JPH10511848A - △６−デサチュラーゼによるγリノレン酸の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リノール酸は、酵素△６-デサチュラーゼでγ−リノレン酸に変換される。本願発明は、△６-デサチュラーゼ遺伝子を含む単離された核酸に向けられている。特に、単離された核酸は、Δ６-デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、コード領域および終結領域を含む。本願発明は、非相同調節配列と機能的に組んだΔ６-デサチュラーゼコード領域を含む組換え体を提供する。本願発明の核酸と組換え体は、トランスジェニック生物体中におけるＧＬＡの産生において使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 △６-デサチュラーゼによるγリノレン酸の産生 リノール酸（１８：２）（ＬＡ）は、酵素△６-デサチュラーゼによって、γ リノレン酸（１８：３）（ＧＬＡ）に変換される。この酵素、もしくはこれをコ ードしている核酸がＬＡ産生細胞に転移されると、ＧＬＡが産生される。本願発 明は、△６-デサチュラーゼ遺伝子を含む核酸を提供する。特に、この核酸は、 △６-デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、コード領域および終結領域を含む 。本願発明は、さらに、非相同調節配列(heterologous regulatory sequences) と機能的に組んだ△６-デサチュラーゼコード領域を含む組換え体に向けられて いる。本願発明の核酸と組換え構築物は、トランスジェニック生物体中における ＧＬＡの産生において使用できる。 脊椎動物細胞は脂肪酸の△⁹位に二重結合を導入することができるが、脂肪酸 鎖の△⁹二重結合とメチル末端との間にさらなる二重結合を導入できないので、 リノール酸（Ｃ₁₈△^9、12）およびα−リノレン酸（Ｃ₁₈△^9、12、15）等の不飽和 脂肪酸は、脊椎動物が合成できない必須食物成分である。これらは他の生成物の 前駆体であるので、リノール酸およびα-リノレン酸は必須脂肪酸であり、一般 に植物源から得られる。リノール酸は、哺乳類では、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、 Ｃ₁₈△^6、9、12）には変換されずに、ほとんどのプロスタグランジンの必須前駆体 であることから極めて重要な脂肪酸であるアラキドン酸（２０：４）に変換され る。 リノール酸の食物供給量は、ＧＬＡとアラキドン酸への結果的な変換の効力に よって、ＧＬＡとアラキドン酸に対する食物的要求を満たす。しかしながら、飽 和脂肪の消費と、高コレステロール血症、アテローム硬化症および心臓病の罹り やすさに関連する他の臨床的疾患等の健康の危険性との間の関係が示された。一 方、不飽和脂肪の消費は、血中コレステロール濃度の低下およびアテローム硬化 症の危険性の低下と関連している。食物ＧＬＡの治療的利点は、アラキドン酸の 前駆体であり、次いでプロスタグランジン合成に寄与するＧＬＡから得られるも のである。従って、リノール酸より不飽和なＧＬＡの消費は、潜在的に健康的な 利点を備えている。しかしながら、ＧＬＡは、実際には、商業的に生育した作物 植物のいずれにも存在しない。 リノール酸は、酵素△６-デサチュラーゼによってＧＬＡに変換される。３５ ０アミノ酸以上の酵素である△６-デサチュラーゼは、膜結合ドメインと脂肪酸 の不飽和化に活性な部位を備えている。この酵素を、ＧＬＡではなくリノール酸 を内的に産生する細胞に転移させると、ＧＬＡが産生される。本願発明は、△６ -デサチュラーゼをコードする遺伝子を提供することによって、機能的な△６-デ サチュラーゼを含み、ＧＬＡを産生するトランスジェニック生物体の産生を可能 にする。大量のＧＬＡの産生を可能にすることに加えて、本願発明は、ＧＬＡの 新規の食物源を提供する。 本願発明は、単離された△６-デサチュラーゼ遺伝子に向けられている。特に 、単離された遺伝子は、△６-デサチュラーゼプロモーター、コード領域および 終結領域を含む。 本願発明は、さらに、△６-デサチュラーゼプロモーター、コード領域および 終結領域を含む発現ベクターに向けられている。 本願発明の他の態様は、非相同調節領域、すなわち△６-デサチュラーゼ遺伝 子から誘導されない成分と機能的に組んだ△６-デサチュラーゼコード領域を含 む発現ベクターに向けられている。 本願発明のベクターを含む細胞および生物体と、この様な生物体の子孫も、本 願発明によって提供される。 本願発明のさらなる態様は、単離された細菌性△６-デサチュラーゼを提供す る。単離された植物性△６-デサチュラーゼも提供される。 本願発明の他の態様は、γリノレン酸の含量が増大した植物を産生する方法を 提供する。 寒冷寛容植物を産生する方法も、本願発明によって提供される。 図１は、シネコシスティス（Synechocystis）△６-デサチュラーゼ（パネルＡ ）および△１２-デサチュラーゼ（パネルＢ）の推定されるアミノ酸配列のヒド ロパシープロファイルを図示したものである。推定上の膜間領域は、一様な線(s ol id bars)で示されている。疎水性指標は、１９アミノ酸残基のウィンドウサイズ に対して計測した［Kyteら（1982）J．Holec．Biol．157］。 図２は、野生型（パネルＡ）とトランスジェニック（パネルＢ）アナベナ属(A nabaena)のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。 図３は、重複領域とサブクローンを備えたコスミドｃＳｙ７５、ｃＳｙ１３お よびＣｓｙ７のマップの図表である。Ｃｓｙ７５、Ｃｓｙ７５−３．５およびＣ ｓｙ７のサブクローンの起源は、斜め斜線で示されている。不活性化された制限 部位は、カッコ書きされている。 図４は、野生型（パネルＡ）とトランスジェニック（パネルＢ）タバコ（toba cco)のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。 図５Ａは、ルリヂサ(borage)から単離された△６-デサチュラーゼｃＤＮＡの ＤＮＡ配列を示す。 図５Ｂは、単離されたルリヂサの△６-デサチュラーゼｃＤＮＡにおける読み 取り枠(open reading frame)のタンパク質配列を示す。デサチュラーゼの三つの アミノ酸モチーフが示され、脂質ボックス、メタルボックス(metal box)１、メ タルボックス２の順になっている。 図６は、ルリヂサ△６-デサチュラーゼと他の膜結合型デサチュラーゼとの類 似性を示すデンドログラムである。ルリヂサ△６-デサチュラーゼのアミノ酸配 列を、ジーンワークス(Gene Works)(Intelligenetics)を用いて他の既知のデサ チュラーゼと比較した。数値は、比較したサブグループ間の相対系統間距離に対 応する。 図７は、２２１．△６．ＮＯＳと１２１．△６．ＮＯＳの制限マップである。 ２２１．△６．ＮＯＳでは、プラスミドの残りの部位はｐＢＩ２２１であり、１ ２１．△６．ＮＯＳでは、プラスミドの残りの部位はｐＢＩ１２１である。 図８は、偽(mock)トランスフェクトした（パネルＡ）および２２１．△６．Ｎ ＯＳトランスフェクトした（パネルＢ）ニンジン細胞のガス液体クロマトグラフ ィープロファイルを示す。１８：２、１８：３αおよび１８：３γ（ＧＬＡ）の 位置が示されている。 図９は、未形質転換タバコの葉（パネルＡ）と１２１．△６．ＮＯＳで形質転 換されたタバコの葉のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。１８： ２、１８：３α、１８：３γ（ＧＬＡ）および１８：４の位置が示されている。 図１０は、未形質転換タバコ種子（パネルＡ）と１２１．△６．ＮＯＳで形質 転換されたタバコの種子のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。１ ８：２、１８：３αおよび１８：３γ（ＧＬＡ）の位置が示されている。 本願発明は、△６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸を提供する。 △６-デサチュラーゼをコードする核酸を同定するために、ＧＬＡを産生する生 物体からＤＮＡを単離する。前記の生物体は、例えば、動物細胞、ある種の真菌 （例えば、Mortierella）、ある種の細菌（例えば、Synechocystis）もしくはあ る種の植物（ルリヂサ、エノセラ(Oenothera)、スグリ(currants)）とすること ができる。ゲノムＤＮＡの単離は、Sambrookら（1989）Molecular Cloning: A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor，NYに例示されているような、当業者に 周知の種々の方法によって行われる。単離されたＤＮＡは、物理的な方法もしく は酵素切断によってフラグメントとされ、Sambrookら(1989)等の参考文献に見ら れる種々の周知技法のいずれかによってバクテリオファージもしくはコスミドベ クター等の適切なベクターにクローン化される。本願発明のＤＮＡを含む発現ベ クターは、特に考慮される。△６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡは、機能 解析の結果によって同定することができる。