JPH06510422A - 植物におけるポリヒドロキシアルカノコートの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物におけるポリヒドロキノアルカノエートの生産技術分野 本発明は植物におけるポリヒドロキシアルカノエートの生産に関する。

背景技術 ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）はＤ（−）−３−ヒドロキシブチレ ートの線状ポリエステルである。

ポリ−３−ヒドロキシブチレートは１９２５年に巨大菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｎ中に最初発見された。ポリヒドロキシブチレートは種々の細菌 の細胞内軸粒中に集積する。該顆粒は細胞膜結合していると思われしかもズダン 黒色染料で染色し得る。該重合体は栄養分制限の条件下で生産されしかも炭素及 びエネルギーの貯ｔｓとして作用する。ポリヒドロキシブチレートの分子量は、 用いた微生物、生育条件及びポリヒドロキンブチレートの抽出に用いた方法に応 じて約ｓｏ　、　ｏｏｏからｉ　、ｏｏｏ、ｏｏｏ以上までに亘っている。ポリ ヒドロキンブチレートはそれが高度に還元された状態で細胞中に存在しく冥質上 不溶性である）且つ無視しうる柱小さい浸透圧を饗する故に理想的な炭素貯蔵源 である。

、ｆ！ポリヒドロキシブチレートびｂｉｔのポリヒドロキシアルカノエート例え ば、ぜソー３−ヒドロキシバレレート及びポリ−３−ヒドロキシオクタノエート は工業上かなりの蒐簀性を有する生分宸性の熱可塑性プラスチックである。

一ト”及び＠ＰＨＡ“は３−ヒドロキシブチレートの重合体、３−ヒドロキシバ レレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３ −ヒドロキシブチレ−トの如き類縁ヒドロキシアルカノエートの重合体及びまた これらのヒドロキシアルカノエートの１種以上の共重合体及び混合物を包含する 。

ポリヒドロキシアルカノエートは生分解性であシしかも土壌の微生物によって迅 速に分解される。ポリヒドロキシアルカノエートは熱可塑性であり（１８０６Ｃ で溶融する）、シかも同じ温度付近（１９０°Ｃ）で溶融する高密度ポリエチレ ンの如き他の熱可塑性プラスチック材料について確立された技法を用いて様々な 形状に容易に成形できる。ポリヒドロキシアルカノエートは埋立て（１ａｎｄｆ ｉｌｌ　）場所及び下水層板利用Ｉ！に場で分解する生分解性包装体の製造に理 想的である。該重合体は生物相溶性であり並びに生分解性であシしかも人体を含 めて哺乳類によって十分に耐性でらり：その分解生成物、３−ヒドロキシブチレ ートは哺乳類の正常な代謝物である。ポリヒドロキンブチレートは長期の分解を 必要とする医薬用途に適当とさせる人体中で緩慢にのみ分解する。

て生産されるポリヒドロキシアルカノエートはＩＣＩ社によシホリヒドロキシブ チレートとポリヒドロキシ／でレレートとの共°重合体として表遺され商標名バ イオポール（ｓＩｏｐｏｃ、）として市販されている。該重合体の性状例えばＰ ＨＢとＰＨＶとの割合は発酵に供給した基質によって決定される。該重合体は熱 加工には普通でレットの形で供給される。然しなから、ポリヒドロキンアルカノ エートは例えばポリエチレンよりも現存の方法によって製造するには隔価である 。それ故ポリヒドロキシアルカノエートの新規でより触済的な生産を提供するの が望ましい。

本発明の１目的はポリヒドロキンアルカノエートを有効に生産する材料及び方法 を提供するものである。

発明の開示 本発明によると、油檀碩物の組侠えゲノムを包含してなる、ポリヒドロキンアル カノエートの生産に適した植物であって、該ゲノムがポリヒドロキシアルカノエ ートの生産に触媒作用するのに必要な酵素をコード化する遺伝子を、目標の植物 ｋＡ胞酸成分該遺伝子の発現を方向付ける遺伝子−劾就列と一緒に含有すること からなる植物が提供される。

これらの遺伝子論節Ｔｈｅ列は生合成経路の発現を特異的に、発生中の極子に方 向付けるプロモーター配列、及び酵素を特定の細胞下小室に標的付けるトラ／グ ツ）　（ｔｒａｎｓｉｔ）　Ａプチド配列を包含する。

ポリヒドロキシアルカノエート生産の触媒作用に必要な１糎又はそれ以上の酵素 をコード化する遺伝子は、ポリヒドロキシブチレート及び他のポリヒドロキンア ルカノエートを生産するととが知られている、アルカ的な量の油を生産する種類 の植物であるのが好ましい。

か＼る植物種は周知であり、”油脂池”（ｏｉｌ−ｓｅｅｄ　）作物として簡単 に記載され、アブラナ、カノーラ（ｃａｎｏｌａ　）　、大豆及びヒマワリを包 含する。多数の油性作物の遺伝的形質転換方法は既知であシ；例えばア適当であ る。か＼る方法は文献に十分記載されてＲ知でありしかも技術的に手広く実施さ れている。

基質、アセチル−ＣｏＡからポリヒドロキシブチレートを生合成するには本明細 着での第１図に説明された３−〇障紮−触媒作用工程を包含する。

使用される３橡の酵素はβ−ケトチオラーゼ、Ｎ／’−ＤＰ結合したアセトアセ チル−ＣｏＡレダクターゼ、及びポリヒドロキシブチレートシンターゼであシ、 こ中にクローン化した時には、３？Ｉｆの遺伝子が、ぜリヒドロキシアルカノエ ートの生産を細胞重量の３０％まで促進することが°知られている。

