ES2231767T3

ES2231767T3 - Produccion de acido gamma linolenico por una delta-6 desaturasa.

Info

Publication number: ES2231767T3
Application number: ES92922205T
Authority: ES
Inventors: Terry Thomas; Avutu S. Reddy; Michael Nuccio; Georges Freyssinet
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer CropScience SA
Priority date: 1991-10-10
Filing date: 1992-10-13
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2012-10-13
Also published as: HUT69781A; NZ244685A; BG61791B1; CN1174236A; DE69233459T2; BG98695A; JPH07503605A; US5689050A; EP0666918A1; CZ81794A3; CN1072722A; BR9206613A; JP3537434B2; CZ285471B6; CN1053469C; AU667848B2; CA2120629C; EP0666918B1; EP0666918A4; DE69233459D1

Abstract

EL ACIDO LINOLEICO SE CONVIERTE EN ACIDO GAMMA-LINOLEICO MEDIANTE LA ENZIMA IERE A UN ACIDO NUCLEICO AISLADO QUE CONTIENE EL GEN DE ATURASA. CONCRETANDO AUN MAS, EL ACIDO NUCLEICO AISLADO COMPRENDE EL PROMOTOR, LA REGION DE CODIFICACION Y LAS REGIONES DE TERMINACION DEL GEN DE PRESENTAN ESTRUCTURAS RECOMBINANTES QUE CONTIENEN LA REGION DE CODIFICACION DE UENCIAS REGULADORAS HETEROLOGAS. LOS ACIDOS NUCLEICOS Y ESTRUCTURAS RECOMBINANTES DE LA PRESENTE INVENCION SON UTILES PARA LA PRODUCCION DE GLA EN ORGANISMOS TRANSGENICOS.

Description

Producción de ácido gamma linolénico por una \Delta-6 desaturasa.

El ácido linoleico (18:2) (LA) es transformado en ácido gamma-linolénico (18:3) (GLA) por la enzima \Delta6-desaturasa. Cuando esta enzima, o el ácido nucleico que la codifica, se transfiere a células productoras de LA, se produce GLA. La presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende el gen de la \Delta6-desaturasa. Más específicamente, el ácido nucleico comprende el promotor, la región codificante y las regiones de terminación del gen de la \Delta6-desaturasa. La presente invención se dirige además a construcciones recombinantes que comprenden la región codificante de la \Delta6-desaturasa en combinación funcional con secuencias reguladoras heterólogas. Los ácidos nucleicos y las construcciones recombinantes de la presente invención son útiles para la producción de GLA en organismos transgénicos.

Los ácidos grasos insaturados tales como los ácidos linoleico (C_{18}\Delta^{9,12}) y \alpha-linolénico (C_{18}\Delta^{9,12,15}) son constituyentes esenciales de la dieta que no pueden ser sintetizados por los vertebrados, puesto que las células de los vertebrados pueden introducir dobles enlaces en la posición \Delta^{9} de los ácidos grasos pero no pueden introducir dobles enlaces adicionales entre el doble enlace en \Delta^{9} y el extremo metilo de la cadena del ácido graso. Como son precursores de otros productos, los ácidos linoleico y \alpha-linolénico son ácidos grasos esenciales, y se obtienen normalmente de fuentes vegetales. El ácido linoleico puede ser convertido por los mamíferos en ácido \gamma-linolénico (GLA, C_{18}\Delta^{6,9,12}), que a su vez puede ser convertido en ácido araquidónico (20:4), un ácido graso de vital importancia puesto que es un precursor esencial de la mayor parte de las prostaglandinas.

El aporte de ácido linoleico de la dieta, en virtud de su conversión, que da como resultado GLA y ácido araquidónico, satisface la necesidad dietética de GLA y ácido araquidónico. Sin embargo, se ha demostrado una relación entre el consumo de grasas saturadas y riesgos para la salud tales como la hipercolesterolemia, la arteriosclerosis y otros trastornos químicos que se correlacionan con la predisposición a padecer enfermedades coronarias, mientras que el consumo de grasas saturadas se ha asociado con una disminución de la concentración de colesterol en sangre y una reducción del riesgo de arteriosclerosis. Los beneficios terapéuticos del GLA de la dieta pueden ser el resultado de que el GLA es un precursor del ácido araquidónico y por consiguiente contribuye así a la síntesis de prostaglandinas. De acuerdo con ello, el consumo de GLA, más insaturado, en lugar de ácido linoleico, tiene beneficios potenciales para la salud. Sin embargo, el GLA no está presente en virtualmente ninguna planta que se cultive con fines comerciales.

El ácido linoleico es convertido en GLA por la enzima \Delta6-desaturasa. La \Delta6-desaturasa, una enzima de aproximadamente 359 aminoácidos, tiene un dominio unido a la membrana y un sitio activo para la desaturación de ácidos grasos. Cuando se transfiere esta enzima a células que producen de forma endógena ácido linoleico pero no GLA, se produce GLA. La presente invención, al proporcionar el gen que codifica la \Delta6-desaturasa, permite la producción de organismos transgénicos que contienen \Delta6-desaturasa funcional y que producen GLA. Además de permitir la producción de grandes cantidades de GLA, la presente invención proporciona nuevas fuentes dietéticas de GLA.

La presente invención se dirige a un gen aislado de la \Delta6-desaturasa. Específicamente, el gen aislado comprende el promotor de la \Delta6-desaturasa, la región codificante, y la región de terminación.

La presente invención se dirige además a vectores de expresión que comprenden el promotor de la \Delta6-desaturasa, la región codificante y la región de terminación.

La presente invención se dirige también a vectores de expresión que comprenden la región codificante de la \Delta6-desaturasa en combinación funcional con regiones reguladoras heterólogas, es decir, elementos no derivados del gen de la \Delta6-desaturasa.

