JP4422211B2 - △6−デサチュラーゼによるγリノレン酸の産生 - Google Patents
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Description
脊椎動物細胞は脂肪酸の△9位に二重結合を導入することができるが、脂肪酸鎖の△9二重結合とメチル末端との間にさらなる二重結合を導入できないので、リノール酸(C18△9,12)およびα−リノレン酸(C18△9,12,15)等の不飽和脂肪酸は、脊椎動物が合成できない必須食物成分である。これらは他の生成物の前駆体であるので、リノール酸およびα−リノレン酸は必須脂肪酸であり、一般に植物源から得られる。リノール酸は、哺乳類では、γ−リノレン酸(GLA、C18△6,9,12)には変換されずに、ほとんどのプロスタグランジンの必須前駆体であることから極めて重要な脂肪酸であるアラキドン酸(20:4)に変換される。
リノール酸の食物供給量は、GLAとアラキドン酸への結果的な変換の効力によって、GLAとアラキドン酸に対する食物的要求を満たす。しかしながら、飽和脂肪の消費と、高コレステロール血症、アテローム硬化症および心臓病の罹りやすさに関連する他の臨床的疾患等の健康の危険性との間の関係が示された。一方、不飽和脂肪の消費は、血中コレステロール濃度の低下およびアテローム硬化症の危険性の低下と関連している。食物GLAの治療的利点は、アラキドン酸の前駆体であり、次いでプロスタグランジン合成に寄与するGLAから得られるものである。従って、リノール酸より不飽和なGLAの消費は、潜在的に健康的な利点を備えている。しかしながら、GLAは、実際には、商業的に生育した作物植物のいずれにも存在しない。
リノール酸は、酵素△6-デサチュラーゼによってGLAに変換される。350アミノ酸以上の酵素である△6-デサチュラーゼは、膜結合ドメインと脂肪酸の不飽和化に活性な部位を備えている。この酵素を、GLAではなくリノール酸を内的に産生する細胞に転移させると、GLAが産生される。本願発明は、△6-デサチュラーゼをコードする遺伝子を提供することによって、機能的な△6-デサチュラーゼを含み、GLAを産生するトランスジェニック生物体の産生を可能にする。大量のGLAの産生を可能にすることに加えて、本願発明は、GLAの新規の食物源を提供する。
本願発明は、単離された△6-デサチュラーゼ遺伝子に向けられている。特に、単離された遺伝子は、△6-デサチュラーゼプロモーター、コード領域および終結領域を含む。
本願発明は、さらに、△6-デサチュラーゼプロモーター、コード領域および終結領域を含む発現ベクターに向けられている。
本願発明の他の態様は、非相同調節領域、すなわち△6-デサチュラーゼ遺伝子から誘導されない成分と機能的に組んだ△6-デサチュラーゼコード領域を含む発現ベクターに向けられている。
本願発明のベクターを含む細胞および生物体と、この様な生物体の子孫も、本願発明によって提供される。
本願発明のさらなる態様は、単離された細菌性△6-デサチュラーゼを提供する。単離された植物性△6-デサチュラーゼも提供される。
本願発明の他の態様は、γリノレン酸の含量が増大した植物を産生する方法を提供する。
寒冷寛容植物を産生する方法も、本願発明によって提供される。
図1は、シネコシスティス(Synechocystis)△6-デサチュラーゼ(パネルA)および△12-デサチュラーゼ(パネルB)の推定されるアミノ酸配列のヒドロパシープロファイルを図示したものである。推定上の膜間領域は、一様な線(solid bars)で示されている。疎水性指標は、19アミノ酸残基のウィンドウサイズに対して計測した[Kyteら(1982)J.Molec.Biol.157]。
図2は、野生型(パネルA)とトランスジェニック(パネルB)アナベナ属(Anabaena)のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。
図3は、重複領域とサブクローンを備えたコスミドcSy75、cSy13およびCsy7のマップの図表である。Csy75、Csy75−3.5およびCsy7のサブクローンの起源は、斜め斜線で示されている。不活性化された制限部位は、カッコ書きされている。
図4は、野生型(パネルA)とトランスジェニック(パネルB)タバコ(tobacco)のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。
図5Aは、ルリヂサ(borage)から単離された△6-デサチュラーゼcDNAのDNA配列を示す。
図5Bは、単離されたルリヂサの△6-デサチュラーゼcDNAにおける読み取り枠(open reading frame)のタンパク質配列を示す。デサチュラーゼの三つのアミノ酸モチーフが示され、脂質ボックス、メタルボックス(metal box)1、メタルボックス2の順になっている。
図6は、ルリヂサ△6-デサチュラーゼと他の膜結合型デサチュラーゼとの類似性を示すデンドログラムである。ルリヂサ△6-デサチュラーゼのアミノ酸配列を、ジーンワークス(Gene Works)(Intelligenetics)を用いて他の既知のデサチュラーゼと比較した。数値は、比較したサブグループ間の相対系統間距離に対応する。
図7は、221.△6.NOSと121.△6.NOSの制限マップである。221.△6.NOSでは、プラスミドの残りの部位はpBI221であり、121.△6.NOSでは、プラスミドの残りの部位はpBI121である。
図8は、偽(mock)トランスフェクトした(パネルA)および221.△6.NOSトランスフェクトした(パネルB)ニンジン細胞のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。18:2、18:3αおよび18:3γ(GLA)の位置が示されている。
図9は、未形質転換タバコの葉(パネルA)と121.△6.NOSで形質転換されたタバコの葉のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。18:2、18:3α、18:3γ(GLA)および18:4の位置が示されている。
図10は、未形質転換タバコ種子(パネルA)と121.△6.NOSで形質転換されたタバコの種子のガス液体クロマトグラフィープロファイルを示す。18:2、18:3αおよび18:3γ(GLA)の位置が示されている。
本願発明は、△6-デサチュラーゼをコードする単離された核酸を提供する。△6-デサチュラーゼをコードする核酸を同定するために、GLAを産生する生物体からDNAを単離する。前記の生物体は、例えば、動物細胞、ある種の真菌(例えば、Mortierella)、ある種の細菌(例えば、Synechocystis)もしくはある種の植物(ルリヂサ、エノセラ(Oenothera)、スグリ(currants))とすることができる。ゲノムDNAの単離は、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NYに例示されているような、当業者に周知の種々の方法によって行われる。単離されたDNAは、物理的な方法もしくは酵素切断によってフラグメントとされ、Sambrookら(1989)等の参考文献に見られる種々の周知技法のいずれかによってバクテリオファージもしくはコスミドベクター等の適切なベクターにクローン化される。本願発明のDNAを含む発現ベクターは、特に考慮される。△6-デサチュラーゼをコードするDNAは、機能解析の結果によって同定することができる。フラグメントとされたDNAを含むベクターは、リノール酸を産生するがGLAを産生しない宿主生物体に、感染、トランス接合(transconjugation)、トランスフェクション等によって転移される。ここで用いたように、“形質転換”とは、一般に、宿主細胞中に外部DNAを取り込むことを指す。宿主生物体中に組み換えDNAを導入する方法は、当業者の知るところであり、Sambrookら(1989)等に見いだされる。これらの生物体によるGLAの産生(すなわち機能獲得)は、例えばガスクロマトグラフィーや当業者に知られた他の方法によってアッセイされる。GLAを産生するに至った生物体、すなわちベクターの導入によって機能を獲得した生物体は、△6-デサチュラーゼをコードするDNAを発現するものと同定され、前記DNAはその生物体から回収される。△6-デサチュラーゼをコードするDNAを特に限定するために、回収されたDNAは、再度フラグメント化され、発現ベクターでクローン化され、上記の方法で機能的に評価される。