フラグメントとされたＤＮＡを含む ベクターは、リノール酸を産生するがＧＬＡを産生しない宿主生物体に、感染、 トランス接合(transconjugation)、トランスフェクション等によって転移される 。ここで用いたように、“形質転換”とは、一般に、宿主細胞中に外部ＤＮＡを 取り込むことを指す。宿主生物体中に組み換えＤＮＡを導入する方法は、当業者 の知るところであり、Sambrookら(1989)等に見いだされる。これらの生物体によ るＧＬＡの産生（すなわち機能獲得）は、例えばガスクロマトグラフィーや当業 者に知られた他の方法によってアッセイされる。ＧＬＡを産生するに至った生物 体、すなわちベクターの導入によって機能を獲得した生物体は、△６-デサチュ ラーゼをコードするＤＮＡを発現するものと同定され、前記ＤＮＡはその生物体 から回収される。△６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡを特に限定するため に、回収されたＤＮＡは、再度フラグメント化され、発現ベクターでクローン化 され、上記の 方法で機能的に評価される。 本願発明の実施例では、ランダムなＤＮＡを、シアノバクテリア（ラン色細菌 ）シネコシスティス（Synechocystis）Pasteur Culture Collection（PCC）6803 、American Type Culture Collection（ATCC）27184から単離し、コスミドベク ターにクローン化し、ＧＬＡを欠くシアノバクテリアアナベナ属株 PCC 7120，A TCC 27893に、トランス接合で導入した。アナベナ属のリノール酸からのＧＬＡ の産生を、ガスクロマトグラフィーで観察し、対応するＤＮＡフラグメントを単 離した。 単離されたＤＮＡを、例えばSambrookら(1989)に見いだされるような、当業者 に周知の方法で配列決定する。 本願発明に従って、△６-デサチュラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ分子が単離され た。特に、△６-デサチュラーゼ遺伝子を含む３．５８８キロベース（ｋｂ）の ＤＮＡがシアノバクテリアシネコシスティスから単離された。３．５８８ｋｂの ＤＮＡのヌクレオチド配列が調べられ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されている。 潜在的なコード領域を決める読み取り枠は、ヌクレオチド３１７〜１５０７およ び２００２〜３０８１に存在する。△６-デサチュラーゼをコードするヌクレオ チドを調べるために、△６-デサチュラーゼ活性を与える３．５８８ｋｂのフラ グメントを、それぞれ単一の読み取り枠を含む二つのサブフラグメントに切断し た。フラグメントＯＲＦ１はヌクレオチド１〜１７０４を含み、フラグメントＯ ＲＦ２は、ヌクレオチド１７０５〜３５８８を含む。各フラグメントを、シアノ バクテリアのカルボキシラーゼプロモーターを含む接合発現ベクター(a conjuga l expression vector)（ＡＭ５４２、Wolkら（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 81，1561）に正・逆の両方向にサブクローン化した。得られた構築物（すな わち、ＯＲＦ１（Ｆ）、ＯＲＦ１（Ｒ）、ＯＲＦ２（Ｆ）およびＯＲＦ２（Ｒ） ）を、標準的な方法（例えば、Wolkら（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81 ，1561参照）によって野生型アナベナ属PCC 7120に接合した。接合されたアナベ ナ属の細胞を、選択培地（Rippkaら（1979）J．Gen Microbiol．111，1に従って 、３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有する標準的なミネラル培地ＢＧ１１Ｎ＋ ）上で２週間生育させた後、非接合細胞を染色する褐色のバックグラウンド上の Ｎｅｏ^R緑色コ ロニーとして同定する。緑色コロニーを選別し、選択的液体培地（１５μｇ／ｍ ｌのネオマイシンを含有するＢＧ１１Ｎ＋）で生育させる。正・逆に配向したＯ ＲＦ１およびＯＲＦ２構築物を含む結果的なトランス接合体から、標準的な方法 （例えば、Dahmerら，（1989）Journal of American Oil Chemical Society 66, 543）で脂質を抽出する。比較のために、野生型のアナベナ属とシネコシスティ スからも、脂質を抽出する。脂肪酸メチルエステルを、ガス液体クロマトグラフ ィー（ＧＬＣ）、例えば水素炎イオン化検出器とキャビラリーカラムを備えたTr acor-560ガス液体クロマトグラフィーを用いて解析する。ＧＬＣ解析の結果は、 表１に示されている。 ＧＬＣ解析によって評価される通り、ＧＬＡ欠乏アナベナ属は、正方向にＯＲ Ｆ２を含有する構築物がトランス接合によって導入された場合に、ＧＬＡ産生機 能を獲得する。カルボキシラーゼプロモーターに逆方向にＯＲＦ２を含有する構 築物、あるいはいずれの方向にＯＲＦ１を含有する構築物も、ＧＬＡ産生を示さ ない。この解析は、１８８４ｂｐフラグメント内部の単一の読み取り枠（ＯＲＦ ２）が△６-デサチュラーゼをコードすることを示す。１８８４ｂｐフラグメン トはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。このことは、図１にそれぞれ（Ａ） および（Ｂ）として示されるように、△６-デサチュラーゼおよび△１２-デサチ ュラーゼ（Wadaら（1990）Nature 347）間のヒドロパシープロファイルの全体的 な類似性によって立証される。 また、本願発明では、ルリヂサ（Borago officinalis）の△６-デサチュラー ゼ遺伝子を含むｃＤＮＡも単離した。１．６８５キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡの ヌクレオチド配列が調べられ、図５Ａに示されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） 。ＡＴＧ開始コドンと停止コドンに下線が付されている。ルリヂサの△６-デサ チュラーゼの読み取り枠に対応するアミノ酸配列は図５Ｂに示されている（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：５）。 △６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸は、上述した機能獲得解析 により、もしくはハイブリダイゼーションプローブとしてシネコシスティスもし くはルリヂサ△６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸を用いた核酸ハ イブリダイゼーション技術によって、他のＧＬＡ産生生物体から同定することが できる。ゲノムおよびｃＤＮＡクローニング方法の両方は、当業者に周知であり 、本願発明で考慮される。ハイブリダイゼーションプローブは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として記載された完全なＤＮＡ配列、ある いはオリゴヌクレオチドプローブを含むその制限フラグメントもしくは別のＤＮ Ａフラグメントを含むことができる。クロスハイブリダイゼーションによる相同 遺伝子をクローニングする方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook(198 9)とBeltzら（1983）Methods in Enzymology 100，266に見出すことができる。 ＧＬＡを産生する生物体から△６-デサチュラーゼ遺伝子を同定する別の方法 としては、ｃＤＮＡライブラリーが、ポリソーマルＲＮＡ(polysomal RNA)から 単離 されたポリＡ⁺ＲＮＡから作製される。ｃＤＮＡ全体から過剰に豊富に発現され た遺伝子を除去するために、過剰に豊富なｃＤＮＡ遺伝子に対応するｃＤＮＡも しくはフラグメントが、ｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーション プローブとして用いられる。ハイブリダイズしないプラークを削除し、得られた 細菌コロニーを使用して液体培養を接種し、配列決定する。例えば、ルリヂサポ リソーマルＲＮＡからなるｃＤＮＡライブラリーから他の種子貯蔵タンパク質(s eed strage protein)ｃＤＮＡを除去する手段として、豊富に発現した種子貯蔵 タンパク質に対応するｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーに最初にハイブリダイズ する。“差し引かれた”ＤＮＡライブラリーを、発現された配列タグ（ＥＴＳ） を生成するために用い、この様なタグを用いて、可能な不飽和を同定するために Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースをスキャンする。 △-デサチュラーゼをコードするＤＮＡの導入によってＧＬＡ産生機能を獲得 したトランスジェニック生物体は、オクタデカテトラエン酸(octadecatetraeoni c acid)（１８：４^△6,9,12,15）産生の機能も獲得する。オクタデカテトラエン 酸は、通常は、魚油およびムラサキ科(Boraginaceae)のある植物種に存在する（ Craigら（1964）J．