ポリヒドロキシブチレートよシも高級なポリヒドロキシアルカノエートの生産を 特定する遺伝子が細菌中に存在することは知られている。特定の遺伝子を単離す るとこれらの高級なポリヒドロキンアルカノエートの発現を可能とする。例えば 、ポリヒドロキシオクタンエート及びポリヒドロキシブチレ−トの生産を特定す る遺伝子は細菌のゾンイドモナスオレオボランスついＣの遺伝子は細菌に広く存 在している。

本発明の実施に必要な全ての微生物は菌寄託機関から公然と入手できる。

本発明の重畳で好Ｉしい特徴はポリヒドロキシアルカノエートの発現に油脂種植 物を使用することである。

本発明者が油種作物を選択したという塩山はか＼る植物が発生中の種子で多量の アセチル−〇〇Ａ基質を天然に生産する（好気性条件下）からであシ、該基質は 通常脂肪酸の合成に使用される。この基質をポリヒドロキシアルカノエートの生 産に５決すると、種子によって貯蔵される油の量を低下させるが、細胞の代謝の 他の観点には最小限の影響を及ぼすものである。それ故、油脂り子中にポリヒド ロキシブチレートの如きポリヒドロキシアルカノエートを工業上採算の合う量で 生産することができる。

作物で発現させ得ることが従来氷製されているが、これは成る問題を呈する。か ＼る作物でのポリヒドロキンアルカノエートの生産を最適とするためには、澱粉 の合成をダウンレギュレートすることが恐らく必要であろう。然しなから、この ダウンレギュレーションを行なったとしても、増大した割合のアセチル−ＣｏＡ 基質の生産を保証しなりものである。更には、この増大された生産が実際に達成 されたとしても、澱粉作物での呼吸によりアセチル−ＣｏＡが急速に利用される ことがあ）得る。

高級植物における発現のためには、細菌（例えばアルカリＭＡｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　）の遺伝子は適当なプロモーター配列及びターミネ ータ−配列を必要とする。種々のプロモーター／ターミネータ−が使用するのに 利用される。構成発現にはカリフラワーのモザイク　ウィルスＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーター及びｎｏｓ　ターミネータ−を使用し得る。然しなから、アブラナの 胚芽の如き油脂種子の発生中の油貯蔵器官に対してのみ、セリヒドロキシアルカ ノエートの合成を目標とするのが好ましい。菜種の貯菫タン白質、ナピンのプロ モーターを用いてポリヒドロキシアルカノエート遺伝子の胚芽特異的発現を得る ことができる。脂質が形放されっ＼ある時の特定の期間中にポリヒドロキシアル カノエ−ト遺伝子を発現させると、利用し得るアセチル−ＣｏＡに対してポリヒ ドロキシアルカノエート酵素によシ有効な競合を確保するものである。この期間 に脂肪酸合成遺伝子の発現が切換えられる該合成遺伝子のプロモーターはかくし てポリヒドロキシアルカノエート遺伝子プロモーターとして使用するには最も適 任な候補である。か＼るプロモーターの例はアブラナのアシル担体タン白質（Ａ ＣＰ）の種子特異的イソ型又はβ−ケトアシルＡＣＰレダクターゼのプロモータ ーである。

ポリヒドロキシアルカノエート遺伝子を真核細胞に挿入するには、該酵素を定置 させる最も適当な細胞下小室に考慮を払わねばならない。２つの要素が重要でア シ；即ちアセチル−ＣｏＡ基質の生産位置及びポリヒドロキシアルカノエート重 合体の貯蔵に利用し得る空間が重要である。

例えば、発生中の菜糧胚芽で脂肪酸の合成に必要とされるアセチル−ＣｏＡ基質 は２通シの工程によって生産される。第１の直接的な工程は色素体中に位置した ピルベートデヒドロゲナーゼ酵素の活性を伴なう。第２の工程はミトコンドリア のピルベートデヒドロゲナーゼによるアセチル−ＣｏＡの初期生産、遊離アセテ ートへの溶解及び該アセテートの色素体中への拡散（色素体中でアセテートはア セチル−ＣｏＡシンターゼによＦ）　ＣｏＡに再エステル化される）を伴なう。

菜種はまた細胞質ゾルのシトレートリアーゼ酵素の活性を介して、色素体中にお けるよりも低い割合でだが細胞質ゾル中にアセチル−ＣｏＡ基質を生産する。

基質の供給を考慮するに、細Ｍ（例えばアルカリ菌、Ａｌｃａｌｉ　ｅｎｅｓ　 ）のβ−ケトチオラーゼ＃素は呼吸の必要量よシも過剰に生産されたアセチル− ＣｏＡを用いてミトコンドリア中で又は細胞質ゾル中で機能し得る。

かくして本発明の調節配列はβ−ケトチオラーゼ遺伝子の発現をミトコンドリア に又は細胞質ゾルに方向付は得る。然しなから、この酵素を、最高割合のアセチ ル−ＣｏＡ発生が生起する色素体に目標付けるのが好ましい。

ミトコンドリアにはポリヒドロキシアルカノエート重合体を貯蔵するに十分な空 間がない。色素体には、少なくともアブラナの胚芽には有意な貯蔵空間が存在す る。最大の貯蔵空間は細胞質ゾルに存在し、その小室は通常油性体で占められて いる。

