JPH1080289A - 植物において活性であるフォスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 - Google Patents

植物において活性であるフォスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用

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JPH1080289A JP9196218A JP19621897A JPH1080289A JP H1080289 A JPH1080289 A JP H1080289A JP 9196218 A JP9196218 A JP 9196218A JP 19621897 A JP19621897 A JP 19621897A JP H1080289 A JPH1080289 A JP H1080289A
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    • C12N15/8277—Phosphinotricin

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フォスフィノトリシン耐性遺伝子の使用法の
提供。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するタンパク質
をコードする体制遺伝子、または特定のＤＮＡ塩基配列
を有する遺伝子を含む植物細胞、あるいは、それらの遺
伝子を含む単子葉植物、単子葉植物体部分、または単子
葉種子、ならびにそれらの遺伝子を植物に導入して、フ
ォスフィノトリシン耐性の単子葉植物、単子葉植物体部
分、または単子葉種子を産生させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】公開前のドイツ国特許出願（Ｐ３６ ２８
７４７．４）（「主出願」）は、ストレプトミセス・
ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogene
s）ＤＳＭ４０７３６（一般寄託株）又はＤＳＭ４１１
２（ブダペスト条約に基づく寄託株）の全ＤＮＡから得
られるフォスフィノトリシン（ＰＣＴ）耐性遺伝子、す
なわち、フォスフィノトリシル−アラニル−アラニン
（ＰＴＴ）耐性による選択、ＢａｍＨＩによる切断、
４．０kbの大きさのフラグメントのクローニング及びＰ
ＴＴ耐性による選択を経て得られる遺伝子、を提示して
いる。さらに、該特許出願は、該ＰＣＴ耐性遺伝子を細
菌におけるＰＴＴ耐性マーカー及び植物細胞におけるＰ
ＴＣ耐性マーカーとしてＰＴＣ耐性植物の生産に利用す
ることも提示している。耐性遺伝子が位置している４kb
大の該ＢａｍＨＩフラグメントは、制限酵素地図（該特
許出願第１図）によって詳細に定義されている。耐性遺
伝子コード領域の位置は、この４kbフラグメントの部分
領域をクローニングすることによって、より正確に決定
された。その結果、耐性遺伝子は１．６kbの大きさのＳ
ｓｔII‐ＳｓｔＩフラグメント（主出願第１図の０．５
５から２．１５の位置）に位置していることが明らかに
なった。また、ＢｇｌIIによる消化によって得られる
０．８kb大のフラグメントは、プラスミドに導入してス
トレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）
を形質転換させた際のＰＴＴ耐性に関与する。この耐性
は、ＰＴＣのＮ−アセチル化に依存している。すなわ
ち、耐性遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼをコー
ドしている。
【０００２】上記の０．８kb大フラグメントのＤＮＡ塩
基配列は、ドイツ国特許追加出願Ｐ３６ ４２ ８２
９．９に再現されている。このＤＮＡ配列から、遺伝子
配列の開始コードン及び転写解読枠（オープン・リーデ
ィング・フレイム）を決定することが可能である。最後
部のヌクレオチドは、終止コードンのＴＧＡ部分であ
る。
【０００３】ストレプトミセス菌類由来の遺伝子は、Ｇ
＋Ｃ比が非常に高い。すなわち、アデニン（Ａ）＋チミ
ン（Ｔ）：グアニン（Ｇ）＋シトシン（Ｃ）は、約３
