CZ285471B6 - Způsob výroby gama linolenové kyseliny účinkem delta-6 Desaturázy - Google Patents

Způsob výroby gama linolenové kyseliny účinkem delta-6 Desaturázy Download PDF

Info

Publication number
CZ285471B6
CZ285471B6 CZ94817A CZ81794A CZ285471B6 CZ 285471 B6 CZ285471 B6 CZ 285471B6 CZ 94817 A CZ94817 A CZ 94817A CZ 81794 A CZ81794 A CZ 81794A CZ 285471 B6 CZ285471 B6 CZ 285471B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
desaturase
acid
plant
gla
nucleic acid
Prior art date
Application number
CZ94817A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ81794A3 (en
Inventor
L. Thomas Terry
S. Reddy Avutu
Michael Nuccio
L. Freyssinet Georges
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone-Poulenc Agrochimie
Publication of CZ81794A3 publication Critical patent/CZ81794A3/cs
Publication of CZ285471B6 publication Critical patent/CZ285471B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083Miscellaneous (1.14.99)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409Fatty acids
    • C12P7/6427Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436Fatty acid esters
    • C12P7/6445Glycerides
    • C12P7/6472Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y114/00Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19003Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825Bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Izolovaná nukleová kyselina kodující kyanobakteriální .DELTA..sup.6.n.-desaturázu a obahující sekvenci SEQ. ID NO:3; Izolovaná nukleová kyselina kódující kyanobakteriální .DELTA..sup.6.n.- desaturázu obsahující nukleotidy 2002 až 3081 sekvence SEQ ID No:1; Způsob přípravy bakteriální kvasinkové nebo rostlinné buňky obsahující kyanobakteriální .DELTA..sup.6.n.-desaturázu, který zahrnuje transformaci bakteriální, kvasinkové nebo rostlinné buňky izolovanou výše uvedenou nukleovou kyselinou; Způsob indukce tvorby gamma-linolenové kyseliny /GLA/ v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo s chybějící GLA, kde bakterie nebo rostlina vytváří linolovou kyselinu. Bakterie nebo rostlina se transformuje izolovanou výše uvedenou nukleovou kyselinou; Způsob indukce tvorby gamma-linolenové kyseliny /GLA/ v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo chybějící GLA a linolovou kyselinou /LA/. Bakterie nebo rostlina se transformuje izolovanou nukleovou kyselinou kódující kyanobakteriální .DELŕ

Description

Vynález se týká izolované nukleové kyseliny, způsobu přípravy bakteriální, kvasinkové nebo rostlinné buňky obsahující kyanobakteriální A6-desaturázu, způsobu indukce tvorby gammalinolenové kyseliny a způsobu indukce tvorby oktadekatetraenové kyseliny.
Dosavadní stav techniky
Nenasycené mastné kyseliny jako kyselina linolová (CigA9,12) a kyselina a-linolenová (ClgA9,1215) jsou podstatné složky výživy, které nemohou být syntetizovány obratlovci, neboť buňky obratlovců mohou zavést dvojné vazby v A9-poloze mastných kyselin, avšak nemohou zavést přídavné dvojné vazby mezi dvojnou vazbou Δ9 a koncovou methylovou skupinou řetězce mastných kyselin. Protože představují prekurzoiy jiných produktů, jsou linolové kyseliny a alinolenové kyseliny esenciálními mastnými kyselinami a obvykle se získají z rostlinných zdrojů. Linolová kyselina může být savci přeměněna na γ-linolenovou kyselinu (GLA, C]gA6·912), která může být dále přeměněna na arachidovou kyselinu (20:4), což je kriticky významná mastná kyselina, protože je podstatným prekurzorem většiny prostaglandinů.
Dietní zjištění linolové kyseliny její výslednou přeměnou na GLA a arachidovou kyselinu uspokojuje dietní požadavky na GLA a arachidovou kyselinu. Byla nicméně dokázána souvislost mezi konzumací mastných kyselin a ohrožením zdraví chorobami jako je hypercholesterolemie, ateroskleróza a jiné chemické nevyváženosti, které souvisí s náchylností k onemocnění koronárních tepen, zatímco konzumace nenasycených mastných kyselin byla spojena se sníženou hladinou cholesterolu v krvi a sníženým nebezpečím aterosklerózy. Terapeutické příznivé dietní účinky GLA plynou z toho, že GLA je prekurzorem arachidové kyseliny a tudíž přispívá k syntéze prostaglandinů. Konzumace více nenasycených kyselin GLA, spíše než kyseliny linolové, má potenciální příznivé účinky na zdraví. Ovšem GLA není ve skutečnosti obsažena v žádných komerčně pěstovaných rostlinách.
Kyselina linolová se přeměňuje na GLA enzymem o názvu A6-desaturáza. A6-desaturáza, enzym obsahující asi 359 aminokyselin, má oblast vázanou na membránu aktivní místo pro odsycení mastných kyselin. Když je tento enzym přenesen do buněk, které endogenně vyvíjejí linolovou kyselinu a nikoliv GLA, vyvíjí se GLA.
Podstata vynálezu
Vynález se týká izolované nukleové kyseliny, kódující kyanobakteriální A6-desaturázu obsahující sekvenci SEQ ID No:3. Izolovaná nukleová kyselina kódující kyanobakteriální Δ6desaturázu obsahuje nukleotidy 2002 až 3081 sekvence SEQ ID No: 1.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob přípravy bakteriální, kvasinkové nebo rostlinné buňky obsahující kyanobakteriální Δό-desaturázu, který zahrnuje transformaci bakteriální, kvasinkové nebo rostlinné buňky izolovanou nukleovou kyselinou definovanou výše.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob indukce tvorby gamma-linolenové kyseliny (GLA) v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo s chybějící GLA, kde uvedená bakterie nebo rostlina vytváří linolovou kyselinu, spočívající vtom, že bakterie nebo rostlina se transformuje izolovanou nukleovou kyselinou definovanou výše.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob indukce tvorby gamma-linolenové kyseliny (GLA) v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo s chybějící GLA a linolovou kyselinou (LA), kde uvedená bakterie nebo rostlina se transformuje výše uvedenou izolovanou nukleovou kyselinou kódující kyanobakteriální A6-desaturázu a izolovanou nukleovou kyselinou kódující Al2-desaturázu.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je způsob indukce tvorby oktadekatetraeonové kyseliny v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo chybějící gamma-linolovou kyselinou nebo oktadekatetraeonovou kyselinou a kde uvedená bakterie nebo rostlina vytváří linolovou kyselinu, kde se uvedená bakterie nebo rostlina transformuje izolovanou nukleovou kyselinou uvedenou výše.
Linolová kyselina (18:2) (LA) se transformuje na gama linolenovou kyselinu (18:3) (GLA) enzymem, nazývaným A6-desaturáza. Když je tento enzym nebo nukleová kyselina, která jej kóduje, přenesen do buněk, produkujících LA, vyvíjí se GLA. Předmětem předloženého vynálezu je také nukleová kyselina, obsahující gen enzymu desaturázy. Přesněji řečeno, nukleová kyselina obsahuje promotor, kódující oblast a terminační oblast genu A6-desaturázy. Předložený vynález se dále týká konstrukce vektoru exprese obsahující kódující oblast A6-desaturázy ve funkční kombinaci s heterologními regulačními sekvencemi. Nukleové kyseliny a konstrukce expresního vektoru podle předloženého vynálezu jsou použitelné pro vytváření GLA v transgenních organizmech.
Předložený vynález dále vytváří rostliny snášející ochlazení. Obr. 1 znázorňuje hydropathické profily dedukovaných sekvencí aminokyselin Synechocystis A6-desaturázy (obr.lA) a Δ12 desaturázy (obr. IB). Domnělé transmembránové oblasti jsou označeny plnými čarami. Hydrofóbní index byl vypočítán pro velikost okna 19 zbytků aminokyselin (Kyte a sp. (1982) J. Molec. Biol. 157).
Obr. 2 znázorňuje průběhy získané plyno-kapalinovou chromatografii pro divoký typ (obr. 2A) a pro transgenní Anabaena (Obr. 2B).
Obr. 3 je diagram map kosmidů cSy75, cSyl3 a cSy7 s oblastmi přesunu a subklony. Začátky subklonů cSy75, cSy75-3.5 a cSy7 jsou označeny přerušovanými uhlopříčkovými čarami. Místa restrikce, která byla odstraněna, jsou v závorkách.
Obr. 4 znázorňuje průběhy získané plyno-kapalinovou chromatografii pro divoký typ (Obr. 4A) a transgenní tabák (obr. 4B).