Amer．Oil Chem．Soc．41，209-211; Grossら（1976）Can． J．Plant Sci．56，659-664）。本願発明のトランスジェニック生物体では、オ クタデカテトラエン酸は、△６-デサチュラーゼによるα-リノレン酸のさらなる 不飽和化もしくは△１５-デサチュラーゼによるＧＬＡの不飽和化によって生じ る。 ＯＲＦ２にコードされる３５９アミノ酸、すなわち、シネコシスティス△６- デサチュラーゼをコードする読み取り枠は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されてい る。ルリヂサ△６-デサチュラーゼをコードする読み取り枠はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：５に示されている。本願発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：５のアミノ酸をコードする他のヌクレオチド配列をさらに考える。例えば、 遺伝コードの縮重から得られる配列を同定することは、当業者の知識の範囲内で ある。さらに、当業者であれば、上述した機能解析から、△６-デサチュラーゼ をコードする読み取り枠を含むフラグメントより小さいサブフラグメントを決定 することができる。 本願発明は、ＬＡからＧＬＡに変換する活性を維持した△６-デサチュラーゼ の ポリペプチドフラグメントおよびその核酸も考慮する。 本願発明の別の態様では、本願発明の核酸、もしくは△６-デサチュラーゼ遺 伝子のプロモーター、コード配列および終結領域を含むより小さいフラグメント を含むベクターが、△６-デサチュラーゼプロモーターおよび終結領域が機能す るシアノバクテリア等の生物体に転移される。従って、組換え△６-デサチュラ ーゼを産生する生物体が、本願発明によって提供される。本願発明のさらに別の 態様は、タンパク質精製の標準的な方法で組み換え生物体から精製される、単離 された△６-デサチュラーゼを提供する。（例えば、Ausubelら（1987）Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates，New York参 照）。 △６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターも、本願発明によっ て提供される。種々の生物体で△６-デサチュラーゼコード配列を発現するよう に適切なベクターを作製することができることは、当業者には明らかである。複 製可能な発現ベクターが、特に好ましい。ここに記載された複製可能な発現ベク ターとは、所望の遺伝子、すなわち△６-デサチュラーゼ遺伝子の調節された発 現のために設計されたＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。好ましくは、ベクター はプラスミド、バクテリオファージ、コスミドもしくはウイルスである。例えば 、Wolkら（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1561-1565およびBustosら（199 1）J．Bacteriol．174，7525-7533に記載されたようなシャトルベクターも、本 願発明に従って考えられる。Sambrookら(1989)，Goeddel，ed.（1990）Method i n Enzymology 185 Academic Press、および Parbal（1988）A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley とSons，Inc.は、本願の△６-デサチュラー ゼをコードする核酸が挿入されて発現されるベクターの詳細な批評を提供する。 この様なベクターは、△６-デサチュラーゼをコードする核酸の発現に作用する 核酸配列をも含む。遺伝子産物の発現に影響する配列部は、プロモーター、エン ハンサー部、上流活性化配列、転写終結シグナルおよびポリアデニレーション部 位を含む。構成性(constitutive)および組織特異的プロモーターの両方が考えら れる。植物細胞の形質転換では、カリフラワーモザイクウイルス(the cauliflow er mosaic virus)（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターおよび植物の種子の成熟中に 調節されるプロモーターに特に関心が向けられる。上記プロモーターと転写調節 部の全て が、単独もしくは組み合わせて、本願の複製可能な発現ベクターにおける使用に 考えられ、当業者に周知である。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、例えばRestre poら（1990）Plant Cell 2，987に記載されている。遺伝的に設計され、かつ変 異した調節配列も考えられる。 当業者であれば、特定の宿主細胞における発現に適したベクターおよび調節部 を決定することができる。例えば、シネコシスティスの△６-デサチュラーゼの コード領域に使用可能に連結され(operably linked)、終結シグナルにさらに使 用可能に連結された、アナベナ族のカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロ モーターを含むベクターは、シアノバクテリアにおける△６-デサチュラーゼの 発現に適している。この文脈の“使用可能に連結され”とは、プロモーターおよ び終結配列が、効果的に機能して転写を調節することを意味する。さらなる実施 例では、トランスジェニック植物における△６-デサチュラーゼの発現に適切な ベクターは、△６-デサチュラーゼコード領域に使用可能に連結され、種子終結 シグナルもしくはノパリン(nopaline)シンターゼ終結シグナルにさらに使用可能 に連結された、ヘリアンチニン(helianthinin)、ナピン(napin)もしくはグリシ ニンから誘導された種子特異的プロモーター配列を含むことができる。さらなる 実施例では、植物における△６-デサチュラーゼの発現に使用されるベクターは 、△６-デサチュラーゼコード領域に使用可能に連結され、構成的もしくは組織 特異的ターミネーターもしくはノパリンシンターゼ終結シグナルにさらに使用可 能に連結された、構成性プロモーター(a constitutive promoter)もしくは組織 特異的プロモーターを含むことができる。 特に、本出願人の、１９９１年４月８日に出願され、参照としてここに取り込 んだ出願中の米国出願第６８２３５４号に記載されたヘリアンチニン調節部は、 本願発明の△６-デサチュラーゼを発現するためのプロモーター部として考えら れる。 ここで考察した機能を維持するような、ここに開示されたヌクレオチド配列も しくは調節部の修飾は、本願発明の範囲内である。この様な修飾は、挿入、置換 および欠失、そして特に遺伝コードの縮重を反映した置換を含む。 この様なハイブリッドベクターの構築に標準的な技術は当業者に周知であり、 Sambrookら(1989)、もしくは広く利用される組換えＤＮＡ技術についての無数の 実験マニュアルのいずれかに見出される。ＤＮＡフラグメントをリゲートするの に種々の方法が利用でき、その選択はＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存す る。本願発明に従って、ハイブリッドベクターに、クローニング、発現もしくは プロセッシングを容易にする他のヌクレオチド配列部、例えば、シグナルペプチ ドをコードする配列、小胞体にタンパク質を維持するのに必要なＫＤＥＬをコー ドする配列、もしくは△６-デサチュラーゼをクロロプラストに向けるトランジ ット(transit)ペプチドをコードする配列を含むことも考えられる。この様な配 列は、当業者に既知である。最適化されたトランジットペプチドは、例えばVan den Broeckら（1985）Nature 313，358に記載されている。原核性および真核性 シグナル配列は、例えば、Michaelisら（1982）Ann．Rev．Microbiol．36，425 に開示されている。 本願発明のさらなる態様は、本願発明の△６-デサチュラーゼをコードするＤ ＮＡを含むシアノバクテリアもしくは植物以外の生物体を提供する。本願発明に 従って考慮されたトランスジェニック生物体は、細菌、シアノバクテリア、真菌 および植物および動物を含む。本願発明の単離されたＤＮＡは、例えば感染、ト ランスフェクション、形質転換もしくはトランス接合等の、当該技術分野で周知 の方法によって宿主に導入することができる。本願発明のＤＮＡをこの様な生物 体に転移する技術は広く知られ、Sambrookら(1989)等の参考文献に記載されてい る。 種々の植物形質転換方法が知られている。△６-デサチュラーゼ遺伝子は、Hor schら（1985）Science 227，1229に記載されたようなリーフディスク形質転換− 再生方法(a leaf disk transformation-regeneration procedure)によって植物 に導入することができる。プロトプラスト培養（Horschら（1984）Science 223 ，496; DeBlockら（1984）EMBO J．2，2143; Bartonら（1983）Cell 32，1033） 等の形質転換の別の方法も用いることができ、本願発明の範囲内である。