DE69535064T2

DE69535064T2 - Herstellung von gamma-linolensaüre durch eine delta 6-desaturase

Info

Publication number: DE69535064T2
Application number: DE69535064T
Authority: DE
Inventors: L. Terry College Station THOMAS; S. Avutu Bryan REDDY; Michael College Station NUCCIO; N. Andrew Bryan NUNBERG; L. Georges FREYSSINET
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer SAS
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-28
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2015-12-29
Also published as: BR9510411A; WO1996021022A3; AR000582A1; CN1177379A; DE69535064D1; CA2207906A1; AU4673596A; RO121387B1; RU2181772C2; JP4422211B2; US5614393A; EP0801680A2; UA61880C2; CN1117864C; CA2207906C; JPH10511848A; WO1996021022A2; ES2262146T3; US5789220A; AU707061B2

Description

Die Linolsäure (18:2) (LA) wird durch das Enzym Δ6-Desaturase in gamma-Linolensäure (18:3) (GLA) umgesetzt. Wird dieses Enzym bzw. die dafür codierende Nukleinsäure in LA-produzierende Zellen eingebracht, so wird GLA produziert. Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuren umfassend das Δ6-Desaturasegen bereit. Insbesondere umfassen die Nukleinsäuren die Promoteren, Codierregionen und Terminationsregionen der Δ6-Desaturasegene. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Konstrukte umfassend eine Δ6-Desaturase-Codierregion in funktioneller Kombination mit heterologen Regulationssequenzen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und rekombinanten Konstrukte eignen sich für die Produktion von GLA in transgenen Organismen.
Ungesättigte Fettsäuren wie Linolsäure (C₁₈Δ^9,12) und α-Linolensäure (C₁₈Δ^9,12,15) sind essentielle Nahrungsbestandteile, die von Wirbeltieren nicht synthetisiert werden können, da Wirbeltierzellen Doppelbindungen in Δ⁹-Position von Fettsäuren einführen können, jedoch keine zusätzlichen Doppelbindungen zwischen die Δ⁹-Doppelbindung und das methylterminale Ende der Fettsäurekette einführen können. Da Linolsäure und α-Linolensäure Vorstufen für weitere Produkte sind, sind diese essentielle Fettsäuren und werden üblicherweise aus pflanzlichen Quellen erhalten. Linolsäure kann von Säugetieren in γ-Linolensäure (GLA, C₈Δ^6,9,12) umgewandelt werden, die wiederum in Arachidonsäure (20:4) umgewandelt werden kann, wobei es sich bei der Arachidonsäure aufgrund der Tatsache, daß sie eine essentielle Vorstufe für die meisten Prostaglandine darstellt, um eine überaus wichtige Fettsäure handelt.
Dadurch, daß Linolsäure in der Nahrung bereitgestellt wird, wird den Anfordernissen an GLA und Arachidonsäure in der Nahrung entsprochen, da die Linolsäure ja in GLA und Arachidonsäure umgewandelt wird. Es wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen der Aufnahme von gesättigten Fetten und Gesundheitsrisiken wie hoher Cholesterinspiegel, Arteriosklerose und anderen klinischen Störungen, die mit Anfälligkeit für Herzerkrankungen korreliert sind, nachgewiesen, während die Aufnahme von ungesättigten Fetten mit einer verringerten Cholesterinkonzentration im Blut und einem reduzierten Arterioskleroserisiko assoziiert wurde. Die therapeutischen Nutzen von GLA in der Nahrung beruhen möglicherweise darauf, daß GLA eine Vorstufe für Arachidonsäure ist und daher zur Prostaglandinsynthese beiträgt. Dementsprechend ist die Aufnahme der stärker ungesättigten GLA statt Linolsäure möglicherweise von gesundheitlichem Nutzen. GLA kommt jedoch in praktisch keiner erwerbsmäßig herangezogenen Kulturpflanze vor.
Galle et al. "Plant Lipid Metabolism" (Hersg. Kader und Mazliak, Kluwer Academic Publishers), S. 509-511 (1995) beschreiben Borretsch-Mikrosomen, die unter anderen Enzymaktivitäten auch eine Δ6-Desaturaseaktivität enthalten. Zur Erforschung der Auswirkung von ansteigenden Detergenskonzentrationen auf die Borretsch-Proteine wurden Solubilisierungsversuche durchgeführt.
Die WO 93/06712 beschreibt eine isolierte Nukleinsäure, die für eine bakterielle Δ6-Desaturase, genauer gesagt für die Synechocystis-Δ6-Desaturase codiert.
Die Linolsäure wird durch das Enzym Δ6-Desaturase in GLA umgewandelt. Die Δ6-Desaturase, ein Enzym mit einer Länge von mehr als 350 Aminosäuren, weist eine membrangebundene Domäne und ein aktives Zentrum für die Desaturierung von Fettsäuren auf. Wird dieses Enzym in Zellen, die endogen Linolsäure, jedoch nicht GLA, produzieren, eingeführt, so wird GLA produziert. Dadurch, daß die vorliegende Erfindung das Gen, das für die Δ6-Desaturase codiert, bereitstellt, ermöglicht sie die Produktion von transgenen Organismen, die eine funktionelle Δ6-Desaturase enthalten und GLA produzieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht nicht nur die Produktion von GLA in hohen Mengen, sondern stellt auch neue Nahrungsmittelquellen für GLA bereit.
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Borretsch-Δ6-Desaturasegene. Genauer gesagt umfassen die isolierten Gene die Δ6-Desaturasepromoter, -Codierregionen und -Terminationsregionen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, die den Δ6-Desaturasepromoter, die Δ6-Desaturase-Codierregion und die Δ6-Desaturase-Terminationsregion umfassen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Expressionsvektoren, die eine Δ6-Desaturase-Codierregion aus Borretsch in funktioneller Kombination mit heterologen Regulationsregionen, also Elementen, die nicht von dem Δ6-Desaturasegen stammen, umfassen.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Zellen und Organismen, die die erfindungsgemäßen Vektoren umfassen, sowie Nachkommen von solchen Organismen bereit.
Es wird eine isolierte bakterielle Δ6-Desaturase beschrieben. Es wird auch eine isolierte pflanzliche Δ6-Desaturase bereitgestellt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung von Pflanzen mit einem erhöhten gamma-Linolensäuregehalt bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer kältetoleranten Pflanze bereit.
In 1 sind die Hydropathy-Profile der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Synechocystis-Δ6-Desaturase (Tafel A) und -Δ12-Desaturase (Tafel B) dargestellt. Mutmaßliche Transmembranregionen sind durch gefüllte Balken dargestellt. Der Hydrophobizitätsindex wurde für ein Fenster mit einer Größe von 19 Aminosäureresten berechnet [Kyte, et al. (1982) J. Molec. Biol. 157].
In 2 sind Gas-Flüssigkeits-Chromatographieprofile von Wildtyp-Anabaena (Tafel A) und transgene Anabaena (Tafel B) dargestellt.
3 ist ein Diagramm von Karten der Cosmide cSy75, cSy13 und Csy7 mit überlappenden Regionen und Subklonen. Die "Origins" der Subklone von Csy75, Csy75-3.5 und Csy7 sind durch die gestrichelten diagonalen Linien gekennzeichnet. Inaktivierte Restriktionsstellen sind eingeklammert.
In 4 sind Gas-Flüssigkeits-Chromatographieprofile von Wildtyp-Tabak (Tafel A) und transgenem Tabak (Tafel B) dargestellt.
In 5A ist die DNA-Sequenz einer aus Borretsch isolierten Δ6-Desaturase-cDNA dargestellt.
In 5B ist die Proteinsequenz des offenen Leserasters in der isolierten Borretsch-Δ6-Desaturase-cDNA dargestellt. Es sind drei Aminosäurenmotive, die für Desaturasen charakteristisch sind, eingezeichnet, bei denen es sich um die Lipid-Box, die Metall-Box 1 und die Metall-Box 2 (in dieser Reihenfolge) handelt.
6 ist ein Dendrogramm, das die Ähnlichkeit der Borretsch-Δ6-Desaturase mit anderen membrangebundenen Desaturasen zeigt. Die Aminosäuresequenz der Borretsch-Δ6-Desaturase wurde unter Verwendung von Gene Works (IntelliGenetics) mit anderen bekannten Desaturasen verglichen. Die Zahlenwerte entsprechen den relativen phylogenetischen Distanzen zwischen den verglichenen Untergruppen.
7 ist eine Restriktionskarte von 221.Δ6.NOS und 121.Δ6.NOS. In 221.Δ6.NOS ist der verbleibende Teil des Plasmids pBI221 und in 121.Δ6.NOS ist der verbleibende Teil des Plasmids pBI121.
