HU215079B

HU215079B - Eljárás növényekben a foszfinotricin ellen hatásos rezisztenciagén előállítására

Info

Publication number: HU215079B
Application number: HU88217A
Authority: HU
Inventors: Renate Alijah; Walter Arnold; Günter Donn; Peter Eckes; Friedrich Hein; Alfred Pühler; Eckhard Strauch; Eugen Uhlmann; Friedrich Wengenmayer; Wolfgang Wohlleben
Original assignee: Hoechst Ag.
Priority date: 1987-01-21
Filing date: 1988-01-20
Publication date: 1998-09-28
Also published as: FI116067B; IL85143A0; AU609082B2; JP3062125B2; JP2993964B2; JPS63273479A; DK23988A; AU1061988A; FI880216A0; JPH1080278A; JPH1080289A; GR3007859T3; CN88100322A; DK23988D0; CN1057120C; JP3093686B2; NZ223227A; CA1321364C; EP0275957A2; CN87100603A

Description

A találmány tárgya eljárás növényekben a foszfinotricin ellen hatásos rezisztenciagén előállítására. A találmány körébe tartozik e rezisztenciagén alkalmazása is.

A 3 628747.4 alapszámú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben (1986. augusztus 23.) olyan, foszfinotricinnel (a továbbiakban rövidítve: PTC) szemben hatásos rezisztenciagént írtunk le, amely úgy állítható elő, hogy a foszfinotricil-alanil-alanin (a továbbiakban: PTT) rezisztenciára szelektált Streptomyces viridochromogenes DSM 40 736 (általános gyűjtemény), illetve DSM 4112 (a Budapesti Letéti Szerződés szerint) össz-DNS állományát BamHI-val hasítják, a 4,0 kb méretű fragmentumot klónozzák, majd PTT-rezisztenciára szelektálják; továbbá javasoltuk ennek a génnek az alkalmazását PTC-rezisztens növények létrehozására, mint PTT-rezisztencia-markert baktériumokban, és mint PTC-rezisztencia-markert növényi sejtekben. Azt a 4 kb méretű BamHI-fragmentumot, amely a rezisztenciagénen helyezkedik el, közelebbről definiálja az 1. ábrában bemutatott restrikciós térkép.

A 4 kb méretű fragmentum részfragmenseinek klónozásával közelebbről behatároltuk a kódoló terület helyzetét. Ennek során kitűnt, hogy a rezisztenciagén az 1,6 kb méretű SstlI-Sstl-ffagmentumon helyezkedik el (az eredeti bejelentés 1. ábrájában bemutatott, 0,55-től 2,15-ig terjedő helyen). BglII-vel végzett emésztés útján egy 0,8 kb méretű fragmentumot kapunk, amely plazmidba való beépítés és az S. lividans transzformációja után PTT-rezisztenciát biztosít. Ennek a rezisztenciának az alapfeltétele a PTC N-acetilezése. Ennek alapján a rezisztenciagén egy acetiltranszferáz enzim kódolásáért felelős.

A 3 642 829.9 számú német szövetségi köztársaságbeli kiegészítő szabadalmi bejelentésben (1986. december 16.) bemutatjuk a fentebb említett 0,8 kb méretű fragmentum DNS-szekvenciáját. A szekvenciából meghatározható az indító kodon és a génszekvencia kódoló része. Az utolsó nukleotid a TGA stop-kodon.

A Streptomyces nemzetségből származó génekben az [adenin (A) + timin (T)]: [guanin (G) + citozin (C)J arány körülbelül 30%:70%, s így a G + C komponens értéke magas. A növényi gének GC aránya alacsonyabb, 50% körüli. Ebből kiindulóan a találmány alapgondolatának további kifejlesztéseként a rezisztenciagén DNS-szekvenciáját optimalizáltuk a növényi RNSpolimeráz-II vonatkozásában kedvező kodonhasználat alkalmazásával végzett új szintézissel.

A találmány tárgya eljárás annak a rezisztenciagénnek a módosítására, amelyet a 3 628 747.4 alapszámú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben és a 3 642 829.9 számú kiegészítő bejelentésben írtunk le, tehát eljárás a gén növényi kodonhasználatnak megfelelő hasznosítására. A megfelelő aminosavszekvenciát a Függelékben mutatjuk be. A találmány további vonásait a szabadalmi igénypontokban definiáljuk, és az alábbiakban világítjuk meg.

