ES2327897T3 - Produccion de polihidroxialcanoato en plantas. - Google Patents
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Abstract
Una planta adaptada para la producción de polihidroxialcanoato que comprende un genoma recombinante, genoma que contiene un gen o genes que codifican una enzima o enzimas necesarias para catalizar la producción de polihidroxialcanoato junto con una secuencia reguladora de gen que dirige la enzima a un plástido.
Description
Producción de polihidroxialcanoato en
plantas.
Esta invención se refiere a la producción de
polihidroxialcanoato en plantas.
Poli-3-hidroxibutirato
(PHB) es un poliéster lineal de D(-)-3
hidroxibutirato. En primer lugar se descubrió en Bacillus
megaterium en 1925. El polihidroxibutirato se acumula en
gránulos intracelulares de una amplia variedad de bacterias. Los
gránulos dan la apariencia de estar unidos a membrana y se pueden
teñir con colorante Negro de Sudán. El polímero se produce en
condiciones de limitación de nutrientes y actúa como una reserva de
carbono y energía. El peso molecular del polihidroxibutirato varía
de aproximadamente 50.000 a mayor de 1.000.000, dependiendo de los
microorganismos implicados, las condiciones de crecimiento y los
métodos empleados para la extracción del polihidroxibutirato. El
polihidroxibutirato es una reserva de carbono ideal ya que existe
en las células en un estado altamente reducido (es prácticamente
insoluble) y ejerce presión osmótica insignificante.
El polihidroxibutirato y polihidroxialcanoato
relacionados, tales como
poli-3-hidroxivalerato y
poli-3-hidroxioctanoato, son
termoplásticos biodegradables de importancia comercial
considerable.
Los términos "polihidroxialcanoatos" y
"PHA" como se usan en lo sucesivo en este documento incluyen
polímeros de 3-hidroxibutirato, polímeros de
hidroxialcanoatos relacionados tales como
3-hidroxivalerato,
3-hidroxihexanoato,
3-hidroxioctanoato,
3-hidroxidecanoato y también copolímeros y mezclas
de más de uno de estos hidroxialcanoatos.
El polihidroxialcanoato es biodegradable y lo
degradan rápidamente los microorganismos de la tierra. Es
termoplástico (se funde a 180ºC) y se puede moldear fácilmente en
formas diversas usando tecnología establecida para los otros
materiales termoplásticos tales como polietileno de alta densidad
que se funde a aproximadamente la misma temperatura (190ºC). El
material es ideal para la producción de empaques biodegradables que
se degradarán en vertederos de basura y aguas residuales. El
polímero es biocompatible, así como biodegradable y el organismo de
mamíferos, incluyendo el ser humano, lo tolera bien; su producto de
degradación, 3-hidroxibutirato, es un metabolito
de mamíferos normal. El polihidroxibutirato se degrada sólo
lentamente en el organismo haciéndolo adecuado para aplicaciones
médicas donde se requiere la degradación a largo plazo.
El polihidroxialcanoato, producido por el
microorganismo Alcaligenes eutrophus, lo fabrica, como un
copolímero de polihidroxibutirato y polihidroxivalerato, Imperial
Chemical Industries PLC y se comercializa con la Marca Comercial
BIOPOL. La naturaleza del polímero, por ejemplo, las proporciones de
PHB y PHV está determina por el sustrato suministrado en la
fermentación. Normalmente se suministra en forma de gránulos para
termoprocesamiento. Sin embargo, el polihidroxialcanoato es más
costoso de fabricar mediante métodos existentes que, digamos, el
polietileno. Por lo tanto, es deseable que se pueda proporcionar una
producción nueva y más económica de polihidroxialca-
noato.
noato.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar materiales y un método para la producción eficaz de
polihidroxialcanoato.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona una planta adaptada para la producción de
polihidroxialcanoato que comprende un genoma recombinante, genoma
que contiene un gen o genes que codifican una enzima o enzimas
necesarias para catalizar la producción de polihidroxialcanoato
junto con una secuencia reguladora de gen que dirige la enzima a un
plástido.
Estas secuencias reguladoras incluyen secuencias
de péptido de tránsito que dirigen las enzimas al plástico.
Los genes que codifican la enzima o enzimas
necesarias para la catálisis de producción de polihidroxialcanoato
se pueden aislar a partir de un microorganismo, tal como
Alcaligenes eutrophus, que se conoce que produce
polihidroxibutirato y otros polihidroxialcanoatos.
Es preferible, por razones que se explicarán más
adelante, que la planta sea de una especie que produzca cantidades
sustanciales de aceite, en lugar de almidón. Tales especies de
plantas se conocen y se denominan simplemente cultivos de
"semillas oleaginosas" e incluyen, colza, canola, soja y
girasol. Se conocen métodos para la transformación genética de
muchos cultivos oleaginosos; por ejemplo, la transformación mediante
métodos de Agrobacterium tumefaciens son adecuados para la
mayoría. Tales métodos se describen con detalle en la bibliografía y
se conocen y practican de forma exhaustiva en la técnica.
La biosíntesis de polihidroxibutirato a partir
del sustrato, acetil-CoA implica tres etapas
catalizadas por enzima, que se ilustran en la Figura 1 en este
documento.
Las tres enzimas implicadas son
\beta-cetotiolasa, acetoacetil-CoA
reductasa unida a NADP y polihidroxibutirato sintetasa, cuyos genes
se han clonado a partir de Alcaligenes eutrophus (Schubert
et al, 1988, J Bacteriol, 170). Cuando se clonan en
Escherichia coli se conoce que los tres genes facilitan la
producción de polihidroxialcanoato hasta el 30% del peso
celular.
Se conoce que en las bacterias existen genes que
especifican la producción del alcanoatos más elevada que la de
butirato. El aislamiento de los genes apropiados permite la
expresión de estos polihidroxialcanoatos más elevados. Por ejemplo,
en las especies bacterianas Pseudomonas oleovorans y
Pseudomonas aeruginosa existen genes que especifican la
producción del polihidroxioctanoato y el decanoato. Sin embargo, los
genes para polímeros análogos están muy extendidos en especies
bacterianas.
Todos los microorganismos necesarios para la
realización de esta invención están disponibles al público en
colecciones de cultivo públicas.
Una característica preferida importante de esta
invención es el uso de una planta oleaginosa para expresión del
polihidroxialcanoato. La razón tras la selección de cultivos
productores de aceite es que tales plantas producen de forma
natural grandes cantidades de sustrato de acetil-CoA
(en condiciones aeróbicas) en la semilla en desarrollo, que se usa
normalmente en síntesis de ácidos grasos. La desviación de este
sustrato en la producción de polihidroxialcanoato reducirá la
cantidad de aceite almacenado por la semilla pero tendrá influencia
mínima sobre otros aspectos del metabolismo de la célula. Por lo
tanto, es posible producir cantidades comercialmente viables de
polihidroxialcanoato tal como polihidroxibutirato en una
oleaginosa.