アセトアセチル−ＣｏＡ又はヒドロキシブチリル−ＣｏＡ経路の中間体が色素体 から細胞質ゾルに輸送され得るかどうかは知られていない。確かに、該中間体が ＣｏＡエステルとして色素体の包膜を横断することはできないであろう。輸出に は、アセトアセテート又はヒドロキシブチレート基が色素体から脂肪酸の輸出に 伴なう輸送系によって認職されることを必要とするであろう。これらの輸送系は 次の工程’：　ＣｏＡエステルの溶解、遊離酸の輸出、及び細胞質ゾルにおける ＣｏＡヱステルの再合成；あるいはアシル基のカルニチンへの移送及びアシルカ ルニチンの輸出を包含すると示唆される。これらの反応ｔ１Ｍｋの１つによって アセトアセチル基を色素体から椙出し得るならば、その時はβ−ケトチオラーゼ を色素体に目標付け、脂質合成に予定されたアセチル−ＣｏＡを利用し且つアセ トアセチル−ＣｏＡレダクターゼ及びポリヒドロキシブチレートシンターゼを細 胞質ゾルに目標付けてこのよシ広々とした小室中で重合体の合成を達成し得る。

アセトアセテート基又はヒドロキシブチレート基の何れも色素体から輸出し得な いならば、ポリヒドロキシアルカノエートを合成するには、３種の経路酵素全て が同じ細胞小室中で発現されるように３８［の経路酵素をこの細胞小器官に目標 付けることを必要とするであろう。

ポリヒドロキシアルカノエートの合成に３種の細菌（例えばアルカ！Ｊ　爾Ａｌ ｃａｌｉｇｅｎｅａ　ｅｔ咀シ」エラー）性酵素を！物色素体に目標付けするた めには、トランジットはプチドと呼ばれる特異的目標付けの調節要素の使用を必 要とする。色素体基質を目標とする配列の可能な供給源は次の成分についての遺 伝子である。

（、）　リブロース　ビスホスフェート　カルボキシラ°−ゼ／オキシゲナーゼ 小サブユニット（ＲＵＢＩＳＣＯｓｓｕ　）　；（ｂ）　アシル担体タン白質（ ＡＣＰ）；（ｃ）　β−ケトアンルＡＣＰレダクターゼ（ｄ）　エノールビルビ ルフキメート−３−ホスフエートンンターゼ（ＥＰＳＰＳ　）　； （、）　フラクトース　１，６−ピスポスフアターゼ。

コレラノウチでＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットすランジットスプチドはポリペプ チドを光合成組織と非光合成組織との両方における色素体に方向付けることが示 された。ＡＣＰ及びβ−ケトアシルＡＣＰレダクターゼのトランジットペプチド はまたアブラナ胚芽の如き植物中で有効に作動するものである。３ｆｉのポリヒ ドロキシアルカノエート遺伝千金てについて同じ色素体トランジットペプチドを 使用する利点は、遺伝子の取込みにおける何れかのバラツキは使用されるトラン ジットにプチドに因るものでないことを確保することである。

若干のタン白質はトランジットはゾテド単独にょっ゛Ｃ色素体基質に有効に目標 付けられると思われるけれども、他のタン白質は成熟タン白質のアミノ末端の２ ０個までのアミノ酸の存在をも必要とする。成熟配列の存在が必要とされること は輸送されるタン白質の大きさ及び装入量に応じて決まると思われる。

植物組織中でポリヒドロキシアルカノエート重合体の合成を得るには、酵素β− ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ及びポリヒドロキシブチ レートシンターゼについて３種の遺伝千金てを発現する植物を得ることが必要で ある。これは次の方策の１つを用いることによシ達成できる： ｉ）植物は３種の、Ｐリヒドロキシアルカノエート経路の遺伝子を用いて１０々 に形質転換させ得る。個々の遺伝子を含有する植物を温室中で生育させ且つ又差 授粉させて２−の経路遺伝子を含有する／・イブリッド植物を得る。次いでこの 方法を反復して３種の遺伝千金てを含有する・・イブリッド植物を製造する。

（１）植物は個々の経路遺伝子を含有するシラスミドを用いて順次形質転換させ 得る。

の経路遺伝子を同じ植物中に同時形質転換させ得る。

４Ｖ）　植物は２種又は３＆の経路遺伝子を含有するプラスミドを用い゛Ｃ形質 転換させ得る。

これら技法の組合せを用いて単一植物中で３種の遺伝千金ての発現を達成し得る 。子孫が３樵の遺伝千金てについて同型接合となるまで連続した回数の交差授粉 を行なう。前記の方法（１）及び（ｌｉｉ）については、２種又は３種のポリヒ ドロキシアルカノエート経路の遺伝子を含有する植物の選択を容易とするのに相 異なる選択し得る標識遺伝子を含有するベクター中に各々の遺伝子を挿入するの が有利である。選択し得る遺伝標識の例ハカナマイシン、ハイグロマイシン、ス ルホンアミド及ヒパイアラホス又はホスフィノトリシンに耐性を付与する遺伝子 である。

