CN102220355A

CN102220355A - 花生二酰甘油酰基转移酶dgat2及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102220355A
Application number: CN 201110123531
Authority: CN
Inventors: 毕玉平; 彭振英; 王龙龙; 纪鸿飞; 李兰; 陈高; 单雷
Original assignee: High Tech Research Center Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: High Tech Research Center Of Shandong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明涉及花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2及其编码基因与应用，属于分子生物学和生物技术技术领域。本发明首次从花生中克隆到了DGAT2基因的全长序列，命名为AhDGAT2(Arachis hypogaea DGAT)。并在不同花生品种中获得8个DGAT2的同源基因，分别命名为AhDGAT2a，AhDGAT2b，AhDGAT2c，AhDGATT2d，AhDGAT2e，AhDGAT2f，AhDGAT2g和AhDGAT2h。上述基因在其编码蛋白的N-端有个别氨基酸的差异，而其C-端完全相同。该基因可用于油料作物转基因育种，提高油料作物的油份含量。

Description

花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2及其编码基因与应用，属于分子生物学和生物技术技术领域。

背景技术

花生是我国重要的油料和经济作物之一，种植面积约502.5万公顷，总产量居世界首位。花生仁含脂50％左右，在几种主要食用油料作物中，其脂肪含量仅次于芝麻，而高于油菜籽、大豆和棉籽。植物油脂(三酰甘油)是油料植物中最多和最重要的有机化合物之一，不仅在植物生长、发育和繁衍过程中扮演着重要的角色，而且作为一种可再生的生物能源产品，具有非常广泛的应用。植物油是食用脂类的主要来源，约占全世界脂类消耗的75％，而且植物油所含的很多单不饱和脂肪酸例如油酸，比饱和脂肪酸具有更高的营养价值。花生种子脂肪酸组成主要包括棕榈酸、油酸和亚油酸，油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的含量高达80％以上，其中油酸含量最高，达42％-68％，是大豆油、葵花子油和玉米油等其它植物油的2-3倍。因此，对花生脂肪酸合成进行系统而全面的研究具有重要的理论意义和实用价值。

随着分子生物学和基因工程技术的发展，现代遗传学和分子育种学已逐渐取代传统育种，广泛应用于作物产量和品质性状的改良。人们希望通过基因工程等生物技术手段改良作物，缩短育种周期，加速新种质或品种的繁育。近年来，国内外学者对脂肪酸生物合成途径进行了大量研究，克隆出许多脂肪酸合成途径及其关键酶基因，初步阐明了脂肪酸合成代谢规律，并在此基础上利用基因工程方法调控植物种子脂肪酸代谢途径、改变脂肪酸组成，从而提高并改善了植物种子脂肪酸含量与品质。

甘油三酯(TAG)是植物种子的主要储存脂类，DGAT是TAG合成途径的限速酶，所以DGAT对种子发育以及油脂积累具有重要作用。通常认为，DGAT在植物种子发育过程中影响种子油分含量、脂肪酸组成以及种子重量等。DGAT是一个较大的基因家族。到目前为止，在植物中共发现3种类型的DGAT基因，分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3。其中DGAT1家族成员最多，只存在于动物和植物中。目前已经在拟南芥、油菜、蓖麻、烟草、大豆、百脉根等植物克隆到了DGAT1基因。DGAT2基因家族的成员在动物，植物和酵母中都存在，并且与DGAT1基因家族没有明显的相关性。目前对植物DGAT2的研究较少，仅在拟南芥、油菜、蓖麻等少数植物中克隆出来。作为DGAT基因家族的新成员，DGAT3基因目前只在花生中发现，其编码蛋白序列与前两种DGAT家族成员同源性很低，但是具有类似的DGAT蛋白功能基序。

如公开号为CN 1712527A(申请号为：200410049633.8)公开了大豆二酰甘油酰基转移酶及其编码基因与应用，该发明所提供的大豆二酰甘油酰基转移酶，是序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少95％的同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质，或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

