UA61880C2 - SYNTHESIS OF g-LINOLENIC ACID UNDER THE ACTION OF DELTA-6-DESATURASE - Google Patents
SYNTHESIS OF g-LINOLENIC ACID UNDER THE ACTION OF DELTA-6-DESATURASE Download PDFInfo
- Publication number
- UA61880C2 UA61880C2 UA97063197A UA97063197A UA61880C2 UA 61880 C2 UA61880 C2 UA 61880C2 UA 97063197 A UA97063197 A UA 97063197A UA 97063197 A UA97063197 A UA 97063197A UA 61880 C2 UA61880 C2 UA 61880C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- desaturase
- gamma
- plant
- linolenic acid
- acid
- Prior art date
Links
- 102100034544 Acyl-CoA 6-desaturase Human genes 0.000 title claims 2
- 108010037138 Linoleoyl-CoA Desaturase Proteins 0.000 title claims 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 13
- 230000009471 action Effects 0.000 title description 5
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract 5
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 claims description 71
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 70
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 70
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 claims description 69
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 29
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 29
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 19
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 18
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims description 17
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 8
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N (2E,4E,6E,8E)-octadeca-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N 0.000 claims description 7
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 7
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 7
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 7
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010083391 glycinin Proteins 0.000 claims description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims 3
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 claims 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 75
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 28
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 27
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 25
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 25
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 25
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 15
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 239000004165 Methyl ester of fatty acids Substances 0.000 description 8
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 8
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 6
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 4
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 244000089742 Citrus aurantifolia Species 0.000 description 3
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241001318330 Nenia Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)[14CH2]OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 0.000 description 1
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 4-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=NC=C1 NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100325756 Arabidopsis thaliana BAM5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100063253 Aspergillus desertorum desS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102100026747 Osteomodulin Human genes 0.000 description 1
- 101710114565 Osteomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000801617 Sacada Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 229940098330 gamma linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 235000021003 saturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 101150024950 sstT gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021081 unsaturated fats Nutrition 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Опис винаходу
Линолевая кислота (18:2)( А) превращается в гамма-линоленовую кислоту (18:3)(0І А) под действием такого 2 фермента, как лб-десатураза. Когда зтот фермент или кодирующую его нуклейновую кислоту вводят в клетки, синтезирующие линолевую кислоту, образуется гамма-линоленовая кислота. Настоящее изобретение относится к нуклейновьм кислотам, содержащим ген лб-десатуразь. Более конкретно, в обьем зтого изобретения входят нуклейновье кислотьі, содержащие промоторьії, кодирующие области и терминальнье области генов лб-десатуразь. Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантньм конструкциям, то содержащим кодирующую область лб-десатуразьі в функциональном сочетаний с о разнородньми регуляторньми последовательностями. Нуклеийновье кислотьі и рекомбинантнье конструкций по данному изобретению полезньї для получения гамма-линоленовой кислоть! в трансгенньїх организмах.
Ненасьщеннье жирнье кислотьі, такие как линолевая кислота (С тА) и о-линоленовая кислота (С А 72 является важньми пищевьіми компонентами, которье не могут бьіть синтезировань! в организме позвоночньх животньх, так как клетки позвоночньйх животньх могут создавать двойньсе связи в л?-положений жирньх кислот, но не могут создавать дополнительнье двойнье связи между двойной связью в ЛлО-положений и метильньм концом цепи жирной кислотьі. Поскольку они являются предшественниками других продуктов, линолевая 2 и о-линоленовая кислотьі являются важньми жирньми кислотами, источником которьїх обьічно являются растения. В организме млекопитающих линолевая кислота превращаєтся в у-линоленовую кислоту (СА,
СА, которая в свою очередь превращаєтся в арахидоновую кислоту (20:4), особенно важную жирную кислоту, так как она является основньім предшественником большинства простагландинов.
Линолевая кислота вследствие конечного превращения в гамма-линоленовую кислоту и арахидоновую сч 29 кислоту удовлетворяет потребности организма в гамма-линоленовой кислоте и арахидоновой кислоте. Однако (У существует определенная зависимость между потреблением насьщенньх жиров и вероятностью возникновения гиперхолестеринемии, атеросклероза и других клинических нарушений, которье влекут за собой ишемическую болезнь сердца, в то время как потребление ненасьщенньїх жиров способствует снижению содержания холестерина в крови и уменьшению вероятности заболевания атеросклерозом. Терапевтические о 3о преимущества пищевой гамма-линоленовой кислотьі, вероятно, связань! с тем, что зта кислота является (се) предшественником арахидоновой кислотьі и, таким образом, способствует синтезу простагландина. Позтому гораздо полезнее включать в рацион питания ненасьщенную гамма-линоленовую кислоту, чем линолевую со кислоту. Однако гамма-линоленовая кислота отсутствует практически во всех воздельваемьх «- сельскохозяйственньїх культурах. 35 Линолевая кислота превращаеєтся в гамма-линоленовую кислоту под действием такого фермента, ї-о как дб-десатураза. лб-десатураза, фермент из более чем 350 аминокислот, имеет мембраносвязьвающую область и активньій центр для десатурации жирньїх кислот. Если зтот фермент ввести в клетки, которье зндогенно синтезируют линолевую кислоту, а не гамма-линоленовую кислоту, то происходит образование « гамма-линоленовой кислотьі. Настоящее изобретениєе, предусматривая ген, кодирующий Ллб-десатуразу, -о с позволяет получить трансгеннье организмь!, которне содержат функциональную дб-десатуразу и синтезируют гамма-линоленовую кислоту. Помимо возможности синтеза гамма-линоленовой кислотьі в больших ;з» количествах, настоящим изобретением предусматриваются нове пищевье источники гамма-линоленовой кислот.
Настоящее изобретение включает вьіделенньюе гень Лб-десатуразь. В частности, вьіделенньюе гень
Ге»! содержат промоторь!ї лб-десатуразьі, кодирующие области и терминальньсе области. -3з Настоящее изобретение далее включает зкспрессирующие векторьі, содержащие промотор лб-десатуразь, кодирующую область и терминальнье области. (ее) Следующим аспектом данного изобретения являются зкспрессирующие векторьії, содержащие кодирующую со 50 область Аб-десатуразьі в функциональном сочетаниий с разнородньіми регуляторньмми областями, то есть с злементами, не вьіделяемьіми из гена лб-десатуразь. «2 Настоящим изобретением предусматриваются также клетки и организмьі, содержащие векторь! по данному изобретению, и потомство таких организмов.
Очередньм аспектом настоящего изобретения предусматривается вьіделенная 22 бактериальная лб-десатураза. Предусматриваєтся также вьіделенная растительная лб-десатураза.
ГФ) Еще одним аспектом данного изобретения является способ получения растений с более вьісоким содержанием гамма-линоленовой кислоть. о Настоящим изобретением предусматривается также способ получения холодоустойчивьїх растений.
На фиг.1 изображеньі профили водорастворимости для вьіведенньїх аминокислотньх 60 последовательностей лб-десатуразьі Зупеспосувіїв (часть А) и Л12-десатуразьі (часть В). Предполагаємье области, пронизьівающие мембрану, обозначеньї сплошньми линиями. Гидрофобньій индекс вьісчитан для окна, вмещающего 19 аминокислотньх остатков |Куїе, еї а)!. (1982) 9. Моїес. Віої. 157).
На фиг.2 изображеньі профили газожидкостной хроматографии для Апараєепа дикого типа (часть А) и трансгенного типа (часть В). бо На фиг.3 дано схематическое изображение карт космид сбу/5, с5у!3 и Сву/ с перекривающимися областями и субклонами. Исходнье области субклонов Сзу/75, Сву75-3,5 и Сву/ обозначеньі пунктирньіми диагональньми линиями. Инактивированньсєе сайть! рестрикции указань! в скобках.
На фиг.4 изображень профили газожидкостной хроматографии для табака дикого типа (часть А) и трансгенного типа (часть В).
На фиг.5А изображена ДНК-последовательность кКДНК дб-десатуразь, вьіделенной из бурачника.
На фиг.5В изображена белковая последовательность открьїтой рамки считьівания в кКДНК лб-десатуразь, вьіделенная из бурачника. Показань! три аминокислотньїх злемента, характерньїх для десатураз, которье в порядке следования представляют собой липидньій блок, металлический блок 1 (тега! рох 1) и металлический 70 блок 2 (тейа! рох 2)0
На фигб изображена дендрограмма, показьвающая сходство лб-десатуразьь бурачника с другими мембраносвязанньми десатуразами. Аминокислотная последовательность Аб-десатуразьі бурачника сравниваєется с десатуразами других известньїх типов на оснований данньїх, приведенньїх в Сепе УУогк5 (ІпіеїПСепеїйісв). Числовье даннье соответствуют относительньм филогенетическим расстояниям между 75 сравниваемьми подгруппами.
На фиг.7 представлена карта рестрикции 221. Аб.МО5 и 121. дб.МО5. На карте рестрикции 221. дб.МО5 остальной части плазмидь! является рВ1221, а на карте рестрикции 121. дб.МО5 остальной частью плазмидь! является рВІ121.
На фиг.8 изображеньі профили газожидкостной хроматографии для мнимотрансфецированньх (часть А) и трасфецированньїх 221. дб.МО5 (часть В) клеток моркови. Показаньі положения, соответствующие 18:2, 18:30, и 18:35 (БІ А).
На фиг.9 изображеньй профили газожидкостной хроматографии для нетрансформированного табачного листа (часть А) и табачного листа, трансформированного 121. лб.МО5. Показаньі положения 18:2, 18:Зо, 18:Зу (СІ А) й 1854. с 29 На фиг.10 изображеньі профили газожидкостной хроматографийи для нетрансформированньїх семян табака Ге) (часть А) и семян табака, трансформированньх 121. дб.МО5 . Показаньії положения 18:2, 18:Зо, 18:Зу (СІ А).
В обьем настоящего изобретения входят вьіделеннье нуклеийновье кислотьі, кодирующие лб-десатуразу.
Для идентификации нуклейновой кислотьї, кодирующей лб-десатуразу, из организма, синтезирующего о зо гамма-линоленовую кислоту, вбіделяют ДНК. Указанньім организмом может бьїть, например, животная клетка, некоторьне грибьі (например, МогііегеІІа), некоторье бактерии (например, Зупеспосузіїв) и некоторне растения со (бурачник, Оепоїйега, смородина). Геномную ДНК можно вьіделить с помощью различньїх методов, хорошо со известньїх специалистам в зтой области, например, с помощью метода, описанного Самбруком и др.(Затргоок еї аІ.) (1989) в справочнике МоїЇесшаг Сіопіпу: А І арогаїогу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагрог, ММ. Вьіделенную ДНК ж з5 делят на фрагментьі с помощью физических методов или ферментативного расщепления и клонируют в «со соответствующем векторе, например, бактериофаге или космидном векторе, в соответствии с любьім хорошо известньмм методом из целого ряда методов, представленньїх в справочньїх материалах, таких как справочник
Самбрука и др.(1989). Особое внимание в зтом изобретений уделено зкспрессирующим векторам, содержащим
ДНК по настоящему изобретению. ДНК, кодирующую Длб-десатуразу, можно идентифицировать посредством « 70 анализа приобретения функции. Вектор, содержащий фрагментарную ДНК, переносят, например, путем -о с инфицирования, трансконьюгирования, трансфекции в организм-хозяин, которьій синтезирует линолевую кислоту, а не гамма-линоленовую кислоту. Мспользуемьй в зтом описаний изобретения термин :з» "трансформация" означает включение посторонней ДНК в клетку-хозяин. Методьі введения рекомбинантной
ДНК в организм-хозяин известньі специалистам в зтой области, и с ними можно ознакомиться, например, в справочнике Самбрука и др.(1989). Синтез гамма-линоленовой кислотьі зтими организмами (то есть б приобретение функции) определяют, например, газовой хроматографией или другими методами, известньіми специалистам в зтой области. Организмьї, которне стали синтезировать гамма-линоленовую кислоту, то есть - приобрели новую функцию в результате введения вектора, определяются как зкспрессирующие ДНК, о кодирующую лб-десатуразу, причем указанную ДНК вьіделяют из организмов. Вьіделенную ДНК можно снова 5р разделить на фрагментьі, клонировать в зкспрессирующих векторах и функционально исследовать с помощью бо вьішеуказанньїх методов с целью более точного определения ДНК, кодирующей лб-десатуразу. о В качестве примера, иллюстрирующего настоящее изобретение, случайную ДНК вьіделяют из цианобактерии Зупеспосузіїз, входящей в Коллекцию культур Пастера (РСС) 6803 и Американскую коллекцию типовьїх культур (АТСС) 27184, клонируют в космидном векторе и вводят путем трансконьюгирования в штамм цианобактерий Апараепа РОСС 7120, АТСС 27893, не синтезирующих гамма-линоленовой кислотьі. Синтез гамма-линоленовой кислотьі из олинолевой кислотьі Апараепа контролируют посредством газовой
Ф, хроматографии, после чего вбіделяют соответствующий фрагмент ДНК. ко Вьіделенную ДНК секвенируют с помощью методов, хорошо известньїх специалистам в зтой области, которье описань, например, в справочнике Самбрука и др. (1989). во В соответствии с настоящим изобретением вьіделяют молекуль! ДНК, содержащие геньі лб-десатуразь!. В частности, из цианобактерий Зупеспосузіїз била вьіделена ДНК длиной 3,588 тьісяч пар нуклеотидов (т.п.н.), содержащая ген лб-десатуразьі. Біла определена нуклеотидная последовательность ДНК длиной З3,588т.п.н., которая представлена в последовательности с индификационнькм Мо.1. Открьтье рамки считьвания, определяющие потенциальнье кодирующие области, находятся в нуклеотидах с 317 по 1507 и в нуклеотидах с 65 2002 по 3081. Чтобь установить нуклеотидь, имеющие непосредственное отношение к кодированию Аб-де-сатуразь, фрагмент днк длиной 3,588т.п.н., которьй определяет активность лб-десатуразьї, расщепляют на два подфрагмента, каждьй из которьїх содержит только одну открьїтую рамку считьувания. Фрагмент ОКЕ1 содержит нуклеотидь! с 1 по 17046, а фрагмент ОКЕ2 содержит нуклеотидьі с 1705 по 3588. Каждьй фрагмент субклонируют в прямой и обратной ориентации в
Коньюгированном зкспрессирующем векторе (АМ542, МУоїкК еї а/.(1984| Ргос. Май. Асад. зсі. ОЗА 81, 1561), которьій содержит промотор карбоксилазьі! цианобактерий. Полученнье конструкции (то есть ОКЕТ(Р), ОКЕ(К),
ОКЕЗ(Е) и ОКЕД(К) коньюгируют со штаммом Апараепа дикого типа РОС 7120 с помощью стандартньїх методов (см., например, УУоЇК еї аЇ. (1984) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 81, 1561). Коньюгированнье клетки штамма
Апараєпа идентифицированьі в виде зеленьїх околоний Мео" она окоричневом о фоне погибающих 70 неконьюгированньїх клеток после вьіращивания в течение двух недель на селективной среде (стандартнье минеральнье средьі ВО11М, содержащие ЗОмкг/мл неомицина в соответствии с описанием Кіррка еї аї.(1979)
У.беп Місгоріої. 111, 1). Зеленье колонии вьделяют и вьращивают в селективньїх жидких средах (80911МЖ-15мкг/мл неомицина). Липидьі зкстрагируют стандартньми методами (например, по методу Оаптаг еї аі. (1989) доцгпа! ої Атегісап ОЇ Спетіса| Зосіеїу 66, 543) из полученньїх трансконьюгантов, содержащих 75 конструкцимй ОЕРТ и ОКЕ2 с прямой и обратной ориентацией. Для сравнения липидь! зкстрагируют также из других культур Апараепа и Бупеспосувіїв. Метиловье зфирь жирньїх кислот анализируют посредством газожидкостной хроматографии, например, с использованием газожидкостного хроматографа Тгасог-560, оборудованного ионизационньм детектором с водородньм пламенем и капилярной колонкой. Результать газожидкостной хроматографии приведень в таблице 1. дпераеладиийтт 023 сч
РЕ ост ЕНИ НЕ ЗНИ ПЕ УНЯ НОЧННЯ НЕННЯ НОЯ о орех си НИ НЕЗМІННІ НЕННЯ НОЕЗННИ ОН
Р ТИ НЕНИ НЕ ЗНИ ПОЕУНИ НООЧННЯ НЕННЯ НОЯ
(Зупеспосувів(дикийти) | хх | «є | х | - | . | о со
Как показьівает газожидкостная хроматография, штамм Апараепа, не синтезирующий гамма-линоленовую кислоту, приобретает функцию синтеза гамма-линоленовой кислотьі, когда путем трансконьюгирования в него о вводят конструкцию, содержащую ОКЕ2 с прямой ориентацией. Трансконьюгатьі, содержащие конструкции с
ОКЕ2 с обратной ориентацией относительно промотора карбоксилазь, или ОКЕ1 с любой ориентацией, не - синтезируют гамма-линоленовой кислоть!. Зтот анализ показьівает, что только одна открьтая рамка считьвания.д (со (ОКЕ2) во фрагменте 1884 комплементарной парь! гетероциклических оснований ДНК кодирует лб-десатуразу.
