ES2262146T3 - Produccion de acido gamma-linolenico por una delta 6-desaturasa. - Google Patents

Produccion de acido gamma-linolenico por una delta 6-desaturasa.

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Abstract

EL ACIDO LINOLEICO SE CONVIERTE EN ACIDO {GA} SE REFIERE A ACIDOS NUCLEICOS AISLADOS QUE INCLUYEN EL GEN DE LA {DL}6 TERMINACION DEL GEN DE LA {DL}6 PORCIONA CONSTRUCCIONES RECOMBINANTES QUE INCLUYEN LA REGION QUE CODIFICA LA {DL}6 CON SECUENCIAS REGULADORAS HETEROLOGAS. LOS ACIDOS NUCLEICOS Y LAS CONSTRUCCIONES RECOMBINANTES DE ESTA INVENCION SON UTILES EN LA PRODUCCION DE AGL EN ORGANISMOS TRANSGENICOS.

Description

Producción de ácido gamma-linolénico por una \Delta6-desaturasa.
El ácido linoleico (18:2) (LA) es transformado en ácido gamma-linolénico (18:3) (GLA) por la enzima \Delta6-desaturasa. Cuando esta enzima, o el ácido nucleico que la codifica, se transfiere a células productoras de LA, se produce GLA. La presente invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden el gen de la \Delta6-desaturasa. Más específicamente, los ácidos nucleicos comprenden los promotores, regiones codificantes y regiones de terminación de los genes de la \Delta6-desaturasa. La presente invención se dirige además a construcciones recombinantes que comprenden una región codificante de la \Delta6-desaturasa en combinación funcional con secuencias reguladoras heterólogas. Los ácidos nucleicos y las construcciones recombinantes de la presente invención son útiles para la producción de GLA en organismos transgénicos.
Los ácidos grasos insaturados tales como los ácidos linoleico (C_{18}\Delta^{9,12}) y \alpha-linolénico (C_{18}\Delta^{9,12,15}) son constituyentes esenciales de la dieta que no pueden ser sintetizados por los vertebrados, puesto que las células de los vertebrados pueden introducir dobles enlaces en la posición \Delta^{9} de los ácidos grasos pero no pueden introducir dobles enlaces adicionales entre el doble enlace en \Delta^{9} y el extremo metilo de la cadena del ácido graso. Como son precursores de otros productos, los ácidos linoleico y \alpha-linolénico son ácidos grasos esenciales, y se obtienen normalmente de fuentes vegetales. El ácido linoleico puede ser convertido por los mamíferos en ácido \gamma-linolénico (GLA, C_{18}\Delta^{6,9,12}), que a su vez puede ser convertido en ácido araquidónico (20:4), un ácido graso de importancia crítica puesto que es un precursor esencial de la mayor parte de las prostaglandinas.
El aporte de ácido linoleico de la dieta, en virtud de su conversión, que da como resultado GLA y ácido araquidónico, satisface la necesidad dietética de GLA y ácido araquidónico. Sin embargo, se ha demostrado una relación entre el consumo de grasas saturadas y riesgos para la salud tales como la hipercolesterolemia, la aterosclerosis y otros trastornos químicos que se correlacionan con la predisposición a padecer enfermedades coronarias, mientras que el consumo de grasas insaturadas se ha asociado con una disminución de la concentración de colesterol en la sangre y una reducción del riesgo de aterosclerosis. Los beneficios terapéuticos del GLA de la dieta pueden ser el resultado de que el GLA es un precursor del ácido araquidónico y por consiguiente contribuye así a la síntesis de prostaglandinas. De acuerdo con ello, el consumo de GLA, más insaturado, en lugar de ácido linoleico, tiene beneficios potenciales para la salud. Sin embargo, el GLA no está presente en virtualmente ninguna planta que se cultive con fines comerciales.
Galle et al., "Plant lipid Metabolism" (Eds. Kader and Mazliak, Klumer Academic Publishers), páginas 509-511 (1995) describe microsomas de borraja que contienen actividad \Delta6 desaturasa, entre otras actividades enzimáticas. Se han llevado a cabo experimentos de solubilización para investigar el efecto de aumentar la concentración de detergentes con las proteínas de la borraja.
La solicitud de patente internacional WO 93/06712 describe un ácido nucleico aislado que codifica \Delta6-desaturasa bacteriana, específicamente \Delta6-desaturasa de synechosystis.
El ácido linoleico es convertido en GLA por la enzima \Delta6-desaturasa. La \Delta6-desaturasa, una enzima de más que 350 aminoácidos, tiene un dominio unido a la membrana y un sitio activo para la desaturación de ácidos grasos. Cuando se transfiere esta enzima a células que producen de forma endógena ácido linoleico pero no GLA, se produce GLA. La presente invención, al proporcionar el gen que codifica la \Delta6-desaturasa, permite la producción de organismos transgénicos que contienen \Delta6-desaturasa funcional y que producen GLA. Además de permitir la producción de grandes cantidades de GLA, la presente invención proporciona nuevas fuentes dietéticas de GLA.
La presente invención se dirige a genes de \Delta6-desaturasa de borraja aislados. Específicamente, los genes aislados comprenden los promotores de la \Delta6-desaturasa, regiones codificantes y regiones de terminación.
La presente invención se dirige además a vectores de expresión que comprenden el promotor de la \Delta6-desaturasa, la región codificante y la región de terminación.
Otro aspecto más de esta invención se dirige a vectores de expresión que comprenden una región codificante de la \Delta6-desaturasa de la borraja en combinación funcional con regiones regulatorias heterólogas, es decir, elementos no derivados del gen de la \Delta6-desaturasa.
También se proporcionan mediante la presente invención células y organismos que comprenden los vectores de la presente invención, y la progenie de tales organismos.
Se describe una \Delta6-desaturasa bacteriana aislada. También se proporciona una \Delta6-desaturasa de una planta aislada.
Otro aspecto más de esta invención proporciona un método para producir plantas con un contenido incrementado en ácido gamma-linolénico.
También se proporciona mediante la presente invención un método para producir plantas con tolerancia al frío.
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La Fig. 1 representa los perfiles de hidropatía de las secuencias deducidas de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa (Panel A) y la \Delta12-desaturasa (Panel B) de Synechocystis. Las regiones que hipotéticamente se extienden por la membrana se indican mediante barras rellenas. El índice hidrófobo se calculó para un tamaño de ventana de 19 residuos aminoácidos [Kyte, et al. (1982) J. Molec. Biol. 157].
La Fig. 2 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido de Anabaena de tipo silvestre (Panel A) y transgénica (Panel B).
La Fig. 3 es un diagrama de mapas de los cósmidos cSy75, cSy13 y cSy7 con las regiones solapantes y los subclones. Los orígenes de los subclones de CSy75, CSy75-3.5 y CSy7 se indican mediante líneas diagonales discontinuas. Los sitios de restricción que han sido inactivados aparecen entre paréntesis.
La Fig. 4 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido de tabaco de tipo silvestre (Panel A) y transgénico (Panel B).
La Fig. 5A representa la secuencia de DNA de un cDNA de \Delta-6 desaturasa aislado de la borraja.
La Fig. 5B representa la secuencia de proteínas del marco abierto de lectura en el cDNA de la \Delta-6 desaturasa de borraja aislado. Se indican tres motivos de aminoácidos característicos de las desaturasas y son, por orden, caja lipídica, caja metálica 1, y caja metálica 2.
La Fig. 6 es un dendrograma que muestra la similitud de la \Delta6-desaturasa de borraja respecto a otras desaturasas unidas a la membrana. La secuencia de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa de borraja se comparó con otras desaturasas conocidas usando Gene Works (IntelliGenetics). Los valores numéricos se correlacionan con distancias filogenéticas relativas entre los subgrupos comparados.
La Fig. 7 es un mapa de restricción de 221.\Delta6.NOS y 121.\Delta6.NOS. En 221.\Delta6.NOS, la parte remanente del plásmido es pBI221 y en 121.\Delta6.NOS, la parte remanente del plásmido es pBI121.
