CN113308481A - 一种大豆dgat2基因外显子编辑位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用。本发明的大豆DGAT基因的编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的编辑位点能被sgRNA介导的Cas9核酸内切酶靶向识别并实现基因组DNA的双链断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。本发明提供的DGAT2基因外显子的编辑位点，为对该基因进行外显子编辑提供了有效的靶标，创制不同的等位基因突变体，为调节DGAT2的表达量以改变大豆的油脂成分提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆甘油二酯提供了可靠的手段和素材。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用。
背景技术
为了保护自身免受外源遗传物质(如噬菌体、质粒)的侵袭，细菌和古细菌进化出了一种RNA分子介导的获得性免疫系统，称为CRISPR(Mojica,et al.)。2013年，研究者利用化脓性链球菌的Cas9蛋白首次在哺乳动物细胞中实现了RNA引导下的精确靶向和基因组序列修饰，为CRISPR/Cas9作为一种广泛应用的基因组编辑工具奠定了基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。刘耀光教授及其团队研发了高效简便的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统(Ma et al.,2016)，在该系统中，可以通过设计不同目标序列的多个导向RNA(sgRNA)，将Cas9蛋白靶向到多个基因组位点上，同时进行多基因编辑，也可以在目的基因的启动子或UTR区域设计靶点，对目的基因的启动子或UTR进行编辑，调节目的基因的表达量。
由于油脂积累的过程是一个复杂多样的过程，油脂的生物合成过程中引起油脂积累变化的基因有很多，主要的转录因子有WRINKLED1、LEAFY COTY-LEDON1、LEAFY COTY-LEDON2、FUSCA 3、ABSCISSIC AC-ID INSENSITIVE 3、DOF4、DOF11等(Focks et al，1998；Pelletier et al，2017；Mendoza et al，2005；Wang et al，2007)，WRINKLED1能够调控糖酵解过程及脂肪酸的合成，突变体在大豆中表现出种皮皱缩，蔗糖、葡萄糖及油脂含量降低，LEAFY COTY-LEDON1是脂肪酸合成的关键调节基因，该基因的表达能够提高有关糖酵解放映和脂肪酸酸合成的相关基因的表达，LEAFY COTY-LEDON2的表达主要依靠WRINKLED1的表达，对糖酵解反应，油脂的生物合成及生物素合成进行调控。与油脂合成相关的酶基因主要有DGAT、FAD、KAS等，在油菜和玉米中有证明过DGAT的过表达能够提高玉米油菜中的油脂含量(Lardizaba et al，2008)，脂肪酸脱氢酶(FAD)能够催化油酸脱氢形成亚油酸，在棉花，油菜和大豆中都已证明抑制酶的作用能够提高油酸的含量(边妙等，2018)。现在主要发现的DGAT家族包括：DGAT1，DGAT2，WS/DGAT，可溶性的DGAT，在大豆中主要发现的是DGAT1和DGAT2两种基因家族。
目前发现的存在于植物中的DGAT基因主要是DGAT1、DGAT2和DGAT3，其中DGAT3仅在花生中发现，其他作物中目前为止未发现，DGAT2主要存在于动植物及酵母中，DGAT1存在于动植物中，通过研究证明，在抑制DGAT1的表达后，在烟草，油菜、棉花(张飞等，2018)的油脂积累都有所减少。在花生、烟草中过表达DGAT1能够提高油脂(郑玲，2018)，并且在续随子、大豆、牡丹中对油脂的调控有重要作用(任鹏国等，2019；袁秀云等，2019)。目前就DGAT基因有关的研究可以了解到，高表达DGAT1基因对于亚麻荠种子的油脂提升9％-14％(苑丽霞等，2015)，对大豆提高5.1％(张飞等，2018)。拟南芥由甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)诱导培养拟南芥哥伦比亚生态型发生点突变从而得到的as11突变体，ass11突变体中由于DGAT基因被抑制导致甘油三酯合成速率减慢，引起甘油二酯(DAG)的积累，使DAG含量明显提高，与野生型进行比较可以提高10％左右。
目前制备1,3-DAG的方法分为化学制备和酶制备两种方法，化学制备法利用特定的底物和催化剂能够制得纯度更高的1,3-DAG，酶制备1,3-DAG反应条件温和，选择性高且副反应少，环境污染少。
油脂在人类的生产生活中扮演着重要的角色，对植物油脂的需求也越来越大，这极大地促进了分子生物学的研究。甘油三酯(TAG)能够为人体提供能量贮存能量，但同时，减少TAG同样可以为糖尿病患者，高血脂患者提供很大的帮助，而植物TAG合成是一个极其复杂的过程，涉及大量的基因及其编码的酶类，改变其中任何一个关键酶，都有可能改变植物含油量或者油酸成分，所以弄清合成过程中的每一个环节具有重大意义。近年来，利用基因工程技术手段改造植物油脂生物合成与代谢途径中相关基因取得了较大的进展，TAG合成途径越来越清晰，与植物脂肪酸和TAG合成相关的基因多态性位点不断被发现，因此研究种子特异性表达DGAT基因对种子总含油量及各主要脂肪酸含量、蛋白含量的影响有助于我们更深层次的了解认识油脂代谢的网络系统，能够为以后增加油脂产量，提高油脂质量提供巨大的帮助。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用。本发明提供的大豆DGAT2(二酰甘油酰基转移酶)基因的编辑位点，可用于Cas9介导的打靶，对DGAT2基因的启动子进行编辑，创制不同的等位基因突变体。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种大豆DGAT2基因外显子的编辑位点作为编辑DGAT基因的靶标的用途，所述大豆DGAT基因的编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述大豆DGAT基因的编辑位点在大豆基因组的准确定位是09号染色体DGAT2基因的1号外显子，染色体的坐标为41998907-42006064，位于DGAT2基因53-76处。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点3’端含有AGG，所述编辑DGAT基因为利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，为GGAGGGGGAGAAGGTGTTCA。
