JP4744049B2 - 改質したポリ不飽和脂肪酸を有する植物 - Google Patents
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Description
導入部分
本出願は、1999年8月26日に出願された米国仮特許出願第60/151,224号、および1999年12月17日に出願された米国仮特許出願第60/172,128号への優先権を特許請求するものである。
【0002】
技術分野
本発明は核酸配列および構築体、およびこれらに関する方法を対象とする。
【0003】
背景
植物油はさまざまな用途において使用される。生合成または天然植物源からの、新規な植物油組成物および/または油組成物を得るための改良された手段が必要とされている。意図する油の使用に応じて、さまざまな異なる脂肪酸組成物が望まれる。
【0004】
このような油および/または改質された脂肪酸組成物を得るために必要とされる1つの手段は、植物の遺伝子工学によるものである。しかしながら、所望の表現型結果を生み出すことができる適切な核酸配列、このような配列の適切な用途を指示することができる調節領域などを同定することが必要である。
【0005】
高等植物は、共通の代謝経路(脂肪酸シンターゼ経路)を介して脂肪酸を合成するようである。脂肪酸がグリセロール骨格に結合し、さらなる発芽用のエネルギー源として貯蔵用のトリグリセリドを形成する、増殖中の種子においては、プロプラスチド中にFAS経路が位置している。最初に行われるステップは、酵素アセチル−CoA:ACPトランスアシラーゼ(ATA)によって触媒される、アセチル−CoAおよびACPからのアセチル−ACP(アセチル保有タンパク質)の形成である。アセチル−CoAから炭素16および18個の脂肪酸への伸長は、以下の順序の反応の周期的作用を含む:マロニル−ACPからの2つの炭素ユニットを縮合させてβ−ケトアシル−ACP(β−ケトアシル−ACPシンターゼ)を形成し、ケト機能をアルコールに還元して(β−ケトアシル−ACPリダクターゼ)、エノイル−ACPを形成するために脱水させ(β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラーゼ)、最後にエノイル−ACPを還元して伸長した飽和アシル−ACPを形成する(エノイル−ACPリダクターゼ)。β−ケトアシル−ACPシンターゼIはパルミトイル−ACP(C16:0)までの伸長を触媒し、一方β−ケトアシル−ACPシンターゼIIはステアロイル−ACP(C18:0)への最終的な伸長を触媒する。貯蔵グリセリド中に見られるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの一般的な植物の不飽和脂肪酸は、ステアロイル−ACPの飽和度低下から誘導されるものであり、可溶性プラスチドΔ−9デサチュラーゼ(「ステアロイル−ACPデサチュラーゼ」と呼ばれることも多い)によって触媒される反応においてオレオイル−ACP(C18:1)を形成する。分子状の酸素には飽和度低下が必要であり、還元されたフェドロキシンがエレクトロン共ドナーとして働く。Δ−12デサチュラーゼおよびΔ−15デサチュラーゼが結びついた膜の作用によって、さらなる飽和度低下が順次に行われる。これらの「デサチュラーゼ」は、このようにしてモノまたはポリ不飽和脂肪酸をそれぞれ生み出す。
【0006】
表現型がFASとなる核酸配列を得ると、油を生成させるための飽和度低下および/または脂肪酸のグリセロール骨格への取り込みは、当該代謝因子の同定、有用な動的性質を有する酵素源の選択および特徴付け、そのアミノ酸のシークエンシングが可能であるレベルまでの当該のタンパク質の精製(アミノ酸配列データを使用して所望のDNA配列を探索するためのプローブとして使用することができる核酸配列を得る)、および構築体の調製、結果として生じる植物の形質転換および分析を含めた(これらだけには限られないが)さまざまな障害の影響を受ける。
【0007】
したがって、さらなる核酸配列標的および脂肪酸組成物を改質するための方法が必要とされる。詳細には、さまざまな範囲の異なる脂肪酸組成物を生成するための構築体および方法が必要とされる。
【0008】
発明の概要
本発明は一般に、ゲノムデサチュラーゼポリヌクレオチド、詳細には二重結合の脂質アシル部分〔脂質アシル鎖においてカルボキシル末端から数えて12番目(Δ12デサチュラーゼまたはfad2)または15番目(Δ15デサチュラーゼまたはfad3)の炭素位置〕への挿入を触媒する酵素をコードしているゲノムデサチュラーゼポリヌクレオチドを対象とする。さらに本発明は、このようなゲノムポリヌクレオチド配列の単離した非コード領域(特にイントロンおよびプロモーター領域を含むもの)を提供する。Δ12およびΔ15デサチュラーゼのプロモーターおよびイントロン配列から誘導される部分的または完全な配列を含む、特異的なオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書で開示する配列は大豆植物から得られるが、大豆のデサチュラーゼ配列と相同であるか同一性があるデサチュラーゼゲノムポリヌクレオチド配列のイントロンおよびプロモーター領域から、追加的な配列を誘導することができることが企図される。以下に記載する標準的な方法を使用して、さまざまな植物源(特に油種穀物)から、このような追加的なデサチュラーゼ配列を得ることができる。
【0009】
植物中の脂肪酸組成物を改質するために使用することができる組換えDNA構築体を提供すること、Δ12およびΔ15デサチュラーゼなどのデサチュラーゼ遺伝子またはタンパク質の転写または転写および翻訳(発現)を改質することも本発明の態様である。本発明は特に、ゲノムクローンのイントロンおよびプロモーター領域から誘導される配列を含むDNA構築体を対象とし、前記配列はDNA構築体においてセンスまたはアンチセンス方向にある。次いでこれらのDNA構築体を使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、脂肪酸のレベルが改質された(特にオレイン酸、リノールおよびリノレン酸のレベルが改質された)植物を生成させる。オレイン酸のレベルを増大させリノール酸およびリノレン酸のレベルを低下させるために、Δ12およびΔ15デサチュラーゼの遺伝子発現をダウンレギュレートさせるための構築体および方法を提供することが詳細には企図される。油種穀物の種組織中の脂肪酸組成を変化させることが詳細には企図される。
【0010】
Δ12およびΔ15デサチュラーゼポリヌクレオチドの発現によって得られる改質された植物細胞、植物、種子および油も、本発明の一部分であるとみなされる。さらに、それぞれの脂肪酸の特異的相対レベルを有する油組成物を生成することが企図される。1つの好ましい実施形態は少なくとも約80〜85%のオレイン酸、わずか約1〜2%のリノレン酸、およびわずか約1〜3%のリノール酸を含み、第2の好ましい実施形態は少なくとも約50〜75%のオレイン酸、少なくとも約10〜30%のリノレン酸、およびわずか約1〜3%のリノール酸を含む。
発明の詳細な説明
【0011】
