ES2536796T3 - Desaturasa y método de producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos - Google Patents

Desaturasa y método de producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos Download PDF

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Abstract

Polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada de entre el grupo que consiste de: (a) una secuencia de ácidos nucleicos tal como se muestra en SEC ID nº 1, (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEC ID nº 2, (c) secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con un ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones de hibridación restrictivas, en la que las condiciones de hibridación restrictivas son hibridaciones en 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de una o más etapas de lavado en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a una temperatura de entre 50ºC y 65ºC y en la que la secuencia de ácidos nucleicos codifica para un polipéptido con actividad de Δ5 desaturasa y especificidad de acil-CoA.

Description

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2001; documentos nº WO 01/29058 y nº WO 99/32619, o Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001, y sirven para inhibir la expresión génica mediante degradación del ARNm. Los enfoques quimeroplásticos o genoplásticos dirigen la modificación in vivo (por ejemplo la introducción de mutaciones puntuales) introduciéndola en los genes en sus loci endógenos. Se dan a conocer métodos correspondientes en las patentes US nº 5.565.350, nº 5.756.325, nº 5.871.984, nº 5.731.181, nº 5.795.972, nº 6.573.046, nº 6.211.351, nº 6.586.184, nº 6.271.360 y nº 6.479.292.
En este contexto, resulta especialmente preferente utilizar la ∆6-desaturasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 5 (d6Des(Pir)), la ∆6-elongasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 7 (d6EIo(Pp)), la ∆5-desaturasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 1 (dSDes(Eh)), la ∆12desaturasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 9 (d12Des(Ps)), la ∆15-desaturasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 13 (d15Des(Perf)), la ω3-desaturasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 11 (o3Des(Pi)), la ∆5-elongasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 15 (d5Elo(Ot)) y la ∆4-desaturasa codificada por la secuencia polinucleótida de SEC ID nº 17 (d4Des(Tc)) con la desaturasa según la invención con el fin de sintetizar ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Los polinucleótidos anteriormente indicados se describen en el documento nº WO 2006/100241. Alternativamente, también resulta posible utilizar una ∆9-elongasa y una ∆8-desaturasa en lugar de la ∆6-desaturasa y ∆6-elongasa anteriormente indicadas, tal como se indica en el documento nº WO 2004/057001. Según el ácido graso que deba prepararse, resulta posible coexpresar, en las células huésped u organismos transgénicos indicados posteriormente en la presente memoria, o utilizar en los métodos según la invención, una diversidad de combinaciones de los polinucleótidos según la invención con las desaturasas o elongasas anteriormente indicadas. Las combinaciones especialmente preferentes para la producción de ácido araquidónico en la Tabla 1, para el ácido eicosapentaenoico en la Tabla 2 y para el ácido docosahexaenoico en la Tabla 3, se detallan posteriormente en la presente memoria. Por ejemplo, resulta posible utilizar la ∆5-desaturasa según la invención, sola o en una combinación adecuada (por ejemplo una ∆12-desaturasa y una ∆15-desaturasa), conjuntamente con d6Des(Pir), d6Elo(Pp), d5Des(Tc), ∆3Des(Pi) para la producción de EPA. Igualmente, la ∆5-desaturasa según la invención, sola o en una combinación adecuada, puede utilizarse conjuntamente con d6Des(Pir), d6Elo(Pp), d5Des(Tc), ω3Des(Pi), d5Elo(Ot), d4Des(Tc) para la producción de ácido docosahexaenoico.
Preferentemente, son los ácidos grasos en fosfolípidos o ésteres de ácido graso-CoA los que se desnaturalizan, ventajosamente en los ésteres de ácido graso-CoA. De esta manera, resulta posible una producción económica y sencilla de estos ácidos grasos poliinsaturados, concretamente en sistemas eucarióticos. Los ácidos grasos insaturados producidos mediante los polinucleótidos según la invención seguidamente pueden formularse como composiciones de aceites, lípidos y ácidos grasos y pueden utilizarse de una manera adecuada.
La presente invención se refiere además a un vector que comprende el polinucleótido según la invención.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos que es capaz de transportar otra molécula de ácidos nucleicos, tal como los polinucleótidos según la invención, a la que se encuentran unidos. Un tipo de vector es un "plásmido", un bucle de ADN circular de doble cadena en el que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Un tipo adicional de vector es un vector vírico, siendo posible ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que han sido introducidos (por ejemplo vectores bacterianos con origen de replicación bacteriano). Otros vectores se integran ventajosamente en el genoma de una célula huésped al introducirlos en la célula huésped y de esta manera se replican conjuntamente con el genoma del huésped. Además, determinados vectores pueden controlar la expresión de genes con los que se encuentran en ligamiento operable. Estos vectores se denominan en el presente contexto, "vectores de expresión". Habitualmente, los vectores de expresión que resultan adecuados para las técnicas de recombinación de ADN adoptan la forma de plásmidos. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, ya que el plásmido es la forma de vector que se utiliza más frecuentemente. Sin embargo, la invención también pretende comprender otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos, que ejercen funciones similares. Además, el término "vector" también pretende comprender otros vectores que resultarán familiares para el experto en la materia, tales como fagos, virus tales como SV40, CMV, TMV, trasposones, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular y cromosomas artificiales. Finalmente, el término también comprende constructos para la recombinación dirigida, es decir homóloga, o para la inserción heteróloga de polinucleótidos.