In 8 sind Gas-Flüssigkeits-Chromatographie-Profile von Karottenzellen, die mit einem Blankvektor (Tafel A) bzw. mit 221.Δ6.NOS (Tafel B) transfiziert wurden, dargestellt. Es sind die Positionen von 18:2, 18:3 α und 18:3 γ(GLA) angegeben.
In 9 sind Gas-Flüssigkeits-Chromatographie-Profile eines nichttransformierten Tabakblatts (Tafel A) und eines mit 121.Δ6.NOS transformierten Tabakblatts dargestellt. Es sind die Positionen von 18:2, 18:3 α, 18:3 γ(GLA) und 18:4 angegeben.
In 10 sind Gas-Flüssigkeits-Chromatographie-Profile für nichttransformierte Tabaksamen (Tafel A) und von mit 121.Δ6.NOS transformierten Tabaksamen dargestellt. Es sind die Positionen von 18:2, 18:3 α und 18:3 γ(GLA) angegeben.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren, die für Δ6-Desaturasen aus Borretsch codieren, bereit. Zur Identifikation einer Nukleinsäure, die für Δ6-Desaturase codiert, wird DNA aus einem Organismus, der GLA produziert, isoliert. Bei diesem Organismus kann es sich zum Beispiel um eine tierische Zelle, um gewisse Pilze (z.B. Mortierella), gewisse Bakterien (z.B. Synechocystis) oder gewisse Pflanzen (Borretsch, Oenothera, Johannisbeeren) handeln. Die Isolation von genomischer DNA kann durch verschiedene Verfahren, mit denen der Durchschnittsfachmann gut vertraut ist, durchgeführt werden, wie dies zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. beschrieben ist. Die isolierte DNA wird physikalisch oder durch Enzymverdau in Fragmente zerlegt und nach einem von verschiedenen gutbekannten Verfahren, die in der Literatur, wie z.B. bei Sambrook et al. (1989) beschrieben sind, in einen entsprechenden Vektor, z.B. einen Bakteriophagen oder einen Cosmidvektor kloniert. Expressionsvektoren, die die DNA der vorliegenden Erfindung enthalten, werden im vorliegenden Zusammenhang ganz besonders in Betracht gezogen. DNA, die für Δ6-Desaturase codiert, kann durch Gain-of-Function-Analyse identifiziert werden. Der Vektor, der in Fragmente zerlegte DNA enthält, wird z.B. durch Infektion, Transkonjugation oder Transfektion in einen Wirtsorganismus, der Linolsäure, jedoch nicht GLA produziert, transferiert. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet "Transformation" allgemein die Übertragung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle. Verfahren für das Einbringen von rekombinanter DNA in einen Wirtsorganismus sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und finden sich zum Beispiel bei Sambrook et al. (1989). Die Produktion von GLA durch diese Organismen (also der Gain-of-Function) wird zum Beispiel mittels Gaschromatographie oder anderen Verfahren, mit denen der Durchschnittsfachmann vertraut ist, getestet. Organismen, bei denen eine GLA-Produktion induziert wurde, also Organismen, die durch Einführung des Vektors eine Funktion gewonnen haben, werden als Organismen, die eine für Δ6-Desaturase codierende DNA exprimieren, identifiziert, und diese DNA wird aus den Organismen gewonnen. Die gewonnene DNA kann wiederum in Fragmente zerlegt, mit Expressionsvektoren kloniert und mit den oben genannten Vorgehensweisen auf ihre Funktion geprüft werden, um die für Δ6-Desaturase codierende DNA genauer zu definieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäure, die für eine Δ6-Desaturase codiert, gemäß Anspruch 1.
Beispielsweise wird wie in WO 93/06712 beschrieben irgendeine DNA aus dem Cyanobakterium Synechocystis Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, American Type Culture Collection (ATCC) 27184 isoliert, in einen Cosmidvektor kloniert und mittels Transkonjugation in das GLR-defiziente Cyanobakterium Anabaena Stamm PCC 7120, ATCC 27893, eingeführt. Die GLA-Produktion von Anabaena-Linolsäure wird gaschromatographisch verfolgt, und das entsprechende DNA-Fragment wird isoliert.
Die isolierte DNA wird nach Verfahren, mit denen der Durchschnittsfachmann gut vertraut ist, und die zum Beispiel bei Sambrook et al. (1989) beschrieben sind, sequenziert.
Aus dem Cyanobakterium Synechocystis wurde eine DNA mit einer Größe von 3,588 Kilobasen (kB), die ein Δ6-Desaturasegen umfaßt, isoliert. Es wurde die Nukleotidsequenz der 3,588 kB großen DNA bestimmt; sie ist in SEQ ID No: 1 dargestellt. Offene Leseraster, die potentielle Codierregionen definieren, sind von Nukleotid 317 bis 1507 und von Nukleotid 2002 bis 3081 vorhanden. Zur Definition der Nukleotide, die für die Codierung von Δ6-Desaturase verantwortlich sind, wird das 3,588 kB große Fragment, das Δ6-Desaturaseaktivität verleiht, in zwei Subfragmente gespalten, von denen jedes nur ein offenes Leseraster enthält. Das Fragment ORF1 enthält die Nukleotide 1 bis 1704, während das Fragment ORF2 die Nukleotide 1705-3588 enthält. Jedes Fragment wird sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärts-Orientierung in einen konjugalen Expressionsvektor (AM542, Wolk et al. [1984] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561), der einen Carboxylasepromoter aus Cyanobakterien enthält, subkloniert. Die erhaltenen Konstrukte [also ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) und ORF2(R)] werden nach Standardmethoden mit Wildtyp-Anabaena PCC 7120 konjugiert (siehe zum Beispiel Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561). Konjugierte Anabaena- Zellen werden nach zweiwöchigem Wachstum auf Selektivmedium (Standard-Mineralmedium BG11N + Zusatz von 30 μg/ml Neomycin nach Rippka et al. (1979) J. Gen. Microbiol. 111, 1) als Neo^R grüne Kolonien gegen einen braunen Hintergrund von absterbenden nichtkonkugierten Zellen identifiziert. Die grünen Kolonien werden selektiert und in Selektiv-Flüssigmedium (BG11N + Zusatz von 15 μg/ml Neomycin) gezüchtet. Die Lipide werden nach Standardverfahren aus den erhaltenen Transkonjuganten, die die Konstrukte ORF1 und ORF2 in Vorwärts- und Rückwärts-Orientierung enthalten, extrahiert (z.B. Dahmer et al. (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543). Für Vergleichszwecke werden auch die Lipide von Wildtyp-Kulturen von Anabaena und Synechocystis extrahiert. Die Fettsäuremethylester werden mittels Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) analysiert, zum Beispiel mit einem Gas-Flüssigkeitschromatographen Typ Tracor-560 mit Wasserstoffflammenionisationsdetektor und Kapillarsäule. Die Ergebnisse der GLC-Analyse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Vorkommen von C18-Fettsäuren in Wildtyp- und transgenen Cyanobakterien
Gemäß GLC-Analyse gewinnen GLA-defiziente Anabaena die Funktion der GLA-Produktion, wenn das Konstrukt, das den ORF2 in Vorwärts-Orientierung enthält, durch Transkonjugation eingeführt wird. Bei Transkonjuganten, die Konstrukte enthalten, die den ORF2 in Rückwärts-Orientierung in bezug auf den Carboxylase-Promoter aufweisen oder den ORF1 in einer beliebigen Orientierung aufweisen, wird keine GLA-Produktion beobachtet. Diese Analyse zeigt, daß das unikäre offene Leseraster (ORF2) innerhalb des 1884 Bp großen Fragments für eine Δ6-Desaturase codiert. Das 1884 Bp große Fragment ist als SEQ ID No: 3 dargestellt. Dies wird durch die Ähnlichkeit der Hydropathieprofile insgesamt zwischen der Δ6-Desaturase und der Δ12-Desaturase [Wada et al. (1990) Nature 347], wie dies in 1 als (A) bzw. (ß) dargestellt ist, belegt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine cDNA, die ein Δ6-Desaturasegen aus Borretsch (Borago officinalis) umfaßt, isoliert. Die Nukleotidsequenz des 1,685 Kilobasen (kB) großen cDNA wurde bestimmt und ist in 5A (SEQ ID No: 4) dargestellt. Das ATG-Startcodon und das Stopcodon sind unterstrichen. Die dem offenen Leseraster in der Borretsch-Δ6-Desaturase entsprechende Aminosäuresequenz ist in 5B (SEQ ID No: 5) dargestellt.