Předložený vynález vytváří izolovanou nukleovou kyselinu kódující A6-desaturázu. Pro identifikaci nukleové kyseliny kódující desaturázu se DNA izoluje z organismu, který vyvíjí GLA. Tento organismus může být například zvířecí buňka, některé houby, například Mortierella, některé bakterie, například Synechocystis, nebo některé rostliny, jako Borago off., Oenothera, nebo rybíz. Izolace genomické DNA může být provedena rozličnými způsoby v oboru známými, které pokusně provedli Sambrook a sp. (1989) a popsali v publikaci Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Izolovaná DNA se fragmentuje fyzikálními metodami nebo enzymatickou digescí a klonuje do vhodného vektoru jako bakteriofága nebo vektoru kosmidu, některým ze známých způsobů obsaženým v literatuře jako je Sambrook a sp. (1989). Specificky jsou zde uvažovány expresní vektory obsahující DNA podle předloženého vynálezu. DNA kódující A6-desaturázu může být indentifikována analýzou zisku funkce. Vektor obsahující fragmentovanou DNA se přenese například infekcí, transkonjugací, transfekcí, do
-2CZ 285471 B6 hostitelského organismu, který vyvíjí linolovou kyselinu, avšak nevyvíjí GLA. Výraz transformace zde obecně používaný znamená obecně vnesení cizí DNA do hostitelské buňky. Způsoby zavedení rekombinanty DNA do hostitelského organismu jsou v oboru obecně známé a mohou být nalezeny například v publikaci Sambrook a sp. (1989). Vytváření GLA těmito organismy, to znamená zisk funkce, se zkouší například plynovou chromatografii nebo jinými způsoby v oboru známými. Organizmy, které byly indukovány k vyvíjení GLA, to znamená získaly funkci zavedením vektoru, jsou identifikovány jako vyjadřující DNA kódující Δ6desaturázu a zmíněná DNA se zpětně získá z těchto organizmů. Zpětně získaná DNA může být opět fragmentována, klonována s expresními vektory a funkčně zkoušena výše uvedenými způsoby pro přesnější definování DNA kódující A6-desaturázu.
Jako příklad provedení předloženého vynálezu je izolována náhodná DNA z kyanobakterie Synechocystis Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, Američan Type Culture Collection (ATCC) 27184, klonované do vektoru kosmidu, a zavedené transkonjugací do bakterie cyanobacterium Anabaena kmen PCC 7120, ATCC 27893 se sníženým obsahem GLA. Vyvíjení GLA z linolové kyseliny Anabaena je sledováno plynovou chromatografii a příslušný fragment DNA je izolován.
Izolovaná DNA je sekvenčně zpracována způsoby v oboru známými, například podle Sambrook asp. (1989).
V rámci předloženého vynálezu byla izolována DNA obsahující gen A6-desaturázy. Přesněji byla z bakterie cyanobakteria Synechocystis izolována DNA 3.588 kilobase (kb) obsahující gen A6-desaturázy. Byla určena sekvence nukleotidů 3.588 kb DNA a je znázorněna v SEQ ID NO: 1. Otevřené čtecí úseky definující potenciální kódovací oblasti jsou přítomny z nukleotidu 317 až do 1507 a z nukleotidu 2002 až do 3081. Pro definování nukleotidů odpovědných za kódování A6-desaturázy je 3.588 kb fragment ukazující aktivitu A6-desaturázy rozštěpen ve dva subfragmenty, z nichž každý obsahuje pouze jeden otevřený čtecí úsek. Fragment ORF1 obsahuje nukleotidy od 1 do 1704, zatímco fragment ORF2 obsahuje nukleotidy od 1705 do 3588. Každý fragment je subklonován v dopředně i zpětné orientaci na konjugovaný expresní vektor (AM542, Wolk a sp. (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1561), který obsahuje promotor kyanobakteriální karboxylázy. Výsledné konstrukty ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) a ORF2(R) jsou konjugovány na divoký typ Anabaena PCC 7120 standardními způsoby (viz například Wolk a sp. (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1561). Konjugované buňky Anabaena jsou identifikovány jako Neo zelení kolonie na hnědém pozadí zanikajících nekonjugovaných buněk po dvou týdnech pěstování na selektivních médiích (standardní minerální média BG11N + obsahující 30 pg/ml neomycinu podle Rippka a sp. (1979) J. Gen Microbiol. 111, 1). Zelené kolonie jsou vyloučeny a pěstovány v selektivních kapalných médiích (BG1 IN + 15 pg/ml neomycinu). Lipidy se extrahují standardními způsoby (například Dahmer a sp. (1989) Joumal of Američan Oil Chemical Society 66, 543) z výsledných transkonjugantů obsahujících dopředně a zpětně orientované konstrukty ORF1 a ORF2. Pro srovnání se lipidy také extrahují z divokého typu kultur Anabaena a Synechocystis. Methylestery mastných kyselin se analyzují plyno-kapalinovou chromatografii (GLC) například s plyno-kapalinovým chromatografem Tracor-560 s detektorem ionizace vodíkového plamene a s kapilární kolonou. Výsledky analýzy GLC jsou uvedeny v tabulce 1.
-3 CZ 285471 B6
Tabulka 1: Výskyt mastných kyselin Cl8 v divokém typu a ve transgenní kyanobakterii
ZDROJ 18:0 18:1 18:2 γ18:3 α18:3 18:4
Anabaena (divoký typ) + + + - + -
Anabaena + ORF1 (F) + + + - + -
Anabaena + ORF1 (R) + + + - + -
Anabaena + ORF2 (F) + + + + + +
Anabaena + ORF2 (R) + + + - + -
Synechocystis (divoký typ) + + + + - -
Jak bylo vyzkoušeno analýzou GLC, Anabaena se sníženým obsahem GLA získá funkci vyvíjení GLA když se transkonjugací zavede konstrukt obsahující ORF2 v dopředně orientaci. Transkonjuganty obsahující konstrukty s ORF2 ve zpětné orientaci k promotoru karboxylázy, nebo ORF1 ve kterékoli orientaci nevykazují žádné vyvíjení GLA. Tato analýza ukazuje, že jediný otevřený úsek čtení (ORF2) v 1884 bp fragmentu kóduje A6-desaturázu. 1884 bp fragment je znázorněn jako SEQ ID NO:3. To je potvrzeno celkovou podobností hydropathických průběhů mezi A6-desaturázou a A12-desaturázou (Wade a sp. (1990) Nátuře 347), jak je znázorněno v obr. 1 jako (A) popřípadě jako (B).
Izolované nukleové kyseliny kódující A6-desaturázu mohou být identifikovány z jiných organizmů vyvíjejících GLA získáním funkční analýzy popsané výše nebo technikou hybridizace nukleových kyselin používající izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje Anabaena Δ6desaturázu jako hybridizační próbu. Oba způsoby klonování genomové DNA a cDNA v oboru známé jsou použity ve předloženém vynálezu. Hybridizační próba: může obsahovat celou sekvenci DNA uvedenou jako SEQ. ID NO:1, nebo restrikční fragment nebo jiný její DNA fragment obsahující vzorek oligonukleotidů. Způsoby klonování homologních genů křížovou hybridizaci jsou v oboru známé a mohou být nalezeny například v publikaci Sambrook (1989) a Beltz a sp. (1983) Methods in Enzymology 100, 26.
Transgenní organizmy, které získají funkci vyvíjení GLA zavedením DNA kódující A6-desaturázu také získají funkci vyvíjet oktadekatetraeonové kyseliny (18:4 6AI2l5y Oktadekatetraeonová kyselina je normálně přítomná v rybích olejích a v některých rostlinných druzích rodu Boraginaceae (Craig a sp. (1964) J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 209-211; Gross a sp. (1976) Can. J. Plant Sci. 56, 659-664). Ve transgenních organizmech podle předloženého vynálezu je oktadekatetraeonová kyselina výsledkem další desaturace α-linolenové kyseliny A6-desaturázou nebo desaturace GLA A15-desaturázou.
359 aminokyselin kódovaných ORF2, to znamená otevřený čtecí úsek kódující A6-desaturázu, je znázorněno jako SEQ. ID NO:2. Předložený vynález dále sleduje jiné sekvence nukleotidů, které kódují aminokyseliny ze SEQ. ID NO:2. Běžným úkolem pracovníka školeného v oboru je identifikace takové sekvence, která vyplývá například z degenerace genetického kódu. Pracovník školený v oboru může dále určit ziskem funkční analýzy popsané výše menší subfragmenty z 1884 bp fragmentu obsahujícího ORF2, který kóduje A6-desaturázu.
Předložený vynález uvažuje takový polypeptidový fragment A6-desaturázy a nukleových kyselin obsahujících aktivitu pro přeměnu LA na GLA.
Podle jiné myšlenky předloženého vynálezu je vektor obsahující 1884 bp fragment nebo menší fragment obsahující promotor, kódovací sekvenci a oblast terminace genu A6-desaturázy přenesen do organizmu, například kyanobakterie, ve kterém promotor a oblasti terminace Δ6desaturázy jsou funkční. Tudíž vynález vytváří organizmy vyvíjející rekombinantu A6-desaturázy. Podle další myšlenky předloženého vynálezu se vyvíjí izolovaná Δό-desaturáza, která může
-4CZ 285471 B6 být vyčištěna z rekombinačních organizmů standardními způsoby čištění proteinů, (například viz
Ausubel a sp. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New
York).