本発明は、ゲノムデサチュラーゼ配列、特に宿主細胞源からのゲノム脂肪酸デサチュラーゼ核酸配列から単離された非コード配列を定める。本発明のデサチュラーゼ配列としては、細胞源から得ることができる蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドなどの源からのアミノ酸をコードする全ての非コード領域など任意の核酸ゲノム配列が挙げられ、それは、植物宿主細胞中、すなわちインビボでの、または植物細胞様環境中、すなわちインビトロでの脂肪酸アシル部分への2重結合の挿入を触媒できる。以下にさらに詳細に記載するように、カルボキシル末端から計数される脂肪酸アシル鎖における炭素12位(Δ12デサチュラーゼ)および炭素15位(Δ15デサチュラーゼ)に2重結合を付加する酵素をコードする具体的なゲノムポリヌクレオチド配列を提供する。さらに、このようなゲノム配列の特異的な非コード領域をここに提供する。
【0012】
用語の「非コード」とは、発現された蛋白質の一部または全部をコードしないポリヌクレオチドの配列を言う。非コード方向としては、限定しないが、イントロン類、プロモーター領域および5’不飽和領域が挙げられる。
【0013】
ここで用いられる用語の「イントロン」とは、発現された蛋白質の一部または全部をコードしないポリヌクレオチドのセグメント、通常はDNAを意味するものとして用語の通常の意味を言う。
【0014】
ここで用いられる用語の「エキソン」とは、発現された蛋白質の一部または全部をコードするポリヌクレオチドのセグメント、通常はDNAを意味する用語の通常の意味を言う。
【0015】
したがって、用語の「イントロン」とは、RNA分子に転写される遺伝子領域ではあるが、それは、RNAが蛋白質に転写される前にRNAからスプライシングされるものを言う。RNAに転写され、引き続き蛋白質に翻訳される遺伝子領域を言う用語の「エキソン」とは対照的である。
【0016】
配列一覧表および実施例において詳細に記載されるように、ゲノムΔ12デサチュラーゼ配列およびΔ15デサチュラーゼ配列およびこのような配列から得られたイントロンおよびプロモーター領域をここに提供する。特に、2種のΔ12デサチュラーゼゲノムクロ−ンが同定され、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:23に記載される。単独Δ15デサチュラーゼゲノムクローンが同定され、SEQ ID NO:3に記載される。単独イントロン領域が、Δ12デサチュラーゼゲノムクローンの各々から得られ、それぞれSEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:24が供される。Δ12デサチュラーゼゲノムクローンの各々からプロモーター領域は、それぞれSEQ ID NO:1(塩基対1−1094)およびSEQ ID NO:23(塩基対1−1704)に含まれる。Δ15デサチュラーゼは、コード領域(SEQ ID NO:4、5、6、7、8、25、26として記載される)内に7種のイントロンを含んでいた。また、予備的結果は、5’非翻訳領域内に追加イントロンがあることを示唆している。
【0017】
ここで記載された配列は大豆から得られるが、イントロン領域およびプロモーター領域は、大豆デサチュラーゼ配列に対して相同性があるかまたは同一性を有するデサチュラーゼゲノムポリヌクレオチド配列から得ることができることが考慮されている。特に、配列を、他の植物源および特に油料種子穀物から得ることができる。このようなゲノム配列は標準方法を用いて得ることができるが、その幾つかを以下に記載する。
【0018】
本発明の配列は、植物における脂肪酸組成物を修飾できるのに使用できる(実施例3および表Iを参照)。特に、センスおよびアンチセンス抑制を、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸の広範囲な濃度を獲得するために使用できることが示されている。特に、オレイン酸の濃度が約26〜80%の範囲であり得、リノール酸の濃度が約2.97〜49.92%の範囲であり得、リノレン酸の濃度が約3.38〜8.81%の範囲であり得ることが示されている。しかし、これらは達成され得る広範囲の単に代表にすぎない。さらに、配列の組合せが追加の脂肪酸組成物を獲得するために使用できることが意図されている。ある一定の組成物が、油の意図的使用に基づいて好まれる。1つの好ましい組成物として、少なくとも約50〜75%のオレイン酸、少なくとも約10〜30%のリノール酸および約3%以下のリノレン酸が挙げられる。特に好ましい実施形態は、少なくとも約60〜70%のオレイン酸、少なくとも約15〜20%のリノール酸および約3%以下のリノレン酸が挙げられる。
【0019】
ここに記載される実施例が、関心のある遺伝子をダウンレギュレートするためにセンスまたはアンチセンス抑制を利用するが、遺伝子発現を変更する他の方法を使用できることが考慮されている。特に、ここに同定された非コード領域に特異的に結合するようにデザインできるDNA結合蛋白質を用いて、遺伝子発現がダウンレギュレートできるか、またはリボチームがこのような非コード領域を開裂するために利用できることが考慮されている。さらに、以下に記載されているように、当業界によく知られている遺伝子発現のダウンレギュレーションの方法が考慮され、本発明の配列と共に使用できる。
【0020】
単離ポリヌクレオチド、蛋白質およびポリペプチド
本発明の第1の態様は、単離デサチュラーゼポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム核酸配列から得ることができる単離ポリヌクレオチドを含む。
【0021】
本発明は、配列一覧表に記載される各配列に対してその全長に亘り同一のポリヌクレオチド配列を提供する。該ポリヌクレオチドとしては、例えば限定しないが、転写された非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、mRNAを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルなどの非コード5’および3’配列などの非コード配列、および追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列が挙げられる。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するためにマーカー配列を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、構造遺伝子および遺伝子発現を制御する天然関連配列を含んで成るポリヌクレオチドが挙げられる。
【0022】