Isolierte Nukleinsäuren, die für eine Δ6-Desaturase codieren, können aus anderen GLA-produzierenden Organismen aufgrund der oben beschriebenen Gain-of-Function-Analyse oder durch Nukleinsäurehybridisierungstechniken, bei denen die isolierte Nukleinsäure, die für die Borretsch-Δ6-Desaturase codiert, als Hybridisierungssonde identifiziert werden. Klonierungsmethoden für genomische cDNA und für cDNA sind dem Fachmann bekannt und werden bei der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Die Hybridisierungssonde kann die Gesamt-DNA-Sequenz, die als SEQ ID No: 1 oder SEQ ID No: 4 beschrieben wird, oder ein Restriktionsfragment oder ein sonstiges DNA-Fragment davon, darunter auch eine Oligonukleotidsonde, umfassen. Verfahren zur Klonierung von homologen Genen durch Kreuzhybridisierung sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und finden sich zum Beispiel in Sambrook (1989) und Beltz et al. (1983) Methods in Enzymology 100, 266.
Bei einem anderen Verfahren zur Identifikation eines Δ6-Desaturasegens von einem GLA-produzierenden Organismus erzeugt man eine cDNA-Bibliothek mit Hilfe von aus polysomaler RNA isolierter Poly-A RNA. Um Gene mit hyperabundanter Expression aus der cDNA-Population zu eliminieren, werden cDNAs oder deren Fragmente, die hyperabundanten cDNAs Genen entsprechen als Hybridisierungssonden für die cDNA-Bibliothek verwendet. Plaques, die nicht hybridisieren, werden herausgeschnitten, und die erhaltenen Bakterienkolonien werden für die Inokulation von Flüssigkulturen verwendet und sequenziert. So werden zum Beispiel, um cDNAs für andere Samenspeicherproteine aus einer cDNA-Bibliothek, die mit Borretsch-Polysomen-RNA hergestellt wurde, zu eliminieren, zuerst cDNAs, die abundant exprimierten Samenspeicherproteinen entsprechen, mit der cDNA-Bibliothek hybridisiert. Mit der "subtrahierten": DNA-Bibliothek werden dann "expressed sequence tags" (ETSs) erzeugt, und mit solchen Tags wird eine Datenbank wie GenBank durchmustert, um potentielle Desaturasen zu identifizieren.
Transgene Organismen, die die Funktion der GLA-Produktion durch Einführung von DNA, die für eine Δ6-Desaturase codiert, dazugewinnen, gewinnen auch die Funktion der Produktion von Octadecatetraensäure (18:4 ^Δ6,9,12,15) dazu. Die Octadecatetraensäure kommt normalerweise in Fischölen und in einigen Pflanzenarten der Familie Boraginaceae vor (Craig et al. [1964] J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 209-211; Gross et al. [1976] Can. J. Plant Sci. 56, 659-664). Bei den erfindungsgemäßen transgenen Organismen entsteht die Octadecatetraensäure durch weitere Desaturierung der α-Linolensäure durch die Δ6-Desaturase oder durch Desaturierung der GLA durch die Δ15-Desaturase.
Die vom ORF2 codierten 359 Aminosäuren, also das offene Leseraster, das für die Synechocystis-Δ6-Desaturase codiert, sind als SEQ ID No: 2 dargestellt. Das offene Leseraster, das für die Borretsch-Δ6-Desaturase codiert, ist in SEQ ID No: 5 dargestellt. Die vorliegende Erfindung sieht außerdem weitere Nukleotidsequenzen vor, die für die Aminosäure SEQ ID No: 5 codieren. Der Durchschnittsfachmann weiß, wie solche Sequenzen, die zum Beispiel aufgrund des degenerierten genetischen Code entstehen, identifiziert werden können. Weiterhin kann der Durchschnittsfachmann durch die oben beschriebene Gain-of-Function-Analyse kleinere Subfragmente der Fragmente, die die für Δ6-Desaturasen codierenden offenen Leseraster enthalten, bestimmen.
Die vorliegende Erfindung sieht beliebige solcher Polypeptidfragmente der Δ6-Desaturase und die Nukleinsäuren hierfür vor, die die Aktivität der Umwandlung von LA zu GLA beibehalten.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenen Erfindung wird ein Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein kleineres Fragment, das den Promoter, die Codiersequenz und die Terminationsregion eines Δ6-Desaturasegens enthält, in einen Organismus, zum Beispiel Cyanobakterien, in dem die Δ6-Desaturase-Promoter- und -terminationsregion funktionsfähig ist, eingeführt. Die vorliegende Erfindung stellt daher Organismen, die eine rekombinante Δ6-Desaturase produzieren, bereit. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Δ6-Desaturase bereit, die aus den rekombinanten Organismen nach Standardmethoden der Proteinaufreinigung auf gereinigt werden kann (siehe zum Beispiel Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New York).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die DNA, die für eine Δ6-Desaturase codiert, enthalten. Dem Durchschnittsfachmann wird klar sein, daß geeignete Vektoren konstruiert werden können, um die Expression der Δ6-Desaturase-Codiersequenz in verschiedenen Organismen zu steuern. Besonders bevorzugt sind replizierbare Expressionsvektoren. Replizierbare Expressionsvektoren sind im vorliegenden Zusammenhang DNA- oder RNA-Moleküle, die im Hinblick auf eine kontrollierte Expression eines gewünschten Gens, also des Δ6-Desaturasegens, konstruiert worden sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Vektoren um Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide oder Viren. Die vorliegende Erfindung sieht auch Shuttle-Vektoren wie sie z.B. bei Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1561-1565 und Bustos et al. (1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533 beschrieben sind, vor. Detallierte Übersichtsartikel über Vektoren, in die eine Nukleinsäure, die für die vorliegende Δ6-Desaturase codiert, insertiert bzw. darin exprimiert werden kann, finden sich bei Sambrook et al. (1989), Goeddel, Hrsg. (1990) Methods in Enzymology 185 Academic Press, und Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc.. Solche Vektoren enthalten auch Nukleinsäuresequenzen, die die Expression von Nukleinsäuren, die für die Δ6-Desaturase codieren, beeinflussen können. Zu Sequenzelementen, die fähig sind, die Expression eines Genprodukts zu beeinflussen, zählen Promoter, Enhancer-Elemente, "upstream activating sequences", Transkriptionsterminationssig nale und Polyadenylierungsstellen. Es werden sowohl konstitutive Promoter als auch gewebespezifische Promoter vorgesehen. Für die Transformation von Pflanzenzellen sind der 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) sowie Promoter, die während der Reifung der Pflanzensamen reguliert werden, von besonderem Interesse. Alle diese Promoter und Transkriptionsregulationselemente, allein oder in Kombination, werden für die Verwendung in den vorliegenden replizierbaren Expressionsvektoren vorgesehen und sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Der CaMV-35S-Promoter wird zum Beispiel bei Restrepo et al. (1990) Plant Cell 2, 987, beschrieben. Gentechnisch veränderte und mutierte Regulationssequenzen sind ebenfalls vorgesehen.
Der Durchschnittsfachmann kann Vektoren und Regulationselemente, die sich für die Expression in einer bestimmten Wirtszelle eignen, festlegen. So eignet sich zum Beispiel für die Expression der Δ6-Desaturase in Cyanobakterien ein Vektor, der den Promoter von dem Gen, das für die Anabaena-Carboxylase codiert, in operativer Verknüpfung mit der Codierregion der Δ6-Desaturase sowie in operativer Verknüpfung mit einem Synechocystis-Terminationssignal umfaßt. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet "in operativer Verknüpfung", daß die Promoter- und Terminatorsequenz eine wirksame Funktion in bezug auf die Transkriptionsregulation ausüben. Als weiteres Beispiel kann ein Vektor, der sich für die Expression einer Δ6-Desaturase in transgenen Pflanzen eignet, eine samenspezifische Promotersequenz, die sich von Helianthinin, Napin oder Glyzinin ableitet, in operativer Verknüpfung mit der Δ6-Desaturase-Codierregion sowie in operativer Verknüpfung mit dem Samen-Terminationssignal oder dem Terminationssignal der Nopalinsynthase umfassen. Als weiteres Beispiel kann ein Vektor, der sich für die Expression einer Δ6-Desaturase in Pflanzen eignet, einen konstitutiven Promoter oder einen gewebespezifischen Promoter in operativer Verknüpfung mit der Δ6-Desaturase-Codierregion sowie in operativer Verknüpfung mit einem konstitutiven oder gewebespezifischen Terminator oder dem Terminationssignal der Nopalinsynthase umfassen.
Insbesondere werden als Promoterelemente für die Steuerung der Expression der Δ6-Desaturase der vorliegenden Erfindung die Helianthinin-Regulationselemente, die in der am 8. April 1991 eingereichten, gemeinsam anhängigen US-Anmeldung mit der Seriennummer 682 354 der Anmelderin beschrieben sind, vorgesehen.
Modifikationen der hier beschriebenen Nukleotidsequenzen oder Regulationselemente, die die hier vorgesehenen Funktionen beibehalten, sind vom Umfang der Erfindung umfaßt. Zu solchen Modifikationen zählen Insertionen, Substitutionen und Deletionen, insbesondere Substitutionen, die den degenerierten genetischen Code widerspiegeln.