La Fig. 8 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido de células de zanahoria transfectadas con un vector vacío (Panel A) transfectadas con 221. \Delta6.NOS (Panel B). Se indican las posiciones de 18:2, 18:3 \alpha, y 18:3 \gamma (GLA).
La Fig. 9 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido de una hoja de tabaco sin transformar (Panel A) y una hoja de tabaco transformada con 121. \Delta6.NOS. Se indican las posiciones de 18:2, 18:3\alpha, 18:3\gamma (GLA), y 18:4.
La Fig. 10 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido para semillas de tabaco sin transformar (Panel A) y semillas de tabaco transformadas con 121. \Delta6.NOS. Se indican las posiciones de 18:2, 18:3\alpha y 18:3\gamma (GLA).
La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican la \Delta6-desaturasa de borraja. Para identificar un ácido nucleico que codifique la \Delta6-desaturasa, se aisla DNA de un organismo que produce GLA. Dicho organismo puede ser, por ejemplo, una célula animal, ciertos hongos (por ejemplo. Mortierella), ciertas bacterias (por ejemplo Synechocystis) o ciertas plantas (borraja, Oenothera, grosellas). El aislamiento del DNA genómico se puede lograr mediante diversos métodos bien conocidos por un experto común en la técnica, tal como fue mostrado con ejemplos por Sambrook et al. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York. El DNA aislado se fragmenta mediante métodos físicos o digestión enzimática y se clona en un vector apropiado, por ejemplo, un vector derivado de un bacteriófago o de tipo cósmido, mediante cualquiera de entre diversos métodos bien conocidos que se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook et al. (1989). Los vectores de expresión que contienen el DNA de la presente invención están contemplados específicamente en la presente memoria. El DNA que codifica la \Delta6-desaturasa se puede identificar mediante un análisis de ganancia de función. El vector que contiene el DNA fragmentado se transfiere, por ejemplo, mediante infección, transconjugación, transfección, a un organismo hospedador que produce ácido linoleico pero no GLA. Tal como se utiliza en la presente memoria, "transformación" se refiere, de manera general, a la incorporación de DNA exógeno en una célula hospedadora. Los métodos para introducir DNA recombinante en un organismo hospedador son conocidos por un experto común en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989). La producción de GLA por estos organismos (es decir, ganancia de función) se ensaya, por ejemplo, por cromatografía de gases u otros métodos conocidos por el experto común en la técnica. Los organismos que son inducidos a producir GLA, es decir, que han ganado esa función por la introducción del vector, se identifican como organismos que expresan DNA que codifica la \Delta6-desaturasa, y dicho DNA se recupera de los organismos. El DNA recuperado se puede volver a fragmentar, clonar con vectores de expresión, y evaluar funcionalmente
mediante los procedimientos anteriores para definir con más detalle el DNA que codifica la \Delta6-desaturasa.
La presente invención se dirige a un ácido nucleico aislado que codifica una \Delta6 desaturasa, como se expone en la reivindicación 1.
Como ejemplo, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 93/06712, se aisla DNA aleatorio de la cianobacteria Synechocystis, Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, American Type Culture Collection (ATCC) 27184, se clona en un vector de tipo cósmido, y se introduce por transconjugación en la cianobacteria deficiente en GLA Anabaena, cepa PCC 7120, ATCC 27893. La producción de GLA a partir de ácido linoleico en Anabaena se controla mediante cromatografía de gases y se aisla el correspondiente fragmento de DNA.
El DNA aislado se secuencia por métodos bien conocidos para alguien con una experiencia normal en la técnica, tal como se encuentra, por ejemplo, en Sambrook et al. (1909).
Se ha aislado de la cianobacteria Synechocystis un DNA de 3,588 kilobases (kb) que comprende un gen de la \Delta6-desaturasa. Se determinó la secuencia de nucleótidos del DNA de 3,588 kb, y se muestra en la SEQ ID NO: 1. Están presentes marcos abiertos de lectura que definen 5 regiones codificantes potenciales desde el nucleótido 317 al 1507 y desde el nucleótido 2002 al 3081. Para definir los nucleótidos responsables de codificar la \Delta6-desaturasa, el fragmento de 3,588 kb que confiere la actividad \Delta6-desaturasa se escinde en dos subfragmentos, cada uno de los cuales contiene sólo un marco abierto de lectura (ORF). El fragmento ORF1 contiene los nucleótidos 1 a 1704, mientras que el fragmento ORF2 contiene los nucleótidos 1705 a 3588. Cada fragmento es subclonado, tanto en orientación directa como inversa, en un vector de expresión conjugador (AM542, Wolk et al. (1984] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561) que contiene un promotor de la carboxilasa cianobacteriana. Las construcciones resultantes (es decir, ORF1 (F), ORF1 (R) , ORF2 (F) y ORF2 (R)) son conjugadas con Anabaena PCC 7120 de tipo silvestre por métodos estándar (véase, por ejemplo, Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561). Las células conjugadas de Anabaena se identifican como colonias verdes Neo^{R} sobre un fondo marrón de células moribundas no conjugadas después de dos semanas de crecimiento en medio selectivo (medio mineral estándar BG11N + que contiene 30 \mug/ml de neomicina según Rippka et al., (1979) J. Gen Microbiol. 111, 1). Se seleccionan las colonias verdes y se hacen crecer en medio líquido selectivo (BG11N+ con 15 \mug/ml de neomicina). Los lípidos se extraen por métodos estándar (por ejemplo, Dahmer et al., (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) de los transconjugantes resultantes que contienen las construcciones ORF1 y ORF2 en las orientaciones directa e inversa. Para comparación, también se extraen lípidos de cultivos de Anabaena y Synechocystis de tipo silvestre. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se analizan por cromatografía de gas-líquido (GLC), por ejemplo con un cromatógrafo de gases-líquidos Tracor-560 equipado con un detector de ionización por llama de hidrógeno y una columna capilar. Los resultados del análisis por GLC se muestran en la Tabla 1.
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TABLA 1 Presencia de ácidos grasos C18 en cianobacterias de tipo silvestre y transgénicas
Origen 18:0 18:1 18:2 \gamma18:3 \alpha18:3 18:4
Anabaena (tipo silvestre) + + + - + -
Anabaena + ORF1 (D) + + + - + -
Anabaena + ORF1 (I) + + + - + -
Anabaena + ORF2 (D) + + + + + +
Anabaena + ORF2 (I) + + + - + -
Synechocystis (tipo silvestre) + + + + - -
Como se determinó por el análisis de GLC, la Anabaena deficiente en GLA gana la función de producción de GLA cuando se introduce por transconjugación la construcción que contiene ORF2 en orientación directa. Los transconjugantes que contienen las construcciones con ORF2 en orientación inversa respecto al promotor de la carboxilasa, o el ORF1 en cualquier orientación, no muestran ninguna producción de GLA. Este análisis demuestra que el único marco abierto de lectura (ORF2) dentro del fragmento de 1884 pb codifica la \Delta6-desaturasa. El fragmento de 1884 pb se muestra como la SEQ ID NO: 3. Esto se comprueba por la similitud global de los perfiles de hidropatía entre la \Delta6-desaturasa y la \Delta12-desaturasa [Wada et al. (1990) Nature 3471] mostrados en la Fig. 1 como (A) y (B), respectivamente.
De acuerdo con la presente invención, se ha aislado un cDNA que comprende un gen de la \Delta6-desaturasa de borraja (Borago officinalis). Se determinó la secuencia de nucleótidos del cDNA de 1,685 kilobases (kb), y se muestra en la Fig. 5A (SEQ ID NO: 4). El codón de partida ATG y el codón de parada están subrayados. La secuencia de aminoácidos correspondiente al marco abierto de lectura en la delta 6-desaturasa de borraja se muestra en la Fig. 5B (SEQ ID NO: 5).