本発明はまた、式:X−(R1)n−(R2)−(R3)n−Yのポリヌクレオチドを含み、式中5’末端におけるXは、水素であり、3’末端におけるYは水素または金属であり、R1およびR3は、任意の核酸残基であり、nは、1から3000、好ましくは1から1000の間の整数であり、R2は、本発明の核酸配列、特に配列一覧表に記載された群から選ばれた核酸配列、好ましくはSEQ ID NO:1〜8および23〜29である。式中、R2は、その5’末端残基はR1に結合して左側にあり、その3’末端残基はR3に結合して右側にあるように配向されている。Rが1よりも大きい何れかのR基により示される核酸残基の任意の伸長は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーの何れか、好ましくはヘテロポリマーであり得る。
【0023】
さらに発明の好ましい実施形態は、発明のポリヌクレオチドに対し全長に亘り少なくとも50%、60%または70%同一であり、またこのようなポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。発明のポリヌクレオチドに対し全長に亘り少なくとも80%同一の領域を含んで成るポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドがさらに好ましい。この点で、全長に亘り少なくとも90%同一のポリヌクレオチドは特に好ましく、少なくとも95%同一のものはとりわけ好ましい。さらに、少なくとも97%の同一性を有するものは、大いに好ましく、また少なくとも98%および99%の同一性を有するものは、特に大いに好ましく、少なくとも99%の同一性を有するものは、最も大いに好ましい。
【0024】
好ましい実施形態は、ゲノムポリヌクレオチド配列から得られ、配列一覧表に記載されるポリヌクレオチドである。
【0025】
さらに本発明は、上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、上記ポリヌクレオチドに対して緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。ここで用いられる用語「緊縮条件」および「緊縮ハイブリダイゼーション条件」とは、配列間に少なくとも95%、また好ましくは少なくとも97%の同一性があれば、一般にハイブリダイゼーションが起こることを意味する。緊縮ハイブリダイゼーション条件の例としては、50%ホルムアミド、5xSSC(150mMNaCl、15mMクエン酸トリナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート(Denhardt)溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含んで成る溶液中、42℃で一晩培養し、次いで約65℃で0.1xSSC中ハイブリダイゼーション支持体を洗浄するものである。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989年)の特に11章に例示されている。 本発明はまた、前記ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有するプローブを用いて、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、配列一覧表に記載されたポリヌクレオチド配列に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーをスクリーニングにより獲得できるポリヌクレオチド配列から本質的に成るポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチド配列の単離を提供する。このようなポリヌクレオチドを獲得するのに有用なフラグメントとしては、例えばここに記載されるプローブおよびプライマーが挙げられる。
【0026】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してここに検討されているように、例えば本発明のポリヌクレオチド類は、RNA、cDNAまたはゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして使用でき、ポリヌクレオチドをコードする完全長cDNA類またはゲノムクローン類を単離し、また配列一覧表に記載されたポリヌクレオチドと高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAまたはゲノムクローン類を単離する。このようなプローブは、一般に少なくとも15個の塩基を含んで成る。好ましくはこのようなプローブは、少なくとも30個の塩基を有することになり、少なくとも50個の塩基を有することができる。特に好ましいプローブ類は、30個の塩基から50個までの塩基を有する。
【0027】
配列一覧表に記載されたポリヌクレオチド配列を含む、または含まれる各遺伝子領域は、配列一覧表で与えられたDNA配列を用いてスクリーニングにより単離し、オリゴヌクレオチドのプローブを合成し得る。次いで本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する標識ポリヌクレオチドを用いて、cDNA、ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーンし、そのプローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する。例えば、デサチュラーゼプロモーターとイントロンの配列に一致する合成オリゴヌクレオチドが作製される。特に、ファージベクターにおけるcDNAライブラリーのスクリーニングは、背景ハイブリダイゼーションレベルがより低いため、このような方法において有用である。
【0028】
典型的には、核酸プローブの使用から得られるデサチュラーゼ配列は、標的デサチュラーゼ配列とプローブに用いた配列との間に60〜70%の配列同一性を示すであろう。しかし、50〜60%という小さな配列同一性を有する長配列もまた得られるであろう。核酸プローブは、核酸配列の長断片であり得るか、またはより短いオリゴヌクレオチドプローブでもあり得る。より長い核酸断片をプローブとして使用する場合(約100bpよりも大)、プローブに用いた配列から20〜50%の偏差(すなわち、50〜80%の配列相同性)を有する配列を標的サンプルから得るために、低緊縮にてスクリーニングし得る。オリゴヌクレオチドプローブは、デサチュラーゼ酵素をコードする全核酸配列よりかなり短くてもよいが、少なくとも約10個のヌクレオチドである必要があり、好ましくは少なくとも約15個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20個のヌクレオチドである。より短い領域を用いる場合は、より長い領域に対比して、より高い程度の配列同一性が望まれる。したがって、他の関連するデサチュラーゼ遺伝子の検出および回収に関して、オリゴヌクレオチドのプローブを設計するためには、保存度の高いアミノ酸配列領域を同定することが望ましい。特に保存度の高い配列を同定できる場合、より短いプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)にとり特に有用なことが多い(Gouldら、PNAS USA (1989)86:1934−1938を参照)。
【0029】