A genetikai kód ismert módon degenerált, azaz egyetlen triplett csak két aminosavat kódol, míg a fennmaradó 18, genetikailag kódolható aminosavhoz

2-6 triplett van hozzárendelve. Ennek következtében a gén szintézise céljára elméletileg számos kodonkombináció választható. Mivel az egyes nukleotidok fentebb említett relatív aránya a DNS teljes szekvenciájában lényeges, a szekvencia optimalizálása során ezt tartottuk szem előtt egyik kritériumként.

A szekvenált génen az alábbi változtatásokat hajtottuk végre:

1. A Streptomyces-gén indító GTG kodonját (a kiegészítő szabadalmi bejelentés szekvenciájában a 258-260 pozíció) a növényi RNS-polimeráz II által felhasznált ATG indító kodonra cseréltük ki.

2. A génen belül a Streptomyces-gén kodonhasználatát úgy változtattuk meg, hogy ennek következtében a növényi génekre jellemző kodonhasználatot kaptuk (G/C-arány).

3. A transzlációs folyamat befejezése céljából a szekvencia végére elhelyeztünk egy TGA stop-kodont.

4. A génszekvencia kezdetét és végét ligálható restrikciós helyekkel láttuk el, abból a célból, hogy a gént tovább építhessük, és növényi szabályzó szekvenciák közé ligálhassuk.

5. A palindrom szekvenciák számát a lehető legcsekélyebb mértékre redukáltuk.

A találmány szerinti (I) képletű DNS-szekvenciát (a megfelelő aminosavszekvenciával együtt) a Függelékben mutatjuk be.

Az Xbal (152-es pozíció), BamHI (312-es pozíció) és Xmal (436-os pozíció) számára rendelkezésre álló három, belső egyedi hasítási hely lehetővé teszi olyan részszekvenciák szubklónozását, amelyek jól jellemzett klónozó vektorokba - így például a pUC 18-ba vagy pUC 19-be - beépíthetők. Ezen túlmenően a génen belül egy sor további, egyedi felismerési szekvenciát építettünk be restrikciós enzimek számára, amelyek egyrészt megteremtik az acetiltranszferáz részszekvenciáinak hozzáférhetőségét, másrészt variációk végrehajtását teszik lehetővé.

Táblázat

Restrikciós enzim	Hasítás az alábbi nukleotid-szám szerint (kódoló szál)
BspMII	11
SacII	64
EcoRV	74
Hpal	80
Aatll	99
BstXI	139
Apai	232
Seal	272
AvrII	308
AflII	336
Stul	385
BssHII	449

HU 215 079 Β

Táblázat (folytatás)

Restrikciós enzim	Hasítás az alábbi nukleotid-szám szerint (kódoló szál)
Foki	487
BglI	536
BglII	550

A részszekvenciák kémiai szintézis útján történő felépítését és az enzimes ligációs (kapcsolási) reakciót önmagában ismert módon hajtottuk végre (lásd a 0133 282, 0136472, 0155 590, 0161504, 0163249, 0171024, 0173 149 és 0177 827 számú publikált európai szabadalmi bejelentéseket). A restrikciós elemzések, a DNS-fragmentumok kapcsolása és a plazmidok E. coli-ban végbemenő transzformációja részletes leírásban megtalálható Maniatis tankönyvében (Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, kiadó Cold Spring Harbor, 1982).

Az így klónozott génszekvenciát ezután növényi szabályzó szignálok szabályozása alatt kifejezés céljából növényekbe vittük be. Erre vonatkozó ismert módszerekről áttekintés található a 0122791 számú publikált európai szabadalmi bejelentésben. így PTC-rezisztens növényi sejteket kaptunk (azaz transzformált sejtekre vonatkozóan szelekciós markerrel rendelkeztünk), valamint rezisztens növényekhez, növényi részekhez és magvakhoz jutottunk.

Az alábbi példákban részletesen bemutatjuk a találmány szerinti eljárást. E példákban a százalékos adatok tömegszázalékot jelentenek, ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk.