０：７０である。植物遺伝子のＧＣ比はこれよりはるか
に低く、約５０％である。このため、本発明はそのさら
なる発展として、耐性遺伝子のＤＮＡ塩基配列を新規
（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成により最適化して、植物のＲＮ
ＡポリメラーゼIIによって利用できる好ましいコードン
にしたものである。
【０００４】本発明は、ドイツ国特許出願Ｐ ３６ ２
８ ７４７．４及びその追加出願Ｐ３６ ４２ ８２
９．９に提示された耐性遺伝子の修飾、すなわち植物に
おいて有用なコードンへの改変に関する。対応アミノ酸
配列は、添付図面に示す通りである。本発明のより具体
的な態様は、特許請求の範囲に定義され、また、以下に
説明する通りである。
【０００５】知られているように、遺伝暗号は縮重す
る。すなわち、単一のトリプレットでコードされるアミ
ノ酸は２種類しかなく、残りの１８のアミノ酸はそれぞ
れ２ないし６種類のトリプレットのいずれかによってコ
ードされている。したがって、理論的には、遺伝子合成
に際しては、多様のコードンの組合せが選択され得る。
上記した、全ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドの構成比が
影響することから、この比を、塩基配列の最適条件に決
める基準のひとつに用いた。
【０００６】次のような修飾を、このように配列させた
遺伝子に対して行った。 （１）ストレプトミセス菌類由来の遺伝子の開始コード
ンＧＴＧ（追加出願塩基配列図中２５８−２６０）を植
物ＲＮＡポリメラーゼIIによて用いられる開始コードン
ＡＴＧで置き換えた。 （２）遺伝子内部において、ストレプトミセス由来の遺
伝子コードンを植物遺伝子のコードンとして適するよう
に改変した（Ｇ／Ｃ比の改変）。 （３）翻訳プロセスを終結させるための終止コードンＴ
ＧＡを配列末端に位置させた。 （４）遺伝子配列の先端及び末端部は、制限酵素部位の
突出末端として、遺伝子を伸長したり、該遺伝子配列を
植物調節配列の間に連結（ライゲーション）したりでき
るようにした。 （５）パリンドローム（回文対構造）配列は最少限に減
らした。
【０００７】本発明に係るＤＮＡ配列Ｉ（対応アミノ酸
配列を併記）を図１に示す。
【０００８】遺伝子内部において、３種類の制限酵素に
対するそれぞれ単一の切断部位（ＸｂａＩ：塩基番号１
５２、ＢａｍＨＩ：同３１２、ＸｍａＩ：同４３６）が
存在するので、ｐＵＣ１８やｐＵＣ１９等よく研究され
たクローニングベクターに組み込みが可能な部分配列の
サブクローニングが可能である。さらに、他の多くの制
限酵素に対するそれぞれ単一の切断部位を有する塩基配
列を遺伝子内に組み込んだ。これによって、一方では、
アセチルトランスフェラーゼの部分配列へのアクセスが
提供され、他方では、必要な修飾が可能になる。制限酵
素名及び切断部位を次表に示す。
【０００９】 制限酵素名 切断部位前の塩基番号 （コード鎖） ＢｓｐＭII １１ ＳａｃII ６４ ＥｃｏＲＶ ７４ ＨｐａＩ ８０ ＡａｔII ９９ ＢｓｔＸＩ １３９ ＡｐａＩ ２３２ ＳｃａＩ ２７２ ＡｖｒII ３０８ ＡｆｌII ３３６ ＳｔｕＩ ３８５ ＢｓｓＨII ４４９ ＦｏｋＩ ４８７ ＢｇｌＩ ５３６ ＢｇｌII ５５０
【００１０】化学合成及び酵素的連結（ライゲーショ
ン）反応による部分配列の構築は、既知の方法（欧州特
許出願０，１３３，２８２、０，１３６，４７２、０，
１５５，５９０、０，１６１，５０４、０，１６３，２
４９、０，１７１，０２４、０，１７３，１４９又は
０，１７７，８２７号明細書）によって行う。制限酵素
による分析、ＤＮＡフラグメントの連結及び大腸菌
（Ｅ．coli）におけるプラスミドの形質転換等の詳細
は、Ｍａｎｉａｔｉｓによる成書に記載されている。
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９
８２）。
【００１１】このようにして、クローニングされた遺伝
子配列は、植物に導入されて植物の調節遺伝子シグナル
の支配下におかれ、発現が誘導される。欧州特許出願
０，１２２，７９１号明細書に既知の方法が解説されて
いる。このようにして、ＰＴＣ耐性を示す（形質転換細