Se pueden identificar ácidos nucleicos aislados que codifican \Delta6-desaturasa de otros organismos productores de GLA mediante el análisis de ganancia de función anteriormente descrito, o mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos utilizando el ácido nucleico aislado que codifica la \Delta6-desaturasa de borraja como sonda de hibridación. Los métodos de clonación tanto de DNA genómico como de cDNA son conocidos por el experto en la técnica y están contemplados en la presente invención. La sonda de hibridación puede comprender la secuencia de DNA entera descrita como SEQ. ID NO: 1 ó SEQ. ID NO: 4, o un fragmento de restricción u otro fragmento de DNA suyo, incluyendo una sonda de oligonucleótidos. Los métodos para clonar genes homólogos por hibridación cruzada son conocidos por el experto común en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook (1989) y Beltz et al. (1983) Methods in Enzymology 100, 266.
En otro método de identificar un gen de la delta 6-desaturasa de un organismo que produce GLA, se hace una genoteca de cDNA a partir de poli-A^{+} RNA aislado de RNA polisómico. Con el fin de eliminar genes expresados hiperabundantes de la población de cDNA, se usan cDNAs o fragmentos suyos correspondientes a genes de cDNAs hiperabundantes como sondas de hibridación para la genoteca de cDNA. Se escinden las placas no hibridantes y las colonias bacterianas resultantes se usan para inocular cultivos líquidos y se secuencian. Por ejemplo, como medio de eliminar otros cDNAs de proteínas de almacenamiento de semillas de una genoteca de cDNA hecha a partir de RNA polisómico de borraja, los cDNAs correspondientes a proteínas de almacenamiento de semillas expresadas abundantemente son hibridados primero a la genoteca de cDNA. La genoteca de DNA "substraído" se usa entonces para generar marcadores de secuencias expresadas (ETSs) y tales marcadores se usan para examinar una base de datos, tal como GenBank, para identificar desaturados potenciales.
Los organismos transgénicos que ganan la función de producción de GLA mediante la introducción de DNA que codifica una \Delta-desaturasa también ganan la función de producción de ácido octadecatetraenoico (18:4\Delta^{6,9,12,15}). El ácido octadecatetraenoico está presente normalmente en aceites de pescado y en algunas especies de plantas de la familia Boraginaceae (Craig et al. [1964] J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 209-211; Gross et al. [1976] Can. J. Plant Sci. 56, 659-664). En los organismos transgénicos de la presente invención, el ácido octadecatetraenoico aparece como resultado de la desaturación adicional del ácido \alpha-linolénico por la \Delta6-desaturasa o la desaturación de GLA por la \Delta15-desaturasa.
Los 359 aminoácidos codificados por ORF2, es decir, el marco abierto de lectura que codifica la \Delta6-desaturasa de Synechocystis, se muestran como la SEQ. ID NO: 2. El marco abierto de lectura que codifica la \Delta6-desaturasa de borraja se muestra en la SEQ ID NO: 5. La presente invención contempla además otras secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Está dentro del ámbito de conocimiento del experto común en la técnica identificar tales secuencias que resultan, por ejemplo, de la degeneración del código genético. Además, un experto común en la técnica puede determinar, mediante el análisis de ganancia de función descrito anteriormente en la presente memoria, subfragmentos más pequeños de los fragmentos que contengan los marcos abiertos de lectura que codifican \Delta6-desaturasas.
La presente invención contempla cualquiera de tales fragmentos polipeptídicos de la \Delta6-desaturasa y los ácidos nucleicos correspondientes a ella que retienen la actividad de convertir LA en GLA.
En otro aspecto de la presente invención, un vector que contiene un ácido nucleico de la presente invención o un fragmento más pequeño que contiene el promotor, la secuencia codificante y la región de terminación de un gen de la \Delta6-desaturasa se transfiere a un organismo, por ejemplo, cianobacterias, en las que el promotor de la \Delta6-desaturasa y las regiones de terminación sean funcionales. Por consiguiente, mediante esta invención se proporcionan organismos productores de \Delta6-desaturasa recombinante. Otro aspecto más de esta invención proporciona \Delta6-desaturasa aislada, que se puede purificar a partir de los organismos recombinantes mediante métodos estándar de purificación de proteínas. (Por ejemplo, véase Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New York).
También se proporcionan mediante la presente invención vectores que contienen un DNA que codifica \Delta6-desaturasa. Será evidente para un experto común en la técnica que se pueden construir vectores apropiados para dirigir la expresión de la secuencia codificante de la \Delta6-desaturasa en una variedad de organismos. Se prefieren especialmente los vectores de expresión que se pueden replicar. Los vectores de expresión que se pueden replicar, tal como se describen en la presente memoria, son moléculas de DNA o RNA obtenidas mediante técnicas de ingeniería genética para conseguir la expresión controlada de un gen deseado, es decir, el gen de la \Delta6-desaturasa. Preferiblemente los vectores son plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus. Los vectores lanzadera, p.ej. los descritos por Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1561-1565 y Bustos et al. (1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533, también están contemplados, de acuerdo con la presente invención. Sambrook et al. (1989), Goeddel, ed. (1990) Methods in Enzymology 185 Academic Press, y Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., proporcionan revisiones detalladas de vectores en los que se puede insertar y expresar un ácido nucleico que codifica la presente \Delta6-desaturasa. Tales vectores contienen también secuencias de ácidos nucleicos que pueden llevar a cabo la expresión de ácidos nucleicos que codifiquen la \Delta6-desaturasa. Los elementos de secuencia capaces de llevar a cabo la expresión de un producto de un gen incluyen promotores, elementos potenciadores, secuencias activadoras corriente arriba, señales de terminación de la transcripción y sitios de poliadenilación. Se contemplan promotores tanto constitutivos como específicos de tejido. Para la transformación de células de plantas, son de particular interés el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y promotores que están regulados durante la maduración de la semilla de la planta. La totalidad de tales promotores y elementos reguladores de la transcripción, de forma aislada o en combinación, se contemplan para su uso en los presentes vectores de expresión que se pueden replicar y que son conocidos para un experto común en la técnica. El promotor CaMV 355 es descrito, por ejemplo, por Restrepo et al. (1990) Plant Cell 2, 987. También están contempladas secuencias reguladoras modificadas por ingeniería genérica y mutadas.
El experto común en la técnica puede determinar vectores y elementos reguladores adecuados para la expresión en una célula hospedadora concreta. Por ejemplo, un vector que comprende el promotor del gen que codifica la carboxilasa de Anabaena unido de forma operativa a la región codificante de la \Delta6-desaturasa y además unido de forma operativa a una señal de terminación de Synechocystis es apropiado para la expresión de la \Delta6-desaturasa en cianobacterias. "Unido de forma operativa" quiere decir en este contexto que el promotor y las secuencias de terminación funcionan de forma efectiva para regular la transcripción. Como ejemplo adicional, un vector apropiado para la expresión de la \Delta6-desaturasa en plantas transgénicas puede comprender una secuencia promotora específica de semillas derivada de la heliantinina, napina, o glicina unida de forma operativa a la región codificante de la \Delta6-desaturasa y además unida de forma operativa a una señal de terminación de semillas o a la señal de terminación de la nopalina sintasa. Como otro ejemplo adicional, un vector para uso en la expresión de la \Delta6-desaturasa en plantas puede comprender un promotor constitutivo o un promotor de tejidos específico unido de forma operativa a la región codificante de la \Delta6-desaturasa y además unido de forma operativa a un terminador específico constitutivo o tisular o a la señal de terminación de la nopalina sintasa.
En particular, los elementos reguladores de la heliantinina descritos en la solicitud del mismo solicitante en tramitación con la presente en EE.UU. con número de serie 682.354, presentada el 8 de abril de 1991, se contemplan como elementos promotores para dirigir la expresión de la \Delta6-desaturasa de la presente invención.
Las modificaciones de las secuencias nucleotídicas o de los elementos reguladores descritos en la presente memoria que mantengan las funciones contempladas en la presente memoria están dentro del alcance de esta invención. Tales modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente las sustituciones que reflejen la degeneración del código genético.