Standardtechniken für die Konstruktion von solchen Hybridvektoren sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt und sind in der Literatur, wie bei Sambrook et al. (1989), oder einem der Vielzahl der Laborhandbücher über das Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik, die allgemein erhältlich sind, nachzulesen. Für die Ligation von DNA-Fragmenten sind verschiedene Strategien verfügbar; ihre Wahl richtet sich nach der Art der Enden der DNA-Fragmente. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin vorgesehen, in den Hybridvektoren weitere Nukleotidsequenzelemente mitzuverwenden, die die Klonierung, die Expression oder die Prozessierung erleichtern, zum Beispiel Sequenzen, die für Signalpeptide codieren, eine für KDEL codierende Sequenz, die für die Retention von Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum erforderlich ist, oder Sequenzen, die für Leitpeptide codieren, die die Δ6-Desaturase an den Chloroplasten adressieren. Solche Sequenzen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Ein optimiertes Leitpeptid wird zum Beispiel von Van den Broeck et al. (1985) Nature 313, 358 beschrieben. Prokaryontische und eukaryontische Signalsequenzen sind zum Beispiel bei Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425 beschrieben.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Organismen, bei denen es sich nicht um Cyanobakterien handelt, bzw. Pflanzen bereitgestellt, die die für die Δ6-Desaturase der vorliegenden Erfindung codierende DNA enthalten. Zu den erfindungsgemäß vorgesehenen transgenen Organismen zählen Bakterien, Cyanobakterien, Pilze sowie Pflanzen und Tiere. Die erfindungsgemäße isolierte DNA kann in den Wirt nach fachbekannten Verfahren eingebracht werden, zum Beispiel durch Infektion, Transfektion, Transformation oder Transkonjugation. Techniken für den Transfer der erfindungsgemäßen DNA in solche Organismen sind gutbekannt und in der Literatur beschrieben, wie z.B. bei Sambrook et al. (1989).
Es sind verschiedene Verfahren für die Transformation von Pflanzen bekannt. Das Δ6-Desaturasegen kann in Pflanzen mit Hilfe eines Blattscheibchen-Transformations-Regenerationsverfahrens eingeführt werden, wie dies bei Horsch et al. (1985) Science 227, 1229 beschrieben ist. Es können auch andere Transformationsmethoden, wie zum Beispiel die Protoplastenkultur (Horsch et al. (1984) Science 223, 496; DeBlock et al. (1984) EMBO J. 2, 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033), verwendet werden; auch dies fällt in den Schutzbereich der Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen mit von Agrobakterium abgeleiteten Vektoren transformiert. Es sind jedoch auch andere Verfahren für die Insertion der erfindungsgemäßen Δ6-Desaturasegene in Pflanzenzellen verfügbar. Zu diesen alternativen Verfahren zählen biolistische Ansätze (Klein et al. (1987) Nature 327, 70), Elektroporation, die chemisch induzierte DNA-Aufnahme sowie die Verwendung von Viren oder Pollen als Vektoren.
Wenn dies für das Transformationsverfahren erforderlich ist, können die erfindungsgemäßen Δ6-Desaturasegene in einen Pflanzentransformationsvektor insertiert werden, z.B. in den von Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111 beschriebenen binären Vektor. Pflanzentransformationsvektoren können dadurch abgewandelt werden, daß man das natürliche Gentransfersystem von Agrobacterium tumefaciens modifiziert. Das natürliche System umfaßt große Ti-Plasmide (tumorinduzierende Plasmide), die einen großen Abschnitt, der als T-DNA bekannt ist, enthalten und der in die transformierten Pflanzen übertragen wird. Ein anderer Abschnitt des Ti-Plasmids, die vir-Region, ist für den Transfer der T-DNA verantwortlich. Die T-DNA-Region wird von terminalen "Repeats" begrenzt. In den modifizierten binären Vektoren wurden die tumorinduzierenden Gene deletiert und die Funktionen der vir-Region werden dafür verwendet, um Fremd-DNA, die von den T-DNA-Border-Sequenzen begrenzt werden, zu übertragen. Die T-Region enthält auch einen selektierbaren Marker für Antibiotikaresistenz sowie eine multiple Klonierungsstelle für die Insertion von zu übertragenden Sequenzen. Die gentechnisch bearbeiteten Stämme sind unter dem Begriff "entwaffnete" A. tumefaciens-Stämme bekannt, und gestatten eine schlagkräftige Transformation von Sequenzen, die von der T-Region begrenzt werden, in die Zellkerngenome von Pflanzen.
Oberflächensterilisierte Blattscheibchen werden mit A. tumefaciens, die die "entwaffnete" Fremd-DNA enthalten, zwei Tage lang kultiviert und anschließend auf antibiotikahaltiges Medium umgesetzt. Transformierte Sprosse werden nach Bewurzelung in einem Medium, das das entsprechende Antibiotikum enthält, selektiert, in Erde umgesetzt und regeneriert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht transgene Pflanzen oder die Nachkommenschaft von diesen Pflanzen, die die isolierte erfindungsgemäße DNA enthalten, vor. Sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen sind vorgesehen. Pflanzenzellen werden mit der isolierten DNA, die für die Δ6-Desaturase codiert, nach einem der oben beschriebenen Pflanzentransformationsverfahren transformiert. Die transformierte Pflanzenzelle, üblicherweise in einer Kalluskultur oder einem Blattscheibchen, wird nach dem Fachmann wohlbekannten Verfahren zu einer ganzen transgenen Pflanze regeneriert (z.B. Horsch et al. (1985) Science 227, 1129). In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der transgenen Pflanze um Sonnenblume, Raps, Mais, Tabak, Erdnuß oder Sojabohne. Da die Nachkommenschaft der transformierten Pflanzen die DNA, die für die Δ6-Desaturase codiert, erbt, werden Samen oder Stecklinge von transformierten Pflanzen für die Aufrechterhaltung der transgenen Pflanzenlinie verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Bereitstellung von transgenen Pflanzen mit einem erhöhten GLA-Gehalt bereit. Bei diesem Verfahren wird DNA, die für eine Δ6-Desaturase codiert, in Pflanzenzellen, denen GLA fehlt bzw, die nur geringe GLA-Gehalte aufweisen, die jedoch LA enthalten, eingeführt und aus den transgenen Zellen werden Pflanzen mit einem erhöhten GLA-Gehalt regeneriert. Insbesondere werden als transgener Organismus erwerbsmäßig angebaute Kulturpflanzen vorgesehen, darunter Sonnenblume, Sojabohne, Raps, Mais, Erdnuß und Tabak, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Bereitstellung von nichtmenschlichen transgenen Organismen, die GLA enthalten, bereit. Bei diesem Verfahren wird DNA, die für eine Δ6-Desaturase codiert, in Pflanzenzellen, denen GLA fehlt bzw. die nur geringe GLA-Gehalte aufweisen, die jedoch LA enthalten, eingeführt. In einer anderen Ausführungsform werden bei dem Verfahren einer oder mehrerer Expressionsvektoren, die DNA, die für eine Δ12-Desaturase und eine Δ6-Desaturase codiert, enthalten, in Organismen, die sowohl GLA- als auch LA-defizient sind, eingebracht. Es werden also Organismen, die sowohl La als auch GLA-definzient sind, dazu gebracht, aufgrund der Expression der Δ12-Desaturase LA zu produzieren, und anschließend wird aufgrund der Expression der Δ6-Desaturase GLA produziert. Expressionsvektoren, die DNA, die für eine Δ12-Desaturase codiert oder die für eine Δ12-Desaturase und eine Δ6-Desaturase codiert, umfassen, können mit gentechnischen Verfahren, die dem Durchschnittfachmann bekannt sind (Sambrook et al., 1989) sowie der veröffentlichten Sequenz der Δ12-Desaturase (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200-203) konstruiert werden. Außerdem wurde erfindungsgemäß entdeckt, daß die Nukleotide 2002-3081 der SEQ ID No: 1 für eine Δ12-Desaturase aus Cyanobakterien codieren. Diese Sequenz kann dementsprechnd für die Konstruktion der vorliegenden Expressionsvektoren verwendet werden. Insbesondere werden als transgener Organismus erwerbsmäßig angebaute Kulturpflanzen vorgesehen, darunter Sonnenblume, Sojabohne, Raps, Mais, Erdnuß und Tabak, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
Die vorliegende betrifft weiterhin ein Verfahren für die Induktion von Kältetoleranz bei Pflanzen. Eine Kälteempfindlichkeit kann auf dem Phasenübergang der Lipide in Zellbrembranen beruhen. Die Phasenübergangstemperatur hängt vom Unsättigungsgrad der Fettsäuren in den Membranlipiden ab, und eine Erhöhung des Unsättigungsgrads, z.B. dadurch, daß man eine Δ6-Desaturase für die Umwandlung von LA zu GLA einbringt, kann somit eine Kälteresistenz induzieren oder verbessern. Bei dem vorliegenden Verfahren wird daher eine DNA, die für eine Δ6-Desaturase codiert, in eine Pflanzenzelle eingebracht und aus der transformierten Pflanzenzelle wird eine Pflanze mit verbesserter Kälteresistenz regeneriert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Raps-, Mais-, Erdnuß- oder Tabakpflanze.