胞を選択する性質を有する）植物細胞、植物体又は植物
体部分及び種子が得られる。
【００１２】本発明の実施態様のいくつかは、次の諸例
によって詳細に説明された通りである。特に記載がない
限り、パーセント表示は重量パーセントである。
【００１３】例 下記の諸例においては、次の培地を用いた。 ａ）細菌用： ＹＴ培地：０．５％酵母エキス、０．８％パクトトリプ
トン、０．５％食塩 ＬＢ培地：０．５％酵母エキス、１％バクトトリプト
ン、１％食塩 固形培地：上記それぞれの培地に１．５％の寒天を添加 ｂ）植物用： Ｍ＋Ｓ培地：Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ： Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５ （１９６２）４７３を参照されたい。 ２ＭＳ培地：２％シュークロースを含むＭ＋Ｓ培地 ＭＳＣ１０培地：２％シュークロース、５００mg/lセフ
ォタクシム、０．１mg/lナフチル酢酸（ＮＡＡ）、１mg
/lベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１００mg/lカナマ
イシンを含むＭ＋Ｓ培地 ＭＳＣ１５培地：２％シュークロース、５００mg/lセフ
ォタキシム、１００mg/lカナマイシンを含むＳ＋Ｍ培地
【００１４】例１ 一本鎖オリゴヌクレオチドの化学合
成 ４個の部分フラグメントＩ−IVの一つであるフラグメン
トIIの合成は、末端オリゴヌクレオチドIIｃ（ＤＮＡ配
列Ｉのコード鎖中のヌクレオチド番号２１９−３１２）
から開始した。固相合成のために、オリゴヌクレオシド
（この場合はヌクレオチド番号３１２のグアノシン）の
３′末端をその３′水酸基を介して支持体に共有結合さ
せる。このとき、支持体は、長鎖アミノアルキル基を官
能基として有するＣＰＧ（調整孔ガラス）を用いる。そ
の他に関しては、合成は、前出の欧州特許出願に記載の
既知の方法に準じて行った。
【００１５】合成の設計は、ＤＮＡ配列II（添付図面第
２図）に示した通りである。これは、他の点においては
ＤＮＡ配列Ｉ（第１図）に対応している。
【００１６】例２ 一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的
結合による遺伝子フラグメントIIの形成 オリゴヌクレオチドの５′末端を燐酸化するために、オ
リゴヌクレオチドIIｂ及びIIｃの各１nmolを、それぞれ
５nmolのアデノシン三燐酸及び４ユニットのＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼと２０μｌの緩衝液（５０mMトリス
−塩酸（ｐＨ７．６）、１０mM塩化マグネシウム及び１
０mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む）中で３７℃
で３０分間反応させた。その後、９５℃で５分間加熱し
て酵素を失活させた。ＤＮＡフラグメントIIで「突出」
配列を形成するオリゴヌクレオチドIIａ及びIIｄは燐酸
化しない。これによって、次の連結プロセス中において
ＤＮＡフラグメントIIに相当するよりも大きいサブフラ
グメントの形成が妨げられる。
【００１７】オリゴヌクレオチドII（ａ−ｄ）を次のよ
うにして連結して、サブフラグメントIIを構成する。ま
ず、オリゴヌクレオチドIIａ及びIIｄ、５′末端を燐酸
化したオリゴヌクレオチドIIｂおよびIIｃの各１nmolを
一緒に４５μｌの緩衝液（５０mMトリス−塩酸（ｐＨ
７．６）、２０mM塩化マグネシウム、２５mM塩化カリウ
ム及び１０mMＤＴＴを含む）に溶解する。ＤＮＡフラグ
メントIIに対応するオリゴヌクレオチドをアニーリング
させるため、オリゴヌクレオチド溶液を９５℃で２分間
加熱の後、緩やかに（２−３時間かけて）２０℃まで冷
却する。次いで、酵素的結合を行うために、２μｌの
０．１M ＤＴＴ、８μｌの２．５mMアデノシン三燐酸
（ｐＨ７）及び５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（２０００
ユニット）を加え、この混合溶液を２２℃で１６時間反
応させる。