当業界で十分理解されている「同一性」とは、配列の比較により決定される際の2つ以上のポリペプチド配列間の関係、または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当業界における「同一性」はまた、このような配列鎖の間のマッチにより決定される際の、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列無関係の程度を意味する。「同一性」は、限定しないが、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.ら、オックスフォード大学プレス、ニューヨーク(1988);Biocomputing:infomatics and Genome Projects,Smith,D.W.ら、アカデミックプレス、ニューヨーク(1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.ら、ヒューマナプレス、ニュージャージー(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.、アカデミックプレス(1987);Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux,Jら、ストックトンプレス、ニューヨーク(1991);およびCarillo,H.、およびLipman,D.,SIAM J Applied Math,48:1073(1988)に記載されたものを含む公知の方法により容易に算出できる。同一性を決定する方法は、試験した配列間で最大に付合するようにデザインされる。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手できるプログラムに体系化されている。2つの配列間の同一性を決定するのに使用できるコンピュータープログラムは、限定しないが、GCG(Devereux,Jら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984);一揃いの5種類のBLASTプログラム、すなわちヌクレオチド配列照会用にデザインされた3種(BLASTN,TBLASNおよびTBLASTX)および蛋白質配列照会用にデザインされた2種(BLASTNおよびTBLASN)(Coulson,Trends in Biotechnology,12:76−80(1994);Birrenら、Genome Analysis,1:543−559(1997))が挙げられる。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他の情報源(BLAST Mannual,Altschul,Sら、NCBI NLM NIH、メリーランド州ベセスダ;Altschul,Sら、J.Mol.Bio.,215:403−410(1990))から公的に入手できる。よく知られたSmith Waterman演算法もまた、同一性を決定するのに使用できる。
【0030】
ポリペプチド配列比較用パラメータは、一般に以下のものが挙げられる:
演算法:NeedlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.48:443−453(1970)
比較マトリクス:HentikoffおよびHentikoffからのBLOSSUM 62、Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10915−10919)1992)
ギャップペナルティー:12
ギャップ長ペナルティー:4
これらのパラメータと共に使用できるプログラムは、ウィスコン州マジソンの遺伝学コンピューターグループから「gap」プログラムとして公的に入手できる。末端gapにペナルティーの無い上記パラメータは、ペプチド比較用デフォルトパラメータである。
【0031】
ポリヌクレオチド配列比較用パラメータは以下のものを含む:
演算法:NeedlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.48:443−453(1970)
比較マトリクス:マッチ=+10;ミスマッチ=0
ギャップペナルティー:50
ギャップ長レングスペナルティー:3
これらのパラメータと共に使用できるプログラムは、ウィスコン州マジソンの遺伝学コンピューターグループから「ギャップ」プログラムとして公的に入手できる。上記パラメータは、核酸比較用デフォルトパラメータである。
【0032】
免疫学的スクリーニングに関して、蛋白質に対する抗体は、ウサギまたはマウスに精製蛋白質またはその部分を注射することにより調製できるが、抗体を調製するこのような方法は当業者によりよく知られている。一般的にポリクローナル抗体は遺伝子単離のためにより有用であるが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れをも産生できる。コードされた蛋白質に対する抗体との交差反応により決定される際、ウェスタン分析は、関連蛋白質が所望の植物種の粗製抽出物に存在することを決定するために実施され得る。交差反応性を観察する場合、関連蛋白質をコードする遺伝子は、所望の植物種を示す発現ライブラリーのスクリーニングにより単離される。発現ライブラリーは、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(1989年)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハーバーラボラトリー)により記載されているように、ラムダgt11を含む商品として入手できる種々のベクター類にて構築できる。
【0033】
植物構築体および使用方法
宿主植物細胞における本発明のデサチュラーゼゲノム配列の転写を方向づけるために、組換えDNA構築体におけるポリヌクレオチド配列の使用が特に興味深い。発現構築体は、一般に本発明の核酸配列に操作して結合された宿主植物細胞において機能的なプロモーターおよび宿主植物細胞において機能的な転写終結領域を含んで成る。
【0034】
当業者は、植物細胞において機能的であり、文献に記載されている多くのプロモーター類があることを認識されるであろう。クロロプラストおよびプラスチド特異的プロモーター類、クロロプラストまたはプラスチド機能性プロモーター類およびクロロプラストまたはプラスチド操作可能プロモーター類も考えられる。
【0035】
1セットのプロモーター類は、たいていの植物器官中に高レベルの発現を生じるCaMV35SプロモーターまたはFMV35Sプロモーターなどの構成プロモーター類である。CaMV35SプロモーターおよびFMV35Sプロモーターの増強形または複製形は、本発明の実施に有用である(Odellら、(1985)Nature 3131:810−812;Rogers、米国特許第5,378,619号)。さらに、葉、幹、根、塊茎、種子、果実など植物の特定の組織において本発明の配列発現をもたらすことが好ましいと思われるが、選ばれたプロモーターは、所望の組織および発生特異性を有する必要がある。
【0036】