Фрагмент 1884 комплементарной парь гетероциклических оснований ДНК представлен в виде последовательностей с идентификационньм Мо.3. Зто подтверждаеєется полньім сходством профилей « водорастворимости у лб-десатуразь! и л12-десатуразь!і |М/ада еї аї. (1990) Майте 347), как показано на фиг.1, (А) и (В). - с Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением из бурачника (Вогазо ойісіпаійй5) можно вьіделить и КДНК, содержащую ген лб-десатуразьі. Била определена нуклеотидная последовательность кДНК длиной 1,685 » тьісячи пар нуклеотидов (т.п.н.), которая представлена на фиг5А (последовательность с индентифици-кационньвм Мо.4). Мнициирующий кодон АТО и отерминирующий кодон подчеркнуть. Аминокислотная последовательность, соответствующая ооткрьтой рамке считьшвания в лбв-десатуразе ме) бурачника, представлена на фиг.5В (последовательность с идентификационньїм Мо.5). - Вьіделеннье нуклеийновье кислотьї, кодирующие лб-десатуразу, можно идентифицировать в других организмах, синтезирующих гамма-линоленовую кислоту, с помощью анализа приобретения функции, со описанного вьіше, или с помощью методов гибридизации нуклеийновьїх кислот с использованием вьіделенной
Го! 20 нуклейновой кислотьі, которая кодирует Зупеспосуз їі з или лб-десатуразу бурачника в виде зонда гибридизации. Методьі клонирования генома и кДНК хорошо известньі специалистам в зтой области, и с настоящим изобретением предполагается их применение. Зонд гибридизации может содержать всю последовательность ДНК, оописьіваемую как о последовательность с идентификационньм Мо.1 или последовательность с идентификационньм Мо.4, либо рестрикционньій фрагмент или другой фрагмент ДНК, 25 включающий олигонуклеотидньй зонд. Методьй клонирования гомологичньх генов путем перекрестной
ГФ) гибридизации известньі специалистам в зтой области, и с ними можно ознакомиться, например, в работе
Самбрука (1989) и Белца и др. (Ве еї аі.) (1983) Меїйподз іп Епгутоїіоду.100, 266. о В соответствии с другим методом идентификации гена лб-десатуразь в организме, синтезирующем гамма-линоленовую кислоту, создают библиотеку КДНК из поли-А"РНК, вьіделенной из полирибо-сомной РНК. бо Чтобьї удалить многочисленнье зкспрессируемье геньі из популяции кДНК, кКДНК или их фрагменти, соответствующие многочисленньіїм генам кКДНК, используют в виде зондов гибридизации для библиотеки кДНК.
Негибридизирующиеся зоньї удаляют, полученньіе бактериальнье колонии используют для инокуляции жидких культур и секвенируют. Например, чтобьї удалить другие КДНК запасного белка семян из библиотеки кКДНК, полученной из поли сомной РНК бурачника, типьі КДНК, соответствующие сильно зко-прессированньїм запасньім 65 белкам семян, сначала гибридизируют с библиотекой кКДНК. "Вьіделенную" библиотеку ДНК затем используют для получения меток зкспрессированньїх последовательностей (ЕТ55), которне применяют для сканирования базь! данньїх, такой как СепВапкК, с целью идентификации потенциальньх десатураторов.
Трансгеннье организмь!ї, которне приобретают функцию синтеза гамма-линоленовой кислоть! в результате Ввведения ДНК, кодирующей д-десатуразу, таюке приобретают функцию синтеза октадекатетраеновой кислоть (18:445.9и12и153, Октадекатетраеєновая кислота обьчно присутствует в рьбьем жире и в некоторьх видах растений семейства Вогадіпасеае (Стгаід еї аІ(1964)| 9У.Атег. ОЇ Спет.Зос.41, 209-211; (згозв еї аї. (1976)
Сап.о.Ріапі Зсі.56, 659-664). В трансгенньїх организмах по настоящему изобретению октадекатетраеновая кислота образуется в орезультате дальнейшей десатурации о-линоленовой кКислоть! под 70 действием лб-десатуразьі или десатурации гамма-линоленовой кислоть! под действием л12-десатуразь!. 359 аминокислот, кодируемьх ОКЕ2, то есть открьітой рамкой считьмвания, кодирующей ЛАб-десатуразу
Зупеспосувзіїзх, представленьі в виде последовательности с индентификационньм Мо.2. Открьтая рамка считьівания, кодирующая лдб-десатуразу бурачника, представлена в последовательности с идентификационньм
Мо.5. Настоящее изобретение далее включает другие нуклеотидньіе последовательности, которье кодируют 79 аминокислоть! последовательности с идентификационньім Мо.2 и в последовательности с идентификационньм
Мо.5. Специалистьі в зтой области могут легко идентифицировать такие последовательности, которье появляются, например, в результате вьірожденности генетического кода. Кроме того, специалисть! в зтой области с помощью описанного вьіше анализа приобретения функции могут определить более мелкие субфрагменть! фрагментов, содержащих открьітье рамки считьівания, которне кодируют лб-десатуразу.
Настоящее изобретение включаєт любой такой полипептидньій фрагмент лб-десатуразьі и нуклеийновьх кислот, которье сохраняют активности в отношений превращения линолевой кислоть! в гамма-линоленовую кислоту.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по данному изобретению, или более мелкий фрагмент, содержащий промотор, кодирующую последовательность и с 29 терминальную область гена лб-десатуразьь переносят в организм, например, цианобактерий, у которьсх Ге) промотор дб-десатуразь! и терминальнье области являются функциональньми. Позтому данньім изобретением предусматриваются организмьі, синтезирующие рекомбинантную лб-десатуразу. Еще одним аспектом данного изобретения является вьіделенная лб-десатураза, которую можно вьіделить в чистом виде из рекомбинантньх о зо Организмов с помощью стандартньх методов очистки белков. (Например, см. А!Єзибеї еї аї. (1987| Ситепі
Ргоїосоїв іп МоіІесшціаг Віоіоду, сгееп Рибіїзпіпд Аввосіагез, Мем Хогк). со
Векторьії, содержащие ДНК, кодирующую лб-десатуразу, также входят в обьем настоящего изобретения. с
Специалистам в зтой области должно бьіть понятно, что можно сконструировать соответствующие векторь, вьізьшвающие зкспрессию кодирующей последовательности лб-десатуразь в ряде организмов. Наиболее -
Зз5 предпочтительньми являются реплицируемье зкспрессирующие векторь. Описьваемье здесь Ге) реплицируемьми зкспрессирующими векторами являются молекульь ДНК или РНК, созданнье для контролируемой зкспрессии требуемого гена, то есть гена лб-десатуразь. Зтими векторами предпочтительно являются плазмидь), бактериофаги, космидьї или вирусь. Настоящим изобретением предполагается « применение шаттл-векторов, например, описанньїх Волком и др. (УМоїК еї аі.) (1984) Ргос. Маїй!. Асай. Зсі. О5А, 1561-1565 и Бастосом и др. (Вивіоз еї аї.) (1991) У.Васіегіої. 174. 7525-7533. Самбрук и др. (1989), СоеадеЇї, - с ей (1990) Меїйодз іп ЕпгутоІоду 185 Асадетіс Ргезв5, и Регра! (1988) А Ргасіїса! Сціде о Моіесшіаг Сіопіпа, ц У9ойп УМіПеу апа Зопв, Іпс., дают подробньй обзор векторов, в которье можно вводить и зкспрессировать ,» нуклеиновую кислоту, коюдирующую данную лб-десатуразу. Такие векторьі содержат также последовательности нуклеиновьїх кислот, которье могут влиять на зкспрессию нуклеиновьїх кислот, кодирующих Ллб-десатуразу.
Злементь! последовательности, способнье вьізьшать зкспрессию генного продукта, включают промоторньї, (22) знхансерьі, предшествующие активирующие последовательности, сигнальі терминации транскрипции и сайть - полиаденилирования. Настоящим изобретением предусматриваются какОконститутивнье, так и тканеспецифичнье промоторь. Для трансформации растительньх клеток особьй интерес представляет (ее) промотор 355 вируса мозайчной болезни цветной капустьї (СамМм) и промоторьі, активизируемье во время со 50 созревания семян растений. Все зти промоторь! и злементьі, регулирующие транскрипцию, в отдельности или в сочетании, рассматриваются с целью их использования в данньїх реплицирующих векторах и известнь с2 специалистам в зтой области. Промотор Самм 355 описьіваєется, например, Кезігеро еї аї. (1990) Ріапі Сеїі 2, 987. В обьем настоящего изобретения входят также генетически сконструированнье и мутированнье регуляторнье последовательности.
Специалистьі в зтой области способньі определить векторьї и регуляторнье злементь!, пригоднье для о зкспрессиий в определенной клетке-хозлине. Например, для зкспрессии Лб-десатуразьь в цианобактериях пригоден вектор, содержащий промотор из гена, кодирующего карбоксилазу вида Апараепа, функционально о связанную с кодирующей областью лб-десатуразьії и далее функционально связанную с сигналом терминации вида Зупеспосузіїг. Термин "функционально связанньй" в зтом контексте означаєт, что промоторнье и 60 терминаторнье последовательности обеспечивают зффективную регуляцию транскрипции. В качестве другого примера можно привести вектор, пригодньій для зкспрессии лб-десатуразь! в трансгенньїх растениях, которьй может содержать характерную для семян промоторную последовательность, вбіделяемую из гелиантинина, напина или глицинина, функционально связанньх с кодирующей областью Ллб-десатуразь и далее функционально связанньїх с сигналом терминации семени или сигналом терминации наполинсинтазь. Еще 62 одним примером может служить вектор, служащий для зкспрессии лАб-десатуразь! в растениях, которьій может содержать конститутивньій промотор или тканеспедифичньй промотор, функционально связанньй с кодирующей областью лб-десатуразь и далее функционально связанньй с о конститутивньм или тканеспецифичньїм терминатором или сигналом терминации наполинсинтазь.
В частности, такие регуляторнье злементь, как гелиантинин, описьіваемье в одновременно рассматриваемой заявке на патент США Мо.682354, поданной 8 апреля 1991г., которая включена в зто описание изобретения в качестве ссьілки, являются промоторньми злементами, служащими для зкспрессии лб-десатуразь! по настоящему изобретению.
Модификации рассматриваемьх нуклеотидньїх последовательностей или регуляторньїх злементов, 70 Ввіполняющих здесь функции, входят в обьем данного изобретения. Такие модификации включают вставки, замень и делеции, в частности, замень, которне отражают вьірожденность генетического кода.
Стандартнье методь! конструирования гибридньїх векторов хорошо известньі специалистам в зтой области и описьіваются в приводимьїх ссьілочньїх материалах, таких как справочник Самбрука и др. (1989), или в любом из множества руководств по лабораторньм исследованиям, которье относятся к технологий получения 75 рекомбинантной ДНК и имеют широкое применение. Существует цельй ряд способов, предназначенньїх для лигирования фрагментов ДНК, вьібор которьїх зависит от характера концов фрагментов ДНК. Кроме того, в обьем настоящего изобретения входят гибриднье векторь), в которьше включеньі злементь! нуклеотидной последовательности, облегчающие клонирование, зкспрессию или процессинг, например, последовательности Окодирующие сигнальнье пептидьі, последовательности, кодирующие КОЕЇ, которая необходима для удерживания белков в зндоплазматическом ретикулуме, или последовательности, кодирующие транзитнье пептидьі, которье направляют Лб-десатуразу в хлоропласт. Такие последовательности известнь специалистам в зтой области. Оптимизированньй транзитньїй пептид описьівается, например, Мап Іеп Вгоеск еї аІ. (1985) Майте 313, 358. Прокариотические и зукариотические сигнальнье последовательности описьіваются, например, Міснеї! із еї а!. (1982) Апп. Кеу. Місгобіо!. 36, 425. Ге
Дальнейшим аспектом настоящего изобретения предусматриваются организмьі), неявляющиеся (5) цианобактериями или растениями, которье содержат ДНК, кодирующую Аб-десатуразу по данному изобретению. Трансгенньіми организмами, входящими в обьем настоящего изобретения, являются бактерии, цианобактерии, грибьі, растения и животнье. Вьіделенную ДНК по настоящему изобретению можно ввести в клетку-хозлин с помощью известньїх методов, например, инфицирования, трансфекции, трансформации и о трансконьюгирования. Методь! переноса ДНК по настоящему изобретению в такие организмь! широко известнь со и описьіваются в справочньїх материалах, таких как работа Самбрука и др. (1989).
Известньі разнообразнье методьі трансформации растений. Ген лб-десатуразьі можно ввести в растения с 00 помощью процедурьі-регенерации листового диска, описанной Ногесп еї а!. (1985) Зсіепсе 227, 1229. Можно «- использовать другие методьі трансформации, такие как культивирование протопласта (Ногесіп еї аї. (1984)
Зо Зсіеєпсе 223, 496; ЮОеВіоск еї аї. (1984) ЕМВО 3. 2, 2143; Вапоп еї аї. (1983) СеїЇ 32, 1033), которне также іс), входят в обьем данного изобретения. В соответствий с предпочтительньм вариантом осуществления настоящего изобретения растения трансформируют с помощью векторов, вьіделенньх из Адгорасіегічшт. Однако существуют другие методь, позволяющие ввести геньі лб-десатуразьі по настоящему изобретению в « растительнье клетки. Такие альтернативнье методьі! включают биобаллистические способь (Кіевїп еї а!. (1987) Машге 327, 70), злектропорацию, опосредованньй химическими веществами ввод ДНК и использование З с вирусов или пьІЛЬЦЬ в качестве векторов. » При необходимости в случае применения метода трансформации геньі Ллб-десатуразьь по настоящему изобретению можно ввести в растительньій трансформирующий вектор, например, бинарньй вектор, описанньй
Вемап (1984) Мисіевїс Асіаз Кез,12, 8111.
Растительнье трансформирующие векторьі можно получить путем изменения натуральной системь б переноса гена Адгобасіегіцт (штегтасіепз. Природная система включаєт плазмидьі, индуцирующие образование - опухолей (Ті) и содержащие большой сегмент, известньй как Т-ДНК, которьй переносится в трансформированньсе растения. Другой сегмент Ті-плазмидь,, міг область, имеет непосредственное отношение к бо переносу Т-ДНК. Область Т-ДНК ограничена концевьіми повторами. В модифицированньїх бинарньїх векторах о 20 удаленьі геньї, индуцирующиє образованиє опухолей, и функции міг области используются для переноса чужеродной ДНК, ограниченной граничньми последовательностями Т-ДНК. Т-область содержит также с селективньій маркер для устойчивости к антибиотикам и множественньїй сайт клонирования, предназначенньй для ввода последовательностей для переноса. Такие сконструированнье штаммь известнь как "обезвреженнье" ("дізаптей") штаммь А. (іШптеїасіеєп: и ообеспечивают зффективную трансформацию 25 последовательностей, ограниченньйх Т-областью, в ядернье геномь растений.