添附図面を参照しながら単に例゛として本発明を以下に記載する。

図面の簡単な説明 第１図はアルカリ菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおけるポリ ヒドロキシブチレート生産の経路を示す；第２図はアルカリ菌Ａｌｃａｌｉｇｅ ｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　ＤＮＡの５．２　ｋｂ　ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ　 フラグメントの物理的地図であり；第３図は植物発現ベクターｐＪＲ１ｉの地図 であシ；第４図は３３ｕトランジツトはプチドーケトチオラーセ構造体の形成中 に生産された３ａ［のＰＣＲ生成物のブザ／プロット分析を示し； 第５図はタバコの葉におけるβ−ケトチオラーゼ酵素活性の図表であシ； 落６図はタバコの葉におけるＮＡＤＰアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ酵素活 性の図表である。

実施例 ３種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生合成遺伝千金てをコード化す る５、２　ｋｂ　ＳｍａＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントをアルカリ菌Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓから前もって単離した（　５ｃｈｕｂｅｒｔ らのＪ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７０゜１９８８　）。ベクターｐ（Ｊｃ９に ューイングランドの生物研究所）中にクローン化したこの７ラグメントをブルー スクリプトＫＳ　−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　）中にクローン化した２、３　ｋ ｂ　ＰｓｔＩサブフラグメントと一緒に西ドイツ、ゲッチンゲン大学のＤｒ　５ ｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌによって提供した。

該フラグメントの制限地図を第２′図に示す。β−ケトチオラーゼ、アセトアセ チルＣｏＡレダクターゼ及びポリヒドロキンブチレート（ＰＨＢ）シンターゼに ついて制限部位の位置及び遺伝子を示す。

タバコ及びアブラナ植物中のＰＨＡ生合成遺伝子の衝成発現を得るのに遍んだ発 現ベクターはｐＪＲｌｉである。

このベクターはＰＨ入遺伝子の挿入を可能とするのに多重クローン化部位によっ て分離されたカリフラワーモザイクウィルスのＣａＭＶ３５Ｓ　プロモーター及 びｎｏｓターミネータ−を含有する。該ベクターは選択し得る遺伝標識としてカ ナマイシン耐性ｎｐｔ　ｒｉ遺伝子も含有する。第３図は植物発現ベクターｐＪ Ｒ１ｉの地図である。

（フタ−ｐＪＲＩＲｉもまた利用され：このベクターは反対の配向に発現カセッ トを含有する。

全ての定常な分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋらの技術（１９８９、Ａ　１ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、第２版）であった。

オリゴヌクレオチドは応用バイオシステム３８０Ｅ　ＤＮＡ合成器で全て合成さ れた。用いたＰＣＲ合成器はテクネ（Ｔｅｃｈｎｅ　）　ＰＨＣ−１プログラマ ブル　ドリーブロック（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋｓ）で あった。Ｔａｑポリメラーゼをパーキ７−　ｘ　ル？　−／セタス（Ｐｅｒｋｉ ｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕ＋）から得た。制限酵素及び他の修飾醇累はニューイ ングランドバイオラブ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）、Ｇｉｂ ｃｏ／ＢＲ［、、ノーサンプリアバイオロジカルズリミテッドアンドファル？シ ア（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＬｉｍｉｔｅｄ　ａｎｄ 　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）から得°られた。配夕１ｊ決定キットハケンプリソジ ・；イオサイエンス（シークエナーゼ）及びプロメガ（タクトラック）から得ら れた。全ての放射性同位元素はアメルンヤム　インターナショナル（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　）社によって供給された。

β−ケトチオラーゼ遺伝子ｈ　ｐｋＳ−＝２．３Ｐ７　ｏ　２．３ｋｂＰｓｔＩ フラグメントから１．３ｋｂ　Ｐｓｔｒ−ＰｌｅＩ　７ラグメントとして単離さ れた。このフラグメントをフレノウフラグメントで平滑末端とさせ、ｐＪＲＩｉ の脱燐酸化Ｓｍａｒ　部位に挿入した。得られるプラスミドをｐＪＲｌｉＴと表 示した。組換えプラスミドはプローブとして１．３ｋｂ挿入フラグメントを用い てコロニーハイブリット形成によって同定された。組換え体の制限地図はセンス の配向で単一のβ−ケトチオラーゼ挿入断片を含む組換え体を示した。挿入断片 の配向は、ＣａＭＶ　３５　Ｓ　プロモーターの３′末端にハイブリッド化した ゾライマーを用いて配列決定によってｖｉ認された。

１．２、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼアセトアセチル−ＣｏＡレダクタ ーゼ遺伝子はｐｋＳ：：２．３Ｐ７から０．９　ｋｂ　ＡｖａＩＩ−ＸｍｎｌＩ フラグメントとして単離された。このフラグメントをｐＪＲＩｉＴについて記載 される如（ｐＪＲｌｉ中に挿入した。然しなから、組換えシラスミド中の挿入フ ラグメントの配向は適当な制限酵素部位の入手不能性によシ制限地図によって確 認し得なかった。それ故ＣａＭＶ　３５　Ｓ　３’プライマーを用いて４種の組 換え体を配列し、これらのうち１ｍはセンス挿入断片を含有することが見出され た。このプラスミドをｐＪＲｌｉＲと表示した。

１．３．　ＰＨＢシンターゼ ＰＨＢシンターゼ遺伝子はＢｓｔＢＩ−３ｔｕＩ　フラグメントとしてｐｋＳ− ：：　２．３　Ｐ７から単離された。この７ラグメントを平滑末端とさせ、ｐＪ ＲＩｉＴ及びｐＪＲＩｉＲについて記載される如（ｐＪＲＩｉ中に挿入した。セ ンス配向で単一の挿入断片を含有する組換え体（ｐＪＲＩｉｓ）シラスミドの同 定は制限地図によって及びＣａＭＶ　３５　Ｓ　３’プライマーでの配列決定に よって確認された。

