DE3737918A1 - In pflanzen wirksames resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung - Google Patents
In pflanzen wirksames resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendungInfo
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Description
Die Hauptanmeldung P 36 28 747.4 betrifft ein Resistenzgen
gegen Phosphinothricin (PTC), erhältlich aus der Gesamt-DNA
von auf Phosphinothricyl-alanyl-alanin (PTT)-Resistenz
selektiertem Streptomyces viridochromogenes DSM 40 736
(allgemeine Sammlung) bzw. DSM 4112 (Hinterlegung unter
Budapester Vertrag) durch Schneiden mit BamHI, Klonieren
eines 4,0 kb großen Fragments und Selektion auf PTT-
Resistenz, sowie die Verwendung dieses Gens zur Herstellung
PTC-resistenter Pflanzen, als PTT-Resistenz-Marker in
Bakterien und als PTC-Resistenz-Marker in Pflanzenzellen.
Das Resistenzgen ist durch eine Restriktionskarte (Fig. 1)
charakterisiert, die das 4 kb große BamHI-Fragment näher
definiert.
Durch Klonieren von Teilbereichen dieses 4 kb-Fragmentes
wurde die Lage des Codierbereichs näher eingegrenzt.
Hierbei zeigte sich, daß das Resistenzgen auf dem 1,6 kb
SstII-SstI-Fragment (Positionen 0,55 bis 2,15 in Fig. 1
der Hauptanmeldung) liegt. Durch Verdauung mit BglII wird
ein 0,8 kb großes Fragment gewonnen, das nach Einbau in ein
Plasmid und Transformation von S. lividans PTT-Resistenz
vermittelt. Diese Resistenz ist durch die N-Acetylierung
von PTC bedingt. Das Resistenzgen codiert somit für eine
Acetyltransferase.
In der Zusatzanmeldung P 36 42 829.9 ist die DNA-Sequenz
des vorstehend genannten 0,8 kb-Fragmente wiedergegeben.
Aus der Sequenz läßt sich das Startcodon und der offene
Leseraster der Gensequenz bestimmen. Das letzte Nucleotid
ist Teil des Stop-Codons TGA.
Gene aus Streptomyceten besitzen mit einem Verhältnis
Adenin (A) + Thymin (T) : Guanin (G) + Cytosin (C) von ca.
30% : 70% einen sehr hohen Anteil an G + C. Der GC-Anteil
von Pflanzengenen liegt mit ca. 50% weitaus niedriger.
Aus diesem Grunde wurde in weiterer Ausgestaltung des
Erfindungsgedankens die DNA-Sequenz des Resistenzgens durch
Neusynthese auf einen für die pflanzliche RNAPolymerase II
günstigen Codongebrauch optimiert.
Die Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert. Weitere
Ausgestaltungen werden im folgenden erläutert.
Der genetische Code ist bekanntlich entartet, d. h. daß nur
für 2 Aminosäuren ein einziges Triplett codiert, während
den restlichen 18 genetisch codierbaren Aminosäuren 2
bis 6 Tripletts zugeordnet sind. Für die Synthese des Gens
steht somit theoretisch zur Auswahl. Da der genannte relative
Anteil der einzelnen Nukleotide an der Gesamt- DNA-Sequenz
von Einfluß ist, wurde er als eines der Kriterien bei der
Sequenzoptimierung zugrunde gelegt.
Folgende Änderungen an dem sequenzierten Gen wurden
durchgeführt:
- 1. Das Streptomycetengen-Startcodon GTG (Position 258-260 in der Sequenz der ersten Zusatzanmeldung) wurde gegen das von der pflanzlichen RNA-Polymerase II benutzte Startcodon ATG ausgetauscht.
- 2. Innerhalb des Gens wurden die Streptomycetengencodons so verändert, daß in Pflanzengenen geeignete Codons daraus resultierten (G/C-Verhältnis).
- 3. Zur Beendigung des Translationsvorgangs wurde an das Ende der Sequenz das TGA-Stopcodon gesetzt.