【００１８】遺伝子フラグメントIIを、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（アクリルアミド濃度１０％、尿素無
添加、ゲルサイズ２０×４０cm、厚さ１mm）によって精
製する。用いるマーカー物質は、ＨｉｎｆＩで切断した
φＸ１７４ＤＮＡ（ＢＲＬ社製）又はＨａｅIII で切断
したｐＢＲ３２２である。
【００１９】遺伝子フラグメントＩ、III 及びIVを同様
の方法にて調整するが、連結ステップが不要であるの
で、「突出」配列はアニーリングの前に５′燐酸に転換
する。
【００２０】例３ 遺伝子フラグメントＩ、II、III 及
びIVを含むハイブリッドプラスミドの調製 ａ）ｐＵＣ１８への遺伝子フラグメントＩの組み込み 市販のプラスミドｐＵＣ１８を、制限酵素ＳａｌＩ及び
ＸｂａＩを製造者の指示通りに用いて、既知の方法で開
環する。制限酵素反応混合液を１％アガロースゲル電気
泳動にかけて既知の方法で分画し、フラグメントをエチ
ジウムブロマイドで染色して可視化する。プラスミドバ
ンド（約２．６ｋｂ）をアガロースゲルから切り出し
て、そのアガロースからＤＮＡを電気溶出させる。
【００２１】最後に、ＸｂａＩ及びＳａｌＩで開環した
１μｇのプラスミドと１０ngのＤＮＡフラグメントＩと
を１６℃で一晩反応させて連結する。
【００２２】ｂ） ｐＵＣ１８への遺伝子フラグメント
IIの組み込み ａ）と同様の方法にて、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩを用い
て開環したｐＵＣ１８と遺伝子フラグメントIIとを連結
する。その際、フラグメントIIは、例２で述べたように
突出末端を予め燐酸化しておく。
【００２３】ｃ）ｐＵＣ１８への遺伝子フラグメントII
I の組み込み ａ）と同様の方法にて、ｐＵＣ１８をＢａｍＨＩ及びＸ
ｍａIII を用いて開環して、遺伝子フラグメントIII と
連結する。
【００２４】ｄ）ｐＵＣ１８への遺伝子フラグメントIV
の組み込み ａ）と同様の方法にて、ｐＵＣ１８をＸｍａIII 及びＳ
ａｌＩを用いて開環して、遺伝子フラグメントIVと連結
する。
【００２５】例４ 完全遺伝子の構築及びｐＵＣプラス
ミドにおけるクローニング ａ）形質転換及び遺伝子フラグメントＩ−IVの複製 このようにして得たハイブリッドプラスミドを用いて大
腸菌を形質転換した。このために、大腸菌Ｋ１２株を７
０mMの塩化カルシウム溶液で処理してコンピテント（Ｄ
ＮＡを導入できる状態）にし、ハイブリッドプラスミド
の懸濁液（７０mMカルシウムを含む１０mMトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５））を加える。常法に従って、プラ
スミドの示す抗生物質耐性又は感受性を利用して形質転
換体を選択し、ハイブリッドベクターを複製する。細胞
を死滅させた後、ハイブリッドプラスミドを分離し、最
初に用いたものと同じ制限酵素で開環し、遺伝子フラグ
メントＩ、II、III 及びIVをゲル電気泳動にて分離す
る。
【００２６】ｂ）遺伝子フラグメントＩ、II、III 及び
IVの連結による全遺伝子の構築 複製によって得られたサブフラグメントＩとIIとを次の
ようにして連結する。分離したフラグメントＩ及びIIの
各１００ngを１０μｌの緩衝液（５０mMトリス−塩酸
（ｐＨ７．６）、２０mM塩化マグネシウム及び１０mMＤ
ＴＴを含む）に溶解し、この溶液を５７℃で５分間加熱
処理する。溶液を室温にまで戻した後、１μｌの１０mM
アデノシン三燐酸（ｐＨ７）及び１μｌのＴ４リガーゼ
（４００ユニット）を加え、室温で１６時間反応させ
る。制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断後、
所望の３１２塩基対フラグメント（ヌクレオチド番号１
−３１２、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）を８％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離精製する。ゲ
ル電気泳動に用いるマーカー物質は、制限酵素ＨａｅII
I にて切断したφＸ１７４ＲＦＤＮＡ（ＢＲＬ社製）で
ある。
【００２７】遺伝子フラグメントIII とIVとを同様の方
法にて連結し、精製をして２４６塩基対のフラグメント