También son proporcionados por la presente invención células y organismos que comprenden los vectores de la presente invención, y la progenie de tales organismos.

La presente invención proporciona además una \Delta6-desaturasa bacteriana aislada e incluso se dirige además a un ácido nucleico aislado que codifica la \Delta6-desaturasa bacteriana.

La presente invención proporciona además un método para producir plantas con contenido incrementado de ácido gamma-linolénico (GLA) que comprende transformar una célula de una planta con un ácido nucleico aislado de la presente invención y regenerar una planta con contenido incrementado de GLA a partir de dicha célula de planta.

También es proporcionado por la presente invención un método para producir plantas con tolerancia al frío.

La Fig. 1 representa los perfiles de hidropatía de las secuencias deducidas de aminoácidos de la \Delta6-desaturasa (Panel A) y la \Delta12-desaturasa (Panel B) de Synechocystis. Las regiones que hipotéticamente se extienden por la membrana se indican mediante barras rellenas. El índice hidrofóbico se calculó para un tamaño de ventana de 19 residuos de aminoácidos [Kyte, et al. (1982) J. Molec. Biol. 157].

La Fig. 2 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido de Anabaena de tipo silvestre (Panel A) y transgénica (Panel B).

La Fig. 3 es un diagrama de mapas de los cósmidos cSy75, cSy13 y cSy7 con las regiones solapantes y los subclones. Los orígenes de los subclones de cSy75, cSy75-3.5 y cSy7 se indican mediante líneas diagonales discontinuas. Los sitios de restricción que han sido inactivados aparecen entre paréntesis.

La Fig. 4 proporciona perfiles de cromatografía de gas-líquido de tabaco de tipo silvestre (Panel A) y transgénico (Panel B).

La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una \Delta6-desaturasa. Para identificar un ácido nucleico que codifique una \Delta6-desaturasa, se aísla DNA de un organismo que produce GLA. Dicho organismo puede ser, por ejemplo, una célula animal, ciertos hongos (por ejemplo. Mortierella), ciertas bacterias (por ejemplo Synechocystis) o ciertas plantas (borraja, Oenothera, grosellas). El aislamiento del DNA genómico se puede lograr mediante diversos métodos bien conocidos por un experto común en la técnica, como fue mostrado con ejemplos por Sambrook et al. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York. El DNA aislado se fragmenta mediante métodos físicos o digestión enzimática y se clona en un vector apropiado, por ejemplo, un vector derivado de un bacteriófago o tipo cósmido, mediante uno cualquiera de entre diversos métodos bien conocidos que se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook et al. (1989). Los vectores de expresión que contienen el DNA de la presente invención están específicamente contemplados en la presente memoria. El DNA que codifica la \Delta6-desaturasa se puede identificar mediante un análisis de ganancia de función . El vector que contiene el DNA fragmentado se transfiere, por ejemplo, mediante infección, transconjugación, transfección, a un organismo hospedador que produce ácido linoleico pero no GLA. Tal como se utiliza en la presente memoria, "transformación" se refiere generalmente a la incorporación de DNA exógeno por parte de una célula hospedadora. Los métodos para introducir DNA recombinante en un organismo hospedador son conocidos por un experto común en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989). La producción de GLA por estos organismos (es decir, ganancia de función) se ensaya, por ejemplo, por cromatografía de gases u otros métodos conocidos por el técnico con una experiencia normal. Los organismos que se inducen a producir GLA, es decir, que han ganado esa función por la introducción del vector, se identifican como organismos que expresan DNA que codifica la \Delta6-desaturasa, y dicho DNA se recupera de los organismos. El DNA recuperado se puede volver a fragmentar, clonar en vectores de expresión, y evaluar funcionalmente mediante los procedimientos anteriores para definir con más detalle el DNA que codifica la \Delta6-desaturasa.

Como un ejemplo de la presente invención, se aísla DNA al azar de la cianobacteria Synechocystis, Colección de Cultivos Pasteur (PCC: Pasteur Culture Colection) 6803, Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC: American Type Culture Collection) 27184, se clona en un vector tipo cósmido, y se introduce por transconjugación en la cepa PCC 7120, deficiente en GLA, de la cianobacteria Anabaena, ATCC 27893. La producción de GLA a partir de ácido linoleico en Anabaena se controla mediante cromatografía de gases y se aísla el correspondiente fragmento de DNA.

El DNA aislado se secuencia por métodos bien conocidos para alguien con una experiencia normal en la técnica tal como se encuentra, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989).

De acuerdo con la presente invención, se ha aislado un DNA que comprende un gen de una \Delta6-desaturasa. Más concretamente, se ha aislado de la cianobacteria Synechocystis un DNA de 3,588 kilobases (kb) que comprende un gen de una \Delta6-desaturasa. Se determinó la secuencia de nucleótidos del DNA de 3,588 kb y se muestra en SEQ ID NO:1. Están presentes marcos abiertos de lectura que definen potenciales regiones codificantes desde el nucleótido 317 al 1507 y desde el nucleótido 2002 al 3081. Para definir los nucleótidos responsables de codificar la \Delta6-desaturasa, el fragmento de 3,588 kb que confiere la actividad \Delta6-desaturasa se escinde en dos subfragmentos, cada uno de los cuales contiene sólo un marco abierto de lectura. El fragmento ORF1 contiene los nucleótidos 1 a 1704, mientras que el fragmento ORF2 contiene los nucleótidos 1705 a 3588. Cada fragmento se subclona tanto en orientación directa como inversa en un vector de expresión que se puede transferir por conjugación (AM542, Wolk et al. [1984] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561) que contiene un promotor de una carboxilasa cianobacteriana. Las construcciones resultantes (es decir ORF1(D), ORF1(I), ORF2(D) y ORF2(I)) se transfieren por conjugación a Anabaena PCC 7120 tipo silvestre mediante métodos estándar (véase, por ejemplo, Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561). Las células conjugadas de Anabaena se identifican como colonias verdes Neo^{R} sobre un fondo marrón de células moribundas no conjugadas después de dos semanas de crecimiento en medio selectivo (medio mineral estándar BG11N + que contiene 30 \mug/ml de neomicina según Rippka et al., (1979) J. Gen Microbiol. 111, 1). Se seleccionan las colonias verdes y se hacen crecer en medio líquido selectivo (BG11N + con 15 \mug/ml de neomicina). Los lípidos se extraen por métodos estándar (por ejemplo, Dahmer et al., (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) de los transconjugantes resultantes que contienen las construcciones ORF1 y ORF2 en las orientaciones directa e inversa.