- 4. Anfang und Ende der Gensequenz wurden mit überhängenden Enden von Restriktionsstellen versehen, um das Gen amplifizieren und zwischen pflanzliche Regulationssequenzen ligieren zu können.
- 5. Palindromische Sequenzen wurden auf ein Mindestmaß reduziert.
Die DNA-Sequenz I ist im Anhang wiedergegeben.
Drei interne singuläre Schnittstellen für die
Restriktionsenzyme XbaI (Position 152), BamHI (312)
und XmaI (436) ermöglichen die Subklonierung von
Teilsequenzen, die in gut untersuchte Klonierungsvektoren,
wie etwa pUC18 oder pUC19, eingebaut werden können.
Zusätzlich wurden innerhalb des Gens eine Reihe von
weiteren singulären Erkennungssequenzen für
Restriktionsenzyme eingebaut, die einerseits einen Zugang
zu Teilsequenzen der Acetyltransferase schaffen und
andererseits die Durchführung von Variationen erlauben:
Restriktionsenzym | |
Schnitt nach Nucleotid-Nr. (codierender Strang) | |
BspMII | |
11 | |
SacII | 64 |
EcoRV | 74 |
HpaI | 80 |
AatII | 99 |
BstXI | 139 |
ApaI | 232 |
ScaI | 272 |
AvrII | 308 |
AflII | 336 |
StuI | 385 |
BssHII | 449 |
FokI | 487 |
BglI | 536 |
BglII | 550 |
Der Aufbau der Teilsequenzen durch chemische Synthese und
enzymatische Ligationsreaktion erfolgt in an sich bekannter
Weise (EP-A 01 33 282, 01 36 472, 01 55 590, 01 61 504,
01 63 249, 01 71 024, 01 73 149 oder 01 77 827). Details
wie Restriktionsanalysen, Ligation von DNA-Fragmenten und
Transformation von Plasmiden in E. coli sind ausführlich im
Lehrbuch von Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al.,
Cold Spring Harbor, 1982) beschrieben.
Die so klonierte Gensequenz wird dann unter der Kontrolle
pflanzlicher Regulationssignale in Pflanzen eingeführt
und zur Expression gebracht. Die EP-A 01 22 791 gibt eine
Übersicht über bekannte Methoden. Man erhält so PTC-
resistente Pflanzenzellen, d. h. man hat ein
Selektionsmerkmal für transformierte Zellen, und Pflanzen.
In den folgenden Beispielen werden einige Ausgestaltungen
der Erfindung im einzelnen erläutert. Prozentangaben
beziehen sich hierbei auf das Gewicht, wenn nichts anderes
angegeben ist.
Die folgenden Medien wurden eingesetzt:
- a) für Bakterien:
YT-Medium: 0,5% Hefe-Extrakt, 0,8% Bacto Trypton, 0,5% NaCl
LB-Medium: 0,5% Hefe-Extrakt, 1% Bacto Trypton, 1% NaCl
als Festmedium: jeweils Zugabe von 1,5% Agar - b) für Pflanzen:
M+S-Medium: Siehe Murashige und Skoog, Physiologica Plantarum 15 (1962) 473
2Ms-Medium: M+S-Medium mit 2% Saccharose
MSC10-Medium: M+S-Medium mit 2% Saccharose, 500 mg/l Cefotaxim, 0,1% mg/l Naphthylessigsäure (NAA), 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 100 mg/l Kanamycin
MSC15-Medium: M+S-Medium mit 2% Saccharose, 500 mg/l Cefotaxim, 100 mg/l Kanamycin.
Als Ausgang für die des Fragments II, Synthese eines der
vier Teilfragmente I-IV, diente das endständige
Oligonukleotid IIc (Nukleotide Nr. 219 bis 312 des
codierenden Stranges der DNA-Sequenz I). Für die
Festphasensynthese wird das am 3′-Ende stehende
Nukleosid, im vorliegenden Fall also Guanosin (Nukleotid
Nr. 312), über die 3′-Hydroxyfunktion kovalent an einen
Träger gebunden verwendet. Trägermaterial ist mit
langkettigen Aminoalkylresten funktionalisiertes CPG
("Controlles Pore Glass"). Im übrigen folgt die Synthese
den (aus den auf Seite 4, Zeile 1-2 genannten EP-A)
bekannte Methoden.