Példák

Az alábbi táptalajokat alkalmaztuk:

a) Baktériumok esetében:

YT-táptalaj: 0,5% élesztőkivonat, 0,6% Bacto Trypton, 0,5% NaCl;

LB-táptalaj: 0,5% élesztőkivonat, 1% Bacto Trypton, l%NaCl;

Szilárd táptalajként: adott esetben 1,5% agart adtunk hozzá.

b) Növények esetében:

M+S-közeg: lásd: Murashige és Skoog: Physiologica Plantarum 15, 473 (1962);

2MS-közeg: M+S-közeg 2% szaccharóztartalommal;

MSCIO-közeg: M+S-közeg 2% szaccharóztartalommal, 500 mg/l cefotaxim, 0,1 mg/l naftil-ecetsav (NAA), 1 mg/l benzilamino-purin (BAP), 100 mg/l kanamicin;

MSC15-közeg: M+S-közeg 2% szaccharóztartalommal, 500 mg/l ce ötaxim, 100 mg/l kanamicin.

szintézise ijitéziséhez, amely , kiinduló anyagalkalmazzuk [az kódoló szálának

1. Egyszálú oligonukleotid kémia A (II) képletű fragmentum szí egyike az I-IV részfragmentumokna k, ként a végállású IIc oligonukleotidt t (I) képletű DNS-szekvencia

219-312 számú nukleotidjai], A szilárd fázisú szintézis céljára a 3’-végződésen elhelyezkedő nukleotidot, jelen esetben tehát a guanozint (312. számú nukleotid) a 3,-hidroxilcsoport útján egy hordozóhoz kovalens módon kötve alkalmazzuk. Vivőanyagként hosszúláncú amino-alkil-csoportokkal funkcionalizált CPG-t („szabályzott pórusméretű üveg”) alkalmazunk. Egyébként a szintézist ismert módszerrel végezzük (lásd a fentebb idézett, publikált európai szabadalmi bejelentéseket).

A szintézis szkémáját a Függelékben csatolt (II) képletű DNS-szekvenciában jeleztük, amely egyébként az (I) DNS-szekvenciának felel meg.

2. Az egyszálú oligonukleotid enzimes kapcsolása a (II) képletű génfragmentumhoz

Az 5’-végződésen elhelyezkedő oligonukleotidok foszforilezése céljából 1 nmol (Ilb) és (IIc) képletű oligonukleotidot 5 nmol adenozin-trifoszfáttal és 4 egy20 ség T4-polinukleotid-kinázzal 20 μΐ 50 mM Trisz-HCl pufferban (pH 7,6), amely 10 mM magnézium-kloridot és 10 mM ditio-treitol (DTT) tartalmaz, 30 percig 37 °C hőmérsékleten kezelünk. Az enzimet ezután 5 percig 95 °C-ra melegítve inaktiváljuk. A (Ila) és (Ilb) képletű oligonukleotidokat, amelyek a (II) képletű DNS-ffagmentumban a túlnyúló szekvenciákat alkotják, nem foszforilezzük. Ez meggátolja a soron következő kapcsolásban nagyobb szubfragmentumok kialakulását, mint amelyek a (II) képletű DNS-fragmen30 tumnak megfelelnek.

A (Ila)-(IId) képletű oligonukleotidokat a (II) képletű szubfragmentummal a következőképpen kötjük össze: 1-1 nmol (Ha) és (Ilb) képletű oligonukleotidot, valamint a (Ilb) és (IIc) képletű 5’-foszfátot együttesen

45 μΐ olyan pufferoldatban, amely 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7,6), 20 mM magnézium-kloridot, 25 mM káliumkloridot és 10 mM DTT-t tartalmaz, oldunk. Az oligonukleotidok (II) képletű DNS-fragmentuma szerinti „Annealing” művelet céljából az oligonukleotidok ol40 datát 2 percig 95 °C-on melegítjük, majd lassan, 2-3 óra alatt 20 °C-ra hűtjük. Az enzimes kapcsolás céljából ezután 2 μΐ 0,1 M DTT-t, 8 μΐ 2,5 mM adenozin-trifoszfátot (pH 7), valamint 5 μΐ T4-DNS-ligázt (2000 egység) teszünk hozzá, és 22 °C-on 16 órán át inkubáljuk.