ＰＨ８経路酵素の各々について成分ポＩＪ−？プチドの色素体中への運搬は遺伝 子配列の５′末端にトランジットズプチド配列を付加することにより達成し得る 。

仕立°〔るべき第１の遺伝子はケトチオラーゼであった。ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＢ）を伴なう技術を用いて、ケトチオラーゼ遺伝子を有するフレームにエ ントウ豆のＲ［ＪＢＩＳＣＯ小サブユニット　トランジットにプチドを結合させ た。

ケトチオラーゼ遺伝子にトランジットＲプチドを結合するには３通りの実験を包 含した。第１の実験はトランジットハプチド配列の３′末端にケトチオラーゼ遺 伝子の５′末端の小部分を付加した。第２の実験はケトチオラーゼ遺伝子の５′ 末端にトランジットにプチドの３′末端の小部分を付加した。第３の実験は前述 の実験で製造したオーパーツ・ングを利用して結合を延長させ且つケトチオラー ゼ遺伝子付きのフレームに結合した全長ノドランジットにゾチドを製造する。４ 種のＰＣＲゾライマーを設計した。− １、トランジツ）　Ｏゾチドの３′末端に向かって延長させるトランジットはプ チドの５′末端：ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＧＡ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　 ＣＴＴ　Ｃ／ｋＧ　ＣＴ２、トランジットハゾチドの５′末端に向かって延長さ ぞ得るケトチオラーゼ遺伝子の５′末端に結合したトランジットはプチドの３′ 末端： ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＧＴＣＡＴＧ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＣ Ｔ　ＣＴＴＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＣＴＴ　ＧＴ３、　ケトチオラーゼ遺伝子 の３′末端に向かって延長させ得るケトチオラーゼ遺伝子の５′末端に結合した トランジッ）　６プチドの３′末端： ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＡＧＣＡＡＴ　Ｇ（ｌｒＴ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＡ　ＡＡＧ 　ＴＧＣＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＣＧＴＴ　ＧＴＣＡＴＣＧＴ４、　ケトチオラー ゼ遺伝子の３′末°端：ＡＣＣＣＣＴ　ＴＣＣＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＣＴＣ ＧＡＣＴ抛ｌの実験については、鋳型ＤＮＡは９８Ｍ６４　（）う／ジットＲプ チド配列）でちり、プライマーは６５６Ｃのアニーリング温度でＴＰＩ及びＴＰ ＫＢであった。誘導されたＰＣＲ生成物をアガロースゲル上に流出させ、１９９ ｂｐに対応するバンドを切出し、アガロースゲルｉ＝ら電気溶出した。

第２の実験においては、鋳型ＤＮＡはｐｋｓ　：：　２．３　Ｐ７でちり、包含 されるプライマーはＴＰＫＴ及びに１でｓｂ、アニーリング温度は６８°Ｃであ る。ＰＣＢ反応の生成物を再びゲル上に流出させ、所要の１．２０７　ｋｂ　、 ζンドを単記し且つゲルスライスから電気溶出した。

第３の実験では鋳型として前記の実験力１ら単離したＤＮＡを利用し且つプライ マーＴＰＩ及びに１を利用した。

アニーリング温度は６５″Ｃであり、このＰＣＲ実験はきわめて無能であるけれ ども若干の全長生成物（１，３５２ｋｂ）が炒成された。

３種のＰＣＢ生成物の各々の小部分をアガロースゲ化上に流出した。プローブと してオリコ゛ス（ｏＬｉｇｏｓ　）の３ａｆ　（ＴＰＩ、　Ｋｌ　及ヒＴＰＫＴ 　）を用いて”ｊ”ｊ’７７’ｏ　ノド分析を行なった。結果を第４図に与え、 第３の反応の生成物はトランジットぼプチドの５′末端、３′トランジツトａプ チド及び５′ケトチオラーゼ遺伝子のオーツ２−ラップ及びケトチオラーゼ遺伝 子°の３′末端を含有することを示す。

ＰＣＲは塩基の誤対合を有し得ることは知られているのでこの生成物の配列を点 検するのが必要であった。

ＰＣＲ生底物を平滑末端とさぞ、切断したＳｍａ　Ｉ及びホスファターゼ化した ｐＵ０１８中にクローン化した。ＰＣＲ生成物を含有する６個のクローンを同定 した。普遍の及び逆プライマー（シークエナーゼキット及びタクトラックキット ）を用いてクローンを配列決定した。遺伝子内でＴｔｈＩＩ１１制限部位までト ランジットＲプチド及びケトチオラーゼ遺伝子の５′末端を通して完全に正確な 配列を有するクローンを同定した。これらのクローンの１種からＴｔｈＩＩｌｌ −Ｋｐｎｌ　７ラグメ／トを切出した。

Ｋｐｎ１部位を切シ詰めて平滑末端を与え、ケトチオラーゼ遺伝子の主要部分に 対応するｐｋＳ−：：　２．３　Ｐ７　からのアルカリ’［Ａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈ’ｕｓ　ＤＮＡのＴｔｈｌｌｌｌ　−５ｍａｌフラグメン トを挿入した。正のクローンを結合内に配列決定した。トランジットＲプチドー ケトチオラーゼフラグメントを切出し、ｐＪＲＩＲｌに挿入した。