本願発明の実施例では、ランダムなDNAを、シアノバクテリア(ラン色細菌)シネコシスティス(Synechocystis)Pasteur Culture Collection(PCC)6803、American Type Culture Collection(ATCC)27184から単離し、コスミドベクターにクローン化し、GLAを欠くシアノバクテリア アナベナ属株PCC 7120,ATCC 27893に、トランス接合で導入した。アナベナ属のリノール酸からのGLAの産生を、ガスクロマトグラフィーで観察し、対応するDNAフラグメントを単離した。
単離されたDNAを、例えばSambrookら(1989)に見いだされるような、当業者に周知の方法で配列決定する。
本願発明に従って、△6-デサチュラーゼ遺伝子を含むDNA分子が単離された。特に、△6-デサチュラーゼ遺伝子を含む3.588キロベース(kb)のDNAがシアノバクテリア シネコシスティスから単離された。3.588kbのDNAのヌクレオチド配列が調べられ、SEQ ID NO:1に示されている。潜在的なコード領域を決める読み取り枠は、ヌクレオチド317〜1507および2002〜3081に存在する。△6-デサチュラーゼをコードするヌクレオチドを調べるために、△6-デサチュラーゼ活性を与える3.588kbのフラグメントを、それぞれ単一の読み取り枠を含む二つのサブフラグメントに切断した。フラグメントORF1はヌクレオチド1〜1704を含み、フラグメントORF2は、ヌクレオチド1705〜3588を含む。各フラグメントを、シアノバクテリアのカルボキシラーゼプロモーターを含む接合発現ベクター(a conjugal expression vector)(AM542、Wolkら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,1561)に正・逆の両方向にサブクローン化した。得られた構築物(すなわち、ORF1(F)、ORF1(R)、ORF2(F)およびORF2(R))を、標準的な方法(例えば、Wolkら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,1561参照)によって野生型アナベナ属PCC 7120に接合した。接合されたアナベナ属の細胞を、選択培地(Rippkaら(1979)J.Gen Microbiol.111,1に従って、30μg/mlのネオマイシンを含有する標準的なミネラル培地BG11N+)上で2週間生育させた後、非接合細胞を染色する褐色のバックグラウンド上のNeoR緑色コロニーとして同定する。緑色コロニーを選別し、選択的液体培地(15μg/mlのネオマイシンを含有するBG11N+)で生育させる。正・逆に配向したORF1およびORF2構築物を含む結果的なトランス接合体から、標準的な方法(例えば、Dahmerら,(1989)Journal of American Oil Chemical Society 66,543)で脂質を抽出する。比較のために、野生型のアナベナ属とシネコシスティスからも、脂質を抽出する。脂肪酸メチルエステルを、ガス液体クロマトグラフィー(GLC)、例えば水素炎イオン化検出器とキャピラリーカラムを備えたTracor-560ガス液体クロマトグラフィーを用いて解析する。GLC解析の結果は、表1に示されている。
GLC解析によって評価される通り、GLA欠乏アナベナ属は、正方向にORF2を含有する構築物がトランス接合によって導入された場合に、GLA産生機能を獲得する。カルボキシラーゼプロモーターに逆方向にORF2を含有する構築物、あるいはいずれの方向にORF1を含有する構築物も、GLA産生を示さない。この解析は、1884bpフラグメント内部の単一の読み取り枠(ORF2)が△6-デサチュラーゼをコードすることを示す。1884bpフラグメントはSEQ ID NO:3に示されている。このことは、図1にそれぞれ(A)および(B)として示されるように、△6-デサチュラーゼおよび△12-デサチュラーゼ(Wadaら(1990)Nature 347)間のヒドロパシープロファイルの全体的な類似性によって立証される。
また、本願発明では、ルリヂサ(Borago officinalis)の△6-デサチュラーゼ遺伝子を含むcDNAも単離した。1.685キロベース(kb)cDNAのヌクレオチド配列が調べられ、図5Aに示されている(SEQ ID NO:4)。ATG開始コドンと停止コドンに下線が付されている。ルリヂサの△6-デサチュラーゼの読み取り枠に対応するアミノ酸配列は図5Bに示されている(SEQ ID NO:5)。
△6-デサチュラーゼをコードする単離された核酸は、上述した機能獲得解析により、もしくはハイブリダイゼーションプローブとしてシネコシスティスもしくはルリヂサ△6-デサチュラーゼをコードする単離された核酸を用いた核酸ハイブリダイゼーション技術によって、他のGLA産生生物体から同定することができる。ゲノムおよびcDNAクローニング方法の両方は、当業者に周知であり、本願発明で考慮される。ハイブリダイゼーションプローブは、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:4として記載された完全なDNA配列、あるいはオリゴヌクレオチドプローブを含むその制限フラグメントもしくは別のDNAフラグメントを含むことができる。クロスハイブリダイゼーションによる相同遺伝子をクローニングする方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook(1989)とBeltzら(1983)Methods in Enzymology 100,266に見出すことができる。
GLAを産生する生物体から△6-デサチュラーゼ遺伝子を同定する別の方法としては、cDNAライブラリーが、ポリソーマルRNA(polysomal RNA)から単離されたポリA+RNAから作製される。cDNA全体から過剰に豊富に発現された遺伝子を除去するために、過剰に豊富なcDNA遺伝子に対応するcDNAもしくはフラグメントが、cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。ハイブリダイズしないプラークを削除し、得られた細菌コロニーを使用して液体培養を接種し、配列決定する。例えば、ルリヂサポリソーマルRNAからなるcDNAライブラリーから他の種子貯蔵タンパク質(seed strage protein)cDNAを除去する手段として、豊富に発現した種子貯蔵タンパク質に対応するcDNAをcDNAライブラリーに最初にハイブリダイズする。“差し引かれた”DNAライブラリーを、発現された配列タグ(ETS)を生成するために用い、この様なタグを用いて、可能な不飽和を同定するためにGenbank等のデータベースをスキャンする。
△-デサチュラーゼをコードするDNAの導入によってGLA産生機能を獲得したトランスジェニック生物体は、オクタデカテトラエン酸(octadecatetraeonic acid)(18:4△6,9,12,15)産生の機能も獲得する。オクタデカテトラエン酸は、通常は、魚油およびムラサキ科(Boraginaceae)のある植物種に存在する(Craigら(1964)J.Amer.Oil Chem.Soc.41,209-211;Grossら(1976)Can.J.Plant Sci.56,659-664)。本願発明のトランスジェニック生物体では、オクタデカテトラエン酸は、△6-デサチュラーゼによるα−リノレン酸のさらなる不飽和化もしくは△15-デサチュラーゼによるGLAの不飽和化によって生じる。