Die folgenden Beispiele dienen der genaueren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1 (nicht erfindungsgemäß)
Stämme und Kulturbedingungen
Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) und Synechococcus (PCC 7942, ATCC 33912) wurden photoautotroph bei 30°C in BG11N+-Medium (Rippka et al. [1979] J. Gen. Microbiol. 111, 1-61) unter Glühlampenbeleuchtung (60 μE.m^–2.S^–1) herangezogen. Die Cosmide und Plasmide wurden in dem Escherichia coli-Stamm DH5α auf LB-Medium mit Antibiotikazusatz in den üblichen Konzentrationen wie von Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York beschrieben selektiert und vermehrt.
BEISPIEL 2 (nicht erfindungsgemäß)
Konstruktion der genomischen Synechocystis-Cosmidbibliothek
Die genomische Gesamt-DNA von Synechocystis (PCC 6803) wurde partiell mit Sau3A verdaut und auf einem Saccharosegradienten (Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) fraktioniert. Die Fraktionen, die DNA-Fragmente mit einer Länge von 30 bis 40 kB enthielten, wurden selektiert und in die dephosphorylierte BamHI-Stelle des Cosmidvektors pDUCA7 (Buikema et al. [1991] J. Bacteriol. 173, 1879-1885) ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro wie bei Ausubel et al. (1987) verpackt und die verpackten Phagen wurden in E. coli DH5α, der das AvaI- und Eco4711-Methylase-Helferplasmid, pRL528, wie bei Buikema et al. (1991) beschrieben, enthielt vermehrt. Insgesamt wurden 1152 Kolonien zufallsmäßig isoliert und einzeln in zwölf 96-Well-Mikrotiterplatten erhalten.
BEISPIEL 3 (nicht erfindungsgemäß)
Gain-of-Function-Expression von GLA in Anabaena
Anabaena (PCC 7120), ein fadenförmiges Cyanobakterium, ist GLA-defizient, enthält jedoch beträchtliche Mengen Linolsäure, welche die Vorstufe für GLA darstellt (2; Tabelle 2). Die in Beispiel 2 beschriebene Synechocystis-Cosmidbibliothek wurde in Anabaena (PCC 7120) konjugiert, um Transkonjuganten, die GLA produzieren, zu identifizieren. Die Anabaena-Zellen wurden in BG11N+-Flüssigmedium bis zur mittleren log-Phase herangezogen und im gleichen Medium auf eine Endkonzentration von ungefähr 2 × 10⁸ pro ml suspendiert. Eine Kultur von E. coli RP4 (Burkardt et al. [1979] J. Gen. Microbiol. 114, 341-348) in der mittleren log-Phase, die in ampicillinhaltigem LB-Medium gezüchtet worden war, wurde gewaschen und in frischem LB-Medium suspendiert. Anschließend wurden Anabaena und RP4 vermischt und gleichmäßig auf BG11N+-Platten mit 5 % LB ausgestrichen. Die genomische Cosmidbibliothek wurde nach der Stempelmethode auf LB-Platten, die 50 μg/ml Kanamycin und 17,5 μg/ml Chloramphenicol enthielten, ausplattiert und anschließend auf BG11N+-Platten, die Anabaena und RP4 enthielten, gestempelt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 30°C wurde mit 30 μg/ml Neomycin unterschichtet und es wurde bei 30°C weiter inkubiert, bis Transkonjuganten auftraten.
Einzelne Transkonjuganten wurden nach der Konjugation isoliert und in 2 ml BG11N+-Flüssigmedium mit 15 μg/ml Neomycin gezüchtet. Aus Wildtypkulturen sowie Kulturen, die Pools von zehn Transkonjuganten enthielten, wurden Fettsäuremethylester hergestellt, und zwar folgendermaßen. Kulturen von Wildtyp- und transgenen Cyanobakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Aus diesen Kulturen wurden gemäß Dahmer et al. (1989) J. Amer. Oil. Chem. Soc. 66, 543-548 Fettsäuremethylester extrahiert und mittels Gas-Flüssigkeitschromatographie (GLC) unter Verwendung eines Tracor-560-Geräts mit Wasserstoffflammenionisationsdetektor und Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm beschichtete FSOT- Superox-II-Säule, Alltech Associates Inc., IL) analysiert. Für die Identifikation der Fettsäuren wurden die Retentionszeiten und die gemeinsam durchgeführte Chromatographie von Standards (von Sigma Chemical Co.) verwendet. Die durchschnittliche Fettsäurezusammensetzung wurde als Verhältnis der Fläche unter dem Peak von jeder C18-Fettsäure, die mit einem internen Standard normalisiert worden war, bestimmt.
Repräsentative GLC-Profile sind in 2 dargestellt. Es sind die C18-Fettsäuremethylester dargestellt. Die Peaks wurden dadurch identifiziert, daß man die Elutionszeiten mit bekannten Standards und Fettsäuremethylestern verglich und wurden anschließend mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie bestätigt. In Tafel A ist die GLC-Analyse von Fettsäuren von Wildtyp-Anabaena dargestellt. Der Pfeil bezeichnet die Migragionszeit der GLA. Tafel B ist ein GLC-Profil von Fettsäuren von Anabaena-Transkonjuganten mit pAM542+1.8F. Zwei GLA-produzierende Pools (von 25 Pools, die 250 Transkonjuganten repräsentieren), die GLA produzierten, wurden identifiziert. Einzelne Transkonjuganten von jedem GLA-positiven Pool wurden auf GLA-Produktion analysiert; es wurden zwei unabhängige Transkonjuganten, nämlich AS13 und AS75, jeweils eine von jedem Pool, identifiziert, die beträchtliche GLA-Mengen exprimierten und die Cosmide, nämlich cSy13 bzw. cSy75, enthielten (3). Die Cosmide überlappen einander in einer ungefähr 7,5 kB langen Region. Ein 3,5 kB langes NheI-Fragment von cSy75 wurde in den Vektor pDUCA7 umkloniert und auf Anabaena übertragen, was zu einer Gain-of-Function-Expression von GLA führte (Tabelle 2).
Zwei NheI/Hind-III-Subfragmente (1,8 bzw. 1,7 kB) des 3,5 kB langen NheI-Fragments von cSy75-3.5 wurden zum Sequenzieren in "pBLUESCRIPT" (Stratagene) subkloniert (3). Es wurden die üblichen molekularbiologischen Techniken wie bei Maniatis et al. (1982) und Ausubel et al. (1987) durchgeführt. pBS1.8 wurde nach der Dideoxy-Methode (Sanger et al. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) mit "SEQUENASE" (United States Biochemical) an beiden Strängen sequenziert, und zwar mit spezifischen Oligonukleotid-Primern, die von Advanced DNA Technologies Laboratory (Biology Department, Texas A & M University) synthetisiert worden waren. Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte mit der GCG-Software (Madison, WI) gemäß Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Beide NheI/HindIII-Subfragmente wurden in einen konjugalen Expressionsvektor, nämlich AM542 übertragen, und zwar sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärts-Orientierung in bezug auf einen Cyanobakterien-Carboxylasepromoter und wurden mittels Konjugation in Anabaena eingebracht. Transkonjuganten, die das 1,8 kB große Fragment in Vorwärts-Orientierung enthielten (AM542-1.8F), produzierten beträchtliche Mengen an GLA sowie Octadecatetraensäure (2; Tabelle 2). Transkonjuganten, die andere Konstrukte enthielten, und zwar entweder das 1,8 kB große Fragment in Rückwärts-Orientierung oder das 1,7 kB große Fragment in Vorwärts- und Rückwärts-Orientierung, produzierten keine nachweisbaren GLA-Mengen (Tabelle 2).
In 2 wird das C18-Fettsäureprofil eines Extrakts aus Wildtyp-Anabaena (2A) mit demjenigen von transgenen Anabaena, die das 1,8 kB große Fragment von cSy75-3.5 in Vorwärts-Orientierung enthalten (2B), verglichen. Die GLC-Analyse der Fettsäuremethylester von AM542-1.8F ergab einen Peak mit einer Retentionszeit, die mit derjenigen des authentischen GLA-Standards identisch war. Die Analyse dieses Peak mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC-MS) bestätigte, daß das Massenfragmentierungsmuster das gleiche wie bei einer GLA-Referenzprobe war. Transgene Anabaena mit geänderten Gehalten an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wiesen ein ähnliches Wachstum und eine ähnliche Morphologie wie der Wildtyp auf.