在植物中过量表达DGAT基因能够显著提高种子的平均重量和含油量，而抑制其表达则能够使TAG含量及油分含量同时降低，并且使脂肪酸组成改变。在野生型拟南芥中过量表达AtDGAT1基因，可以使DGAT1的转录水平和活性明显提高(10％～70％)，油脂积累增加，种子平均重量增加。在大豆中过量表达Umbelopsis ramanniana的DGAT2A基因可以使大豆成熟种子含油量增加。

在花生克隆到了DGAT3基因，该基因与DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10％，但是其编码蛋白具有类似的DGAT蛋白功能基序，并且与TAG合成密切相关。另外，该基因定位于细胞质中，而DGAT1和DGAT2是定位于内质网上的。然而到目前为止，在花生中还没有任何关于DGAT1与DGAT2的信息。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，首次从花生中克隆得到了TAG合成途径限速酶DGAT2基因的全编码区cDNA，并且命名为AhDGAT2(Arachis hypogaea DGAT2)基因。对不同花生品种的DGAT2基因进行多次测序，结果表明，在花生的不同种属间总共存在8种类型的同源基因，分别命名为AhDGAT2a～h，这8条同源基因编码的蛋白氨基酸序列在其C-端高度保守，仅在N-端有个别氨基酸的差异(图1)。该基因通过构建植物过量表达载体，利用农杆菌介导的侵染法转化野生烟草，可使转基因烟草叶片与种子脂肪酸含量明显增加，脂肪酸组成改变。该基因可用于油料作物转基因育种，提高其含油量并改善其脂肪酸成分。

编码花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2的基因AhDGAT2，该基因分子选自：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

(b)编码如SEQ ID NO.2所示多肽的核酸分子，或者，编码与SEQ ID NO.2所示多肽同源性为99.55％及以上相同功能的多肽的核酸分子。

所述(b)中，同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID NO.2，第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、第26位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。

所述(b)中，同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2，该转移酶为SEQ ID NO.2所示的多肽，或者，同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽。

所述同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID NO.2，第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、第26位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。

所述同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

本发明AhDGAT2基因cDNA全长为1208bp，其中开放阅读框部分为1005bp，因此其编码翻译的蛋白质具有334个氨基酸，将此序列在Genbank数据库中进行检索，表明与已发表的卫矛DGAT2蛋白以及拟南芥DGAT2蛋白相比，氨基酸相似性分别为66.17％与60.78％，并且具有类似的DGAT蛋白结构域，如图2所示，黑色表示相同的氨基酸残基。表明本发明已经克隆得到了花生中编码DGAT2蛋白的基因。Genbank登记号及其物种来源如下：EaDAGT2(卫矛，ADF57328.1)，AtDGAT2(拟南芥，AAK32844.1)。

一种含有上述基因AhDGAT2的表达载体。

含有上述基因AhDGAT2或上述表达载体的重组细胞。

上述花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2基因AhDGAT2在制备转基因花生方面的应用。

本发明首次从花生中克隆到了DGAT2基因的全长序列，命名为AhDGAT2(Arachishypogaea DGAT)。并在不同花生品种中获得8个DGAT2的同源基因，分别命名为AhDGAT2a(SEQID NO.1)，AhDGAT2b(SEQ ID NO.10)，AhDGAT2c(SEQ ID NO.11)，AhDGAT2d(SEQ ID NO.12)，AhDGAT2e(SEQ ID NO.13)，AhDGAT2f(SEQ ID NO.14)，AhDGAT2g(SEQ ID NO.15)和AhDGAT2h(SEQ ID NO.16)。上述基因在其编码蛋白的N-端有个别氨基酸的差异，而其C-端完全相同。