Se ha sugerido previamente que los genes de
Alcaligenes eutrophus se podían expresar en un cultivo de
almidón pero esto tiene determinados problemas. Para optimizar la
producción de polihidroxialcanoato en un cultivo de este tipo,
probablemente sería necesario regular a la baja la síntesis de
almidón. Sin embargo, aunque se pudiera lograr esta regulación a la
baja no garantizaría un índice aumentado de producción de
acetil-CoA. Además, aunque se consiguiera esta
producción aumentada, es posible que la acetil-CoA
fuera utilizada rápidamente por la respiración en el cultivo de
almidón.
Para la expresión en plantas superiores los
genes bacterianos (por ejemplo, Alcaligenes eutrophus)
requieren secuencias promotoras y terminadoras adecuadas. Están
disponibles para uso diversos promotores/terminadores. Para la
expresión constitutiva se puede usar el promotor y terminador
nos del virus del mosaico de coliflor CaMV35S. Sin embargo,
se prefiere dirigir la síntesis de polihidroxialcanoato sólo al
órgano de almacenamiento de aceite en desarrollo de la semilla
oleaginosa tal como el embrión de colza. El promotor de la proteína
de almacenamiento de la semilla de colza, napin, se podría usar para
obtener expresión específica de embrión de genes de
polihidroxialcanoato. La expresión de los genes de
polihidroxialcanoato durante el periodo preciso en el cual se está
preparando lípido asegurará la competición eficaz por las enzimas de
polihidroxialcanoato por acetil-CoA disponible. Los
promotores de genes de síntesis de ácidos grasos cuyas expresiones
se activan en este momento son, por tanto, los candidatos más
apropiados para usarse como promotores de genes de
polihidroxialcanoato. Los ejemplos de tales promotores son los de
isoformas específicas de semillas de proteína transportadora de
acilo de colza (ACP) o \beta-cetoacil ACP
reductasa.
reductasa.
Al insertar los genes de polihidroxialcanoato en
células eucariotas, se tiene que tener en consideración el
compartimiento subcelular más apropiado en el cual localizar las
enzimas. Dos factores son importantes: el sitio de producción de
sustrato de acetil-CoA y el espacio disponible para
almacenamiento del polímero de polihidroxialcanoato.
El acetil-CoA necesario para
síntesis de ácidos grasos en, por ejemplo, embrión de colza en
desarrollo se produce por dos rutas. La primera ruta directa
implica la actividad de una enzima piruvato deshidrogenasa
localizada en el plástido. La segunda ruta implica la producción
inicial de acetil-CoA mediante piruvato
deshidrogenasa mitocondrial, lisis para liberar el acetato y
difusión del acetato en el plástido donde se reesterifica a CoA
mediante la acetil-CoA sintetasa. La semilla de
colza también produce acetil-CoA en el citosol,
aunque en un índice menor que en el plástido, a través de la
actividad de una enzima citosólica citrato liasa.
Considerando el suministro de sustrato, la
enzima \beta-cetotiolasa bacteriana (por ejemplo,
Alcaligenes) podría funcionar en la mitocondria, usando
acetil-CoA producido en exceso de los requerimientos
de la respiración o en el citosol. Sin embargo, de acuerdo con la
invención esta enzima se dirige a los plástidos, donde se producen
índices más elevados de generación de
acetil-CoA.
Las mitocondrias carecen de espacio suficiente
para almacenamiento del polímero de polihidroxialcanoato. En los
plástidos existe espacio de almacenamiento significativo, al menos
en el embrión de colza.
No se conoce si los intermediarios de la ruta de
acetoacetil-CoA o hidroxibutiril-CoA
se pueden transportar desde el plástido al citosol. Con toda
certeza, los mismos no serían capaces de atravesar la membrana de
envuelta del plástido como ésteres de CoA. La exportación
necesitaría que los sistemas de transporte implicados en la
exportación de ácidos grasos desde plástidos reconozcan a los grupos
de acetoacetato o hidroxibutirato. Se ha sugerido que los mismos
implican: lisis del éster de CoA, exportación del ácido libre y
resíntesis del éster de CoA en el citosol; o transferencia de los
grupos acilo a carnitina y exportación de acil carnitina. Si los
grupos de acetoacetilo se pueden exportar desde el plástido por uno
de estos mecanismos, entonces sería posible dirigir la
\beta-cetotiolasa al plástido, para utilizar
acetil-CoA destinado para la síntesis de lípidos y
dirigir acetoacetil-CoA reductasa y
polihidroxibutirato sintetasa al citosol para conseguir la síntesis
de polímero en este compartimiento más espacioso. Si no se pueden
exportar los grupos de acetoacetato ni de hidroxibutirato desde el
plástido, la síntesis de polihidroxialcanoato necesitará que las
tres enzimas de ruta se dirijan a este organelo de forma que se
expresen en el mismo compartimiento celular.
Para dirigir las tres enzimas bacterianas (tal
como Alcaligenes eutrophus) para la síntesis de
polihidroxialcanoato al plástido de planta se necesita el uso de
elementos reguladores de dirección específicos denominados péptidos
de tránsito. Las fuentes posibles de secuencias de dirección de
estroma de plástido son los genes para:
(a) subunidad pequeña de ribulosa bifosfato
carboxilasa/oxigenasa (RUBISCO ssu);
(b) proteína transportadora de acilo (ACP);
(c) \beta-cetoacil ACP
reductasa;
(d)
enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintetasa (EPSPS);
(e) fructosa
1,6-bifosfatasa.
De estos, el péptido de tránsito de subunidad
pequeña RUBISCO ha demostrado dirigir polipéptidos a plástidos en
tejidos tanto fotosintéticos como no fotosintéticos. Los péptidos de
tránsito de ACP y \beta-cetoacil ACP reductasa
también funcionarían de forma eficaz en plantas tales como el
embrión de colza. La ventaja de usar el mismo péptido de tránsito
de plástido para los tres genes de polihidroxialcanoato es asegurar
que cualquier variabilidad en la captación de los genes no se deba
al péptido de tránsito que se usa.
Aunque algunas proteínas parecen dirigirse
eficazmente al estroma de plástido mediante el péptido de tránsito
solo, otras proteínas también necesitan la presencia de hasta 20
aminoácidos del extremo amino de la proteína madura. La necesidad
de la presencia de secuencias maduras parece depender del tamaño y
la carga de la proteína que se tiene que transportar.