Der Syntheseplan ist in die DNA-Sequenz II (Anhang)
eingezeichnet, die im übrigen der DNA-Sequenz I entspricht.
Zur Phosphorylierung der Oligonukleotide am 5′-Terminus
wurde je 1 nmol der Oligonukleotide IIb und IIc mit
5 nmol Adenosintriphosphat und 4 Einheiten T4-
Polynukleotid-Kinase in 200 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid und 10 mM
Dithiothreitol (DTT) 30 Minuten bei 37°C behandelt.
Das Enzym wird durch fünfminütiges Erhitzen auf 95°C
desaktiviert. Die Oligonukleotide IIa und IId, welche
im DNA-Fragment II die "überhängende" Sequenz bilden,
werden nicht phosphoryliert. Dies verhindert bei der
nachfolgenden Ligation die Ausbildung größerer
Subfragmente als sie dem DNA-Fragment II entsprechen.
Die Oligonukleotide II (a-d) werden wie folgt zum
Subfragment II ligiert: Je 1 mmol der Oligonukleotide
IIa und IId sowie der 5′-Phosphate von IIb und IIc
werden zusammen in 45 µl Puffer, enthaltend 50 mM
Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM Magnesiumchlorid, 25 mM
Kaliumchlorid und 10 mM DTT, gelöst. Für das "Annealing"
der Oligonukleotide gemäß DNA-Fragment II wird die
Lösung der Oligonukleotide 2 Minuten auf 95°C erhitzt
und dann langsam (2-3 Stunden) auf 20°C abgekühlt. Zur
enzymatischen Verknüpfung setzt man dann 2 µl 0,1 m DTT,
8 µl 2,5 mM Adenosintriphosphat (pH 7) sowie 5 µl T4-
DNA-Ligase (2000 Units) zu und inkubiert 16 Stunden bei
22°C.
Die Reinigung des Genfragments II erfolgt durch
Gelelektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamidgel
(ohne Harnstoffzusatz, 20·40 cm, 1 mm Dicke), wobei
als Markersubstanz ⌀X 174 DNA (Fa. BRL), geschnitten
mit Hinfl oder pBR322, geschnitten mit HaeIII, diente.
Die Herstellung der Genfragmente I, III und IV erfolgt
analog, wobei aber die "überhängenden" Sequenzen vor dem
"Annealing" in die 5′-Phosphate übergeführt werden, da
kein Ligationsschritt erforderlich ist.
Das handelsübliche Plasmid pUC18 wird in bekannter
Weise mit den Restriktionsendonukleasen SalI und XbaI
nach den Angaben der Hersteller geöffnet. Der
Verdauungsansatz wird auf einem 1%igen Agarosegel
durch Elektrophorese in bekannter Weise aufgetrennt
und die Bruchstücke durch Anfärben mit Ethidiumbromid
sichtbar gemacht. Die Plasmidbande (ca. 2,6 kb) wird
anschließend aus dem Agarosegel herausgeschnitten und
durch Elektroelution von der Agarose abgetrennt.
1 µg Plasmid, mit XbaI und SalI geöffnet, wird dann mit
10 ng des DNA-Fragments I über Nacht bei 16°C ligiert.
Analog zu a) wird pUC18 mit XbaI und BamHI
aufgeschnitten und mit dem Genfragment II, das zuvor
wie in Beispiel 2 beschrieben an den überhängenden
Enden phosphoryliert wurde, ligiert.
Analog zu a) wird pUC18 mit BamHI und XmaIII
aufgeschnitten und mit dem Genfragment III ligiert.
Analog zu a) wird pUC18 mit XmaIII und SalI geschnitten
und mit dem Genfragment IV ligiert.