Las técnicas estándar para la construcción de tales vectores híbridos son bien conocidas por los expertos comunes en la técnica y se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook et al. (1989), o cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio sobre tecnología de DNA recombinante que están ampliamente disponibles. Se dispone de toda una variedad de estrategias para ligar fragmentos de DNA, la elección de las cuales depende de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de DNA. De acuerdo con la presente invención, se contempla además incluir en los vectores híbridos otros elementos de secuencias nucleotídicas que faciliten la clonación, la expresión o el procesamiento, por ejemplo secuencias que codifican péptidos señales, una secuencia que codifica la secuencia KDEL, que se requiere para la retención de proteínas en el retículo endoplásmico, o secuencias que codifican péptidos de tránsito que dirijan la \Delta6-desaturasa al cloroplasto. Tales secuencias son conocidas para un experto común en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado es descrito, por ejemplo, por Van de Broeck et al. (1985) Nature 313, 358. Están descritas secuencias señalizadoras procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, por Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona organismos distintos de las cianobacterias o plantas que contienen el DNA que codifica la \Delta6-desaturasa de la presente invención. Los organismos transgénicos contemplados de acuerdo con la presente invención incluyen bacterias, cianobacterias, hongos, y plantas y animales. El DNA aislado de la presente invención se puede introducir en el hospedador mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, infección, transfección, transformación o transconjugación. Las técnicas para transferir el DNA de la presente invención a tales organismos son ampliamente conocidas y se proporcionan en referencias tales como Sambrook et al. (1989).
Se conoce una amplia variedad de métodos de transformación de plantas. El gen de la \Delta6-desaturasa se puede introducir en plantas mediante un procedimiento de transformación - regeneración de discos foliares, como ha sido descrito por Horsch et al. (1985) Science 227, 1229. Se pueden usar otros métodos de transformación, tales como cultivo de protoplasto (Horsch et al. (1984) Science 223, 496; DeBlock et al. (1984) EMBO J. 2, 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033) y están dentro del alcance de esta invención. En una realización preferida las plantas se transforman con vectores derivados de Agrobacterium. Sin embargo, están disponibles otros métodos para insertar los genes de la \Delta6-desaturasa de la presente invención en células de plantas. Tales métodos alternativos incluyen planteamientos biolísticos (Klein et al. (1987) Nature 327, 70), electroporación, absorción de DNA inducida químicamente, y uso de virus o polen como vectores.
Cuando sea necesario para el método de transformación, los genes de la \Delta6-desaturasa de la presente invención se pueden insertar en un vector de transformación de plantas, por ejemplo, el vector binario descrito por Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Pueden obtenerse derivados de vectores de transformación de plantas modificando el sistema natural de transferencia de genes de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plásmidos Ti (inductores de tumores) grandes que contienen un segmento grande, conocido como T-DNA, que se transfiere a las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia del T-DNA. La región del T-DNA está flanqueada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, se han eliminado los genes inductores de tumores y se utilizan las funciones de la región vir para transferir DNA exógeno flanqueado por las secuencias flanqueantes del T-DNA. La región T contiene también un marcador que permite la selección por resistencia a antibióticos, y un sitio múltiple de clonación para insertar secuencias para ser transferidas. Tales cepas modificadas por ingeniería genética se conocen como cepas "desarmadas" de A. tumefaciens, y permiten la transformación eficiente de secuencias flanqueadas por la región T en los genomas de los núcleos de las plantas.
Los discos foliares esterilizados en su superficie se inoculan con A. tumefaciens que contiene el DNA exógeno "desarmado", se cultivan durante dos días y se transfieren luego a un medio que contiene un antibiótico. Los brotes transformados se seleccionan después de que echen raíces en un medio que contiene el antibiótico apropiado, se trasfieren al suelo y se regeneran.
Otro aspecto de la presente invención proporciona plantas transgénicas o una progenie de estas plantas que contienen el DNA aislado de la invención. Se contemplan tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las células de las plantas se transforman con el DNA aislado que codifica la \Delta6-desaturasa mediante cualquiera de los métodos de transformación de plantas anteriormente descritos. La célula de planta transformada, habitualmente un cultivo de callo o disco foliar, se regenera para dar una planta transgénica completa por métodos bien conocidos para un experto común en la técnica (por ejemplo, Horsch et al. (1985) Science 227, 1129). En una realización preferida, la planta transgénica es girasol, colza, maíz, tabaco, cacahuete o soja. Puesto que la progenie de las plantas transformadas hereda el DNA que codifica la \Delta6-desaturasa, se utilizan semillas o esquejes de plantas transformadas para mantener la línea de plantas transgénicas.
La presente invención proporciona además un método para proporcionar plantas transgénicas con un contenido incrementado de GLA. Este método incluye introducir DNA que codifica \Delta6-desaturasa en células de plantas que carecen o tienen niveles bajos de GLA pero contienen LA, y regenerar plantas con un contenido en GLA incrementado a partir de las células transgénicas. En particular, se contempla como el organismo transgénico plantas de cultivos que se culti-
van con fines comerciales, que incluyen, pero no están limitados a, girasol, soja, colza, maíz, cacahuete y tabaco.
La presente invención proporciona además un método para proporcionar organismos transgénicos no humanos que contienen GLA. Este método comprende introducir DNA que codifica la \Delta6-desaturasa en un organismo que carece de o tiene bajos niveles de GLA, pero que contiene LA. En otra realización, el método comprende introducir uno o más vectores de expresión que comprenden DNA que codifica la \Delta12-desaturasa y la \Delta6-desaturasa en organismos que son deficientes tanto en GLA como en LA. De acuerdo con ello, se induce la producción de LA en organismos deficientes tanto en LA como GLA mediante la expresión de la \Delta12-desaturasa, y se genera entonces GLA debido a la expresión de la \Delta6-desaturasa. Se pueden construir vectores de expresión que comprenden DNA que codifica la \Delta12-desaturasa, o la \Delta12-desaturasa y la \Delta6-desaturasa, por métodos de tecnología recombinante conocidos por un experto común en la técnica (Sambrook et al., 1989) y la secuencia publicada de la \Delta12-desaturasa (Wada et al [1990] Nature (Londres) 347, 200-203). Además, se ha descubierto, de acuerdo con la presente invención, que los nucleótidos 2002-3081 de la SEQ. ID NO: 1 codifican \Delta12-desaturasa cianobacteriana. De acuerdo con esto, esta secuencia se puede utilizar para construir los vectores de expresión objeto de la invención. En particular, se contemplan como organismo transgénico plantas de cultivo que se cultivan con fines comerciales, que incluyen, pero no están limitados a, girasol, soja, colza, maíz, cacahuete y tabaco.
La presente invención se dirige además a un método para inducir tolerancia al frío en plantas. La sensibilidad al frío se puede deber a una transición de fase de lípidos de las membranas celulares. La temperatura de transición de fase depende del grado de insaturación de los ácidos grasos de los lípidos de membrana y así, incrementar el grado de insaturación, por ejemplo, introduciendo una \Delta6-desaturasa para convertir LA en GLA, puede inducir o mejorar la resistencia al frío. De acuerdo con esto, el presente método comprende introducir DNA que codifica la \Delta6-desaturasa en una célula de planta, y regenerar una planta con resistencia al frío mejorada a partir de dicha célula de planta transformada. En una realización preferida, la planta es una planta de girasol, soja, colza, maíz, cacahuete o tabaco.
Los siguientes ejemplos ilustran de forma adicional la presente invención.
Ejemplo 1
(No incluido en la invención)
Cepas y Condiciones de Cultivo
Se hizo crecer Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) y Synechococcus (PCC 7942, ATCC 33912) de forma fotoautótrofa a 30ºC en medio BG11N+ (Rippka et al. (1979) J. Gen. Microbiol. 111, 1-61) bajo iluminación de lámparas incandescentes (6 \muE.m^{-2}.S^{-1}). Los cósmidos y plásmidos se seleccionaron y propagaron en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli sobre medio LB suplementado con antibióticos a concentraciones normales, tal como ha sido descrito por Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York.
Ejemplo 2
(No incluido en la invención)
Construcción de una Genoteca de Cósmidos de Synechocystis
DNA genómico total de Synechocystis (PCC 6803) se digirió parcialmente con Sau3A y se fraccionó en un gradiente de sacarosa (Ausubel et al. [1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Se seleccionaron las fracciones que contenían fragmentos de DNA de 30 a 40 kb y se ligaron al sitio BamHI desfosforilado del vector cósmido, pDUCA7 (Buikema et al. [1991] J. Bacteriol. 173, 1879-1885). El DNA ligado fue empaquetado in vitro como ha sido descrito por Ausubel et al. (1987), y los fagos empaquetados fueron propagados en E. coli DH5\alpha que contenía el plásmido auxiliar de metilasa AvaI y Eco4711, pRL528, tal como ha sido descrito por Buikema et al. (1991). Se aislaron al azar un total de 1152 colonias y se mantuvieron individualmente en doce placas de microtitulación de 96 pocillos.