Vektory obsahující DNA kódující Δό-desaturázu jsou také vytvářeny předloženým vynálezem. Je zřejmé, že vhodné vektory mohou být konstruovány k řízení vyjádření kódové sekvence Δ6desaturázy v rozličných organizmech. Replikovatelné vektoiy vyjádření jsou zvláště preferovány. Replikovatelné vektory vyjádření zde popisované jsou molekuly DNA nebo RNA zpracované pro řízené vyjádření žádaného genu, to je genu Δό-desaturázy. Přednostně jsou tyto vektory plazmidy, bakteriofágy, kosmidy nebo viry. Kyvadlové vektory, například popsané Wolk a sp. (1984) Proč. Nati. Acad. Aci. USA, 1561-1565 a Bustos a sp. (1991) J. Bacteriol. 174, 75257533, jsou také uvažovány v souvislosti s předloženým vynálezem. Sambrook a sp. (1989). Goeddel (1990) Methods in Enzymology 185 Acacemic Press, a Perbal (1988) a Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, lne., podávají podrobný přehled vektorů, do kterých může být zavedena nukleová kyselina kódující danou Δό-desaturázu a tam vyjádřena. Takové vektory také obsahují sekvence nukleových kyselin, které mohou způsobit vyjádření nukleových kyselin kódujících Δό-desaturázu. Prvky sekvence schopné uskutečnit vyjádření produktu genu obsahují promotory, zlepšovací prvky, protiproudé aktivační sekvence, signály přepisu terminace a místa polyadenylace. Jsou sledovány konstitutivní i tkáňové specifické promotory. Pro transformaci rostlinných buněk mají zvláštní význam promotor květákového mosaikového viru (CaMV) 355 a promotory, které jsou regulovány během zrání plodin. Všechny takové promotory a transkripční regulátorové prvky jednotlivě nebo v kombinaci jsou uvažovány pro použití ve přítomných replikovatelných vektorech vyjádření a jsou v oboru známé. Promotor CaMV 355 je popsán například Restrepo a sp. (1990) Plant Cell 2, 987. Také jsou uvažovány geneticky zpracované a mutované regulátorové sekvence.
Normálně školený odborník může určit vektory a regulátorové prvky vhodné pro vyjádření ve zvláštní hostitelské buňce. Tak například vektor obsahující promotor z genu kódujícího karboxylázu Anabaena operačně svázaný s kódovací oblastí Δό-desaturázy a dále operačně svázaný se signálem terminace ze Synechocystis je vhodný pro vyjádření Δό-desaturázy v kyanobakterii. Výraz operačně svázaný zde značí, že promotor a terminační sekvence účinně fungují pro regulaci přepisu. Jako další příklad vektor vhodný pro vyjádření Δό-desaturázy ve transgenních rostlinách může obsahovat sekvenci promotorů specifických pro semeno odvozenou z helianthininu, napinu nebo glycinu a operačně svázanou s kódovací oblastí Δό-desaturázy a dále operačně svázanou s terminačním signálem specifickým pro semeno nebo terminačním signálem syntézy nopalinu.
Zejména regulační prvky helianthininu popsané v přihlášce vynálezu Spojených států amerických téhož přihlašovatele číslo série 682,354 ze dne 8. dubna 1991 jsou uvažovány jako prvky promotoru pro řízení vyjádření Δό-desaturázy předloženého vynálezu.
Modifikace sekvencí nukleotidů nebo regulačních prvků zde popsané, které udržují uvažované funkce, jsou v rámci myšlenky předloženého vynálezu. Takové modifikace obsahují vložení, substituce a zrušení a zejména substituce, které odrážejí degeneraci genetického kódu.
Standardní techniky pro konstrukci takových hybridních vektorů jsou v oboru dobře známé a popisuje je například Sambrook a sp. (1989) nebo řada laboratorních příruček o rekombinantách DNA a jejich technologii. Existuje řada strategií pro ligaci fragmentů DNA a jejich volba závisí na typu konců fragmentů DNA. V souhlase s předloženým vynálezem se dále uvažuje zavést do hybridních vektorů jiné sekvence prvků nukleotidů, které usnadňují klonování, vyjádření nebo zpracování například sekvence kódující signálové peptidy, sekvence kódující KDEL, požadovaný pro udržení proteinů v endoplasmickém retikulu nebo sekvence kódující tranzitní peptidy, které řídí Δό-desaturázu ke chloroplastu. Takové sekvence jsou v oboru známé.
-5 CZ 285471 B6
Optimalizovaný tranzitní peptid popisuje například Van den Broeck a sp. (1985) Nátuře 313,
358. Prokaryotické a eukaryotické sekvence signálů jsou popsány například od Michaelis a sp.
(1982), Ann. Rev. Microbiol. 36, 425.
Další myšlenka předloženého vynálezu vytváří organizmy jiné než kyanobakterie, které obsahují DNA kódující A6-desaturázu podle předloženého vynálezu. Transgenní organizmy uvažované v rámci předloženého vynálezu zahrnují bakterie, kyanobakterie, houby a rostliny a zvířata. Izolovaná DNA podle předloženého vynálezu může být zavedena do hostitelského organismu způsoby v oboru známými, například infekcí, transfekcí, transformací nebo transkonjugací. Techniky přenosu DNA podle předloženého vynálezu do takových organizmů jsou obecně známé a popsané v literatuře jako Sambrook a sp. (1989).
Je známo množství způsobů transformace rostlin. Gen A6-desaturázy může být do rostlin zaveden způsobem transformace a regenerace plochy listu jak je popsal Horsch a sp. (1985) Science 227, 1229. Jiné způsoby transformace, jako kultura protoplastu (Horsch a sp. (1984) Science 223, 496; DeBlock a sp., (1984) EMBO J. 2, 2143; Bartoň a sp. (1983) Cell 32, 1033) mohou také být použity a spadají do rámce předloženého vynálezu. Ve přednostním provedení se rostliny transformují vektory odvozenými od Agrobacterium. Nicméně jsou přístupné i jiné způsoby pro zavedení genu A6-desaturázy podle předloženého vynálezu do rostlinných buněk. Takové alternativní způsoby zahrnují biologické přístupy (Klein a sp. (1987) Nátuře 327, 70), elektroporaci, chemicky indukovaný převod DNA, a použití virů nebo pylu jako vektorů.
Je-li to nutné pro způsob transformace, gen Δ6—desaturázy podle předloženého vynálezu může být zaveden do transformačního vektoru rostliny, například binárního vektoru, kteiý popisuje Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Transformační vektory rostlin mohou být odvozeny modifikací přírodního systému přenosu genů Agrobacterium tumefaciens. Přírodní systém obsahuje velké Ti (tumor indukující) plazmidy obsahující velký segment, známý jako T-DNA, který se přenese na transformované rostliny. Jiný segment Ti-plasmidu, oblast virů, je odpovědná za přenos T-DNA Oblast T-DNA je ohraničena opakováním terminálu. V modifikovaných binárních vektorech mají geny indukující tumor být potlačeny a funkce oblasti virů jsou použity pro přenos cizí DNA obklopené okrajovými sekvencemi T-DNA. T-oblast také obsahuje volitelný příznak pro antibiotickou odolnost a násobné klonovací místo pro vložení sekvencí pro přenos. Takové zpracované kmeny jsou známy jako odzbrojené kmeny A. tumefaciens a umožňují účinnou transformaci sekvencí ohraničených T-oblastí do nukleárních genomů rostlin.
Povrchově sterilizované plochy listů se inokulují A. tumefaciens obsahující odzbrojenou cizí DNA a kultivují se po dva dny a potom se přenesou do média obsahujícího antibiotikum. Transformované výhonky se po ujmutí pěstují v prostředí obsahujícím vhodné antibiotikum, přenesou se do půdy a regenerují.
Jiná myšlenka předloženého vynálezu vytváří transgenní rostliny nebo progeny těchto rostlin obsahující izolovanou DNA podle vynálezu. Uvažují se monokotyledenní i dikotyledenní rostliny. Rostlinné buňky se transformují izolovanou DNA kódující A6-desaturázu některým způsobem transformace rostlin popsaným výše. Transformovaná rostlinná buňka, obvykle ve tvrdé kultuře nebo ploše listu se regeneruje na úplnou transgenní rostlinu způsoby v oboru dobře známými, které popsal například Horsch a sp. (1985) Science 227, 1129. Ve přednostním provedení transgenní rostlina je slunečnice, řepka olejka, kukuřice, tabák, arašíd nebo sojový bob. Protože progeny transformovaných rostlin zdědí DNA kódující A6-desaturázu, sadby nebo řízky z transformovaných rostlin se použijí pro zachování linie transgenní rostliny.