ГФ) Листовье диски со стерилизованной поверхностью инокулируют "обезвреженньм" видо А. (Шптегїасіепв, содержащим чужеродную ДНК, культивируют в течение двух дней, а затем переносят на среду, содержащую о антибиотик. Трансформированнье проростки вьібирают после укоренения в среде, содержащей соответствующий антибиотик, переносят в почву и регенерируют. 60 Другим аспектом настоящего изобретения предусматриваются трансгенньіе растения или потомство зтих растений, содержащее ДНК по данному изобретению. В обьем настоящего изобретения входят как однодольнье, так и двудольнье растения. Растительнье клетки трансформируют вьделенной ДНК, кодирующей Длб-десатуразу, с помощью любого из описанньх вьше методов трансформации растений.
Трансформированную растительную клетку, обьічно в культуре каллусньїх тканей или на листовом диске, бо регенерируют в полностью трансгенном растений с помощь методов, хорошо известньїх специалистам в зтой области (например, Ногзсп еї аїЇ. (1985) Зсіепсе 227, 1129). В соответствии с предпочтительньмм вариантом осуществления изобретения трансгенньм растением является подсолнечник, рапс (оїе зеей гаре), кукуруза, табак, озарахис или соя. Поскольку потомство трансформированньїх растений наследует ДНК,
Кодирующую лб-десатуразу, семена или черенки трансформированньїх растений используют для сохранения линии трансгенньїх растений.
Настоящим изобретением далее предусматриваєтся способ получения трансгенньїх растений с повьішенньм содержанием гамма-линоленовой кислотьі. Зтот способ включает введение ДНК, кодирующей
Аб-десатуразу, в растительнье клетки с низким содержанием или полньім отсутствием гамма-линоленовой 70 КислотьЬ, которье содержат линолевую кислоту, и регенерацию растений с повьішенньм содержанием гамма-линоленовой кислотьі из трансгенньїх оклеток. В частности, такие широко распространеннье сельскохозяйственньюе культурь, как соя, рапс, кукуруза, арахис и табак, рассматриваются в качестве трансгенньїх организмов, но не ограничиваются ими.
Настоящим изобретением далее предусматривается способ получения трансгенньїх организмов, 75 содержащих гамма-линоленовую кислоту. Зтот способ включает введение ДНК, кодирующей лб-десатуразу, в организмь! с низким содержанием или полньм отсутствием гамма-линоленовой кислотьі, но содержащие линолевую кислоту. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предусматриваєется способ, которьій включает введение одного или нескольких зкспрессирующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую дД12-десатуразу и лб-десатуразу, в организмь, не содержащие ни гамма-линоленовой кислотьї, ни линолевой кислоть. В соответствии с зтим способом у организмов, не содержащих ни линолевой кислотьї, ни гамма-линоленовой кислоть!І, вьізьївают синтез линолевой кислоть путем зкспрессии Л12-десату-разь, после чего синтезируют гамма-линоленовую кислоту в результате зкспрессии Аб-десатуразь Зкспрессирующие векторьї, содержащие ДНК, кодируючую А12-десатуразу или д12-десатуразу и лб-десатуразу, можно получить с помощью методов рекомбинантньхх ДНК, известньх СМ 29 специалистам в зтой области (Затргоок еї а). 1989), й с помощью последовательности Л12-десатуразь, Ге) опубликованной в научной литературе (УУада еї аї. (19901 Майшге (І опдоп) 347, 200-203. Кроме того, настоящее изобретение позволило установить, что нуклеотидьі 2002-3081 последовательности с идентификационньм Мо.1 кодируют л12-десатуразу цианобактерий. Позтому зту последовательность можно использовать для получения целевьїх зкспрессирующих векторов. В частности, такие широко распространеннье сельскохозяйственнье о культурьі, как подсолнечник, соя, рапс, кукуруза, арахис и табак, рассматриваются в качестве трансгенньїх ее) организмов, но не ограничиваются ими.
Настоящее изобретение далее относится Кк способу повьшения холодоустойчивости растений. 09
Чувствительность к охлаждению может бьіть связана с фазовьім переносом липидов в клеточньїх мембранах. (че
Температура фазового переноса зависит от степени ненасьщенности жирньїх кислот в липидах мембрань,
Зо позтому увеличение степени ненасьіщенности, например, путем введения лб-десатуразь! с целью превращения ї-оі линолевой кислоть! в гамма-линолено-вую кислоту, может сделать растение холодоустойчивьм или понизить чувствительность к охлаждению. Позтому настоящим изобретением предусматриваєтся введение ДНК, кодирующей лб-десатуразу, в растительнье клетки и регенерация растений с о повьішенной « 20 холодоустойчивостью из указанньїх трансформированньх растительньх клеток. В соответствии с з предпочтительньм вариантом осуществления настоящего изобретения такими растениями являются с подсолнечник, соя, рапс, кукуруза, арахис или табак. :з» Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1
Штаммь и условия культивирования бо що Зупеспосувзіїв (РОС 6803, АТСС 27184), Апараепа (РОСС 7120, АТОСС 27893 и Бупеспоссив (РОСС 7942, АТОС 33912) вніращивают фотоавтотрофическим путем при температуре З0"С в среде ВОЇІМЕ(КіррКа еї аї. (1979) - У.беп. МісгобіоІї. 111, 1-61) под светом ламп накаливания (60 цЕ.т?. 87), Отбирают космидь! и плазмидь и со культивируют их в штамме ЕзспПегіспіа сої ОН5бо в среде Луриа, дополненной антибиотиками в стандартньх 5р Концентрациях, как описано в работе Мапіайз еї а). (1982) Моїіесшціаг Сіопіпд: А ГГарогаюгу Мапиаї, Соїа со Зргіпд Нагбог І арогагу, Соїд 5ргіпд, Мем Могк. о Пример 2
Создание геномной библиотеки космид штамма Зупеспосузіїз
Всю геномную ДНК, полученную из штамма Зупеспосувіїв (РОС 6803) частично расщепляют с помощью вв ЗаизА и фракцинируют в градиенте концентрации сахарозь! (Аизирбеї! еї а!. (1987) Ситепі Ргоюсоїв іп Моіесшцаг
Віоіоду, Сгеепе Рибіїзпіпд Авзосіагез апа Уміеу Іпіегесіепсе, Мемж/ МогкК). Фракции, содержащие фрагменть! ДНК (Ф, длиной от ЗО до 40т.п.н. отбирают и лигируют в дефосфорилированньій сайт Ватні космидного вектора, ка ррОсСА7 (ВиїКкета еї аї. (1991) 9.Васіегіої. 173, 1879-1885). Лигированную ДНК упаковьшвают іп мйго, как описано А!йзирбеї еї аі!. (1987), и упакованньій фаг культивируют в культуре Е.соїї ОНбо, содержащей плазмиду бо рКІ528 клетки-помощника синтеза метилазь Амаї и Есо4711, как зто описано Виїкета еї а!. (1991). Произвольно вьіделяют в общей сложности 1152 колониий и помещают отдельно на двенадцать 96-луночньїх титрационньх микропланшетов.
Пример З
Зкспрессия гамма-линоленовой кислоть! в Апараепа с приобретением функции 65 Апараеєпа (РСС 7120), нитевиднье цианобактериий, не имеют гамма-линоленовой кислотьІ, но содержат значительнье количества линолевой кислоть, предшественника гамма-линоленовой кислоть! (фигура 2;
таблица 2). Библиотеку космид Зупеспосузіїв, описанную в примере 2, коньюгируют в Апараепа (РСС 7120) с целью идентификации трансконьюгантов, синтезирующих гамма-линоленовую кислоту. Клетки Апараепа вьращивают до полулогарифмической фазьі в жидкой среде ВО11М-- и повторно суспендируют в такой же бреде до конечной концентрации, равной примерно 1х109 клеткам на мл. Культуру Е.сої БРА в полулогарифмической фазе (Вигкага еї аї. (1979) 9У.Сеп. МісгобріоІ,114, 341-348), вниращенную в среде Луриа, содержащей ампициллин, промьівают и вновь суспендируют в свежей среде Луриа. После зтого Апараепа и
КРА смешивают и равномерно распределяют по планшетам со средой ВО11Мк, содержащей 595 средь! Луриа.
Геномную библиотеку космид помещают на планшеть! со средой Луриа, содержащие 50мкг/мл ка-намицина и 70. 17,5мкг/мл хлорамфеникола, повторяя зту процедуру дваждь, а затем помещают на планшеть! со средой вВОо11МЖ, содержащей Апараепа и КР4. После инкубации в течение 24 часов при температуре 30"С вводят подслой из ЗОмкг/мл неомицина; и продолжают инкубацию при температуре З30"С до появления трансконьюгатов. Отдельнье трансконьюгать! отделяют после коньюгирования и вьіращивают в 2мл жидкой средьі ВО11М- с 15мкг/мл неомицина. Метиловье зфирь! жирньїх кислот получают из культур дикого типа и 75 Культур, содержащих пуль! из десяти трансконьюгатов, вьіполняя следующую процедуру. Дикие и трансгеннье цианобактериальнье культурьї отделяют центрифугированием и дваждь! промьтвают дистиллированной водой.
Метиловье зфирь!ї жирньїх кислот зкстрагируют из зтих культур, как зто описано в работе Юаптег еї аї. (989)
У.Атег. ОЇЇ. Спет. Зос.6б6, 543-548, и анализируют посредством газожидкостной хроматографии с помощью хроматографа Тгасог-560, оборудованного ионизационньім детектором с водородньмм пламенем и капиллярной Колонкой (ЗОм х 0,25мм связанного ЕБОТ Зирегох ІІ, АІесп Авзосіа(ез Іпс., І). Для идентификации жирньх кислот служат значения времени удержания и ко-хроматографии зталонов (предоставленньїх компанией Зідта
Спетіса! Со.). Средний состав жирньїх кислот определяют в виде отношений пиковой области каждой С18 жирной кислотьі, нормализованной в отношений внутреннего зталона.
Типичнье профили газожидкостной хроматографии показань на фиг.2. На зтой фигуре изображень су метиловне зфирь! С18 жирньх кислот. Пики идентифицируют путем сравнения значений времени злюирования с известньми зталонами метиловьїх зфиров жирньїх кислот и подтверждают путем газовой хроматографии и і) масс-спектрометрии. На фиг.2А показаньі результать! газожидкостно хроматографии жирньїх кислот Апараепа дикого типа. Стрелкой показано время миграции гамма-линоленовой кислотьі. На фиг.28 изображен профиль хроматографии жирньїх кислот транконьюгатов Апараепа с рАМ542-1.8Е. Вьіявлено два пула, синтезирующих «3 гамма-линоленовую кислоту (из 25 пулов, представляющих 250 транконьюгатов). Отдельнье трансконьюгать каждого пула, давшего положительнье результать! в отношений гамма-линоленовой кислотьі, анализируют на со синтез гамма-линоленовой кислоть!; определяют два независимьїх транконьюгата, АЗ1З и А5З75, по одному из ее) каждого пула, которне синтезируют значительнье количества гамма-линоленовой кислоть! и содержат космидь, сбЗу13 и сЗу75 (фигура 3). Перекрьивающиеся космидьі образуют область длиной примерно 7,5т.п.н. Фрагмент --
МНеї длиной З,5т.п.н. космидьі! сзу75 вновь клонируют в векторе РОСА? и переносят в Апараепа, в результате «о чего имеет место зкспрессия гамма-линоленовой кислоть! с приобретением функции (таблица 2).
Два субфрагмента МАеї/Ніпанй («1,8 и 1,7т.п.н.) из фрагмента Ме длиной З3,5т.п.н. космидьі сЗу75-3,5 субклониру-ют в "рВІІ ШЕЗСКІРТ" (Зігаїадепе) (фигура 3) с целью секвенирования. Используют стандартнье « методьі молекулярной биологии, описаннье Мапіайз ей а), (1982) ми А!йвиреі! ей аїЇ. (1987). Дидезоксисиквенирование (Запдег еї а. (1977| Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 74, 5463-5467) плазмидьи рВ5І, 8 0 с вьполняют с помощью "секвеназь" (Опійей Зіафез Віоспетіса)) в отношений обеих цепей, используя й специальнье олигонуклеотиднье затравки, синтезированнье лабораторией прогрессивньїх технологий синтеза "» ДНК (Биологический факультет, Техасский университет). Анализ последовательности ДНК производят с помощью программного обеспечения 5ЗСО (Мадисон, шт. Винсконсин) в соответствии с описанием ЮОемегеих еї 81. (1984) Мисівїс Асідз Кевз.12, 387-395.
Ге») Субфрагменть! МНеї1/Ніпан! переносят в коньюгальньій зкспрессирующий вектор АМ542 с прямой и обратной з ориентацией в отношений промотора, представляющего собой карбоксилазу цианобактерий, и вводят в
Апараєпа путем коньюгирования. Трансконьюгать, содержащие фрагмент длиной 1,8т.п.н. с прямой (ее) ориентацией (АМ542-1,8Е), позволяют получить значительнье количества гамма-линоленовой кислоть! и октадекатетраеновой кислоть (фигура 2; таблица 2). Трансконьюгатьі, содержащие другие конструкции, а также со обратно ориентированньій фрагмент длиной 1,8т.п.н. или прямо и обратно ориентированньій фрагмент длиной о 1,7т.п.н., не синтезируют гамма-линоленовую кислоту на детектируемьїх уровнях (таблица 2).
На фигуре 2 профиль С18 жирной кислоть! зкстракта из Апараєпа дикого типа (фигура 2А) сравниваєтся с профилем Апараепа трансгенного типа, содержащим фрагмент космидь! сЗу75-3,5 длиной 1,8т.п.н. с прямой ориентацией (фигура 28). Газожидкостная хроматография метиловьх зфиров жирньїх кислот, полученньїх из фрагмента АМ542-1.8А, позволила вьіявить пик со временем удержания, идентичньім такому же показателю у о подлинного зталона гамма-линоленовой кислотьі. Анализ зтого пика посредством газовой хроматографии и ко масс-спектрометрии (3С-М5) подтвердил наличие аналогичной картиньії фрагментации по массе, что и в контрольной пробе гамма-линоленовой кислоть. Апараепа трансгенного типа с изменньми уровнями бо полиненасьіщенньїх жирньїх кислот аналогичен дикому типу по скорости роста и морфологии. в 1 пвюрвя во во) ва ва,
Дикий тип
Вупеспосучів (вид Рссевов) 1136 25|55| 1213
Аперавпа видРоСт20) 029 248 зл 352020
Вупеспососсив (видРостеяг, 206 тя 11 вамвютят 0000000 зва зов о рамою 00000028 тя зв 33330 вамвюлтя 0000000 ва заз вв вАмеа отв та 1-1 вамеяат 000000 орав 0 5 Аме 000000 вах 0000 рамевиленит 0002758 95) 2165 18:0, стеариновая кислота; 18:1, олеиновая кислота; 18:2, линолевая кислота; 18:3(о), линоленовая кислота; 18:3(у),уллиноленовая кислота; 18:4, октадекатетраєновая кислота. 720 Пример 4
Трансформация бЗупеспососсив генами Аб и л12 десатуразь!