Die so erhaltenen Hybridplasmide werden in E. coli
transformiert. Hierzu wird der Stamm E. coli K 12
durch Behandlung mit einer 70 mM Calciumchloridlösung
kompetent gemacht und mit der Suspension des
Hybridplasmids in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5),
der 70 mM an Calciumchlorid ist, versetzt. Die
transformierten Stämme werden wie üblich unter
Ausnutzung der durch das Plasmid vermittelten
Antibiotikaresistenzen bzw. -empfindlichkeiten
selektioniert und die Hybridvektoren amplifiziert.
Nach Abtöten der Zellen werden die Hybridplasmide
isoliert, mit den ursprünglich eingesetzten
Restriktionsenzymen aufgeschnitten und die
Genfragmente I, II, III und IV durch
Gelelektrophorese isoliert.
Die durch Amplifikation erhaltenen Subfragmente I
und II werden wie folgt verknüpft. Je 100 ng der
isolierten Fragmente I und II werden zusammen in
10 µl Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6),
20 mM Magnesiumchlorid und 10 mM DTT, gelöst und
diese Lösung wird 5 Minuten auf 57°C erhitzt.
Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist,
gibt man 1 µl 10 mM Adenosintriphosphat (pH 7) sowie
1 µl T4-DNA-Ligase (400 Units) zu und inkubiert
16 Stunden bei Raumtemperatur. Nach dem Nachschneiden
mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI wird das
gewünschte 312 bp-Fragment (Nukleotide 1-312, SalI-
BamHI) durch Gelelektrophorese auf einem 8%igen
Polyacrylamidgel gereinigt, wobei als Markersubstanz
⌀X 174 RF DNA (Fa. BRL), geschnitten mit dem
Restriktionsenzym HaeIII, dient.
In gleicher Weise werden die Genfragmente III und IV
miteinander verknüpft, wobei man nach der Reinigung
ein 246 bp-Fragment (Nukleotide 313-558, BamHI-SalI)
erhält. Als Marker bei der Gelelektrophorese wird
pBR322, geschnitten mit dem Restriktionsenzym MspI,
verwendet.
Zum Aufbau des Gesamtgens (DNA-Sequenz I) werden
15 ng des 312 bp-Fragmentes und 12 ng des 246 bp-
Fragmentes mit 1 µg des handelsüblichen Plasmids
pUC18, das zuvor mit dem Restriktionsenzym SalI
aufgeschnitten und an den Enden enzymatisch
dephosphoryliert wurde, wie oben beschrieben
ligiert. Nach der Transformation und Amplifikation
(wie in Beispiel 4a) beschrieben wird durch SalI-
Verdauung der richtige Klon mit dem 558 bp-Fragment
gemäß der DNA-Sequenz I identifiziert.
Kompetente E. coli-Zellen werden mit 0,1 bis 1 µg des
Hybridplasmids, das die DNA-Sequenz I enthält, transformiert
und auf Amipicillin enthaltenden Agarplatten plattiert.
Anschließend lassen sich Klone, die die korrekt
integrierten Sequenzen im Plasmid enthalten, durch
DNA-Schnellaufarbeitung identifizieren (Maniatis a.a.O.).
Das an den Enden mit SalI-Schnittstellen versehene
optimierte Resistenzgen wurde in die SalI-Schnittstelle
der Polylinkersequenz des Plasmides pDH51 (Pietrzak et
al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5857) ligiert. Auf
diesem Plasmid sind Promotor und Terminator des 35S-
Transkripts aus Cauliflower Mosaic Virus lokalisiert,
die vom pflanzlichen Transkriptionsapparat erkannt werden.
Durch die Ligation des Resistenzgens wurde dieses hinter
dem Promotor und vor dem Terminator des 35S-Transkripts
inseriert. Die korrekte Orientierung des Gens wurde
durch Restriktionsanalysen bestätigt.
Der Promotor des ST-LS1-Gen aus Solanum Tuberosum (Eckes
et al., Mol. Gen. Genet. 205 (1986) 14) wurde ebenfalls
zur Expression des optimierten Acetyltransferase-Gens
in Pflanzen verwendet.