（ヌクレオチド番号３１３−５５８、ＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｌＩフラグメント）を得る。ゲル電気泳動に用いるマー
カーは、制限酵素ＭｓｐＩで切断したｐＢＲ３２２であ
る。
【００２８】全遺伝子（ＤＮＡ配列Ｉ）を構築するため
に、１５ngの３１２塩基対フラグメント及び１２ngの２
４６塩基対フラグメントを、前記のようにして１μｇの
市販のプラスミドｐＵＣ１８と連結させる。その際、ｐ
ＵＣ１８は、制限酵素ＳａｌＩにて予め開環し、末端を
酵素的に脱燐酸しておく。例４ａ）と同様の方法にて形
質転換及び複製を行った後、ＤＮＡ配列Ｉに相当する５
５８塩基対フラグメントを有する目的のクローンをＳａ
ｌＩ消化によって確認する。
【００２９】例５ ハイブリッドプラスミドの形質転換 コンビテントにした大腸菌をＤＮＡ配列Ｉを含むハイブ
リッドプラスミド０．１−１μｇにて形質転換し、アン
ピシリンを含む寒天平板に塗布する。このようにして、
プラスミドに正しく組み込まれた塩基配列を有するクロ
ーンを、迅速ＤＮＡ分析法（Ｍａｎｉａｔｉｓ：前出）
を用いて確認することができる。
【００３０】例６ 合成遺伝子と、植物において認識さ
れる調節シグナルとの融合 末端にＳａｌＩ切断部位を設けておいた最適条件にした
耐性遺伝子とプラスミドｐＤＨ５１（Ｐｉｅｔｒｚａｋ
ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９
８６）５８５７）のポリリンカー配列とを、ＳａｌＩ切
断部位で連結した。このプラスミドは、植物の転写機構
によって認識される、カリフラワーモデイクウイルス由
来の３５Ｓ転写のプロモーター及びターミネーターを含
んでいる。この連結によって、耐性遺伝子を、３５Ｓ転
写のプロモーターの下流であってターミネーターの上流
である位置に挿入した。この遺伝子の正確な位置を制限
酵素分析によって確認した。
【００３１】同様の方法にて、ソラナム・ツベロサム
（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からのＳＴ−
ＬＳＩ遺伝子のプロモーター（Ｅｃｋｅｓら：Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５（１９８６）１４）を、最
適条件にしたアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の植物
における発現に用いた。
【００３２】例７ 調節配列を含む耐性遺伝子のアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への挿入 ａ）同時取り込み法 プロモーター、最適条件にした耐性遺伝子及びターミネ
ーターを含む全転写ユニット（例６）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し、中間大腸菌ベクターｐＭＰＫ１１０（Ｐ
ｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ：博士論文、Ｕｎｉｖ．Ｃｏｌｏ
ｇｎｅ（１９８５）、ｐ９１以降参照）のＥｃｏＲＩ切
断部位に連結した。この中間ベクターは、耐性遺伝子を
その調節配列とともにアグロバクテリウム・ツメファシ
エンスのＴｉ（ティー・アイ）プラスミドに移動させる
のに必要であった。この、いわゆる接合は、Ｖａｎ Ｈ
ａｕｔｅらの記載している方法にて行った（ＥＭＢＯ
Ｊ．２（１９８３）４１１）。これによって、遺伝子
を、ｐＭＰＫ１１０ベクター及びＴｉプラスミドｐＧＶ
３８５０ｋａｎＲ（Ｊｏｎｅｓら：ＥＭＢＯ Ｊ．４
（１９８５）２４１１）に存在する標準ベクターｐＢＲ
３２２の塩基配列を介しての相同組換えによって、調節
シグナルとともにＴｉプラスミドに組み込んだ。
【００３３】この目的のため、大腸菌ＤＨ１（ｐＭＰＫ
１１０誘導体の宿主株）及びＧＪ２３（Ｖａｎ Ｈａｕ
ｔｅら：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４
（１９８６）５８５７）の新鮮培養液各５０μｌを、乾
燥させたＹＴ−寒天平板上で混合し、３７℃で１時間培
養した。得られた細菌を３mlの１０mM硫酸マグネシウム