ORF2にコードされる359アミノ酸、すなわち、シネコシスティス△6-デサチュラーゼをコードする読み取り枠は、SEQ ID NO:2に示されている。ルリヂサ△6-デサチュラーゼをコードする読み取り枠はSEQ ID NO:5に示されている。本願発明は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:5のアミノ酸をコードする他のヌクレオチド配列をさらに考える。例えば、遺伝コードの縮重から得られる配列を同定することは、当業者の知識の範囲内である。さらに、当業者であれば、上述した機能解析から、△6-デサチュラーゼをコードする読み取り枠を含むフラグメントより小さいサブフラグメントを決定することができる。
本願発明は、LAからGLAに変換する活性を維持した△6-デサチュラーゼのポリペプチドフラグメントおよびその核酸も考慮する。
本願発明の別の態様では、本願発明の核酸、もしくは△6-デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、コード配列および終結領域を含むより小さいフラグメントを含むベクターが、△6-デサチュラーゼプロモーターおよび終結領域が機能するシアノバクテリア等の生物体に転移される。従って、組換え△6-デサチュラーゼを産生する生物体が、本願発明によって提供される。本願発明のさらに別の態様は、タンパク質精製の標準的な方法で組み換え生物体から精製される、単離された△6-デサチュラーゼを提供する。(例えば、Ausubelら(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates,New York参照)。
△6-デサチュラーゼをコードするDNAを含むベクターも、本願発明によって提供される。種々の生物体で△6-デサチュラーゼコード配列を発現するように適切なベクターを作製することができることは、当業者には明らかである。複製可能な発現ベクターが、特に好ましい。ここに記載された複製可能な発現ベクターとは、所望の遺伝子、すなわち△6-デサチュラーゼ遺伝子の調節された発現のために設計されたDNAもしくはRNA分子である。好ましくは、ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、コスミドもしくはウイルスである。例えば、Wolkら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1561-1565およびBustosら(1991)J.Bacteriol.174,7525-7533に記載されたようなシャトルベクターも、本願発明に従って考えられる。Sambrookら(1989),Goeddel,ed.(1990)Method in Enzymology 185 Academic Press、およびParbal(1988)A Practical Guide to Molecular Cloning,John WileyとSons,Inc.は、本願の△6-デサチュラーゼをコードする核酸が挿入されて発現されるベクターの詳細な批評を提供する。この様なベクターは、△6-デサチュラーゼをコードする核酸の発現に作用する核酸配列をも含む。遺伝子産物の発現に影響する配列部は、プロモーター、エンハンサー部、上流活性化配列、転写終結シグナルおよびポリアデニレーション部位を含む。構成性(constitutive)および組織特異的プロモーターの両方が考えられる。植物細胞の形質転換では、カリフラワーモザイクウイルス(the cauliflower mosaic virus)(CaMV)35Sプロモーターおよび植物の種子の成熟中に調節されるプロモーターに特に関心が向けられる。上記プロモーターと転写調節部の全てが、単独もしくは組み合わせて、本願の複製可能な発現ベクターにおける使用に考えられ、当業者に周知である。CaMV35Sプロモーターは、例えばRestrepoら(1990)Plant Cell 2,987に記載されている。遺伝的に設計され、かつ変異した調節配列も考えられる。
当業者であれば、特定の宿主細胞における発現に適したベクターおよび調節部を決定することができる。例えば、シネコシスティスの△6-デサチュラーゼのコード領域に使用可能に連結され(operably linked)、終結シグナルにさらに使用可能に連結された、アナベナ族のカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターを含むベクターは、シアノバクテリアにおける△6-デサチュラーゼの発現に適している。この文脈の“使用可能に連結され”とは、プロモーターおよび終結配列が、効果的に機能して転写を調節することを意味する。さらなる実施例では、トランスジェニック植物における△6-デサチュラーゼの発現に適切なベクターは、△6-デサチュラーゼコード領域に使用可能に連結され、種子終結シグナルもしくはノパリン(nopaline)シンターゼ終結シグナルにさらに使用可能に連結された、ヘリアンチニン(helianthinin)、ナピン(napin)もしくはグリシニンから誘導された種子特異的プロモーター配列を含むことができる。さらなる実施例では、植物における△6-デサチュラーゼの発現に使用されるベクターは、△6-デサチュラーゼコード領域に使用可能に連結され、構成的もしくは組織特異的ターミネーターもしくはノパリンシンターゼ終結シグナルにさらに使用可能に連結された、構成性プロモーター(a constitutive promoter)もしくは組織特異的プロモーターを含むことができる。
特に、本出願人の、1991年4月8日に出願され、参照としてここに取り込んだ出願中の米国出願第682354号に記載されたヘリアンチニン調節部は、本願発明の△6-デサチュラーゼを発現するためのプロモーター部として考えられる。
ここで考察した機能を維持するような、ここに開示されたヌクレオチド配列もしくは調節部の修飾は、本願発明の範囲内である。この様な修飾は、挿入、置換および欠失、そして特に遺伝コードの縮重を反映した置換を含む。
この様なハイブリッドベクターの構築に標準的な技術は当業者に周知であり、Sambrookら(1989)、もしくは広く利用される組換えDNA技術についての無数の実験マニュアルのいずれかに見出される。DNAフラグメントをリゲートするのに種々の方法が利用でき、その選択はDNAフラグメントの末端の性質に依存する。本願発明に従って、ハイブリッドベクターに、クローニング、発現もしくはプロセッシングを容易にする他のヌクレオチド配列部、例えば、シグナルペプチドをコードする配列、小胞体にタンパク質を維持するのに必要なKDELをコードする配列、もしくは△6-デサチュラーゼをクロロプラストに向けるトランジット(transit)ペプチドをコードする配列を含むことも考えられる。この様な配列は、当業者に既知である。最適化されたトランジットペプチドは、例えばVan den Broeckら(1985)Nature 313,358に記載されている。原核性および真核性シグナル配列は、例えば、Michaelisら(1982)Ann.Rev.Microbiol.36,425に開示されている。
本願発明のさらなる態様は、本願発明の△6-デサチュラーゼをコードするDNAを含むシアノバクテリアもしくは植物以外の生物体を提供する。本願発明に従って考慮されたトランスジェニック生物体は、細菌、シアノバクテリア、真菌および植物および動物を含む。本願発明の単離されたDNAは、例えば感染、トランスフェクション、形質転換もしくはトランス接合等の、当該技術分野で周知の方法によって宿主に導入することができる。本願発明のDNAをこの様な生物体に転移する技術は広く知られ、Sambrookら(1989)等の参考文献に記載されている。