Tabelle 2 Zusammensetzung der C18-Fettsäuren in Wildtyp- und transgenen Cyanobakterien
BEISPIEL 4 (nicht erfindungsgemäß)
Transformation von Synechococcus mit Δ6- und Δ12-Desaturasegenen
Ein drittes Cosmid, nämlich cSy7, das ein Δ12-Desaturasegen enthält, wurde dadurch isoliert, daß man die genomische Synechocystis-Bibliothek mit einem Oligonukleotid durchmusterte, das mit Hilfe der veröffentlichten Synechocystis-Δ12-Desaturase-Gensequenz synthetisiert worden war (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200-203). Ein 1,7 kB großes AvaI-Fragment von diesem Cosmid, das das Δ12-Desaturasegen enthielt, wurde identifiziert und als Sonde verwendet, um nachzuweisen, daß cSy13 nicht nur ein Δ6-Desaturasegen, sondern auch ein Δ12-Desaturasegen enthält (3). Die genomische Southern-Blot-Analyse zeigte weiterhin, daß sowohl das Δ6- als auch das Δ12-Desaturasegen unikär in dem Synechocystis-Genom vorliegen, so daß beide funktionellen Gene, die an der C18-Fettsäuredesaturierung beteiligt sind, im Synechocystis-Genom eng miteinander verbunden sind.
Das einzellige Cyanobakterium Synechococcus (PCC 7942) ist sowohl linolsäure- als auch GLA (3)-defizient. Das Δ12- und das Δ6-Desaturasegen wurden einzeln sowie gemeinsam in pAM854 (Bustos et al. [1991] J. Bacteriol. 174, 7525-7533), einen Shuttle-Vektor, der Sequenzen enthält, die für die Integration von Fremd-DNA in das Genom von Synechococcus (Golden et al. [1987] Methods in Enzymol. 153, 215-231) erforderlich ist, kloniert. Synechococcus wurde mit diesen Genkonstrukten transformiert und es wurden Kolonien selektiert. Aus transgenen Synechococcus wurden Fettsäuremethylester extrahiert und mittels GLC analysiert.
Tabelle 2 zeigt, daß die Haupt-Fettsäuren des Wildtyp-Synechococcus Sterinsäure (18:0) und Ölsäure (18:1) sind. Mit pAM854-Δ12 transformierte Synechococcus exprimierten zusätzlich zu den wichtigsten Fettsäuren auch Linolsäure (18:2). Transformanten mit pAM854-Δ6 und Δ12 produzierten sowohl Linoleat als auch GLA (Tabelle 1). Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß Synechococcus, der sowohl das Δ12- als auch das Δ6- Desaturasegen enthält, die Fähigkeit, eine zweite Doppelbindung in Δ12-Stellung sowie eine dritte Doppelbindung in Δ6-Stellung von C18-Fettsäuren einzubauen, dazu gewonnen hat. Bei der Transformante, die pAM854-Δ6 enthielt, wurden jedoch keine Veränderungen bezüglich der Fettsäurezusammensetzung beobachtet, was anzeigt, daß bei Fehlen von dem von der Δ12-Desaturase synthetisierten Substrat die Δ6-Desaturase nicht aktiv ist. Der Versuch bestätigt weiterhin, daß das 1,8 kB große NheI/HindIII-Fragment (3) sowohl Codierregionen als auch Promoterregionen des Δ6-Desaturasegens aus Synechocystis enthält. Transgene Synechococcus mit veränderten Gehalten an mehrfach ungesättigten Fettsäuren waren bezüglich Wachstumsgeschwindigkeit und Morphologie dem Wildtyp ähnlich.
BEISPIEL 5 (nicht erfindungsgemäß)
Nukleotidsequenz der Δ6-Desaturase
Es wurde die Nukleotidsequenz des 1,8 kB großen Fragments von cSy75-3.5, das das funktionelle Δ6-Desaturasegen enthielt, bestimmt. Es wurde ein offenes Leseraster, das für ein 359 Aminosäuren langes Polypeptid codiert, identifiziert (4). Mittels Kyte-Doolittle-Hydropathieanalyse (Kyte et al. [1982] J. Mol. Biol. 157, 105-132) wurden zwei Regionen von hydrophoben Aminosäuren identifiziert, die Transmembrandomänen darstellen könnten (1A); außerdem ist das Hydropathieprofil der Δ6-Desaturase demjenigen des Δ12-Desaturasegens (1B; Wada et al.) und der Δ9-Desaturase (Thiede et al. [1986] J. Biol. Chem. 261, 13230-13235) ähnlich. Die Sequenzähnlichkeit zwischen der Δ6- und der Δ12-Desaturase aus Synechocystis beträgt jedoch weniger als 40 % bei den Nukleotiden und ungefähr 18 % bei den Aminosäuren.
BEISPIEL 6 (nicht erfindungsgemäß)
Übertragung der Cyanobakterien-Δ6-Desaturase in Tabak
Das Cyanobakterien-Δ6-Desaturasegen wurde in einen Pflanzenexpressionsvektor mobilisiert und auf Tabak mit Hilfe der Agrobacterium-vermittelten Gentransfertechniken übertragen. Um zu gewährleisten, daß die übertragene Desaturase in Blättern und sich entwickelnden Samen entsprechend exprimiert wird und daß das Desaturasegenprodukt an das endoplasmatische Retikulum oder den Chloroplasten weitergeleitet wird, wurden verschiedene Expressionskassetten mit dem offenen Leseraster (ORF) der Δ6-Desaturase aus Synechocystis konstruiert. Zu den Bestandteilen dieser Kassetten zählen: (i) ein 35S-Promoter oder ein samenspezifischer Promoter, der vom Sonnenblumen-Helianthiningen stammt, um die Δ6-Desaturase-Genexpression in allen Pflanzengeweben bzw. nur in sich entwickelnden Samen voranzutreiben, (ii) ein mutmaßliches Signalpeptid, das entweder vom Karotten-Extensingen oder vom Sonnenblumen-Helianthiningen für die Zielsteuerung der neusynthetisierten Δ6-Desaturase in das ER, (iii) eine ER-Lumen-Retentionssignalsequenz (KDEL) am COOH-Ende des Δ6-Desaturase-ORF, sowie (iv) ein optimiertes Transitpeptid für die Zielsteuerung der Δ6-Desaturase in den Chloroplasten. Der 35S-Promoter ist ein Derivat von pRTL2; siehe Beschreibung durch Restrepo et al. (1990). Die optimierte Transitpeptidsequenz ist bei Van de Broeck et al. (1985) beschrieben. Das Karotten-Extensin-Signalpeptid ist bei Chen et al. (1985) EMBO J. 9, 2145 beschrieben.
Es wurden transgene Tabakpflanzen hergestellt, enthaltend ein chimäres Cyanobakterien-Desaturasegen umfassend das Synechocystis-Δ6-Desaturasegen in Fusion mit einer Retentionssequenz für das endoplasmatische Retikulum (KDEL) und ein Extensin-Signalpeptid, das vom CaMV-35S-Promoter getrieben wird. Aus PCR-Amplifikationen der transgenen genomischen Tabak-DNA geht hervor, daß das Δ6-Desaturasegen in das Tabakgenom eingebaut worden war. Die Fettsäuremethylester von Blättern dieser transgenen Tabakpflanzen wurden extrahiert und mittels Gas-Flüssigkeitschromatographie (GLC) analysiert. Bei diesen transgenen Tabakpflanzen waren beträchtliche GLA-Mengen angehäuft (4). In 4 sind die Fettsäuremethylester gemäß GLC dargestellt. Die Peaks wurden dadurch identifiziert, daß man die Elutionszeiten mit bekannten Fettsäuremethylester-Standards verglich. Cyanobakteriengene, die am Fettsäuremetabolismus beteiligt sind, können also für die Erzeugung von transgenen Pflanzen mit geänderten Fettsäurezusammensetzungen verwendet werden.
BEISPIEL 7
Konstruktion der Borretsch-cDNA-Bibliothek
Aus Borretschsamen wurden 12 Tage nach der Bestäubung (12 DPP) membrangebundene Polysomen isoliert, und zwar nach dem Prokoll von Larkins und Davies (1975 Plant Phys. 55 : 749-756), das für Erbsen entwickelt worden war. Aus den Polysomen wurde gemäß Mechler (1987 Methods in Enzymology 152 : 241-248, Academic Press) die RNA extrahiert.
Aus der membrangebundenen polysomalen RNA wurde mit Hilfe von Oligotex-dT-Beads (Qiagen) Poly-A+ RNA isoliert. Die entsprechende cDNA wurde mit Hilfe des ZAP-cDNA-Synthesekits von Stratagene erzeugt. Die cDNA-Bibliothek wurde mit dem Lambda-ZAP-II-Vektor-Kit im Lambda-ZAP-II-Vektor (Stratagene) konstruiert. Die Primärbibliothek wurde in Gigapack-II-Gold-Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt. Mit der Bibliothek wurden "expressed sequence tags" (ESTs) erzeugt, und mit den Sequenzen, die den Tags entsprachen, wurde die GenBank-Datenbank durchmustert.
