を含む、[30]から[32]のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
[34]
前記DNA分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み、かつT‐DNA分子である、[30]から[33]のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
[35]
アグロバクテリウム細胞である、または植物細胞のゲノムに組み込まれる、[30]から[34]のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
[36]
少なくとも1つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼをコードする、[30]から[35]のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
[37]
[15]に定義される酵素のセットをコードする遺伝子、および/または[16]または[17]に定義される酵素をコードする1またはそれ以上の遺伝子を含む、[36]の遺伝子コンストラクト。
[38]
i)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、または45のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、または45に示される1またはそれ以上の配列と、少なくとも95%同一または99%同一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および/または外因性ポリヌクレオチド。
[39]
[38]のポリヌクレオチドおよび/または[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクト。
[40]
配列番号11、14、18、22、23、28、34、35、39、もしくは45のいずれか1つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号11、14、18、22、23、28、34、35、39、もしくは45で示される1もしくはそれ以上の前記配列と少なくとも95%同一もしくは99%同一である前記ヌクレオチドの配列は、プロモーターに操作可能に結合される、[39]のベクターまたは遺伝子コンストラクト。
[41]
以下のセットの酵素:
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。
[42]
[1]から[9]のいずれか1つに定義される脂質を含み、または1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、[16]または[17]に定義される1またはそれ以上の特徴を有する、[41]の細胞。
[43]
i)配列番号10に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ12‐デサチュラーゼをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列と、
ii)配列番号12に規定される配列を有するアミノ酸を含むω3‐デサチュラーゼをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列とを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができる1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。
[44]
1またはそれ以上の[38]の前記ポリヌクレオチド、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、または[39]もしくは[40]の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。
[45]
植物における、植物部分におけるものである、および/または成熟した植物種子の細胞である、[41]から[44]のいずれか1つの細胞。
[46]
前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である、[45]の細胞。
[47]
[41]から[46]のいずれか1つの細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物。
[48]
トランスジェニック植物である、[47]のトランスジェニック非ヒト生物。
[49]
a)その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含み、および
b)以下のセットの酵素:
i)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/または真菌のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
ii)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、の1つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように1またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)、ならびに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)および/またはエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは約7%から20%である、油料種子植物。
[50]
前記植物は、キャノーラ、ダイズ、カメリナサティバ、またはシロイヌナズナ植物である、[49]の植物。
[51]
1またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐CoA基質を使用することができる、[49]または[50]の植物。
[52]
1またはそれ以上の前記Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼは、もし存在する場合には、アシル‐CoA基質を用いることができ、好ましくは、i)Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、およびΔ4‐デサチュラーゼ、またはii)Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼのそれぞれは、アシル‐CoA基質を用いることができる、[51]の植物。
[53]
前記植物の成熟した、収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgのDHA含有量を有する、[49]から[52]のいずれか1つの植物。
[54]
DHAを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物であって、
前記植物の成熟した、収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgのDHA含有量を有する植物。
[55]
前記外因性ポリヌクレオチドを含む、[49]から[54]のいずれか1つの植物の植物細胞。
[56]
以下の特徴:
i)[48]から[54]のいずれか1つの植物由来である、
ii)[1]から[9]のいずれか1つに定義される脂質を含む、
iii)[10]から[28]のいずれか1つのプロセスで使用され得る、
iv)[30]から[37]のいずれか1つの遺伝子コンストラクトを含む、または
v)[14]、[41]、または[48]から[52]のいずれか1つに定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の1またはそれ以上を有する植物部分、好ましくは種子。
[57]
DHAおよび重量で約4%から約15%の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子であって、
前記種子の前記DHAの含有量は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgである、種子。
[58]
[1]から[9]のいずれか1つに定義される、1もしくはそれ以上のまたは全ての特徴を含む、抽出脂質を産生するために使用され得る、[41]から[46]、もしくは[55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、または[57]の前記種子。
[59]
[41]から[45]のいずれか1つの細胞を産生する方法であって、
a)前記細胞、好ましくは、LC‐PUFAを合成することができない細胞に、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド、[39]または[40]の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、[14]、[41]から[43]、または[48]から[52]のいずれか1つに定義される1またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
b)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
c)任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
d)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、を含む方法。
[60]
前記細胞における脂質が、1またはそれ以上の[1]から[9]に定義される特徴を有する、[59]に記載の方法。
[61]
前記遺伝子コンストラクト、前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチドの組み合わせは、前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる、[59]または[60]に記載の方法。
[62]
前記細胞は植物細胞であり、前記方法は、工程a)の前記細胞から形質転換植物を再生する工程をさらに含む、[59]から[61]のいずれか1つの方法。
[63]