トランジットハプチドーレダクターゼ構成体については、ＰＣＲをまた利用した 。この構成体には、ＤｄｅＩ部位（トランジットにプチド及びレダクターゼ配列 に特異）が遺伝子の５′末端近くに存在するので唯１つのＰＣＢ実験を必要とし た。ＰＣＢ実験は２穐のプライマーを要したニー １．３′末端に向かって延長させ得°るトラ／ジットはプチドの５′末端に相同 性の配列。Ｃ１ａ　Ｉ部位を配列５′〜トランジントハプチド配列に組込んだ。

ＡＣＣＡＴＣＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＧＡ　’ｒＡＴ　Ｃ ＣＴ　ＣＴＴ２．５’）う／ジットハゾチドに向がっ゛Ｃ延長させ得るように３ ′トランジットハプチド配列付きのフレームに結合した、レダクターゼ遺伝子中 の丁度通ったＤｄｅ１部位に相同性の配列。

ＡＴＧ　ＣＧＣＴＧＡ　ＧＴＣＡＴＧ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡ 　ＣＣＡＴＴＧ　ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＡＴ これらの２種のプライマー及び鋳型としてトランジットハプチドＤＮＡを用いる ＰＣＲ後に、１９５ｂｐ生成物をアガロースゲル上に同定し、電気溶離にょシ単 離した。ＤｄｅＩ　Ｘｍｎ１レダクターゼ遺伝子を単離し、ＤｄｅＩで切断した ＰＣＢ生成物に結合させた。アガロースゲル電気泳動後に、１．０６３　ｋｂバ ンドを単離し、Ｃ１ａＩで切断し、Ｃ１ａｌ　ｇｃｏＲＶブルースクリプトＳＫ （→中に結合させた。ポジティブ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ＋ｓ）が特徴とされる。

３、ＰＨＢ遺伝子を用いての植物の形質転換次の如く直接的な取込みによシセシ ウム純度のｐＪＲＩｉＴ　、ｐＪＲＩｉＲ１ｐＪＲＩｉｓ及びｐＪＲＩｉを個々 に−）を接種した。培養物を６６０　ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が０．５となる まで大体１６時間２８’Ｃで振盪培養した。

細胞を遠心分ｈ　（３０００ｒｐｍ、　５ｏｒｖａｌｌ　ＲＴ　６０００Ｂ、　 ６　分。

４６Ｃ）によシ回収した。これらの細胞を２５０μｔの氷冷２０　ｍＭ　ＣａＣ ｌ２中に再懸濁させた。次いで細胞懸濁物を０．１−の分量で予備冷却済みのエ ラはンドル７管に分配した。大体ｌμｇのセシウム純度のプラスミド’　ＤＮＡ を各々の管に添加した。次いで細胞に液体窒素中での凍結によシ熱ショックを与 え続いて３７’Ｃで５分間培養した。しＢ培地（１−）を添加し、細胞を２８’ Ｃで３〜４時間振虐培養にょシ回収させた。細胞のはレットは遠心分＝　（１１ ，５００９Ｌ、ｓ　ｏ秒、２０”Ｃ）にょシ得られ、０．１−のしＢに再懸濁さ せた。組換え細胞を、カナマイシン（５０μｇ／−）、ストレプトマイシン（５ ０μｇ／＋Ｒｔ）及びり７アムピシン（１００μｇ／　ｒｎｔ）を含有するしＢ （寒天で固化した）上で選択し、続いて２８°Ｃで培養した。

次いで得られるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｊｕｍ　’ｆｉ１株のミニーゾレゾ（ｍ１ ｎｔ　−ｐｒｅｐ　）　ＤＮＡを＄ｌａし、制限酵素消化にょシ分析して転位が 生起しなかったことを確認した。

３．２．植物の形質転換 タバコの葉片及びアブラナの葉柄に菌株しＢＡ４４０４／ＪＲＩ５　ＬＢＡ４４ ０４／ｐＪＲＩｉＴ、［、ＢＡ４４０４／ｐＪＲＩｊＲ及びしＢＡ４４０４／ｐ ＪＲＩｉｓを個々に接種した。植物は２５″ｃの温度及び１６時間の光周期で生 ゛育室中で栽培した。

の次亜塩素酸ナトリウム中で殺菌し、滅菌水で洗浄し−ＣからＭＳ培地（Ｉｍｐ ｅｒｉａｌ　）　（３％ショ糖及び０．７％の植物寒天（Ｇｉｂｃｏ　）を含有 する）上で発芽させた。子葉を５日令の幼苗から切除し、その葉柄を前記の如く ＭＳ培地に配置するが、４．５μｇ／−のベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を補 充した。子葉をこの培地中で２４時間栽培し、その後にそれらの葉柄をＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液中に浸漬した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物をカ ナマイシン（５０μｇ　／　ｍｌ　）含有しＢ培地中で一夜生育さぞ、それに続 いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞をＲレット化し液体のＭＳ培地で洗浄し、 ０Ｄ５５Ｑ０．１に希釈した。接種した葉柄を４．５μｇ／ｄＢＡＰ含有ＭＳ培 地ｐご戻し、栽培室で２時間培養した。次いでＢＡＰ　（４，５μｇ／ｍｇ）、 カルベニシリン（Ｄｕｃｈｅｆａ　）　（５００μｇ／ｍ　）及びカナマイシン （１５μｇ　／　ｍｌ　）を補充したＭＳ培地に子葉を移送した。