作为本发明所述用途的优选实施方式，具体包括以下步骤：
(1)构建含有所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点的Cas9 sgRNA表达载体；
(2)将上述表达载体转化至发根农杆菌K599中，并侵染大豆子叶；
(3)除草剂加压筛选转基因系；
(4)PCR鉴定Cas9基因，测序验证靶点序列编辑情况。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述表达载体为以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架构建插入有所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点序列的Cas9sgRNA表达载体。
本发明以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架构建插入有DGAT2基因编辑靶位点的Cas9sgRNA表达载体YC2，将其转化至发根农杆菌K599中，侵染大豆子叶节。表达载体中含有除草剂抗性基因，可以使用除草剂筛选转基因系，随后对含有除草剂抗性的转基因系进行Cas9基因鉴定，然后对含有Cas9基因的转基因系进行靶点编辑效果检测。
本发明的有益效果：
利用本发明提供的编辑位点，可以在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得DGAT2不同的等位基因突变体。促使二酰甘油酰基转移酶失活，抑制甘油三酯合成从而得到大豆油脂成分改变的突变体。使得到的大豆油脂中DAG成分升高。
当DAG作为一种食品添加剂的主要成分时，能够提高食品保质期，延长保存时间，在现如今肥胖成为世界的趋势时，低热量食品受到人们的追捧，DAG在人体中不易吸收，难以储存，可以在不影响食欲的同时降低食品热量，DAG可以替代普通油脂制造低热量食品，DAG的生理功能包括控制人用餐后的血脂快速升高，能够提高人体分泌瘦素，在肠道中，DAG影响肠道微生物并引起其他器官功能性变化来防止脂肪的吸收，从而抑制体重增加，预防形成动脉血栓。
附图说明
图1：编辑位点在大豆基因组上的位置示意图；DGAT2基因启动子编辑位点T1是一段长23bp的已知DNA序列，序列为：GGAGGGGGAGAAGGTGTTCAAGG(SEQ ID NO：1)，该位点在大豆基因组的准确定位是09号染色体DGAT2基因1号外显子上，染色体的坐标为45178492-45178514。
图2：插入有编辑位点T1的Cas9 sgRNA表达载体示意图；其中Cas9 sgRNA表达载体是以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架，Cas9基因，AtU3d启动子，靶点T1和sgRNA(SEQ ID NO：2)的一个表达载体；标有LB、RB表明为双元载体，LB全称是left border，RB全称是rightborder。
图3：敲除载体构建的电泳图；其中，M：2kb DNA ladder，A：sgRNA表达盒扩增的第一轮PCR产物，B：sgRNA表达盒扩增的第二轮PCR产物，C：大肠杆菌DH10b的菌落PCR产物电泳图。
图4：转基因毛状根检测靶点的编辑效果图；其中，M：2kb ladder DNAmarker；A：农杆菌K599菌落PCR产物的电泳图，B：农杆菌感染大豆子叶，培养15天后长出的毛状根，C：毛根DNA扩增Cas9产物的电泳图，D：靶点检测引物扩增转基因毛状根的产物，E：靶点的编辑结果。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
除非特别指出或是单独定义，本发明所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。
实施例1插入有Dt1基因启动子编辑靶位点T1的Cas9 sgRNA表达载体CLY2的构建
(1)主要试剂和来源
大肠杆菌菌株DH5α、发根农杆菌菌株K599，均购自全式金公司。sgRNA载体、pLYCRISPR/Cas9载体均由华南农业大学刘耀光教授实验室提供。BsaⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶、Master Taq mix均购自TaKaRa公司；PCR产物回收试剂盒购自全式金公司；质粒提取试剂盒购自全式金公司；胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
靶点接头引物：
T1-F：5’-gtcaGGAGGGGGAGAAGGTGTTCA-3’(SEQ ID NO：3)
T1-R：5’-aaacTGAACACCTTCTCCCCCTCC-3’(SEQ ID NO：4)
第一轮PCR的引物为：
U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO：5)
gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO：6)
第二轮PCR的引物为：
B1-F：5’-TTCAGAGGTCTCTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO：7)
BL-R：5’-AGCGTGGGTCTCGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO：8)
载体测序引物：
SP3-F：5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACCG-3’(SEQ ID NO：9)
SP1-R：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’(SEQ ID NO：10)
(2)操作步骤
第一步，靶点接头，引物退火：各取正反向引物(T1-F、T1-R)10ul(10uM)加入80ulH2O中，90℃30s，转至室温。
第二步，双链接头与gRNA表达盒酶切连接。
gRNA载体连接(边切边连)：分别加入T4 DNA ligase 0.1ul，T4 DNA ligasebuffer 1ul，gDNA(10ug/ul)1ul，上一步已退火接头引物(linker)1ul，Bsa10.5ul，H2O6.4ul，进行PCR，5个循环37℃5min，20℃5min。
第三步，第一轮PCR，扩增gRNA表达盒。
分别加入Master Taq mixQ 5ul，U-F 0.14ul，gRNA-R 0.14ul，H2O 3.3ul上一步PCR产物1.4ul，进行PCR，94℃3min，10个循环(94℃10s，55℃20s，72℃10s)，25个循环(94℃10s，60℃20s，72℃10s)。取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪查看是否有500bp的条带(图3A)。
第四步，第二轮PCR扩增
分别加入Master Taq mixQ 10ul，B1-F 0.15ul，BL-R 0.15ul，H2O 8.7ul，上一步PCR产物稀释十倍后取1ul，进行PCR，94℃3min，35个循环(94℃10s，60℃20s，72℃30s)，72℃5min，16℃保温。取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪查看是否有500bp的条带(图3B)。50ul GSB 12000g/min离心1min，倒掉废液，加入650ul WB，12000g/min离心1min，倒掉废液离心，12000g/min离心2min，离心柱放入干净的离心管，开盖静置5min加入30ul 65℃H2O离心12000g/min离心2min，得到回收产物后测取浓度。
第五步：sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体连接
15μL反应体系：Cut Smart Buffer 1.5μL，CRISPR/Cas9质粒0.5μL，BsaI1μL，上一步纯化产物(浓度为60～70ng/μL)4μL，T4 DNA ligase 0.2μL，10×NEB T4 DNA ligasebuffer 1.5μL，10×NEB Cut Smart Buffer 1.5μL，加无菌水补足到15μL。PCR程序设置为：37℃5min，10℃5min，20℃5min，37℃5min，15个循环，将连接得到的载体命名为YC2。
第五步：连接产物的转化
E.coli DH5α感受态细胞放在冰上解冻5分钟后加入10μL上一步连接反应液，轻轻弹动混合均匀。冰浴30min后，放入42℃水浴锅中热激1min后立刻冰浴2min。在超净工作台中加500μL不含抗生素的LB培养液，37℃220rpm振荡培育1小时，5000rpm离心1min后，倒掉部分上清液，重悬菌液吸出，均匀涂布于含有壮观霉素的LB固体培养基上，放入37℃培养箱过夜。挑取细菌单克隆，使用SP3-F，SP1-R进行PCR检测(图3C)，阳性克隆送天一辉远测序。
实施例2大豆转基因毛根靶点编辑效果检测
(1)主要试剂和来源
本实验提取毛根DNA来自栽培大豆W82(Glycine max Wm82.a2.v1)。发根农杆菌菌株K599，购自全式金公司；质粒提取试剂盒购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪公司；萌发培养基：霍格兰营养液0，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8；毛根诱导培养基：霍格兰营养液(购买厂家：coolaber)，2％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
Cas9的引物为：
SP3-F：5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACCG-3’(SEQ ID NO：9)
SP1-R：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’(SEQ ID NO：10)
靶点检测的引物为：
JC-F：5’-ATTCGGCAACCAAACCATGC-3’(SEQ ID NO：11)
JC-R：5’-GCATGGTTTGGTTGCCGAAT-3’(SEQ ID NO：12)
(2)操作步骤
第一步：K599农杆菌转化。
测序正确的阳性克隆进行质粒提取。
1)取5μL需转化的质粒加入50μL感受态农杆菌中。
2)在冰上放置30分钟。
3)在液氮中处理5分钟。
4)37℃处理5分钟。
5)再次在冰上放置5分钟。
6)加入500μL无抗性LB液体培养基，在28℃中恢复3～5小时。
7)恢复后的菌液12000rpm离心30秒，去除部分上清，剩余的200μL菌液吹散沉淀的菌，涂布在有壮观霉素的LB平板上，28℃培养箱中放置2天。
8)进行菌落PCR，筛选出有目的质粒的菌落。10μL反应体系：5μL MasterTaq mix，引物(SP3-F、SP1-R)各0.2μL，3.6μL无菌水，1μL菌液。PCR程序设置为：95℃2min；35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃90s；72℃2min。进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统查看是否出现2000bp左右的目的条带(图4A)。