Para obtener síntesis de polímero de
polihidroxialcanoato en tejidos de plantas es necesario obtener
plantas que expresan los tres genes para las enzimas
\beta-cetotiolasa, acetoacetil-CoA
reductasa y polihidroxibutirato sintetasa. Esto se puede conseguir
usando una de las siguientes estrategias:
- i)
- Las plantas se pueden transformar individualmente con los tres genes de ruta del polihidroxialcanoato. Las plantas que contienen genes individuales se cultivan en el invernadero y con polinización cruzada para obtener plantas híbridas que contienen dos genes de ruta. Después, este procedimiento se repite para producir plantas híbridas que contienen los tres genes.
- ii)
- Las plantas se pueden transformar secuencialmente con plásmidos que contienen los genes de ruta individuales.
- iii)
- Dos o tres genes de ruta se puede cotransformar en la misma planta mediante infección simultánea con Agrobacteria que contienen los genes individuales.
- iv)
- Las plantas se pueden transformar con plásmidos que contienen dos o tres genes de ruta.
Se puede usar una combinación de estas técnicas
para obtener la expresión de los tres genes en una planta única. Se
realizan rondas sucesivas de polinización cruzada hasta que la
descendencia sea homocigota para los tres genes. Para los métodos
(ii) y (iii) anteriormente, es provechoso insertar cada gen en
vectores que contengan diferentes genes marcadores seleccionables
para facilitar la selección de plantas que contengan dos o tres
genes de ruta de polihidroxialcanoato. Los ejemplos de marcadores
seleccionables son genes que confieren resistencias a kanamicina,
higromicina, sulfonamidas y bialafos o fosfinotricina.
Ahora, la invención se describirá a modo de
ejemplo sólo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra la ruta para producción de
polihidroxibutirato en Alcaligenes eutrophus;
La Figura 2 es un mapa físico del fragmento
SmaI-EcoRI de 5,2 kb de ADN de Alcaligenes
eutrophus;
La Figura 3 es un mapa del vector de expresión
de planta pJR1i;
La Figura 4 muestra el análisis de transferencia
de Southern de los tres productos de PCR producidos durante la
preparación de la construcción de péptido de tránsito
ssu-cetotiolasa;
La Figura 5 es un gráfico de actividades
enzimáticas de \beta-cetotiolasa en hojas de
tabaco;
La Figura 6 es un gráfico de actividades
enzimáticas de NADP acetoacetil CoA reductasa en hojas de
tabaco.
Ejemplo
Un fragmento SmaI-EcoRI de 5,2
kb que codifica los tres genes biosintéticos de polihidroxialcanoato
(PHA) se había aislado previamente a partir de Alcaligenes
eutrophus (Schubert et al, 1988, J Bacteriol, 170). Este
fragmento clonado en el vector pUC9 (New England Biolabs) junto con
un fragmento PstI sub de 2,3 kb clonado en Bluescript KS-
(Stratagene) fueron proporcionados por el Dr. Steinbuchel de la
Universidad de Gottingen, Alemania. En la Figura 2 se muestra un
mapa de restricción del fragmento. Se muestran las posiciones de los
sitios de restricción y las posiciones de los genes de
\beta-cetotiolasa, acetoacetil CoA reductasa y
polihidroxibutirato sintetasa (PHB).
El vector de expresión elegido para obtener
expresión constitutiva de genes biosintéticos de PHA en plantas de
tabaco y de colza fue pJR1i. Este vector contiene el promotor y el
terminador nos del virus del mosaico de coliflor CaMV35S,
separado por un sitio de clonación múltiple para permitir la
inserción de los genes de PHA. El vector también contiene el gen
nptII de resistencia a kanamicina como un marcador
seleccionable. La Figura 3 es un mapa del vector de expresión de
plantas pJR1i. También se utilizó el vector pJRIRi; este vector
contiene el casete de expresión en la orientación opuesta.
Todas las técnicas de biología molecular de
rutina fueron las de Sambrook et al (1989, A laboratory
manual, Segunda edición). Todos los oligonucleótidos se
sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied Biosystems 380B. Las
máquinas de PCR usadas fueron Techne PHC-1
Programmable Dri-Blocks. La Taq polimerasa se obtuvo
en Perkin-Elmer/Cetus. Las enzimas de restricción y
otras enzimas modificadoras se obtuvieron de New England Biolabs,
Gibco/BRL, Northumbria Biologicals Limited y Pharmacia. Los kits de
secuenciación se obtuvieron en Cambridge Biosciences (Sequenase) y
Promega (Taqtrack). Todos los radio-isótopos fueron
suministrados por Amersham International.
El gen de \beta-cetotiolasa se
aisló como un fragmento PstI-PleI de 1,3 kb a partir
del fragmento PstI de 2,3 kb de pKS-::2.3P7. Los extremos de este
fragmento se cortaron para producir extremos romos con Klenow y se
insertó en el sitio SmaI defosforilado de pJRli. El plásmido
resultante se denominó pJR1iT. Los plásmidos recombinantes se
identificaron mediante hibridación de colonia usando el fragmento de
inserto de 1,3 kb como una sonda. La cartografía de restricción de
recombinantes reveló los que contenían un inserto único de
\beta-cetotiolasa en la orientación sentido. La
orientación del inserto se confirmó mediante secuenciación usando un
cebador que hibridó al extremo 3' del promotor de CaMV35S.
El gen de acetoacetil-CoA
reductasa se aisló como un fragmento AvaII-XmnII de
0,9 kb a partir de pKS::2.3P7. Este fragmento se insertó en pJRIi
como se ha descrito para pJRIiT. Sin embargo, la orientación del
fragmento de inserto en plásmidos recombinantes no se pudo
confirmar mediante cartografía de restricción debido a que no
estaban disponibles sitios de enzima de restricción adecuados. Por
lo tanto, se secuenciaron cuatro recombinantes usando el cebador 3'
de CaMV35S y, de estos, se observó que uno contenía un inserto
sentido. Este plásmido se denominó pJRIiR.
El gen de PHB sintetasa se aisló a partir de
pKS-::2.3P7 como un fragmento de BstBI-StuI. Este
fragmento se cortó para producir extremos romos y se insertó en
pJRIi como se ha descrito para pJRIiT y pJRIiR. La identidad de
plásmidos recombinantes (pJRIiS) que contenían un inserto único en
orientación sentido se confirmó mediante cartografía de restricción
y mediante secuenciación con el cebador 3' de CaMV35S.
El transporte hacia plástidos de los
polipéptidos de componente para cada una de las enzimas de ruta de
PHB se puede conseguir mediante la adición de una secuencia de
péptido de tránsito al extremo 5' de la secuencia de genes.
El primer gen a adaptarse fue el de cetotiolasa.