Третью космиду, с5у7, содержащую ген л12-десатуразьі, вбіделяют путем скрининга геномной библиотеки
БЗупеспосувіїв олигонуклеотидом, синтезированньм из опубликованной в литературе последовательности с ов гена А12-десатуразьі Зупеспосувіїв (МУада ей а). (1990| Майте (Гопдоп) 347, 200-203). В зтой космиде идентифицируют фрагмент Амаї длиной 1,7т.п.н., содержащий ген л12-десатуразьі и используют его в качестве і9) зонда для демонстрации отого, что космида сЗу1!3 помимо гена лб-десатуразьь содержит также ген д12-десатуразь (фигура 3). Геномньй анализ по методу саузерн - блоттинга далее показьіваєт, что гень! как лв-, так и л12-десатуразьі уникальньї в геноме Зупеспосузіїв в том отношений, что оба функциональньх с гена, имеющих отношение к десатурации С18 жирньх кислот, близко связань! в геноме Зупес-посувіїв. с
Одноклеточнье цианобактериий Зупеспососсиз (РОСС 7942) не )имеют ни ленолевой кислоть, ни гамма-линоленовой кислоть! (3). Геньі л12 и лб-десатуразьіь клонируют отдельно и вместе в шаттл-векторе 09 рАМ854 (Визіоз еї а!. (19911 У.Васіегіої. 174, 7525-7533), которьій содержит последовательности, необходимье спр для интеграции чужеродной ДНК в геном Зупеспососсиз (Соїдеп еї аї. (1987) Меїйподз іп Епгутої. 153, 215-231).
Зо Зупеспососсив трансформируют зтими генньіми конструкциями и отбирают колонии, трансформируют зтими ісе) генньіми конструкциями и отбирают колонии. Метиловье зфирь! жирньїх кислот зкстрагируют из Зупеспососсив трансгенного типа и анализируют посредством газожидкостной хроматографии.
В таблице 2 показано, что основньмми жирньми кислотами Зупеспососсиз дикого типа являются стеориновая «4, кислота (18:0) и олеиновая кислота (18:1). Цианобактерии Зупеспососсив, трансформированнье РАМ854- А12, помимо основньх жирньх кислот ситезируют линолевую кислоту (18:22). Трансформанть), полученнье с не) с помощью рАМ854- дб и А12, синтезируют как линолеат, так и гамма-линоленовую кислоту (таблица 1). Зти з» результать! свидетельствуют о том, что цианобактерии Зупеспососсив, содержащий геньї Л12 и дб-десатуразь, способнь! создавать вторую двойную связь в Л12-положениий и третью двойную связь в лб-положениий С18 жирньїх кислот. Однако у трансформанта, содержащего рАМ854- дб, не обнаружено изменений в составе о 75 жирньмх кислот, что указьівает на то, что при отсутствий субстрата, синтезируемого Л12-десатура-зой, Лб-десатураза не проявляет активности. Зтот зксперемент далее - подтверждаєт, что фрагмент Мнпеї/Ніпай длиной 1,8т.п.н. (фигура 3) содержит как кодирующую, так и
Го) промоторную области гена дб-десатуразь! Зупеспосузіїв. Цианобактериий Зупеспососсив трансгенного типа с измененньми уровнями полиненасьщенньх жирньх кислот аналогичньь дикому типу по скорости роста и бо морфологии. о Пример 5
Нуклеотидная последовательность лб-десатуразь!
Определяют нуклеотидную последовательности фрагмента сбЗу75-3,5 длиной 1,8т.п.н. Идентифицируют открьитую рамку считьявания, кодирующую полипептид 359 аминокислот (фигура 4). С помощью анализа на водорастворимость Кайта-Дулитла (Куїе еї аї!. (19821 9.Мої. Вісі. 157, 105-132) идентифицируют две области
ІФ) гидрофобньїх аминокислот, которье могут представлять трансмембраннье домень! (фигура ТА): кроме того, ко профиль водорастворимости Длб-десатуразьь аналогичен Дд12-десатуразьі (ІВ; УУада еї аїЇ) и 9-десатураз (Тпіеде еї аї. (1986) 9.Віої. Спет. 261, 13230-13235). Однако сходство последовательностей между лб бо и А12-десатуразой Зупеспосузіїв составляет менее 4095 на уровне нуклеотидов и примерно 1895 на уровне аминокислот.
Пример 6
Перенос дб-десатуразьі цианобактерий в табак
Ген Аб-десатуразьї цианобактерий активируют в растительном зкспрессирующем векторе и переносят в 62 табак с помощью методов переноса генов, опосредственного Адгорасіегічт. Для гарантий того, что перенесенная десатураза должньім образом зкспрессирована в листьях и развивающихся семенах и что продукт гена десатуразьі введен в зндоплазматический ретикулум или хлоропласт, конструируют различнье полигеннье зкспрессирующие кластерьі с ооткрьтой рамкой считьмвания л-десатуразьї Зупеспосузіїв. / Компоненть! зтих кластеров включают: (і) промотор 355 или семяспецифичньй промотор, полученньй из гена гелиантинина подсолнечника, с целью зкспрессии гена лб-десатуразьі во всех тканях растения или только в развивающихся семенах, (ії) предполагаемьй сигнальньй пептид из гена зкстенсина моркови или гена гелиантинина подсолнечника для введения вновь синтезированной лб-десатуразьі в зндоплазматический ретикулум (ЕК), (ії) сигнальную последовательность сохранения полости зндоплазматического ретикулума 70 «КОЕМ) у СООН-конца открьїтой рамки считьівания лб-десатуразь и (ім) оптимизированньй транзитньй пептид, служащий для ввода лб-десатуразьії в хлоропласт. Промотор 355 является производньім рКТІ2, описанньім
Кезігеро еї ам. Последовательность оптимизированного транзитного пептида описана Мап де Вгоеск еї а). (1985).
Сигнальньй пептид зкстенсина моркови описан Спеп еї а!. (1985) ЕМВО .).9, 2145.
Получают трансгеннье растения табака, содержащие рекомби-нантньій ген десатуразь! цианобактерий, представляющий собой ген Аб-десатуразьї Зупеспосувзіїз, связанньій с последовательностью сохранения зндоплазматического ретикулума (КОЕЇ) и сигнальньм пептидом зкстенсина, стимулируемого промотором
Самм 355. Амплификации геномной ДНК трансгенного табака, образуемье в результате полимеразной цепной реакции, показьивают, что ген Аб-десатуразьь включен в геном табака. Метиловье зфирь! жирньїх кислот, полученнье из листьев зтих трансгенньїхх растений табака, зкстрагируют и анализируют посредством газожидкостной хроматографии. Зти трансгеннье растения табака накапливают значительнье количества гамма-линоленовой кислоть (фигура 4). На фигуре 4 показаньі! метиловье зфирь! жирньїх кислот, вьіявленньме газожидкостной хроматографией. Пики идентифицированьй путем сравнения времени злюирования с известньми зталонами метиловьх зфиров жирньх кислот. Таким образом, цианобактериальнье гень, участвующие в обмене жирньх кислот, можно использовать для генерации трансгенньх растений с с 29 измененньми составами жирньх кислот. г)
Пример 7
Создание библиотеки кКДНК бурачника
Мембраносвязаннье полирибосомь! вьіделяют из семян бурачника через 12 дней после опьіления в соответствии с протоколом, разработанньїм для гороха Латкинсом (І аїКкіпз) и Девисом (Оаміевз) (1975 Ріапі РНуз. о 30 55:749-756). РНК зкстрагируют из полирибосом по методу, описанному Мехлером (Меспіег) (1987 Мейштовдв іп со
ЕпгутоїЇоду 152:241-248, Асадетіс Ргевзв).
Поли-А" РНК вьіделяют из РНК мембраносвязанньїх полирибосом, используя грануль! Оїїдоїех-ат (Сіадеп). со
Соответствующую кДНК получают, используя набор для синтеза кКДНК 2АР фирмь! Зігаїадепе. Библиотеку КДНК -/-чее создают в векторе ламбда 2АР ІІ (5ігаїадепе), используя набор для синтеза вектора ламбда 7АР ІІ. Первичную 35 библиотеку упаковьівают в упаковочньїй зкстракт Сідараск І! Соїа (Зігаїадепе). Зту библиотеку используют для і-й синтеза меток зкспрессированньїхпоследовательностей (Е5Т) и последовательности, соответствующие зтим меткам, используют для сканирования базьї данньїх СепВапк.
Пример 8 «
Протокол гибридизации - т0 Зондьі гибридизации для скрининга библиотеки кКДНК бурачника получают путем синтеза случайной с праймированной ДНК, описанного А!йзире! ей а). (1994 Сиптепі Ргоїосоіїв іп Моїесцшіаг Віоіоду, УмМпеу "з ІпФіегзсіепсе, М.У.), при зтом они соответствуют ранее идентифицированной кДНК зкспрессированного запасного белка семян. Невключеннье нуклеотидьі удаляют в осадительной колонке 0-50 (Воепгіпдег Маппеїт). Зонд денатурируют для гибридизации путем кипячения на водяной бане в течение 5 минут с последующим бьістрь!м 75 охлаждением на льду. Фильтрьї для гибридизации предварительно гибридизируют при температуре 60"С в
Ф течение 2-4 часов в растворе для предгибридизации (б-кратньй раствор хлорида и цитрата натрия (555) - ІМапіайвз еї ам. 1984 МоіІесшаг Сіопіпд А Іарогагу МапиаЇї, Соїд Зргіпд Нагрог Іарогайюгу|)|, содержащий 1-кратньій раствор Денхартса, 0,0595 пирофосфата натрия, 100мкг/мл денатурированной ДНК спермь! лосося).
Ме Денатурированньій зонд добавляют в раствор гибридизации (б-кратньій раствор хлорида и цитрата натрия, (ее) 50 1-кратньій раствор Денхарта, 0,0595 пирофосфата натрия, 100мкг/мл денатурированной ДНК спермь! лосося) и инкубируют, перемешивая при температуре 60"С в течение ночи. Фильтрь! промьвают в 4-, 2- и 1-кратньїх с растворах ЗЕТ по 15 минут в каждом при температуре 607. 20-кратньій исходньій раствор ЗЕТ состоит из З молей Масі, О4моля трис-основания, 2о0ммолей Ма 2ЗДТК-2Н20. 4-кратньійй промьівочньій раствор ЗЕТ состоит из 4-кратного раствора ЗЕТ, 12,5ммоля РО,/, рН 6,8 и 0,295 додецилсульфата натрия. 2-кратньй промьівочньй раствор ЗЕТ состоит из 2-кратного раствора ЗЕТ, 12,5ммоля РО), рН 6,8 и 0,295 додецилсульфата натрия.
ГФ) 1-кратньій промьівочньій раствор ЗЕТ состоит из 1-кратного раствора ЗЕТ, 12,5 ммоля НО», рН 6,8 и 0,290 кю додецилсульфата натрия. Фильтрь! сушат на воздухе, а затем подвергают воздействию рентгеновской пленки в течение 24 часов с использованием усиливающих зкранов при температуре -8070.
Пример 9 60 Произвольное секвенирование кДНК, вьіделенньїх из библиотеки мембраносвязанньїх полисом семян бурачника (через 12 дней после опьіления)
Библиотеку кКДНК бурачника пассируют на чашках с низкой плотностью (500 бляшкообразующих единиц на 150мм чашках Петри). Наиболее распространеннье кДНК запасного белка семян вьічленяют путем скрининга с использованием ранее идентифицированньїх соответствующих КДНК. Негибридизирующие бляшки вьірезают, бо используя процедуру вьрезания и реагентьь фирмь! Зігаїадепе. Полученнье бактериальнье колоний используют для инокуляции жидких культур и секвенируют либо вручную, либо с помощью автоматического секвенатора АВІ. Каждую кКДНК секвенируют один раз и метят последовательности, состоящие из 200-300 пар оснований. Все секвенирование вьіполняют по методу циклического секвенирования (Ерісепіге). Получено более 300 меток зкспрессированньїх последовательностей. Каждую метку последовательности сравнивают с базой данньїх СепВапкК с помощью компьютерной программь! ВІ АЗТХ и идентифицируют ряд генов липидного обмена, включая лб-десатуразу.
Поиски в базе данньїх с использованием клона кКДНК, обозначенного трр-65, с помощью программь! ВІ АЗТХ и базьї данньїх зетВапкК привели к вьіявлению значительной совместимости с лб-десатуразой Зупеспосузіїв. 70 Однако установлено, что зтот клон не является полной кКДНК. Полную кДНК вьіделяют, используя трр-65 для скрининга библиотеки мембраносвязанньїх полисом бурачника.
Определяют последовательность вьіделенной КкКДНК (фиг.5А, последовательность с идентификационньм
МоО,ї) и белковую последовательность открьтой рамки считьмшания (фиг.5В, последовательность с идентификационньмм Мо.5) сравнивают с другими известньми десатуразами, используя программу 75 сравнительного анализа первичной структурьі белков Сепеуогке ((ІпіейПідсСепеїйісв) фиг.2). Зтот анализ показьіваєт, что данная кКДНК является геном лдб-десатуразь! бурачника.
Будучи схожей с известньіми десатуразами других растений, лб-десатураза бурачника имеет определеннье отличия, показаннье на дендрограмме, изображенной на фиг.б. Кроме того, сравнение аминокислотньх последовательностей, характерньїх для десатураз, в частности, тех, которне участвуют в связьіваниий металлов (металлический блок 1 и металлический блок 2), позволяет вьіявить различия, существующие между лб-десатуразой бурачника и десатуразами других растений (таблица 3).
Аб-Десатураза бурачника отличается от цианобактериальной формь! не только всей последовательностью (фиг.б), но также и липидньім блоком, металлическим блоком 1 и металлическим блоком 2 аминокислотньх частей (таблица 3) Как показано в таблице З, все три части являются новьіми в последовательности. Только с 29 металлический блок 2 лб-десатуразьь бурачника имеет некоторое сходство с металлическим блоком Ге) 2 Абв-десатуразьі! Зупеспосузіїв.
Помимо зтого, лб-десатураза бурачника отличаєется также от другого гена десатуразь бурачника, л12-десатуразьїі. Р1-81 является полной КДНК, которая идентифицирована на основе анализа меток о 2р Зкспрессированньх последовательностей, и демонстрирует большое сходство с л12-десатуразой Агарідорзов (Ева 2). Сравнение липидного блока, металлического блока 1 и металлического блока 2 аминокислотньїх частей 00 (таблица 3) у дб- и л12-десатураз бурачника показьювает, что в зтих областях имеет место незначительная со степень подобия. Расположение зтих двух последовательностей на дендрограмме, изображенной на фиг.б, показьіваєт, насколько далеки зти два гена друг от друга. -- (Се) « о - с і їз з
Ф
- со ю со о " шДдиИШОЛИШИИИТТТТ " РІ-81 является полной кКДНК, которая идентифицирована на оснований анализа меток зкспрессированной последовательности и
ГФ) демонстрирует большое сходство с А12-десатуразой Агрідорвів (Тад2). з Пример 10 во Конструкция 222.1 АУМОЗ для переходной зкспрессийи
Вектор рВ1221 (деПегвоп еї аі. 1987 ЕМВО .. 6:3901-3907) получают для лигирования расщеплением с помощью Ватні ЕсоЇСК І (Рготеда), что позволяет вьірезать кодирующую область зЗИ5, не повреждая промотор 355 и терминатор МО5. кКДНК Адб-десатуразьіь бурачника вьрезают из плазмидьій Блюскрипта (бігабїадепе) путем расщепления с помощью Ватні ХпоЇ. Конец Хпо!Ї дефосфолируют, используя фрагмент б5 Кленова. Зтот фрагмент затем клонируют в сайтах Вагані/ЕсоЇСк | вектора рВІ221, получая 221. АЗМОЗ (фиг.7). В 221. А"МО5 стальной частью (скелетом) рестрикционной картьі, изображенной на фиг.7, является вектор рВ1221.
Пример 11
Конструкция 121.Аб.МОЗ для стабильной трансформации
Вектор рВІ121 (ЧепПегзоп еї аі. 1987 ЕМВО )3.6:3901-3907) получают для лигирования расщеплением с помощью ВатнНі и ЕсоЇСК І (Рготеда), что позволяет вьурезать кодирующую область 505, не повреждая промотор 355 и терминатор МОБ. кКДНК лб-десатуразьіь бурачника вьрезают из плазмидь! Блюскрипта (Зігабадепе) путем расщепления с помощью Ватні и ХпоіЇ. Конец Хпо! дефосфолируют, используя фрагмент
Кленова. Зтот фрагмент затем клонируют в сайтах ВатНі/Есо!СвВ | вектора рВІ121, получая 121. лУМОЗ 70. (фиг.7). В 121. А"МОЗ остальной частью (скелетом) рестрикционной картьі, изображенной на фиг.7 является вектор рВІ121.