有益效果

本发明首次从花生中克隆得到编码DGAT2蛋白的基因AhDGAT2。该基因过量表达能够提高转基因烟草叶片与种子的脂肪酸含量，改变其脂肪酸组成。花生作为重要的经济作物，该基因在花生及其它油料作物中表达，能够提高其脂肪酸含量并改善脂肪酸组成，具有非常重要的经济效益和社会效益。

附图说明

图18条AhDGAT2的同源基因编码蛋白的氨基酸序列比对结果。

图2卫矛和拟南芥DGAT2蛋白的氨基酸序列与花生中由AhDGAT2a，b基因推导的氨基酸序列的比对结果。

图3(a)AhDGAT2a，b转基因烟草种子总脂肪酸含量的柱状图。

图3(b)AhDGAT2a，b转基因烟草种子不饱和脂肪酸C18:1n7含量的柱状图。

图3(c)AhDGAT2a，b转基因烟草种子不饱和脂肪酸C18:2n6含量的柱状图。

图3(d)AhDGAT2a，b转基因烟草种子不饱和脂肪酸C20:1含量的柱状图。

图3(e)AhDGAT2a，b转基因烟草种子不饱和脂肪酸C20:2含量的柱状图。

图3(f)AhDGAT2a，b转基因烟草种子不饱和脂肪酸C18:3n3含量的柱状图。

图4(a)AhDGAT2a，b转基因烟草叶片中总脂肪酸含量的柱状图。

图4(b)AhDGAT2a，b转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸C18:1n7含量的柱状图。

图4(c)AhDGAT2a，b转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸C18:1n9含量的柱状图。

图4(d)AhDGAT2a，b转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸C18:2n6含量的柱状图。

图4(e)AhDGAT2a，b转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸C18:3n3含量的柱状图。

图4(f)AhDGAT2a，b转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸C22:5n3含量的柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明做进一步描述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2a的克隆

(1)RNA提取：采用CTAB法提取花生品种鲁花14(Arachis hypogaea L.)未成熟种子总RNA，具体步骤如下：

a)称取0.2g花生材料或-70℃保存的样品，在液氮中充分研磨成粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻；

b)将研磨好的组织迅速转移至预热(65℃)的含有600μl CTAB提取液的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀；

c)65℃水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡5次；

d)冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min；

e)将上清转移到另一新的EP管中，加入2μl的DNaseI，37℃水浴15min；

f)再加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min；

g)将上清转移到另一新的EP管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4℃过夜沉淀；

h)4℃，12,000rpm离心20min，弃上清；

i)分别用70％乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50μl DEPC-H₂O溶解沉淀；

j)用浓度为1％普通琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为1μl，100V，25min，在紫外凝胶成像系统中观察其完整性；

(2)cDNA第一条链的合成：

按照Fermentas公司的AMV反转录试剂盒的操作程序进行反转录，得到完整的cDNA第一条链，将得到的cDNA置于-20℃保存；

(3)PCR反应：

根据PCR反应要求设计花生AhDGAT2基因的特异性引物如下：

正向引物：5’TCAACAGCCACCGAATCCA 3’(SEQ ID NO.17)

反向引物：5’TAAAACAAGGAAGGGTGCCA 3’(SEQ ID NO.18)

PCR扩增体系如下：

10×反应缓冲液：2ul；脱氧核苷酸混合物(dNTP，每种脱氧核苷各2.5mM)：2ul；

正向引物(10uM)：1ul；反向引物(10uM)：1ul；

模板cDNA：1ul；LA-Taq酶：0.2ul；

双蒸水：12.8ul

PCR扩增程序如下：

94℃5分钟；然后进入下列循环：94℃30秒，60℃30秒，72℃1分20秒，共计30个循环；最后72℃延伸10分钟。

(4)基因克隆：取2ul PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步按Promega公司产品pGEM-Teasy和pGEM-Teasy Vector system说明书进行。然后把连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在表面涂有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)的含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中过夜培养。