Předložený vynález dále vytváří způsob vyvíjení transgenních rostlin se zvýšeným obsahem GLA. Tento způsob spočívá v zavedení DNA kódující A6-desaturázu do rostlinných buněk
-6CZ 285471 B6 majících nízký obsah nebo žádnou GLA, avšak obsahujících LA, a v regeneraci rostlin se zvýšeným obsahem GLA z transgenních buněk. Zejména komerčně pěstované rostliny se uvažují jako transgenní organismy a jsou to, bez omezení, slunečnice, sojový bob, řepka olejka, kukuřice, arašíd a tabák.
Předložený vynález dále vytváří způsob vyvíjení transgenních organizmů obsahujících GLA. Tento způsob spočívá v zavedení DNA kódující A6-desaturázu do organizmu, kteiý nemá nebo má nízkou úroveň GLA, avšak obsahuje LA. V jiném provedení tento způsob spočívá v zavedení jednoho nebo více expresních vektorů obsahujících DNA kódující A12-desaturázu a Δ6desaturázu do organizmů, které neobsahují ani GLA ani LA. Organizmy, které neobsahují ani GLA ani LA se indukují, aby vyvíjely LA vyjádřením A12-desaturázy a potom se vyvíjí GLA následkem vyjádření A6-desaturázy. Expresní vektory obsahující DNA kódující A12-desaturázu nebo A12-desaturázu a A6-desaturázu mohou být konstruovány způsoby technologie rekombinant, které jsou v oboru známé (Sambrook a sp., 1989) a zveřejněná sekvence A12-desaturázy (Wada a sp. (1990) Nátuře (London) 347, 200-203). Navíc bylo objeveno v souhlase se předloženým vynálezem, že nukleotidy 2002-3081 ze SEQ. ID NO:1 kódují kyanobakteriální A12-desaturázu. Tudíž může být tato sekvence použita pro konstrukci příslušných expresních vektorů. Jako transgenní organizmus jsou zejména uvažovány komerčně pěstované rostliny, což jsou bez omezení slunečnice, sojový bob, řepka olejka, kukuřice, arašíd a tabák.
Předložený vynález dále zahrnuje způsob indukující odolnost rostlin proti ochlazení. Citlivosti na chladno může být následek přenosu fáze lipidů v buněčných membránách. Teplota přenosu fáze závisí na stupni nenasycení mastných kyselin v lipidech membrány a tedy zvýšení stupně nenasycenosti, například zavedením Δό-desaturázy pro přeměnu LA a GLA může indukovat nebo zlepšit odolnost proti ochlazení. Způsob podle vynálezu tudíž spočívá v zavedení DNA kódující A6-desaturázu do rostlinné buňky a v regeneraci rostliny se zvýšenou odolností proti ochlazení ze zmíněné transformované rostlinné buňky. Ve přednostním provedení rostlina je slunečnice, sojový bob, řepka olejka, kukuřice, arašid nebo tabák.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález je znázorněn na výkresech, kde obr. 1 znázorňuje hydropathické profily dedukovaných sekvencí aminokyselin Synechocystis A6-desaturázy (obr. IA) a Á12-desaturázy (obr. IB), obr. 2 znázorňuje průběhy získané plyno-kapalinovou chromatografií pro divoký typ (obr. 2A) a transgenní Anabaena (obr. 2B), obr. 3 je diagram map kosmidů cSy75, cSyl3 a cSy7 s oblastmi přesahu a subklony a obr. 4 znázorňuje průběhy získané plynokapalinovou chromatografií pro divoký typ (obr. 4A) a transgenní tabák (obr. 4B).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Druhy a podmínky kultivace
Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) a Svnechococcus (PCC 7942, ATCC 33912) byly kultivovány fotoautotropicky při 30 °C v prostředí BG11N+ (Rippka a sp. (1979) J. Gen. Microbiol. 111, 1-61) při osvětlení inkandescenčními lampami (60 pE.m^.S’1). Kosmidy a plazmidy byly kultivovány a propagovány v Escheria Coli druh DH5a na médiu LB doplněném antibiotiky při standardních koncentracích,
-7CZ 285471 B6 jak popsal Maniatis a sp. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring, New York.
Příklad 2
Konstrukce genomické knihovny kosmidu Synechocvstis
Celková genomická DNA ze Synechocvstis (PCC 6803) byla částečně digestována se Sau3A a frakcionována na sacharózovém gradientu (Ausubel a sp. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Frakce obsahující 30 až 40 kb fragmentů DNA byly kultivovány a ligovány do defosforylovaného místa BamHI vektoru kosmidu, pDUCA7 (Buikema a sp. (1991) J. Bacteriol. 173, 1879-1885). Ligovaná DNA byla zabalena in vitro, jak popsal Ausubel a sp. (1987), a zabalené fágy byly propagovány v E. coli DH5a obsahující methylázový pomocný plasmid Aval a Eco4711, pRL528 jak popsal Buikema a sp. (1991). Celek 1152 kolonií byl izolován náhodně a udržován individuálně ve dvanácti 96-stěnových mikrotitrových deskách.
Příklad 3
Vyjádření zisku funkce GLA v Anabaena
Anabaena (PCC 7120), vláknitá kyanobakterie, neobsahuje GLA, avšak obsahuje významná množství kyseliny linolové, prekurzoru pro GLA, viz obr. 2 a tabulku 2. Knihovna kosmidu Synechocvstis popsaná v příkladu 2 byla konjugována do Anabaena (PCC 7120) pro identifikaci transkonjugantů, které vyvíjejí GLA. Buňky Anabaena byly kultivovány do mid-log fáze v kapalném prostředí BG11N+ a resuspendovány ve stejném prostředí na konečnou koncentraci asi 2xl08 buněk na 1 ml. Kultura midlog fáze E. coli RP4 (Burkardt a sp. (1979) J. Gen. Microbiol. 114, 341-348) kultivovaná vLB obsahujícím ampicilin byla promyta a resuspendována v čerstvém LB prostředí. Anabaena a RP4 byly potom smíchány a nastříkány na desky BG11N+ obsahující 5% LB. Genomická knihovna kosmidu byla replikované nanesena na desky LB obsahující 50 pg/ml kanamycinu a 17,5 pm/ml chloramfenikolu a potom byla nanesena na desky BG11N+ obsahující Anabaena a RP4. Po 24 hodinách inkubace při 30 °C bylo podloženo 30 pg/ml neomycinu a inkubace při 30 °C pokračovala až do objevení transkonjugantů.
Individuální transkonjuganty byly izolovány po konjugaci a kultivovány ve 2 ml kapalného prostředí BG11N+ s 15 pg/ml neomycinu. Methylestery mastných kyselin byly připraveny z kultur divokého typu a z kultur obsahujících oblasti deseti transkonjugantů následovně. Kultury divokého typu a transgenní kyanobakteriální kultury byly vytěženy centrifugací a promyty dvakrát destilovanou vodou. Methylestery mastných kyselin byly extrahovány z těchto kultur jak popsal Dahmer a sp. (1989) J. Amer. Oil Chem. Soc. 66, 543-548 a byly analyzovány plynokapalinovou chromatografíí (GLC) použitím chromatografii Tracor 560 opatřeného detektorem ionizace vodíkového plamene a kapilární kolonou (30 m x 0,25 mm vázaný FSOT Superox II, Alltech Associates lne., IL). Retenční doby a kochromatografíe standardů (získaných od Sigma Chemical Co.) byly použity pro identifikaci mastných kyselin. Střední složení mastných kyselin bylo určeno jako poměr vrcholové plochy každé Cl8 mastné kyseliny normalizované k mezinárodní normě.
Representativní GLC profily jsou znázorněny na obr. 2. Jsou znázorněny methylestery mastné kyseliny Cl8. Vrcholy byly identifikovány srovnáním časů eluce se známými normami metylesterů mastných kyselin a byly ověřeny plynovou chromatografii a hmotovou spektrografíí. Obr. 2A znázorňuje GLC analýzu mastných kyselin divokého typu Anabaena. Šipka označuje dobu migrace GLA. Obr. 2B jsou profil GLC mastných kyselin transkonjugantů Anabaena
-8CZ 285471 B6 s pAM542+1.8F. Dvě vyvíjecí oblasti GLA (ze 25 oblastí reprezentujících 250 transkonjugantů) byly identifikovány jako vyvíjející GLA. Jednotlivé transkonjuganty každé oblasti pozitivní na GLA byly analyzovány na vyvíjení GLA. Dva nezávislé transkonjuganty, AS 13 a AS75, každý zjedné oblasti, byly identifikovány jako vyjadřující významné úrovně GLA a obsahující kosmidy cSyl3 popřípadě cSy75, viz obr. 3. Přesah kosmidů je v oblasti dlouhé přibližně 7,5 kb. Fragment 3.5 kb Nhel kosmidu cSy75 byl reklonován ve vektoru pDUCA7 a převeden do Anabaena s výsledkem zisku funkce vyjádření GLA (Tabulka 2).