Se empleó una técnica que implica reacción en cadena de polimerasa
(PCR) para unir la secuencia de péptido de tránsito de subunidad
pequeña RUBISCO pea en fase con el gen de cetotiolasa.
Unir el péptido de tránsito al gen de
cetotiolasa implicó tres experimentos. El primer experimento añadió
una parte pequeña del extremo 5' del gen de cetotiolasa en el
extremo 3' de la secuencia de péptido de tránsito. El segundo
experimento añadió una parte pequeña del extremo 3' del péptido de
tránsito al extremo 5' del gen de cetotiolasa. El tercer
experimento utilizó las salientes producidas en los experimentos
anteriores para prolongarse a través de la unión y producir péptido
de tránsito de longitud completa unido en fase con el gen de
cetotiolasa. Se diseñaron cuatro cebadores de PCR:
\newpage
- 1.
- Extremo 5' del péptido de tránsito que permite prolongación hacia su extremo 3':
- 2.
- Extremo 3' de péptido de tránsito unido a extremo 5' del gen de cetotiolasa que permite la prolongación hacia el extremo 5' del péptido de tránsito:
- 3.
- Extremo 3' del péptido de tránsito unido al extremo 5' del gen de cetotiolasa que permite la prolongación hacia el extremo 3' del gen de cetotiolasa:
- 4.
- Extremo 3' del gen de cetotiolasa:
\vskip1.000000\baselineskip
Para el primer experimento el ADN de molde fue
pSM64 (secuencia de péptido de tránsito) y los cebadores fueron TP1
y TPKB con una temperatura de hibridación de 65ºC. Los productos
obtenidos de PCR se desarrollaron en un gel de agarosa y la banda
correspondiente a 199 pb se cortó y electroeluyó a partir del
gel.
En el segundo experimento el ADN de molde fue
pKS::2.3P7, los cebadores implicados fueron TPKT y K1 y la
temperatura de hibridación 68ºC. Los productos de la reacción de
PCR de nuevo se desarrollaron en un gel y la banda de 1,207 kb
necesaria se aisló y electroeluyó a partir del corte de gel.
El tercer experimento utilizó el ADN aislado a
partir del experimento anterior como molde y los cebadores TP1 y
K1. La temperatura de hibridación fue 65ºC y aunque este experimento
de PCR fue muy ineficaz se formó algún producto de longitud
completa (1,352 kb).
Una pequeña parte de cada uno de los tres
productos de PCR se desarrolló en un gel de agarosa. Se realizó
análisis de transferencia de Southern usando tres de los oligos como
sondas (TP1, K1 y TPKT). Los resultados se proporcionan en la
Figura 4 y muestran que el producto de la tercera reacción contenía
el extremo 5' del péptido de tránsito, el solapamiento de péptido
de tránsito 3' y el gen de cetotiolasa 5' y el extremo 3' del gen
de cetotiolasa.
Fue necesario comprobar la secuencia de este
producto ya que se sabe que PCR puede incorporar desapareamientos
de bases. El producto de PCR se cortó para producir extremos romos y
se clonó en pUC18 con SmaI cortado y fosfatado. Se identificaron
seis clones que contenían el producto de PCR. Los clones se
secuenciaron usando los cebadores universal e inverso (kit de
Sequenase y kit de Taqtrack). Se identificaron clones con secuencia
completamente correcta a través del péptido de tránsito y el extremo
5' del gen de cetotiolasa hasta un sitio de restricción TthIII1
dentro del gen. A partir de uno de esos clones se escindió un
fragmento TthIII1-Kpn1. El sitio KpnI se volvió a
cortar para dar un extremo romo y se insertó un fragmento
TthII11-SmaI de ADN de Alcaligenes eutrophus
a partir de Pks-::2.3P7 correspondiente a la parte principal del gen
de cetotiolasa. Se secuenciaron clones positivos a través de las
uniones. El fragmento de péptido de
tránsito-cetotiolasa se escindió y se insertó en
pJRIRi.
Para la construcción de péptido de
tránsito-reductasa también se utilizó PCR. Esto
requirió sólo un experimento de PCR ya que un sitio Dde I (único en
la secuencias de péptido de tránsito y reductasa) estaba presente
cerca del extremo 5' del gen. El experimento de PCR necesitó dos
cebadores:
\newpage
- 1.
- Secuencia homóloga al extremo 5' del péptido de tránsito que permitiría la prolongación hacia el extremo 3'. Se incorporó un sitio CIa I en la secuencia 5' a la secuencia de péptido de tránsito.
- 2.
- Secuencia homóloga para apenas pasar el sitio Dde I en el gen de reductasa, unida en fase con la secuencia del péptido de tránsito 3' para permitir la prolongación hacia el péptido de tránsito 5'.
Después de PCR con estos dos cebadores y ADN de
péptido de tránsito como molde, el producto de 195 pb se identificó
en geles de agarosa y se aisló mediante electroelución. El gen de
reductasa DdeI XmnI se aisló y ligó al producto de PCR cortado con
DdeI. Después de electroforesis en gel de agarosa la banda 1,063 kb
se aisló, se cortó con CiaI y se ligó en Bluescript SK(-) CiaI
EcoRV. Los positivos se están caracterizando.
pJRliT, pJRliR, pJRliS y pJRli purificados con
cesio se transformaron individualmente en Agrobacterium
tumefaciens cepa LBA4404 mediante captación directa de la forma
siguiente. Se inoculó LB (10 ml) con A. tumefaciens cepa
LBA4404. El cultivo se incubó con agitación a 28ºC durante
aproximadamente 16 horas hasta que la densidad óptica (DO) a 660 nm
fue 0,5. Las células se recuperaron mediante centrifugación (3000
rpm Sorval RT6000B, 6 min, 4ºC). Las mismas se resuspendieron en
250 \mul de CaCl_{2} 20 mM enfriado con hielo. La suspensión de
células después se repartió en tubos Eppendorf preenfriados en
alícuotas de 0,1 ml. Se añadió aproximadamente 1 \mug de ADN de
plásmido purificado con cesio a cada tubo. Después, las células se
sometieron a choque térmico mediante congelación en nitrógeno
líquido seguida de incubación a 37ºC durante 5 minutos. Se añadió
medio LB (1 ml) y se permitió que las células se recuperaran por
incubación (agitada) a 28ºC durante 3-4 horas. Los
sedimentos celulares se obtuvieron mediante centrifugación (11500 g,
30 segundos, 20ºC) y se resuspendieron en 0,1 ml de LB. Las células
recombinantes se seleccionaron en LB (solidificado con agar) que
contenía kanamicina (50 \mug/ml), estreptomicina (500 \mug/ml)
y rifampicina (100 \mug/ml) seguido de incubación a 28ºC.