Пример 12
Переходная зкспрессия
Всю работу, связанную с протопластами, вьіполняют в стерильном вьітяжном шкафу. Один мл упакованньх 75 клеток суспензий моркови расщепляют в ЗОмл плазмолизующего раствора (25г/л КСІ, З3,Б5г/л. Сасі 5-Ноо, 10ммолей МЕЗ5, рН 5,6 и О0,2моля маннитола) с 195 целлюлозь!, 0,195 пектолиазь и 0,195 дрейсалазь! в течение ночи в темноте при комнатной температуре. Вьісвобожденнье протопластьь фильтруют Через сито с отверстиями 150 ут и гранулируют центрифугированием (100х г, 5 минут), после чего дваждь! промьшвают в плазмирующем растворе. Протопластьї подсчитьшают в двухкамерном гемоцитомере. ДНК трансфецируют в протопластьі путем обработки полизтиленгликолем в соответствии с описанием Нунберга и Томаса (Мипрега апа Тотаз, 1993, Меїйодз іп Ріапі Моїесцшіаг Віооду апа Віофїесппоіоду, В.К.СіісК апа 9.Е.Тпотрзоп, евдФв., рр.241-248), используя 109 протопластов и 50-70мкг плазмидной ДНК (221.А6.МОВ8). Протопласть! культивируют, встряхивая, в бмл М5-средьі, дополненной 0,2 моля маннитола и Змкл 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоть, в темноте в течение 48 часов. сч 29 Пример 13 Ге)
Стабильная трансформация табака
Конструкцию на основе плазмидного вектора 121.49.МО5 используют для трансформации табака (Місойапа їІарасит су. хапійї) посредством Адгобрасіегішт в соответствии со стандартньмми процедурами (Ногвегп еї аї., 1985, о
Зсіепсе 227: 1229-1231; Водце еї аЇ,, 1990 Мої. Сепеї. 221: 49-57) за исключением того, что исходнье трансформанть! вьібирают на 100мкг/мл канамицина. с
Пример 14 со
Получение и анализ метиловьїх зфиров жирньх кислот (ЕАМЕ)
Ткани, взятье из трансфецированньїх протопластов и трансформированньїх растений табака замораживают с зв В ЖиИдкомМ азоте й лиофилизуют в течение ночи. Метиловье зфирьї жирньїх кислот получают в соответствии со с способом, описанньім Дагмером и др. (Юбаптег еї аї!., 1989, У.Атег. ОЇ Спет. Зос. 66: 543-548). В некоторьх случаях растворитель снова вьіпаривают и метиловье зфирь жирньх кислот еще раз суспендируют в зтилацетате и один раз зкстрагируют дейонизированной водой для удаления водорастворимьїх загрязняющих примесей. Метиловье зфирь! жирньїх кислот анализируют посредством газовой хромотографии на колонке . 5 « 20 М Зсіепійс ОВ-мах (длина ЗОм, внутренний диаметр 0,25мм, пленка толщиной 0,25мкм). -о
Пример анализа переходного состояния приведен на фиг.8, которьій позволяет вьіявить совокупность из с трех независимьїх трансфекций. Добавление кДНК лб-десатуразьь бурачника соответствует появлению з гамма-линоленовой кислоть, которая является одним из возможньїх продуктов дб-десатуразь.
На фигурах 9 и 10 изображеньі профили газовой хроматографии зфиров жирньїх кислот, вьіделенньх соответственно из тканей листа и семени контрольньїх и трансформированньйх растений табака. На фигуре ЗА
Ге» изображен профиль ткани листа табака дикого типа (хапійі); на фигуре 9В изображен профиль ткани листа табака, трансформированного с помощью лб-десатуразьь бурачника при транскрипционной регуляции, що осуществляємой промотором 355 Самм (рВІ 121. А5.МО5). Пики соответствуют 18:22, 18:37 (гамма-линоленовая (ее) кислота), 18:30; и 18:4 (октадеканоновая кислота). На Фигуре 10А показан профиль газовой хроматографийи со 50 семян табака дикого типа; на фигуре 108 изображен профиль ткани семени растения табака, трансформированного с помощью рВІ 121.49У.МО8. Пики соответствуют 18:2, 18:37 (гамма-линоленовая кислота) мк и 18:33. Относительное распределение Сід жирньх кислот в контрольньїх и трансгенньїх семенах табака показано в таблице 4. о ю » взнах їз
Приведенньсе вьіше результать! показьівают, что гамма-линоленовая кислота включена в триацилглицеридь! и семян трансгенного табака, содержащего лб-десатуразу бурачника. 55 Перечень последовательностей
(1) Общая информация: (І) Заявитель: Рон-Поуленк Агрохими (ї) Название изобретения: Синтез гамма-линоленовой кислоть! под действием лб-десатуразь (ії) Количество последовательностей: 25 (м) Почтовьй адрес: (А) Получатель: Зс!ціу, Зсой, Мигрпу « Ргезвег (В) Улица: 400 Сагаеп Сіїу Ріага (С) Город: Сагдеп Сіу 70 (0) Штат: Мем/ Хоїк (Е) Страна: Опней 5іа(ев (Р) Почтовьй индекс: 11530 (М) Компьютерное представление: (А) Тип средь!: Гибкий диск (В) Компьютер: ІВМ РС-совместимьй (С) Операционная система: РО-0О5/М5-005 (Б) Программное обеспечение: Раїепііп Кеїеазе 1.0, версия 1.25 (мі) Данньсе о текущей заявке: (А) Номер заявки: (В) Дата регистрации: 30 декабря 1994Гг. (С) Классификация: (мії) Информация о поверенном и патентном агенте: (А) Имя: Прессер Леопольд (В) Регистрационньй номер: 19827 с (С) Справочньй и реестровьїй номер: 83837УХМУ (їх) Информация о телесвязи: о (А) Телефон: (516) 742-4343 (В) Телефакс: (516) 742-4366 (С) Телекс: 230 901 БАМ5 ОК о (2) Данньсе о последовательности с идентификационньм Мо.1: (Ї) Характеристики последовательности: со (А) Длина: 3588 пар оснований Ге) (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Тип цепи: оба - (Юр) Топология: линейная Ге) (ії) Тип молекуль!:: ДНК (геномная) ші с ;» (22) - (ее) о 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
(їх) Отличительніле особенности: (А) Названиє/определитель: СО5 «В) Положенне: 2002..3081 й (хі) Описание последовательностиї с идентификанионньм Мо, 1:
ССТАСССАСС АОТСАССАТОо ССТТСААТТТ СОССАТТСТо АСССАССССС СТАТТСТСВА й
ТОССОССАТТ СОСАТТОТТА АТОСТІТСТТ СААССАТОСС СТООСТАААС СТТТАСАСАС 120 70 САССТТСССА САССАСОТТА СТТТОАСТСТ ТТССоСостТо бСбосссссА тттттТоСстт 180
ТОССОСТТТО СОСААТСАСО ССАТОССОСА АТТОССсТТТО ТТТОАССАСА СТТООСССАТ 240
ТСАОСААДТТ СТСАТТСАСС ААСАССАТОС СТОССТСААТ ТТАССССТОЯ СОСАТТТАТО зоо
ССАТСАТСОС АССССААТОТ ТСАТСТАТТА ССТАССООСС САСАСТОАЛА СОСАТТТАСТ зво то АСССОСАСТО СТОАЛАТААТТ ТААССТТОСА АТСТОСОСАС САТТТААТАС ТОССАСАААА 420
АССССААССС ААСАССАЛАС ССОСАТСССС ТТОССССАДА ТТТТОСАААС ТОАТТАССВА 480
ССТОСОСсСАС ТАТСЬОСОСТ АТОТОСААСА ОСТОАТАТОС ОТОСТОТТСТ ТТТТАТТСТТ 540
ЗАТСАТТТТТ СТОСССАССТ ТСАТСТАССТ ТТОСАТТСАТ СААСАТАТТО ССССАСТОСА бо
ССССТТСТАТ ТТТТСССТоО ССАТОАТТАС СбОССССОСТ СОСААССААС АОСТосСсбА ббо
АЛАСТОСОСС САТАТСАТСА ДАСТАТТСАС АСТОСТОАТОо АТОАтТооССо сосссссост 70:
САТЕТССТАТТ ТСТТАТОССС ТАСТОААТОА ТТТСАТОСТТ СССАСТОССТ ТТАСТСАСТТ 780 с 29 ТТтТОСАТОСО СССАКСТТАС СССАТОСССА ТСАСАТСАТС АТТТОоТобоС ТОосесссАСТ вао г)
САССАТОССС АТТАТТСАЛО ВСТТААТТСА ССАбСОССАТ САААТТСТОС ТААТССААВА за0
СОАТАСАСАТ ААТОСТІТСТ ТОСАТАСОСС ССОСТСССТО бООСТОСССо ТААТТСТОСА 96о
БСАТОСССОС СТАСАЛАСАА ССТТОСОСТО СОССАДТАТС ДАСССАСССО ААбССАТТСТ 1а20 о сстооссвос АССОАССАСА СССТТААСТТ ОСАААТТОСС СТААСТОССА АССССАТСОС 1080 (ее)
СССТАСОСТО ССАСТОСТОТ ТСССТТОССА СОАТОСССАС ТТТАбОСТОТ СССТОСАСсК 1140 (ее)
АСТАТТТОАА ТТТОАААССоС ТОСТТТОТОС ОССОСААТТО бССАССТАТТ ССТТТОоСоСС 1200 «--
СОСосСосСтоа СОСОССААЛА ТТТТОСОСАА ССОСАТСАСС САТОАТТТОоС тотосотТАОоС 1260 «о
ССТАСССАСС ТТААТСАСТО СТААССАТОСС СТТТОСОССАС СААТТОСТТА АДАТТОСАСС 1320
ССААААСТСТ САТТТОСТТо СОСТСТАТСТ АСААССОбСТ СССААЛААССА ТОСАТАССТО 1380
СБААТТАТТО ССТАСССАТО ТОСАСТСТОС АСАССТОТТО ТАТТТААССА ТОСССоССАС 1440 «
ТССССТАСАС СААСТТТСОС САТССССОСО ТОССАСТОСТ ОАТОСТСТОб АСТСТТТТТТ 1500 З с ;» (о) - (ее) о 50 62
Ф) ко бо б5
ССТІТАССАТ бСССОСАТОб ААСТСТТОАС ТОСОСССААТ ССТОАТСВАС АААСАдСОоСсТ 1560
ТІСТСТАТОТ ТТАСТАТТТТ ТААСТТААСС ДАСАССАСАб САТААСТТСС ААДАСАААТТ 1620
ААССТСАААА АСТАССАААА ТААСТТТААТ ТСАТААСТОСА СТТІТАСТОС ТАААСАССОоС 1680
ТОСААДАДАС ТСАСАТАААА ТААКАССТТС АСТТСССТТТ ТАТАТТІСТОА ССАТОосСТТОС 1750
САСОСАТОТО СТСТАООСАС ТІТТТССОСТ ОССТІТАСАС АСТАТІТТСТ ССААсТоеСОоС 1800
ТААСТОСССС АТТТТТАСОС ААВАТСАТАТ АСАСАСТАТС ССААТАТТОС САСАсСстТтТтТОа 1860 706 АТОАСТСАСТ СТАБАДСОСА САСТААААТТ СТАССААТОС АСТСССАСТТ ССДАТАААТТ 1920
ТТТАСТСТОС СоСобсостТо САСТТІТТТТ СТАСТТААТОо ЯСОСТАТААТ СТСАААСсТТТ 1980
ТТТАТСТАТТ ТАААТТТАТА А АТО СТА АСА Сб о САА АСА АТТ АЛЛА ТТТ ДСС 2031
Меє печп Тпг А1а С1іу Аго 116 був РБе Тьг 1 5 10
САС АдА Сос соб ТТ СсТ СОС СТА СТА ААС ОСА соб сто САТ ОСС ТАС 2079
Сіп був АгЯ С1у Рре Аг Ага Маї цеп АБп о біп Ах Уаї Аєр Аїа Туг 15 20 25
ТТТ ССС САС САТ СОС СТО АСС САД дО САТ ДАТ ССС ТОоС АТО ТАТ ОСсТОо 2127
Рпе Аїа біз Нів сіу рей Тпг о біп Агу АвроАвп о Рго бег о Мес Тут Гей 30 35 40
ВА ОАСС Сто АтТтТ о АтТт сто сто тоб Тто тт отТсс ост тоб осо ттт сто 2175 цув ТИг Грем ІїІ3Зе Ії Ма) Печ Тер Печ Ре Бех Аїа Тгр Аза Рпе Уаї 45 БО 85 стт тгтосст о ссА Стт о АтТТ тТТтТ соб сто Соо СТА сто осот тот АТО ст 22213 Ге
Тез Рпе А1а Рго Маї 116 Ре Рко УМаї Акад Гей Пес біу Сув Мес Уаї во 65 7о о тт бСб АТО БСС тте боб ссс отттТ ТосСоТтТо ААТ сто бос САС САТ СОС 2271 ем Аїа І12 діа Печ А1їа А1їа РБе Бек РрБе Авп Ууаї Сіу нів Авр А1а - 75 во 85 за
ААС САС ААТ ОСС ТАТ ТО ТСС ААТ ССС САС АТС ААС Со сттТ сто бос 2319 о
Авп Нів Авп А1іа Тух бет бек АБп Рко Нів І1е Авп АгЯя Маї бем с1у 95 100 105 со
АТО АССОТАСООдтТ тт отТс Об ТТА ТСТ АОоТ ТТ СТІ тоб СОС ТАТ СОС 2367 (ее)
Ме Тіт Туг Авр Рпе Маї біу цей бВеї Бех Ре Пец Тур Ак Тух Ака 110 115 120 «--
САС ААС ТАТ о ТТа САС САС АСС ТАС АСС ААТ АТІ СТТ бос САТ САС сто 2415 (Те)
Нів Авп Туг Пец Нів ців Тих Туєк ТЬг о АБп т11е Пец біу Нів Авр Уаї 125 130 1315
САА АТС САТ СА САТ оС ОСА СТА СОТ АТО АСТ ССТ ОДА САД ОАА САТ 2463 січ І1е Нів біу Авр біу Аза Маї АтЯ Мес 5Бег Рго бі біп бій Нів « 140 145 150 - с . ит (22) -й (ее) (ее) і) ко 60 б5
СТТ ОСТ АТТ ТАТ о ССТ ТТ САС САА ТТТ ТАТ АтТтТ тоб ост ТТА ТАТ Ост 2511
Уа1 б1іу 116 Тут Ага Рпе біп біп Ре Туг Іїе Тер Сс1у це Туг Бе 155 160 165 170
ТТС АТТ СОС ТТТ ТАТ ТО ТТТ ОСТ ТАС ООАТ СТО ТАС СТА Сто СТ ААТ 2559
Ре Ії Рхо рРпе Тух Тгр Рпе Геч Тут Авр маї Тук Печ Маї цей дво 175 180 185
ААА СОС ААА ТАТ САС САС САТ АЛ дТТ ССТ ССТ ТТо САС СОС СТА САА 2607
Був Сіу цув Тук Нів АБр Нів Був І1е Рго Рго Ре Сіп Бко без бід 190 195 20а 70 ТТА ОСТ АСТ ТТо СТА боб АТТ ААО СТА ТТА То сто бос отдс о стт ТТ 2655
Тез Аїа Бех Пец Печ б1іу І1е Пув Гей Пец Тгройец біу Туу Маї РНе 205 210 215 бос ТТА ОСТ сто ост сто обсС оТТТ ТСО АТТ ССТ ОбдДА СТА ТТА ТТ ОбОоТ 2703 б1іу пре Рго цец Аза Пец б1іу Рре Зек І1є Рго б)іч Уаї ре І12е б1у 220 225 230 т ССТ ТО СТА АССОТАТ АТО АСС ТАТ ОбС АТО сто сттТ о ТоС десС АТС ОТТТ 2751