Para comparar, también se extraen lípidos de cultivos de Anabaena y Synechocystis de tipo silvestre. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se analizan por cromatografía de gas-líquido (GLC), por ejemplo con un cromatógrafo de gas-líquido Tracor-560 equipado con un detector de ionización por llama de hidrógeno y una columna capilar. Los resultados del análisis por GLC se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Presencia de ácidos grasos C18 en cianobacterias de tipo silvestre y transgénicas

1

Como se determinó por el análisis de GLC, la Anabaena deficiente en GLA gana la función de producción de GLA cuando se introduce por transconjugación la construcción que contiene ORF2 en orientación directa. Los transconjugantes que contienen las construcciones con ORF2 en orientación inversa respecto al promotor de la carboxilasa, u ORF1 en cualquier orientación, no muestran ninguna producción de GLA. Este análisis demuestra que el único marco abierto de lectura (ORF2) dentro del fragmento de 1884 pb codifica la \Delta6-desaturasa. El fragmento de 1884 pb se muestra como SEQ ID NO:3. Esto está apoyado por la similitud global de los perfiles de hidropatía entre la \Delta6-desaturasa y la \Delta12-desaturasa [Wada et al. (1990) Nature 347] como se muestra en la Fig. 1 como (A) y (B), respectivamente.

Se pueden identificar ácidos nucleicos aislados que codifican \Delta6-desaturasas de otros organismos productores de GLA mediante el análisis de ganancia de función anteriormente descrito, o mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos utilizando el ácido nucleico aislado que codifica la \Delta6-desaturasa de Anabaena como sonda de hibridación. Los métodos de clonación tanto de DNA genómico como de cDNA son conocidos por el experto en la técnica y están contemplados en la presente invención. La sonda de hibridación puede comprender la secuencia completa de DNA descrita como SEQ. ID NO:1, o un fragmento de restricción u otro fragmento suyo de DNA, incluyendo una sonda oligonucleotídica. Los métodos para clonar genes homólogos por hibridación cruzada son conocidos para el experto común en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook (1989) y Beltz et al. (1983) Methods in Enzymology 100, 266.

Los organismos transgénicos que ganan la función de producción de GLA mediante la introducción de DNA que codifica una \Delta-desaturasa también ganan la función de producción de ácido octadecatetraenoico (18:4\Delta^{6,9,12,15}). El ácido octadecatetraenoico está presente normalmente en aceites de pescado y en algunas especies de plantas de la familia Boraginaceae (Craig et al. [1964] J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 209-211; Gross et al. [1976] Can. J. Plant Sci. 56, 659-664). En los organismos transgénicos de la presente invención, el ácido octadecatetraenoico aparece como resultado de la desaturación adicional del ácido \alpha-linolénico por la \Delta6-desaturasa o la desaturación de GLA por la \Delta15-desaturasa.

Los 359 aminoácidos codificados por ORF2, es decir, el marco abierto de lectura que codifica la \Delta6-desaturasa, se muestran como la SEQ. ID NO:2. La presente invención contempla además otras secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos de SEQ ID NO:2. Está dentro del ámbito de conocimiento del experto común en la técnica identificar tales secuencias que resultan, por ejemplo, de la degeneración del código genético. Además, un experto común en la técnica puede determinar, mediante el análisis de ganancia de función descrito anteriormente en la presente memoria, subfragmentos más pequeños del fragmento de 1884 pb que contengan el ORF2 que codifica la \Delta6-desaturasa.

La presente invención contempla cualquiera de tales fragmentos polipeptídicos de la \Delta6-desaturasa y los ácidos nucleicos correspondientes a ella que retienen la actividad de convertir LA en GLA.

En otro aspecto de la presente invención, un vector que contiene el fragmento de 1884 pb o un fragmento más pequeño que contiene el promotor, la secuencia codificante y la región de terminación del gen de la \Delta6-desaturasa se transfiere a un organismo, por ejemplo, cianobacterias, en las que el promotor de la \Delta6-desaturasa y las regiones de terminación sean funcionales. De acuerdo con ello, mediante esta invención se proporcionan organismos productores de \Delta6-desaturasa recombinante. Otro aspecto más de esta invención proporciona \Delta6-desaturasa aislada, que se puede purificar a partir de los organismos recombinantes mediante métodos estándar de purificación de proteínas. (Por ejemplo, véase Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Nueva York).