(5)质粒DNA的提取：用全式金公司的EasyPure Plasmid MiniPrep kit质粒提取试剂盒提取质粒DNA，具体步骤参照产品说明书。

(6)序列测定：对上述质粒DNA进行测序。

(7)5’和3’末端序列的克隆：按照Clontech公司的SMART RACE cDNA AmplificationKit说明书进行。将扩增的序列连接到pGEM-T easy载体上进行测序，方法同(4)、(5)、(6)。

(8)全长序列拼接：利用DNAMAN软件，将测序得到的5’和3’末端序列与中间片段进行拼接，得到完整的包含5’和3’末端的全长AhDGAT2a基因序列，即SEQ ID NO.1所示全长为1208bp的cDNA序列。

(9)同源序列检索：用BLAST软件将克隆到的AhDGAT2a基因序列与Genbank数据库中的序列进行比对。

花生AhDGAT2a基因植物表达载体的构建

(1)根据克隆得到的AhDGAT2a基因的核苷酸序列，设计引物。上游引物引入KpnI(GGTACC)位点，下游引物引入BamH I(GGATCC)位点，核苷酸序列如下：

正向引物：5’CGGGGTACCTCAACAGCCACCGAATCCA 3’

反向引物：5’CGCGGATCCTAAAACAAGGAAGGGTGCCA 3’

以花生未成熟种子总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。

PCR扩增反应体系如下：

10×反应缓冲液：2ul；脱氧核苷酸混合物(dNTP，各2.5mM)：2ul；

正向引物(10uM)：1ul；反向引物(10uM)：1ul；

模板cDNA：1ul；LA-Taq酶：0.2ul；

双蒸水：12.8ul；

PCR扩增反应程序如下：

获得包含完整读码框的长度为1173bp的cDNA序列，该序列5’端带KpnI(GGTACC)酶切位点，3’端带有BamHI(GGATCC)酶切位点。

(2)取2ul PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-Teasy和pGEM-Teasy Vector system说明书进行。然后把连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在表面上涂有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)的含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中过夜培养。然后用全式金公司的EasyPure Plasmid MiniPrep kit质粒提取试剂盒提取质粒DNA，进行序列测定。

(3)用BamHI和KpnI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T easy载体上切下，同时用BamHI和KpnI双酶切载体pROK II，回收目的片段和载体片段，连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取部分单克隆进行酶切验证，并经过测序验证，得到植物过量表达载体pROK II-35S-AhDGAT2a。

(4)将构建好的植物过量表达载体pROK II-35S-AhDGAT2a转化农杆菌，所用菌株为LBA4404(由山东农业大学作物生物学国家重点实验室提供)。

烟草遗传转化

(1)烟草种子(SR1，由山东省农业科学院高新技术研究中心提供)用75％乙醇消毒1min，无菌水冲洗3～5次；将次氯酸钠和水以1∶4的比例稀释，对种子消毒10min，无菌水冲洗5次，均匀铺洒于1/2MS0基本培养基上，使其发芽；

(2)待种子发芽(约两周)后，将其转移到单独的瓶中(1/2MS培养基)，生长4～5周，待植株长出足够的叶子以供转化；

(3)挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养约24h，至对数生长期，即可用；

(4)将菌液6000rpm离心6min，收集菌体，MS液体培养基重悬；

(5)取烟草叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，将剪好的烟草叶片放于重悬的菌液中1.5min，不断振荡，取出后用无菌滤纸吸干水分，将其整齐紧密地排列在MS分化培养基上，28℃，暗培养两天；

(6)暗培养两天后，将叶片松散地排列在MS选择培养基上，28℃，光照时间16h/d，每隔两周更换一次培养基；

(7)待其长出丛生芽时，将其切下放入伸长培养基上，使其伸长；

(8)丛生芽长至3～5cm时，转移到生根培养基，促其生根；

(9)待根系发育好后，将苗洗根移入盛有无菌土的花盆中，盖地膜3天；

(10)光下培养，长至一定程度移到大盆中，温室常规管理。

上述MS分化培养基组分如下：MS培养基+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+250mg/L头孢噻肟钠。