BEISPIEL 8
Hybridisierungsprotokoll
Für das Durchmustern der Borretsch-cDNA-Bibliothek wurden mit der von Ausubel et al. (1994 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y.) beschriebenen "random primed"-DNA-Synthese Hybridisierungssonden erzeugt, die zuvor identifizierten reichlich exprimierten Samen-Speicherprotein-cDNAs entsprachen. Die nichteingebauten Nukleotide wurden mit Hilfe einer G-50 Spin-Säule (Boehringer Mannheim) entfernt. Die Sonde wurde für die Hybridisierung durch 5 minütiges Kochen im Wasserbad und anschließendes rasches Abkühlen auf Eis denaturiert. Die Filter für die Hybridisierung wurden 2-4 Stunden bei 60°C in Vorhybridisierungslösung (6 × SSC [Maniatis et al. 1984 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory], 1 × Denhartsche Lösung, 0,05 % Natriumpyrophosphat, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA) vorhybridisiert. Die denaturierte Sonde wurde zu der Hybridisierungslösung (6 × SSC, 1 × Denhartsche Lösung, 0,05 Natriumpyrophosphat, 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA) gegeben und unter Schütteln über Nacht bei 60°C inkubiert.
Die Filter wurden jeweils 15 Minuten bei 60°C in 4 ×, 2 × und 1 × SET-Waschlösung gewaschen. Eine 20 × SET-Waschlösung ist 3 M NaCl, 0,4 M Tris-Base, 20 mM Na₂EDTA-2H₂O. Die 4 × SET-Waschlösung war 4 × SET, 12,5 mM PO₄, pH 6,8 und 0,2 % SDS. Die 2 × SET-Waschlösung war 2 × SET, 12,5 mM PO₄, pH 6,8 und 0,2 % SDS. Die 1 × SET-Waschlösung war 1 × SET, 12,5 mM PO₄, pH 6,8 und 0,2 % SDS. Die Filter wurden an der Luft trocknen gelassen und dann 24 Stunden lang mit einem Röntgenfilm mit Verstärkungsschirm bei –80°C belichtet.
BEISPIEL 9
Zufallsmäßige Sequenzierung von cDNAs aus einer Bibliothek von membrangebundenen Polysomen aus Borretschsamen (12 DPP)
Die Borretsch-cDNA-Bibliothek wurde in niedriger Dichte (500 PBE auf 150-mm-Petrischalen) ausplattiert. Mit hoher Häufigkeit vorhandene Samen-Speicherprotein-cDNAs wurden durch Durchmustern mit den zuvor identifizierten entsprechenden cDNAs "subtrahiert". Plaques, die nicht hybridisierten, wurden mit Hilfe der Präparationsvorschrift und der Reagentien von Stratagene herauspräpariert. Mit den erhaltenen Bakterienkolonien wurden Flüssigkulturen inokuliert, und diese wurden entweder von Hand oder mit einem automatischen Sequenziergerät von ABI sequenziert. Jede cDNA wurde einmal sequenziert und ausgehend von 200-300 Basenpaaren wurde ein Sequenz-Tag erzeugt. Alle Sequenzierschritte wurden durch "cycle sequencing" (Epicentre) durchgeführt. Über 300 ESTs wurden erzeugt. Jeder Sequenz-Tag wurde mit Hilfe des BLASTX-Computerprogramms mit der GenBank-Datenbank verglichen, und mehrere Lipidstoffwechselgene, darunter auch die Δ6-Desaturase, wurden identifiziert.
Durch Datenbankabfragen mit einem cDNA-Klon mit der Bezeichnung mbp-65 mit Hilfe von BLASTX mit der GenBank-Datenbank gelangte man zu einer signifikanten Übereinstimmung mit der Synechocystis-Δ6-Desaturase. Es wurde jedoch bestimmt, daß es sich bei diesem Klon nicht um eine Volllängen-cDNA handelte. Eine Volllängen-cDNA wurde mit mbp-65 isoliert, um die Bibliothek der membrangebundenen Polysomen aus Borretsch zu durchmustern. Die Sequenz der isolierten cDNA wurde bestimmt (5A, SEQ ID No: 4), und die Proteinsequenz des offenen Leserasters (5B, SEQ ID No: 5) wurde mit anderen bekannten Desaturasen mit dem Geneworks (IntelligGenetics)-Protein-Alignment-Programm verglichen (2). Dieses Alignment ergab, daß es sich bei der cDNA um das Δ6-Desaturasegen aus Borretsch handelte.
Obwohl die Delta-6-Desaturase aus Borretsch anderen bekannten pflanzlichen Desaturasen ähnlich ist, bestehen Unterschiede, wie dies in dem in 6 gezeigten Dendrogramm angegeben ist. Weiterhin ergibt ein Vergleich der Aminosäuresequenzen, die für Desaturasen typisch sind, insbesondere derjenigen, die angeblich an der Metallbindung beteiligt sind (Metall-Box 1 und Metall-Box 2), die Unterschiede zwischen der Delta-6-Desaturase aus Borretsch und den anderen pflanzlichen Desaturasen (Tabelle 3).
Die Delta-6-Desaturase aus Borretsch unterscheidet sich von der Cyanobakterienform nicht nur bezüglich der Gesamtsequenz (6), sondern auch bezüglich der Aminosäurenmotive in der Lipid-Box, der Metall-Box 1 und der Metall-Box 2 (Tabelle 3). Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, sind alle drei Motive neuartig bezüglich ihrer Sequenz. Nur die Metall-Box 2 der Delta-6-Desaturase aus Borretsch weist einen gewissen Verwandtschaftsgrad mit der Metall-Box 2 der Delta-6-Desaturase aus Synechocystis auf.
Außerdem existieren Unterschiede zwischen der Delta-6-Desaturase aus Borretsch und einem weiteren Desaturasegen aus Borretsch, nämlich der Delta-12-Desaturase. Bei P1-81 handelt es sich um eine Volllängen-cDNA, die mittels EST-Analysde identifiziert wurde und eine starke Ähnlichkeit mit der Delta-12-Desaturase aus Arabidopsis (Fad 2) aufweist. Ein Vergleich der Aminosäuremotive der Lipid-Box, der Metall-Box 1 und der Metall-Box 2 (Tabelle 3) bei der Delta-6- und der Delta-12-Desaturase aus Borretsch zeigt, daß in diesen Regionen wenig Homologie existiert. Die Stellung der beiden Sequenzen in dem Dendrogramm in 6 zeigt, wie schwach verwandt diese beiden Gene sind.
BEISPIEL 10
Konstruktion von 222.1Δ⁶NOS für die Transiente und Expression
Der Vektor pBI221 (Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6: 3901-3907) wurde durch Restriktionsspaltung mit BamHI und EcoICR I (Promega), das die GUS-Codierregion herausschneidet, jedoch den 35S-Promoter und den NOS-Terminator unverändert läßt, für die Ligation vorbereitet. Die Δ6-Desaturase-cDNA aus Borretsch wurde aus dem Bluescript-Plasmid (Stratagene) durch Restriktionsspaltung mit BamHI und XhoI herausgeschnitten. Das XhoI-Ende wurde mittels Klenow-Fragment stumpfendig gemacht. Dieses Fragment wurde anschließend in die BamHI/EcoICR I Restriktionsstellen von pBI221 kloniert, wodurch man zu 221.Δ⁶NOS gelangte (7). In 221.Δ⁶NOS ist der verbleibende Abschnitt (das verbleibende Gerüst) der in 7 dargestellten Restriktionskarte pBI221.
BEISPIEL 11
Konstruktion von 121.Δ⁶.NOS für die stabile Transformation
Der Vektor pBI121 (Jefferson et al. 1987, EMBO J. 6:3901-3907) wurde durch Restriktionsspaltung mit BamHI und EcoICR I (Promega), das die GUS-Codierregion herausschneidet, jedoch den 35S-Promoter und den NOS-Terminator unverändert läßt, für die Ligation vorbereitet. Die Δ6-Desaturase-cDNA aus Borretsch wurde aus dem Bluescript-Plasmid (Stratagene) durch Restriktionsspaltung mit BamHI und XhoI herausgeschnitten. Das XhoI-Ende wurde mittels Klenow-Fragment stumpfendig gemacht. Dieses Fragment wurde anschließend in die BamHI/EcoICR I Restriktionsstellen von pBI121 kloniert, wodurch man zu 121.Δ⁶NOS gelangte (7). In 121.Δ⁶NOS ist der verbleibende Abschnitt (das verbleibende Gerüst) der in 7 dargestellten Restriktionskarte pBI121.