A (II) képletű génfragmentum tisztítását gélelektroforézissel végezzük 10%-os poliakrilamidgélen (karbamid hozzáadása nélkül, mérete 20x40 cm, vastagsága 1 mm), aminek során jelzőanyagként Hinfl50 gyei hasított 0x174 DNS-t (Fa. BRL), vagy HaelII-mal hasított pBR322-t alkalmazunk.

Analóg módon állítjuk elő az (I), (III) és (IV) képletű génfragmentumokat, amelyekben azonban a „túlnyúló” szekvenciákat az „Annealing” művelet előtt 5’-fosz55 fátokká alakítjuk, mivel ebben az esetben kapcsoló lépés (ligáció), nem szükséges.

Az (I), (II), (III) és (IV) képletű génfragmentumokat tartalmazó hibrid-plazmidok előállítása

a) Az (I) képletű génfragmentum beépítése pUCl 8-ba

HU 215 079 Β

A kereskedelmi forgalomból beszerezhető pUC18 plazmidot az előállító cég adatai alapján a Sáli és Xbal restrikciós endonukleáz enzimekkel ismert módon elhasítjuk. Az emésztési keveréket 1%-os agarózgélen elektroforézis segítségével ismert módon elválasztjuk, és a hasítás során kapott fragmenseket etidium-bromiddal megfestve láthatóvá tesszük. A plazmidsávot (mintegy 2,6 kb méretű) az agarózgélből kimetsszük, és az agarózból elektroelucióval izoláljuk.

Ezt követően 1 μg Xbal-gyel és Sall-gyel hasított plazmidot 10 ng (I) DNS-fragmentummal éjszakán át 16 °C hőmérsékleten tartva kapcsolásnak (ligációnak) vetjük alá.

b) A (II) képletű génfragmentum beépítése pUC 18-ba

Az a) lépéshez hasonló módon a pUC18-at Xbal és

BamHI segítségével hasítjuk, majd a (Π) képletű génfragmentummal - amelyet a fenti a 2. példa szerint a túlnyúló végein foszforileztünk - kapcsoljuk.

c) A (III) képletű génffagmentum beépítése pUC 18-ba

Az a) lépéshez hasonlóan a pUC18-at BamHI és

XmalII segítségével hasítjuk, és a (III) képletű génfragmentummal kapcsoljuk.

d) A (IV) képletű génfragmentum beépítése pUC 18-ba

Az a) lépéshez hasonlóan a pUC18-at XmalII és

Ball segítségével hasítjuk, és a (IV) képletű génfragmentummal kapcsoljuk.

4. A teljes gén felépítése, és klónozása pUC-plazmidban

a) Az (I) - (IV) képletű génfragmentumok transzformációja és amplifikálása

Az így kapott hibrid-plazmidokat E. coli-ba transzformáljuk. Erre a célra az E. coli K 12 törzset 70 mM kalcium-klorid oldattal kezelve kompetenssé tesszük, majd a hibrid-plazmidnak 10 mM Trisz-HCl pufferban (pH 7,5) készített szuszpenziójával, amely 70 mM kalcium-kloridot tartalmaz, elegyítjük. A transzformált törzseket a szokásos módon, a plazmid által biztosított, antibiotikumokkal szembeni rezisztencia, illetve érzékenység felhasználásával szelektáljuk, és a hibrid vektorokat amplifikáljuk. A sejtek elölése után a hibrid-plazmidokat izoláljuk, az eredetileg alkalmazott restrikciós enzimekkel hasítjuk, és az (I), (Π), (ΠΙ) és (IV) képletű génfragmentumokat gélelektroforézissel izoláljuk.

b) Az (I), (II), (III) és (IV) képletű génfragmentumok összekapcsolása a teljes génné

Az amplifikáció útján kapott (I) és (II) képletű szubfragmentumokat a következőképpen kapcsoljuk össze. 100-100 ng izolált (I) és (II) képletű fragmentumot 10 μί -50 mM Trisz-HCl-t (pH 7,6), 20 mM magnézium-kloridot és 10 mM DTT-t tartalmazó - pufferoldatban oldunk, és az oldatot 5 percig 57 °C-on melegítjük. Az oldatnak szobahőmérsékletre való lehűlése után μί 10 mM adenozin-trifoszfátot (pH 7) és 1 pl T4-DNS-ligázt (400 egység) adunk hozzá, és 16 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután utólagos hasítást végzünk Sáli és BamHI restrikciós enzimekkel, majd a kívánt 312 bp fragmentumot (1-312 számú nukleotidok, Sall-BamHI) 8%-os poliakrilamidgélen gélelektroforézissel tisztítjuk. Ennek során jelzőanyagként (markerként) HaelII restrikciós enzimmel hasított

0x174 RF DNS-t (Fa. BRL) használunk.