種々の植物形質転換方法が知られている。△6-デサチュラーゼ遺伝子は、Horschら(1985)Science 227,1229に記載されたようなリーフディスク形質転換−再生方法(a leaf disk transformation-regeneration procedure)によって植物に導入することができる。プロトプラスト培養(Horschら(1984)Science 223,496;DeBlockら(1984)EMBO J.2,2143;Bartonら(1983)Cell 32,1033)等の形質転換の別の方法も用いることができ、本願発明の範囲内である。好ましい実施態様では、植物がアグロバクテリウム誘導ベクター(Agrobacterium-derived vectors)で形質転換される。しかしながら、他の方法を、本願発明の△6-デサチュラーゼ遺伝子を植物細胞に挿入するのに利用することができる。別の方法としては、バイオリスティック(biolistic)アプローチ(Kleinら(1987)Nature 327,70)、エレクトロポレーション(電気穿孔法)、化学的に誘導されたDNAの取り込み、およびベクターとしてのウイルスもしくは花粉の使用を含む。
形質転換方法を必要とする場合は、本願発明の△6-デサチュラーゼ遺伝子を、例えばBevan(1984)Nucleic Acids Res.12,8111に記載されたバイナリーベクター等の植物形質転換ベクターに挿入することができる。植物形質転換ベクターは、Agrobacterium tumefaciensの通常の遺伝子転移システムを修飾することによって誘導することができる。通常のシステムは、形質転換された植物に転移される、T−DNAとして知られる巨大セグメントを含む、Ti(腫瘍−誘導)−プラスミドを含む。Tiプラスミドの他のセグメント、vir領域は、T−DNA転移の原因である。T−DNA領域には、末端繰り返しが隣接している。修飾されたバイナリーベクターでは、腫瘍誘導遺伝子が削除され、T−DNA端部配列が隣接した外部DNAを転移するために、vir領域の機能が利用される。またT−領域は、抗生物質耐性に選択的なマーカーを含み、転移の配列を挿入するための多重クローニング部位を含む。このように設計された株は、“無力化(disarmed)”A.tumefaciens株として知られ、T−領域が隣接した配列を、植物の核ゲノムに効率的に形質転換する。
表面が滅菌されたリーフディスクに、“無力化”外来DNA含有A.tumefaciensを接種し、2日間培養し、抗生物質含有培地に移す。適切な抗生物質を含む培地に植え付けた後に、形質転換された新芽を選別し、土壌に移し、再生する。
本願発明の別の態様は、本願発明の単離されたDNAを含むトランスジェニック植物もしくはこれらの植物の子孫を提供する。単子葉および双子葉植物の両方が考慮される。植物細胞は、上述の植物の形質転換方法のいずれかによって、△6-デサチュラーゼをコードする単離されたDNAで形質転換される。通常はカルス培養もしくはリーフディスクの形質転換された植物細胞は、当業者に周知の方法(例えば、Horschら(1985)Science 227,1129)によって、完全トランスジェニック植物に再生される。好ましい実施態様では、トランスジェニック植物は、ヒマワリ、アブラナ(oil seed rape)、トウモロコシ、タバコ、ピーナツもしくは大豆である。形質転換された植物の子孫は、△6-デサチュラーゼをコードするDNAが遺伝するので、形質転換植物の種子もしくは切片は、トランスジェニック植物系統を維持するのに使用される。
本願発明はさらに、GLAの量が増大したトランスジェニック植物を提供する方法を提供する。この方法は、GLAを欠いているか、あるいは低レベルのGLAを備えた、LAを含む植物細胞に、△6-デサチュラーゼをコードするDNAを導入すること、およびトランスジェニック細胞からGLA含量が増大した植物を再生することを含む。特に、商業的に生育した収穫植物は、ヒマワリ、大豆、アブラナ、トウモロコシ、ピーナツおよびタバコを含むと考えられるが、これらに限定されない。
本願発明は、さらに、GLAを含むトランスジェニック生物体を提供する方法を提供する。この方法は、GLAを欠いているか、あるいは低レベルのGLAを有するが、LAを含む生物体に、△6-デサチュラーゼをコードするDNAを導入することを含む。他の実施態様では、この方法は、△12-デサチュラーゼおよび△6-デサチュラーゼをコードするDNAを含む一つ以上の発現ベクターを、GLAおよびLAの両方を不足とする生物体中に導入することを含む。従って、LAとGLAの両方を不足とする生物体は、△12-デサチュラーゼの発現によってLAを産生するように誘導され、しかして△6-デサチュラーゼの発現によってGLAが生成される。△12-デサチュラーゼ、もしくは△12-デサチュラーゼおよび△6-デサチュラーゼをコードするDNAを含む発現ベクターは、当業者に知られた組換え技術の方法(Sambrookら,1989)および△12-デサチュラーゼの公開された配列(Wadaら,[1990]Nature(London)347,200-203)から構築することができる。さらに、本願発明により、SEQ ID NO:1のヌクレオチド2002−3081が、シアノバクテリアの△12-デサチュラーゼをコードすることが示された。従って、この配列は、本願の発現ベクターを構築するために用いられる。特に、商業的に生育された収穫植物は、ヒマワリ、大豆、アブラナ、トウモロコシ、ピーナツおよびタバコを含むと考えられるが、これらに限定されない。
本願発明は、植物に寒冷寛容を誘導する方法にも向けられている。寒冷感受性は、細胞膜の脂質の相転移によることがある。相転移温度は、膜脂質の脂肪酸の不飽和の度合いに依存し、例えばLAをGLAに変換する△6-デサチュラーゼを導入することにより、不飽和の度合いを増大することにより、寒冷耐性を誘導もしくは改良することができる。従って、この方法は、△6-デサチュラーゼをコードするDNAを植物細胞に導入すること、この形質転換された植物細胞から、改良された寒冷耐性を備えた植物を再生することを含む。好ましい実施態様では、植物は、ヒマワリ、大豆、アブラナ、トウモロコシ、ピーナツおよびタバコである。
以下の実施例は、本願発明をさらに例証する。
実施例1
株と培養条件
シネコシスティス(Synechocystis)(PCC6803、ATCC27184)、アナベナ(Anabaena)(PCC7120、ATCC27893)およびシネココッカス(Synechococcus)(PCC7942、ATCC33912)を、白熱ランプ(60μE.m-2.S-1)の照明下でBG11N+培地(Rippkaら(1979)J.Gen.Microbiol.111,1-61)で30℃で光独立栄養生物学的に生育した。コスミドおよびプラスミドを、Maniatisら(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring,New Yorkに記載された標準的な濃度で抗生物質を添加したLB培地上の大腸菌(Escherichia coli)のDH5α株内で、選別および繁殖させた。
実施例2
シネコシスティスコスミドゲノムライブラリーの作製
シネコシスティス(PCC6803)の全体のゲノムDNAを、Sau3Aで部分的に切断し、スクロース勾配で分画した(Ausubelら(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,New York)。30〜40kbのDNAフラグメントを含む画分を選別し、コスミドベクターpDUCA7(Buikemaら(1991)J.Bacteriol.173,1879-1885)の脱リン酸化BamHI部位にリゲートした。リゲートされたDNAを、Ausubelら(1987)に記載されたようにin vitroでパッケージし、パッケージされたファージを、Buikemaら(1991)に記載されたAvaIおよびEco4711メチラーゼヘルパープラスミドpRL528を含むE.coli DH5αで繁殖させた。全部で1152のコロニーをランダムに単離し、個別に96ウェルミクロタイタープレートで維持した。
実施例3
アナベナにおけるGLAの機能獲得発現