好まし い実施態様では、植物がアグロバクテリウム誘導ベクター(Agrobacterium-deriv ed vectors)で形質転換される。しかしながら、他の方法を、本願発明の△６-デ サチュラーゼ遺伝子を植物細胞に挿入するのに利用することができる。別の方法 とし ては、バイオリスティック(biolistic)アプローチ（Kleinら（1987）Nature 327 ，70）、エレクトロホレーション（電気穿孔法）、化学的に誘導されたＤＮＡの 取り込み、およびベクターとしてのウイルスもしくは花粉の使用を含む。 形質転換方法を必要とする場合は、本願発明の△６-デサチュラーゼ遺伝子を 、例えばBevan（1984）Nucleic Acid sRes．12，8111に記載されたバイナリーベ クター等の植物形質転換ベクターに挿入することができる。植物形質転換ベクタ ーは、Agrobacterium tumefaciensの通常の遺伝子転移システムを修飾すること によって誘導することができる。通常のシステムは、形質転換された植物に転移 される、Ｔ−ＤＮＡとして知られる巨大セグメントを含む、Ｔｉ（腫瘍−誘導） −プラスミドを含む。Ｔｉプラスミドの他のセグメント、ｖｉｒ領域は、Ｔ−Ｄ ＮＡ転移の原因である。Ｔ−ＤＮＡ領域には、末端繰り返しが隣接している。修 飾されたバイナリーベクターでは、腫瘍誘導遺伝子が削除され、Ｔ−ＤＮＡ端部 配列が隣接した外部ＤＮＡを転移するために、ｖｉｒ領域の機能が利用される。 またＴ−領域は、抗生物質耐性に選択的なマーカーを含み、転移の配列を挿入す るための多重クローニング部位を含む。このように設計された株は、“無力化(d isarmed)”A．tumefaciens株として知られ、Ｔ−領域が隣接した配列を、植物の 核ゲノムに効率的に形質転換する。 表面が減菌されたリーフディスクに、“無力化”外来ＤＮＡ含有A．tumefacie nsを接種し、２日間培養し、抗生物質含有培地に移す。適切な抗生物質を含む培 地に植え付けた後に、形質転換された新芽を選別し、土壌に移し、再生する。 本願発明の別の態様は、本願発明の単離されたＤＮＡを含むトランスジェニッ ク植物もしくはこれらの植物の子孫を提供する。単子葉および双子葉植物の両方 が考慮される。植物細胞は、上述の植物の形質転換方法のいずれかによって、△ ６-デサチュラーゼをコードする単離されたＤＮＡで形質転換される。通常はカ ルス培養もしくはリーフディスクの形質転換された植物細胞は、当業者に周知の 方法（例えば、Horschら（1985）Science 227，1129）によって、完全トランス ジェニック植物に再生される。好ましい実施態様では、トランスジェニック稙物 は、ヒマワリ、アブラナ(oil seed rape)、トウモロコシ、タバコ、ピーナツも しくは大豆である。形質転換された植物の子孫は、△６-デサチュラーゼをコー ドするＤ ＮＡが遺伝するので、形質転換植物の種子もしくは切片は、トランスジェニック 植物系統を維持するのに使用される。 本願発明はさらに、ＧＬＡの量が増大したトランスジェニック植物を提供する 方法を提供する。この方法は、ＧＬＡを欠いているか、あるいは低レベルのＧＬ Ａを備えた、ＬＡを含む植物細胞に、△６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡ を導入すること、およびトランスジェニック細胞からＧＬＡ含量が増大した植物 を再生することを含む。特に、商業的に生育した収穫植物は、ヒマワリ、大豆、 アブラナ、トウモロコシ、ピーナツおよびタバコを含むと考えられるが、これら に限定されない。 本願発明は、さらに、ＧＬＡを含むトランスジェニック生物体を提供する方法 を提供する。この方法は、ＧＬＡを欠いているか、あるいは低レベルのＧＬＡを 有するが、ＬＡを含む生物体に、△６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡを導 入することを含む。他の実施態様では、この方法は、△１２-デサチュラーゼお よび△６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡを含む一つ以上の発現ベクターを 、ＧＬＡおよびＬＡの両方を不足とする生物体中に導入することを含む。従って 、ＬＡとＧＬＡの両方を不足とする生物体は、△１２-デサチュラーゼの発現に よってＬＡを産生するように誘導され、しかして△６-デサチュラーゼの発現に よってＧＬＡが生成される。△１２-デサチュラーゼ、もしくは△１２-デサチュ ラーゼおよび△６-デサチュラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、 当業者に知られた組換え技術の方法（Sambrookら，1989）および△１２-デサチ ュラーゼの公開された配列（Wadaら，［1990］Nature（London）347，200-203） から構築することができる。さらに、本願発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ のヌクレオチド２００２−３０８１が、シアノバクテリアの△１２-デサチュラ ーゼをコードすることが示された。従って、この配列は、本願の発現ベクターを 構築するために用いられる。特に、商業的に生育された収穫植物は、ヒマワリ、 大豆、アブラナ、トウモロコシ、ピーナツおよびタバコを含むと考えられるが、 これらに限定されない。 本願発明は、植物に寒冷寛容を誘導する方法にも向けられている。寒冷感受性 は、細胞膜の脂質の相転移によることがある。相転移温度は、膜脂質の脂肪酸の 不飽和の度合いに依存し、例えばＬＡをＧＬＡに変換する△６-デサチュラーゼ を導入することにより、不飽和の度合いを増大することにより、寒冷耐性を誘導 もしくは改良することができる。従って、この方法は、△６-デサチュラーゼを コードするＤＮＡを植物細胞に導入すること、この形質転換された植物細胞から 、改良された寒冷耐性を備えた植物を再生することを含む。好ましい実施態様で は、植物は、ヒマワリ、大豆、アブラナ、トウモロコシ、ピーナツおよびタバコ である。 以下の実施例は、本願発明をさらに例証する。 実施例１ 株と培養条件 シネコシスティス(Synechocystis)（ＰＣＣ６８０３、ＡＴＣＣ２７１８４） 、アナベナ(Anabaena)（ＰＣＣ７１２０、ＡＴＣＣ２７８９３）およびシネココ ッカス(Synechococcus)（ＰＣＣ７９４２、ＡＴＣＣ３３９１２）を、白熱ラン プ（６０μＥ．ｍ^-2．Ｓ^-1）の照明下でＢＧ１１Ｎ＋培地（Rippkaら（1979）J ．Gen．Microbiol．111，1-61）で３０℃で光独立栄養生物学的に生育した。コ スミドおよびプラスミドを、Maniatisら（1982）Molecular Cloning: A Laborat ory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring，New Yorkに記載さ れた標準的な濃度で抗生物質を添加したＬＢ培地上の大腸菌(Escherichia coli) のＤＨ５α株内で、選別および繁殖させた。 実施例２ シネコシスティスコスミドゲノムライブラリーの作製 シネコシスティス（ＰＣＣ６８０３）の全体のゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａで 部分的に切断し、スクロース勾配で分画した（Ausubelら（1987）Current Proto cols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Inters cience，New York）。３０〜４０ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む画分を選別し 、コスミドベクターｐＤＵＣＡ７（Buikemaら（1991）J．Bacteriol．173，1879 -1885）の脱リン酸化ＢａｍＨＩ部位にリゲートした。リゲートされたＤＮＡを 、Ausubelら(1987)に記載されたようにin vitroでパッケージし、パッケージさ れたファージを、Buikemaら(1991)に記載されたＡｖａＩおよびＥｃｏ４７１１ メチラーゼヘルパープラスミドｐＲＬ５２８を含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αで繁 殖させた。全部で１１５２のコロニーをランダムに単離し、個別に９６ウェルミ クロタイタープレートで維持した。 実施例３ アナベナにおけるＧＬＡの機能獲得発現 アナベナ（ＰＣＣ７１２０）、繊維状シアノバクテリアは、ＧＬＡが不十分で あるが、ＧＬＡの前駆体であるリノール酸を大量に含む（図２；表２）。ＧＬＡ を産生するトランス接合体を同定するために、実施例２に記載されたシネコシス ティスコスミドライブラリーをアナベナ（ＰＣＣ７１２０）に接合した。アナベ ナ細胞を、ＢＧ１１Ｎ＋液体培地で中対数期(mid-log phase)まで生育し、終濃 度が約２ｘ１０⁸細胞／ｍｌとなるように同じ培地に再懸濁した。アンピシリン を含むＬＢ培地で生育したE.coli ＲＰ４の中対数期培養を洗浄し、新鮮なＬＢ 培地に再懸濁した。アナベナとＲＰ４を混合し、５％ＬＢを含むＢＧ１１Ｎ＋プ レートに平らに広げた。コスミドゲノムライブラリーを、５０μｇ／ｍｌのカナ マイシンと１７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上に レプリカプレートし、アナベナとＲＰ４を含むＢＧ１１Ｎ＋プレート上にパッチ (patch)した。