Аїа Бек Маї Тпт Тут Меє ТНх Тук 01у І1е Уаї Уаї Сує ТВг Ії впе 235 240 245 250
АтТа Сто ССС САТ сто ТТО ОАА ТСА АСТ САЛО ТІТ Сто дес СоС бАТ сот 2799
Меє еп Аїа Нів Маї цем бій Бек Трк о біц Рбе еп ТПг о РКО Авр о б1у 255 250 255
САА ТСС ОСТ ССС АТТ САТ САС САС То ОСТ АТТ ТоС САА дтТтТ о сстТ дес 28547 сій Бек біу діа 116 Ар Авр Сі Тгр Аза ІТе Сув біп І1е Акд Ті 270 2775 280
Ввсп ОСС ЛАТ ТТТ ОСС АСС ААТ АКТ СОС ТТТ тоб АС отТоб тТтТт тот бас 2855 Ге
Тпг о Аза дяп Рпе Аза ТБх Авп Авп Рго Ре Ттр Авп о Ттр Рпе Сув Сіу 285 230 295 ге) бот ТТА ААТ САС САА стТТ АСС САС САТ СТТ ОТТО ССС ААТ АТТ ТОТ САТ 2943
Сіу пец Авп Нів біп Уаї ТБг Ні Нів Без рРпе Рко АБп о ї1е Сув Нівн 300 305 310
АТТ САС ТАТ ССС ОСАД ОТТО САД ААТ АТТ АТТ АС САТ сТТ ТаС САд САС 2991 о
І1е Нів Тут Рго біп без Сіц АБпої11е ч116е був Авр Чаї Сув-'єїп 10 315 320 325 330 со
ТТТ ОСТ СТО САА ТАТ ААА ОТТО ТАТ ССС АСС ТТ АвВА бСо осо АТО осо зоза (ее)
Рпе біу уаї бйіш Тук Пув Ма)ї Тук Рко ТЕ Рпе Гує А1їа Аза І1їе А1їа 335 340 345 ч:
ТСТ ААС ТАТ СОС Тоо СТА САС ССС АТО БОС ААА ОСА ТСб ТСАСАТТОСС зов (Се)
Бек деп Тух Дгч Тгр Бей Січ А1ї1а Мес біу був А1а Бек 350 355 36
ТТОССАТТОА АССААЛАТОС СААЛААТСССТ ССТАДАТСТА ТОАТОСАдаС СТТТСТОоТТО 3148
СССОССбАСС АЛАТСССССА ТОСТОАССАА АССТТОАТОТ ТОССАТТОСТ ССАААСССАС 3208 « 20 - с . ит (22) - (ее) (ее) і) ко 60 65 с о (ав) со (ге) - (Се) « - с з
Ге) шк (ее) бо о «2 (Ф) ко 60 65 біп б1іп Ре Туг І1еє Тгтр б1у це Тук о йеп РБе Ізе Ркго Рре Тук ТІр 165 170 175
Рпе реп Тук Авр Маї Тут Пем уаії Пез Авп Був біу Був Тух Нів Авр 180 185 190
Нів руб І16е Рго Рго Рбе біп Рко Пец біш Пейп Аза бет Бей еп б1іу 195 200 205
І1е Був Пец Бцец Ткр Іеи біу Тух Ма1ї Ре Сіу Пец Ркго Пец діа Гем 210 215 220 70 біу рве Бек Ії рРко бі Уаї Гей І1е біу Діа бет чаї Тіт Туг Мес 225 230 235 240
Тпк Тух біу І1е Ма1 Уа) Сув ТптІ І1е БНе Мес Пец діа Нів Уаї грец 245 250 255 бі Бех ТП об1з Рпе рецз ТвгоРуто Авросіу бі Бех біу А1а ї1е дер 260 25 270
Авр біц Тер Аіїа І1е Сув Ссіп І1е Акад ТНК ТБг о АД1іа АБп о РНе А1а ТЕ 275 2во 07 285
Авп Авип Рго Рпе Ткр АБпоТгр о Ре Суб Сіу біу рец Авп Нів Сіп Маї 290 235 300 Й : й - : :
ТВтІ Нія Нів Гей Ве Рго Авп ї11е Сув Нів ї11е Нів Тух Рко біп Пец 305 310 зї15 320 січ дяп Іїе І1е Пує йво Уа1ї Сув С1іп СМ Рре піу Маї біз Тук Був 325 330 335 с чаї Тухк Рхто ТІ Рбе був А1їа А1а І1е А1їа бек Авп Туг Ак Ткр їеч 340 345 350 Ге) сій діа Ме Сбіу цув Діа Бех й 355 І -
С) Даннне о последовательности с идентификапионньм Мо. 3: о (1) Характеристики последовательности: - со (А) Длина: 1884 пар оснований со (В) Тип: нукленновая кислота (С) Тип цепи: оба : «- (0) Топология: линейная й (Се) (і) Тип молекуль: ДНК (теномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо. 3:
АССТТСАСТТ СОСІТІТАТА ТТОТОАССАТ ООТТСССАБо САТСТОСТОСТ АОСОАСсТТТТ І-І) «
ТеСССТОССТ ТТАСАСАСТА ТТТТСТССАА СТОСОСТААС ТОССССАТТТ ТТАБОСАААА 1280 шщ с . и? (22) - (ее) (ее) і) ко 60 65
ТСАТАТАСАС АСТАТСССАА ТАТТОССАСА ОСТІТСАТОА СТСАСТОТАС ААСОСАСАСТ 180
ААААТТСТАС СААТОСАСТС ССАСТТОСАЛ ТАААТТТТТА СстІСТеСеСеб боосСтосАстТ 240
ТТТТТТСТАС ТТААТОСОСОО ТАТААТОСТОА ААСТІТТТТТА ТСТАТТТАДА ТТТАТАДАТО 300 й СТААСАССОС АЛАСААТТАА АТІТАСССАС АААСОоСОСоТ ТТСоТСОсСат АСТАААССДА збо
СООСТОСАТОо ССТАСТТТОС СОАССАТОСОС СТОАСССААА СОСАТААТОС СТОСАТОТАТ 429
СТОААААССС ТОАТТАтТтсТт оСТотТостТто ТтІТтоСостт сбосстттстТ ссттттТост 480 70 ССАСТТАТТТ ТТСОбстТоСо ССТАСТООСТ ТОТАТОСОТТТ ТОобСссАтТоСс сттоссосес 540
ТТІТТССТТСА АТОТСООССА СОАТОССААС САСААТОССТ АТТОСТССАА ТОеСССАсСАТое 500
ААСССоОТТС ТОБОСАТСАС СТАСОАТТТТ ОТССООТТАТ СТАСТТТТСТ ТТООСОСтТАТ бЕо
СОССАСАДСТ АТТІТОСАССА САССТАСАСС ААТАТТСТТО СССАТСАСОТ ССАААТССАТ т20 т ССАСАТОССо САСТАСОТАТ САСТОСТОАА САДОСААСАТО ТТОСТАТТТА ТООТТТОсСАОа 7во
СААТТТТАТА ТІТОбОСТТТ АТАТСТІТТС АТТСССТТТТ АТТОСТТТСТ СТАССАТОоТо 840
ТАССТАСТОС ТТААТАААСО САААТАТСАС САССАТАААА ТТОСТОСТТТ ССАССССОСТА 900
СААТТАССТА ОТТТОСТАСОо САТТААССТА ТТАтТОобСстТоо оСстТАСОаТІтТтТ СбостТтТАСссТ 9ва стТбОостТстТоОо ОСТТТТССАТ ТОСТОААСТА ТТААТТОСТО СТТСОСТААС СТАТАТОАСС 1020
ТАТОССАТОС ТОСТТТОСАС САТСТТТАТО СТОССССАТО ТСТТОСААТС ААСТОААТТТ 1080
СТСАСССОСО АТОСТОААТО СОСТОССАТТ САТСАСОАСТ ОООСТАТТТО ССАЛАТТОСТ 1140 се
МссАСОдССА АТТТТСССАС СААТААТСОС ТТТТОСВАСТ СОТТТТСТОЄ ССОТТТАААТ 1200 о
САССААСТТА СССАССАТСТ ТТТССССААТ АТТТОТСАТА ТТСАСТАТОС ССААТТООАА 1260
ВАТАТТАТТА АОСАТСТТТО ССААСАСТТТ ОСТОТОСААТ АТАААОТТТА ТоССдеСстТТо 1320 й АААССООСОА ТСОССТСТАА СТАТСОСТОа СТАСАСОССА ТОСООСАААСС АТСОТОАСАТ 1380 о
ТОССтТТОССА ТТОСАВОСААА АТОССЛАКАТ СССТОСТАВА ТСтТАтТсАТСВ вАСССТТТСТ 1545 со
СТТОСССОСС САССАВАТОС ССБАТОСТОА ССАААОСТТО АТОТТООСАТ ТОСТоСАВАС 1500 со
ССАСТТТОАС СОбОТТСАТТ вСССосСАСТТ ТСААССТОАС СТАБОАСОСА ААСАТТОСОТ 1560 ьо
САТТІТТОСТС АвАТОСОоСТО ОСАТАТТОАА АоостТТсАСС АестТтТтТОоотТтТ ТСТАСоеСстТОоС 1620 І«о)
ТСААТОСБАА ОСАСАДАССО ТСАСААТТОТ ТТАТТСТОЗТ САСАССАТСА ССБСАСССАтТо 1680
САТОТОСТСТ ААСССАСССС ТООССАДСОоС ТТОПВАССААС СССАТОСААА ТІСТССАСЗА 1740
СОСТАСОССА САААААТТАТ Аттсостост САТТТСТТОС БОСТАТСОСА ССТАССОАТТ 1800 «
З с з (е)) шк (ее) бо «2 (Ф. ко бо 65
ТТТОАССАТТ ТТТОССАЛОС ААТТСТАТСС ССАСТАТСТО САТСССАСТо ССоССоСсСсТоТ 1860
АСААААТТТТ АТССАТСАСС ТАС 1884 (2) Даннне о последовательности с пдептификационньм Мо. 4: (2) Характеристики последовательцости; (А) Длина 1685 пар основапий (8) Тип: нукленновая кислота (С) Тип цепи: оба 70 (0) Топологня линейная (й) Тип молекуль, ДЯК. (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо. 4:
ААТАТСТОСС ТАСССТОССА ААСАСАСТАС ТСАТТТТТСА ТСААТООСТО СТСАААТСАА. бо /5 ЗАВАТАСАТТ АССТСАСАТО ААСТСААСАА ССАССАТАЛА ССОССАСАТС ТАТОСАТСТС 120
САТТСАВОСС АААСССТАТО АТОТТТСССА ТТСОСТОААА САССАТОСАС СТОобСАсСТтТ 180
ТСССТТСААС ДОТСТТОСТо СТСААСАБСТ ААСТОАТОСА ТТТСТТОСАТ ТОСАТоСТОС 240
СТСТАСАТОС ААСААТСТТО АХААСТТІТТТ САСТООСТАТ ТАТСТТАААС АТТАСТСТСТ 300 ттстодАсстТт ТСТАААСАТТ АТАОСАЛОСТ ТОТСТІТСАС ТІТТСТАААА ТоОсТТТатА зво
ТСАСАААААА ССТСАТАТТА ТОТТТОСААС ТТТОТОСТТТ АТАССААТОС ТОТТТОСТАТ 420
САСТСТТТАТ СобсСТТТІоТ ТТТОТОАсбО ТСоТТТГТОСТА САТТТОоТТІтТ СстсОостТотТ 480
САТОСССТТТ СТТТОСАТТС АСАСТОСТТо САТТОСАСАТ САТОСТОСОС АТТАТАТастТ 548 с що АСТСТСТОАТ ТСААСОСТТА АТААСТТТАТ СССТАТТТТТ ОСТОСАЛАТТ СТСТТТСвОС БОО і)
ЛАТААСТАТТ ОСТТОСТОСА ААТОСААССА ТААТОСАСАТ САСАТТОССТ СТААТАБОСТ БО
ТСААТАТСЬС ССТОАТТТАС ААТАТАТАСС АТТССТТСТтТ СТСТСТТОСА АСТТТТТТОб 720 о
ТТСАСТСВСС ТСТСАТТТСТ АТОВСВАЛАЄ СТТСАСТТТТ САСТСТТТАТОСААСАТТСТТ тво
ТСТАЛСТТАТ СААСАТТОСА САТТТТАССС ТАТТАТСТОТ ССТОСТАССС ТСААТАТСТА 840 со
ТСТАСААТСТ СТСАТААТОТ ТОТТОАССАА САСАДАТОТО ТОСТАТСОАС СТСАССААСтТ зо со
СТТСССАТОС СТАСТСТТСТ ССАТТТОСТА СССОТТОСТТ СТТТІСТІСТТ ТОССТААтТтТо 960 --
СССТСАААСА АТТАТСТТТО ТТАТТОСААС ТТТАТСАСТО АСТОСААТОС ААСААСТТСА 1020 ее,
СТТІСТОСТТО ААССАСТТСТ СТТСААСТСТ ТТАТОТТОСА АЛАСССТАААС ССВАТААТТО 1080
СТТТСАСААА САДАСОСАТО ССАСАСТТОА САТТТСТТОТ ССТОСТТОСА ТОосАТТоСсТТ 1140 « з ТСАТОСТОСА ТТОСААТТСС АААТТСАССА ТСАТТТОТТТ СССААСАТОС СТАСАТОСВА 1200 З с з (о) - (ее) о 50 62
Ф) ко бо б5
ССТТАСОАЛА АТСТСОСОСТ АСОТОАТССА СТТАТОСААС АВАСАТААТТ ТОССТТАСАА 1250
ТТАТОСАТСТ ТІСТОСААбо ССААТОАААТ САСАСТСАСА АСАТТОДОСА АСАСАССАТТ 1320
ССАСОСТАСО САТАТААССА АСССОСТОСС СААСААТТТО СТАТООСААС СТСТТСАСАС 1380
ТОСАТОСТТАА ДАТТАСССТТ АСТТСАТОТА АТААТТТОАС АТТАТСТАТС ТОСТАТОТТТ 1440
СТОТСТТсСТо ТТОСТІСТАС ТІСТТОбАСТ САТТОСААСТ ТОТСТІТТАТ СоТТТАТТАС 1500
АТОСТІТТТТА АТАТАТТІТА САССТІТТОС ТТТСАТСТСС АТТАТТСАТО ААТААссАсТ 1560 70 ТОСАТАТТОТ САДТТСТІСТ БСТСААТАТС ТОАТАТТТТО ОААТОТАСТТ ТоТАССАСТО 1620
ТОТТТТСАстТ ТОАвОСтТСАТ СТОТАСТТСТ АТАСАСТТТО ТТТАААТОоСТ ТАТОТоАТсТ 1680
ТАТІТ 16585 (2) Даннье о последовательности с идентификационньм Мо. 5: (0 Характеристики последовательности: (А) Длина 448 аминокислот (В) Тип; аминокислота (Б) Топология: линейная (й) Тип молекуль: ДНК (теномная)ї /-:(/ І Й (хі) Описанне последовательности с идентификацпионньм Мо. 5: мес Аза Авіа біп І11е цув Був Тух І18є Тіт бек Ар біц їец цув Авп 1 2 10 15 нія Ар рує Рхо Сіу Ар Пец Тур ї11е бек І1е біп с1у Пув Аза Тух с "20 25 30 2 о
Авр Уаї бек Авр Тер Маї Був АБр Нів Рго б1у пі1у Бех бБпе Рко Пец 35 40: 45 пуб бек Печ Аїа с1іу йіп бій Уаї Трг о Авр Аза Ре Уаї А1їа Ре йівб - 5о 5 бо о тго віа бет Тіт Тгр мує Ап Пец Авробубв Ре Ре Тих п1у Тук ТУуг в5 70 75 во (ее) їец цув Авор о Тут бег Ма) бБет біз Уаї бек Був Авр оТут Аг ПЦуБ Пец (со) а5 90 95 -
Уа1ї Рипе бі ре бБетг Був Мес С1у ївц Тут Авр Мун Був Сі1у Нів І1е 100 105 110 «со
Мес Ре А1а тру Пец Суб Рпе Іїе А1а Мес цей РБе Аза Мес бег Уаї 115 120 25
Тук біу маї Пеш Ре СуБ сім с1іу Маї це Уаї Нів Пецп Рпе бек 01у « 130 1135 140 - с . а (о) - (ее) (ее) 62 ко бо б5
Сув Пец Меє б1у Рпе Пец Ттр ЇТ1е Сіп бек біу Тур І11е Сіу Нів Авр 145 150 155 169
А1Та Ссіу нів Тух Мех Уаї Уаї бек Авр бет Агу цец Ап Пув Ве Мве 165 170 175 с1у І1є Ре А1а А1їа Авп Сув Ппем бек біу т1є бек т1е 01у ТЕр Тгр 180 185 190 цу Ткр Авп Нів Авп А1та Ні Нів ІЗе А1а Сує Деп бБет Пем Сім Туг 195 200 205 70 Авр Рто Авр цем біп Тух Ії Рго Рпе ви Уаї уаї Зег бек ПЦув Ре 210 215 220
Рре Сіу Бех Пем ТПтх бек Нів Ре Тук бі Був Акд Гец Тпк РБе Ар 225 239 235 240
Бех Тец Зек Ахо Ре Ре Уаї Бек Тук Сіп Ніє Тур ТНК Рпе Туг рРго 75 245 250 255
І1іе мес Сув Аза Аза Аку ви Авп Мес Тут Уаї біп бек Беп т11е Ме 260 265 270
Те печ Тпг Був Аг Ав Маї Бех Тукх Ату А1Та біп Сі цец їв бу 275 280 285
Сув рей Маї Рле бег І1е ТЕр Тут Рко Пец реп Уаї бек Сув їеч Ркго 230 295 300
Авп Ттр біу біз Агу Ії1е Мес Рпе Маї І)е Аїа бек Пец бек Чаї ТЕ 305 310 315 320 біу Ме біп'біп баї Сіп Ре Бег Ге Авп Ніб бпПе бек бБетг бек Чаї с 325 330 335 о
Тук Ма1 01у цув Рго рув Сзу Абзп Авєп Ткр Рпе біш цув біп Тг о Авр з4о 345 зва сіу Тпї рец Авр т112є бех Сув Рко Рго Тгр Мей Абр Тгр Ріе Нів біу 355 360 365 о , Й т
С1у бек біп Рпе біп І1е бі Ні Нів Пац Рбе РрРго ГЦув Мебє Рко Агч со з7о 375 зво (ее)
Сув Анп реп АкЯд ПуБ І1е Зех Рко Тух Маї 116 біц цец Сув ув Цув 385 390 395 400 «--
Нів АБп Ге Рго Тух Авп Тут Аіїа Бег Ріе бБег Пув А1їа АБп Сіц Меєк (Се) 495 410 415