植物種子組織に優先的に発現する転写開始領域からの本発明の核酸配列の発現が特に興味深い。このような種子優先転写開始配列の例としては、植物保存蛋白質遺伝子をコードする配列または油料種子における脂肪酸生合成に関連する遺伝子から誘導された種子優先転写開始配列が挙げられる。このようなプロモーター類の例としては、ナピン(napin)(Kridleら、Seed Sci.Res.1:209:219(1991))、ファセオリン、ゼイン、大豆トリプシン阻害剤、ACP、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ、β−コングリシニン(conglycinin)の大豆α’サブユニット(Chenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,83:8560−8564(1986))およびオレオシン(oleosin)などの遺伝子からの5’調節領域が挙げられる。
【0037】
デサチュラーゼを与える蛋白質の局在化を特定の細胞内区画、例えばミトコンドリア、小胞体、液胞、クロロプラストまたは他のプラスチド区画へと方向付けることは有利である。例えば、本発明の興味のある遺伝子が、発現のためにクロロプラストなどのプラスチドに向けられる場合、構築体はまた、遺伝子をプラスチドに向けさせる配列利用を用いることとなる。このような配列は、ここではクロロプラスト透過ペプチド(CTP)またはプラスチド透過ペプチド(PTP)と呼ばれる。本様式において、興味のある遺伝子を、プラスチドに直接挿入しない場合、発現構築体はさらに、興味のある遺伝子をプラスチドに向けさせる透過ペプチドをコードする遺伝子を含む。該クロロプラスト透過ペプチドは、興味のある遺伝子から誘導されてもよく、またはCTPを有する非相同性配列から誘導されてもよい。このような透過ペプチドは当業界に知られている。例えば、Von Heijneら、(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104−126;Clarkら(1989)J.Biol.Chem.264:17544−17550;della−Cioppaら(1987)Plant Physiol.84:965−968;Romerら(1993)Biochem.Biophys.Res Commun.196:1414−1421;およびShahら、(1986)Science 233:478−481を参照されたし。
【0038】
意図された利用に依存して、構築体は、全ゲノム核酸配列またはこのような配列の特定の非コード領域またはこのような配列の部分を含み得る。例えば、供されたデサチュラーゼ蛋白質のアンチセンス阻害が望まれる場合、全配列は必要としない。さらに、構築体に用いられたデサチュラーゼ配列をプローブとして用いようとする場合、デサチュラーゼ配列、例えば保存度の高いデナチュラーゼ領域をコードする配列の特定の部分のみを含む構築体を調製することは有利と思われる。
【0039】
当業者は、宿主細胞内の内因性配列の発現阻害のために、種々の方法があることを認識するであろう。このような方法としては、限定しないが、アンチセンス抑制(Smithら、(1988)Nature 334:724−726)、共抑制(Napoliら、(1989)Plant Cell 2:279−289)、リボチーム(PCT公報WO第97/10328号)、センスおよびアンチセンスの組合せ(Waterhouseら、(1998)Proc.Natle.Acad.Sci.USA 95:13959−13964)、プロモーターの沈黙化(Parkら、(1996)Plant J.9(2):183−194)、DNA結合蛋白質(Beerliら、(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14628−14633;およびLiuら、(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA:94:5525−5530)が挙げられる。宿主細胞における内因性配列の抑制法は、一般的に転写または少なくとも抑制される配列の一部の転写および翻訳を使用する。このような配列は、内因性配列の非コード領域と同じくコード化に相同であり得る。
【0040】
なおその上、転写終結調節領域も、本発明の植物発現構築物内に供し得る。転写終結領域は、デサチュラーゼまたは異なる遺伝資源から誘導される都合のよい転写終結領域、例えば転写開始領域と本来関連する転写終結領域をコードするDNA配列により供し得る。当業者は、植物細胞において転写を終結できる任意の都合のよい転写終結領域が、本発明の構築体に使用できることを認識されるであろう。
【0041】
別途に、構築体は、宿主植物細胞プラスミドから直接デサチュラーゼ配列の発現を方向づけるために調製され得る。このような構築体および方法は、当業者に知られており、例えばSvabら、(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526−8530およびSvabおよびMaliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:90:913−917および米国特許第5,693,507号に一般に記載さている。
【0042】
発現構築体を含有する組換えDNA構築体が導入された植物細胞、組織、器官または植物は、形質転換、形質移入されているか、または遺伝導入がなされていると考えられる。遺伝子導入または形質転換された細胞または植物には、細胞または植物の子孫およびこのような遺伝子導入植物を異種交配における親株として使用し、デサチュラーゼ拡散配列の存在から生じる変化した表現型を示す飼育プログラムから生じた子孫も含まれる。
【0043】
関心のあるDNA配列としてその発現の増減のために、本発明のデサチュラーゼポリヌクレオチドを有する植物発現構築体または転写構築体は、広範囲の植物、特に食用および産業使用の植物油の生産に係る植物により使用され得る。本質的に温暖気候の油料種子穀物が最も好ましい。興味のある植物としては、限定しないが、セイヨウアブラナ種子(カノーラおよび高エルカ酸変種)、ヒマワリ、ベニバナ、綿花、大豆、ピーナッツ、ココナツおよびヤシ油、およびトウモロコシが挙げられる。組換え構築体を宿主細胞に導入する方法に依って、他のDNA配列が必要とされ得る。重要なことに、本発明は、双子葉植物種および単子葉植物種に同じく適用され、新規および/または改良された形質変換および調節法に容易に適用し得るであろう。
【0044】
植物デサチュラーゼプロモーターおよび/または植物中のイントロン構築体の利用が特に興味深く、限定しないが、変更した脂肪酸組成物を有する葉、幹、根、生殖器官、および種子などの植物または植物部分を生産する。デサチュラーゼプロモーターおよび/またはイントロン構築体において特に興味深いのは、宿主細胞内の脂肪酸組成物の修飾のためにセンスまたはアンチセンス方向における、Δ−12およびΔ−15デサチュラーゼゲノム配列のプロモーターおよび/またはイントロン配列の利用である。