３０℃で２４時間インキュベーションした後、３０μｇ／ｍｌの ネオマイシンを下に敷き、トランス接合体が現れるまで３０℃でインキュベーシ ョンを続けた。 個々のトランス接合体を接合後に単離し、１５μｇ／ｍｌのネオマイシンを含 む２ｍｌのＢＧ１１Ｎ＋液体培地で生育した。脂肪酸メチルエステル類を、野生 型培養物および以下のような１０のトランス接合体のプールを含む培養物から調 製した。野生型とトランスジェニックシアノバクテリアの培養物を、遠心して回 収し、蒸留水で２回洗浄した。脂肪酸メチルエステル類を、Dahmerら（1989）J ．Amer．Oil．Chem．Soc．66，543-548に記載されているようにして上記培養物 から抽出し、水素炎イオン化検出器とキャピラリーカラムとを備えたTracor-560 （３０ｍｘ０．２５ｍｍ bonded FSOT Superox II，Alltech Associates Inc.， IL）を用いたガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）で分析した。標準の保持時 間とコクロマトグラフイー(co-chromatography)（Sigma Chemical Co．から得ら れた）を、脂肪酸の同定のために用いた。平均的な脂肪酸組成を、内部標準に対 する標準化された各Ｃ１８脂肪酸のピーク面積の比率として調べた。 代表的なＧＬＣプロファイルが図２に示されている。Ｃ１８脂肪酸メチルエス テル類が示されている。脂肪酸メチルエステル類の既知の標準を用いた溶出時間 を比較することによってピークを同定し、ガスクロマトグラフィー質量分析によ って確認した。パネルＡは、アナベナの野生型の脂肪酸のＧＬＣ分析を示す。矢 印は、ＧＬＡの移動時間を示す。パネルＢは、ｐＡＭ５４２＋１．８Ｆを備えた アナベナのトランス接合体の脂肪酸のＧＬＣプロファイルである。二つのＧＬＡ 産生プール（２５プールは２５０トランス接合体を意味する）が、ＧＬＡを産生 することが同定された。各ＧＬＡ陽性プールの個々のトランス接合体をＧＬＡ産 生について分析した；各プールに由来する、二つの独立したトランス接合体、Ａ Ｓ１３およびＡＳ７５が、顕著なレベルのＧＬＡを発現したこと、並びに、コス ミド類、ｃＳｙ１３およびｃＳｙ７５をそれぞれ含むことが同定された（図３） 。これらのコスミドは、長さが約７．５ｋｂの領域において重複する。ｃＳｙ７ ５の３．５ｋｂのＮｈｅＩフラグメントをベクターｐＤＵＣＡ７に再度クローン 化し、ＧＬＡの機能獲得発現を生じるアナベナに転移した（表２）。 ｃＳｙ７５−３．５の３．５ｋｂのＮｈｅＩフラグメントの二つのＮｈｅＩ／ ＨｉｎｄIIIサブフラグメント（１．８および１．７ｋｂ）を、配列決定用に“ ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”(Stratagene)にサブクローン化した（図３）。標準的 な分子生物学的技術を、Maniatisら(1982)とAusubelら(1987)によって記載され ているようにして行った。ｐＢＳ１．８のジデオキシシークエンシング（Sanger ら（1977）Proc．Natl．Acad．Sci．USA74，5463-5467）を、the Advanced DNA Technologies Laboratory(Biology Department，Texas A & M University)によ って 合成された特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、二本鎖について“ ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ”(United States Biochemical)で行った。Devereuxら（198 4）Nucleic Acids Res．12，387-395に記載されているように、ＧＣＧ（Madison ，WI）ソフトウェアを用いて、ＤＮＡ配列解析を行った。 両方のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIIIサブフラグメントを、シアノバクテリアのカル ボキシラーゼプロモーターに対して正・逆の両方向で、接合発現ベクターＡＭ５ ４２に形質転換し、接合によりアナベナに導入した。１．８ｋｂのフラグメント を正の方向に含むトランス接合体（ＡＭ５４２−１．８Ｆ）は、顕著な量のＧＬ Ａとオクタデカテトラエン酸を産生した（図２；表２）。他の構築物、逆方向の １．８ｋｂフラグメントもしくは正・逆両方向の１．７ｋｂフラグメントを含む トランス接合体は、検出可能なレベルのＧＬＡを産生しなかった（表２）。 図２は、野生型アナベナ属から抽出したＣ１８脂肪酸プロファイルと、正方向 にｃＳｙ７５−３．５の１．８ｋｂフラグメントを含むトランスジェニックアナ ベナから抽出した脂肪酸のプロファイルとを比較した（図２Ｂ）。ＡＭ５４２− １．８Ｆからの脂肪酸メチルエステル類のＧＬＣ解析は、確実なＧＬＡ標準と同 じ保持時間のピークを示した。ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ） によるこのピークの解析により、ＧＬＡ参照サンプルと同じ質量分画パターンを 備えていることが確認された。変更されたレベルのポリ不飽和脂肪酸を備えたト ランスジェニックアナベナは、成長速度および形態学において野生型と類似して いた。 １８：０,ステアリン酸；１８：１,オレイン酸；１８：２,リノール酸；１８： ３(α),リノレン酸：１８：３(γ),γ-リノレン酸；１８：４,オクタデカテトラ エン酸 実施例４ △６および△１２-デサチュラーゼ遺伝子を用いたシネココッカスの形質転換 △１２-デサチュラーゼ遺伝子を含む第三のコスミド、ｃＳｙ７を、開示され たシネコシスティス(Synechocystis)△１２-デサチュラーゼ遺伝子配列（Wadaら （1990）Nature（London）347，200-203）から合成されたオリゴヌクレオチドで シネコシスティスゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離し た。△１２-デサチュラーゼ遺伝子を含むこのコスミドの１．７ｋｂ ＡｖａＩフ ラグメントを同定し、プローブとして用いて、ｃＳｙ１３が△６-デサチュラー ゼ遺伝子だけでなく△１２-デサチュラーゼ遺伝子も含むことが証明された（図 ３）。ゲノムサザンブロット解析は、△６−および△１２-デサチュラーゼ遺伝 子の両方がシネコシスティスゲノム中で独特であるので、Ｃ１８脂肪酸不飽和に 係る両方の機能遺伝子がシネコシスティスゲノム中で密接に関連することをさら に示した。 単細胞シアノバクテリア（ラン色細菌）シネココッカス（ＰＣＣ７９４２）は 、リノール酸とＧＬＡの両方において不十分である（３）。△１２および△６- デサチュラーゼ遺伝子を、シネココッカスのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込むの に必要な配列を含むシャトルベクター（Goldenら（1987）Methods in Enzynlol ．153，215-231）であるｐＡＭ８５４（Bustosら（1991）J．Bacteriol．174，7 525-7533）に、個々に、かつ、共にクローン化した。シネココッカスをこれらの 遺伝子構築物で形質転換し、コロニーを選別した。脂肪酸メチルエステルを、ト ランスジェニックシネココッカスから抽出し、ＧＬＣを解析した。 表２は、野生型シネココッカスの主な脂肪酸が、ステアリン酸（１８：０）お よびオレイン酸（１８：１）であることを示している。ｐＡＭ８５４−△１２で 形質転換されたシネココッカスは、この主な脂肪酸に加えてリノール酸（１８： ２）を発現した。ｐＡＭ８５４−△６および△１２で形質転換されたものは、リ ノレアート(linoleate)とＧＬＡの両方を産生した（表１）。△１２−および△ ６-デサチュラーゼ遺伝子の両方を含むシネココッカスは、Ｃ１８脂肪酸の△１ ２位に第二の二重結合と△６位に第三の二重結合を導入する能力を獲得した。し かし ながら、ｐＡＭ８５４−△６を含む形質転換体では脂肪酸組成において何の変化 も観察されず、△１２-デサチュラーゼによって合成された基質が存在しない条 件下では、△６-デサチュラーゼが不活性であることを示している。この実験は 、１．８／ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（図３）が、シネコシス ティス△６-デサチュラーゼ遺伝子のコード領域とプロモーター領域の両方を含 むことをさらに確認する。ポリ不飽和脂肪酸のレベルが変化したトランスジェニ ックシネココッカスは、成長速度と形態学において野生型と類似していた。 実施例５ △６-デサチュラーゼのヌクレオチド配列 機能的な△６-デサチュラーゼ遺伝子を含むｃＳｙ７５−３．５の１．８ｋｂ フラグメントのヌクレオチド配列を調べた。３５９アミノ酸のポリペプチドをコ ードする読みとり枠を同定した（図４）。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性 解析(Kyteら（1982）J．Mol．Biol．157，105-132)は、トランスメンブレンドメ インを示し得る疎水性アミノ酸の二つの領域；さらに、△６-デサチュラーゼの 疎水性プロファイルが△１２-デサチュラーゼ遺伝子（図１Ｂ；Wadaら）および △９-デサチュラーゼ（Thiedeら（1986）J．