ТНІ Беч АгЯ ТВгоГпей Аку Авп оТвВг Аза Пезч біп Аза Аго Авр ї1е Ток 420 425 430
Мцув Рго цец Рго Цув дап Пец Уа! Тгр біц Аза пе Нів Тнг Нів біу « 435 440 445 -о с (2) Данньсе о последовательности с идентификационньім Мо.6: (Ї) Характеристики последовательности: . и?» (А) Длина: 8 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная
Ге» (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.6: - со йо Ме Су Ніб в Аа Су Ні (ее) о (2) Данньсе о последовательности с идентификационньм Мо. 7: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 8 аминокислот (В) Тип: аминокислота 59 (Юр) Топология: линейная
ГФ) (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) т (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо. 7:
Авп Ма! су Нів Авр Аа Авп Ніб 60 1 5 (2) Даннье о последовательности с идентификационньм: Мо.8: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 8 аминокислот б5 (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная
(і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.8:
Ма! Геи су Ніз Авр Сув Су Ніз 1 5 (2) Данньсе о последовательности с идентификационньім Мо.9: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 8 аминокислот то (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.9: ма! Ме Ага Нів Сім Суз Су Нів 1 5 (2) Даннье о последовательности с идентификационньїм Мо.10: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 8 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационнь!м Мо.10: с о
Ма! Пе Су Нів Ар Сув Аа Ніз 1 5 (2) Даннье о последовательности с идентификационньм Мо.11: ав (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 8 аминокислот со (В) Тип: аминокислота с (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) -- (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.11: Ге)
Ма! ма! Су Ніз Авр Сув Су Нів 1 5 « 20 (2) Даннье о последовательности с идентификационнь!м Мо.12: з (Ї) Характеристики последовательности: с (А) Длина: 5 аминокислот :з» (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная)
Фу но (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.12: шо Нів Авп Аїа Ні Нів 1 5 (ее)
Го! 20 (2) Даннье о последовательности с идентификационнь!м Мо.13: (Ї) Характеристики последовательности: ме, (А) Длина: 6 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная 59 (ї) Тип молекуль!: ДНК (геномная)
ГФ) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.13: їмо) Нів Авп Туг Геиц Нів Ніз 1 5 60 (2) Даннье о последовательности с идентификационньм Мо. 14: (ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная 65 (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.14:
Ні Агд Тпг Нів Нів 1 5 95 (2) Даннье о последовательности с идентификационнь!м Мо.15: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная то (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационнь!м Мо.15:
Ні Аго Аго Нів Ніб 1 5 (2) Даннье о последовательности с идентификационньм Мо. 16: (ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная (ї) Тип молекуль!:: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационнь!м Мо.16:
Нів Ар Аго Ніз Ніз 1 5 с о (2) Даннье о последовательности с идентификационньм Мо. 17: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота ав (О) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) со (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.17: с
Ні Авр Сіп Нів Нів «- ! 5 (Се) (2) Даннье о последовательности с идентификационньїм Мо.18: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот « 20 (Б) Тип: аминокислота з (Ю) Топология: линейная с (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) :з» (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.18:
Нів Авр Нів Ні Нів 4 5 (22) - (2) Даннье о последовательности с идентификационнь!м Мо.19: (Ї) Характеристики последовательности: со (А) Длина: 5 аминокислот бо о (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная ме, (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.19:
Нів Авп Нів Нів Нів о 1 5 іме) (2) Даннье о последовательности с идентификационньім Мо.20: (Ї) Характеристики последовательности: 60 (А) Длина: 6 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньїм Мо.20: б5
Рпе Сіп Ме си Нів Нів
1 5 (2) Даннье о последовательности с идентификационнь!м Мо.21: (Ї) Характеристики последовательности: 9 (А) Длина: 6 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) /0 (хі) Описание последовательности с идентификационньм Мо.21:
Нів Сіп Ма! Тнг Нів Нів 1 5 (2) Даннье о последовательности с идентификационньм Мо.22: 19 (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота (р) Топология: линейная (ії) Тип молекуль!:: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационньїм Мо.22:
Нів ма! Іе Нів Нів 1 5 с (2) Даннье о последовательности с идентификационньїм Мо.23: о (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота (Юр) Топология: линейная ав) (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационнь!м Мо.23: 09 с
Ні Маї Аа Ніз Ніз 1 5 - (Се) (2) Даннье о последовательности с идентификационнь!м Мо.24: (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот (В) Тип: аминокислота « 20 (Юр) Топология: линейная з с (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) (хі) Описание последовательности с идентификационнь!м Мо.24: з
Нів Пе Рго Ні Нів 1 5 б (2) Даннье о последовательности с идентификационньїм Мо.25: - (Ї) Характеристики последовательности: (А) Длина: 5 аминокислот бо (В) Тип: аминокислота о 20 (Юр) Топология: линейная (і) Тип молекуль!: ДНК (геномная) с (хі) Описание последовательности с идентификационнь!м Мо.25:
Ні Ма! Рго Нів Ніб 1 5
Ф) іме)
Claims (24)
1. Вьіделенная нуклейновая кислота, кодирующая дельта-б-десатуразу из Вогадо опісіпаїїв, которая соответствует нуклеотидной последовательности ЗЕО ІЮ Мо: 4.
2. Вьіделенная нуклеийновая кислота, которая кодирует дельта-б-десатуразу, соответствующую аминокислотной последовательности ЗЕО ІЮО Мо: 5. 65
3. Вектор, содержащий нуклеийновую кислоту по любому из пп. 1-2.
4. Вектор по п. 3, встроенньй в клетку.
5. Вектор по п. 4, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой животного, бактериальной клеткой, растительной клеткой или грибковой клеткой.
6. Зкспрессирующий вектор, содержащий вьіделенную нуклейновую кислоту по любому из пп. 1-2, которая Ффункционально связана с промотором и, необязательно, с сигналом терминации, способньм вьзвать зкспрессию генного продукта указанной вьіделенной нуклеийновой кислоть.
7. Зкспрессирующий вектор по п. б, отличающийся тем, что промотором является промотор дельта-б-десатуразьї, промотор карбоксилазьь Апараепа, промотор гелиантинина, промотор глицинина, промотор напина, промотор 355 из Самм или тканеспецифичньй промотор гелиантинина. 70
8. Зкспрессирующий вектор по п. б, отличающийся тем, что промотор является конститутивнь!м или тканеспецифичньм.
9. Зкспрессирующий вектор по п. б, отличающийся тем, что сигналом терминации является сигнал терминации Зупеспосузіїз, сигнал терминации нопалинсинтазь! или сигнал терминации семени.
10. Зкспрессирующий вектор по любому из пп. 6-9, встроенньй в клетку.
11. Зкспрессирующий вектор по п. 10, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой животного, бактериальной клеткой, растительной клеткой или грибной клеткой.
12. Способ получения растения с повьішенньім содержанием гамма-линоленовой кислоть (1 А), которьй включает: (а) трансформацию растительной клетки вьіделенной нуклеийновой кислотой по любому из пп. 1-2; и (Б) регенерацию растения с повьішенньм содержанием гамма-линоленовой кислоть! (СІ А) из указанной растительной клетки.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанньмм растением является подсолнечник, соя, кукуруза, табак, арахис, морковь или маслиничньй рапс.
14. Способ получения растения с повьішенньім содержанием гамма-линоленовой кислоть (1 А), которьй сч ов ВКключает: (а) трансформацию растительной клетки вектором по любому из пп. 3, 6-9; и і) (Б) регенерацию растения с повьішенньм содержанием гамма-линоленовой кислоть! (СІ А) из указанной растительной клетки.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанньмм растением является подсолнечник, соя, кукуруза, о зо табак, арахис, морковь или маслиничньй рапс.
16. Способ индукции получения гамма-линоленовой кислоть (С А) в организме с низким содержанием или со полньім отсутствием гамма-линоленовой кислоть, которьій включаєт трансформацию указанного организма о вьіделенной нуклеийновой кислотой по любому из пп. 1-2.
17. Способ индукции получения гамма-линоленовой кислоть (С А) в организме с низким содержанием или -- з5 полньм отсутствием гамма-линоленовой кислоть, которьій включаєт трансформацию указанного организма (ау вектором по любому из пп. 3, 6-9.
18. Способ индукции получения гамма-линоленовой кислоть (С А) в организме с низким содержанием или полньїм отсутствием гамма-линоленовой кислоть! и линолевой кислоть (ГА), которьій включает трансформацию указанного организма вьіделенной нуклейиновой кислотой по любому из пп. 1-2 и вьіделенной нуклеийновой « Кислотой, кодирующей дельта-12-десатуразу. в с
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная вьіделенная нуклейновая кислота, кодирующая Й дельта-6-десатуразу, содержит нуклеотидь! 44-1390 5ЕО ІО Мо: 4. а
20. Способ индукции получения октадекатетраеновой кислотьі в организме с низким содержанием или полньім отсутствием гамма-линоленовой кислотьІ, которьій включает трансформацию указанного организма Ввіделенной нуклеиновой кислотой по любому из пп. 1-2. Ге»
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанньім организмом является бактерия, гриб, растение или животное. -
22. Способ индукциий получения октадекатетраеновой кислотьі в организме с низким содержанием или о полньім отсутствием гамма-линоленовой кислотьІ, которьій включает трансформацию указанного организма 5р Вектором по любому из пп. 3, 6-9. со
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанньім организмом является бактерия, гриб, растение или о животное.