También se proporcionan mediante la presente invención vectores que contienen DNA que codifica una \Delta6-desaturasa. Será evidente para un experto común en la técnica que se pueden construir vectores apropiados para dirigir la expresión de la secuencia codificante de la \Delta6-desaturasa en una variedad de organismos. Se prefieren especialmente los vectores de expresión que se pueden replicar. Los vectores de expresión que se pueden replicar, tal como se describen en la presente memoria, son moléculas de DNA o RNA obtenidas mediante técnicas de ingeniería genética para conseguir la expresión controlada de un gen deseado, es decir, el gen de la \Delta6-desaturasa. Preferiblemente los vectores son plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus. De acuerdo con la presente invención, también se contemplan vectores lanzadera, por ejemplo como los descritos por Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1561-1565 y Bustos et al. (1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533. Sambrook et al. (1989), Goeddel, ed. (1990) Methods in Enzymology 185 Academic Press, y Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., proporcionan revisiones detalladas de vectores en los que se puede insertar y expresar un ácido nucleico que codifica la presente \Delta6-desaturasa. Tales vectores contienen también secuencias de ácidos nucleicos que pueden llevar a cabo la expresión de ácidos nucleicos que codifiquen la \Delta6-desaturasa. Los elementos de secuencia capaces de llevar a cabo la expresión de un producto de un gen incluyen promotores, elementos potenciadores, secuencias activadoras situadas aguas arriba, señales de terminación de la transcripción y sitios de poliadenilación. Se contemplan promotores tanto constitutivos como específicos de tejido. Para la transformación de células de plantas, son de particular interés el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y promotores que están regulados durante la maduración de la semilla de la planta. La totalidad de tales promotores y elementos reguladores de la transcripción, de forma aislada o en combinación, se contemplan para su uso en los presentes vectores de expresión que se pueden replicar y que son conocidos para un experto común en la técnica. El promotor 35S del CaMV está descrito, por ejemplo, por Restrepo et al. (1990) Plant Cell 2, 987. También están contempladas secuencias reguladoras modificadas por ingeniería genética y mutadas.

El experto común en la técnica puede determinar vectores y elementos reguladores adecuados para la expresión en una célula hospedadora concreta. Por ejemplo, un vector que comprende el promotor del gen que codifica la carboxilasa de Anabaena unido de forma operativa a la región codificante de la \Delta6-desaturasa y además unido de forma operativa a una señal de terminación de Synechocystis es apropiado para la expresión de la \Delta6-desaturasa en cianobacterias. "Unido de forma operativa" en este contexto quiere decir que el promotor y las secuencias de terminación funcionan de forma efectiva para regular la transcripción. Como ejemplo adicional, un vector apropiado para la expresión de la \Delta6-desaturasa en plantas transgénicas puede comprender una secuencia promotora específica de semillas derivada de la heliantinina, napina, o glicina unida de forma operativa a la región codificante de la \Delta6-desaturasa y además unida de forma operativa a una señal de terminación de semillas o a la señal de terminación de la nopalina sintasa.

En particular, los elementos reguladores de la heliantinina descritos en la solicitud del mismo solicitante en tramitación con la presente en EE.UU. con número de serie 682.354, presentada el 8 de abril de 1991 e incorporada a la presente memoria como referencia, se contemplan como elementos promotores para dirigir la expresión de la \Delta6-desaturasa de la presente invención.

Las modificaciones de las secuencias nucleotídicas o de los elementos reguladores descritos en la presente memoria que mantengan las funciones contempladas en la presente memoria están dentro del alcance de esta invención. Tales modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente las sustituciones que reflejen la degeneración del código genético.

Las técnicas estándar para la construcción de tales vectores híbridos son bien conocidas para los expertos comunes en la técnica y se pueden encontrar en referencias tales como Sambrook et al. (1989), o en cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio sobre la tecnología del DNA recombinante que están ampliamente disponibles. Se dispone de toda una variedad de estrategias para ligar fragmentos de DNA, la elección de las cuales depende de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de DNA. De acuerdo con la presente invención se contempla además incluir en los vectores híbridos otros elementos de secuencias nucleotídicas que faciliten la clonación, la expresión o el procesamiento, por ejemplo secuencias que codifican péptidos señales, una secuencia que codifica la secuencia KDEL, que se requiere para la retención de proteínas en el retículo endoplásmico o secuencias que codifican péptidos de tránsito que dirijan la \Delta6-desaturasa al cloroplasto. Tales secuencias son conocidas para un experto común en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado está descrito, por ejemplo, por Van den Broeck et al. (1985) Nature 313, 358. Están descritas secuencias señalizadoras procarióticas y eucarióticas, por ejemplo, por Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona organismos distintos de las cianobacterias que contienen el DNA que codifica la \Delta6-desaturasa de la presente invención. Los organismos transgénicos contemplados de acuerdo con la presente invención incluyen bacterias, cianobacterias, hongos, y plantas y animales. El DNA aislado de la presente invención se puede introducir en el hospedador mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, infección, transfección, transformación o transconjugación. Las técnicas para transferir el DNA de la presente invención a tales organismos son ampliamente conocidas y se proporcionan en referencias tales como Sambrook et al. (1989).

Se conoce una amplia variedad de métodos de transformación de plantas. El gen de la \Delta6-desaturasa se puede introducir en plantas mediante un procedimiento de transformación - regeneración de discos foliares como ha sido descrito por Horsch et al. (1985) Science 227, 1229. También se pueden utilizar otros métodos de transformación, tales como el cultivo de protoplastos (Horsch et al. (1984) Science 223, 496; DeBlock et al. (1984) EMBO J. 2, 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033) y están dentro del alcance de esta invención. En una realización preferida las plantas se transforman con vectores derivados de Agrobacterium. Sin embargo, están disponibles otros métodos para insertar el gen de la \Delta6-desaturasa de la presente invención en células de plantas. Tales métodos alternativos incluyen los abordajes biolísticos (Klein et al. (1987) Nature 327, 70), electroporación, absorción del DNA inducida químicamente, y uso de virus o polen como vectores.

Cuando sea necesario para el método de transformación, el gen de la \Delta6-desaturasa de la presente invención se puede insertar en un vector de transformación de plantas, por ejemplo, el vector binario descrito por Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Pueden obtenerse derivados de vectores de transformación de plantas modificando el sistema natural de transferencia de genes de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plásmidos Ti (inductores de tumores) grandes que contienen un segmento grande, conocido como T-DNA, que se transfiere a las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia del T-DNA. La región del T-DNA está flanqueada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, se han eliminado los genes inductores de tumores y se utilizan las funciones de la región vir para transferir DNA exógeno flanqueado por las secuencias flanqueantes del T-DNA. La región T contiene también un marcador que permite la selección por resistencia a antibióticos, y un sitio múltiple de clonación para insertar secuencias para ser transferidas. Tales cepas modificadas por ingeniería genética se conocen como cepas "desarmadas" de A. tumefaciens, y permiten la transformación eficiente de secuencias flanqueadas por la región T en los genomas de los núcleos de las plantas.