Ejemplo 3
(No incluido en la invención)
Expresión de GLA por ganancia de función en Anabaena
La Anabaena (PCC 7120), una cianobacteria filamentosa, es deficiente en GLA pero contiene cantidades significativas de ácido linoleico, el precursor del GLA (Figura 2; Tabla 2). La genoteca de cósmidos de Synechocystis descrita en el Ejemplo 2 se conjugó en Anabaena (PCC 7120) para identificar transconjugantes que producen GLA. Se hicieron crecer células de Anabaena hasta la fase semilogarítmica en medio líquido BG11N+ y se resuspendieron en el mismo medio hasta una concentración final de aproximadamente 2x10^{6} células por ml. Un cultivo en fase semilogarítmica de E. coli RP4 (Burkardt et 11. (1979) J. Gen. Microbiol. 114, 341-348) que creció en LB que contenía ampicilina se lavó y resuspendió en medio LB nuevo. Se mezclaron entonces Anabaena y RP4 y se extendieron uniformemente sobre placas de BG11N+ que contenían LB al 51%. Se obtuvieron réplicas en placa de la genoteca de cósmidos sobre placas de LB que contenían 50 \mug/ml de kanamicina y 17,5 \mug/ml de cloramfenicol y se situaron posteriormente a modo de parches sobre placas de BG11N+ que contenían Anabaena y RP4. Después de 24 horas de incubación a 30ºC, se colocaron 30 \mug/ml de neomicina a modo de subcapa; y se continuó con la incubación a 30ºC hasta que aparecieron transconjugantes.
Después de la conjugación, se aislaron transconjugantes individuales y se hicieron crecer en 2 ml de medio líquido BG11N+ con 15 \mug/ml de neomicina. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de cultivos de tipo silvestre y cultivos que contenían combinados de diez transconjugantes como sigue. Los cultivos de cianobacterias de tipo silvestre y transgénicas se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con agua destilada. Se extrajeron ésteres metílicos de ácidos grasos de estos cultivos, como ha sido descrito por Dahmer et al. (1989) J. Amer. Oil. Chem. Soc. 66, 543-548 y se analizaron mediante Cromatografía de Gas-Líquido (GLC) utilizando un Tracor-560 equipado con un detector de ionización por llama de hidrógeno y una columna capilar (Superox II de 30 m x 0,25 mm enlazada mediante FSOT, Alltech Associates Inc., IL). Para la identificación de los ácidos grasos se utilizaron los tiempos de retención y patrones co-cromatográficos (obtenidos de Sigma Chemical Co.). La composición media de ácidos grasos se determinó como la relación del área del pico de cada ácido graso C18 normalizada respecto a un patrón interno.
Los perfiles de GLC representativos se muestran en la Fig. 2. Se muestran los ésteres metílicos de ácidos grasos C18. Los picos se identificaron comparando los tiempos de elución con patrones conocidos de ésteres metílicos de ácidos grasos y se confirmaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas. El Panel A representa el análisis por GLC de ácidos grasos de Anabaena de tipo silvestre. La flecha indica el tiempo de migración del GLA. El Panel B es un perfil de GLC de ácidos grasos de transconjugantes de Anabaena con pAM542+1.8F. Se identificaron dos combinados de muestras productores de GLA (de 25 combinados que representaban 250 transconjugantes). Se analizó la producción de GLA en transconjugantes individuales de cada combinado positivo respecto al GLA; se identificaron dos transconjugantes independientes, AS13 y AS75, uno de cada combinado, que expresaban niveles significativos de GLA y que contenían cósmidos, cSy13 y cSy75, respectivamente (Figura 3). Los cósmidos se solapan en una región de aproximadamente 7,5 kb de longitud. Un fragmento NheI de 3,5 kb de cSy75 se reclonó en el vector pDUCA7 y se transfirió a Anabaena, dando como resultado expresión de GLA por ganancia de función (Tabla 2).
Dos subfragmentos NheI/HindIII (1,8 y 1,7 kb) del fragmento Nhe I de 3,5 kb de cSy75-3.5 se subclonaron en "pBLUESCRIPT" (Stratagene) (Figura 3) para su secuenciación. Se realizaron técnicas estándar de biología molecular tal como ha sido descrito por Maniatis et al. (1982) y Ausubel et al. (1987). Se llevó a cabo una secuenciación didesoxi (Sanger et al. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) del pBS1.8 con "SEQUENASE" (United States Biochemical) en ambas cadenas utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos sintetizados por el Laboratorio de Tecnologías Avanzadas de DNA (Biology Department, Texas A & M University). El análisis de la secuencia de DNA fue realizado con el software GCG (Madison, WI) tal como ha sido descrito por Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Ambos subfragmentos NheI/HindIII se transfirieron a un vector de expresión que se puede transferir por conjugación, AM542, tanto en orientación directa como inversa con respecto al promotor de la carboxilasa cianobacteriana, y se introdujeron en Anabaena por conjugación. Los transconjugantes que contenían el fragmento de 1,8 kb en la orientación directa (AM542-1.8F) produjeron cantidades significativas de GLA y ácido octadecatetraenoico (Figura 2; Tabla 2). Los transconjugantes que contenían otras construcciones, o con el fragmento de 1,8 kb en orientación inversa con el fragmento de 1,7 kb en orientación directa e inversa, no produjeron niveles detectables de GLA (Tabla 2).
La Figura 2 compara el perfil de ácidos grasos C18 de un extracto de Anabaena de tipo silvestre (Figura 2A) con el de Anabaena transgénica que contenía el fragmento de 1,8 kb de cSy75-3.5 en la orientación directa (Figura 2B). El análisis por GLC de los ésteres metílicos de ácidos grasos de AM542-1.8F reveló un pico con un tiempo de retención idéntico al del patrón de GLA auténtico. El análisis de este pico mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) confirmó que tenía el mismo patrón de fragmentación de masas que la muestra de GLA de referencia. Las Anabaena transgénicas con niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados resultaron ser similares a las de tipo silvestre en tasa de crecimiento y morfología.
TABLA 2 Composición de ácidos grasos C18 en cianobacterias de tipo silvestre y transgénicas
Cepa Ácido graso (%)
18:0 18:1 18:2 18.3(\alpha) 18.3(\gamma) 18.4
Synechocystis
de tipo silvestre 13,6 4,5 54,5 - 27,3 -
(sp. PCC6803)
Anabaena
(sp. PCC7120) 2,9 24,8 37,1 35,2 - -
Synechococcus
(sp. PCC7942) 20,6 79,4 - - - -
Transconjugantes de Anabaena
cSy75 3,8 24,4 22,3 9,1 27,9 12,5
cSy75-3.5 4,3 27,6 18,1 3,2 40,4 6,4
pAM542 – 1.8F 4,2 13,9 12,1 19,1 25,4 25,4
pAM542 – 1.8R 7,7 23,1 38,4 30,8 - -
pAM542 – 1.7F 2,8 27,8 36,1 33,3 - -
pAM542 – 1.7R 2,8 25,4 42,3 29,6 - -
Transformantes de Synechococcus
pAM854 27,8 72,2 - - - -
pAM854 -\Delta^{12} 4,0 43,2 46,0 - - -
pAM854 -\Delta^{6} 18,2 81,8 - - - -
pAM854 -\Delta^{6} y \Delta^{12} 42,7 25,3 19,5 - 16,5 -
18:0, ácido esteárico; 18:1, ácido oleico; 18:2, ácido linoleico; 18:3(\alpha), ácido linolénico; 18:3(\gamma), ácido
\gamma-linolénico; 18:4, ácido octadecatetraenoico 
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Ejemplo 4
(No incluido en la invención)
Transformación de Synechococcus con genes de la \Delta6 y \Delta12 desaturasa
Se aisló un tercer cósmido, cSy7, que contiene un gen de la \Delta12-desaturasa, mediante el cribado de la genoteca de Synechocystis con un oligonucleótido sintetizado a partir de la secuencia publicada del gen de la \Delta12-desaturasa de Synechocystis (Wada et al. [1990) Nature (Londres) 347, 200-203). Se identificó un fragmento AvaI de 1,7 kb de este cósmido que contenía el gen de la \Delta12-desaturasa y se utilizó como sonda para demostrar que cSy13 no sólo contiene un gen de la \Delta6-desaturasa sino también un gen de la \Delta12-desaturasa (Figura 3). El análisis genómico por transferencia tipo Southern mostró además que tanto el gen de la \Delta6 como el de la \Delta12-desaturasa son únicos en el genoma de Synechocystis, de forma que ambos genes funcionales implicados en la desaturación de ácidos grasos C18 están estrechamente unidos en el genoma de Synechocystis.