前記遺伝子および/または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前記細胞内に発現される、[62]の方法。
[64]
[59]から[63]のいずれか1つの方法を用いて産生される細胞。
[65]
種子を産生する方法であって、
a)好ましくは少なくとも1000のこのような植物の個体群の一部としてのフィールドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも1ヘクタールのエリアで、[48]から[54]のいずれか1つの植物、または[10]から[28]、[56]、もしくは[57]のいずれか1つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
b)前記植物の1つまたは複数から種子を収穫することと、
c)任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgDHA/ヘクタールの総DHA収率を有するオイルを産生することと、
を含む、方法。
[66]
以下の特徴:
i)前記オイルが[2]、または[4]から[7]のいずれか1つに定義される、
ii)前記植物部分または種子が、[14]、[16]から[19]、[21]から[28]のいずれか1つのプロセスで使用され得る、
iii)前記外因性ポリヌクレオチドが、[30]から[35]のいずれか1つの遺伝子コンストラクトに含まれる、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドは、[38]の外因性ポリヌクレオチドを含む、
v)前記植物細胞は、[43]の細胞である、
vi)前記種子は、[65]の方法で産生された、の1またはそれ以上を有する、[48]から[57]のいずれか1つの前記植物、植物細胞、植物部分、または種子。
[67]
1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび/もしくは脂肪酸エロンガーゼ、または1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに1もしくはそれ以上の脂肪酸エロンガーゼを産生する方法であって、
[36]または[37]の前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド、[39]または[40]の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、1またはそれ以上の[14]、[41]から[43]、または[48]から[52]のいずれか1つで定義される外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、細胞でまたは細胞フリーの発現システムで発現することを含む方法。
[68]
[10]から[28]のいずれか1つの前記プロセス、[41]から[46]、もしくは[55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、または[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂質またはオイル。
[69]
油料種子のオイルの抽出により得られる、[29]または[68]の脂質またはオイル。
[70]
キャノーラオイル(セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ亜種)、マスタードオイル(セイヨウカラシナ)、他のアブラナオイル、ヒマワリ油(ヒマワリ)、亜麻仁油(アマ)、ダイズオイル(ダイズ)、ベニバナオイル(ベニバナ)、コーンオイル(トウモロコシ)、タバコオイル(タバコ)、ピーナッツオイル(ピーナッツ)、パームオイル、綿実油(ワタ)、ココナッツオイル(ココヤシ)、アボカドオイル(アボカド)、オリーブオイル(オリーブ)、カシューオイル(カシューナッツ)、マカダミアオイル(マカダミア)、アーモンドオイル(アーモンド)、またはシロイヌナズナ種子オイル(シロイヌナズナ)である、[29]、[68]、または[69]の脂質またはオイル。
[71]
[10]から[28]のいずれか1つの前記プロセス、[41]から[46]、もしくは[55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、または[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂肪酸。
[72]
[56]、[57]、または[66]のいずれか1つの種子から得られる種子ミール。
[73]
1またはそれ以上の、[29]、もしくは[59]から[51]のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、[62]の前記脂肪酸、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、[39]もしくは[40]の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、[41]から[46]、もしくは[55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、または[72]の前記種子ミールを含む組成物。
[74]
1またはそれ以上の、[1]から[9]、[29]、もしくは[59]のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、[62]の前記脂肪酸、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、[39]もしくは[40]の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、[41]から46]、もしくは[55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、[72]の前記種子ミール、または[73]の組成物を含む家畜飼料、化粧品、または化学物質。
[75]
家畜飼料を産生する方法であって、
1またはそれ以上の、[1]から[9]、[29]、もしくは[59]のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、[62]の前記脂肪酸、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、[39]もしくは[40]の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、[41]から[46]、もしくは55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、[72]の前記種子ミール、または[73]の前記組成物を、少なくとも1つの他の食品原料成分と混合することを含む、方法。
[76]
PUFAから利益を得る、症状を治療または防止する方法であって、
対象に、1またはそれ以上の、[1]から[9]、[29]、もしくは[59]のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、[62]の前記脂肪酸、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、[39]もしくは[40]の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、[41]から[46]、もしくは[55]のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、[72]の前記種子ミール、[73]の前記組成物、または[74]の前記家畜飼料、を投与することを含む、方法。
[77]
前記症状は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗鬆症、腎結石、AIDS、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵意(aggressive hostility)、副腎白質ジストロフィー(adrenoleukodystophy)、冠動脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼性疾患である、[76]の方法。
[78]
PUFAから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、1またはそれ以上の、[1]から[9]、[29]、もしくは[59]のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、[62]の前記脂肪酸、[30]から[37]のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、[38]の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、[39]もしくは[40]の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、[41]から[46]、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、[47]もしくは[48]の前記トランスジェニック生物、[49]から[53]のいずれか1つの前記油料種子植物、[54]の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、[49]もしくは[56]の前記植物部分、[57]の前記種子、[66]の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、[72]の前記種子ミール、[73]の前記組成物、または[74]の前記家畜飼料、の使用。
[79]
[56]、[57]、または[66]のいずれか1つの種子を得ることと、金銭的利益のために得られた前記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法。
[80]
前記種子を得ることは、[48]から[54]、または[66]のいずれか1つの前記植物を栽培すること、および/または前記植物から前記種子を収穫することを含む、[79]の方法。
[81]
前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、および/または前記種子を保存することをさらに含む、[80]の方法。
[82]