アナベナ(PCC7120)、繊維状シアノバクテリアは、GLAが不十分であるが、GLAの前駆体であるリノール酸を大量に含む(図2;表2)。GLAを産生するトランス接合体を同定するために、実施例2に記載されたシネコシスティスコスミドライブラリーをアナベナ(PCC7120)に接合した。アナベナ細胞を、BG11N+液体培地で中対数期(mid-log phase)まで生育し、終濃度が約2x108細胞/mlとなるように同じ培地に再懸濁した。アンピシリンを含むLB培地で生育したE.coli RP4の中対数期培養を洗浄し、新鮮なLB培地に再懸濁した。アナベナとRP4を混合し、5%LBを含むBG11N+プレートに平らに広げた。コスミドゲノムライブラリーを、50μg/mlのカナマイシンと17.5μg/mlのクロラムフェニコールを含むLBプレート上にレプリカプレートし、アナベナとRP4を含むBG11N+プレート上にパッチ(patch)した。30℃で24時間インキュベーションした後、30μg/mlのネオマイシンを下に敷き、トランス接合体が現れるまで30℃でインキュベーションを続けた。
個々のトランス接合体を接合後に単離し、15μg/mlのネオマイシンを含む2mlのBG11N+液体培地で生育した。脂肪酸メチルエステル類を、野生型培養物および以下のような10のトランス接合体のプールを含む培養物から調製した。野生型とトランスジェニックシアノバクテリアの培養物を、遠心して回収し、蒸留水で2回洗浄した。脂肪酸メチルエステル類を、Dahmerら(1989)J.Amer.Oil.Chem.Soc.66,543-548に記載されているようにして上記培養物から抽出し、水素炎イオン化検出器とキャピラリーカラムとを備えたTracor-560(30m x 0.25mm bonded FSOT Superox II,Alltech Associates Inc.,IL)を用いたガス液体クロマトグラフィー(GLC)で分析した。標準の保持時間とコクロマトグラフィー(co-chromatography)(Sigma Chemical Co.から得られた)を、脂肪酸の同定のために用いた。平均的な脂肪酸組成を、内部標準に対する標準化された各C18脂肪酸のピーク面積の比率として調べた。
代表的なGLCプロファイルが図2に示されている。C18脂肪酸メチルエステル類が示されている。脂肪酸メチルエステル類の既知の標準を用いた溶出時間を比較することによってピークを同定し、ガスクロマトグラフィー質量分析によって確認した。パネルAは、アナベナの野生型の脂肪酸のGLC分析を示す。矢印は、GLAの移動時間を示す。パネルBは、pAM542+1.8Fを備えたアナベナのトランス接合体の脂肪酸のGLCプロファイルである。二つのGLA産生プール(25プールは250トランス接合体を意味する)が、GLAを産生することが同定された。各GLA陽性プールの個々のトランス接合体をGLA産生について分析した;各プールに由来する、二つの独立したトランス接合体、AS13およびAS75が、顕著なレベルのGLAを発現したこと、並びに、コスミド類、cSy13およびcSy75をそれぞれ含むことが同定された(図3)。これらのコスミドは、長さが約7.5kbの領域において重複する。cSy75の3.5kbのNheIフラグメントをベクターpDUCA7に再度クローン化し、GLAの機能獲得発現を生じるアナベナに転移した(表2)。
cSy75−3.5の3.5kbのNheIフラグメントの二つのNheI/HindIIIサブフラグメント(1.8および1.7kb)を、配列決定用に“pBLUESCRIPT”(Stratagene)にサブクローン化した(図3)。標準的な分子生物学的技術を、Maniatisら(1982)とAusubelら(1987)によって記載されているようにして行った。pBS1.8のジデオキシシークエンシング(Sangerら(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463-5467)を、the Advanced DNA Technologies Laboratory(Biology Department,Texas A & M University)によって合成された特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、二本鎖について“SEQUENASE”(United States Biochemical)で行った。Devereuxら(1984)Nucleic Acids Res.12,387-395に記載されているように、GCG(Madison,WI)ソフトウェアを用いて、DNA配列解析を行った。
両方のNheI/HindIIIサブフラグメントを、シアノバクテリアのカルボキシラーゼプロモーターに対して正・逆の両方向で、接合発現ベクターAM542に形質転換し、接合によりアナベナに導入した。1.8kbのフラグメントを正の方向に含むトランス接合体(AM542−1.8F)は、顕著な量のGLAとオクタデカテトラエン酸を産生した(図2;表2)。他の構築物、逆方向の1.8kbフラグメントもしくは正・逆両方向の1.7kbフラグメントを含むトランス接合体は、検出可能なレベルのGLAを産生しなかった(表2)。
図2は、野生型アナベナ属から抽出したC18脂肪酸プロファイルと、正方向にcSy75−3.5の1.8kbフラグメントを含むトランスジェニックアナベナから抽出した脂肪酸のプロファイルとを比較した(図2B)。AM542−1.8Fからの脂肪酸メチルエステル類のGLC解析は、確実なGLA標準と同じ保持時間のピークを示した。ガスクロマトグラフィー質量分析(GC−MS)によるこのピークの解析により、GLA参照サンプルと同じ質量分画パターンを備えていることが確認された。変更されたレベルのポリ不飽和脂肪酸を備えたトランスジェニックアナベナは、成長速度および形態学において野生型と類似していた。
実施例4
△6および△12-デサチュラーゼ遺伝子を用いたシネココッカスの形質転換
△12-デサチュラーゼ遺伝子を含む第三のコスミド、cSy7を、開示されたシネコシスティス(Synechocystis)△12-デサチュラーゼ遺伝子配列(Wadaら(1990)Nature(London)347,200-203)から合成されたオリゴヌクレオチドでシネコシスティスゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。△12-デサチュラーゼ遺伝子を含むこのコスミドの1.7kb AvaIフラグメントを同定し、プローブとして用いて、cSy13が△6-デサチュラーゼ遺伝子だけでなく△12-デサチュラーゼ遺伝子も含むことが証明された(図3)。ゲノムサザンブロット解析は、△6−および△12-デサチュラーゼ遺伝子の両方がシネコシスティスゲノム中で独特であるので、C18脂肪酸不飽和に係る両方の機能遺伝子がシネコシスティスゲノム中で密接に関連することをさらに示した。
単細胞シアノバクテリア(ラン色細菌)シネココッカス(PCC7942)は、リノール酸とGLAの両方において不十分である(3)。△12および△6-デサチュラーゼ遺伝子を、シネココッカスのゲノム中に外来DNAを組み込むのに必要な配列を含むシャトルベクター(Goldenら(1987)Methods in Enzymol.153,215-231)であるpAM854(Bustosら(1991)J.Bacteriol.174,7525-7533)に、個々に、かつ、共にクローン化した。シネココッカスをこれらの遺伝子構築物で形質転換し、コロニーを選別した。脂肪酸メチルエステルを、トランスジェニックシネココッカスから抽出し、GLCを解析した。
表2は、野生型シネココッカスの主な脂肪酸が、ステアリン酸(18:0)およびオレイン酸(18:1)であることを示している。pAM854−△12で形質転換されたシネココッカスは、この主な脂肪酸に加えてリノール酸(18:2)を発現した。pAM854−△6および△12で形質転換されたものは、リノレアート(linoleate)とGLAの両方を産生した(表1)。△12−および△6-デサチュラーゼ遺伝子の両方を含むシネココッカスは、C18脂肪酸の△12位に第二の二重結合と△6位に第三の二重結合を導入する能力を獲得した。しかしながら、pAM854−△6を含む形質転換体では脂肪酸組成において何の変化も観察されず、△12-デサチュラーゼによって合成された基質が存在しない条件下では、△6-デサチュラーゼが不活性であることを示している。この実験は、1.8/kbのNheI/HindIIIフラグメント(図3)が、シネコシスティス△6-デサチュラーゼ遺伝子のコード領域とプロモーター領域の両方を含むことをさらに確認する。ポリ不飽和脂肪酸のレベルが変化したトランスジェニックシネココッカスは、成長速度と形態学において野生型と類似していた。