Hasonló módon kapcsoljuk egymással a (III) és (IV) képletű génfragmentumokat, aminek során a tisztítás után 246 bp fragmentumot kapunk (313-558 számú nukleotidok, BamHI-Sall). A gélelektroforézis során markerként Mspl restrikciós enzimmel hasított pBR322t alkalmazunk.

A teljes gén [(I) képletű DNS-szekvencia] felépítése céljából 15 ng 312 bp fragmentumot és 12 ng 246 bp fragmentumot 1 pg kereskedelmi forgalomból beszerezhető pUC18 plazmiddal - amelyet előzőleg Sáli restrikciós enzimmel hasítottunk, és a végződésein enzimatikusan defoszforileztünk - a fentebb leírtak szerint kapcsolunk. A transzformáció és amplifikáció után (a 4a példában leírtak szerint) Sall-emésztéssel azonosítjuk a kívánt kiónt, amely az (I) képletű DNS-szekvencia szerinti 558 bp fragmentumot tartalmazza.

5. A hibrid-plazmidok transzformációja

Kompetens E. coli sejteket 0,1-1 pg hibrid-plazmiddal, amely az (I) képletű DNS-szekvenciát tartalmazza, transzformálunk, és ampicillint tartalmazó agarlemezekre visszük. Ezt követően azok a kiónok, amelyek a plazmidban a helyesen integrált szekvenciákat tartalmazzák, gyors DNS analízis segítségével azonosíthatók (Maniatis, lásd az idézett helyen).

6. A szintetizált gén fúziója olyan szabályozó szignálokkal, amelyeket a növény felismer

A végződésein Sáli hasítási helyekkel ellátott, optimalizált rezisztenciagént a pDH51 plazmid polilinkerének Sáli hasítási helyével [Pietrzak és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 14, 5857 (1986)] kapcsoljuk. Ezen a plazmidon lokalizálva van a karfiol mozaikvírusából származó 35S-transzkriptum promótere és terminátora, amelyeket a növény transzkripciós rendszere felismer. A rezisztenciagén ligációja útján e gént a 35S-transzkriptum promótere mögé és terminátora elé illesztjük be. A gén helyes orientációját restrikciós elemzéssel igazoljuk.

A Solanum tuberosum-ból származó ST-LSI-gén promoterét [Eckes és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 205, 14 (1986)] hasonló módon alkalmaztuk az optimizált acetiltranszferáz-gén kifejezésére növényekben.

7. A rezisztenciagén bevitele Agrobacterium tumefaciens-ba a szabályzó szekvenciákkal együtt

a) A kointegrátum-módszer

A promoterből, optimizált rezisztenciagénből és terminátorból álló teljes transzkripciós egységet (6. példa) az EcoRI restikciós enzimmel kihasítjuk, és az E. coli pMPKl 10 intermedier vektorának az EcoRI hasítási helyére kapcsoljuk (P. Eckes, Disszertáció, Kölni Egyetem, 1985 91. skk. oldalak). Ez az intermedier vektor arra a célra szükséges, hogy a rezisztenciagént szabályzó szekvenciáival vigyük át az Agrobacterium tumefaciens Ti-plazmidjába. Ezt az úgynevezett konjugációt a Van Haute és munkatársai által leírt eljárás útján [EMBO J. 2, 411 (1983)] hajtjuk végre. Ennek során a gént szabályzó szignáljaival homológ rekombináció útján integráljuk a

HU 215 079 Β

Ti-plazmidba, a pMPKllO vektorban és a Tiplazmidban jelenlévő pGV3850kanR szekvenciákon át [Jones és munkatársai: EMBO J. 4, 2411 (1985)].