Dva Nhel/Hind III subfragmenty (1.8 a 1.7 kb) ze 3.5 kb Nhe I fragmentu ze cSy75-3.5 byly subklonovány do pBLUESCRJPT (Stratagene), viz obr. 3, pro sekvenční zpracování. Byly provedeny standardní techniky molekulární biologie, jak je popisuje Maniatis a sp. (1982) a Ausubel a sp. (1987). Dideoxy sekvenční zpracování (Sanger a sp. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) pBS1.8 bylo provedeno se SEQUENASE (United States Biochemical) na obou řadách použitím specifických oligonukleotidů jako primérů syntetizovaných v Advanced DNA Technologies Laboratory (Biology Department, Texas A & M University). Sekvenční analýza DNA byla provedena sGCG (Madison, WI) programovým vybavením, které popsal Devereux a sp. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Oba Nhel/HindlII subfragmenty byly přeneseny do konjugovaného vektoru vyjádření, AM542, v dopředně i zpětné orientaci s ohledem na promotor kyanobakteriální karboxylázy a byly zavedeny do Anabaena konjugací. Transkonjuganty obsahující 1.8 kb fragment v dopředně orientaci (AM542-1.8F) vyvíjely významná množství GLA a oktadekatetraeonové kyseliny, viz obr. 2 a tabulku 2. Transkonjuganty obsahující jiné konstrukty, buď zpětně orientovaný 1.8 kb fragment nebo dopředně a zpětně orientovaný 1.7 kb fragment, nevyvíjely zjistitelné úrovně GLA, viz tabulku 2.
Obr. 2 srovnává profil mastné kyseliny Cl8 extraktu z divokého typu Anabaena (obr. 2A) s profilem transgenní Anabaena obsahující 1.8 kb fragment cSy75-3.5 vdopředné orientaci (obr. 2B). Analýza metylesterů mastných kyselin z AM542-1.8F metodou GLC objevila vrchol s retenční dobou identickou s retenční dobou autentického standardu GLA. Analýza tohoto vrcholu plynovou chromatografií a hmotovou spektrometrií (GC-MS) potvrdila, že měl stejný vzor hmotové fragmentace jako srovnávací vzorek GLA. Transgenní Anabaena s alterovanými úrovněmi polynenasycených mastných kyselin byly v rychlosti růstu a v morfologii podobné divokému typu.
Tabulka 2
Složení mastných kyselin C18 v divokém typu a ve transgenní kyanobakterii
Druh Mastná kyselina (%)
18:0 18:1 18:2 18:3 (a) 18:3 (y) 18:4
Divoký typ
Sinechocystis (sp. PCC6803) 13.6 4.5 54.5 - 27.3 -
Anabaena (sp. PCC7120) 2.9 24.8 37.1 35.2 - -
Synechococcus (Sp. PCC7942) 20.6 79.4 - - - -
-9CZ 285471 B6
Tabulka 2 - pokračování
Druh Mastná kyselina (%)
18:0 18:1 18:2 18:3 («) 18:3 (7) 18:4
Transkonjuganty Anabaena
cSy75 3.8 24.4 22.3 9.1 27.9 12.5
cSy75-3.5 4.3 27.6 18.1 3.2 40.4 6.4
pAM542-1.8F 4.2 13.9 12.1 19.1 25.4 25.4
PAM542-1.8R 7.7 23.1 38.4 30.8 - -
pAM542-1.7F 2.8 27.8 36.1 33.3 - -
pAM542-1.7R 2.8 25.4 42.3 29.6 - -
Transformanty Synechococcus
pAM854 27.8 72.2 - - - -
pAM854-A12 4.0 43.2 46.0 - - -
pAM854-A6 18.2 81.8 - - - -
pAM854-A6 & A12 42.7 25.3 19.5 - 16.5 -
18.0, kyselina stearová; 18.1, kyselina olejová; 18.2, kyselina linolová; 18.3 (a), kyselina alinolenová:18.3 (γ), kyselina γ-linolenová; 18.4, kyselina oktadekatetraenová
Příklad 4
Transformace Synechococcus geny A6-desaturázy a A12-desaturázy
Třetí kosmid, cSy7, který obsahuje gen A12-desaturázy, byl izolován stíněním genomické knihovny Synechocvstis s oligonukleotidem syntetizovaným ze zveřejněné genové sekvence Svnechocystis A12-desaturázy (Wade a sp. (1990) Nátuře (London) 347, 200-203). Fragment 1.7 kb Aval z tohoto kosmidu obsahující gen A12-desaturázy byl identifikován a použit jako vzorek pro důkaz, že cSyl3 obsahuje nejen gen A6-desaturázy, ale také gen A12-desaturázy (obr. 3). Genomická Southem blot analýza dále ukázala, že geny A6-desaturázy i Δ12desaturázy jsou jediné v genomu Svnechocystis, takže oba funkcionální geny zavedené v desaturaci mastné kyseliny Cl8 jsou v genomu Svnechocystis těsně svázány.
Jednobuněčná kyanobakterie Synechococcus (PCC 7942) neobsahuje linolovou kyselinu ani GLA (3). Geny A12-desaturázy a A6-desaturázy byly klonovány individuálně a spolu do pAM854 (Bustos a sp. (1991) J. Bacteriol. 174, 7525-7533), kyvadlového vektoru který obsahuje sekvence nutné pro integraci cizí DNA do genomu Synechococcus (Golden a sp. (1987) Methods in Enzymol. 153, 215-231). Synechococcus byl transformován s těmito genovými konstrukty a byly kultivovány kolonie. Metylestery mastných kyselin byly extrahovány z transgenního Synechococcus a analyzovány metodou GLC.
Tabulka 2 ukazuje, že základní mastné kyseliny divokého typu Synechococcus jsou kyselina stearová (18:0) a kyselina olejová (18:1). Synechococcus transformovaný spAM854-A12 vyjadřoval linolovou kyselinu (18:2) přídavně k základním mastným kyselinám. Transformanty spAM854-A6 a Δ12 vyvíjely jak linoláty tak GLA (tabulka 1). Výsledky ukázaly, že Synechococcus obsahující geny A12-desaturázy i A6-desaturázy získal schopnost zavést druhou dvojnou vazbu v poloze A12-desaturázy a třetí dvojnou vazbu v poloze A6-desaturázy u mastných kyselin Cl8. Nicméně ve transformantu obsahujícím pAM854-A6 nebyly pozorovány
-10CZ 285471 B6 žádné změny ve složení mastných kyselin, což znamená, že při nepřítomnosti substrátu syntetizovaného Á12-desaturázou je Δό-desaturáza neaktivní. Tento pokus dále potvrzuje, že
Nhel/HindlII fragment (obr. 3) obsahuje oblast kódování i oblast promotoru genu Δό-desaturázy
Synechocystis. Transgenní Synechococcus se změněnými úrovněmi polynenasycených mastných kyselin byly v rychlosti růstu a morfologii podobné divokému typu.
Příklad 5
Sekvence nukleotidů Δό-desaturázy
Sekvence nukleotidů 1.8 kb fragmentu cSy75-3.5 obsahující gen funkcionální Δό-desaturázy byla určena. Otevřený čtecí úsek kódující polypeptid 359 aminokyselin byl identifikován (obr. 4). Hydropathická analýza metodou Kyte-Doodlittle (Kyte a sp. (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132) identifikovala dvě oblasti hydrofóbních aminokyselin, které by mohly představovat domény transmembrány (obr. IA). Dále je hydropathický profil Δό-desaturázy podobný hydropathickému profilu A12-desaturázy (obr. IB; Wada a sp.) a také A9-desaturázy (Thiede a sp. (1986) J. Biol. Chem. 26, 13230-13235). Podobnost sekvence mezi Δό-desaturázou a Δ12desaturázou Synechocystis je však nižší než 40% na úrovni nukleotidů asi 18% na úrovni aminokyselin.
Příklad 6
Přenos kyanobakteriální Δό-desaturázy do tabáku
Gen kyanobakteriální Δό-desaturázy byl mobilizován do rostlinného expresního vektoru a přenesen na tabák použitím Agrobacterium pro přenos genu. Pro zajištění, aby přenesená desaturáza byla vhodně vyjádřena v listech a vyvíjejících se semenech a aby produkt genu desaturázy byl zacílen k endoplasmatickému retikulu nebo chloroplastu, byly zkonstruovány rozličné expresní kazety s otevřeným čtecím úsekem (ORF) Δ-desaturázy Synechocystis. Složky těchto kazet jsou: (i) 35S promotor nebo specifický promotor semena odvozený od genu helianthininu slunečnice pro způsobení vyjádření genu Δό-desaturázy ve všech rostlinných tkáních popřípadě pouze ve vyvíjejících se semenech, (ii) peptidy domnělého signálu buď z genu extenzinu mrkve, nebo z genu halianthininu slunečnice pro zacílení nové syntetizované Δό-desaturázy do ER, (iii) sekvenci signálů pro retenci v lumen ER (KDEL) u COOH-konce ORF Δό-desaturázy a (iv) optimizovaný tranzitní peptid, aby zacílil Δό-desaturázu do chloroplastu. Promotor 35S je derivát pRTL2, který popsal Rastrepo a sp. (1990). Sekvence optimizovaných tranzitních peptidů je popsána, viz Van de Broeck a sp. (1985). Peptid signálu extenzinu z mrkve popsal Chen a sp. (1985) EMBO J. 9, 2145.