Los discos foliares esterilizados en su superficie se inoculan con A. tumefaciens que contiene el DNA exógeno "desarmado", se cultivan durante dos días y se transfieren luego a un medio que contiene un antibiótico. Los brotes transformados se seleccionan después de que echen raíces en medio que contiene el antibiótico apropiado, se transfieren al suelo y se regeneran.

Otro aspecto de la presente invención proporciona plantas transgénicas o una progenie de estas plantas que contienen el DNA aislado de la invención. Se contemplan tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las células de las plantas se transforman con el DNA aislado que codifica la \Delta6-desaturasa mediante cualquiera de los métodos de transformación de plantas anteriormente descritos. La célula de planta transformada, habitualmente un cultivo de callo o disco foliar, se regenera para dar una planta transgénica completa por métodos bien conocidos para un experto común en la técnica (por ejemplo, Horsch et al. (1985) Science 227, 1129). En una realización preferida, la planta transgénica es girasol, colza, maíz, tabaco, cacahuete o soja. Puesto que la progenie de las plantas transformadas hereda el DNA que codifica la \Delta6-desaturasa, se utilizan semillas o esquejes de plantas transformadas para mantener la línea de plantas transgénicas.

La presente invención proporciona además un método para proporcionar plantas transgénicas con un contenido incrementado de GLA. Este método incluye introducir DNA que codifica una \Delta6-desaturasa en células de plantas que carecen de o tienen bajos niveles de GLA pero que contienen LA, y regenerar plantas con un contenido incrementado de GLA a partir de las células transgénicas. En particular, se contempla como el organismo transgénico plantas que se cultivan con fines comerciales, incluyendo, pero sin limitarse a, girasol, soja, colza, maíz, cacahuete y tabaco.

La presente invención proporciona además un método para proporcionar organismos transgénicos que contienen GLA. Este método comprende introducir DNA que codifica una \Delta6-desaturasa en un organismo que carece de o tiene bajos niveles de GLA, pero que contiene LA. En otra realización, el método comprende introducir uno o más vectores de expresión que comprenden DNA que codifica una \Delta12-desaturasa y una \Delta6-desaturasa en organismos que son deficientes tanto en GLA como en LA. De acuerdo con ello, se induce la producción de LA en organismos deficientes tanto en LA como GLA mediante la expresión de la \Delta12-desaturasa, y se genera entonces GLA debido a la expresión de la \Delta6-desaturasa. Se pueden construir vectores de expresión que comprenden DNA que codifica la \Delta12-desaturasa, o la \Delta12-desaturasa y la \Delta6-desaturasa, por métodos de tecnología recombinante conocidos por un experto común en la técnica (Sambrook et al., 1989) y la secuencia publicada de la \Delta12-desaturasa (Wada et al [1990) Nature (Londres) 347, 200-203. Además, se ha descubierto según la presente invención que los nucleótidos 2002-3081 de SEQ. ID NO:1 codifican una \Delta12-desaturasa cianobacteriana. De acuerdo con esto, esta secuencia puede utilizarse para construir los vectores de expresión objeto de la invención. En particular, se contempla como el organismo transgénico plantas de cultivos que se cultivan con fines comerciales, incluyendo, pero sin limitarse a, girasol, soja, colza, maíz, cacahuete y tabaco.

La presente invención se dirige además a un método para introducir tolerancia al frío en plantas. La sensibilidad al frío se puede deber a una transición de fase de lípidos de las membranas celulares. La temperatura de transición de fase depende del grado de insaturación de los ácidos grasos de los lípidos de membrana y así, incrementar el grado de insaturación, por ejemplo, introduciendo una \Delta6-desaturasa para convertir LA en GLA, puede inducir o mejorar la resistencia al frío. De acuerdo con esto, el presente método comprende introducir DNA que codifica la \Delta6-desaturasa en una célula de planta, y regenerar una planta con resistencia al frío mejorada a partir de dicha célula de planta transformada. En una realización preferida, la planta es una planta de girasol, soja, colza, maíz, cacahuete o tabaco.

Los siguientes ejemplos ilustran de forma adicional la presente invención.

Ejemplo 1 Cepas y condiciones de cultivo

Se hizo que crecieran Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) y Synechococcus (PCC 7942, ATCC 33912) de forma fotoautótrofa a 30ºC en medio BG11N+ (Rippka et al. [1979] J. Gen. Microbiol. 111, 1-61) bajo iluminación de lámparas incandescentes (60 \muE.m^{-2}.S^{-1}). Los cósmidos y plásmidos se seleccionaron y propagaron en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli sobre medio LB suplementado con antibióticos a concentraciones normales tal como ha sido descrito por Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, Nueva York.

Ejemplo 2 Construcción en Cósmidos de una Genoteca Genómica de Synechocystis

Se digirió parcialmente con Sau3A DNA genómico total de Synechocystis (PCC 6803) y se fraccionó en un gradiente de sacarosa (Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, Nueva York). Se seleccionaron las fracciones que contenían fragmentos de DNA de 30 a 40 kb y se ligaron al sitio BamHI desfosforilado del cósmido vector, pDUCA7 (Buikema et al. [1991] J. Bacteriol. 173, 1879-1885). El DNA ligado se empaquetó in vitro tal como ha sido descrito por Ausubel et al. (1987), y el fago empaquetado se propagó en E. coli DH5\alpha que contenía un plásmido auxiliar con una secuencia codificante de una metilasa entre sitios Aval y Eco4711, pRL528, tal como ha sido descrito por Buikema et al. (1991). Se aisló al azar un total de 1152 colonias y se mantuvieron individualmente en doce placas de microtitulación de 96 pocillos.