Erre a célra 50-50 μί friss folyadékkultúrát alkalmazunk a DH1 E. coli törzsből (a pMPKllO-származék gazdatörzse) és az E. coli GJ23 törzsből [Van Haute és munkatársai: Nucleic Acids. Rés. 14, 5857 (1986)] száraz YT-agarlemezen elegyítve, majd a keveréket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A baktériumokat 3 ml 10 mM magnézium-szulfát oldatban reszuszpendáljuk, és antibiotikumos agarlemezekre visszük (50 pg/ml spektinomicin: szelektálás pMPKllO-re; 10 μg/ml tetraciklin: szelektálás R64drdll-re; 50 μg/ml kanamicin: szelektálás pGJ28-ra). A szelektív agarlemezeken szaporodó baktériumok a három plazmidot tartalmazzák, és az Agrobacterium tumefaciensszel végzendő konjugáció céljára 37 °C hőmérsékleten YT folyékony táptalajon szaporítjuk. Az Agrobacteriumokat 28 °C-on LB-táptalajon tenyésztjük. Minden egyes száraz YT-agarlemezre 50 μί baktériumszuszpenziót keverünk, majd 12-16 órán át 28 °C-on inkubáljuk. A baktériumokat 3 ml 10 mM magnézium-szulfát oldatban reszuszpendáljuk, és antibiotikumos lemezekre visszük (0,05 g/l eritromicin, 0,025 g/l klóramfenikol: szelektálás az Agrobacteriumtörzsre; 0,3 g/l streptomicin és 0,1 g/l spectinomicin:szelektálás a pMPKllO Ti-plazmidba való integrálására). Ezeken a szelektív lemezeken csak azok az Agrobacteriumok képesek szaporodni, amelyekben a pMPKl 10-származék homológ rekombinációk útján integrálva van a baktérium Ti-plazmidjában.

A pGV3850kanR Ti-plazmidon a már előzőleg jelenlévő, növényekben kanamicinnel szemben hatásos rezisztenciagénen kívül a PTC-vel szemben ható rezisztenciagént is lokalizáltuk. Mielőtt ezeket az Agrobacterium-kiónokat transzformáció céljára alkalmaztuk, egy „Southem-Blot” kísérlettel ellenőriztük, hogy megtörtént-e a kívánt integráció.

b) A bináris vektor módszer

A Koncz és munkatársai [Mól. Gén. Génét. 204, 383 (1986)] által leírt bináris vektorrendszert alkalmazzuk. A Koncz és munkatársai [PNAS 84 (1987), 131] által leírt pPCV701 vektort a következőképpen módosítjuk: a BamHI és HindlII restrikciós enzimekkel a vektorból eltávolítunk egy olyan fragmentumot, amelyen - többek között - a TRI és TR2 promóterek helyezkednek el. Az így kapott plazmidot recirkularizáljuk. Az e vektoron jelenlévő EcoRI hasítási helyre a pEH51 vektorból származó, mintegy 800 bázispárt tartalmazó fragmentumot illesztünk be, amelyen jelen van a karfiol mozaikvírusából származó 35Stranszkriptum promotere és terminátora [Pietrzak és munkatársai: Nukleic Acids Rés. 14, 5858 (1986)]. Az így kapott plazmidban a 35S-promoter és -terminátor között egy szinguláris Sall-hasítási hely van. Erre a hasítási helyre beillesztjük (inszertáljuk) az optimalizált PTC-rezisztenciagént. Ennek a génnek a kifejeződése most már a 35S-transzkriptum szabályzó szekvenciák szabályozása alatt áll.

Ezt a pPCV801Ac plazmidot transzformáljuk az E. coli SM10 törzsbe [Simon és munkatársai.

Bio/Technology 1, 784 (1983)]. A pPCV801Ac plazmid Agrobacterium tumefaciens-be történő átvitele után 50 μί SmlO-tenyészetet és 50 μί C58-Agrobacterium-tenyészetet [GV3101, Van Larebeke és munkatársai: Natúré 252, 169 (1974)] a pMP90RK Ti-plazmiddal [Koncz és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 204, 383 (1986)], mint kisegítő plazmiddal egy száraz YTAgarlemezen összekeverünk, és mintegy 16 órán át 28 °C-on inkubáljuk. Ezt követően a baktériumokat 3 ml 1 mM magnézium-szulfát oldatban reszuszpendáljuk, és antibiotikumos lemezekre helyezzük (0,1 g/l rifampicin: szelektálás GV3101-re; 0,025 g/l kanamicin: szelektálás pMP90RK-ra; 0,1 g/l karbenicillin: szelektálás pPCV801Ac-ra). Ezeken a lemezeken csak olyan Agrobacteriumok képesek a szaporodásra, amelyek mindkét plazmidot (azaz a pMP90RK és pPCV801Ac plazmidot) tartalmazzák. Mielőtt ezeket az Agrobacteriumokat a növényi transzformáció céljára felhasználjuk, „Southern Blotting” segítségével ellenőrizzük, hogy a pPCV801Ac plazmid az Agrobacteriumokban a megfelelő formában van-e jelen.