に再懸濁させて、抗生物質を含む寒天平板（スペクチノ
マイシン５０μｇ／ml：ｐＭＰＫ１１０を選択、テトラ
サイクリン１０μｇ／ml：Ｒ６４ｄｒｄ１１を選択、カ
ナマイシン５０μｇ／ml：ｐＧＪ２８を選択）に塗布す
る。選択寒天平板で増殖する細菌は３種類のプラスミド
を有するものであって、アグロバクテリウム・ツメファ
シエンスと接合させるためにＹＴ液体培地中で３７℃で
増殖させた。アグロバクテリアをＬＢ培地中で２８℃で
培養した。細菌懸濁液各５０μｌを乾燥させたＹＴ−寒
天平板上で混合し、２８℃で１２−１６時間培養した。
得られた細菌を３mlの１０mM硫酸マグネシウムに再懸濁
させて、抗生物質を含む寒天平板（エリスロマイシン
０．０５g/l 、クロラムフェニコール０．０２５g/l ：
アグロバクテリウム菌株選択、ストレプトマイシン０．
０３g/l 及びスペクチノマイシン０．１g/l ：ｐＭＰＫ
１１０のＴｉプラスミドへの組入の選択）に塗布した。
相同接合によって細菌ＴｉプラスミドにｐＭＰＫ１１０
を組み込んだアグロバクテリアのみが、これらの選択平
板培地で増殖できる。
【００３４】ここにおいて、植物において活性であり、
最初から存在していた抗生物質カナマイシンに対する耐
性遺伝子の他に、ＰＴＣ耐性遺伝子がＴｉプラスミドｐ
ＧＶ３８５０ｋａｎＲ上に組み込まれた。これらのアグ
ロバクテリウムのクローンを形質転換に用いる前に、所
望の組み込みが行われたかどうかをサザーンブロット法
で確認した。
【００３５】ｂ）バイナリーベクター法 ｋｏｎｃｚら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４
（１９８６）３８３）の記載しているバイナリーベクタ
ーシステムを用いた。ｋｏｎｃｚらの記載しているベク
ターｐＰＣＶ７０１（ＰＮＡＳ ８４（１９８７）１３
１）を次のように改変した。とくにＴＲ１及びＴＲ２プ
ロモーターを含むフラグメントをベクターから取り除く
ために、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII を用い
た。得られたプラスミドを再び環状にした。このベクタ
ーのＥｃｏＲＩ切断部位に、ベクターｐＤＨ５１からの
フラグメントを挿入した。このｐＤＨ５１ベクターは、
約８００塩基対の長さで、カリフラワーモザイクウイル
ス由来の３５Ｓ転写のプロモーター及びターミネーター
を含んでいる。（Ｐｉｅｔｒｚａｋら：Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９８６）５８５８）。得
られたプラスミドｐＰＣＶ８０１は、３５Ｓプロモータ
ーとターミネーターとの間に唯１個のＳａｌＩ切断部位
を有する。最適条件にしたＰＴＣ耐性遺伝子をこの切断
部位に挿入した。ここにおいて、遺伝子の発現は３５Ｓ
転写調節配列の制御下に置かれた。
【００３６】このプラスミド（ｐＰＣＶ８０１Ａｃ）で
大腸菌ＳＭ１０（Ｓｉｍｏｎら：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ １（１９８３）７８４）を形質転換させた。
プラスミドｐＰＣＶ８０１Ａｃをアグロバクテリウム・
ツメファシエンスに移入するために、各５０μｌのＳＭ
１０培養液及びＣ５８アグロバクテリウム培養液（ＧＶ
３１０１、Ｖａｎ Ｌａｒｅｂｅｋｅら：Ｎａｔｕｒｅ
２５２（１９７４）１６９）をヘルパープラスミドと
してのＴｉプラスミドｐＭＰ９０ＲＫ（Ｋｏｎｃｚら：
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４（１９８６）３８
３）とともに、乾燥させたＹＴ寒天平板上で混合し、２
８℃で約１６時間培養した。得られた細菌を３mlの１mM
硫酸マグネシウムに再懸濁させ、これを抗生物質寒天平
板（リファンピシン０．１g/l ：ＧＶ３１０１を選択、
カナマイシン０．０２５g/l ：ｐＭＰ９０ＲＫを選択、
カルベニシリン０．１g/l ：ｐＰＣＶ８０１Ａｃを選
択）上に塗布した。両プラスミド（ｐＭＰ９０ＲＫ及び
ｐＰＣＶ８０１Ａｃ）を含むアグロバクテリアのみがこ
の平板上で増殖することができる。これらのアグロバク
テリアを植物の形質転換に用いる前に、プラスミドｐＰ