Los vectores pueden introducirse en las células procarióticas y eucarióticas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Los términos "transformación" y "transfección", conjugación y transducción, tal como se utilizan en el presente contexto, pretenden comprender una multiplicidad de métodos conocidos de la técnica anterior para la introducción de ácidos nucleicos foráneos (por ejemplo ADN) en una célula huésped, incluyendo la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección, la competencia natural, la transferencia mediada químicamente, la electroporación o el bombardeo con partículas. Pueden encontrarse métodos adecuados para la transformación o transfección de células huésped, incluyendo células vegetales, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2a ed., Cold Spring Harbor
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inserción, o la secuencia de los ácidos nucleicos insertados en el casete de expresión no resultan de importancia crítica, es decir, puede insertarse una secuencia de ácidos nucleicos en la primera o en la última posición en el casete sin que su expresión se vea sustancialmente influida por ello. Ventajosamente, pueden utilizarse en el casete de expresión diferentes promotores, tales como, por ejemplo, los promotores USP, LegB4 o DC3, y diferentes terminadores. Sin embargo, también resulta posible utilizar solo un tipo de promotor en el casete. Sin embargo, ello podría conducir a sucesos de recombinación no deseados.
Los vectores de expresión recombinante utilizados pueden diseñarse para la expresión en células procarióticas o eucarióticas. Ello resulta ventajosa ya que con frecuencia se llevan a cabo etapas intermedias de construcción del vector en los microorganismos en aras de la simplicidad. Por ejemplo, los genes de la ∆12-desaturasa, la ∆15desaturasa, las ∆12- y ∆15-desaturasas, la ω3-desaturasa, la ∆6-desaturasa, la ω6-elongasa, la ω9-elongasa, la ∆8-desaturasa, la ∆5-desaturasa, la ω5-elongasa y/o la ∆4-desaturasa pueden expresarse en células bacterianas, células de insecto (utilizando vectores de expresión baculovíricos), células de levaduras y otras células fúngicas (ver Romanos M.A. et al., "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488, 1992; van den Hondel
C.A.M.J.J. et al., "Heterologous gene expression in filamentous fungi", en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Eds., páginas 396-428: Academic Press: San Diego, 1991; y en van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J., "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy J.F. et al., Eds., páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), 1991; algas (Falciatore et al., Marine Biotechnology. 3:239-251, 1999), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella y Stylonychia, en particular de la especie Stylonychia lemnae, utilizando vectores en un método de transformación tal como se describe en el documento nº WO 98/01572 y, preferentemente, en células de plantas multicelulares (ver Schmidt, R. and Willmitzer, L., "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586, 1988; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, páginas 71-119, 1993; F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Eds.: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225, 1991 (y referencias citadas en los mismos)). Se comentan en mayor detalle las células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras de promotor de T7 y polimerasa de T7.
En la mayoría de casos, la expresión de proteínas en procariotas implica la utilización de vectores que compreden promotores constitutivos o inducibles que controlan la expresión de proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de expresión de fusión típicos son, entre otros, pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), en los que la glutatión-S-transferasa (GST), la proteína E de unión a maltosa y la proteína A, respectivamente, se encuentran fusionadas con la proteína diana recombinante. Son ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión inducibles adecuados, entre otros, pTrc (Amann et al., Gene 69:301-315, 1988) y pET 11 d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 1990, 60-89). La expresión del gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac por parte de la ARN polimerasa del huésped. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11 d se basa en la transcripción de un promotor de fusión T7-g10-lac que está mediado por una ARN polimerasa vírica (T7 gn1), que se ecoexpresa. La polimerasa vírica es proporcionada por las cepas de huésped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profageno λ residente que aloja un gen gn1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. El experto en la materia conocerá otros vectores que resultan adecuados para los organismos procarióticos; estos vectores son, por ejemplo en E. coli, pLG338, pACYC184, la serie pBR, tal como pBR322; la serie pUC, tal como pUC18 o pUC19; la serie M113mp, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 o pBdCl; en Streptomyces, pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361; en Bacillus, pUB110, pC194 o pBD214; en Corynebacterium, pSA77 o pAJ667