24. Способ получения растения с повьішенной холодоустойчивостью, которьіїй включает: (а) трансформацию растительной клетки вьіделенной нуклеийновой кислотой по любому из пп. 1-2; и 5Б (Б) регенерацию указанного растения с о повьшенной холодоустойчивостью из /указанной трансформированной растительной клетки. Ф) 25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанньмм растением является подсолнечник, соя, кукуруза, ка табак, арахис, морковь или маслиничньй рапс. во Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2003, М 12, 15.12.2003. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/366,779 US5614393A (en) | 1991-10-10 | 1994-12-30 | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| PCT/IB1995/001167 WO1996021022A2 (en) | 1994-12-30 | 1995-12-28 | Production of gamma linolenic acid by a δ6-desaturase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA61880C2 true UA61880C2 (en) | 2003-12-15 |
Family
ID=23444458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97063197A UA61880C2 (en) | 1994-12-30 | 1995-12-28 | SYNTHESIS OF g-LINOLENIC ACID UNDER THE ACTION OF DELTA-6-DESATURASE |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5614393A (uk) |
| EP (1) | EP0801680B1 (uk) |
| JP (2) | JP4422211B2 (uk) |
| CN (1) | CN1117864C (uk) |
| AR (1) | AR000582A1 (uk) |
| AU (1) | AU707061B2 (uk) |
| BR (1) | BR9510411A (uk) |
| CA (1) | CA2207906C (uk) |
| DE (1) | DE69535064T2 (uk) |
| ES (1) | ES2262146T3 (uk) |
| RO (1) | RO121387B1 (uk) |
| RU (1) | RU2181772C2 (uk) |
| UA (1) | UA61880C2 (uk) |
| WO (1) | WO1996021022A2 (uk) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484137C2 (ru) * | 2006-01-04 | 2013-06-10 | Монсанто С.А.С. | Мутанты fad-2 и высокоолеиновые растения |
Families Citing this family (105)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090077692A1 (en) * | 1991-10-10 | 2009-03-19 | Thomas Terry L | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase |
| US20070130654A1 (en) * | 1991-10-10 | 2007-06-07 | Thomas Terry L | Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase |
| US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| US7109392B1 (en) | 1996-10-09 | 2006-09-19 | Cargill, Incorporated | Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase |
| US5977436A (en) * | 1997-04-09 | 1999-11-02 | Rhone Poulenc Agrochimie | Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| US5959175A (en) * | 1997-04-09 | 1999-09-28 | Thomas; Terry L. | Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| CN1253588A (zh) * | 1997-04-11 | 2000-05-17 | 艾博特公司 | 在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物 |
| US7745694B1 (en) | 1997-04-11 | 2010-06-29 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants |
| US5968809A (en) | 1997-04-11 | 1999-10-19 | Abbot Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US5972664A (en) | 1997-04-11 | 1999-10-26 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US6051754A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-18 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US6075183A (en) * | 1997-04-11 | 2000-06-13 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US6100450A (en) * | 1997-10-22 | 2000-08-08 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Seed specific promoters based on arabidopsis genes |
| GB9724783D0 (en) * | 1997-11-24 | 1998-01-21 | Inst Arable Crops Research | Novel polypeptides |
| AU761152B2 (en) * | 1998-03-17 | 2003-05-29 | Cargill Incorporated | Genes for mutant microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| US6635806B1 (en) * | 1998-05-14 | 2003-10-21 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for expression of transgenes in plants |
| CA2329159A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Bruce Kelder | Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products |
| CA2330024C (en) * | 1998-06-12 | 2012-01-24 | Calgene Llc | Polyunsaturated fatty acids in plants |
| DE19828850A1 (de) * | 1998-06-27 | 1999-12-30 | Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer | Sphingolipid-Desaturase |
| BR9912745A (pt) * | 1998-08-04 | 2001-11-06 | Cargill Inc | Promotores da desnaturase de ácido graxo de plantas |
| AU1097900A (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-26 | Abbott Laboratories | Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom |
| EP1121150A4 (en) * | 1998-10-09 | 2003-06-04 | Merck & Co Inc | DELAT 6 FATTY ACID DESATURASE |
| AU2163100A (en) * | 1998-12-03 | 2000-06-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Membrane-bound desaturases |
| US6864077B1 (en) | 1998-12-03 | 2005-03-08 | Edgar B. Cahoon | Membrane-bound desaturases |
| JP4383671B2 (ja) * | 1998-12-07 | 2009-12-16 | ワシントン ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション | 不飽和化酵素、およびそれらを多価不飽和脂肪酸の合成のために用いる方法 |
| US8791327B2 (en) | 1998-12-07 | 2014-07-29 | Washington State University Research Foundation | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| US6825017B1 (en) | 1998-12-07 | 2004-11-30 | Washington State University Research Foundation | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids |
| DE60012934T2 (de) | 1999-02-26 | 2005-08-25 | Martek Biosciences Corp. | Verfahren zum Abtrennen von einem Docosahexaensäure enthaltenden Triglycerid aus einem Triglyceridgemisch |
| KR20020025069A (ko) | 1999-06-07 | 2002-04-03 | 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 | 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제 |
| WO2001002591A1 (de) * | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Basf Plant Science Gmbh | Δ6-desaturasegene exprimierende pflanzen und pufas enthaltende öle aus diesen pflanzen und ein verfahren zur herstellung ungesättigter fettsäuren |
| DE10030976A1 (de) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Basf Ag | DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren |
| AU6350300A (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-30 | Dow Chemical Company, The | Method for chemical analysis of biological material |
| WO2001020000A1 (de) * | 1999-09-10 | 2001-03-22 | Celanese Ventures Gmbh | Nucleinsäure aus tetrahymena kodierend für eine delta-6-desaturase, ihre herstellung und verwendung |
| CA2301158A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-24 | Stephen J. Allen | Screening methods for compounds useful for modulating lipid metabolism in disease |
| DK1911837T3 (da) | 2000-09-28 | 2011-08-29 | Bioriginal Food & Science Corp | FAD5-2 fedtsyredesaturasefamiliemedlem og anvendelser deraf |
| DE10102337A1 (de) | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte |
| ES2337564T3 (es) * | 2002-01-30 | 2010-04-27 | Basf Plant Science Gmbh | Metodo para elaborar acidos grasos poliinsaturados mediante un nuevo gen de elongasa. |
| US7211656B2 (en) * | 2002-01-30 | 2007-05-01 | Abbott Laboratories | Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof |
| GB2385852A (en) | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
| DE10219203A1 (de) | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
| US7078234B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| BR0317304A (pt) * | 2002-12-19 | 2005-11-08 | Univ Bristol | Processo para a produção de compostos, sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácidos, construção gênica, vetor, e, organismo |
| ATE517984T1 (de) * | 2003-02-27 | 2011-08-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
| AU2004225483B2 (en) | 2003-03-28 | 2009-07-23 | Monsanto Technology, Llc | Novel plant promoters for use in early seed development |
| EP1613746B1 (de) * | 2003-03-31 | 2013-03-06 | University Of Bristol | Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren |
| WO2004090123A2 (de) * | 2003-04-08 | 2004-10-21 | Basf Plant Science Gmbh | Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle |
| WO2005014834A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-17 | The University Of York | Fatty acid biosynthesis 3 |
| US9433228B2 (en) | 2003-08-01 | 2016-09-06 | Basf Plant Science Gmbh | Method for the production of multiple-unsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| US11952581B2 (en) | 2003-08-01 | 2024-04-09 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| EP1656449B1 (en) * | 2003-08-21 | 2009-05-06 | Monsanto Technology LLC | Fatty acid desaturases from primula |
| CA2450000A1 (en) | 2003-12-18 | 2005-06-18 | Alberta Research Council Inc. | Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil |
| CN1930277B (zh) | 2004-02-27 | 2011-02-02 | 巴斯福植物科学有限公司 | 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法 |
| EP1720988B1 (de) | 2004-02-27 | 2011-10-12 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen |
| US20050220901A1 (en) * | 2004-03-22 | 2005-10-06 | Huttenbauer Samuel Jr | Methods of pharmaceutical separation from plants |
| CN1968688A (zh) * | 2004-04-16 | 2007-05-23 | 孟山都技术有限公司 | 脂肪酸去饱和酶在玉米中的表达 |
| CN102559364B (zh) | 2004-04-22 | 2016-08-17 | 联邦科学技术研究组织 | 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸 |
| US7834250B2 (en) | 2004-04-22 | 2010-11-16 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells |
| US7364883B2 (en) | 2004-05-07 | 2008-04-29 | Yeastern Biotech Co., Ltd. | Process for producing poly-unsaturated fatty acids by oleaginous yeasts |
| ES2325837T3 (es) * | 2004-12-17 | 2009-09-21 | Agfa Graphics Nv | Sistema y procedimiento de alimentacion de tinta a un cabezal de impresion de vaiven en un aparato de impresion por inyeccion de tinta. |
| DE102004063326A1 (de) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen |
| WO2006089950A2 (en) | 2005-02-26 | 2006-08-31 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| DE102005013779A1 (de) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen |
| ATE552343T1 (de) | 2005-04-19 | 2012-04-15 | Basf Plant Science Gmbh | Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen |
| AU2006237346B2 (en) | 2005-04-20 | 2011-04-07 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| AU2006245701B2 (en) | 2005-05-10 | 2011-04-28 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| ES2550623T3 (es) * | 2005-05-23 | 2015-11-11 | Blue Horse Labs, Inc. | Cártamo con ácido gamma linolénico elevado |
| DE102005038036A1 (de) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen |
| GB2431158A (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Rothamsted Res Ltd | Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid |
| DE102005052551A1 (de) | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
| GB0603160D0 (en) | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Rothamsted Res Ltd | Nucleic acid |
| AR059376A1 (es) | 2006-02-21 | 2008-03-26 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados |
| US8629195B2 (en) | 2006-04-08 | 2014-01-14 | Bayer Materialscience Ag | Production of polyurethane foams |
| US7678560B2 (en) * | 2006-05-17 | 2010-03-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Δ 5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids |
| ES2366297T3 (es) | 2006-07-19 | 2012-01-13 | Monsanto Technology, Llc | Desaturasas de ácidos grasos de tetraselmis suecica. |
| AU2007287585B2 (en) | 2006-08-24 | 2013-08-29 | Basf Plant Science Gmbh | Isolation and characterization of a novel Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains |
| CA2661697A1 (en) | 2006-08-29 | 2008-03-06 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Synthesis of fatty acids |
| EP2182056B1 (de) | 2006-10-06 | 2015-12-23 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen nicht-humanen Organismen |
| AU2008214568B2 (en) | 2007-02-16 | 2013-04-18 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
| CA2695112A1 (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Basf Plant Science Gmbh | Elongases and processes for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| WO2009077478A2 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters from brassica napus for seed specific gene expression |
| AU2009242130B2 (en) * | 2008-04-30 | 2013-09-19 | Rothamsted Research Ltd. | Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| DE112009001585T5 (de) | 2008-07-01 | 2012-02-23 | Basf Plant Science Gmbh | Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression |
| DE112009002048T5 (de) | 2008-08-26 | 2012-01-26 | Basf Plant Science Gmbh | Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl |
| EP2358882B1 (en) | 2008-11-18 | 2017-07-26 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids |
| CA2744930C (en) | 2008-12-12 | 2018-03-20 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| MX2011010763A (es) | 2009-04-17 | 2011-12-16 | Basf Plant Science Co Gmbh | Promotor de planta operable en endosperma y usos del mismo. |
| CA2756146C (en) | 2009-04-22 | 2018-12-04 | Basf Plant Science Company Gmbh | Whole seed specific promoter |
| EP2821492A3 (en) | 2009-05-13 | 2015-04-08 | BASF Plant Science Company GmbH | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
| AU2010270309A1 (en) | 2009-07-10 | 2012-02-02 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants |
| CA3037072C (en) | 2009-07-17 | 2022-07-26 | Basf Plant Science Company Gmbh | Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof |
| DE112010005958T5 (de) | 2009-12-03 | 2013-08-14 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expressionskassetten für die Embryo-spezifische Expression in Pflanzen |
| US9388437B2 (en) | 2010-06-25 | 2016-07-12 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
| CN102250928A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-11-23 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因及其表达载体和应用 |
| AU2013246661B2 (en) | 2012-04-12 | 2018-12-20 | Rothamsted Research Ltd | Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids |
| US8946460B2 (en) | 2012-06-15 | 2015-02-03 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Process for producing polyunsaturated fatty acids in an esterified form |
| KR101437605B1 (ko) * | 2012-06-29 | 2014-09-15 | 대한민국 | 형질 전환된 유채를 제조하는 방법 |
| GB201217524D0 (en) | 2012-10-01 | 2012-11-14 | Rothamsted Res Ltd | Recombinant organisms |
| JP6554099B2 (ja) * | 2013-08-07 | 2019-07-31 | イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッドＹｅｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ． | ｐ５３変異体を再活性化することの可能なペプチド |
| SG11201604871VA (en) | 2013-12-18 | 2016-07-28 | Commw Scient Ind Res Org | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
| KR102527795B1 (ko) | 2014-06-27 | 2023-05-02 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 도코사펜타에노산을 포함하는 지질 |
| US11230578B2 (en) | 2016-02-04 | 2022-01-25 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides and use of same in the treatment of diseases, disorders or conditions associated with a mutant P53 |
| FR3053052B1 (fr) | 2016-06-28 | 2021-02-12 | Fermentalg | Microalgue modifiee pour une production enrichie en tag |
| CN112048460B (zh) * | 2020-08-07 | 2023-06-16 | 中国科学院水生生物研究所 | 工程化细鞘丝藻及其生产gla的应用 |
| GB202409759D0 (en) * | 2021-12-16 | 2024-08-21 | Bioriginal Food & Science Corp | Plants with enhanced gamma linolenic acid production |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4736866B1 (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | Transgenic non-human mammals | |
| NZ221259A (en) * | 1986-07-31 | 1990-05-28 | Calgene Inc | Seed specific transcriptional regulation |
| BR9007159A (pt) * | 1989-02-24 | 1991-12-10 | Monsanto Co | Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos |
| US5260379A (en) * | 1991-09-13 | 1993-11-09 | Eastman Kodak Company | Polyester blends with improved processability |
| PH31293A (en) * | 1991-10-10 | 1998-07-06 | Rhone Poulenc Agrochimie | Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage. |
| US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
| WO1994018337A1 (en) * | 1993-02-05 | 1994-08-18 | Monsanto Company | Altered linolenic and linoleic acid content in plants |
-
1994
- 1994-12-30 US US08/366,779 patent/US5614393A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-28 BR BR9510411A patent/BR9510411A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-12-28 DE DE69535064T patent/DE69535064T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 CA CA002207906A patent/CA2207906C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 CN CN95197728A patent/CN1117864C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 ES ES95944464T patent/ES2262146T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 AR AR33486195A patent/AR000582A1/es active IP Right Grant
- 1995-12-28 RU RU97112919/13A patent/RU2181772C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-12-28 RO RO97-01202A patent/RO121387B1/ro unknown
- 1995-12-28 EP EP95944464A patent/EP0801680B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-28 AU AU46735/96A patent/AU707061B2/en not_active Ceased
- 1995-12-28 UA UA97063197A patent/UA61880C2/uk unknown
- 1995-12-28 WO PCT/IB1995/001167 patent/WO1996021022A2/en active IP Right Grant
- 1995-12-28 JP JP52082796A patent/JP4422211B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-01-28 US US08/789,936 patent/US5789220A/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-01 JP JP2007201265A patent/JP2007330267A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2484137C2 (ru) * | 2006-01-04 | 2013-06-10 | Монсанто С.А.С. | Мутанты fad-2 и высокоолеиновые растения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9510411A (pt) | 1998-05-19 |
| WO1996021022A3 (en) | 1996-09-12 |
| AR000582A1 (es) | 1997-07-10 |
| CN1177379A (zh) | 1998-03-25 |
| DE69535064D1 (de) | 2006-07-27 |
| DE69535064T2 (de) | 2006-12-07 |
| CA2207906A1 (en) | 1996-07-11 |
| AU4673596A (en) | 1996-07-24 |
| RO121387B1 (ro) | 2007-04-30 |
| RU2181772C2 (ru) | 2002-04-27 |
| JP4422211B2 (ja) | 2010-02-24 |
| US5614393A (en) | 1997-03-25 |
| EP0801680A2 (en) | 1997-10-22 |
| CN1117864C (zh) | 2003-08-13 |
| CA2207906C (en) | 2009-12-01 |
| JPH10511848A (ja) | 1998-11-17 |
| WO1996021022A2 (en) | 1996-07-11 |
| ES2262146T3 (es) | 2006-11-16 |
| US5789220A (en) | 1998-08-04 |
| AU707061B2 (en) | 1999-07-01 |
| JP2007330267A (ja) | 2007-12-27 |
| EP0801680B1 (en) | 2006-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA61880C2 (en) | SYNTHESIS OF g-LINOLENIC ACID UNDER THE ACTION OF DELTA-6-DESATURASE | |
| Shibata et al. | Plant lipoxygenases | |
| RU2152996C2 (ru) | Фрагмент днк (варианты), вектор, способ получения растения, способ индуцирования продукции гамма-линоленовой кислоты (варианты), способ индуцирования продукции октадекатетраеновой кислоты и дельта-6-десатураза цианобактерий | |
| CN107312785A (zh) | OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用 | |
| JP2003512821A (ja) | 外来性遺伝子の転写調節方法 | |
| JPS6322191A (ja) | 遺伝子の発現方法 | |
| JP6945865B2 (ja) | Ｃａｓタンパク質発現カセット | |
| KR20080071190A (ko) | 델타-９ 일롱가제, 및 다중불포화 지방산 생성에 있어서의이들의 용도 | |
| JPH06510422A (ja) | 植物におけるポリヒドロキシアルカノコートの生産 | |
| US11345937B2 (en) | Construction of Mucor circinelloides cell factory for producing stearidonic acid and fermentation technology thereof | |
| CN101321872B (zh) | 高γ-亚麻酸红花 | |
| CN106536733A (zh) | 适于高密度栽植的植物体及其利用 | |
| CN105368851B (zh) | 一种来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶、含所述脱饱和酶的载体、重组微生物及其应用 | |
| CN105505930B (zh) | 花生Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2-1B-m基因的启动子及其制备方法和应用 | |
| CN113308481A (zh) | 一种大豆dgat2基因外显子编辑位点及其应用 | |
| TW201142021A (en) | A gene of unsaturated fatty acid synthetic enzyme isolated from marchantia polymorpha and its use | |
| Thimmaraju et al. | Morphometric and biochemical characterization of red beet (Beta vulgaris L.) hairy roots obtained after single and double transformations | |
| CN116240231A (zh) | 一种纳米酶级联反应系统及其制备方法和应用 | |
| WO2011010485A1 (ja) | エイコサノイド生産方法、並びにゼニゴケ由来のエイコサノイド生合成系遺伝子及びその利用 | |
| CN108659108B (zh) | 一种与黄金梨果顶硬化相关的nac转录因子 | |
| CN105906696A (zh) | 一个新的棉纤维发育相关基因GhEIN3的鉴定及应用 | |
| US20040103450A1 (en) | Soybean mutant strain and soybean oil therefrom | |
| CN105112419B (zh) | 花生Δ12脂肪酸脱氢酶AhFAD2-1B基因的启动子及其制备方法和应用 | |
| JP5641232B2 (ja) | オゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼの遺伝子及び該遺伝子を利用するプロスタグランジン類生産方法 | |
| CN104450748B (zh) | 糙草△6‑脂肪酸脱饱和酶ApD6D基因家族及其重组表达载体和应用 |