8. Nicotiana tabacum transzformációja

Agrobacterium tumefaciens segítségével

Az optimalizált rezisztenciagént az úgynevezett „levéllemez” („leaf disc”) transzformációs módszerrel visszük be dohánynövényekbe.

Az Agrobacteriumokat a megfelelő antibiotikumokkal 30 ml LB-közegbe visszük át állandó rázás közben 28 °C hőmérsékleten (ez körülbelül 5 napig tart). Ezután a baktériumokat 10 percig percenként 7000 fordulatszámmal egy Christ-centrifiigában ülepítjük, és egyszer mossuk 20 ml 10 mM magnéziuszulfát oldattal. Ismételt centrifugálás segítségével a baktériumokat 20 ml 10 mM magnézium-szulfát oldatban szuszpendáljuk, és Petri-csészébe visszük át. A levéllemez-fertőzés céljára 2 MS-közegben, steril tenyészetben növekvő Wisconsin 38 dohánynövények levelein alkalmazzuk. Valamennyi steril tenyészetet 25-27 °C hőmérsékleten 16 órás megvilágítási és 8 órás sötétben tartó periódussal, fehér fényben tartjuk.

A dohányleveleket levágjuk, és a levélfelületeket dörzspapírral feldörzsöljük, majd a leveleket apróbb darabokra vágjuk, és a baktériumtenyészetbe mártjuk. Ezután a levéldarabokat M+S-közegbe visszük át, és 2 napon át normális tenyésztési körülmények között tartjuk. A baktériumokkal történt 2 napos fertőzés után a levélrészeket folyékony M+S-közegben mossuk, és MSC10 agarlemezekre visszük át. A transzformált hajtásokat az együttesen átvitt rezisztencia alapján a kanamicin antibiotikummal szemben szelektáljuk. 3-6 héttel később láthatóvá válnak az első hajtások. Az egyes hajtásokat üvegdobozokban, MSC15-közegben tovább tenyésztjük. A következő hetekben a levágott hajtások közül egyesek a vágás helyén gyökereket eresztenek.

A transzformált növények közvetlenül is szelektálhatok PTC-tartalmú növényi közegekre. A transzformáit növények DNS-elemzése („Southern Blotting”) és RNS-elemzése („Northern Blotting”) útján kimutattuk a PTC-rezisztenciagén jelenlétét és kifejeződését.

HU 215 079 Β

9. A transzformált növények PTC-vel szembeni rezisztenciájának a kimutatása

Abból a célból, hogy a transzformált növényekben a rezisztenciagén működőképességét ellenőrizzük, egyrészt transzformált, másrészt nem-transzformált növények levéltöredékeit 1-10+ M L-PTC-t tartalmazó M+S tenyésztőközegbe visszük át. A nem-transzformált növények fragmentumai elhalnak, viszont a transzformált növények töredékeiből új hajtásokat tudunk regenerálni. A transzformált növények gyökeret eresztenek, és problémamentesen növekednek 110³ M L-PTC-t tartalmazó M+S-tenyésztőközegben. A transzformált növényeket a steril körülményekből a talajba visszük át, és 2 kg/ha, illetve 5 kg/ha dózisban PTC-vel permetezzük be. A nem-transzformált növények nem élik túl ezt a herbicides kezelést, viszont a transzformált növényeken nem figyelhető meg a herbicid által előidézett károsodás. A bepermetezett, transzformált növény külseje és növekvése legalább annyira jónak adódik, mint a nem permetezett kontrollnövényeké.