実施例5
△6-デサチュラーゼのヌクレオチド配列
機能的な△6-デサチュラーゼ遺伝子を含むcSy75−3.5の1.8kbフラグメントのヌクレオチド配列を調べた。359アミノ酸のポリペプチドをコードする読みとり枠を同定した(図4)。Kyte−Doolittle疎水性解析(Kyteら(1982)J.Mol.Biol.157,105-132)は、トランスメンブレンドメインを示し得る疎水性アミノ酸の二つの領域;さらに、△6-デサチュラーゼの疎水性プロファイルが△12-デサチュラーゼ遺伝子(図1B;Wadaら)および△9-デサチュラーゼ(Thiedeら(1986)J.Biol.Chem.261,13230-13235)と類似していることを同定した。しかしながら、シネコシスティス△6−および△12-デサチュラーゼ間の配列類似性は、ヌクレオチドレベルで40%未満であり、アミノ酸レベルで約18%である。
実施例6
シアノバクテリア△6-デサチュラーゼのタバコへの転移
シアノバクテリア△6-デサチュラーゼ遺伝子を、植物発現ベクターに導入し、アグロバクテリウム仲介遺伝子転移技術(Agrobacterium mediated gene transfer techniques)を用いてタバコに移入した。移入されたデサチュラーゼが葉および発達中の種子において適切に発現されること、およびデサチュラーゼ遺伝子産物が小胞体もしくはクロロプラストに向けられることを確認するために、シネコシスティス△デサチュラーゼ読みとり枠(ORF)を備えた種々の発現カセットを構築した。これらのカセットの成分は、(i)発達中の種子のみにおいて、もしくは全ての植物組織において、△6-デサチュラーゼ遺伝子の発現を誘導するための、ヒマワリ ヘリアンチニン(helianthinin)遺伝子から誘導された種子特異的プロモーターもしくは35Sプロモーター、(ii)新規に合成された△6-デサチュラーゼをERに向けるための、ニンジン エクステンシン(carrot extensin)遺伝子もしくはヒマワリ ヘリアンチニン遺伝子に由来する推定上のシグナルペプチド、(iii)△6-デサチュラーゼORFのCOOH−末端のERルーメン保持シグナル配列(KDEL)、および(iv)△6-デサチュラーゼをクロロプラストに向ける最適化されたトランジットペプチドを含む。35Sプロモーターは、Restrepoら(1990)に記載されたpRTL2の誘導体である。最適化されたトランジットペプチド配列は、Van de Broeckら(1985)によって記載されている。ニンジン エクステンシン シグナルペプチドは、Chenら(1985)EMBO J.9,2145によって記載されている。
小胞体保持配列(KDEL)およびCaMV35Sプロモーターによって誘導されたエクステンシン シグナルペプチドに融合したシネコシスティス△6-デサチュラーゼ遺伝子を含むキメラ シアノバクテリア デサチュラーゼ遺伝子を含む、トランスジェニックタバコ植物(tobacco plants)を産生した。トランスジェニックタバコ ゲノムDNAのPCR増幅は、△6-デサチュラーゼ遺伝子がタバコゲノムに取り込まれたことを示唆している。これらのトランスジェニック タバコ植物の葉の脂肪酸メチルエステル類を抽出し、ガス液体クロマトグラフィー(GLC)で解析した。これらのトランスジェニックタバコは顕著な量のGLAを蓄積した(図4)。図4は、GLCで同定された脂肪酸メチルエステル類を示す。ピークを、脂肪酸メチルエステルの既知の標準と溶出時間を比較することによって同定した。従って、脂肪酸代謝に係るシアノバクテリア遺伝子は、変更された脂肪酸組成を備えたトランスジェニック植物を産生するために使用することができる。
実施例7
ルリヂサcDNAライブラリーの構築
膜結合ポリソームを、LarkinsとDavies(1975 Plant Phys.55:749-756)によってエンドウ(peas)用に確立されたプロトコールを用いて受粉から12日後(12DPP)にルリヂサの種子から単離した。RNAを、Mechlerによって記載されたように(1987 Methods in Enzymology 152:241-248,Academic Press)、ポリソームから抽出した。
ポリA+RNAを、Oligotex-dTビーズ(Qiagen)の使用により膜結合ポリソームRNAから単離した。対応するcDNAを、Stratagene’s ZAP cDNA合成キットを用いて作成した。cDNAライブラリーを、λZAPIIベクターキットを用いたλZAPIIベクター(Stratagene)に構築した。主要なライブラリーを、Gigapack II Goldパッケージングエクストラクト(Stratagene)にパッケージした。このライブラリーを用いて、発現された配列タグ(EST)を生成し、タグに対応する配列を用いてGenBankデータベースをスキャンした。
実施例8
ハイブリダイゼーションプロトコル
ルリヂサcDNAライブラリーをスクリーニングするハイブリダイゼーションプローブを、Ausubelらに記載されたようにして(1994 Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,N.Y.)ランダム・プライムド・DNA合成(random primed DNA synthesis)によって生成し、先に同定された豊富に発現された種子貯蔵タンパク質cDNAと一致した。取り込まれていないヌクレオチドをG−50スピンカラムで除去した(Boehringer Manheim)。ハイブリダイゼーションのために、プローブを5分間ウォーターバスで煮沸して編成させ、氷上で急速に冷却した。ハイブリダイゼーション用フィルターを、プレハイブリダイゼーション溶液(6X SSC[Maniatisら1984 Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory]、1X Denharts溶液、0.05%ピロリン酸ナトリウム、100μg/ml変性サケ精子DNA)中で2−4時間60℃でプレハイブリダイズした。変性プローブを、ハイブリダイゼーション溶液(6X SSC、1X Denharts溶液、0.05% ピロリン酸ナトリウム、100μg/ml変性サケ精子DNA)に添加し、夜通し攪拌しながら60℃でインキュベートした。フィルターを、4x、2xおよび1x SET洗浄で、60℃で15分間洗浄した。20X SETストック溶液は、3M NaCl、0.4M Tris塩基、20mM Na2EDTA−2H2Oである。4X SET洗浄は、4X SET、12.5mM PO4、pH6.8および0.2%SDSである。2X SET洗浄は、2X SET、12.5mM PO4、pH6.8および0.2%SDSである。1X SET洗浄は、1X SET、12.5mM PO4、pH6.8および0.2%SDSである。フィルターを空気乾燥させ、−80℃でスクリーンを増強しながら24時間、X線フィルムに露光した。
実施例9
ルリヂサ種子(12DPP)膜結合ポリソームライブラリーからのcDNAのランダムシークエンシング
ルリヂサcDNAライブラリーを低密度(150mmペトリ皿に500pfu)でプレートした。多数存在する種子貯蔵タンパク質cDNAを、先に同定された対応するcDNAを用いてスクリーニングすることによって“差し引いた”。ハイブリダイズしないプラークを、Stratagene’s削除プロトコルと試薬を用いて削除した。得られた細菌コロニーを用いて液体培地に接種し、手動またはABI自動シークエンサーで配列決定した。各cDNAを一度配列決定し、配列タグを200−300塩基対から生成した。全てのシークエンシングは、サイクルシークエンシングによって行った(Epicentre)。300以上のESTを生成した。各配列タグを、BLASTXコンピュータープログラムによってGenBankデータベースと比較し、△6-デサチュラーゼを含む多数の脂質代謝遺伝子を同定した。