BEISPIEL 12
Transiente Expression
Alle Arbeiten mit Protoplasten wurden in einer sterilen Werkbank durchgeführt. Ein ml gepackte Karotten-Suspensionszellen wurden mit 30 ml Plasmolyselösung (25 g/l KCl, 3, 5 g/l CaCl₂-H₂O, 10 mM MES, pH 5, 6 und 0,2 M Mannit) mit 1 % Cellulase, 0,1 % Pectolyase und 0,1 % Dreisalase über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur verdaut. Die freigesetzten Protoplasten wurden durch ein 150-μm-Sieb filtriert und durch Zentrifugation (100 × g, 5 Minuten) zu einem Pellet sedimentiert und anschließend zweimal mit Plasmolyselösung gewaschen. Die Protoplasten wurden mit einem Doppelkammer-Hämacytometer gezählt. Die DNA wurde in die Protoplasten durch PEG-Behandlung wie bei Nunberg und Thomas (1993 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick und J.E. Thompson, Hrsg, S. 241-248) transfiziert, wobei 10⁶ Protoplasten und 50-70 μg Plasmid-DNA (221.Δ6.NOS) verwendet wurden. Die Protoplasten wurden 48 Stunden lang im Dunkeln unter Schütteln in 5 ml MS-Medium mit einem Zusatz von 0,2 M Mannit und 3 μm 2,4-D kultiviert.
BEISPIEL 13
Stabile Transformation von Tabak
Das 121.Δ⁶.NOS-Plasmidkonstrukt wurde für die Transformation von Tabak (Nicotiana tabacum cv. xanthi) mittels Agrobacterium nach Standardverfahren (Horsh et al., 1985 Science 227: 1229-1231 Bogue et al., 1990 Mol. Gen. Genet. 221: 49-57) verwendet, nur daß die ursprünglichen Transformanten auf 100 μg/ml Kanamycin selektiert wurden.
BEISPIEL 14
Herstellung und Analyse der Fettsäuremethylester (FAMEs)
Gewebe von transfizierten Protoplasten und transfizierten Tabakpflanzen wurde in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und über Nacht lyophilisiert. Die FAMEs wurden wie bei Dahmer et al. (1989 J. Amer. Oil Chem. Soc. 66: 543-548) beschrieben hergestellt. In manchen Fällen wurde das Lösungsmittel nochmals abgedampft und die FAMEs wurden in Essigester aufgenommen und einmal mit entionisiertem Wasser extrahiert, um eventuell vorhandene wasserlösliche Kontaminanten zu entfernen. Die FAMEs wurden mittels Gaschromatographie (GC) auf einer DB-Wax-Säule von J&W Scientific (Länge 30 m, ID 0,25 mm, Schichtdicke 0,25 μm) analysiert.
Ein Beispiel für einen transienten Assay ist in 8 dargestellt, die drei unabhängige Transfektionen als gemeinsamen Pool darstellt. Ein Zusatz der Δ6-Desaturase-cDNR aus Borretsch stimmt mit dem Auftreten von Gamma-Linolensäure (GLA), bei der es sich um eines der möglichen Produkte der Δ6-Desaturase handelt, überein.
Die 9 und 10 zeigen GC-Profile der FAMEs aus Blatt- und Samengewebe von Kontroll-Tabakpflanzen sowie transformierten Tabakpflanzen. 9A zeigt das Profil von Blattgewebe von Wildtyp-Tabak (xanthi); 9B zeigt das: Profil von Blattgewebe einer Tabakpflanze, die mit der Borretsch-Δ6-Desaturase unter der transkriptionsmäßigen Kontrolle des 35S-CaMV-Promoters (pBI 121.Δ⁶NOS) transformiert wurde. Die Peaks entsprechen 18:2, 18:3γ (GLA), 18:3α und 18:4 (Octadecansäure). 10A zeigt das GC-Profil von Samen eines Wildtyp-Tabaks; 10B zeigt das Profil von Samengewebe einer Tabakpflanze, die mit pBI 121.Δ⁶NOS transformiert worden war. Die Peaks entsprechen 18:2, 18:3γ(GLA) und 18:3α.
Die relative Verteilung der C₁₈-Fettsäuren in Kontroll-Tabaksamen und transgenen Tabaksamen ist in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Aus den oben dargestellten Ergebnissen geht hervor, daß GLA in die Triacylglyceride von transgenen Tabakblättern und -samen, die die Borretsch-Δ6-Desaturase enthalten, eingebaut ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die für eine Δ6-Desaturase codiert, wobei die Nukleinsäure aus der folgenden Reihe stammt (a) Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 5 oder für eines ihrer Fragmente codiert, (b) Nukleinsäure, die der SEQ ID No: 4 oder einem Fragment davon entspricht, (c) Nukleinsäure, umfassend das Δ6-Desaturasegen, das mit einer der Nukleinsäuren gemäß (a) oder (b) in einer Hybridisierungslösung, die 6 × SSC, 1 × Denhart'sche Lösung, 0,05 Natriumpyrophosphat und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthält, bei einer Hybridisierungstemperatur von 60°C hybridisiert.
Isolierte Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 5 codiert.
Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-2.
Expressionsvektor, umfassend die isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-2 in operativer Verknüpfung mit einem Promoter sowie gegebenenfalls einem Terminationssignal, der fähig ist, das Genprodukt der isolierten Nukleinsäure zu exprimieren.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Promoter um einen Δ6-Desaturase-Promoter, einen Anabaena-Carboxylase-Promoter, einen Helianthinin-Promoter, einen Glycinin-Promoter, einen Napin-Promoter, den 35S-Promoter aus CaMV oder einen gewebespezifischen Helianthinin-Promoter handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei dieser Promoter konstitutiv oder gewebespezifisch ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Terminationssignal um ein Synechocystis-Terminationssignal, ein Nopalinsynthase-Terminationssignal oder ein samenterminales Signal handelt.
Zelle, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 3-7.
Zelle nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Zelle um eine tierische Zelle, eine Bakterienzelle, eine Pflanzenzelle oder eine pilzliche Zelle handelt.
Nicht-menschlicher Organismus, der genetisch mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 3-7 transformiert ist.
Transgener Organismus nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Organismus um ein Bakterium, einen Pilz, eine Pflanze oder ein Tier handelt.
Pflanze oder Nachkommenschaft dieser Pflanze, die von der Pflanzenzelle nach Anspruch 9 regeneriert worden ist, wobei die Pflanze oder Nachkommenschaft genetisch mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 3-7 transformiert ist.
Pflanze nach Anspruch 12, wobei es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß-, Karotten- oder Rapspflanze handelt.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gamma-Linolensäure (GLA)-Gehalt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit der isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-2; und (b) Regenerieren einer Pflanze mit erhöhtem GLA-Gehalt aus der Pflanzenzelle.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gamma-Linolensäure (GLA)-Gehalt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 3-7; und (b) Regenerieren einer Pflanze mit erhöhtem GLA-Gehalt aus der Pflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß-, Karotten- oder Rapspflanze handelt.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-2 zur Herstellung eines Mittels für die Induktion der Produktion von Gamma-Linolensäure (GLA) in einem GLA-defizienten Organismus bzw. einem Organismus, dem GLA fehlt.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 3-7 zur Herstellung eines Mittels für die Induktion der Produktion von Gamma-Linolensäure (GLA) in einem GLA-defizienten Organismus bzw. einem Organismus, dem GLA fehlt.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2 und einer isolierten Nukleinsäure, die für die Δ12-Desaturase codiert, zur Herstellung eines Mittels zur Induktion der Produktion von Gamma-Linolensäure (GLA) in einem Organismus, der GLA- und Linolsäure (LA)-defizient ist bzw. dem GLA und Linolsäure (LA) fehlen.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die isolierte Nukleinsäure, die für die Δ6-Desaturase codiert, die Nukleotide 44 bis 1390 der SEQ ID No: 4 umfaßt.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-2 zur Herstellung eines Mittels für die Induktion der Produktion von Octadecatetraensäure in einem Organismus, der gamma-linolensäuredefizient ist bzw. dem Gamma-Linolensäure fehlt.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 3-7 zur Herstellung eines Mittels für die Induktion der Produktion von Octadecatetraensäure in einem Organismus, der gamma-linolensäuredefizient ist bzw. dem Gamma-Linolensäure fehlt.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei es sich bei dem Organismus um ein Bakterium, einen Pilz, eine Pflanze oder ein Tier handelt.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit verbesserter Kälteresistenz, das folgendes umfaßt: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit der isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-2; und (b) Regenerieren der Pflanze mit verbesserter Kälteresistenz aus der transformierten Pflanzenzelle.
Pflanze nach Anspruch 24, wobei es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß-, Karotten- oder Rapspflanze handelt.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Hybridisierungssonde für die Identifikation einer isolierten Nukleinsäure, die für die Δ6-Desaturase codiert, aus anderen GLA-produzierenden Organismen.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei es sich bei der isolierten Nukleinsäure um die Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 5 codiert oder ein Fragment davon oder um die Nukleinsäure, die durch die SEQ ID Nr.: 4 wiedergegeben ist oder ein Fragment davon handelt.