【0045】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の宿主細胞における利用のための構築体の調製に使用できる。本発明の使用のための宿主としては、限定しないが、植物細胞、細菌細胞、カビ細胞(酵母を含む)、昆虫細胞および哺乳類細胞が挙げられる。
【0046】
例えば、デナチュラーゼ酵素として単離核酸配列によりコードされた蛋白質の活性および特異性を確認するために、インビトロアッセイについてバキュロウィルス発現系を用いて昆虫細胞培養にて実施できる。このようなバキュロウィルス発現系は当業界に知られており、Leeらの米国特許第5,348,886号により記載されており、その全体が、ここに引用文献として組込まれている。
【0047】
このような遺伝形質転換植物の獲得における形質転換法は、この発明にとって重要ではなく、現在では植物形質転換の種々の方法が利用できる。さらに、穀物を形質転換するためにより新規な方法が利用できるようになれば、それらもまた、この記載に従って直接適用されてもよい。例えば、アグロバクテリウム感染に本来鋭敏な多くの植物種は、アグロバクテリウムに媒介された形質転換の3成分または2成分ベクター法により首尾よく変換され得る。多くの場合、T−DNAによる片側または両側に具体的には左端および右端、さらに具体的に右端隣接した構築体を有することが望ましいであろう。これは特に、構築体がアグロバクテリウム−ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム−リゾゲネスを形質転換の様式として使用する場合に有用であるが、しかし、T−DNA端は形質転換の他の様式での使用を見つけ得る。また、種々の単子葉植物種および双子葉植物種の形質転換を可能にするミクロ注射法、DNA粒子衝撃法および電気穿孔法が発展してきた。
【0048】
通常、DNA構築体と共に、宿主における発現にとって必要な調節領域を有し、形質転換細胞の選択に供する構造遺伝子が含まれるであろう。この遺伝子は、細胞毒剤、例えば抗生物質、重金属、毒素に対する抵抗性のために栄養素用急性宿主、ウィルス免疫などにプロトトロピーを供する相補性を提供し得る。宿主に依って、発現構築体またはその成分が導入され、種々の宿主に対して種々の選択条件が用いられる1種または複数のマーカーを使用し得る。
【0049】
植物細胞の形質転換にアグロバクテリウムが用いられる場合、アグロバクテリウム宿主に存在するT−DNAまたはTi−プラスミドまたはRi−プラスミドとの相同的組換えのために、アグロバクテリウム宿主に導入し得るベクターを使用し得る。組換えのためにT−DNAを含有するTi−プラスミドまたはRi−プラスミドは腕状化してもよいし(えい瘤形成能あり)、または腕状化しなくてもよく(えい瘤形成能なし)、後者は形質転換したアグロバクテリウム宿主中にウィルス遺伝子が存在している限りにおいて許容される。腕状化プラスミドは、正常な植物細胞とえい瘤の混合物を供することができる。
【0050】
アグロバクテリウムが宿主植物細胞を形質転換する媒体として用いられる幾つかの例において、T−DNA境界領域によって境界づけられている発現構築体または転写構築体は、大腸菌およびアグロバクテリウムを複製できる広範囲宿主ベクターに挿入されることになるが、広範囲ベクターは文献に記載されている。通常使用されるのは、pRK2またはその誘導体である。例えば、引用文献としてここに組入れているDittaら、(Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.(1980)77:7347−7351)およびEPA0120515を参照のこと。他に植物細胞内に発現される配列を、1つは大腸菌内のベクターを安定化し、他方はアグロバクテリウム内のベクターを安定化させる別個の複製配列を含むベクター内へ挿入し得る。例えば、pRiHRI(Jouaninら、Mol.Gen.Genet.(1985)201:370−374)の複製源を利用し、宿主のアグロバクテリウム細胞内での植物発現ベクターの安定性付与を供するMcBrideおよびSummerfelt(Plant Mol.Biol.(1990)14:269−276)を参照のこと。
【0051】
発現構築体およびT−DNAと共に、形質転換アグロバクテリウムおよび形質転換植物細胞の選択を可能にする1種または複数のマーカーが含まれるであろう。クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドG418、ヒグロマイシンなどの抵抗性など、多数のマーカーが植物細胞と共に使用するために開発された。使用された具体的なマーカーは、本発明にとって本質的ではないが、具体的な宿主および構築様式に依って好ましいマーカーがある。
【0052】
アグロバクテリウムを用いる植物細胞の形質転換には、外植片を形質転換したアグロバクテリウムと合わせて形質転換に十分な時間培養し、バクテリアを殺菌し、適当な選択的培地において植物細胞を培養し得る。カルスが形成したら、適当な植物ホルモンを用い、知られた方法に従ってシュート形成を促進でき、植物の生殖のために固着培地に移す。その後、植物は増殖して結実し、その種子は反復的生殖を確かにするために、また植物油の単離のために使用され得る。
【0053】
宿主細胞における不飽和脂肪酸産生を変化させるため本発明に従って第2の発現構築体を使用し得る。例えば、脂肪酸生合成に関与する蛋白質に対するヌクレオチド配列を有する第2の発現構築体とデサチュラーゼ発現構築体とを合わせて宿主細胞へ導入し得る。
【0054】
複数の発現構築体を含む本発明の植物細胞を得るには幾つかの可能な方法がある。本発明の発現構築体をコードするDNA配列を有する構築体、およびある酵素をコードする別のDNA配列を有する少なくとももう1つの構築体を含む植物を生産する任意の手段が本発明に含まれる。例えば、発現構築体は第2の構築体と同時に、双方の構築体を単独の形質転換ベクターに包含することによるか、または各々が所望の遺伝子を発現する別々のベクターを用いることによるかの何れかによって、植物を形質転換するために使用し得る。第2の構築体は、すでにデサチュラーゼ発現構築体により形質転換されている植物内へ導入することができ、または別途に、1つはデサチュラーゼ構築体を発現し、また1つは第2の構築体を発現している形質転換植物を交配して同一植物内にそれらの構築体を共に導入することができる。
【0055】
本発明を一般的に記述するに当たって、下記の実施例を参照することにより理解がより容易となろうが、これは説明のために入れられているのであって、本発明を限定する意図はない。
【0056】
実施例
実施例1 デサチュラーゼゲノム配列のクローニング
1A.大豆Δ12デサチュラーゼ(fad2−1)
大豆fad2−1A配列は大豆fad2−1cDNAプローブを用いて大豆ゲノムライブラリーのスクリーニングにより同定された。3種の推定ダイズfad2−1クローンを同定し、プラーク精製した。3種のダイズfad2−1クローンのうち2種を、pブルースクリプトIIKS+(層遺伝子)に連結し、塩基配列決定した。両クローン(14−1および11−12)は、同一であり、ダイズfad2−1cDNAと厳密にマッチした。全fad2−1Aクローンの配列は、SEQ ID NO:1で供される。