9)将拥有目的质粒的菌落进行挑菌、摇菌和保菌。
第二步：大豆的立体毛根转化。
把灭菌后的大豆W82放置在萌发培养基上，在恒定25℃的持续光照下放置5～7天。直到子叶竖起，与下胚约成直角状态。发根用的农杆菌K599(含有目的质粒)，28℃培养至OD＝0.6左右，取1mL菌液，5000rpm，室温离心5分钟，移除上清液，用200μL的10mM MgCl2重悬沉淀。用解剖刀在子叶的背面抠一个小三角状的洞。将处理好的子叶整齐的摆放到根诱导培养基上。在子叶的洞里边加入20μL侵染液。25℃光照培养12天左右，就会有根毛长出。
第三步：靶点编辑效果检测。
根据DNA提取试剂盒上的步骤，每3个转基因毛状根混合成一个样进行DNA提取。以提取的毛状根DNA为模板，用SP3-F、SP1-R引物和靶位点检测引物JC-F、JC-R分别扩增靶点所在区域的片段，PCR反应体系：10μL Master Taqmix，正向引物和反向引物各0.4μL，2μLDNA模板，ddH2O补足到20μL。PCR程序为：94℃2min；35个循环：95℃30s，59℃30s，72℃1min；最后72℃5min。Cas9 PCR有带的毛根对应的靶点检测引物扩增的产物送到天一辉远公司测序，利用BioEdit软件查看测序数据，由靶位点的测序结果查看靶点的编辑效果。
结果表明：如图4所示，图4A表明构建靶点成功，图4B为将构建好的载体YC2转入大豆发根验证，图4C提取毛根DNA并用引物SP3-F、SP1-R进行PCR后，图4E使用靶点检测引物(JC-F、JC-R)进行PCR后送后引物进行测序，图4D检测结果可以看出靶点后的碱基被编辑产生双峰。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州大学
<120> 一种大豆DGAT2基因外显子编辑位点及其应用
<130> 2021.04.26
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 1
ggagggggag aaggtgttca agg 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggagggggag aaggtgttca 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtcaggaggg ggagaaggtg ttca 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aaactgaaca ccttctcccc ctcc 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cggaggaaaa ttccatccac 20
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gtcgtgctcc acatgttgac cg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
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cccgacatag atgcaataac ttc 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
attcggcaac caaaccatgc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gcatggtttg gttgccgaat 20
Claims (6)
1.一种大豆DGAT2基因外显子的编辑位点作为编辑DGAT基因的靶标的用途，其特征在于，所述大豆DGAT基因的编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大豆DGAT基因的编辑位点在大豆基因组的准确定位是09号染色体DGAT2基因的1号外显子，染色体的坐标为41998907-42006064。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点3’端含有AGG，所述编辑DGAT基因为利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过人工设计的sgRNA来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)构建含有所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点的Cas9 sgRNA表达载体；
(2)将上述表达载体转化至发根农杆菌K599中，并侵染大豆子叶；
(3)除草剂加压筛选转基因系；
(4)PCR鉴定Cas9基因，测序验证靶点序列编辑情况。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述表达载体为以pLYCRISPR/Cas9载体为骨架构建插入有所述大豆DGAT2基因外显子的编辑位点序列的Cas9 sgRNA表达载体。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN113862282A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-31 | 广州大学 | 大豆pcl同源基因编辑位点及其应用 |
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-
2021
- 2021-05-10 CN CN202110506769.0A patent/CN113308481A/zh active Pending
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