ＣＶ８０１Ａｃが間違いなくアグロバクテリア内に存在
しているかどうかを、サザーンブロット法によって確認
した。
【００３７】例８ アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスによるニコチナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ）の形質転換 最適条件にした耐性遺伝子を、いわゆる、リーフディス
ク形質転換法によってタバコ植物に移入した。アグロバ
クテリアを適当な抗生物質を含むＬＢ培地３０ml中で約
２８℃で継続振とうしながら培養した（約５日間）。得
られた細菌をクリスト遠心分離器による７０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心分離によって沈澱させ、２０mlの１０
mM硫酸マグネシウムで１回洗浄した。さらに遠心分離し
た後、得られた細菌を２０mlの１０mM硫酸マグネシウム
に懸濁させてペトリ皿に移した。２ＭＳ培地で無菌培養
したウィスコンシン３８タバコ植物の葉をリーフディス
ク感染に用いた。全ての無菌培養は、２５〜２７℃で、
１６時間明培養／８時間暗培養のサイクルで、明培養は
白色光の下で行った。
【００３８】タバコ葉を切り取り、葉の表面をサンドペ
ーパーにて傷つけ、これを小片に切り刻んで細菌培養液
に浸した。次いで、葉小片をＭ＋Ｓ培地に移し、通常の
培養条件で２日間維持した。２日間の細菌感染の後、葉
小片をＭ＋Ｓ液体培地で洗浄し、ＭＳＣ１０寒天平板に
移した。形質転換した芽を、共に移入されたカナマイシ
ン耐性をマーカーとして選択した。３−６週間の後、最
初の芽が肉眼で見えるようになった。個々の芽を、さら
にガラス容器中でＭＳＣ１５培地で培養した。数週間の
後、切断をしておいたいくつかの芽の切断部位からの根
が生じた。
【００３９】形質転換植物は、ＰＴＣを含む植物培地か
ら直接に選択することも可能であった。ＰＴＣ耐性遺伝
子の存在とその発現を、形質転換植物のＤＮＡ分析（サ
ザーンブロット法）及びＲＮＡ分析（ノーザンブロット
法）によって確認した。
【００４０】例９ 形質転換植物のＰＴＣ耐性の証明 形質転換植物の耐性遺伝子の機能を調べるため、形質転
換植物及び非形質転換植物からの葉片を０．１mMＬ−Ｐ
ＴＣを含むＭ＋Ｓ栄養培地に入れた。非転換植物からの
葉片は死滅したが、形質転換植物からの葉片は発芽し
た。形質転換植物からの葉からは根が生じ、１mMＬ−Ｐ
ＴＣを含むＭ＋Ｓ栄養培地上で容易に生長した。形質転
換した植物を無菌状態から土壌に移植し、そこで２kg／
ha及び５kg／haのＰＴＣ噴霧を行った。非転換植物は、
この除草剤処理では生存できなかったが、形質転換植物
ではこの除草剤による影響が認められなかった。噴霧処
理した形質転換植物の生長状態は、噴霧処理をしない対
照植物にも劣らなかった。
【００４１】例１０ 形質転換したＰＴＣ耐性植物にお
けるＰＴＣのアセチル化を証明するアセチルトランスフ
ェラーゼ分析 形質変換させたＰＴＣ耐性タバコ植物又は非転換タバコ
植物から採った葉組織約１００mgを緩衝液（５０mMトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、２mMＥＤＴＡ、０．１mg／ml
ロイペプチン、０．３mg／mlウシ血清アルブミン、０．
３mg／mlＤＴＴ、０．１５mg／mlフェニールメチルスル
フォニル・フルオライド（ＰＭＳＦ））中で均質化し
た。
【００４２】遠心分離の後、得られた上澄液の２０μｌ
を１μｌの放射線ラベルした１０mMＤ，Ｌ−ＰＴＣ及び
１μｌの１００mMアセチル−ＣｏＡとともに３７℃で２
０分間反応させた。その後、２５μｌの１２％トリクロ
ル酢酸を反応液に加え、遠心分離した。得られた上澄液
の７μｌを薄層クロマトグラフィープレートに移し、ピ
リジン／ｎ−ブタノール／酢酸／水の混液（容量比で５
０：７５：１５：６０）中で２回上昇展開を行った。Ｐ
ＴＣとアセチルＰＴＣとをこのようにして単離して、オ
ートラジオグラフィーで確認した。非形質変換植物にお
いてはＰＴＣのアセチルＰＴＣへの転化は見られなかっ
たが、形質変換させた耐性植物においてはこの転化が可
能であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子のＤＮＡ配列及びそれに対応す