La cianobacteria unicelular Synechococcus (PCC 7942) es deficiente tanto en ácido linoleico como en GLA(3). Los genes de la \Delta12 y \Delta6-desaturasa se clonaron individualmente y juntos en pAM854 (Bustos et al. [1991] J. Bacteriol. 174, 7525-7533), un vector lanzadera que contiene secuencias necesarias para la integración de DNA exógeno en el genoma de Synechococcus (Golden et al. [1987] Methods in Enzymol. 153, 215-231). Se transformó Synechococcus con estas construcciones génicas y se seleccionaron colonias. Se extrajeron de Synechococcus transgénicos ésteres metílicos de ácidos grasos y se analizaron por GLC.
La Tabla 2 muestra que los ácidos grasos principales de Synechococcus de tipo silvestre son el ácido esteárico (18:0) y el ácido oleico (18:1). Los Synechococcus transformados con pAM854-\Delta12 expresaban ácido linoleico (18:2) además de los ácidos grasos principales. Las bacterias transformadas con pAMB54-\Delta6 y \Delta12 produjeron tanto linoleato como GLA (Tabla 1). Estos resultados indican que un Synechococcus que contiene los genes tanto de la \Delta12 como de la \Delta6-desaturasa ha ganado la capacidad de introducir un segundo doble enlace en la posición \Delta12 y un tercer doble enlace en la posición \Delta6 de los ácidos grasos C18. Sin embargo, no se observó ningún cambio en la composición de ácidos grasos en el transformante que contenía pAM854-\Delta6, indicando que, en ausencia de sustrato sintetizado por la \Delta12-desaturasa, la \Delta6-desaturasa es inactiva. Este experimento confirma además que el fragmento NheI/HindIII de 1,8 kb (Figura 3) contiene las regiones tanto codificante como promotora del gen de la \Delta6-desaturasa de Synechocystis. Los Synechococcus transgénicos con niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados resultaron ser similares a los de tipo silvestre en tasa de crecimiento y morfología.
Ejemplo 5
(No incluido en la invención)
Secuencia de nucleótidos de la \Delta6-desaturasa
Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de 1,8 kb de cSy75-3.5 que incluía el gen funcional de la \Delta6-desaturasa. Se identificó un marco abierto de lectura que codificaba un polipéptido de 359 aminoácidos (Figura 4). Un análisis de hidropatía Kyte-Doolittle (Kyte et al. [1982] J. Mol. Biol., 157, 105-132) identificó dos regiones de aminoácidos hidrófobos que podían representar dominios transmembrana (Figura 1A); es más, el perfil hidropático de la \Delta6-desaturasa es similar al del gen de la \Delta12-desaturasa (Figura 1B; Wada et al.) y las \Delta9-desaturasas (Thiede et al. [1986) J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Sin embargo, la similitud de secuencias entre las \Delta6 y \Delta12-desaturasas de Synechocystis es menor que 40% a nivel de los nucleótidos y de aproximadamente 18% a nivel de los aminoácidos.
Ejemplo 6
(No incluido en la invención)
Transferencia de \Delta^{6}-desaturasa cianobacteriana a tabaco
Se movilizó el gen de la \Delta^{6}-desaturasa cianobacteriana a un vector de expresión de plantas y se transfirió a tabaco utilizando técnicas de transferencia de genes mediada por Agrobacterium. Para asegurar que la desaturasa transferida se expresa apropiadamente en hojas y semillas en desarrollo y que el producto del gen de la desaturasa esté dirigido al retículo endoplásmico o al cloroplasto, se construyeron diversos casetes de expresión con el marco abierto de lectura de la \Delta-desaturasa de Synechocystis. Los componentes de estos casetes incluyen: (i) un promotor 35S o un promotor específico de semillas derivado del gen de la heliantinina de girasol para dirigir la expresión del gen de la \Delta^{6}-desaturasa en todos los tejidos de la planta o sólo en semillas en desarrollo respectivamente, (ii) un hipotético péptido señal, o del gen de la extensina de zanahoria o del gen de la heliantinina de girasol, para dirigir la \Delta^{6}-desaturasa recién sintetizada al RE, (iii) una secuencia señal para la retención en el lumen del RE (KDEL) en el extremo carboxilo del ORF de la \Delta^{6}-desaturasa, y (iv) un péptido de tránsito optimizado para dirigir la \Delta^{6}-desaturasa al cloroplasto. El promotor 35S es un derivado de pRTL2 descrito por Restrepo et al. (1990). La secuencia del péptido de tránsito optimizado está descrita por Van de Broeck et al. (1985). El péptido señal de la extensina de zanahoria está descrito por Chen et al (1985) EMBO J., 9, 2145.
Se produjeron plantas transgénicas de tabaco que contenían un gen quimérico con la desaturasa cianobacteriana, compuesto del gen de la \Delta^{6}-desaturasa de Synechocystis fusionado a una secuencia de retención en el retículo endoplásmico (KDEL) y un péptido señal de la extensina dirigido por el promotor 35S de CaMV. Las amplificaciones por PCR del DNA genómico de tabaco transgénico indican que el gen de la \Delta^{6} -desaturasa estaba incorporado al gen del tabaco. Se extrajeron los ésteres metílicos de ácidos grasos de hojas de estas plantas transgénicas de tabaco y se analizaron por cromatografía de gas-líquido (GLC). Estas plantas transgénicas de tabaco acumulaban cantidades significativas de GLA (Figura 4). La Figura 4 muestra ésteres metílicos de ácidos grasos según lo determinado por GLC. Los picos se identificaron comparando los tiempos de elución con patrones conocidos de ésteres metílicos de ácidos grasos. De acuerdo con ello, se pueden utilizar genes de cianobacterias implicados en el metabolismo de ácidos grasos para generar plantas transgénicas con composiciones de ácidos grasos alteradas.
Ejemplo 7
Construcción de una genoteca de cDNA de borraja
Se aislaron polisomas unidos a la membrana de 5 semillas de borraja 12 días después de la polinización (12 DDP) usando el protocolo establecido para los guisantes por Larkins y Davies (1975 Plant Phys. 55:749-756). Se extrajo RNA de los polisomas como describe Mechler (1987 Methods in Enzymology 152:241-248, Academic Press).
Se aisló RNA Poli-A+ del RNA polisómico unido a la membrana mediante el uso de cuentas Oligotex-dT (Qiagen). Se preparó el correspondiente cDNA usando el kit de síntesis de cDNA ZAP, de Stratagene. La genoteca de cDNA se construyó en el vector lambda ZAP II (Stratagene) usando el kit de vector lambda ZAP II. La genoteca principal se empaquetó en extracto de empaquetamiento Gigapack II Gold (Stratagene). La genoteca se usó para generar marcadores de secuencias expresadas (ESTs), y se usaron secuencias correspondientes a los marcadores para examinar la base de datos GenBank.