Después, ADN de Mini-prep de las cepas de
Agrobacterium resultante se aisló y analizó mediante
digestión con enzima de restricción para asegurar que no hubieran
ocurrido rearreglos.
Trozos de hojas de tabaco y pecíolos de colza se
inocularon individualmente con las cepas LBA4404/JRIi,
LBA4404/pJRIiT, LBA4404/pJRIiR y LBA4404/pJRIiS. Las plantas se cultivaron en una habitación de crecimiento con una temperatura de 25ºC y un fotoperiodo de 16 horas.
LBA4404/pJRIiT, LBA4404/pJRIiR y LBA4404/pJRIiS. Las plantas se cultivaron en una habitación de crecimiento con una temperatura de 25ºC y un fotoperiodo de 16 horas.
Plántulas de Brassica napus vc Westar se
esterilizaron en hipoclorito de sodio al 10% y se lavaron en agua
estéril antes de la germinación en medio MS (Imperial) (que contiene
sacarosa al 3% y fitagar al 0,7% (Gibco). Los cotiledones se
extirparon de plántulas de 5 días de edad y los pecíolos de las
mismas se pusieron en medio MS como anteriormente pero
complementado con 4,5 \mug/ml de bencilaminopurina (BAP). Los
cotiledones se cultivaron en este medio durante 24 horas después de
lo cual sus pecíolos se sumergieron en una solución de
Agrobacterium. El cultivo de Agrobacterium se había
cultivado durante la noche en medio LB que contenía kanamicina (50
\mug/ml) a continuación de lo cual las células de
Agrobacterium se habían sedimentado y lavado en medio MS
líquido y se habían diluido hasta OD_{660} 0,1. Los pecíolos
inoculados se devolvieron al medio MS que contenía 4,5 \mug/ml de
BAP y se incubaron en la habitación de cultivo durante 2 días.
Después, los cotiledones se transfirieron a medio MS complementado
con BAP (4,5 \mug/ml), carbenicilina (Duchefa) (500 \mug/ml) y
kanamicina (15 \mug/ml). Los cotiledones se subcultivaron en este
medio cada dos semanas hasta la producción de callo verde y, con el
tiempo, brotes. Los brotes se extirparon y cultivaron en MS que
contenía carbenicilina (500 \mug/ml) y kanamicina (15 \mug/ml)
hasta que se transfirieron al invernadero.
Semillas de Nicotiana tabacum vc SRI se
esterilizaron como se ha descrito anteriormente y se germinaron en
medio MS (que contenía sacarosa al 3% y bactoagar al 0,8%). Las
puntas de brotes de estas semillas después se micropropagaron en
este medio para proporcionar plantas para estudios de
transformación. Trozos de hojas de estas plantas se sumergieron en
una solución de Agrobacterium (preparada como se ha descrito
anteriormente) y después se cultivaron en medio MS que contenía
sacarosa al 3%, bactoagar al 0,8%, 1 \mug/ml de BAP y 0,1
\mug/ml de NAA, durante 2 días. Después, los trozos de hojas se
cultivaron en el mismo medio complementado con carbenicilina (500
\mug/ml) y kanamicina (100 \mug/m) durante 5 semanas. Los brotes
regenerados se extirparon y cultivaron en MS que contenía sacarosa
al 3%, bactoagar al 0,8%, 200 pg/ml de carbenicilina y 100
\mug/ml de kanamicina durante 2 pases de 5 semanas antes de la
transferencia al invernadero.
Se obtuvieron plantas de tabaco y colza
resistentes a kanamicina para las que se habían transformado
individualmente con JRIi, JRIiT, JRIiR y JRIiS.
Cotiledones de colza y trozos de hojas de tabaco
también se inocularon con mezclas de cepas de Agrobacterium.
Estas inoculaciones se realizaron como se ha descrito previamente
excepto que se prepararon mezclas 1:1 de cultivos de
Agrobacterium diluidos de la misma densidad óptica,
inmediatamente antes de la inoculación.
La expresión de enzimas de ruta de PHA de
Alcaligenes eutrophus en tejidos de plantas se detectó
mediante ensayos de actividad enzimática. La presencia de los
polipéptidos de enzima también se detectó mediante análisis de
transferencia de Western.
Para los últimos análisis, se generaron
anticuerpos policlonales de conejo frente a las enzimas purificadas
\beta-cetotiolasa y NADP acetoacetil CoA reductasa
a partir de Alcaligenes eutrophus. Las bacterias se
sedimentaron, lavaron y se prepararon extractos crudos como han
descrito Haywood y Large (1981, Biochem J, 199,
187-201). Se purificó
\beta-cetotiolasa A mediante cromatografía en
hidroxiapatita, seguida de cromatografía de intercambio aniónico en
FPLC mono Q, seguido de filtración en gel en Superdex
S-200 (Pharmacia), usando modificaciones de métodos
descritos por Haywood et al (1988, FEMS Microbiology Letters,
52, 91-96). Se purificó NADP
acetoacetil-CoA reductasa usando las mismas
técnicas, con una etapa de cromatografía de afinidad adicional en
2', 5' ADP sefarosa (Pharmacia). Las proteínas purificadas se
sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil
sulfato de sodio (SDS PAGE) de acuerdo con el método de Laemmli
(1970, Nature, 222, 680-685). La preparación final
de \beta-cetotiolasa mostró una banda única teñida
con azul de coomassie a 41 kd. La preparación de reductasa final
mostró una banda principal a 26 kb. 3 mg de cetotiolasa purificada y
2 mg de reductasa purificada se sometieron a SDS PAGE preparativa.
Las bandas correspondientes a las dos enzimas se electroeluyeron a
partir de los geles y se inyectaron en conejos para generar
anticuerpos policlonales. Se demostró que los sueros de muestras de
sangre primarias y secundarias a continuación de la inyección
contenían anticuerpos específicos para sus enzimas diana a través
de análisis de transferencia de Western de extractos crudos de
Alcaligenes.
Los extractos crudos de hojas de tabaco se
prepararon moliendo tejido de hoja en tampón de fosfato de potasio
50 mM, pH 7,0, que contenía ditiotreitol 1 mM. Después de
centrifugación a 30.000 g, se condujeron ensayos enzimáticos para
cetotiolasa y acetoacetil CoA reductasa en alícuotas de los
sobrenadantes por los métodos descritos por Haywood et al
(1988, FEMS Microbiology Letters, 52, 91-96; 52,
259-264). Se condujeron ensayos de PHB sintetasa en
alícuotas de los sobrenadantes de 30.000 g y alícuotas del
sedimento, resuspendidas en tampón de extracción, por el método de
Haywood et al (1989, FEMS Microbiology Letters, 57,
1-6).