En una realización adicional, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae comprenden pYeDesaturasec1 (Baldari et al., Embo J. 6:229-234, 1987), pMFa (Kurjan y Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113-123, 1987) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y métodos para la construcción de vectores que resultan adecuados para la utilización en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, comprenden los que se describen en detalle en: van den Hondel C.A.M.J.J. y Punt, P.J., "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of fungi, 1991; J.F. Peberdy et al., ed., páginas 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, o en: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., páginas 396-428: Academic Press: San Diego]. Son vectores levaduras adecuados adicionales, por ejemplo, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23.
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Los vectores anteriormente indicados son sólo un pequeña muestar de los posibles vectores que resultan adecuados. El experto en la materia conocerá plásmidos adicionales, que se describen en, por ejemplo: Cloning Vectors (eds. Pouwels P.H. et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Para sistemas de expresión adicionales adecuados para células procarióticas y eucarióticas, ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Tal como se ha indicado anteriormente, el vector de expresión puede, además de los polinucleótidos según la invención, comprender también genes adicionales que deben introducirse en los organismos. Resulta posible y preferente introducir en los organismos huésped, y expresar en los mismos, genes reguladores tales como los genes para inductores, represores o enzimas que, como resultado de su actividad enzimática, participan en la regulación de uno o más genes de una ruta biosintética. Estos genes puede ser de origen heterólogo u homólogo. Los genes o polinucleótidos heterólogos se derivan de un organismo de un origen que difiere del origen del organismo diana en el que deben introducirse los genes o polinucleótidos. En el caso de genes o polinucleótidos homólogos, el organismo diana y el organismo de origen son idénticos. Por lo tanto, el vector preferentemente comprende por lo menos un polinucleótido adicional que codifica para un enzima adicional que participa en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos. El enzima se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste de: acil-CoA deshidrogenasa(s), acil-ACP [= proteína portadora de acilo] desaturasa(s), acil-ACP tioesterasa(s), ácido graso aciltransferasa(s), acilCoA:lysophospholipid aciltransferasa(s), ácido graso sintasa(s), ácido graso hidroxilasa(s), acetil-coenzima A carboxilasa(s), acil-coenzima A oxidasa(s), ácido graso desaturasa(s), ácido graso acetilenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol lipasa(s), aleno óxido sintasa(s), hidroperóxido liasa(s), ácido graso elongasa(s), ∆4-desaturasa(s), ∆5desaturasa(s), ∆6-desaturasa(s), ∆8-desaturasa(s), ∆9-desaturasa(s), ∆12-desaturasa(s), ∆15-desaturasa(s), ∆12- y ∆15-desaturasa(s), ω3-desaturasa, ∆5-elongasa(s), ∆6-elongasa(s) y ∆9-elongasa(s). Las combinaciones génicas especialmente preferentes se listan en las Tablas 5 y 6 en los ejemplos, posteriormente.
La invención se refiere además a una célula huésped que comprende el polinucleótido según la invención o el vector según la invención.
En principio, las células huésped para los fines de la presente invención pueden ser todas células eucarióticas o procarióticas. Pueden ser células primarias de animales, plantas o microorganismos multicelulares, por ejemplo de aquellos que se mencionan en otro sitio de la descripción. Adicionalmente, el término comprende además líneas celulares que pueden obtenerse de dichos organismos.
Sin embargo, las células huésped para los fines de la invención también pueden ser microorganismos unicelulares, por ejemplo bacterias u hongos. Son microorganismos especialmente preferentes los hongos seleccionados de entre el grupo de las familias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae o Tuberculariaceae. Algunos microorganismos preferentes adicionales se seleccionan de entre el grupo: Choanephoraceae, tales como los géneros Blakeslea, Choanephora, por ejemplo los géneros y las especies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae, tales como el género Mortierella, por ejemplo los géneros y las especies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, la familia Mucorales, tales como los géneros y las especies Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer, Fusarium graminearium, Pythiaceae, tales como los géneros Phytium, Phytophthora, por ejemplo los géneros y las especies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae, tales como los géneros Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, por ejemplo los géneros y las especies Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces
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