\newpage
Ejemplo 8
Protocolo de hibridación
Se generaron sondas de hibridación para cribar la genoteca de cDNA de borraja mediante el uso de síntesis de DNA cebado aleatorio, tal como ha sido descrito por Ausubel et al (1994 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y.) y se correspondieron con cDNAs de proteínas de almacenamiento de semillas expresadas abundantemente e identificadas previamente. Los nucleótidos no incorporados se retiraron mediante el uso de una columna de centrifugado G-50 (Boehringer Manheim). La sonda se desnaturalizó para la hibridación por ebullición en un baño de agua durante 5 minutos, después se enfrió rápidamente en hielo. Los filtros para la hibridación fueron hibridados previamente a 60ºC durante 2-4 horas en una solución de prehibridación (SSC (cloruro sódico-citrato sódico) 6X [Maniatis et al 1984 Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory], Solución de Denhart 1X, pirofosfato sódico 0,05%, DNA de esperma de salmón desnaturalizado, 100 \mug/ml). La sonda desnaturalizada se añadió a la solución de hibridación (SSC 6X, Solución de Denhart 1X, pirofosfato sódico 0,05%, DNA de esperma de salmón desnaturalizado, 100 pg/ml) y se incubó a 60ºC con agitación durante una noche. Los filtros se lavaron en lavados de SET 4x, 2x, y 1x durante 15 minutos cada uno a 60ºC. Una solución concentrada de SET 20X es NaCl 3M, base Tris 0,4 M, Na_{2}EDTA-2H_{2}O 20 mM. El lavado con SET 4X fue SET 4X, 12,5 mM PO_{4}, pH 6,8 y SDS (dodecilsulfato sódico) 0,2%. El lavado con SET 2X fue SET 2X, PO_{4} 12,5 mM, pH 6,8 y SDS 0,2%. El lavado con SET 1X fue SET 1X, PO_{4} 12,5 mM, pH 6,8 y SDS 0,2%. Los filtros se dejaron secar al aire y se expusieron después a película de rayos X durante 24 horas con pantallas intensificadoras a -80ºC.
Ejemplo 9
Secuenciación aleatoria de cDNAs a partir de una genoteca polisómica unida a la membrana de semilla (12 DDP) de borraja
La genoteca de cDNA de borraja se llevó a placas a baja densidad (500 pfu en placas de Petri de 150 mm). Se "sustrajeron" cDNAs de proteínas de almacenamiento de semillas altamente predominantes mediante cribado con los cDNAs correspondientes identificados previamente. Se escindieron las placas no hibridantes usando el protocolo y reactivos de escisión de Stratagene. Se usaron las colonias bacterianas resultantes para inocular cultivos líquidos y se secuenciaron bien manualmente o bien mediante un secuenciador automatizado ABI. Cada cDNA se secuenció una vez y se generó un marcador de secuencias a partir de 200-300 pares de bases. Toda la secuenciación se realizó por secuenciación en ciclos (Epicentre). Se generaron más de 300 ESTs. Cada marcador de secuencia se comparó con la base de datos GenBank mediante el programa de ordenador BLASTX y se identificaron varios genes de metabolismo de lípidos, incluyendo la \Delta6-desaturasa.
Las búsquedas en la base de datos con un clon de cDNA designado como mbp-65 usando el BLASTX con la base de datos GenBank dio como resultado un emparejamiento significativo con la \Delta6-desaturasa de Synechocystis. Se determinó, sin embargo, que este clon no era un cDNA de longitud completa. Se aisló un cDNA de longitud completa usando el mbp-65 para cribar la genoteca polisómica de borraja unida a la membrana. Se determinó la secuencia del cDNA aislado (Fig. 5A, SEQ ID NO:4) y la secuencia de proteínas del marco abierto de lectura (Fig. 5B, SEQ ID NO:5) se comparó con otras desaturasas conocidas usando un programa de alineación de proteínas de Geneworks (IntelligGenetics) (Fig. 2). Esta alineación indicó que el cDNA era el gen de la \Delta6-desaturasa.
Aunque similar a otras desaturasas de plantas conocidas, la delta 6-desaturasa de borraja es distinta, como se indica en el dendrograma mostrado en la Fig. 6. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos características de las desaturasas, particularmente las que se propone que están implicadas en unión metálica (caja metálica 1 y caja metálica 2), ilustra las diferencias entre la delta 6-desaturasa de borraja y otras desaturasas de plantas (Tabla 3).
La delta 6-desaturasa de borraja se distingue de la forma cianobacteriana no sólo en la secuencia global (Fig. 6) sino también en los motivos aminoácidos de la caja lipídica, caja metálica 1 y caja metálica 2 (Tabla 3). Como indica la Tabla 3, los tres motivos son de secuencia nueva. Sólo la caja metálica 2 de la delta 6-desaturasa de borraja muestra alguna relación con la caja metálica 2 de la delta-6 desaturasa de Synechocystis.
Además, la delta 6-desaturasa de borraja es también distinta de otro gen de desaturasa de borraja, la delta-12 desaturasa. P1-B1 es un cDNA de longitud completa que fue identificado por análisis con EST, y muestra mucha similitud con la delta-12 desaturasa de Arabidopsis (Fad 2). Una comparación de los motivos de aminoácidos de la caja lipídica, caja metálica 1 y caja metálica 2 (Tabla 3) en las delta-6 y delta-12 desaturasas indica que existe poca homología en estas regiones. La colocación de las dos secuencias en el dendrograma de la Fig. 6 indica lo lejanamente relacionados que están estos dos genes.
1
Ejemplo 10
Construcción de 222.1\Delta^{6}NOS para transiente y expresión
El vector pBI221 (Jefferson et al. 1987 EMBO J. 6:3901-3907) se preparó para su unión por digestión con BamHI y EcoICR I (Promega) que escinde la región codificante GUS dejando al promotor 35S y al terminador NOS intactos. El cDNA de la \Delta6-desaturasa de borraja fue escindido del plásmido Bluescript (Stratagene) por digestión con BamHI y XhoI. El extremo Xhol se hizo romo mediante el uso del fragmento Klenow. Este fragmento se clonó después en los sitios BamHI/EcoICR I del pBI221, dando 221.\Delta^{6}.NOS (Fig. 7). En 221.\Delta^{6}.NOS, la parte restante (esqueleto) del mapa de restricción representado en la Fig. 7 es pBI221.
Ejemplo 11
Construcción de 121.\Delta^{6}.NOS para transformación estable
El vector pBI121 (Jefferson et al. 1987 EMBO J. 6:3901-3907) se preparó para su unión por digestión con BamHI y EcoICR I (Promega) que escinde la región codificante GUS dejando al promotor 35S y al terminador NOS intactos. El cDNA de la \Delta^{6}-desaturasa de borraja fue escindido del plásmido Bluescript (Stratagene) por digestión con BamHI y XhoI. El extremo Xhol se hizo romo mediante el uso del fragmento Klenow. Este fragmento se clonó después en los sitios BamHI/EcoICR 1 de pBI121, dando 121.\Delta^{6}NOS (Fig. 7). En 121.\Delta^{6}.NOS, la parte restante (esqueleto) del mapa de restricción representado en la Fig. 7 es pBI121.
Ejemplo 12
Expresión de transientes
Todos los trabajos que implicaban protoplastos se realizaron en una cabina estéril. Se digirió un ml de células empaquetadas de zanahoria en suspensión en 30 ml de solución plasmolizante (KCl 25 g/l, CaCl_{2}-H_{2}O 3,5 g/l, MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10 mM, pH 5,6 y manitol 0,2 M) con celulasa 1%, pectoliasa 0,1%, y dreisalasa 0,1% durante una noche, en la oscuridad, a temperatura ambiente. Los protoplastos liberados se filtraron a través de una malla de 150 \mum y se granularon por centrifugación (100x g, 5 min.) después se lavaron dos veces en solución plasmolizante. Los protoplastos se contaron usando un hemocitómetro de doble cámara. Se transfectó DNA en los protoplastos por tratamiento con PEG tal como ha sido descrito por Nunberg y Thomas (1993 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick and J. E. Thompson, eds. págs. 241-248) usando 10^{6} protoplastos y 50-70 ug de DNA plásmido (221.\Delta6.NOS). Los protoplastos se cultivaron en 5 ml de medio MS suplementado con manitol 0,2 M y 3 \mum de 2,4-D durante 48 horas en la oscuridad, con agitación.