Biol．Chem．261，13230-13235）と 類似していることを同定した。しかしながら、シネコシスティス△６−および△ １２-デサチュラーゼ間の配列類似性は、ヌクレオチドレベルで４０％未満であ り、アミノ酸レベルで約１８％である。 実施例６ シアノバクテリア△⁶-デサチュラーゼのタバコへの転移 シアノバクテリア△⁶-デサチュラーゼ遺伝子を、植物発現ベクターに導入し、 アグロバクテリウム仲介遺伝子転移技術(Agrobacterium mediated gene transfe r techniques)を用いてタバコに移入した。移入されたデサチュラーゼが葉およ び発達中の種子において適切に発現されること、およびデサチュラーゼ遺伝子産 物 が小胞体もしくはクロロプラストに向けられることを確認するために、シネコシ スティス△デサチュラーゼ読みとり枠（ＯＲＦ）を備えた種々の発現カセットを 構築した。これらのカセットの成分は、（i）発達中の種子のみにおいて、もし くは全ての植物組織において、△⁶-デサチュラーゼ遺伝子の発現を誘導するため の、ヒマワリ ヘリアンチニン(helianthinin)遺伝子から誘導された種子特異的 プロモーターもしくは３５Ｓプロモーター、（ii）新規に合成された△⁶-デサチ ュラーゼをＥＲに向けるための、ニンジン エクステンシン(carrot extensin)遺 伝子もしくはヒマワリ ヘリアンチニン遺伝子に由来する推定上のシグナルペプ チド、（iii）△⁶-デサチュラーゼＯＲＦのＣＯＯＨ−末端のＥＲルーメン保持 シグナル配列（ＫＤＥＬ）、および（iv）△６-デサチュラーゼをクロロプラス トに向ける最適化されたトランジットペプチドを含む。３５Ｓプロモーターは、 Restrepoら(1990)に記載されたｐＲＴＬ２の誘導体である。最適化されたトラン ジットペプチド配列は、Van de Broeckら(1985)によって記載されている。ニン ジン エクステンシンシグナルペプチドは、Chenら（1985）EMBO J．9，2145によ って記載されている。 小胞体保持配列（ＫＤＥＬ）およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって誘導 されたエクステンシンシグナルペプチドに融合したシネコシスティス△⁶-デサチ ュラーゼ遺伝子を含むキメラ シアノバクテリア デサチュラーゼ遺伝子を含む、 トランスジェニックタバコ植物(tobacco plants)を産生した。トランスジェニッ クタバコゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、△⁶-デサチュラーゼ遺伝子がタバコゲノ ムに取り込まれたことを示唆している。これらのトランスジェニック タバコ植 物の葉の脂肪酸メチルエステル類を抽出し、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬ Ｃ）で解析した。これらのトランスジェニックタバコは顕著な量のＧＬＡを蓄積 した（図４）。図４は、ＧＬＣで同定された脂肪酸メチルエステル類を示す。ピ ークを、脂肪酸メチルエステルの既知の標準と溶出時間を比較することによって 同定した。従って、脂肪酸代謝に係るシアノバクテリア遺伝子は、変更された脂 肪酸組成を備えたトランスジェニック植物を産生するために使用することができ る。 実施例７ ルリヂサｃＤＮＡライブラリーの構築 膜結合ポリソームを、LarkinsとDavies(1975 Plant Phys．55:749-756)によっ てエンドウ(peas)用に確立されたプロトコールを用いて受粉から１２日後（１２ ＤＰＰ）にルリヂサの種子から単離した。ＲＮＡを、Mechlerによって記載され たように(1987 Methods in Enzymology 152:241-248，Academic Press)、ポリソ ームから抽出した。 ポリＡ＋ＲＮＡを、Oligotex-dTビーズ(Qiagen)の使用により膜結合ポリソー ムＲＮＡから単離した。対応するｃＤＮＡを、Stratagene's ZAP ｃＤＮＡ合成 キットを用いて作成した。ｃＤＮＡライブラリーを、λＺＡＰIIベクターキット を用いたλＺＡＰIIベクター（Stratagene）に構築した。主要なライブラリーを 、Gigapack II Gold パッケージングエクストラクト（Stratagene）にパッケー ジした。このライブラリーを用いて、発現された配列タグ（ＥＳＴ）を生成し、 タグに対応する配列を用いてGenBankデータベースをスキャンした。 実施例８ ハイブリダイゼーションプロトコル ルリヂサｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするハイブリダイゼーション プローブを、Ausubelらに記載されたようにして(1994 Current Protocols in Mo lecular Biology，Wiley Interscience，N.Y.)ランダム・プライムド・ＤＮＡ合 成（random primed DNA synthesis）によって生成し、先に同定された豊富に発 現された種子貯蔵タンパク質ｃＤＮＡと一致した。取り込まれていないヌクレオ チドをＧ−５０スピンカラムで除去した（Boehringer Manheim）。ハイブリダイ ゼーションのために、プローブを５分間ウォーターバスで煮沸して編成させ、氷 上で急速に冷却した。ハイブリダイゼーション用フィルターを、プレハイブリダ イゼーション溶液（６Ｘ ＳＳＣ[Maniatisら 1984 Molecular Cloning A Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory]、 １Ｘ Denharts溶液、０．０ ５％ ピロリン酸ナトリウム、１００μ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中で２−４時間 ６０℃でプレハイブリダイズした。変性プローブを、ハイブリダイゼーション溶 液（６Ｘ ＳＳＣ、 １Ｘ Denharts溶液、０．０５％ ピロリン酸ナトリウム、１ ００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に添加し、夜通し攪拌しながら６０℃でイ ンキュベートした。フィルターを、４ｘ、２ｘおよび１ｘ ＳＥＴ洗浄で、６０ ℃で１５分間洗浄した。２０Ｘ ＳＥＴストック溶液は、３Ｍ ＮａＣｌ、０．４ Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、２０ｍＭ Ｎａ₂ＥＤＴＡ−２Ｈ₂Ｏである。４Ｘ ＳＥＴ洗浄 は、４Ｘ ＳＥＴ、１２．５ｍＭ ＰＯ₄、ｐＨ６．８および０．２％ＳＤＳであ る。２Ｘ ＳＥＴ洗浄は、２Ｘ ＳＥＴ、１２．５ｍＭ ＰＯ₄、ｐＨ６．８および ０．２％ＳＤＳである。１Ｘ ＳＥＴ洗浄は、１Ｘ ＳＥＴ、１２．５ｍＭ ＰＯ₄ 、ｐＨ６．８および０．２％ＳＤＳである。フィルターを空気乾燥させ、−８０ ℃でスクリーンを増強しながら２４時間、Ｘ線フィルムに露光した。 実施例９ ルリヂサ種子（１２ＤＰＰ）膜結合ポリソームライブラリーからの ｃＤＮＡのランダムシークエンシング ルリヂサｃＤＮＡライブラリーを低密度(１５０ｍｍペトリ皿に５００ｐｆｕ) でプレートした。多数存在する種子貯蔵タンパク質ｃＤＮＡを、先に同定された 対応するｃＤＮＡを用いてスクリーニングすることによって“差し引いた”。ハ イブリダイズしないプラークを、Stratagene's 削除プロトコルと試薬を用いて 削除した。得られた細菌コロニーを用いて液体培地に接種し、手動またはＡＢＩ 自動シークエンサーで配列決定した。各ｃＤＮＡを一度配列決定し、配列タグを ２００−３００塩基対から生成した。全てのシークエンシングは、サイクルシー クエンシングによって行った(Epicentre)。３００以上のＥＳＴを生成した。各 配列タグを、ＢＬＡＳＴＸコンピュータープログラムによってGenBankデータベ ースと比較し、△６-デサチュラーゼを含む多数の脂質代謝遺伝子を同定した。 GenBankデータベースを備えたＢＬＡＳＴＸを用いたｍｂｐ−６５と称された ＣＤＮＡクローンを用いたデータベースサーチは、シネコシスティス△６-デサ チュ ラーゼと非常に適合した。しかしながら、このクローンは全長のｃＤＮＡではな かったことが調べられた。全長のｃＤＮＡは、ルリヂサ膜結合ポリソーマルライ ブラリーを選別するためにｍｂｐ−６５を用いて単離された。単離されたｃＤＮ Ａの配列を調べ（図５Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、読みとり枠のタンパク質 配列（図５Ｂ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を、Geneworks(IntelligGenetics)タン パク質整列プログラムを用いて、他の既知のデサチュラーゼと比較した（図２） 。この整列は、ｃＤＮＡがルリヂサ△６-デサチュラーゼ遺伝子であることを示 した。 他の既知の植物デサチュラーゼに類似しているが、ルリヂサ△６-デサチュラ ーゼは、図６に示されたデンドログラムに示されるように区別される。さらに、 デサチュラーゼのアミノ酸配列の特徴、特に金属結合に係ると予想される部分（ メタルボックス１およびメタルボックス２）の比較は、ルリヂサ△６-デサチュ ラーゼと他の植物のデサチュラーゼとの間の差異を示す（表３）。 