10. Acetiltranszferáz-pröba a PTC acetilezésének kimutatására transzgén, PTC-vel szemben rezisztens növényekben

Körülbelül 100 mg transzgén, PTC-rezisztens dohánynövényből, illetőleg nem-transzformált dohánynövényből származó levélszövetet homogenizálunk egy olyan pufferoldatban, amely a következő komponenseket tartalmazza: 50 mM Trisz-HCl, pH 7,5; 2 mM EDTA; 0,1 mg/ml leupeptin; 0,3 mg/ml marhaszérumalbumin; 0,3 mg/ml DTT; 0,15 mg/ml fenil-metilszulfonil-fluorid (PMSF).

Ezután centrifúgáljuk, majd a tiszta felülúszóból 20 ml-t 1 μΐ 10 mM radioaktívan jelzett D,L-PTC-vel és 1 μΐ 100 mM acetil-CoA-val 20 percig 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Ezt követően a reakcióelegyet 25 μΐ 12%-os triklór-ecetsavval elegyítjük és centrifugáljuk. A felülúszóból 7 μΐ-t vékonyréteg-kromatográfiás lemezre viszünk át, és felszálló irányban egymás után kétszer futtatjuk piridin/n-butanol/ecetsav/víz 50:75:15:60 térfogatarányú elegyével. így a PTC-t és az acetil-PTC-t egymástól el tudjuk választani, és autoradiográfiás úton ki tudjuk mutatni.

A nem-transzformált növényeken a PTC nem alakul át acetil-PTC-vé, ezzel szemben a transzgenikus, rezisztens növények képesek erre az átalakításra.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás foszfinotricin-rezisztenciagén előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan gént szintetizálunk, amely a növényi kodonhasználatnak megfelelő kodonokat tartalmaz és az (I) képlet szerinti aminosavszekvenciájú fehérjét kódolja.

(Elsőbbsége: 1987. január 21.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képlet szerinti DNS-szekvenciájú (9-554. nukleotidpozíciók) gént szintetizálunk.

(Elsőbbsége: 1987. január 21.)
3. Eljárás növényekben működőképes, foszfinotricin-rezisztenciát kiváltó expressziós egység előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. vagy 2. igénypont szerint előállított foszfinotricin-rezisztenciagént növényekben működőképes szabályozó és expressziós szignálokhoz kapcsolunk.

(Elsőbbsége: 1987. január 21.)
4. Eljárás foszfinotricin-rezisztenciagént vagy egy, vagy több foszfinotricin-rezisztenciagén-ffagmenst tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. vagy 2. igénypont szerint előállított foszfinotricin-rezisztenciagént, 3. igénypont szerint előállított foszfínotricin expressziós egységet vagy a (II) képlet szerinti DNS-szekvencia I-IV. foszfinotricin-rezisztenciagénfragmensei közül egyet vagy többet vektorba építünk.

(Elsőbbsége: 1987. január 21.)
5. Eljárás 4. igénypont szerint előállított vektort tartalmazó gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy gazdasejtet 4. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.

(Elsőbbsége: 1987. január 21.)
6. Eljárás 1. vagy 2. igénypont szerint előállított foszfinotricin-rezisztenciagént vagy annak fragmensét tartalmazó, adott esetben foszfinotricin-rezisztens növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy növényi sejtet 1. vagy 2. igénypont szerint előállított génnel, a (II) képlet szerinti DNS-szekvencia I-TV. fragmensével, 3. igénypont szerint előállított expressziós egységgel vagy

4. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk, és adott esetben foszfinotricin-rezisztenciára szelektálunk.

(Elsőbbsége: 1987. január 21.)
7. Eljárás 1. vagy 2. igénypont szerint előállított gént vagy annak fragmensét tartalmazó, adott esetben foszfinotricin-rezisztens növény, növényi rész vagy növényi mag előállítására, azzal jellemezve, hogy növényi sejtet 1. vagy 2. igénypont szerint előállított génnel, a (II) képlet szerinti DNS-szekvencia I-IV. fragmensével, 3. igénypont szerint előállított expressziós egységgel vagy 4. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk, a transzformálást követően adott esetben foszfinotricin-rezisztenciára szelektálunk, a transzformáit sejtet kifejlett növénnyé regeneráljuk, majd adott esetben a növény egy részét izoláljuk, vagy a növényből magot fogunk.