上述MS选择培养基组分如下：MS培养基+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+250mg/L头孢噻肟钠+50mg/L卡那霉素。

上述伸长培养基组分如下：MS培养基+250mg/L头孢噻肟钠+100mg/L卡那霉素。

上述生根培养基组分如下：1/2MS培养基+250mg/L头孢噻肟钠+150mg/L卡那霉素。

转基因烟草T0代植株叶片与种子脂肪酸含量测定

(1)取转基因烟草和野生烟草同一生长期的叶片，洗净，擦干。将叶片装入50mL的离心管中，放入冷冻干燥仪中进行真空干燥，充分干燥后取出密闭存放。

(2)叶片与种子脂肪酸组成及其含量测定。样品由中国农业大学，农业部饲料工业中心用气相色谱法进行脂肪酸含量测定。

结果如图3所示：与对照相比，多个转基因烟草株系的种子脂肪酸总含量均有不同程度的提高，而且AhDGAT2b转基因株系脂肪酸的提高量要比AhDGAT2a转基因株系高。不饱和脂肪酸如C18:1n7、C18:2n6、C18:3n3、C20:1与C20:2增加较为显著。转基因烟草叶片中脂肪酸含量与组成的变化与种子中略有差异(图4)，其中C20:1与C20:2变化不明显，而C18:1n9和C22:5n3含量提高较为明显。

实施例2

如实施例1中所述，不同之处在于，花生AhDGAT2a基因植物表达载体的构建过程中，构建好的植物过量表达载体命名为pROK II-35S-AhDGAT2b。

实施例3

如实施例1中所述，不同之处在于，花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2c的克隆过程中，所用花生品种为飞龙乡(Arachis hypogaea L.)。

实施例4

如实施例1中所述，不同之处在于，花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2d的克隆过程中，所用花生品种为飞龙乡(Arachis hypogaea L.)。

实施例5

如实施例1中所述，不同之处在于，花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2e的克隆过程中，所用花生品种为野生型花生Arachis glabrata L.。

实施例6

如实施例1中所述，不同之处在于，花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2f的克隆过程中，所用花生品种为野生型花生Arachis glabrata L.。

实施例7

如实施例1中所述，不同之处在于，花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2g的克隆过程中，所用花生品种为野生型花生Arachis glabrata L.。

实施例8

如实施例1中所述，不同之处在于，花生中甘油三酯合成途径限速酶基因AhDGAT2h的克隆过程中，所用花生品种为野生型花生Arachis.chacoensis L.。

Claims

1.编码花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2的基因AhDGAT2，该基因分子选自：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

2.如权利要求1所述的基因AhDGAT2，其特征在于，所述(b)中，同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID NO.2，第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、第26位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。

3.如权利要求2所述的基因AhDGAT2，其特征在于，所述(b)中，同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

4.花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2，该转移酶为SEQ ID NO.2所示的多肽，或者，同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽。

5.如权利要求4所述的转移酶DGAT2，其特征在于，所述同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽SEQ ID NO.2，第3位氨基酸突变为缬氨酸、第6位氨基酸突变为天冬氨酸、第9位氨基酸突变为缬氨酸、第26位氨基酸突变为脯氨酸、第37位氨基酸突变为甲硫氨酸和/或第118位氨基酸突变为脯氨酸。

6.如权利5所述的转移酶DGAT2，其特征在于，所述同源性为99.55％及以上的相同功能的多肽是指多肽序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

7.一种含有权利要求1所述基因AhDGAT2的表达载体。

8.含有权利要求1所述基因AhDGAT2或权利要求7所述表达载体的重组细胞。

9.权利要求1-3任意之一所述花生二酰甘油酰基转移酶DGAT2基因AhDGAT2在制备转基因花生方面的应用。