Para el análisis de transferencia de Western,
alícuotas de los sobrenadantes de 30.000 g se sometieron a SDS PAGE
y se transfirieron electroforéticamente a filtros de nitrocelulosa.
Después los filtros se enjuagaron en TBS (Tris-HCl
50 mM, pH 7,9, NaCl 150 mM) y se incubaron en TBS más albúmina
sérica bobina al 5%. Las proteínas que reaccionaban con suero
anti-cetotiolasa o anti-reductasa se
detectaron incubando los filtros en 100 ml de TBS que contenía 2 ml
del suero pertinente durante 1-2 h. El primer
anticuerpo unido se detectó posteriormente usando conjugado de
fosfatasa alcalina de cabra anti-IgG de conejo y
reactivo de desarrollo de color de fosfatasa alcalina de nitroazul
de tetrazolio (BioRad Laboratories).
Los análisis bioquímicos iniciales se realizaron
en plantas de tabaco subcultivadas que crecían en cultivo de
tejido. Dieciocho plantas resistentes a kanamicina transformadas con
cetotiolasa de JR1i se sometieron a análisis enzimáticos y los
resultados se compararon con plantas de control no transformadas. Se
extrajeron hojas del mismo tamaño.
La Figura 5 muestra las actividades enzimáticas
de \beta-cetotiolasa en las hojas de tabaco. Los
números de identificación de plantas individuales se muestran en el
eje x. Las plantas a la izquierda de la línea de puntos son plantas
de control no transformadas. Las plantas a la derecha de la línea
están transformadas con cetotiolasa de JR1i.
Se detectó un nivel bajo de actividad de
cetotiolasa en plantas de control no transformadas. Casi todas las
plantas transformadas de cetotiolasa de JR1i tenían actividad de
cetotiolasa mayor que el control. La actividad más alta fue 34
nmol/min/mg de proteína, 2,8 veces más alta que la planta de control
más alta. En transferencias de Western, el anticuerpo
anti-cetotiolasa detectó un polipéptido a 41 kb en
plantas de tabaco de control no transformadas, posiblemente
correspondiente a la actividad enzimática de cetotiolasa endógena.
Mientras también se detectó un polipéptido de 41 kb en extractos de
las plantas transformadas con cetotiolasa de JR1i, las
transferencias de Western no pudieron distinguir cuantitativamente
plantas transformadas de no transformadas.
La Figura 6 muestra las actividades enzimáticas
de NADP acetoacetil CoA reductasa en hojas de las plantas de tabaco
cultivadas en cultivo de tejido. Los números de identificación de
plantas individuales se muestran en el eje x. Las plantas a la
izquierda de la línea de puntos son plantas de control no
transformadas. Las plantas a la derecha de la línea están
transformadas con reductasa de pJR1i.
Se detectó un nivel bajo de actividad de
acetoacetil CoA reductasa en plantas de control no transformadas.
Casi todas las 21 plantas transformadas con reductasa de JR1i tenían
actividad de reductasa mayor a la del control. La actividad más
alta fue 30 nmol/min/mg de proteína, 4 veces mayor que la planta de
control más alta. En transferencias de Western el anticuerpo
anti-reductasa no detectó ningún polipéptido con un
p.m. de 26 kd en extractos de plantas de control no transformadas.
Sin embargo, se detectó un polipéptido de 26 kd en extractos de las
plantas transformadas con reductasa de JR1i. Por lo tanto, se
demostró la expresión del gen de reductasa bacteriano en hojas de
tabaco.
Claims (27)
1. Una planta adaptada para la producción de
polihidroxialcanoato que comprende un genoma recombinante, genoma
que contiene un gen o genes que codifican una enzima o enzimas
necesarias para catalizar la producción de polihidroxialcanoato
junto con una secuencia reguladora de gen que dirige la enzima a un
plástido.
2. Una planta de acuerdo con la reivindicación 1
en la que el gen o genes que codifican la enzima o enzimas
necesarias para la catálisis de producción de polihidroxialcanoato
se aíslan a partir de un microorganismo.
3. Una planta de acuerdo con la reivindicación 2
en la que el microorganismo es Alcaligenes eutrophus.
4. Una planta de acuerdo con la reivindicación 1
en la que la planta es una planta productora de aceite.
5. Una planta de acuerdo con la reivindicación 4
en la que dicha planta productora de aceite se selecciona entre el
grupo que consiste en colza, canola, soja y girasol.
6. Una planta de acuerdo con la reivindicación
1, en la que la planta es una planta de tabaco.
7. Una planta de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha enzima o enzimas se seleccionan entre el grupo
que consiste en \beta-cetotiolasa,
acetoacetil-CoA reductasa y polihidroxibutirato
sintetasa.
8. Una planta de acuerdo con la reivindicación
1, en la que dicha secuencia reguladora de gen incluye secuencias
de péptido de tránsito que codifican péptidos de tránsito para
dirigir las enzimas a un plástido.
9. Un plástido de planta que comprende enzimas
necesarias para catalizar la producción de polihidroxialcanoato,
obteniéndose el plástido o pudiendo obtenerse a partir de una planta
como se ha indicado en la reivindicación 1.
10. Un plástido de acuerdo con la reivindicación
9 en el que las enzimas están codificadas por genes aislados a
partir de un microorganismo que se conoce que produce
polihidroxialcanoato.
11. Un plástido de acuerdo con la reivindicación
10 en el que las enzimas están codificadas por genes aislados a
partir de Alcaligenes eutrophus, Pseudomonas
oleovorans o Pseudomonas aeruginosa.
12. Un plástido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 11 en el que dichas enzimas se seleccionan
entre el grupo que consiste en \beta-cetotiolasa,
acetoacetil CoA reductasa y polihidroxibutirato sintetasa.
13. Un plástido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 12 que comprende las enzimas
\beta-cetotiolasa, acetoacetil CoA reductasa y
polihidroxibutirato sintetasa.
14. Un plástido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 13 en el que el plástido se obtiene o se
puede obtener a partir de una planta como se ha indicado en la
reivindicación 8.
15. Una planta de acuerdo con la reivindicación
8, en la que la secuencia reguladora de gen codifica un péptido
seleccionado entre el grupo que consiste en péptido de tránsito de
subunidad pequeña (RUSBISCO ssu) de ribulosa bifosfato
carboxilasa/oxigenasa, péptido de tránsito de ACP, péptido de
tránsito de \beta-cetoacil ACP reductasa, péptido
de tránsito de
enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintetasa (EPSPS) y péptido de tránsito de fructosa
1,6-bifosfatasa.