【0057】
この完全長クローンを得る前に、fad2−1Aゲノムクローンの一部を、5’非翻訳配列(プライマー12506、5’−ATACAAGCCACTAGGCAT−3’、SEQ ID NO:9)からcDNA(プライマー11698:5’−GATTGGCCATGCAATGAGGGAAAAGG−3’、SEQ ID NO:10)内にデザインされたPCRプライマーを用いてPCR増幅した。fad2−1Aイントロンを含んだこのPCR生成物を、ベクターpCR2.1(インビトロゲン)にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズfad2−1A部分ゲノムクローン(SEQ ID NO:27)およびそのイントロン領域(SEQ ID NO:2)を、MacvectorにおけるPustell比較プログラムを用いて大豆cDNA配列との比較により同定した。イントロン配列は、ATG開始コドンの後から始まり、420個の塩基長である。
【0058】
第2のfad2−1遺伝子科メンバーもまた、同定しクローン化し、ここではfad2−1Bと言う。ダイズfad2−1B部分ゲノムクローン(SEQ ID NO:23)(プロモーター(1〜1704個の塩基対)を含む);5’UTR(1705〜1782個の塩基対);イントロン番号1(1786〜2190個の塩基対);fad2−1Bコード化領域(1783〜1785個および2191〜2463個の塩基対)の一部およびそのイントロン領域(SEQ ID NO:24)を、MacvectorにおけるPustell比較プログラムを用いて大豆cDNA配列との比較により同定した。イントロン配列は、ATG開始コドンの後から始まり、405個の塩基長である。
【0059】
1B.大豆Δ15デサチュラーゼ(fad3)
部分大豆fad3ゲノム配列を、プライマー10632、5’−CUACUACUACUACTCGAGACAAAGCCTTTAGCCTATG−3’(SEQ ID NO:11)および10633:5’−CAUCAUCAUCAUGGATCCCATGTCTCTCTATGCAAG−3’(SEQ ID NO:12)を用いて大豆DNAからPCR増幅した。伸長テンプレートPCRシステム(Boehringer Mannheim)を製造元説明書に従って使用した。生じたPCR生成物をベクターpCR2.1(インビトロゲン)にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズfad3部分ゲノムクローン配列およびイントロン領域を、MacvectorにおけるPustell比較プログラムを用いて大豆fad3cDNA配列との比較により確認した。この同定された部分ゲノム大豆fad3配列(SEQ ID NO:3)から、7種のイントロンが同定された(SEQ ID NO:4(イントロン番号1)、SEQ ID NO:5(イントロン番号2)、SEQ ID NO:6(イントロン番号3A)、SEQ ID NO:7(イントロン番号4)、SEQID NO:8(イントロン番号5)、SEQ ID NO:25(イントロン番号3B)、SEQ ID NO:26(イントロン番号3C)。イントロン番号1は、192個の塩基対長であり、294位と485位との間に位置し、イントロン番号2は、348個の塩基対長であり、576位と923位との間に位置し、イントロン番号3Aは、142個の塩基対長であり、991位と1132位との間に位置し、イントロン番号3Bは、98個の塩基対長であり、1225位と1322位との間に位置し、イントロン番号3Cは、115個の塩基対長であり、1509位と1623位との間に位置し、イントロン番号4は、1231個の塩基対長であり、1705位と2935位との間に位置し、およびイントロン番号5は、626個の塩基対長であり、3074位と3699位との間に位置する。
【0060】
実施例2 発現構築体
テンプレートとしてfad2−1A部分ゲノムクローン(SEQ ID NO:27)およびプライマー12701(5’−ACGAATTCCTCGAGGTAAATTAAATTGTGCCTGC−3’(SEQ ID NO:13))および12702(5’−GCGAGATCTATCGATCTGTGTCAAAGTATAAAC−3’(SEQ ID NO:14))を用いて、大豆fad2−1Aイントロン配列をPCRにより増幅した。生じた増幅生成物を、ベクターpCR2.1(インビトロゲン)にクローン化し、塩基配列決定した。次いで、センスおよびアンチセンス方向で、ダイズfad2−1Aイントロンを発現カセット、pCGN3892にクローン化した。ベクターpCGN3892は、大豆7SプロモーターおよびエンドウPBCS3’を含む。次いで双方の遺伝子融合体を、FMVプロモーターにより調節されたCP4遺伝子を含むベクターpCGN9372に別個に連結した。生じた発現構築物(PCGN5469センスおよびpCGN5471アンチセンス)を、下記の生物学的方法を用いて大豆の形質転換に用いた。
【0061】
テンプレートとしてfad2−1B部分ゲノムクローン(SEQ ID NO:23)およびプライマー13883(5’−GCGATCGATGTATGATGCTAAATTAAATTGTGCCTG−3’(SEQ ID NO:30))および13876(5’−GCGGAATTCCTGTGTCAAAGTATAAAGAAG−3’(SEQ ID NO:31))を用いて、大豆fad2−1Bイントロン配列をPCRにより増幅した。生じた増幅生成物を、ベクターpCR2.1(インビトロゲン)にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズfad2−1Bイントロンを、プラスミドpCGN5468(ダイズfad2−1Aイントロン(センス)およびエンドウRBCS3’に融合された大豆7Sプロモーターを含む)またはpCGN5470(ダイズfad2−1Aイントロン(アンチセンス)およびエンドウRBCS3’に融合された大豆7Sプロモーターを含む)中、それぞれセンスおよびアンチセンス方向で、ダイズfad2−1Aイントロンの3’末端に融合した。次いで生じたイントロン組合せ融合体をFMVプロモーターにより調節されたCP4遺伝子を含むベクターpCGN9372に別々に連結した。生じた発現構築物(pCGN5485、fad2−1A&BイントロンセンスおよびpCGN5486、fad2−1A&Bイントロンアンチセンス)を、下記の生物学的方法を用いて大豆の形質転換に用いた。
【0062】