前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む、[79]から[81]のいずれか1つの方法。
[83]
前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用いて行われる、[79]から[82]のいずれか1つの方法。
[84]
a)[56]、[57]、または[66]のいずれか1つに定義された種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および/または収穫することと、
b)前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し、および/または選り分けることと、
c)工程b)で分離された前記種子をふるいにかけおよび/またはソートすること、および容器内に前記ふるいにかけられたおよび/またはソートされた種子をロードすることにより、種子の入った容器を産生することを含む、種子の入った容器を産生するプロセス。
[85]
多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに任意に1またはそれ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが約7%から20%であり、これにより前記エチルエステルを産生する、プロセス。
Claims (85)
- エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸
(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサ
ヘキサエン酸(DHA)、並びに、任意にステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエ
ン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA
)の1またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記DHAのレベ
ルは、約7%から20%である、抽出植物脂質。 - 以下の特徴:
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約2%から
18%の間、または約2%から16%の間、または約2%から15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)の
レベルは、6%未満、または3%未満、または2%未満、または1%未満である、
lxvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、
約1%から約30%の間、約3%から約30%の間、または約6%から約30%の間、ま
たは1%から約20%の間、または約30%から約60%の間、または約45%から約6
0%、または約30%である、
lxviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)の
レベルは、約4%から約35%の間、または約4%から約20%の間、または約4%から
17%の間である、
lxix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)
のレベルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、または約10%から約
35%の間、または約20%から約35%の間、または約4%から16%の間、または約
2%から16%の間である、
lxx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)の
レベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05
%から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、または0
.05%から約2%の間である、
lxxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)
のレベルは、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7
%の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から
約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(
ETA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未
満、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4
%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
lxxiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(
ETrA)のレベルは、4%未満、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、
0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1
%の間である、
lxxiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(
EPA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、
0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2
%の間である、
lxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DP
A)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.0
5%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間
である、
lxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約8
%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%
、約17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から
20%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
lxxvii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5
Δ4,7,10,13,16)を含む、
lxxviii)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22
:5Δ4,7,10,13,16)を実質的に含まない、
lxxix)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質
的に含まない、
lxxx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4
%から約25%の間、または約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、約4%
から約60%の間、約30%から約60%の間、または約45%から約60%の間である
、
lxxxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベル
は、約4%から約35%の間、または約8%から約25%の間、または8%から約22%
の間である、
lxxxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベ
ルは、約20%から約75%の間、または約50%から約75%の間、または約60%か
ら約75%の間である、
lxxxiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは
、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20
%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の
間、または約4%から約10%の間である、
lxxxiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、
約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%か
ら約10%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
lxxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、3
6%から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%
から約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
lxxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、
9%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12
%から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
lxxxvii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂
肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5
の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15
未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
lxxxviii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3
脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.