Byly vyrobeny rostliny transgenního tabáku obsahující gen kyanobakteriální desaturázy sestávající z genu Δό-desaturázy Synechocystis fúzovaného na endoplasmickou sekvenci retikulámí retence (KDEL) a peptid signálu způsobeného promotorem CaMC 35S. Zesílení PCR genomové DNA transgenního tabáku ukazuje, že gen Δό-desaturázy byl zaveden do genu tabáku. Metylestery mastných kyselin těchto rostlin transgenního tabáku byly extrahovány a analyzovány plyno-kapalnou chromatografií (GLC). Tyto transgenní tabáky nahromadily významné množství GLA (obr. 4). Obr. 4 znázorňuje metylestery mastných kyselin stanovené pomocí GLC. Vrcholy byly identifikovány srovnáním dob eluce se známými standardy metylesterů mastných kyselin. Tak mohou být kyanobakteriální geny působící v metabolismu mastných kyselin užity pro vyvíjení transgenních rostlin se změněným složením mastných kyselin.
-11 CZ 285471 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 3588 páru baze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet větví: obě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (ix) Provedení:
(A) Jméno/Klíč: CDS ίο (B) Umístění: 2002..3081 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
GCTAGCCACC AGTGACGATG CCTTGAATTr GGCCATTCTG ACCCAGGCCC GTATTCTGAA 60
TCCCCGCATT CGCATTGTTA ATCGTTTGTT CAACCATGCC CTGGGTAAAČ GTTTAGACAC 120
CACC1IGuCA GACCACGTTA GTTTGAGTGT TTCCGCCCTG GCGGCCCCGA TrmTccrr 180
TGCGGCTTTG GGCAATCAGG CGATCGGGCA ATTGCGTTTG TTTGACCAGA CTTGGCCCAT 240
TCAGGAAATT GTCATTCACC AAGACCATCC CTGGCTCAAT TTACCCCTGG CGGATTTATG 300
GGATGATCCG AGCCGAATGT TGATCTATTA CCTACCGGCC CACAGTGAAA CGGATTTAGT 36Π
AGGCGCAGTG GTGAATAATT TAACGTTGCA ATCTGGGGAC CATTTAATAG TGGGACAAAA 420
ACCCCAACCC AAGACCAAAC GGCGATCGCC TTGGCGCAAA TITTCCAAAC TGATTACCAA 480
CCTGCGGGAG TATCAGCGGT ATGTCCAACA GGTGATATGG GTGGTGTTGT TTTTATTGTT 540
GArtíAi mi CTGGCCACCT TCATCTACGT TTCCATTGAT CAACATATTG CCCCAGTGGA 600
CGCGTTGTAT TTTTCCGTGG GCATGATTAC CGGGGCCGGT GGCAAGGAAG AGGTGGCCGA 660
AAAGTCCCCC GATATCATCA AAGTATTCAC AGTGGTGATG ATGATCGCCG GGGCGGGGGT 720
GATTGGTATT TGTTATGCCC TACTGAATGA TTTCATCCTT GGCAGTCGCT TTAGTCAGTT 780
TTTGGATGCG GCCAAGTTAC CCGATCGCCA TCACATCATC ATTTGTGGGC TGGGGGGAGT 840
GAGCATGCCC ATTATTGAAG AGTTAATTCA CCAGGGCCAT GAAATTGTGG TAATCGAAAA 900
GGATACAGAT AATCGTTTCT TGCATACGGC CCGCTCCCTG GGGGTGCCCG TAATTGTGGA 960
-12CZ 285471 B6
GGATGCCCGC CTAGAAAGAA CGTTGGCCTG CGCCAATATC AACCGAGCCG AAGCCATTGT 1020
ggtggccacc AGCGACGACA CCGTTAACTT GGAAATTGGC CTAACTGCCA AGGCGATCGC 1080
CCCTAGCCTG CCAGTGGTGT TGCGTTGCCA GGATGCCCAG TTTAGCCTGT CCCTGCAOGA 1140
AGTATTTGAA TTTGAAACGG TGCTTTGTCC GGCGGAATTG GCCACCTATT CCTTTGCGGC 1200
GGCGGCCCTG GGGGGCAAAA TTTTGGGCAA CGGCATGACC GATGATTTGC TGTGGGTAGC 1260
CCTAGCCACC TTAATCACTC CTAACCATCC CTTTGCCGAC CAATTGGTTA AAATTGCAGC 1320
CCAAAAGTCT GATTTCGTTC CCCTCTATCT AGAACGGGGT GGCAAAACCA TCCATAGCTG 1380
GGAATTATTG GGTACCCATC TCGACTCTGG AGACGTGTTG TATTTAACCA TGCCCGCCAC 1440
TGCCCTAGAG CAACTTTGGC GATCGCCCCG TGCCACTGCT GATCCTCTGG AcrcTrrrrr 1500
GGTTTAGCAT GGGGGGATGG AACTCTTGAC TCGGCCCAAT GGTGATCAAG AAAGAACGCT 1560
TTGTCTATGT TTAGTATTTT TAAGTTAACC AACAGCAGAG GATAACTTCC AAAAGAAATT 1620
AAGCTCAAAA AGTAGCAAAA taagtttaat TCATAACTGA GTTTTACTGC TAAACAGCGG 1680
TGCAAAAAAG TCAGATAAAA TAAAAGCTTC acttcggttt TATATTGTGA CCATGGTTCC 1740
CAGGCATCTG CTCTAGGGAG tttttccgct GCCTTTAGAG AGTATTTTCT CCAAGTCGGC 1800
TAACTCCCCC ΛΧ 1 1 1 X AAAATCATAT AuAuAuxAlC CCAATATTGC CAGAGCTTTG 1860
ATGACTCACT GTAGAAGGCA GACTAAAATT CTAGCAATGG ACTCCCAGTT GGAATAAATT 1920
TTTAGTCTCC CCCGGCGCTG GAGTTTTTTT GTAGTTAATG GCGu 1Λ ť ΑΛΤ GTGAAAGTTT 1980
TTTATCTATT TAAATTTATA A ATG CTA ACA GCG GAA AGA ATT AAA TTT ACC 2031
Met Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Phe Thr
1 5 10
CAG AAA CGG GGG TTT CGT CGG GTA CTA AAC CAA CGG GTG GAT GCC TAC 2079
Gin Lys Arg Gly Phe Arg Arg Val Leu Asn Gin Arg Val Asp Ala Tyr
15 20 25
TTT GCC GAG CAT GGC CTG ACC CAA AGG GAT AAT CCC TCC ATG TAT CTG 2127
Phe Ala Glu His Gly Leu Thr Gin Arg Asp Asn Pro Ser Met Tyr Leu
30 35 40
AAA ACC CTG ATT ATT GTG CTC val Leu TGG TTG TTT TCC GCT TGG GCC TTT GTG Val 2175
Lys Thr Leu 45 Ile Ile Trp 50 Leu Phe Ser Ala Trp Ala Phe 55
CTT TTT GCT CCA GTT ATT TTT CCG GTG CGC CTA CTG GGT TGT ATG GTT 2223
Leu Phe Ala Pro Val ile Phe Pro Val Arg Leu Leu Gly Cys Met Val
60 65 70
TTG GCG ATC GCC TTG GCG GCC TTT TCC TTC AAT GTC GGC CAC GAT GCC 2271
Leu Ala Ile Ala Leu Ala Ala Phe Ser Phe Asn Val Gly His Asp Ala
75 80 85 90
AAC CAC AAT GCC TAT TCC TCC AAT CCC CAC ATC AAC CGG GTT CTG GGC 2319
Asn His Asn Ala Tyr Ser Ser Asn Pro His Ile Asn Arg val Leu Gly
95 100 105
ATG ACC TAC GAT TTT GTC GGG ΤΤΛ TCT AGT TTT CTT TGG CGC TAT CGC 2367
Met Thr Tyr Asp Phe Val Gly Leu Ser Ser Phe Leu Trp Arg Tyr Arg
110 115 120
CAC AAC TAT TTG CAC CAC ACC TAC ACC AAT ATT CTT GGC CAT GAC GTG 2415
His Asn Tyr Leu His His Thr Tyr Thr Asn Ile Leu Gly His Asp Val
125 130 135
-13 CZ 285471 B6
GAA ATC CAT GGA GAT GGC GCA GTA CGT ATG AGT CCT GAA CAA GAA CAT 2453
Glu Ile 140 His Gly Asp Gly Ala 145 Val Arg Met Ser Pro 150 Glu Gin Glu His
GTT GGT ATT TAT CGT TTC CAG CAA TTT TAT ATT TGG GGT TTA TAT CTT 2511
Val Gly Ile Tyr Arg Phe Gin Gin Phe Tyr Ile Trp Gly Leu Tyr Leu
155 160 165 170
TTC ATT CCC TTT TAT TGG TTT CTC TAC GAT GTC TAC CTA GTG CTT ΛΛΤ 2559
Phe Ile Pro Phe Tyr Trp Phe Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Val Leu Asn
175 180 185
AAA GGC AAA TAT CAC GAC CAT AAA ATT CCT CCT TTC CAG CCC CTA GAA 2607
Lys Gly Lys Tyr His Asp His Lys Ile Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu
190 195 200
TTA GCT AGT TTG CTA GGG ATT AAG CTA TTA TGG CTC GGC TAC GTT TTC 2655
Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ile Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyt Val Phe
205 210 215
GGC TTA CCT CTG GCT CTG GGC ΤΓΓ TCC ATT CCT GAA > GTA TTA ATT GGT 2703
Gly Leu Pro Leu Ala Leu Gly Phe Ser Ile Pro Glu Val Leu Ile Gly
220 225 230
GCT TCG GTA ACC TAT ATG ACC TAT GGC ATC GTG GTT TGC ACC ATC TTT 2751