Ejemplo 3 Expresión de GLA por ganancia de función en Anabaena

Anabaena (PCC 7120), una cianobacteria filamentosa, es deficiente en GLA pero contiene cantidades significativas de ácido linoleico, el precursor del GLA (Figura 2; Tabla 2). La genoteca de cósmidos de Synechocystis descrita en el Ejemplo 2 se conjugó en Anabaena (PCC 7120) para identificar transconjugantes que producen GLA. Se hicieron crecer células de Anabaena hasta la fase semilogarítmica en medio líquido BG11N+ y se resuspendieron en el mismo medio hasta una concentración final de aproximadamente 2x10^{8} células por ml. Un cultivo en fase semilogarítmica de E. coli RP4 (Burkardt et al. [1979] J. Gen. Microbiol. 114, 341-348) crecido en LB que contenía ampicilina se lavó y resuspendió en medio LB de reciente preparación. Se mezclaron entonces Anabaena y RP4 y se extendieron uniformemente sobre placas de BG11N+ que contenían LB al 5%. Se obtuvieron réplicas en placa de la genoteca genómica de cósmidos sobre placas de LB que contenían 50 \mug/ml de kanamicina y 17,5 \mug/ml de cloranfenicol y se situaron posteriormente a modo de parches sobre placas de BG11N+ que contenían Anabaena y RP4. Después de 24 horas de incubación a 30ºC, se colocaron 30 \mug/ml de neomicina a modo de subcapa; y se continuó con la incubación a 30ºC hasta que aparecieron transconjugantes.

Después de la conjugación, se aislaron transconjugantes individuales y se hicieron crecer en 2 ml de medio líquido BG11N+ con 15 \mug/ml de neomicina. Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de cultivos de tipo silvestre y cultivos que contenían combinados de diez transconjugantes como sigue. Los cultivos de cianobacterias de tipo silvestre y transgénicas se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con agua destilada. De estos cultivos se extrajeron ésteres metílicos de ácidos grasos como ha sido descrito por Dahmer et al. (1989) J. Amer. Oil. Chem. Soc. 66, 543-548 y se analizaron mediante Cromatografía de Gas-Líquido (GLC) utilizando un Tracor-560 equipado con un detector de ionización por llama de hidrógeno y una columna capilar (Superox II de 30 m x 0,25 mm enlazada mediante FSOT, Alltech Associates Inc., IL). Para la identificación de los ácidos grasos se utilizaron los tiempos de retención y patrones cocromatográficos (obtenidos de Sigma Chemical Co.). La composición media de ácidos grasos se determinó como la relación del área del pico de cada ácido graso C18 normalizada respecto a un patrón interno.

Los perfiles representativos de GLC se muestran en la Fig. 2. Se muestran los ésteres metílicos de ácidos grasos C18. Los picos se identificaron comparando los tiempos de elución con patrones conocidos de ésteres metílicos de ácidos grasos y se confirmaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas. El Panel A representa el análisis por GLC de ácidos grasos de Anabaena tipo silvestre. La flecha indica el tiempo de migración del GLA. El Panel B es un perfil de GLC de ácidos grasos de transconjugantes de Anabaena con pAM542+1.8F. Se identificaron dos combinados de muestras productores de GLA (de 25 combinados que representaban 250 transconjugantes). Se analizó la producción de GLA en transconjugantes individuales de cada combinado positivo respecto al GLA; se identificaron dos transconjugantes independientes, AS13 y AS75, uno de cada combinado, que expresaban niveles significativos de GLA y que contenían cósmidos, cSy13 y cSy75, respectivamente (Figura 3). Los cósmidos se solapan en una región de aproximadamente 7,5 kb de longitud. Un fragmento Nhel de 3,5 kb de cSy75 se reclonó en el vector pDUCA7 y se transfirió a Anabaena, dando como resultado expresión de GLA por ganancia de función (Tabla 2).

Dos subfragmentos NheI/HindIII (1,8 y 1,7 kb) del fragmento NheI de 3,5 kb de cSy75-3.5 se subclonaron en "pBLUESCRIPT" (Stratagene) (Figura 3) para su secuenciación. Se llevaron a cabo técnicas estándar de biología molecular como las descritas por Maniatis et al. (1982) y Ausubel et al. (1987). Se llevo a cabo secuenciación con didesoxi (Sanger et al. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) del pBS1.8 con "SEQUENASE" (United States Biochemical) en ambas cadenas utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos sintetizados por el Laboratorio de Tecnologías Avanzadas de DNA (Biology Department, Texas A & M University). El análisis de la secuencia de DNA se realizó con el programa informático GCG (Madison, WI) tal como ha sido descrito por Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395.

Ambos subfragmentos NheI/HindIII se transfirieron a un vector de expresión que se puede transferir por conjugación, AM542, tanto en orientación directa como inversa con respecto al promotor de la carboxilasa cianobacteriana, y se introdujeron en Anabaena por conjugación. Los transconjugantes que contenían el fragmento de 1,8 kb en la orientación directa (AM542-1.8F) produjeron cantidades significativas de GLA y ácido octadecatetraenoico (Figura 2; Tabla 2). Los transconjugantes que contenían otras construcciones, o con el fragmento de 1,8 kb en orientación inversa con el fragmento de 1,7 kb en orientación directa e inversa, no produjeron niveles detectables de GLA (Tabla 2).