Die gesamte Transkriptionseinheit aus Promotor,
optimiertem Resistenzgen und Terminator (Beispiel 6)
wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI ausgeschnitten
und in die EcoRI-Schnittstelle des intermediären
E. coli-Vektors pMPK110 ligiert (Peter Eckes,
Dissertation, Univ. Köln, 1985, S. 91 f.). Dieser
intermediäre Vektor war nötig, um das Resistenzgen
mit seinen Regulationssequenzen in das Ti-Plasmid
von Agrobacterium tumefaciens zu überführen. Diese
sogenannte Konjugation wurde nach dem von Van Haute
et al. (EMBO J. 2 (1983) 411) beschriebenen Verfahren
druchgeführt. Dabei wurde das Gen mit seinen
Regulationssignalen durch homologe Rekombination
über die im pMPK110-Vektor und im Ti-Plasmid
pGV3850kanR (Jones et al., EMBO J. 4 (1985) 2411)
enthaltenen Sequenzen des Standardvektors pBR322 in
das Ti-Plasmid integriert.
Dazu wurden je 50 µl frische Flüssigkulturen der
E. coli-Stämme DH1 (Wirtsstamm des pMPK110-Derivates)
und GJ23 (Van Haute et al., Nucleic Acids Res. 14
(1986) 5857) auf einer trockenen YT-Agarplatte
vermischt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Die Bakterien wurden in 3 ml 10 mM MgSO4
resuspendiert und auf Antibiotika-Agarplatten
ausplattiert (Spectinomycin 50 µg/ml: Selektion
auf pMPK110; Tetracyclin 10 µg/ml: Selektion auf
R64drd11; Kanamycin 50 µg/ml: Selektion auf pGJ28).
Die auf den selektriven Agarplatten wachsenden
Bakterien enthielten die drei Plasmide und wurden
für die Konjugation mit Agrobacterium tumefaciens in
YT-Flüssigmedium bei 37°C vermehrt. Die Agrobakterien
wurden in LB-Medium bei 28°C kultiviert. Je 50 µl
Bakteriensuspension wurden auf einer trockenen
VT-Agarplatte vermischt und für 12 bis 16 Stunden bei
28°C inkubiert. Die Bakterien wurden in 3 ml 10 mM
MgSO₄ resuspendiert und auf Antibiotikaplatten
ausplattiert (Erythromycin 0,05 g/l, Chloramphenicol
0,025 g/l: Selektion auf den Agrobakterienstamm;
Streptomycin 0,3 g/l und Spectinomycin 0,1 g/l:
Selektion auf die Integration des pMK110 in das
Ti-Plasmid). Auf diesen selektiven Platten können nur
Agrobakterien wachsen, bei denen das pMPK110-Derivat
durch eine homologe Rekombination in das bakterielle
Ti-Plasmid integriert ist.
Auf dem Ti-Plasmid pGV3850kanR war nun neben dem
schon vorher vorhandenen, in Pflanzen wirksamen
Resistenzgen gegen das Antibiotikum Kanamycin auch
das Resistenzgen gegen PTC lokalisiert. Bevor diese
Agrobakterienklone für die Transformation eingesetzt
wurden, wurde durch ein "Southern-Blot"-Experiment
überprüft, ob die gewünschte Integration erfolgt war.
Es wurde das binäre Vektorsystem, das von Koncz et al.
(Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383) beschrieben worden
war, verwendet. Der von Koncz et al. (PNAS 84 (1987)
131) beschriebene Vektor pPCV701 wurde folgendermaßen
verändert: Mit den Restiktionsenzymen BamHI und
HindIII wurde ein Fragment, auf dem u.a. die
Promotoren TR1 und TR2 lokalisiert sind, aus dem
Vektor entfernt. Das resultierende Plasmid wurde
rezirkularisiert. In die vorhandene EcoRI-Schnittstelle
auf diesem Vektor wurde ein ca. 800 Basenpaare langes
Fragment aus dem Vektor pDH51 inseriert, auf dem
Promotor und Terminator des 35S-Transkriptes aus
Cauliflower Mosaic Virus lagen (Pietrzak et al.,
Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5858). Das resultierende
Plasmid pPCV801 hatte zwischen 35S-Promotor und
-Terminator eine singuläre SalI-Schnittstelle. In
diese Schnittstelle wurde das optimierte
PTC-Resistenzgen inseriert. Seine Expression
stand nun unter der Kontrolle der 35S-Transkript-
Regulationssequenzen.