ルリヂサ△６-デサチュラーゼは、全ての配列のみならず（図６）脂質ボック ス、メタルボックス１およびメタルボックス２アミノ酸モチーフにおいて、シア ノバクテリア形態から区別される（表３）。表３が示すように、３つの全てのモ チーフが配列において新規である。ルリヂサ△６-デサチュラーゼメタルボック ス２のみが、シネコシスティス△６-デサチュラーゼメタルボックス２と何らか の関係を示した。 さらに、ルリヂサ△６-デサチュラーゼは、他のルリヂサデサチュラーゼ遺伝 子である△１２-デサチュラーゼからも区別される。Ｐ１−８１は、ＥＳＴ解析 によって同定される全長のｃＤＮＡであり、アラビドプシス(Arabidopsis)△１ ２-デサチュラーゼ（Fad2）に高い類似性を示す。ルリヂサ△６および△１２-デ サチュラーゼにおける脂質ボックス、メタルボックス１およびメタルボックス２ アミノ酸モチーフの比較（表３）は、これらの領域においてほとんど相同性が存 在しないことを示した。図６のデンドログラムにおける二つの配列の配置は、こ れらの二つの遺伝子がどれくらい離れて関係しているのかを示す。 実施例１０ トランジエント(transient)と発現のための２２２．１△⁶ＮＯＳの構築 ベクターｐＢＩ２２１（Jeffersonら 1987 EMBO J．6:3901-3907）を、３５Ｓ プロモーターとＮＯＳターミネーターを完全に残したＧＵＳコード領域を削除す るBamHIとEcoICRI(Promega)を用いた切断により、リゲーション用に準備した。 ルリヂサ△６-デサチュラーゼｃＤＮＡを、BamHIとXhoIを用いた切断によってBl uescriptプラスミド（Stratagene）から切除した。XhoI末端を、クレノウフラグ メントの使用によって平滑にした。このフラグメントを、ｐＢＩ２２１のBamHI ／EcoICRI部位にクローン化し、２２１．△⁶ＮＯＳを得た（図７）。２２１．△⁶ ．ＮＯＳにおいて、図７に記載された制限マップの残りの部位（バックボーン ）はｐＢＩ２２１である。 実施例１１ 安定な形質転換のための１２１．△⁶．ＮＯＳの構築 ベクターｐＢＩ１２１（Jeffersonら 1987 EHBO J．6: 3901-3907）を、３５ ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターを完全に残したＧＵＳコード領域を削除 するBamHIとEcoICRI(Promega)を用いた切断により、リゲーション用に準備した 。ルリヂサ△６-デサチュラーゼｃＤＮＡを、BamHIとXhoIを用いた切断によって Bluescriptプラスミド（Stratagene)から切除した。XhoI末端を、クレノウフラ グメントの使用によって平滑にした。このフラグメントを、ｐＢＩ１２１のBamH I／EcoICRI部位にクローン化し、１２１．△⁶ＮＯＳを得た（図７）。１２１． △⁶．ＮＯＳにおいて、図７に記載された制限マップの残りの部位（バックボー ン）はｐＢＩ１２１である。 実施例１２ トランジエント（過渡的）発現 プロトプラストに係る全ての研究を無菌の覆い（フード）において行った。１ ｍｌのパックされたニンジン懸濁細胞を、１％セルラーゼ、０．１％ペクトリア ーゼ(pectolyase)、および０．１％ドレイサラーゼ(dreisalase)を含む３０ｍｌ の原形質分解溶液（２５ｇ／ｌ ＫＣｌ、３．５ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂−Ｈ₂Ｏ、１ ０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６および０．２Ｍ マンニトール）中で、夜通し、暗室 で、室温で切断した。放出されたプロトプラストを１５０μｍメッシュを介して 濾過し、遠心（１００ｘｇ、５分）してペレット化し、原形質分解溶液中で２回 洗浄した。二重チャンバー血球計数器(a double chambered hemocytometer)を用 いてプロトプラストを計測した。このプロトプラストに、１０⁶プロトプラスト および５０−７０μｇのプラスミドＤＮＡ（２２１．△６．ＮＯＳ）を用いて、 NunbergとThomas（1993 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolo gy、B.R．GlickとJ.E.Thompson，eds．pp.241-248）に記載されたように、ＰＥ Ｇ処置によってＤＮＡを移入した。０．２Ｍマンニトールと３μｍの２．４−Ｄ を補足した５ｍｌのＭＳ培地中で、暗室で攪拌しながら、４８時間、プロトプラ ストを培養した。 実施例１３ タバコの安定な形質転換 １２１．△⁶．ＮＯＳプラスミド構築物を用いて、最初の形質転換体を１００ μｇ／ｍｌのカナマイシン上で選別することを除いて、標準的な方法（Horshら ，1985 Science 227: 1229-1231; Bogueら，1990 Mol．Gen．Genet．221: 49-57 ）に従って、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を介してタバコ（Nicotiana t abacum cv．xanthi）を形質転換した。 実施例１４ 脂肪酸メチルエステル類（ＦＡＭＥ）の調製および分析 形質転換されたプロトプラストと形質転換されたタバコ植物からの組織を液体 窒素で冷凍し、夜通し凍結乾燥させた。Dahmerら(1989 J．Amer．Oil Chem．Soc ．66:543-548)に記載されているようにして、ＦＡＭＥを調製した。場合によっ ては、溶媒を再度蒸発させ、ＦＡＭＥを酢酸エチルに再懸濁し、脱イオン水で一 度抽出して、あらゆる水溶性不純物を除去した。ＦＡＭＥを、J & A Scientific DB-wax カラム（長さ３０ｍ、ＩＤが０．２５ｍｍ、０．２５μｍのフィルム） でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって解析した。 トランジエントアッセイ(a transient assay)の例は、図８に示されており、 ３つの独立したトランスフェクションが一緒にプールされていることを示してい る。ルリヂサ△６-デサチュラーゼｃＤＮＡの付加は、△６-デサチュラーゼが生 成可能な産物の一つであるγリノレン酸（ＧＬＡ）の出現に対応している。 図９および１０は、それぞれ対照および形質転換されたタバコ植物の葉および 種子組織から誘導されたＦＡＭＥのＧＣプロファイルを示す。図９Ａは、野生型 タバコ（ｘａｎｔｈｉ）の葉の組織のプロファイルを提供し；図９Ｂは３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターの転写制御下のルリヂサ△６-デサチュラーゼ（ｐＢＩ１ ２１△⁶ＮＯＳ）で形質転換されたタバコ植物の葉の組織のプロファイルを提供 する。ピークは、１８：２、１８：３γ（ＧＬＡ）、１８：３αおよび１８：４ （オクタデカノン酸(octadecanonic acid)）に対応する。図１０Ａは、野生型タ バコの種子のＧＣプロファイルを示し、図１０ＢはｐＢＩ １２１△⁶ＮＯＳで 形質転換されたタバコ植物の種子組織のプロファイルを示す。ピークは、１８： ２、１８：３γ（ＧＬＡ）、および１８：３αに対応する。 対照とトランスジェニックタバコ種子におけるＣ１８脂肪酸の相対分率は表４ に示されている。 上記の結果は、ルリヂサ△６-デサチュラーゼを含むトランスジェニックタバ コの葉および種子のトリアシルグリセリド類にＧＬＡが取り込まれたことを示す 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１月１０日 【補正内容】 請求の範囲 １． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド配列を含むBorago officinalis由来 の△６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸。 ２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。 ３． 請求項１または２に記載の核酸を含むベクター。 ４． 単離された核酸の遺伝子産物の発現に作用しうるプロモーターおよび任意 に終結シグナルに使用可能に連結された請求項１または２に記載の単離された核 酸を含む発現ベクター。 ５． プロモーターが、△６-デサチュラーゼプロモーター、アナベナカルボキ シラーゼプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター、グリシニンプロモーター 、ナビンプロモーター、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターもしくはヘリアンチニン 組織特異的プロモーターである、請求項４記載の発現ベクター。 ６． プロモーターが、構成性もしくは組織特異的である、請求項４記載の発現 ベクター。 ７． 終結シグナルが、シネコシスティス終結シグナル、ノパリンシンターゼ終 結シグナル、もしくは種子終結シグナルである、請求項４記載の発現ベクター。 ８． 請求項３ないし７のいずれか一項記載のベクターを含む細胞。 ９． 動物細胞、細菌細胞、植物細胞もしくは真菌細胞である、請求項８記載の 細胞。 １０． 請求項１または２に記載の単離された核酸で遺伝的に形質転換された生 物体。 １１． 請求項３ないし７のいずれか一項記載のベクターで遺伝的に形質転換さ れた生物体。 １２． 細菌、真菌、植物もしくは動物である、請求項１０または１１記載の生 物体。 １３． 請求項９記載の植物細胞から再生され、かつ、請求項１または２記載の 核酸で遺伝的に形質転換された、植物もしくは該植物の子孫。 １４． ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジンもしくは アブラナである、請求項１３記載の植物。 １５． （ａ）請求項１または２に記載の単離された核酸で植物細胞を形質転換 し、かつ、 （ｂ）前記植物細胞からγリノレン酸（ＧＬＡ）含量が増大した植物を再生する ことを含む、γリノレン酸含量が増大した植物を産生する方法。 １６． （ａ）請求項３ないし７のいずれか一項に記載のベクターで植物細胞を 形質転換し、かつ、 （ｂ）前記植物細胞からγリノレン酸（ＧＬＡ）含量が増大した植物を再生する ことを含む、γリノレン酸含量が増大した植物を産生する方法。 １７． 植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジン もしくはアブラナである、請求項１５または１６記載の方法。 １８． 請求項１または２記載の単離された核酸で生物体を形質転換することを 含む、γリノレン酸（ＧＬＡ）が不十分もしくはＧＬＡを欠失した生物体におけ るＧＬＡの産生を誘導する方法。 １９． 請求項３ないし７のいずれか一項に記載のベクターで生物体を形質転換 することを含む、γリノレン酸（ＧＬＡ）が不十分もしくはＧＬＡを欠失した生 物体におけるＧＬＡの産生を誘導する方法。 ２０． 請求項１または２記載の単離された核酸および△１２-デサチュラーゼ をコードする単離された核酸で生物体を形質転換することを含む、γリノレン酸 （ＧＬＡ）およびリノレン酸（ＬＡ）が不十分もしくはＧＬＡおよびＬＡを欠失 した生物体におけるＧＬＡの産生を誘導する方法。 ２１． △６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸が、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：４のヌクレオチド４４〜１３９０を含む、請求項２０記載の方法。 ２２． 請求項１または２記載の単離された核酸で生物体を形質転換することを 含む、γリノレン酸が不十分もしくはγリノレン酸を欠失した生物体におけるオ クタデカテトラエン酸の産生を誘導する方法。 ２３． 請求項３ないし７のいずれか一項に記載のベクターで生物体を形質転換 することを含む、γリノレン酸が不十分もしくはγリノレン酸を欠失した生物体 におけるオクタデカテトラエン酸の産生を誘導する方法。 ２４． 生物体が、細菌、真菌、植物もしくは動物である、請求項２２または２ ３記載の方法。 ２５． （ａ）請求項１または２に記載の単離された核酸で植物細胞を形質転換 し、かつ、 （ｂ）前記形質転換された植物細胞から寒冷耐性が改良された植物を再生する ことを含む、寒冷耐性が改良された植物を産生する方法。 ２６． 植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジン もしくはアブラナである、請求項２５記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ナッチオ，マイケル アメリカ合衆国 テキサス 77841 カレ ッジ ステーション ピー オー ボック ス 553 (72)発明者 ナンバーグ，アンドリュー エヌ アメリカ合衆国 テキサス 77801 ブラ イアン スプルースウッド ストリート 2804 ビー (72)発明者 フレイシネ，ジョルジュ エル フランス 69450 サンスィローモンドー ル リュ ドゥ ネルヴロ 21

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ルリヂサ△６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸。 ２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド配列を含む請求項１記載の単離され た核酸。 ３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。 ４． 請求項１ないし３のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。 ５． 単離された核酸の遺伝子産物の発現に作用しうるプロモーターおよび任意 に終結シグナルに使用可能に連結された請求項１ないし３のいずれか一項に記載 の単離された核酸を含む発現ベクター。 ６． プロモーターが、△６-デサチュラーゼプロモーター、アナベナカルボキ シラーゼプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター、グリシニンプロモーター 、ナピンプロモーター、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターもしくはヘリアンチニン 組織特異的プロモーターである、請求項５記載の発現ベクター。 ７． プロモーターが、構成性もしくは組織特異的である、請求項５記載の発現 ベクター。 ８． 終結シグナルが、シネコシスティス終結シグナル、ノパリンシンターゼ終 結シグナル、もしくは種子終結シグナルである、請求項５記載の発現ベクター。 ９． 請求項４ないし８のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。 １０． 動物細胞、細菌細胞、植物細胞もしくは真菌細胞である、請求項９記載 の細胞。 １１． 請求項１ないし３のいずれか一項に記載の単離された核酸を含むトラン スジェニック生物体。 １２． 請求項４ないし８のいずれか一項記載のベクターを含むトランスジェニ ック生物体。 １３． 細菌、真菌、植物もしくは動物である、請求項１１または１２記載のト ランスジェニック生物体。 １４． 請求項１０記載の植物細胞から再生された植物もしくは該植物の子孫。 １５． ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジンもしくは アブラナである、請求項１４記載の植物。 １６． （ａ）請求項１ないし３のいずれか一項に記載の単離された核酸で植物 細胞を形質転換し、かつ、 （ｂ）前記植物細胞からγリノレン酸（ＧＬＡ）含量が増大した植物を再生する ことを含む、ＧＬＡ含量が増大した植物を産生する方法。 １７． （ａ）請求項４ないし８のいずれか一項に記載のベクターで植物細胞を 形質転換し、かつ、 （ｂ）前記植物細胞からγリノレン酸（ＧＬＡ）含量が増大した植物を再生する ことを含む、ＧＬＡ含量が増大した植物を産生する方法。 １８． 植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジン もしくはアブラナである、請求項１６または１７記載の方法。 １９． 請求項１ないし３のいずれか一項記載の単離された核酸で生物体を形質 転換することを含む、γリノレン酸（ＧＬＡ）が不十分もしくはＧＬＡを欠失し た生物体におけるＧＬＡの産生を誘導する方法。 ２０． 請求項４ないし８のいずれか一項に記載のベクターで生物体を形質転換 することを含む、γリノレン酸（ＧＬＡ）が不十分もしくはＧＬＡを欠失した生 物体におけるＧＬＡの産生を誘導する方法。 ２１． ルリヂサ△６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸および△１ ２-デサチュラーゼをコードする単離された核酸で生物体を形質転換することを 含む、γリノレン酸（ＧＬＡ）およびリノール酸（ＬＡ）が不十分もしくはＧＬ ＡおよびＬＡを欠失した生物体におけるＧＬＡの産生を誘導する方法。 ２２． △６-デサチュラーゼをコードする単離された核酸が、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：４のヌクレオチド４４〜１３９０を含む、請求項２１記載の方法。 ２３． 請求項１ないし３のいずれか一項記載の単離された核酸で生物体を形質 転換することを含む、γリノレン酸が不十分もしくはγリノレン酸を欠失した生 物体におけるオクタデカテトラエン酸の産生を誘導する方法。 ２４． 請求項４ないし８のいずれか一項に記載のベクターで生物体を形質転換 することを含む、γリノレン酸が不十分もしくはγリノレン酸を欠失した生物体 におけるオクタデカテトラエン酸の産生を誘導する方法。 ２５． 生物体が、細菌、真菌、植物もしくは動物である、請求項２３または２ ４記載の方法。 ２６． （ａ）請求項１ないし３のいずれか一項に記載の単離された核酸で植物 細胞を形質転換し、かつ、 （ｂ）前記形質転換された植物細胞から寒冷耐性が改良された植物を再生するこ とを含む、寒冷耐性が改良された植物を産生する方法。 ２７． （ａ）請求項４ないし８のいずれか一項に記載のベクターで植物細胞を 形質転換し、かつ、 （ｂ）前記形質転換された植物細胞から寒冷耐性が改良された植物を再生するこ とを含む、寒冷耐性が改良された植物を産生する方法。 ２８． 植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジン もしくはアブラナである、請求項２６または２７記載の方法。