Ala Ser Val Thr Tyr Met Thr Tyr Gly Ile Val val cys Thr Ile Phe
235 240 245 250
ATG CTG GCC CAT CTG TTG GAA TCA ACT GAA TTT CTC ACC CCC GAT GGT 2799
Met Leu Ala His Val Leu Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly
255 260 255
GAA TCC GGT GCC ATT GAT GAC GAG TGG GCT ATT TGC CAA ATT CGT ACC 2847
Glu Ser Gly Ala Ile Asp Asp Glu Trp Ala Ile Cys Gin Ile Arg Thr
270 275 280
ACG GCC AAT TTT GCC ACC AAT AAT CCC TTT TGG AAC TGG TTT TGT GGC 2895
Thr Ala Asn phe Ala Thr Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe Cys Gly
285 290 295
GGT TTA AAT CAC CAA GTT ACC CAC CAT CTT TTC CCC AAT ATT TGT CAT 2943
Gly Leu Asn His Gin Val Thr His His Leu Phe Pro Asn Ile Cys His
300 305 310
ATT CAC TAT CCC CAA TTG GAA AAT ATT ATT AAG GAT GTT TGC CAA GAG 2991
Ile His Tyr Pro Gin 1Λυ Glu Asn Ile Ile Lys Asp val Cys Gin Glu
315 320 325 330
TTT GGT GTC GAA TAT AAA GTT TAT CCC ACC TTC ΑΛΑ GCG GCG ATC GCC 3039
Phe Gly Val Glu Tyr Lys Val Tyr Frc Thr Phe Lys Ala Ala Ile Ala
335 340 345
TCT AAC TAT CGC TGG CTA GAG GCC ATG GGC AAA GCA TCG TGACATTGCC 3088
Ser Asn Tyr Arg Trp Leu Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser
350 355 360
AGCAAAATGG
CAAAATCCCT
3148
TTGGGATTGA
CGTAAATCTA
TGATCGAAGC
CTTTCTGTTG
CCCGCCGACC
AAATCCCCGA
TGCTGACCAA
AGGTTGATGT
TGGCATTGCT
CCAAACCCAC
3208
TTTGAGGGGG
TTCATTGGCC
GCAGTTTCAA
GCTGACCTAG
GAGGCAAAGA
TTGGGTGATT
3268
TTGCTCAAAT
CCGCTGGGAT
ATTGAAAGGC
TTCACCACCT
TTGGTTTCTA
CCCTGCTCAA
3328
TGGGAAGGAC
AAACCGTCAG
AATTGTTTAT
TCTGGTGACA
CCATCACCGA
CCCATCCATG
3388
TGGTCTAACC
CAGCCCTGGC
CAAGGCTTGG
ACCAAGGCCA
TGCAAATTCT
CCACGAGGCT
3448
AGGCCAGAAA
AATTATATTG
GCTCCTGATT
TCTTCCGGCT
ATCGCACCTA
CCGATTTTTG
3508
AGCATTITTG
CCAAGGAATT
CTATCCCCAC
TATCTCCATC
CCACTCCCCC
GCCTGTACAA
3568
- 14CZ 285471 B6
3588 aattitatcc atcagctagc (2) Informace pro SEQ ID NO:2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 359 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineami (ii) Typ molekuly: protein (xi) opis sekvence: SEQ IDN0:2:
Met Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Phe Thr Gin Lys Arg Gly rhe Arg
1 5 10 15
Arg Val Leu Asn Gin Arg Val Asp Ala Tyr Phe Ala Glu His Gly Leu
20 25 30
Thr Gin Aru Asp Asn Pro Ser Met Tyr Leu Lys Thr Leu Ile Ile Val
35 40 45
Leu Trp Leu Phe Ser Ala Trp Ala Phe Val Leu Phe Ala Pro Val Ile
50 55 60
Phe Pro Val Ara Leu Leu G)y Cys Met val Leu Ala Ile Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Ser Phe Asn val Gly His Asp Ala Asn His Asn Ala Tyr Ser
85 90 95
Ser Asn Pra His Ile Asn Arg val Leu Gly Met Thr Tyr Asp Phe Val
100 105 110
Gly Leu Ser Ser Phe Leu Trp Ara Tyr Arg His Asn Tyr Leu His His
115 120 125
Thr Tyr Thr Asn Ile Leu Gly His Asp Val Glu Ile His Gly Asp Gly
130 135 140
Ala Val Arg Met Ser Pro Glu Gin Glu His Val Gly Ile Tyr Arg Phe
145 150 155 160
Gin Gin Phe Tyr Ile Trp Gly Leu Tyr Leu Phe Ile Pro Phe Tyr Trp
165 170 175
Phe Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Val 180 Leu Asn 185 Lys Gly Lys Tyr 190 His Asp
His Lys Ile Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly
195 200 205
Ile tys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu
210 215 220
Gly Phe Ser Ile Pro Glu Val Leu Ile Gly Ala Ser val Thr Tyr Met
225 230 235 240
Thr Tyr Gly Ile Val Val Cys Thr Ile Phe Met Leu Ala His val Leu
245 250 255
Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly Glu Ser Gly Ala Ile Asp
260 265 270
- 15 CZ 285471 B6
A«P Glu Trp Ala Ile Cys Cln Ile Arg Thr Thr Ala Asn Phe Ala Thr
275 280 285
Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe Cys Gly Gly Leu Asn Mls Gin Val 290 295300
Thr His His Leu Phe Pro Asn Ile Cys His Ile His Tyr Pro GinLeu
305 3J0 31$320
Glu Asn Ile Ile Lys Asp Va) Cys Gin Glu Phe Gly Val Glu TyrLys
325 330335
Val Tyr Pro Thr Phe Lys Ala Ala Ile Ala Ser Asn Tyr Arg Trp Leu
340 345350
Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser
355 (2) Informace pro SEQ ID NO:3:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1884 párů baze (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet větví: obě (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) io (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:
AGCTTCACTT CGGTTHATA TTGTGACCAT GGTTCCCAGG CATCTGCTCT AGGGAGTTTT60
TCCGCTGCCT TTAGAGAGTA TTTTCTCCAA GTCGGCTAAC ŤCCCCCATTT TTAGGCAAAA120
TCATATACAG ACTATCCCAA TATTGCCAGA GCTTTGATGA CTCACTGTAG AAGGCAGACT180
AAAATTCTAG CAATGGACTC CCAGTTGGAA ΤλλΑΤΤΓΓΤλ GTCTCCCCCG GCGCTGGAGTZ40
TTTTTTGTAG TTAATGGCGG TATAATGTGA AAGTTrTTTA TCTATTTAAA TTTATAAATG300
CTAACAGCGG AAAGAATTAA ATTTACCCAG AAACGGGGGT TTCGTCGGGT ACTAAACCAA360
CGGGTGGATG CCTACTTTGC CGAGCATGGC CTGACCCAAA GGGATAATCC CTCCATGTAT420
CTGAAAACCC TGATTATTGT GCTCTGGTTG TTTTCCGCTT GGGCCTTTGT GCTTTTTGCT480
CCAGTTATTT TTCCGGTGCG CCTACTGGGT TGTATGGTTT TGGCGATCGC CTTGGCGGCC540
TTTTCCTTCA ATGTCGGCCA CGATGCCAAC CACAATGCCT ATTCCTCCAA TCCCCACATC600
AACCGGGTTC TGGGCATGAC CTACGATTTT GTCGGGTTAT CTAGTTTTCT TTGGCGCTAT660
CGCCACAACT ATTTGCACCA CACCTACACC AATATTCTTG GCCATGACGT GGAAATCCAT720
GGAGATGGCG CAGTACGTAT GAGTCCTGAA CAAGAACATG TTGGTATTTA TCGTTTCCAG780
CAATTTTATA TTTGGGGTTT ATATCTTTTC ATTCCCTTTT ATTGGTTTCT CTACGATGTC840
TACCTAGTGC TTAATAAAGG CAAATATCAC GACCATAAAA TTCCTCCTTT CCAGCCCCTA900
GAATTAGCTA GTTTGCTAGG GATTAAGCTA TTATGGCTCG GCTACGTTTT CGGCTTACCT960
CTGGCTCTGG GCTTTTCCAT TCCTGAAGTA TTAATTGGTG CTTCGGTAAC CTATATGACC1020
TATGGCATCG TGGTTTGCAC CATCTTTATG CTGGCCCATG TGTTGGAATC AACTGAATTT1080
CTCACCCCCG ATGGTGAATC CGGTGCCATT GATGACGAGT GGGCTATTTG CCAAATTCGT1140
ACCACGGCCA ATTTTGCCAC CAATAATCCC TTTTGGAACT GGTTTTGTGG CGGTTTAAAT1200
CACCAAGTTA CCCACCATCT TTTCCCCAAT ATTTGTCATA TTCACTATCC CCAATTGGAA1260
- 16CZ 285471 B6
ΑΑΤΑΤΓΑΤΓΑ AGGATGTTTG CCAAGAGTTT GGTGTGGAAT ATAAAGTTTA TCCCACCTTC 1320
AAAGCGGCGA TCGCCTCTAA CTATCGCTGG CTAGAGGCCA TGGGCAAAGC ATCGTGACAT 13B0
TGCCTTGGGA TTGAAGCAAA ATGGCAAAAT CCCTCGTAAA TCTATGATCG aagcctttct 1440
GTTGCCCGCC GACCAAATCC CCGATGCTGA CCAAAGGTTG ATGTTGGCAT TGCTCCAAAC 1500