La Figura 2 compara el perfil de ácidos grasos C18 de un extracto de Anabaena tipo silvestre (Figura 2A) con el de Anabaena transgénica que contenía el fragmento de 1,8 kb de cSy75-3.5 en la orientación directa (Figura 2B). El análisis por GLC de los ésteres metílicos de ácidos grasos de AM542-1.8F reveló un pico con un tiempo de retención idéntico al del patrón de GLA auténtico. El análisis de este pico mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) confirmó que tenía el mismo patrón de fragmentación de masas que la muestra de GLA de referencia. Las Anabaena transgénicas con niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados resultaron ser similares a las de tipo silvestre en tasa de crecimiento y morfología.

TABLA 2 Composición de ácidos grasos C18 en cianobacterias de tipo silvestre y transgénicas

2

Ejemplo 4 Transformación de Synechococcus con Genes de las \Delta6 y \Delta12-desaturasas

Se aisló un tercer cósmido, cSy7, que contiene un gen de la \Delta12-desaturasa, mediante el cribado de la genoteca genómica de Synechocystis con un oligonucleótido sintetizado de la secuencia publicada del gen de la \Delta12-desaturasa de Synechocystis (Wada et al. [1990] Nature (Londres) 347, 200-203). Se identificó un fragmento Aval de 1,7 kb de este cósmido que contenía el gen de la \Delta12-desaturasa y se utilizó como sonda para demostrar que cSy13 no sólo contiene un gen de la \Delta6-desaturasa sino también un gen de la \Delta12-desaturasa (Figura 3). El análisis genómico por transferencia tipo Southern mostró además que tanto el gen de la \Delta6 como el de la \Delta12-desaturasa son únicos en el genoma de Synechocystis, de forma que ambos genes funcionales implicados en la desaturación de ácidos grasos C18 están estrechamente unidos en el genoma de Synechocystis.

La cianobacteria unicelular Synechococcus (PCC 7942) es deficiente tanto en ácido linoleico como en GLA(3). Los genes de la \Delta12 y la \Delta6-desaturasa se clonaron de forma individual y juntos en pAM854 (Bustos et al. [1991] J. Bacteriol. 174, 7525-7533), un vector lanzadera que contiene secuencias necesarias para la integración de DNA exógeno en el genoma de Synechococcus (Golden et al. [1987] Methods in Enzymol. 153, 215-231). Se transformó Synechococcus con estas construcciones génicas y se seleccionaron colonias. Se extrajeron de Synechococcus transgénicos ésteres metílicos de ácidos grasos y se analizaron por GLC.

La Tabla 2 muestra que los ácidos grasos principales de Synechococcus tipo silvestre son el ácido esteárico (18:0) y el ácido oleico (18:1). Synechococcus transformados con pAM854-\Delta12 expresaban ácido linoleico (18:2) además de los ácidos grasos principales. Las bacterias transformadas con pAMB54-\Delta6 y \Delta12 produjeron tanto linoleato como GLA (Tabla 1). Estos resultados indican que un Synechococcus que contiene los genes tanto de la \Delta12 como de la \Delta6-desaturasa ha ganado la capacidad de introducir un segundo doble enlace en la posición \Delta12 y un tercer doble enlace en la posición \Delta6 de los ácidos grasos C18. Sin embargo, no se observó ningún cambio en la composición de ácidos grasos en el transformante que contenía pAM854-\Delta6, indicando que, en ausencia de sustrato sintetizado por la \Delta12-desaturasa, la \Delta6-desaturasa es inactiva. Este experimento confirma además que el fragmento Nhel/HindIII de 1,8 kb (Figura 3) contiene las regiones tanto codificante como promotora del gen de la \Delta6-desaturasa de Synechocystis. Los Synechococcus transgénicos con niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados resultaron ser similares a los de tipo silvestre en tasa de crecimiento y morfología.

Ejemplo 5 Secuencia de nucleótidos de la \Delta6-desaturasa

Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de 1,8 kb de cSy75-3.5 que incluía el gen funcional de la \Delta6-desaturasa. Se identificó un marco abierto de lectura que codificaba un polipéptido de 359 aminoácidos (Figura 4). Un análisis de hidropatía de Kyte-Doolittle (Kyte et al [1982] J. Mol. Biol. 157, 105-132) identificó dos regiones de aminoácidos hidrófobos que podrían representar dominios transmembrana (Figura 1A); es más, el perfil hidropático de la \Delta6-desaturasa es similar al del gen de la \Delta12-desaturasa (Figura 1B; Wada et al.) y \Delta9-desaturasas (Thiede et al. (1986] J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Sin embargo, la similitud de secuencia entre las \Delta6 y \Delta12-desaturasas de Synechocystis es menor que 40% a nivel de los nucleótidos y de aproximadamente 18% a nivel de los aminoácidos.

Ejemplo 6 Transferencia de la \Delta6-desaturasa cianobacteriana al tabaco

Se movilizó el gen de la \Delta6-desaturasa cianobacteriana a un vector de expresión de plantas y se transfirió a tabaco utilizando técnicas de transferencia de genes mediada por Agrobacterium. Para asegurar que la desaturasa transferida se expresa apropiadamente en hojas y semillas en desarrollo y que el producto del gen de la desaturasa esté dirigido al retículo endoplásmico o al cloroplasto, se construyeron diversos casetes de expresión con el marco abierto de lectura de la \Delta-desaturasa de Synechocystis. Los componentes de estos casetes incluyen: (i) un promotor 35S o un promotor específico de semillas derivado del gen de la heliantinina de girasol para dirigir la expresión del gen de la \Delta6-desaturasa en todos los tejidos de la planta o sólo en semillas en desarrollo respectivamente, (ii) un hipotético péptido señal, o del gen de la extensina de zanahoria o del gen de la heliantinina de girasol, para dirigir la \Delta6-desaturasa recién sintetizada al RE, (iii) una secuencia señal para la retención en el lumen del RE (KDEL) en el extremo carboxilo del ORF de la \Delta6-desaturasa, y (iv) un péptido de tránsito optimizado para dirigir la \Delta6-desaturasa al cloroplasto. El promotor 35S es un derivado de pRTL2 descrito por Restrepo et al. (1990). La secuencia del péptido de tránsito optimizado está descrita por Van de Broeck et al. (1985). El péptido señal de la extensina de zanahoria está descrito por Chen et al (1985) EMBO J., 9, 2145.