16. Un plásmido que comprende dos o tres genes
biosintéticos de PHA seleccionados entre el grupo que consiste en
(i) un gen que codifica una enzima
\beta-cetotiolasa, (ii) un gen que codifica una
enzima acetoacetil CoA reductasa y (iii) un gen que codifica una
enzima PHA sintetasa, siendo el plásmido adecuado para la
transformación de una planta, de manera que las enzimas se dirigen
a un plástido.
17. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación
16 que comprende los tres de dichos genes.
18. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación
16 ó 17 que comprende adicionalmente secuencias reguladoras de gen
adecuadas para expresión de los genes en una planta superior.
19. Un plásmido de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 18 en el que las enzimas comprenden un
péptido de tránsito que dirige la enzima a un plástido de planta
cuando la planta se transforma con el plásmido.
20. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación
19, en el que el péptido se selecciona entre el grupo que consiste
en péptido de tránsito de subunidad pequeña de ribulosa bifosfato
carboxilasa/oxigenasa (RUBISCO ssu), péptido de tránsito de ACP,
péptido de tránsito de \beta-cetoacil ACP
reductasa, péptido de tránsito de
enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintetasa (EPSPS) o péptido de tránsito de fructosa
1,6-bifosfatasa.
21. Un método para transformar una planta con
genes biosintéticos de PHA, comprendiendo el método la etapa de
introducir en una célula de planta un plásmido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20.
22. Un proceso para producir
polihidroxialcanoato, que comprende cultivar una planta que se ha
obtenido por el método de la reivindicación 21 y obtener el
polihidroxialcanoato a partir de la misma.
23. Un proceso para preparar un plástido de
planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14
que comprenden la etapas de introducir en una planta que contiene
plástido genes que codifican dichas enzimas, comprendiendo además
cada gen en su extremo 5' una secuencia que codifica un péptido de
tránsito que dirige la enzima al plástido.
24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
23 en el que los péptidos de tránsito se seleccionan entre el grupo
que consiste en péptido de tránsito de subunidad pequeña de ribulosa
bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RUBISCO ssu), péptido de tránsito
de ACP, péptido de tránsito de \beta-cetoacil ACP
reductasa, péptido de tránsito de
enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintetasa (EPSPS) y péptido de tránsito de fructosa
1,6-bifosfatasa.
25. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
23 ó 24 en el que las enzimas son dos o tres de
\beta-cetotiolasa, acetoacetil CoA reductasa y
polihidroxibutirato sintetasa.
26. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 23-25 en que la planta es una
planta de tabaco.
27. Una planta que comprende un plástido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
9-14.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5245023A (en) | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| GB9108756D0 (en) | 1991-04-24 | 1991-06-12 | Ici Plc | Production of polyalkanoate in plants |
| US5610041A (en) * | 1991-07-19 | 1997-03-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants |
| ATE295891T1 (de) * | 1991-07-19 | 2005-06-15 | Univ Michigan State | Transgene pflanzen die polyhydroxyalkanoate produzieren |
| CA2127807A1 (en) * | 1992-11-20 | 1994-06-09 | John Maliyakal | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic |
| KR960705938A (ko) * | 1993-11-09 | 1996-11-08 | 미리암 디. 메코너헤이 | 유전자 전환된 프럭탄 축적 작물 및 그의 제조 방법(Transgenic Fructan Accumulating Crops and Method for Their Production) |
| ID23491A (id) * | 1994-01-28 | 1995-09-07 | Procter & Gamble | Kopolimer-kopolimer yang dapat dibiodegradasi dan baha-bahan plastik yang terdiri dari kopolimer-kopolimer yang dapat dibiodegradasi |
| SG49096A1 (en) * | 1994-01-28 | 1998-05-18 | Procter & Gamble | Biodegradable 3-polyhydtoxybuyrate/3- polyhydroxyhexanoate copolymer films |
| MX9603065A (es) * | 1994-01-28 | 1997-06-28 | Procter & Gamble | Pelicula biodegradable de copolimero 3-polihidroxilobutirato/3-polihidroxilohexanoato. |
| ZA95627B (en) * | 1994-01-28 | 1995-10-05 | Procter & Gamble | Biodegradable copolymers and plastic articles comprising biodegradable copolymers |
| CN1079835C (zh) * | 1994-06-01 | 2002-02-27 | 普罗克特和甘保尔公司 | 利用空气分级作用回收聚羟基链烷酸酯的方法 |
| DK0763126T3 (da) * | 1994-06-01 | 1999-11-29 | Procter & Gamble | Fremgangsmåde til udvinding af polyhydroxyalkanoater ved anvendelse af centrifugalfraktionering |
| GB9414506D0 (en) * | 1994-07-18 | 1994-09-07 | Zeneca Ltd | Improved production of polyhydroxyalkanoate |
| US6127606A (en) * | 1995-02-08 | 2000-10-03 | University Of Warwick | Method of using transactivation proteins to control expression in transgenic plants |
| GB9502456D0 (en) * | 1995-02-08 | 1995-03-29 | Univ Warwick | Control of genes in transgenic plants |
| US6083729A (en) | 1995-10-26 | 2000-07-04 | Metabolix, Inc. | Methods for isolating polyhydroxyalkanoates from plants |
| US5849894A (en) * | 1995-11-29 | 1998-12-15 | Monsanto Company | Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase |
| WO1997022711A1 (en) | 1995-12-19 | 1997-06-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases |
| US6143947A (en) * | 1996-01-29 | 2000-11-07 | The Procter & Gamble Company | Fibers, nonwoven fabrics and absorbent articles comprising a biodegradable polyhydroxyalkanoate comprising 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate |
| US6946588B2 (en) | 1996-03-13 | 2005-09-20 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use |
| US5958745A (en) * | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants |
| US6091002A (en) | 1996-03-13 | 2000-07-18 | Monsanto Company | Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants |
| US5959179A (en) * | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Method for transforming soybeans |
| US5750848A (en) * | 1996-08-13 | 1998-05-12 | Monsanto Company | DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates |
| WO1999000505A1 (en) * | 1997-06-30 | 1999-01-07 | The Curators Of The University Of Missouri | Use of dna encoding plastid pyruvate dehydrogenase and branched chain oxoacid dehydrogenase components to enhance polyhydroxyalkanoate biosynthesis in plants |
| AU8587998A (en) | 1997-07-25 | 1999-02-16 | Monsanto Company | Pha compositions and methods for their use in the production of pha films |
| EP1015565B1 (en) | 1997-09-19 | 2006-04-12 | Metabolix, Inc. | Biological systems for manufacture of polyhydroxyalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids |
| EP1044278A1 (en) * | 1998-01-05 | 2000-10-18 | Monsanto Company | Biosynthesis of medium chain length polyhydroxyalkanoates |
| WO1999034687A1 (en) | 1998-01-07 | 1999-07-15 | Metabolix, Inc. | Animal nutrition compositions |
| US6649382B1 (en) * | 1998-01-19 | 2003-11-18 | Lg Chemical Ltd. | Methods of making polyhydroxyalkanoate using biosynthesis genes from alcaligenes latus |
| US6586658B1 (en) | 1998-03-06 | 2003-07-01 | Metabolix, Inc. | Modification of fatty acid metabolism in plants |
| WO1999051760A1 (en) | 1998-04-08 | 1999-10-14 | Metabolix, Inc. | Methods for separation and purification of biopolymers |
| MXPA00011401A (es) * | 1998-05-22 | 2003-04-22 | Metabolix Inc | Composiciones de biopolimero de polimero de polihidroxialcanoato. |
| AU768244B2 (en) * | 1998-07-30 | 2003-12-04 | Metabolix, Inc. | Enzymes for biopolymer production |
| ES2302386T3 (es) | 1998-08-04 | 2008-07-01 | Metabolix, Inc. | Produccion de polihidroxialcanoatos a partir de polioles. |
| US6077931A (en) * | 1998-12-21 | 2000-06-20 | The Procter & Gamble Company | Biodegradable PHA copolymers |
| US6174990B1 (en) | 1998-12-21 | 2001-01-16 | The Procter & Gamble Company | Films comprising biodegradable PHA copolymers |
| US6160199A (en) * | 1998-12-21 | 2000-12-12 | The Procter & Gamble Company | Absorbent articles comprising biodegradable PHA copolymers |
| US6835820B2 (en) | 1999-01-07 | 2004-12-28 | The University Of Massachusetts | Polyhydroxyalkanoate biosynthesis associated proteins and coding region in bacillus megaterium |
| EP1141317A1 (en) * | 1999-01-07 | 2001-10-10 | University of Massachusetts | POLYHYDROXYALKANOATE BIOSYNTHESIS ASSOCIATED PROTEINS AND CODING REGION IN $i(BACILLUS MEGATERIUM) |
| AU3516100A (en) | 1999-03-05 | 2000-09-21 | Monsanto Technology Llc | Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways |
| CA2365276C (en) | 1999-03-15 | 2009-08-25 | Universite Laval | Method for producing polyhydroxyalkanoates in recombinant organisms |
| US6451564B1 (en) | 1999-07-02 | 2002-09-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for producing L-isoleucine |
| DE60040125D1 (de) * | 1999-08-09 | 2008-10-16 | Riken Wako | Verfahren zur Transformierung von Pflanzen, transformierte Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von Polyestern |
| US7700074B2 (en) * | 2002-02-07 | 2010-04-20 | Pettegrew Jay W | Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism |
| US7407778B2 (en) | 2002-02-07 | 2008-08-05 | Pettegrew Jay W | Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders |
| US20060257842A1 (en) * | 2003-05-29 | 2006-11-16 | Pettegrew Jay W | Cryopreservation media and molecules |
| CN1795198B (zh) * | 2003-05-29 | 2011-08-17 | 杰伊·W·佩特格尤 | 对神经精神疾病进行医学成像所用的甘油磷酸胆碱及其衍生物 |
| CA2581458A1 (en) * | 2006-03-22 | 2007-09-22 | National Research Council Of Canada | Process for producing poly-.beta.-hydroxybutyrate |
| JP5500823B2 (ja) | 2006-09-01 | 2014-05-21 | 株式会社カネカ | 熱可塑性エラストマー組成物 |
| TWI568847B (zh) | 2007-03-16 | 2017-02-01 | 奇諾麥提卡公司 | 用於１，４-丁二醇及其前驅物之生物合成的組合物及方法 |
| US7947483B2 (en) | 2007-08-10 | 2011-05-24 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol |
| BRPI0918483A2 (pt) | 2008-09-10 | 2020-07-14 | Genomatica, Inc | organismo microbiano que não ocorre naturalmente, e, método para produzir um composto |
| JP5964747B2 (ja) | 2009-06-04 | 2016-08-03 | ゲノマチカ， インク． | １，４−ブタンジオールの生成のための微生物体及び関連する方法 |
| VN29235A1 (es) * | 2009-06-04 | 2012-03-26 | ||
| CA2777459A1 (en) * | 2009-10-13 | 2011-04-21 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto |
| US8530210B2 (en) | 2009-11-25 | 2013-09-10 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
| RU2012132908A (ru) | 2010-02-11 | 2014-03-20 | Метаболикс, Инк. | Способ получения производных химических соединений |
| US8637286B2 (en) * | 2010-02-23 | 2014-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| US8048661B2 (en) * | 2010-02-23 | 2011-11-01 | Genomatica, Inc. | Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes |
| CN103459604A (zh) | 2011-02-14 | 2013-12-18 | 希乐克公司 | 加工生物质 |
| BR112014030202A2 (pt) | 2012-06-04 | 2017-09-12 | Genomatica Inc | microorganismos e métodos para a produção de 4-hidroxibutirato 1,4-butanodiol e compostos relacionados |
| BR112020008273A2 (pt) | 2017-10-27 | 2020-10-20 | Xyleco, Inc. | processamento de biomassa |
| EP3980546A4 (en) * | 2019-06-10 | 2023-06-21 | Yield10 Bioscience, Inc. | TRANSGENIC LAND PLANTS EXPRESSING A POLYHYDROXYAL CANOATE SYNTHASE SEED SPECIFIC WITH CYTOSOLIC LOCALIZATION |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4266855A (en) * | 1979-09-24 | 1981-05-12 | Quantor Corporation | Quick change lens system |
| ATE93542T1 (de) * | 1984-12-28 | 1993-09-15 | Plant Genetic Systems Nv | Rekombinante dna, die in pflanzliche zellen eingebracht werden kann. |
| US5229279A (en) | 1987-06-29 | 1993-07-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| US5245023A (en) * | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
| US5250430A (en) | 1987-06-29 | 1993-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Polyhydroxyalkanoate polymerase |
| EP0482077B1 (en) * | 1989-07-10 | 1998-10-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing polyester biopolymers |
| GB9108756D0 (en) | 1991-04-24 | 1991-06-12 | Ici Plc | Production of polyalkanoate in plants |
| GB9115245D0 (en) * | 1991-07-16 | 1991-08-28 | Ici Plc | Production of polyalkanoate |
| ATE295891T1 (de) | 1991-07-19 | 2005-06-15 | Univ Michigan State | Transgene pflanzen die polyhydroxyalkanoate produzieren |
| GB9223332D0 (en) | 1992-11-06 | 1992-12-23 | Ici Plc | Production of polyhydroxyalkanoate in plants |
-
1991
- 1991-04-24 GB GB919108756A patent/GB9108756D0/en active Pending
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