Dieses Plasmid (pPCV801Ac) wurde in den E. coli-Stamm
SM10 transformiert (Simon et al., Bio/Technology 1
(1983), 784). Zur Überführung des Plasmids pPCV801Ac
nach Agrobacterium tumefaciens wurden je 50 µl der
SM10-Kultur und einer C58-Agrobacterienkultur (GV3101,
Van Larebeke et al., Nature 252 (1974) 169) mit dem
Ti-Plasmid pMP90RK (Koncz et al., a.a.O.) als
Helferplasmid auf einer trockenen YT-Agarplatte
vermischt und für ca. 16 Stunden bei 28°C inkubiert.
Die Bakterien wurden anschließend in 3 ml 1 mM MgSO₄
resuspendiert und auf Antibiotikaplatten ausplattiert
(Rifampicin 0,1 g/l: Selektion auf GV3101, Kanamycin
0,025 g/l: Selektion auf pMP90RK, Carbenicillin
0,1 g/l: Selektion auf pPCV801Ac). Auf diesen Platten
können nur Agrobakterien wachsen, die beide Plasmide
(pMP90RK und pPCV801Ac) enthalten. Bevor diese
Agrobakterien für die Pflanzenzentransformation
eingesetzt wurden, wurde durch "Southern Blotting"
überprüft, daß das Plasmid pPCV801Ac in seiner
korrekten Form in den Agrobakterien vorhanden ist.
Das optimierte Resistenzgen wurde mittels der
sogenannten "leaf disc" Transformationsmethode in
Tabakpflanzen übertragen.
Die Agrobakterien wurden in 30 ml LB-Medium mit den
entsprechenden Antibiotika bei 28°C unter ständigem
Schütteln herangezogen (etwa 5 Tage). Dann wurden die
Bakterien durch eine zehnminütige Zentrifugation bei
7000 rpm in einer Christ-Zentrifuge sedimentiert und
einmal mit 20 ml 10 mM MgSO₄ gewaschen. Nach einer
weiteren Zentrifugation wurden die Bakterien in 20 ml
10 mM MgSO₄ suspendiert und in eine Petrischale
überführt. Für die Blattscheiben-Infektion wurden
Blätter von in Sterilkultur auf 2MS-Medium wachsenden
Wisconsin 38-Tabakpflanzen verwendet. Alle
Sterilkulturen wurden bei 25 bis 27°C in einem 16 Stunden
Licht/8 Stunden Dunkel-Rhythmus bei Weißlicht gehalten.
Tabakblätter wurden abgeschnitten und die Blattoberflächen
mit Sandpapier verwundet. Nach der Verwundung wurden
die Blätter in kleinere Stücke zerschnitten und in die
Bakterienkultur getaucht. Dann wurden die Blattstücke
auf M+S-Medium transferiert und für zwei Tage unter
normalen Kulturbedingungen gehalten. Nach der zweitägigen
Infektion mit den Bakterien wurden die Blattstücke in
flüssigem M+S-Medium gewaschen und auf MSC10-Agarplatten
überführt. Transformierte Sprosse wurden aufgrund der
mitübertragenen Resistenz gegen das Antibiotikum
Kanamycin selektioniert. 3 bis 6 Wochen später wurden
die ersten Sprosse sichtbar. Einzelne Sprosse wurden auf
MSC15-Medium in Glasdosen weiterkultiviert. In den
folgenden Wochen bildeten einige der abgeschnittenen
Sprosse an der Schnittstelle Wurzeln.
Transformierte Pflanzen konnten auch direkt auf PTC-
haltigen Pflanzenmedien selektioniert werden.