Se produjeron plantas transgénicas de tabaco que contenían un gen quimérico con la desaturasa cianobacteriana, compuesto del gen de la \Delta6-desaturasa de Synechocystis fusionado a una secuencia de retención en el retículo endoplásmico (KDEL) y un péptido señal de la extensina dirigido por el promotor 35S de CaMV. Las amplificaciones por PCR del DNA genómico de tabaco transgénico indican que el gen de la \Delta^{6}-desaturasa estaba incorporado al gen del tabaco. Se extrajeron los ésteres metílicos de ácidos grasos de hojas de estas plantas transgénicas de tabaco y se analizaron por cromatografía de gas-líquido (GLC). Estas plantas transgénicas de tabaco acumulaban cantidades significativas de GLA (Figura 4). La Figura 4 muestra ésteres metílicos de ácidos grasos según lo determinado por GLC. Los picos se identificaron comparando los tiempos de elución con patrones conocidos de ésteres metílicos de ácidos grasos. De acuerdo con ello, se pueden utilizar genes de cianobacterias implicados en el metabolismo de ácidos grasos para genera plantas transgénicas con composiciones de ácidos grasos alteradas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Thomas, Terry L.

\hskip3.9cm

Reddy, Avutu S.

\hskip3.9cm

Nuccio, Michael

\hskip3.9cm

Freyssinet, Georges L.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GAMMA-LINOLÉNICO MEDIANTE UNA DELTA 6-DESATURASA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Scully, Scott, Murphy & Presser

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(B): CALLE: 400 Garden City Plaza

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(C): CIUDAD: Garden City

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(D): ESTADO: Nueva York

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): CÓDIGO POSTAL: 11530

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(v): FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: Por asignar

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-ENERO-1992

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE LEGAL/AGENTE:

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(A): NOMBRE: McNulty, William E.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 22.606

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 8383Z

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA LAS TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (516) 742-4343

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (516) 742-4366

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TÉLEX: 230 901 SANS UR

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(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3588 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: :2002..3081

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 359 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

7

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(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1884 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

8

9

Claims

1. Un ácido nucleico que codifica una delta-6 desaturasa, en el que dicho ácido nucleico se selecciona entre:

(a) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o un fragmento suyo,

(b) el ácido nucleico representado por SEQ ID NO:3 o un fragmento suyo,

(c) un ácido nucleico que hibrida con cualquiera de los ácidos nucleicos de (a) o (b)

2. Un vector de expresión que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 1.

3. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico que codifica una delta-6 desaturasa está unido de forma operativa a un promotor y/o a una señal de terminación capaz de llevar a cabo la expresión del producto del gen de dicho ácido nucleico.

4. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que dicho promotor es un promotor de delta-6 desaturasa, un promotor de la carboxilasa de Anabaena, un promotor de heliantinina, un promotor de glicina, un promotor de napina, el promotor 35S del CaMV, o un promotor de heliantinina específico de tejido.

5. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que dicha señal de terminación es una señal de terminación de Synechocystis, una señal de terminación de la nopalina sintasa, o una señal de terminación de semillas.

6. Una célula aislada transformada genéticamente, que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1, o un vector según las reivindicaciones 2 a 5.

7. La célula transformada genéticamente de la reivindicación 6, en la que dicha célula es una célula animal, una célula bacteriana, una célula de planta o una célula fúngica.

8. Un organismo no humano transformado genéticamente, que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1, o un vector según las reivindicaciones 2 a 5.

9. El organismo no humano transformado genéticamente de la reivindicación 8, en el que dicho organismo es una bacteria, un hongo, una planta o un animal.

10. Una planta según la reivindicación 9 o una progenie transgénica suya, que es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete o colza.

11. Un método para proporcionar una planta transgénica con contenido incrementado de ácido gamma-linolénico (GLA) que comprende:

(a) transformar una célula de planta con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, y

(b) regenerar una planta con contenido incrementado de GLA a partir de dicha célula de planta.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha planta es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete o colza.

13. Un método para proporcionar un organismo transgénico no humano que contenga ácido gamma-linolénico (GLA), que comprende transformar un organismo que carece de o tiene niveles bajos de GLA, pero que contiene ácido linoleico (LA), con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

14. Un método para proporcionar un organismo transgénico no humano que contenga ácido gamma-linolénico (GLA), que comprende transformar un organismo deficiente tanto en GLA como en ácido linoleico (LA) con un vector seleccionado del grupo que consiste en:

(a) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que contiene también un ácido nucleico aislado que codifica una delta-12 desaturasa.

(b) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 y un vector que contiene un ácido nucleico aislado que codifica una delta-12 desaturasa.

15. Un método para proporcionar un organismo transgénico no humano que contenga ácido octadecatetraenoico, que comprende transformar un organismo deficiente en o que carece de ácido gamma-linolénico con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

16. El método de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho organismo es una bacteria, un hongo, o una planta.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicha planta es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete o colza.

18. Un organismo no humano según la reivindicación 8 ó 9, o una planta según la reivindicación 10 o una progenie transgénica suya, que comprende además un ácido nucleico que codifica una delta-12 desaturasa.

19. Un método para producir una planta con resistencia al frío mejorada que comprende:

(a) transformar una célula de planta con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, y

(b) regenerar dicha planta con resistencia al frío mejorada a partir de dicha célula de planta transformada.

20. El método de la reivindicación 19, en el que dicha planta es una planta de girasol, soja, maíz, tabaco, cacahuete o colza.

21. Una delta-6 desaturasa bacteriana aislada, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento suyo.