Ejemplo 13
Transformación estable de tabaco
Se usó la construcción del plásmido 121.\Delta^{6}.NOS para transformar tabaco (Nicotiana tabacum cv. xanthi) mediante Agrobacterium según procedimientos estándar (Horsh et al., 1985 Science 227: 1229-1231; Bogue et al., 1990 Mol. Gen. Genet. 221:49-57), excepto que los transformantes iniciales se seleccionaron sobre 100 ug/ml de kanamicina.
Ejemplo 14
Preparación y análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAGs)
Se congeló en nitrógeno líquido tejido de protoplastos transfectados y plantas de tabaco transformadas y se liofilizaron durante una noche. Se prepararon los EMAGs tal como ha sido descrito por Dahmer et al (1989 J. Amer. Oil Chem. Soc. 66:543-548). En algunos casos, el disolvente se evaporó de nuevo, y los EMAGs se resuspendieron en acetato de etilo y se extrajeron una vez con agua desionizada para retirar cualquier contaminante soluble en agua. Los EMAGs se analizaron por cromatografía de gases (GC) en una columna J&W Scientific DB-wax (30 m de longitud, 0,25 mm de diámetro interno, 0,25 un de película).
Un ejemplo de un ensayo de transientes se muestra en la Fig. 8, que representa tres transfecciones independientes reunidas. La adición del cDNA de la \Delta6-desaturasa de borraja se corresponde con la aparición de ácido gamma linolénico (GLA) que es uno de los productos posibles de la \Delta6-desaturasa.
Las Figuras 9 y 10 representan perfiles de GC de los EMAGs derivados del tejido foliar y de semilla, respectivamente, de plantas de tabaco de control y transformadas. La Figura 9A proporciona el perfil de tejido foliar de tabaco de tipo silvestre (xanthi); La Figura 9B proporciona el perfil de tejido foliar de una planta de tabaco transformada con la \Delta-6 desaturasa de borraja bajo el control transcripcional del promotor 35S CaMV (pBI 121\Delta^{6}NOS). Los picos corresponden a 18:2, 18:3\gamma (GLA), 18:3\alpha y 18:4 (ácido octadecanonico). La Figura 10A muestra el perfil de GC de semillas de un tabaco de tipo silvestre; La Figura 10B muestra el perfil de tejido de semillas de una planta de tabaco transformada con pBI 121\Delta^{6}NOS. Los picos corresponden a 18:2, 18:3\gamma (GLA) y 18:3\alpha.
La distribución relativa de los ácidos grasos C_{18} en semillas de tabaco de control y transgénicas se muestra en la Tabla 4.
TABLA 4
Ácido graso Xanthi pBI121\Delta^{6} NOS
18:0 4,01% 2,5%
18:1 13% 13%
18:2 82% 82%
18:3y (GLA) - 2,7%
18:3\alpha 0,82% 1,4%
Los resultados precedentes demuestran que el GLA es incorporado en los triacilglicéridos de hojas y semillas de tabaco transgénicas que contienen la \Delta6-desaturasa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Rhone-Poulenc Agrochimie
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GAMMA LINOLÉNICO POR UNA DELTA 6-DESATURASA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 25
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Scully, Scott, Murphy & Presser
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 400 Garden City Plaza
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Garden City
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos (F) ZIP: 11530
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-DIC-1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE LEGAL/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Presser, Leopold
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 19,827
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 8383ZYXW
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA LAS TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (516) 742-4343
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (516) 742-4366
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX: 230 901 SANS UR
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3588 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: :2002..3081
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 359 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1884 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1685 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 448 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ile Gly His Asp Ala Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Val Gly His Asp Ala Asn His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Gly His Asp Cys Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Ala His Glu Cys Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Gly His Asp Cys Ala His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Gly His Asp Cys Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asn Ala His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asn Tyr Leu His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Thr His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Arg His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asp Arg His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asp Gln His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asp His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Asn His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gln Ile Glu His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Val Thr His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Val Ile His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido

Claims (27)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una \Delta-6 desaturasa, en el que dicho ácido nucleico se selecciona entre:
(a)
un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento suyo,
(b)
el ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 4 o un fragmento suyo,
(c)
un ácido nucleico que comprende el gen de la \Delta-6 desaturasa que se híbrida con uno cualquiera de los ácidos nucleicos de (a) ó (b) en una solución de hibridación que contiene SSC (cloruro sódico-citrato sódico) 6x, solución de Denhart 1x, pirofosfato sódico 0,05% y DNA de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml, a una temperatura de hibridación de 60ºC.
2. Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
3. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, unido de forma operativa a un promotor y opcionalmente a una señal de terminación capaz de llevar a cabo la expresión del gen producto de dicho ácido nucleico aislado.
5. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que dicho promotor es un promotor de la \Delta-6 desaturasa, un promotor de la carboxilasa de Anabaena, un promotor de la heliantinina, un promotor de la glicinina, un promotor de la napina, el promotor 35S de CaMV, o un promotor específico de tejidos de la heliantinina.
6. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que dicho promotor es constitutivo o específico de tejidos.
7. El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que dicha señal de terminación es una señal de terminación de Synechocystis, una señal de terminación de la nopalina sintasa, o una señal terminal de semillas.
8. Una célula que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7.
9. La célula de la reivindicación 8, en la que dicha célula es una célula animal, un célula bacteriana, una célula vegetal o una célula fúngica.
10. Un organismo no humano transformado genéticamente con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7.
11. El organismo transgénico de la reivindicación 10, en el que dicho organismo es una bacteria, un hongo, una planta o un animal.
12. Una planta o progenie de dicha planta que ha sido regenerada a partir de la célula vegetal de la reivindicación 9, en la que dicha planta o dicha progenie de planta está transformada genéticamente con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7.
13. La planta de la reivindicación 13, en la que dicha planta es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete, zanahoria o colza.
14. Un método de producir una planta con un contenido en ácido gamma linolénico (GLA) incrementado, que comprende:
(a)
transformar una célula vegetal con el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2; y
(b)
regenerar una planta con un contenido en GLA incrementado de dicha célula vegetal.
15. Un método de producir una planta con un contenido en ácido gamma linolénico (GLA) incrementado, que comprende:
(a)
transformar una célula vegetal con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7; y
(b)
regenerar una planta con un contenido de GLA incrementado a partir de dicha célula vegetal.
16. El método de la reivindicación 15 ó 16, en el que dicha planta es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete, zanahoria o colza.
\newpage
17. Uso de un ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la fabricación de un agente para inducir la producción de ácido gamma linolénico (GLA) en un organismo deficiente o carente de GLA.
18. Uso de un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 para la fabricación de un agente para inducir la producción de ácido gamma linolénico (GLA) en un organismo deficiente o carente de GLA.
19. Uso de un ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y un ácido nucleico aislado que codifica la \Delta12-desaturasa para la fabricación de un agente para inducir la producción de ácido gamma linolénico (GLA) en un organismo deficiente o carente de GLA y ácido linoleico (LA).
20. El uso de la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico aislado que codifica la \Delta-6 desaturasa comprende los nucleótidos 44 a 1390 de la SEQ ID NO: 4.
21. Uso de un ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la fabricación de un agente para inducir la producción de ácido octadecatetraenoico en un organismo deficiente o carente de ácido gamma linolénico.
22. Uso de un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 para la fabricación de un agente para inducir la producción de ácido octadecatetraenoico en un organismo deficiente o carente de ácido gamma linolénico.
23. El método de la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho organismo es una bacteria, un hongo, una planta o un animal.
24. Un método de producir una planta con resistencia al frío mejorada, que comprende:
(a)
transformar una célula vegetal con el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2; y
(b)
regenerar dicha planta con resistencia al frío mejorada a partir de dicha célula vegetal transformada.
25. El método de la reivindicación 24, en el que dicha planta es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete, zanahoria o colza.
26. Uso de un ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2 como sonda de hibridación para identificar un ácido nucleico aislado que codifica la \Delta-6 desaturasa de otros organismos productores de GLA.
27. El uso de la reivindicación 26, en el que el ácido nucleico aislado es el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento suyo, o el ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 4 o un fragmento suyo.
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