5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.1
5未満、約0.1、約0.2、または約1.0である、
lxxxix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70
%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、また
は約75%から約90%の間の、Δ12‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のLAへの
転換の効率に基づく、
xc)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少な
くとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間
、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の、Δ6‐デサチュラー
ゼによる、ALAのSDAへの転換の効率に基づく、
xxci)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、
少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約
75%から約85%の間の、Δ6‐エロンガーゼによる、SDAのETA酸への転換の効
率に基づく、
xcii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、
少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約
75%から約98%の間の、Δ5‐デサチュラーゼによる、ETAのEPAへの転換の効
率に基づく、
xciii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%
、少なくとも約90%、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の
、Δ5‐エロンガーゼによる、EPAのDPAへの転換の効率に基づく、
xciv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、
少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約
85%から約95%の間の、Δ4‐デサチュラーゼによる、DPAのDHAへの転換の効
率に基づく、
xcv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少
なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約1
0%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xcvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、
少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約
40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく
、
xcvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%
、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または
約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcviii)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xcix)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約
70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約
99%の間、または約90%から約99%の間であり、
c)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
ci)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.001%か
ら約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含む、または
、これらを実質的に含まない、
cii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも70%または少なくとも
80%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
ciii)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/
18:3(TAG58:12)である、
civ)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、の1もしく
はそれ以上、または全てを有する請求項1の脂質。 - オイルの形態であって、該オイルの重量の少なくとも約90%、または少なくとも約9
5%、少なくとも約98%、または約95%から約98%の間が前記脂質である、請求項
1または請求項2の脂質。 - 1またはそれ以上のステロールをさらに含む、請求項1から3のいずれか1つの脂質。
- オイルの形態であって、約10mgのステロール/gのオイル未満、約7mgのステロ
ール/gのオイル未満、約1.5mgから約10mgの間のステロール/gのオイル、ま
たは約1.5mgから約7mgの間のステロール/gのオイルを含む請求項4の脂質。 - カンペステロール/24‐メチルコレステロール、Δ5‐スチグマステロール、エブリ
コール、β‐シトステロール/24‐エチルコレステロール、Δ5‐アベナステロール/
イソフコステロール、Δ7‐スチグマステロール/スティグマスト‐7‐エン‐3β‐オ
ールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上、または全てを含む請求項4
または請求項5の脂質。 - 約0.5mgのコレステロール/gのオイル未満、約0.25mgのコレステロール/
gのオイル未満、約0mgから約0.5mgの間のコレステロール/gのオイル、もしく
は約0mgから約0.25mgの間のコレステロール/gのオイルを含む、またはコレス
テロールを実質的に含まない、請求項4から6のいずれか1つの脂質。 - 前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイルである、請求項1から7
のいずれか1つの脂質。 - 前記脂質は、アブラナ属種オイル、ワタオイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベ
ニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコシオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオ
イル、ソルガムブルガレオイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイ
スグイネエヌシスオイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアング
スティフォリウスオイル、イネオイル、アフリカイネオイル、カメリナサティバオイル、
クランベアビシニカオイル、ミスカンサスxギガンティウスオイル、またはススキオイル
である、請求項8の脂質。 - i)脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含
み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸
(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリド
ン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびドコサヘキサエン酸(DHA)
、並びに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)およびエイコサテトラエン酸(ETA)
の1またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量
における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含
有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセス。 - 前記抽出脂質は、請求項2から9に定義される1またはそれ以上の特徴を有する、請求
項10のプロセス。 - 前記植物部分が、種子、好ましくは油料種子である、請求項10または請求項11のプ
ロセス。 - 前記種子が、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモ
ロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種
、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフ
ォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ、好まし
くは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバの種子である、請
求項12のプロセス。 - 種子1グラム当たり、少なくとも約18mg、少なくとも約22mg、少なくとも約2
6mg、約18mgから約100mgの間、約22mgから約70mgの間、または約2
4mgから約50mgの間のDHAを、前記種子が含む、請求項12または請求項13の
プロセス。 - 前記植物部分は、以下のセットの酵素:
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラー
ゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロ
ンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュ
ラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐
エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードし、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を
方向づけることが可能である、1またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される
、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項10から14のいずれか1つのプロセス。 - 前記植物部分が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少な
くとも約80%、約60%から約95%の間、約70%から約90%の間、または約75
%から約85%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノ
ール酸に転換する、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少な
くとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約91%の間、または約80
%から約91%の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ω6脂肪酸をω3脂
肪酸に転換する、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少
なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の
間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、1またはそ