GenBankデータベースを備えたBLASTXを用いたmbp−65と称されたcDNAクローンを用いたデータベースサーチは、シネコシスティス△6-デサチュラーゼと非常に適合した。しかしながら、このクローンは全長のcDNAではなかったことが調べられた。全長のcDNAは、ルリヂサ膜結合ポリソーマルライブラリーを選別するためにmbp−65を用いて単離された。単離されたcDNAの配列を調べ(図5A、SEQ ID NO:4)、読みとり枠のタンパク質配列(図5B、SEQ ID NO:5)を、Geneworks(IntelligGenetics)タンパク質整列プログラムを用いて、他の既知のデサチュラーゼと比較した(図2)。この整列は、cDNAがルリヂサ△6-デサチュラーゼ遺伝子であることを示した。
他の既知の植物デサチュラーゼに類似しているが、ルリヂサ△6-デサチュラーゼは、図6に示されたデンドログラムに示されるように区別される。さらに、デサチュラーゼのアミノ酸配列の特徴、特に金属結合に係ると予想される部分(メタルボックス1およびメタルボックス2)の比較は、ルリヂサ△6-デサチュラーゼと他の植物のデサチュラーゼとの間の差異を示す(表3)。
ルリヂサ△6-デサチュラーゼは、全ての配列のみならず(図6)脂質ボックス、メタルボックス1およびメタルボックス2アミノ酸モチーフにおいて、シアノバクテリア形態から区別される(表3)。表3が示すように、3つの全てのモチーフが配列において新規である。ルリヂサ△6-デサチュラーゼメタルボックス2のみが、シネコシスティス△6-デサチュラーゼメタルボックス2と何らかの関係を示した。
さらに、ルリヂサ△6-デサチュラーゼは、他のルリヂサデサチュラーゼ遺伝子である△12-デサチュラーゼからも区別される。P1−81は、EST解析によって同定される全長のcDNAであり、アラビドプシス(Arabidopsis)△12-デサチュラーゼ(Fad2)に高い類似性を示す。ルリヂサ△6および△12-デサチュラーゼにおける脂質ボックス、メタルボックス1およびメタルボックス2アミノ酸モチーフの比較(表3)は、これらの領域においてほとんど相同性が存在しないことを示した。図6のデンドログラムにおける二つの配列の配置は、これらの二つの遺伝子がどれくらい離れて関係しているのかを示す。
実施例10
トランジエント(transient)と発現のための222.1△6NOSの構築
ベクターpBI221(Jeffersonら1987 EMBO J.6:3901-3907)を、35SプロモーターとNOSターミネーターを完全に残したGUSコード領域を削除するBamHIとEcoICRI(Promega)を用いた切断により、リゲーション用に準備した。ルリヂサ△6-デサチュラーゼcDNAを、BamHIとXhoIを用いた切断によってBlue scriptプラスミド(Stratagene)から切除した。XhoI末端を、クレノウフラグメントの使用によって平滑にした。このフラグメントを、pBI221のBamHI/EcoICRI部位にクローン化し、221.△6NOSを得た(図7)。221.△6.NOSにおいて、図7に記載された制限マップの残りの部位(バックボーン)はpBI221である。
実施例11
安定な形質転換のための121.△6.NOSの構築
ベクターpBI121(Jeffersonら1987 EMBO J.6:3901-3907)を、35SプロモーターとNOSターミネーターを完全に残したGUSコード領域を削除するBamHIとEcoICRI(Promega)を用いた切断により、リゲーション用に準備した。ルリヂサ△6-デサチュラーゼcDNAを、BamHIとXhoIを用いた切断によってBlue scriptプラスミド(Stratagene)から切除した。XhoI末端を、クレノウフラグメントの使用によって平滑にした。このフラグメントを、pBI121のBamHI/EcoICRI部位にクローン化し、121.△6NOSを得た(図7)。121.△6.NOSにおいて、図7に記載された制限マップの残りの部位(バックボーン)はpBI121である。
実施例12
トランジエント(過渡的)発現
プロトプラストに係る全ての研究を無菌の覆い(フード)において行った。1mlのパックされたニンジン懸濁細胞を、1%セルラーゼ、0.1%ペクトリアーゼ(pectolyase)、および0.1%ドレイサラーゼ(dreisalase)を含む30mlの原形質分解溶液(25g/l KCl、3.5g/l CaCl2−H2O、10mM MES、pH5.6および0.2M マンニトール)中で、夜通し、暗室で、室温で切断した。放出されたプロトプラストを150μmメッシュを介して濾過し、遠心(100xg、5分)してペレット化し、原形質分解溶液中で2回洗浄した。二重チャンバー血球計数器(a double chambered hemocytometer)を用いてプロトプラストを計測した。このプロトプラストに、106プロトプラストおよび50−70μgのプラスミドDNA(221.△6.NOS)を用いて、NunbergとThomas(1993 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology、B.R.GlickとJ.E.Thompson,eds.pp.241-248)に記載されたように、PEG処置によってDNAを移入した。0.2Mマンニトールと3μmの2.4−Dを補足した5mlのMS培地中で、暗室で攪拌しながら、48時間、プロトプラストを培養した。
実施例13
タバコの安定な形質転換
121.△6.NOSプラスミド構築物を用いて、最初の形質転換体を100μg/mlのカナマイシン上で選別することを除いて、標準的な方法(Horshら,1985 Science 227:1229-1231;Bogueら,1990 Mol.Gen.Genet.221:49-57)に従って、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を介してタバコ(Nicotiana tabacum cv.xanthi)を形質転換した。
実施例14
脂肪酸メチルエステル類(FAME)の調製および分析
形質転換されたプロトプラストと形質転換されたタバコ植物からの組織を液体窒素で冷凍し、夜通し凍結乾燥させた。Dahmerら(1989 J.Amer.Oil Chem.Soc.66:543-548)に記載されているようにして、FAMEを調製した。場合によっては、溶媒を再度蒸発させ、FAMEを酢酸エチルに再懸濁し、脱イオン水で一度抽出して、あらゆる水溶性不純物を除去した。FAMEを、J & A Scientific DB-waxカラム(長さ30m、IDが0.25mm、0.25μmのフィルム)でガスクロマトグラフィー(GC)によって解析した。
トランジエントアッセイ(a transient assay)の例は、図8に示されており、3つの独立したトランスフェクションが一緒にプールされていることを示している。ルリヂサ△6-デサチュラーゼcDNAの付加は、△6-デサチュラーゼが生成可能な産物の一つであるγリノレン酸(GLA)の出現に対応している。
図9および10は、それぞれ対照および形質転換されたタバコ植物の葉および種子組織から誘導されたFAMEのGCプロファイルを示す。図9Aは、野生型タバコ(xanthi)の葉の組織のプロファイルを提供し;図9Bは35S CaMVプロモーターの転写制御下のルリヂサ△6-デサチュラーゼ(pBI121△6NOS)で形質転換されたタバコ植物の葉の組織のプロファイルを提供する。ピークは、18:2、18:3γ(GLA)、18:3αおよび18:4(オクタデカノン酸(octadecanonic acid))に対応する。図10Aは、野生型タバコの種子のGCプロファイルを示し、図10BはpBI 121△6NOSで形質転換されたタバコ植物の種子組織のプロファイルを示す。ピークは、18:2、18:3γ(GLA)、および18:3αに対応する。