生の仮皮及び最後には石板が生成されるまで子葉を２週毎にこの培地上で継代栽 培した。石板を切除し、温室に移送するまでカルベニシリン（５００μｇ　／ｍ ｌ　）及びカナマイ７ノ（１５μｇ／ｒｎｔ）含有ＭＳ上で栽培した。

タバコＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ　ＳＲＩの種子を前記の如く 殺菌し、ＭＳ培地（３チのショ糖及び０，８％のバクドアガルを含有する）上で 発芽させた。次いでこれらの幼苗からの石板先端をこの培地上で微小繁殖させて 形質転換研究用の植物を与える。゛これらの植物からの浸出さぞ、次いで３％の ショ糖と０．８−のバクドアガルと１　μｇ７ｍｌ　＋７）　ＢＡＰと０．　Ｉ 　Ａｇ／ｍｌ　ノＮＡＡとを含有するＭＳ培地上で２日間栽培した。次いで葉片 をカルベニシリン（５００ｔｔｇ／　ｍｌ　）及びカナマイシｙ　（１００μｇ ／Ｔｎｔ）を補給した同じ培地上で５週間栽培した。再生した石板を切除し、３ ％のショ糖、０．８％のバクドアガル、２００μｇ／ｙｄＬＤカルベニシリン及 び１１００ｔｔ／−のカナマイシンを含有するＭＳ上で５週間２回経過させて栽 培させてから温室に移送した。

カナマイシン耐性のタバコ及びアブラナ植物がＪＲＩｉ、ＪＲＩ　ｉＴ　１ＪＲ Ｉ　ｉＲ及びＪＲＩｉＳ　’ｔ’個ｋ　Ｋ形質転換した植物について得られた。

３．３．共形質転洪 アブラナの子葉及びタバコの葉片にまたＡｇｒｏｂｌＬｃｔｅ−−口」二菌株の 混合物を接種した。これらの接種は、同じ光学密度の希釈したＡｇｒｏｂａｃｔ ａｒｉｕｍ培養物の１＝１混合物を接種直前に調製する以外は前記の如く行なっ た。

ＰＨＡ経路酵素の発現は酵素活性検定によって検出された。酵素ポリＲプチドの 存在もウェスタンプロット分析によって検出された。

酵素ポＩＪ　６プチドの分析にっＡｏては、ラビットのボｅｕｔｒｏｐｈｕｓか らのＷ’Ｍ済みβ−ケトチオラーゼ及びＮＡＤＰアセトアセチルＣｏＡレダクタ ーゼ酵素に対して上昇させた。１１８Ｍをはレット化し、洗浄し、粗製の抽出物 をＨａｙｗｏｏｄ及びＬａｒｇｅ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ＊　１９９．１８７〜 ２０１、１９８１　）によって記載される如＜ｐ４ｉした。β−ケトチオラーゼ ＡはＨａｙｗｏＯｄらによって記載された方法の改良法（１９８Ｌ　ＦＥＭＳ　 Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌ＠ｔｔｅｒｓ。

５２、９１〜９６）を用いてヒドロキシルアパタイト上でのクロマトグラフィー 、続いてＦＰ［、ＣモノＱ上でのアニオン交換クロマトグラフイー、続いてスー パーデッラスＳ　−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社裏）上でのゲルｆ’過によっ °〔精製された。Ｎ入ＤＰアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、２’、５’ 　ＡＤＰセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上での追加のアフィニティー クロマトグラフィ一工程と共ｔこ同じ技術を用いて精製された。精製されたタン 白質はＬａｅｍｍｌｉの方法（１９７０，Ｎａｔｕｒｅ、　２２２．６８０〜６ ８５）によジナトリウム　ドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ＳＤＳ　ＰＡＧＦ、）操作を施した。

最終のβ−ケトチオラーゼ製剤は４１　ｋｄでクーマシープルで染色した単一の バンドを示した。最終のレダクターゼ製剤は２６ｋｄで主要なバンドを示した。

３岬の精製済みケトチオラーゼ及び２岬の′ａ製済みレダクターゼは調製的ＳＤ Ｓ　ＰＡＧＥを受けた。２′ＰＭの酵素に対応するバンドをゲルから電気溶離さ ゛せ、ラビットに注射し゛Ｃポリクローナル抗体を上昇させた。注射に続い゛〔 −次出血及び二次出血からの血清は粗製のＡｌｃａ±１虹と１抽出物のウェスタ ンプロット分析を介してそれらの標的酵素に特異的な抗体を含有することを示し た。

１　ｍＭのジチオトレイトールを含有する５０ｍＭの燐酸カリウム緩衝剤１７． ０）中でタバコの葉組織を粉砕することによシタバコの葉の粗製抽出物を調製し た。

３０．０００９−での遠心分離後に、ケトチオラーゼ及びアセトアセチルＣｏＡ レダクターゼについての酵素検定はＨａｙｗｏｏｄらによって記載された方法（ １９８８，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、５２．９１〜 ９６　；　５２，２５９〜２６４）によシ上澄液の分割量について実施した。Ｐ ＨＢシンターゼ検定はＨａｙｗｏｏｄらの方法（１９８９，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ ｏｂｉ−ｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　５７．１〜６　）によシ、３０．００ ０　Ｐ上澄液の分割量について行ない且つ抽出緩衝液に再懸濁したＲレットの分 割量について行なった。