れ以上の植物の細胞において、ALAをSDAに転換する、
iv)前記Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0
.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の
間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転
換する、
v)前記Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくと
も約75%、約60%から約95%の間、約70%から約80%の間、または約75%か
ら約80%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、SDAをETAに転
換する、
vi)前記Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少な
くとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約95%の間
、約70%から約95%の間、または約75%から約95%の間の効率で、1またはそれ
以上の植物の細胞において、ETAをEPAに転換する、
vii)前記Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少な
くとも約90%の間、約50%から約90%の間、または約85%から約95%の間の効
率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、EPAをDPAに転換する、
viii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約90%、
少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約
85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、DPAをD
HAに転換する、
ix)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのオレイン酸の転換
の効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%か
ら約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間である、
x)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのLAの転換の効率が
、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%
、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%
の間である、
xi)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのALAの転換の効
率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約
55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間である、
xii)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠
いている対応する細胞よりも、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約15%から
約30%の間、または約22.5%から約27.5%の間で多いω3脂肪酸を含む、
xiii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、、リノール酸(LA)に対してα‐リノレン
酸(ALA)を優先的に不飽和化する、
xiv)前記Δ6‐エロンガーゼは、また、Δ9‐エロンガーゼ活性を有する、
xv)前記Δ12‐デサチュラーゼは、また、Δ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvi)前記Δ6‐デサチュラーゼは、また、Δ8‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvii)前記Δ8‐デサチュラーゼは、また、Δ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
またはΔ6‐デサチュラーゼ活性を有していない、
xviii)前記Δ15‐デサチュラーゼは、また、GLAでω3‐デサチュラーゼ活
性を有し、
xix)前記ω3‐デサチュラーゼは、また、LAでΔ15‐デサチュラーゼ活性を有
する、
xx)前記ω3‐デサチュラーゼは、両方のLAおよび/またはGLAを不飽和化する
、
xxi)前記ω3‐デサチュラーゼは、、LAに対してGLAを優先的に不飽和化する
、
xxii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約10%、少なく
とも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約15%から約30%
の間、または約20%から約25%の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のDHAへ
の転換の効率に基づく、
xxiii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約15%、少な
くとも約20%、少なくとも約22%、約15%から約60%の間、約20%から約40
%の間、または約22%から約30%の間の、前記植物部分におけるLAのDHAへの転
換の効率に基づく、
xxiv)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約17%、少なく
とも約22%、少なくとも約24%、約17%から約65%の間、約22%から約35%
の間、または約24%から約35%の間の、前記植物部分におけるALAのDHAへの転
換の効率に基づく、
xxx)1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐
PC基質よりもアシル‐CoA基質で、より高い活性を有する、
xxxi)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、LAよりもALAで、
より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に
結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高いΔ6‐デサチュ
ラーゼ活性を有する、
xxxiii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、基質としてのALAで、LAと比較して
、少なくとも約2倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくと
も4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有する、
xxxiv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に
結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高い活性を有する、
xxxv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結
合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、少なくとも約5倍高いΔ6
‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有する、
xxxvi)前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
xxxvii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、ETAで、検出可能なΔ5‐デサチュラ
ーゼ活性を有していない、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する請求項15のプロセス。 - 前記植物部分が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、配列番号10で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ
酸配列を含む、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、配列番号12で規定される配列を有するアミノ酸
、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ
酸配列を含む、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、配列番号16で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号16と少なくとも50%同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
iv)前記Δ6‐エロンガーゼが、配列番号25で規定される配列を有するアミノ酸、
配列番号26のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号25および/または配
列番号26と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
v)前記Δ5‐デサチュラーゼが、配列番号30で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号30と少なくとも50%同一であるアミノ酸
配列を含む、
vi)前記Δ5‐エロンガーゼが、配列番号37で規定される配列を有するアミノ酸、
その生物学的に活性な断片、または配列番号37と少なくとも50%同一であるアミノ酸
配列を含む、
vii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、配列番号41で規定される配列を有するアミノ
酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号41と少なくとも50%同一であるアミ
ノ酸配列を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する、請求項15または請求項16のプロセス
。 - 前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)、モノ
アシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、グリセロール‐3‐ホスフ
ェートアシルトランスフェラーゼ(GPAT)、1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフ
ェートアシルトランスフェラーゼ(LPAAT)好ましくはC22多価不飽和脂肪族アシ
ル‐CoA基質を使用し得るLPAAT、アシル‐CoA:リソホスファチジルコリンア
シルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスホリパーゼA2(PLA2)、ホスホリパ
ーゼC(PLC)、ホスホリパーゼD(PLD)、CDP‐コリンジアシルグリセロール
コリンホスフォトランスフェラーゼ(CPT)、ホスファチジル(phoshatidy
l)コリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)、ホスファチジ
ルコリン:ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(PDCT)、アシ
ル‐CoAシンターゼ(ACS)、または2つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせを
コードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項15から17のいずれか1つの
プロセス。 - 前記植物部分が、FAE1、DGAT、MGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT
、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、FATBのようなチオエステラーゼ、
またはΔ12‐デサチュラーゼ、または2つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせから
選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および/または活性を下方制
御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項10か
ら18のいずれか1つのプロセス。 - 少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求
項15から19のいずれか1つのプロセス。 - 少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが、オイル生合成もしくはオレオシンの
ような蓄積遺伝子から、またはコンリニンのような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られ
た、請求項20のプロセス。 - 前記Δ4‐デサチュラーゼおよび前記Δ5‐エロンガーゼをコードする、外因性ポリヌ
クレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の種子の発生以前、ま
たはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を開始し、前記プロモ
ーターが前記Δ12‐デサチュラーゼおよび前記ω3‐デサチュラーゼをコードする前記
外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける、請求項15から21のいずれか1つのプロ
セス。 - 前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるDNA分子
、好ましくはT‐DNA分子において共有結合で結合され、好ましくは前記植物部分の前
記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなDNA分子の数は、1、2もしくは3以下で
あり、または2もしくは3である、請求項15から22のいずれか1つのプロセス。 - 前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ6‐デサチュラーゼをそれぞれ
コードする少なくとも2つの異なる外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項23のプロセ
ス。 - 前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリ
ヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも約40%、または少
なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または約5
0%から約80%の間である、請求項15から24のいずれか1つのプロセス。 - 前記脂質は、オイル、好ましくは油料種子由来の種子オイルの形態であり、前記脂質の
重量の少なくとも約90%、または少なくとも約95%、少なくとも約98%、または約
95%から約98%の間がトリアシルグリセロールである、請求項10から25のいずれ
か1つのプロセス。 - 前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記DHAのレベルを増加させるために
前記脂質を処理することをさらに含む、請求項10から26のいずれか1つのプロセス。 - 前記処理がエステル交換反応である、請求項27のプロセス。
- 請求項10から28のいずれか1つのプロセスを用いて産生された、脂質または該脂質
を含むオイル。 - 単一のDNA分子に全て共有結合で結合される、第1の遺伝子、第2の遺伝子、第3の
遺伝子、第4の遺伝子、第5の遺伝子、および第6の遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子コ
ンストラクトであって、
第1、第2、および第3の遺伝子が第1の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第
4、第5、および第6の遺伝子が第2の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび/また
はポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、およ
び転写ターミネーター、および/またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記DNA分子が3、4、5、または6つの異なるプロモーターを
含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、1もしくはそれ以上のまた
は全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性で
あり、
前記第1の遺伝子の転写の方向が、前記第3の遺伝子から離れており、前記第3の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第4の遺伝子の転写の方向が、前記第6の遺伝子から離れており、前記第6の遺伝
子の転写の方向と反対であり、
前記第2の遺伝子の転写の方向が、前記第1の遺伝子または前記第3の遺伝子と同じで
あり、
前記第5の遺伝子の転写の方向が、前記第4の遺伝子または前記第6の遺伝子と同じで
あり、
前記第2の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約
0.2から約3.0キロベースの間の第1のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、前記第1または第3の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約1.0から約10.0キロベースの間の第2のスペーサー領域により前記第1の遺伝
子クラスターが第2の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第5の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約
0.2から約3.0キロベースの間の第3のスペーサー領域により、より近いいずれかの
、第4または第6の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く、キメラ遺伝子コンストラ
クト。 - 前記DNA分子が、約1.0から約10.0キロベースの間のスペーサー領域により、
より近いいずれかの、前記第1の遺伝子クラスターまたは前記第2の遺伝子クラスターか
ら間隔を置く第7の遺伝子を含む、請求項30の遺伝子コンストラクト。 - 前記DNA分子が、2つまたはそれ以上の異なる転写ターミネーターおよび/またはポ
リアデニル化領域を含む、請求項30または請求項31の遺伝子コンストラクト。 - 少なくとも1つの前記スペーサー領域がマトリックス結合領域(MAR)を含む、請求
項30から32のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。 - 前記DNA分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み、かつT‐DNA分子で
ある、請求項30から33のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。 - アグロバクテリウム細胞である、または植物細胞のゲノムに組み込まれる、請求項30
から34のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。 - 少なくとも1つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼをコ
ードする、請求項30から35のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。 - 請求項15に定義される酵素のセットをコードする遺伝子、および/または請求項16
または17に定義される酵素をコードする1またはそれ以上の遺伝子を含む、請求項36
の遺伝子コンストラクト。 - i)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、ま
たは45のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、
または45に示される1またはそれ以上の配列と、少なくとも95%同一または99%同
一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および/または外因性ポリヌクレオチド。 - 請求項38のポリヌクレオチドおよび/または請求項30から37のいずれか1つの前
記遺伝子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクト。 - 配列番号11、14、18、22、23、28、34、35、39、もしくは45のい
ずれか1つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号11、14、18、
22、23、28、34、35、39、もしくは45で示される1もしくはそれ以上の前
記配列と少なくとも95%同一もしくは99%同一である前記ヌクレオチドの配列は、プ
ロモーターに操作可能に結合される、請求項39のベクターまたは遺伝子コンストラクト
。 - 以下のセットの酵素:
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラー
ゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロ
ンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デ
サチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4
‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ
4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュ
ラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐
エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができるように、1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞
。 - 請求項1から9のいずれか1つに定義される脂質を含み、または1もしくはそれ以上の
または全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、請求項16または請求項17
に定義される1またはそれ以上の特徴を有する、請求項41の細胞。 - i)配列番号10に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ12‐デサチュラーゼを
コードする第1の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列と、
ii)配列番号12に規定される配列を有するアミノ酸を含むω3‐デサチュラーゼを
コードする第2の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号
12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列とを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけるこ
とができる1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。 - 1またはそれ以上の請求項38の前記ポリヌクレオチド、請求項30から37のいずれ
か1つの前記遺伝子コンストラクト、または請求項39もしくは請求項40の前記ベクタ
ーもしくは遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。 - 植物における、植物部分におけるものである、および/または成熟した植物種子の細胞
である、請求項41から44のいずれか1つの細胞。 - 前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である、請求項45
の細胞。 - 請求項41から46のいずれか1つの細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物。
- トランスジェニック植物である、請求項47のトランスジェニック非ヒト生物。
- a)その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含み、
および
b)以下のセットの酵素:
i)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/または真菌のΔ
15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュ
ラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
ii)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌
のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサ
チュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、の1つをコードする外因
性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発
現を方向づけることができるように1またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可
能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸
(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリド
ン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)、
ならびに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)および/またはエイコサテトラエン酸(
ETA)を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは約7%から20%である
、油料種子植物。 - 前記植物は、キャノーラ、ダイズ、カメリナサティバ、またはシロイヌナズナ植物であ
る、請求項49の植物。 - 1またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐CoA基質を使用することができ
る、請求項49または請求項50の植物。 - 1またはそれ以上の前記Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチ
ュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼは、もし存在する場合には、アシル‐CoA基質
を用いることができ、好ましくは、i)Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、
およびΔ4‐デサチュラーゼ、またはii)Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラー
ゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼのそれぞれは、アシル‐CoA基質を用いることができ
る、請求項51の植物。 - 前記植物の成熟した、収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg
、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なく
とも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラム
の種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mg
のDHA含有量を有する、請求項49から52のいずれか1つの植物。 - DHAを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、また
はカメリナサティバ植物であって、
前記植物の成熟した、収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg
、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なく
とも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラム
の種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mg
のDHA含有量を有する植物。 - 前記外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項49から54のいずれか1つの植物の植物
細胞。 - 以下の特徴:
i)請求項48から54のいずれか1つの植物由来である、
ii)請求項1から9のいずれか1つに定義される脂質を含む、
iii)請求項10から28のいずれか1つのプロセスで使用され得る、
iv)請求項30から37のいずれか1つの遺伝子コンストラクトを含む、または
v)請求項14、41、または48から52のいずれか1つに定義される外因性ポリヌ
クレオチドのセットを含む、
の1またはそれ以上を有する植物部分、好ましくは種子。 - DHAおよび重量で約4%から約15%の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫され
たセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子であって、
前記種子の前記DHAの含有量は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ま
しくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約
36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子
あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgである
、種子。 - 請求項1から9のいずれか1つに定義される、1もしくはそれ以上のまたは全ての特徴
を含む、抽出脂質を産生するために使用され得る、請求項41から46、もしくは55の
いずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物
、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウア
ブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項
56の前記植物部分、または請求項57の前記種子。 - 請求項41から45のいずれか1つの細胞を産生する方法であって、
a)前記細胞、好ましくは、LC‐PUFAを合成することができない細胞に、請求項
30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および
/または外因性ポリヌクレオチド、請求項39または請求項40の前記ベクターまたは遺
伝子コンストラクト、請求項14、41から43、または48から52のいずれか1つに
定義される1またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
b)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
c)任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
d)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、を
含む方法。 - 前記細胞における脂質が、1またはそれ以上の請求項1から9に定義される特徴を有す
る、請求項59に記載の方法。 - 前記遺伝子コンストラクト、前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、前記
ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチドの組み合わせは、
前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる、請求項59または請求項60に記載の方法
。 - 前記細胞は植物細胞であり、前記方法は、工程a)の前記細胞から形質転換植物を再生
する工程をさらに含む、請求項59から61のいずれか1つの方法。 - 前記遺伝子および/または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前記細胞内に発現され
る、請求項62の方法。 - 請求項59から63のいずれか1つの方法を用いて産生される細胞。
- 種子を産生する方法であって、
a)好ましくは少なくとも1000のこのような植物の個体群の一部としてのフィール
ドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも1ヘクタールのエリアで、
請求項48から54のいずれか1つの植物、または請求項10から28、56、もしくは
57のいずれか1つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
b)前記植物の1つまたは複数から種子を収穫することと、
c)任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgDHA/
ヘクタールの総DHA収率を有するオイルを産生することと、
を含む、方法。 - 以下の特徴:
i)前記オイルが請求項2、または4から7のいずれか1つに定義される、
ii)前記植物部分または種子が、請求項14、16から19、21から28のいずれ
か1つのプロセスで使用され得る、
iii)前記外因性ポリヌクレオチドが、請求項30から35のいずれか1つの遺伝子
コンストラクトに含まれる、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドは、請求項38の外因性ポリヌクレオチドを含む、
v)前記植物細胞は、請求項43の細胞である、
vi)前記種子は、請求項65の方法で産生された、
の1またはそれ以上を有する、請求項48から57のいずれか1つの前記植物、植物細胞
、植物部分、または種子。 - 1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび/もしくは脂肪酸エロンガーゼ、ま
たは1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに1もしくはそれ以上の脂肪酸エ
ロンガーゼを産生する方法であって、
請求項36または請求項37の前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離およ
び/または外因性ポリヌクレオチド、請求項39または請求項40の前記ベクターまたは
遺伝子コンストラクト、1またはそれ以上の請求項14、41から43、または48から
52のいずれか1つで定義される外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、細胞でまたは
細胞フリーの発現システムで発現することを含む方法。 - 請求項10から28のいずれか1つの前記プロセス、請求項41から46、もしくは5
5のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは48の前記トランスジェニック生物、
請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブ
ラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項5
6の前記植物部分、請求項57の前記種子、または請求項66の前記植物、植物細胞、植
物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂質またはオイル。 - 油料種子のオイルの抽出により得られる、請求項29または請求項68の脂質またはオ
イル。 - キャノーラオイル(セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ亜種)、マスタードオイル(
セイヨウカラシナ)、他のアブラナオイル、ヒマワリ油(ヒマワリ)、亜麻仁油(アマ)
、ダイズオイル(ダイズ)、ベニバナオイル(ベニバナ)、コーンオイル(トウモロコシ
)、タバコオイル(タバコ)、ピーナッツオイル(ピーナッツ)、パームオイル、綿実油
(ワタ)、ココナッツオイル(ココヤシ)、アボカドオイル(アボカド)、オリーブオイ
ル(オリーブ)、カシューオイル(カシューナッツ)、マカダミアオイル(マカダミア)
、アーモンドオイル(アーモンド)、またはシロイヌナズナ種子オイル(シロイヌナズナ
)である、請求項29、68、または69の脂質またはオイル。 - 請求項10から28のいずれか1つの前記プロセス、請求項41から46、もしくは5
5のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは48の前記トランスジェニック生物、
請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブ
ラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項5
6の前記植物部分、請求項57の前記種子、または請求項66の前記植物、植物細胞、植
物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂肪酸。 - 請求項56、57、または66のいずれか1つの種子から得られる種子ミール。
- 1またはそれ以上の、請求項29、もしくは59から51のいずれか1つの前記脂質も
しくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝
子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請
求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41
から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前
記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請
求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、
請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前
記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、または請求項72の前記種子ミールを含む
組成物。 - 1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質
もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺
伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、
請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項4
1から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の
前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、
請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物
、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の
前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、または請
求項73の組成物を含む家畜飼料、化粧品、または化学物質。 - 家畜飼料を産生する方法であって、
1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質
もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺
伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、
請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項4
1から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の
前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、
請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物
、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の
前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、または請
求項73の前記組成物を、少なくとも1つの他の食品原料成分と混合することを含む、方
法。 - PUFAから利益を得る、症状を治療または防止する方法であって、
対象に、1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの
前記脂質もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つ
の前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレ
オチド、請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、
請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求
項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種
子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサテ
ィバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求
項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、
請求項73の前記組成物、または請求項74の前記家畜飼料、を投与することを含む、方
法。 - 前記症状は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗鬆症、腎結石、AIDS
、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群
、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵
意(aggressive hostility)、副腎白質ジストロフィー(adrenoleukodystophy)、冠動
脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎
、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出血、子宮内膜症、月経前
症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼性疾患である、請求項7
6の方法。 - PUFAから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、1ま
たはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質もしく
はオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コ
ンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項
39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41から
46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記ト
ランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項
54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求
項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前記植
物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、請求項73の前
記組成物、または請求項74の前記家畜飼料、の使用。 - 請求項56、57、または66のいずれか1つの種子を得ることと、金銭的利益のため
に得られた前記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法。 - 前記種子を得ることは、請求項48から54、または66のいずれか1つの前記植物を
栽培すること、および/または前記植物から前記種子を収穫することを含む、請求項79
の方法。 - 前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、および/または前記種子
を保存することをさらに含む、請求項80の方法。 - 前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む、請求項79か
ら81のいずれか1つの請求項の方法。 - 前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用いて行われる、請求項79
から82のいずれか1つの請求項の方法。 - a)請求項56、57、または66のいずれか1つに定義された種子を含む植物の地上
部分を刈り取り、並べ、および/または収穫することと、
b)前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し
、および/または選り分けることと、
c)工程b)で分離された前記種子をふるいにかけおよび/またはソートすること、お
よび容器内に前記ふるいにかけられたおよび/またはソートされた種子をロードすること
により、種子の入った容器を産生することを含む、種子の入った容器を産生するプロセス
。 - 多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽
出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸
、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、
およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに任意に1またはそれ以上のステアリドン酸
(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、および
エイコサテトラエン酸(ETA)を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前
記DHAのレベルが約7%から20%であり、これにより前記エチルエステルを産生する
、プロセス。
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