るアミノ酸配列を示す、アミノ酸及びＤＮＡ配列Ｉ、の
説明図。
【図２】図１の本発明の遺伝子のＤＮＡ配列及びそれに
対応するアミノ酸配列を示し、かつ、該ＤＮＡ配列の構
築の設計をサブフラグメント名を表示して説明する、ア
ミノ酸及びＤＮＡ配列II、の説明図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 レナーテ、アリヤー ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、ケスタ ーカンプ、14 (72)発明者 ウォルフガング、ウォールレーベン ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、メンツ ェルシュトラーセ、１ (72)発明者 アルフレート、ピューラー ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、アム、 ワルトシュレースヒェン、２ (72)発明者 ペーター、エッケス ドイツ連邦共和国ケルクハイム（タウヌ ス）、アム、フラックスラント、18 (72)発明者 ギュンター、ドン ドイツ連邦共和国ホーフハイム、アム、タ ウヌス、ザクセンリング、35 (72)発明者 オイゲン、ウールマン ドイツ連邦共和国グラースヒュッテン、タ ウヌス、ツム、タールブリック、31 (72)発明者 フリードリッヒ、ハイン ドイツ連邦共和国ハッタースハイム、ア ム、マイン、エルレスリング、40 (72)発明者 フリードリッヒ、ウェンゲンマイヤー ドイツ連邦共和国ホーフハイム、アム、タ ウヌス、アム、ザイエンバッハ、38

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の（１）、（２）または（３）の遺伝
    子を含む単子葉植物細胞。 （１）下記のアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
    する耐性遺伝子であって、そのＧ＋Ｃ含量を低下させる
    ことによって植物中での使用に適するようにしてある、
    耐性遺伝子。 【化１】 （２）下記のＤＮＡ塩基配列Ｉ（ヌクレオチド番号９−
    ５５４）を含む、上記（１）に記載の耐性遺伝子。 【化２】 （３）植物において活性である調節及び発現シグナルと
    連結された、下記のＤＮＡ塩基配列を有する遺伝子。 【化３】
  2. 【請求項２】下記の（１）、（２）または（３）の遺伝
    子を含む単子葉植物体、単子葉植物体部分又は単子葉植
    物種子。 （１）下記のアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
    する耐性遺伝子であって、そのＧ＋Ｃ含量を低下させる
    ことによって植物中での使用に適するようにしてある、
    耐性遺伝子。 【化４】 （２）下記のＤＮＡ塩基配列Ｉ（ヌクレオチド番号９−
    ５５４）を含む、上記（１）に記載の耐性遺伝子。 【化５】 （３）植物において活性である調節及び発現シグナルと
    連結された、下記のＤＮＡ塩基配列を有する遺伝子。 【化６】
  3. 【請求項３】下記の（１）、（２）または（３）の遺伝
    子を単子葉植物に導入して該植物の調節遺伝子シグナル
    の制御下におき、それを発現させることからなる、フォ
    スフィノトリシン耐性の単子葉植物細胞、単子葉植物部
    分、単子葉植物体又は単子葉植物種子を産生させる方
    法。 （１）下記のアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
    する耐性遺伝子であって、そのＧ＋Ｃ含量を低下させる
    ことによって植物中での使用に適するようにしてある、
    耐性遺伝子。 【化７】 （２）下記のＤＮＡ塩基配列Ｉ（ヌクレオチド番号９−
    ５５４）を含む、上記（１）に記載の耐性遺伝子。 【化８】 （３）植物において活性である調節及び発現シグナルと
    連結された、下記のＤＮＡ塩基配列を有する遺伝子。 【化９】
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