テンプレートとしてfad3部分ゲノムクローンおよび以下のプライマー:イントロン番号1、プライマー12568:5’−GATCGATGCCCGGGGTAATAATTTTTGTGT(SEQ ID NO:15)および12569:5’−CACGCCTCGAGTGTTCAATTCAATCAATG(SEQ ID NO:16);イントロン番号2、プライマー12514:5’−CACTCGAGTTAGTTCATACTGGCT(SEQ ID NO:17)および12515:5’−CGCATCGATTGCAAAATCCATCAAA(SEQ ID NO:18);イントロン番号4、プライマー10926:5’−CUACUACUACUACTCGAGCGTAAATAGTGGGTGAACAC(SEQ ID NO:19)および10927:5’−CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC(SEQ ID NO:20);イントロン番号5、プライマー10928:5’−CUACUACUACUACTCGAGGCGCGTACATTTTATTGCTTA(SEQ ID NO:21)および10929:5’−CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCTGCAGTGAATCCAAATG(SEQ ID NO:22)を用いて、大豆fad3ゲノムクローンから同定された7種のイントロンのうち4種をPCRにより増幅した。各イントロンに対して生じたPCR生成物を、ベクターpCR2.1(インビトロゲン)にクローン化し、塩基配列決定した。イントロン番号1、2、4および5を全て、センスおよびアンチセンス方向で、pCGN3892に別個に連結した。pCGN3892は、大豆7SプロモーターおよびエンドウRBCS3’を含む。これらの融合体を、大豆への形質転換のためのFMVプロモーターにより調節されたCP4遺伝子を含むベクターpCGN9372に連結した。生じた発現構築物(pCGN5455、fad3イントロン番号4イントロンセンス;pCGN5459、fad3イントロン番号4イントロンアンチセンス;pCGN5456、fad3イントロン番号5イントロンセンス;pCGN5460、fad3イントロン番号5イントロンアンチセンス;pCGN5466、fad3イントロン番号2イントロンアンチセンス;pCGN5473、fad3イントロン番号1イントロンアンチセンス)を、下記の生物学的方法を用いて大豆の形質転換に用いた。
【0063】
ダイズfad3イントロン番号3Cおよび4もまた、ここでfad3―1Bと呼ばれる第2のfad3遺伝子科メンバーからもPCR増幅した。以下のプライマー、5’CATGCTTTCTGTGCTTCTC3’(SEQ ID NO:32)および5’GTTGATCCAACCATAGTCG3’(SEQ ID NO:33)を用いて、ダイズfad3−1Bイントロン番号3Cおよび4を大豆DNAからPCR増幅した。このPCR生成物を、ベクターpCR2.1(インビトロゲン)にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズfad3−1Bイントロン番号3Cおよび4に関する配列は、SEQ ID NOs:28および29で供される。
【0064】
実施例3 植物形質転換および分析
Δ12およびΔ15デサチュラーゼイントロンのセンスおよびアンチセンス発現に係る発現構築体を含む線状DNAフラグメントは、McCabeら、(1988)Bio/Technology 6:923−926の方法により大豆(Asgrow変種A4922)へ安定に導入された。形質転換された大豆植物は、グリホサートを含む培地上の選択により同定された。
【0065】
脂肪酸組成物は、ガスクロマトグラフィーを用いてイントロン発現構築体により形質転換された大豆系の種子から分析された。T2プールされた種子およびT2単独種子油組成物は、非形質転換大豆からの種子と比較して、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成物が、遺伝形質転換大豆系列からの種子油において変化したことを明示している。表1は、説明した構築体を用いて得られた結果の要約を示している。これらのデータは、デサチュラーゼ遺伝子の非コード領域のセンスおよびアンチセンス発現が脂肪酸組成物を変化させることを明らかに示している。このデータはまた、脂肪酸組成物を変える種々の系列を得るためにイントロンが使用できることを示す。所望の相対的脂肪酸組成物に依存してこのような系列から選択することができる。さらに、各イントロンは、各脂肪酸のレベルを様々な程度に変更できることから、イントロンの組合せが、所望の組成物に依存して使用できることが考慮されている。
【0066】
【表1】
【0067】
本明細書に言及されている全ての出版物および特許出願は、本発明に係る当業者の技能レベルを表す。参照のためにここに組入れている全ての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願と同程度に具体的に、また個別に参照のために組入れられていることを表す。
【0068】
前述の発明は、明確な理解の目的上、図解や例によってかなり詳細に記述したが、添付の請求項の範囲内である一定の変更および修飾が実施され得ることは明らかであろう。
【配列表】
Claims (6)
- a)配列番号:2により表されるポリヌクレオチド配列、
b)Fad2デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制できる30ヌクレオチドを有する(a)のフラグメント、
c)Fad2デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制できる50ヌクレオチドを有する(a)のフラグメント、
d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるFad2デサチュラーゼ遺伝子発現を抑制できる配列を含む単離したポリヌクレオチド分子。 - 植物宿主細胞中で機能する異種プロモーターに操作可能に連結された請求項1に記載のポリヌクレオチド配列の少なくとも1つを含む組換えDNA構築体。
- 該ポリヌクレオチド配列が、センス方向にある、請求項2記載の組換えDNA構築体。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか1つを含むDNA構築体、または請求項2もしくは3に記載の構築体を大豆植物種子において発現させ、ここに、該ポリヌクレオチドまたは該構築体は、該Fad2デサチュラーゼ遺伝子を抑制でき、センスまたはアンチセンス方向に位置し;次いで、
該ポリヌクレオチド配列またはイントロンの転写が開始され、該Fad2デサチュラーゼ遺伝子の該発現が抑制される条件下で、該種子を増殖させるステップを含み、ここに、該大豆種子は:
(a)26〜80%のオレイン酸、2.97〜49.92%のリノール酸、および3.38〜8.81%のリノレン酸;または
(b)50〜75%のオレイン酸、わずか10〜30%のリノール酸、およびわずか1〜3%のリノレン酸を含む油性組成物を含むことを特徴とする植物細胞中のデサチュラーゼ遺伝子発現を抑制する方法。 - 請求項2もしくは3からの構築体を含む大豆植物種子であって、ここに、該大豆植物種子は:
(a)26〜80%のオレイン酸、2.97〜49.92%のリノール酸、および3.38〜8.81%のリノレン酸;または
(b)50〜75%のオレイン酸、わずか10〜30%のリノール酸、およびわずか1〜3%のリノレン酸を含む油性組成物を有し、または請求項4の方法により得ることができる大豆植物種子。 - 請求項5記載の植物種子を含む植物。
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