対照とトランスジェニックタバコ種子におけるC18脂肪酸の相対分率は表4に示されている。
上記の結果は、ルリヂサ△6-デサチュラーゼを含むトランスジェニックタバコの葉および種子のトリアシルグリセリド類にGLAが取り込まれたことを示す。
【配列表】
(1)一般情報
(i)出願人:Rhone−Poulenc Agrochimie
(ii)発明の名称:△6-デサチュラーゼによるγリノレン酸の産生
(iii)配列の数:25
(iv)連絡の住所:
(A)住所:Scully,Scott,Murphy & Presser
(B)通り:400 Garden City Plaza
(C)都市名:Garden City
(D)州名:ニューヨーク
(E)国名:米国
(F)郵便番号:11530
(v)コンピューターが読み込むことのできる形態:
(A)媒体種:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン(PatentIn)リリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)本出願の情報:
(A)出願番号:
(B)出願日:1994年12月30日
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人の情報:
(A)名称:Presser,Leopold
(B)登録番号:19827
(C)参照/事件整理番号:8383ZYXW
(ix)通信情報:
(A)電話:(516)742−4343
(B)ファックス:(516)742−4366
(C)テレックス:230 901 SANS UR
(2)配列番号(SEQ ID NO):1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:3588塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:Genomic DNA
(ix)特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:2002..3081
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(i)配列の特徴:
(A)長さ:359アミノ酸
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(ii)配列の種類:タンパク質
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(i)配列の特徴:
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(i)配列の特徴:
(A)長さ:1685塩基対
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(i)配列の特徴:
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(ii)配列の種類:Genomic DNA
(xi)配列:SEQ ID NO:25:
Claims (26)
- SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を含むBorago officinalis由来の△6-デサチュラーゼをコードする単離された核酸。
- SEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
- 請求項1または2に記載の核酸を含むベクター。
- 単離された核酸の遺伝子産物の発現に作用しうるプロモーターおよび任意に終結シグナルに使用可能に連結された請求項1または2に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
- プロモーターが、△6-デサチュラーゼプロモーター、アナベナカルボキシラーゼプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター、グリシニンプロモーター、ナビンプロモーター、CaMVの35Sプロモーターもしくはヘリアンチニン組織特異的プロモーターである、請求項4記載の発現ベクター。
- プロモーターが、構成性もしくは組織特異的である、請求項4記載の発現ベクター。
- 終結シグナルが、シネコシスティス終結シグナル、ノパリンシンターゼ終結シグナル、もしくは種子終結シグナルである、請求項4記載の発現ベクター。
- 請求項3ないし7のいずれか一項記載のベクターを含む細胞。
- 動物細胞、細菌細胞、植物細胞もしくは真菌細胞である、請求項8記載の細胞。
- 請求項1または2に記載の単離された核酸で遺伝的に形質転換されたヒト以外の生物体。
- 請求項3ないし7のいずれか一項記載のベクターで遺伝的に形質転換されたヒト以外の生物体。
- 細菌、真菌、植物もしくは動物である、請求項10または11記載のヒト以外の生物体。
- 請求項9記載の植物細胞から再生され、かつ、請求項1または2記載の核酸で遺伝的に形質転換された、植物もしくは該植物の子孫。
- ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジンもしくはアブラナである、請求項13記載の植物。
- (a)請求項1または2に記載の単離された核酸で植物細胞を形質転換し、かつ、(b)前記植物細胞からγリノレン酸(GLA)含量が増大した植物を再生することを含む、γリノレン酸含量が増大した植物を産生する方法。
- (a)請求項3ないし7のいずれか一項に記載のベクターで植物細胞を形質転換し、かつ、(b)前記植物細胞からγリノレン酸(GLA)含量が増大した植物を再生することを含む、γリノレン酸含量が増大した植物を産生する方法。
- 植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジンもしくはアブラナである、請求項15または16記載の方法。
- 請求項1または2記載の単離された核酸でヒト以外の生物体を形質転換することを含む、γリノレン酸(GLA)が不十分もしくはGLAを欠失したヒト以外の生物体におけるGLAの産生を誘導する方法。
- 請求項3ないし7のいずれか一項に記載のベクターでヒト以外の生物体を形質転換することを含む、γリノレン酸(GLA)が不十分もしくはGLAを欠失したヒト以外の生物体におけるGLAの産生を誘導する方法。
- 請求項1または2記載の単離された核酸および△12-デサチュラーゼをコードする単離された核酸でヒト以外の生物体を形質転換することを含む、γリノレン酸(GLA)およびリノレン酸(LA)が不十分もしくはGLAおよびLAを欠失したヒト以外の生物体におけるGLAの産生を誘導する方法。
- △6-デサチュラーゼをコードする単離された核酸が、SEQ ID NO:4のヌクレオチド44〜1390を含む、請求項20記載の方法。
- 請求項1または2記載の単離された核酸でヒト以外の生物体を形質転換することを含む、γリノレン酸が不十分もしくはγリノレン酸を欠失したヒト以外の生物体におけるオクタデカテトラエン酸の産生を誘導する方法。
- 請求項3ないし7のいずれか一項に記載のベクターでヒト以外の生物体を形質転換することを含む、γリノレン酸が不十分もしくはγリノレン酸を欠失したヒト以外の生物体におけるオクタデカテトラエン酸の産生を誘導する方法。
- ヒト以外の生物体が、細菌、真菌、植物もしくは動物である、請求項22または23記載の方法。
- (a)請求項1または2に記載の単離された核酸で植物細胞を形質転換し、かつ、(b)前記形質転換された植物細胞から寒冷耐性が改良された植物を再生することを含む、寒冷耐性が改良された植物を産生する方法。
- 植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、ピーナツ、ニンジンもしくはアブラナである、請求項25記載の方法。
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