ウェスタンプロット分析については、３０．０ＯＯＰ上貨み液の分割量をＳＤＳ 　ＰＡＧＥにかけしかもニトロセルロースフィルターに電気泳動的に転移した。

次いでフィルターをＴＢＳ　（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７，９，１５ ０ｍＭＮＸＣ２）中でゆすぎ、ＴＢＳ＋５％ウシの血清アルブミン中で培養した 。アンチ−ケトチオラーゼ又はアンチ−レダクターゼ血清と反応するタン白質は ２−の類縁血清を含有する１００−のＴＢＳ中で１〜２時間フィルターを培養す ることにより検出された。結合した第１の抗体は続いてヒツジのアンチ−ラビッ トＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体及びニトロブルーテトラゾリウムアル カリ性ホスファターゼ発色試薬（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏ　−ｒａｔｏｒｊｅｓ 社）を用いて検出された。

最初の生化学的分析は組織培養で生育中の継代培養したタバコ植物で実施した。

ＪＲＩ　ｉケトチオラーゼで形質転換したカナマイシン耐性植物１８種を酵素分 析にかけ、結果を非形質転換の対照植物と比較した。同じ大きさの葉を抽出した 。

第５図はタバコの葉におけるβ−ケトチオラーゼ酵素活性を示す。個々の植物の 識別番号はＸ軸に示す。

点線の左側にある植物は非形質転換対照植物である。

点線の右側にある植物はＪＲＩ　ｉケトチオラーゼで形質転換されている。

低レベルのケトチオラーゼ活性が非形質転換植物植司で検出された。ＪＲｌｉ　 ケトチオラーゼで形質転換した植物の殆んど全てが対照植物よシも高いケトチオ ラーゼ活性を有した。最高のケトチオラーゼ活性は３４ｎｍｑ　［／分／キタン 白質であシ、最高の対照植物よシも２．８倍［い。ウェスタンプロットにおいて は、抗ケトチオラーゼ抗体は非形質転換植物タバコ植物において４１ｋｄでポリ はプチドを検出し、恐らくは内因性のケトチオラーゼ酵素活性に相当するもので ある。４１ｋｄ４ぜ１Ｊ　、、ｌプチドはまたＪＲｌｉ　ケトチオラーゼ形質転 換した植物の抽出物中に検出されたけ°れども、ウェスタンプロットは非形質転 換植物から形質転換植物を定量的に区別し得なかった。

第６図は組織培養で生育させたタバコ植物の葉におけるＮｋＤＰアセトアセチル ＣｏＡレダクターゼｉ＊ｘ活性を示す。個々の植物の識別番号はＸ軸に示す。点 線の左側の植物は非形質転換の対照植物である。点線の右側の植物はｐＪＲ１ｉ レダクターゼで形質転換されている。

低いレベルのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ活性が非形質転換の対照植物で 検出された。ＪＲ１ｉレダクターゼで形質転換させた２１種の植物の殆んど全て が対照植物よシも高いレダクターゼ活性を有した。最高のレダクターゼ活性は３ ０ｎｍｏｌ／分／ηタン白質であり、最高の対照植物よシも４倍高い。ウェスタ ンプロットにおいては抗レダクターゼ抗体は非形質転換対照植物の抽出物におい て２６ｋｄのｍ、Ｗ、で何らのポリはプチドを検出しなかった。然しながら２６ ｋｄポリはゾチドはＪＲＩ　ｉ　レダクターゼ形質転換植物の抽出物中で検出さ れた。それ故タバコの葉における細菌性レダクターゼ遺伝子の発現は証明された 。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　７ ＜！Ｌｅ＜６　加／ｇ／　１（ｎｕｌｌ）ｉ　翌ｆ　音知（Ｗｅ／６　”　／Ｈ ／　ｌ０ＩＯＬ＋）’ｉ　’４　Ｊ　蓄％手続補正書 平成６年７月６日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリヒドロキシアルカノエートの生産に適し且つ油糧植物の組換えゲノムを 包含してなる植物であつて、該ゲノムがポリヒドロキシアルカノエートの生産に 触媒作用するのに必要な酵素をコード化する遺伝子を、目標の植物細胞成分に該 遺伝子の発現を方向付ける遺伝子調節配列と一緒に含有することからなる、ポリ ヒドロキシアルカノエートの生産に適した植物。
2. ２．ポリヒドロキシアルカノエート生産の触媒作用に必要な１種又はそれ以上の 酵素をコード化する遺伝子は微生物から単離される請求の範囲１記載の植物。
3. ３．微生物はアルカリ菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ属の微生物 である請求の範囲２記載の植物。
4. ４．次いで油糧植物はアブラナ、カノーラ（ｃａｎｏｌａ）、大豆及びヒマワリ よりなる群から選ばれる請求の範囲１記載の植物。
5. ５．前記の酵素はβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ及 びポリヒドロキシブチレートシンターゼよりなる群から選ばれる請求の範囲１記 載の植物。
6. ６．前記の遺伝子調節配列はポリヒドロキシアルカノエート遺伝子の発現を油貯 蔵器官に方向付ける請求の範囲１記載の植物。
7. ７．発現は発生中の油貯蔵器官に方向付けられる請求の範囲６記載の植物。
8. ８．発現は胚芽に方向付けられる請求の範囲６記載の植物。
9. ９．前記の遺伝子調節配列はポリヒドロキンアルカノエート遺伝子の発現を細胞 質ゾルに又はミトコンドリアに又は色素体に方向付ける請求の範囲１記載の植物 。