Durch DNA-Analyse ("Southern Blotting") und RNA-Analyse
("Northern Blotting") der transformierten Pflanzen wurde
das Vorhandensein und die Expression des PTC-Resistenzgens
nachgewiesen.
Zur Überprüfung der Funktionalität des Resistenzgens in
transformierten Pflanzen wurden Blattfragmente
transformierter und nichttransformierter Pflanzen
auf M+S-Nährmedien mit 1·10-4 M L-PTC überführt. Die
Fragmente nichttransformierter Pflanzen starben ab,
während aus den Fragmenten transformierter Pflanzen neue
Sprosse regeneriert werden konnten. Transformierte
Sprosse bewurzelten und wuchsen ohne Probleme auf M+S-
Nährmedien mit 1·10-3 M L-PTC. Transformierte Pflanzen
wurden aus sterilen Bedingungen in Erde getopft und
mit 2 kg/ha und 5 kg/ha PTC besprüht. Während
nichttransformierte Pflanzen diese Herbizidbehandlung
nicht überlebten, zeigten transformierte Pflanzen keine
durch das Herbizid bewirkten Schädigungen. Das Aussehen
und Wuchsverhalten der besprühten, transformierten
Pflanzen war mindestens genauso gut wie bei unbesprühten
Kontrollpflanzen.
Ca. 100 mg Blattgewebe von Transgenen, PTC-resistenten
Tabakpflanzen bzw. von nichttransformierten Tabakpflanzen
wurden in einem Puffer, bestehend aus : 50 mM Tris/HCl
pH 7,5; 2 mM EDTA; 0,1 mg/ml Leupeptin; 0,3 mg/ml
Rinderserumalbumin; 0,3 mg/ml DTT; 0,15 mg/ml
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) homogenisiert.
Nach anschließender Zentrifugation wurden 20 µl des
klaren Überstandes mit 1 µl 10 mM radioaktiv
markierten D,L-PTC und 1 µl 100 mM Acetyl-CoA für
20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die
Reaktionsmischung mit 25 µl 12% Trichloressigsäure
versetzt und abzentrifugiert. Vom Überstand wurden 7 µl
auf eine Dünnschichtchromatographie-Platte übertragen
und in einem Gemisch aus Pyridin : n-Butanol :
Essigsäure : Wasser (50 : 75 : 15 : 60 Volumenteile)
aufsteigend zweimal entwickelt. PTC und Acetyl-PTC
wurden so voneinander getrennt und konnten durch
Autoradiographie nachgewiesen werden.
Nichttransformierte Pflanzen zeigten keine Umsetzung
des PTC zum Acetyl-PTC, während transgene, resistente
Pflanzen dazu in der Lage waren.
Claims (10)
1. Resistenzgen gemäß Patent (Patentanmeldung
P 36 28 747.4) und Zusatzpatent (Patentanmeldung
P 36 42 829.9), dadurch gekennzeichnet, daß es an den
Codongebrauch in Pflanzen angepaßt ist.
2. Resistenzgen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die
DNA-Sequenz I (Anhang, Nukleotidposition 9-554).
3. Genstruktur, gekennzeichnet durch die DNA-Sequenz I
(Anhang), gekoppelt an in Pflanzen wirksame Regulations-
und Expressionssignale.
4. Vektor, gekennzeichnet durch das Resistenzgen nach
Anspruch 1 oder 2.
5. Vektor, gekennzeichnet durch eine Genstruktur nach
Anspruch 3.
6. Vektoren, gekennzeichnet durch eines oder mehrere der
Genfragmente I-IV.
7. Wirtszelle, gekennzeichnet durch einen Vektor nach
Anspruch 4, 5 oder 6.
8. Pflanzenzelle, gekennzeichnet durch ein Gen nach
Anspruch 1, 2 oder 3.
9. Pflanzen, deren Teile und Samen, gekennzeichnet durch
ein Gen nach Anspruch 1, 2 oder 3.
10. Verwendung des Gens nach Anspruch 1 oder 2 bzw. der
Genstruktur nach Anspruch 3 zur Erzeugung von
Phosphinothricin-resistenten Pflanzenzellen und Pflanzen.
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