CCACTTTGAG GGGGTTCATT GGCCGCAGTT TCAAGCTGAC CTAGGAGGCA AAGATTGGGT 1560
GATTTTGCTC AAATCCGCTG GGATATTGAA AGGCTTCACC ACCTTTGGTT TCTACCCTGC 1620
TCAATGGGAA GGACAAACCG TCAGAATTGT TTATTCTGGT GACACCATCA CCGACCCATC 1680
CATGTGGTCT aacccagccc TGGCCAAGGC TTGGACCAAG GCCATGCAAA TTCTCCACGA 1740
GGCTAGGCCA GAAAAATTAT ATTGGCTCCT gatttcttcc GGCTATCGCA CCTACCGATT 1800
TTTGAGCATT tttgccaagg AATTCTATCC CCACTATCTC CATCCCACTC CCCCGCCTGT 1860
ACAAAATTTT ATCCATCAGC TAGC 1884
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná nukleová kyselina kódující kyanobakteriální Δό-desaturázu obsahující sekvenci SEQIDNo:3.
  2. 2. Izolovaná nukleová kyselina kódující kyanobakteriální Δό-desaturázu obsahující nukleotidy 2002 až 3081 sekvence SEQ ID No:l.
  3. 3. Způsob přípravy bakteriální, kvasinkové nebo rostlinné buňky obsahující kyanobakteriální Δό-desaturázu, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci bakteriální, kvasinkové nebo rostlinné buňky izolovanou nukleovou kyselinou podle nároků 1 nebo 2.
  4. 4. Způsob indukce tvorby gamma-linolenové kyseliny v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo s chybějící gamma-linoleovou kyselinou, kde bakterie nebo rostlina vytváří linolovou kyselinu, vyznačující se tím, že bakterie nebo rostlina se transformuje izolovanou nukleovou kyselinou podle nároků 1 nebo 2.
  5. 5. Způsob indukce tvorby gamma-linolenové kyseliny v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo schybějící gamma-linoleovou kyselinou a linolovou kyselinou, vyznačující se tím, že se uvedená bakterie nebo rostlina transformuje izolovanou nukleovou kyselinou kódující kyanobakteriální Δό-desaturázu podle nároků 1 nebo 2 a izolovanou nukleovou kyselinou kódující A12-desaturázu.
  6. 6. Způsob indukce tvorby oktadekatetraeonové kyseliny v bakterii nebo rostlině se sníženým obsahem nebo chybějící gamma-linolenovou kyselinou nebo oktadekatetraenovou kyselinou a kde uvedená bakterie nebo rostlina vytváří linolovou kyselinu, vyznačující se tím, že se uvedená bakterie nebo rostlina transformuje izolovanou nukleovou kyselinou podle nároku 1.
CZ94817A 1991-10-10 1992-10-13 Způsob výroby gama linolenové kyseliny účinkem delta-6 Desaturázy CZ285471B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77447591A 1991-10-10 1991-10-10
US81791992A 1992-01-08 1992-01-08
PCT/US1992/008746 WO1993006712A1 (en) 1991-10-10 1992-10-13 Production of gamma linolenic acid by a δ6-desaturase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ81794A3 CZ81794A3 (en) 1995-09-13
CZ285471B6 true CZ285471B6 (cs) 1999-08-11

Family

ID=27118889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ94817A CZ285471B6 (cs) 1991-10-10 1992-10-13 Způsob výroby gama linolenové kyseliny účinkem delta-6 Desaturázy

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5552306A (cs)
EP (1) EP0666918B1 (cs)
JP (1) JP3537434B2 (cs)
KR (1) KR100316068B1 (cs)
CN (2) CN1053469C (cs)
AT (1) ATE284961T1 (cs)
AU (1) AU667848B2 (cs)
BG (1) BG61791B1 (cs)
BR (1) BR9206613A (cs)
CA (1) CA2120629C (cs)
CZ (1) CZ285471B6 (cs)
DE (1) DE69233459T2 (cs)
DK (1) DK0666918T3 (cs)
ES (1) ES2231767T3 (cs)
HU (1) HU217328B (cs)
IL (1) IL103407A (cs)
MX (1) MX9205820A (cs)
NZ (1) NZ244685A (cs)
PH (1) PH31293A (cs)
RO (1) RO113256B1 (cs)
RU (1) RU2152996C2 (cs)
UA (1) UA43314C2 (cs)
WO (1) WO1993006712A1 (cs)

Families Citing this family (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614393A (en) * 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
US20070130654A1 (en) * 1991-10-10 2007-06-07 Thomas Terry L Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
WO1994018337A1 (en) * 1993-02-05 1994-08-18 Monsanto Company Altered linolenic and linoleic acid content in plants
US5639645A (en) * 1993-09-22 1997-06-17 Mitsubishi Corporation Recombinant Δ9 desaturase and a gene encoding the same
US6310194B1 (en) * 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5965793A (en) 1995-09-20 1999-10-12 Monsanto Company, Inc. Strong early seed-specific gene regulatory region
US5977436A (en) * 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5959175A (en) * 1997-04-09 1999-09-28 Thomas; Terry L. Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6051754A (en) * 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US6075183A (en) * 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
CN1253588A (zh) * 1997-04-11 2000-05-17 艾博特公司 在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6080911A (en) * 1997-04-15 2000-06-27 Ohio University Mice models of growth hormone insensitivity
BR9808676B1 (pt) * 1997-04-15 2010-10-05 construção genética, processos para produzir um polipeptìdeo epoxigenase enzimaticamente ativo, recombinante, e, polipeptìdeo recombinante de ocorrência não natural.
US6100450A (en) * 1997-10-22 2000-08-08 Rhone-Poulenc Agrochimie Seed specific promoters based on arabidopsis genes
CA2329159A1 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Bruce Kelder Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products
CA2330024C (en) * 1998-06-12 2012-01-24 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US20030163845A1 (en) * 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
KR20020025069A (ko) 1999-06-07 2002-04-03 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
GB9929897D0 (en) * 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
FR2803592A1 (fr) 2000-01-06 2001-07-13 Aventis Cropscience Sa Nouveaux derives de l'acide 3-hydroxypicolinique, leur procede de preparation et compositions fongicides les contenant.
FR2810994B1 (fr) * 2000-06-30 2004-03-12 Biogemma Fr Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications
EP1197550A3 (en) * 2000-08-25 2002-11-20 Pfizer Products Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis
DK1911837T3 (da) 2000-09-28 2011-08-29 Bioriginal Food & Science Corp FAD5-2 fedtsyredesaturasefamiliemedlem og anvendelser deraf
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
CA2435685C (en) * 2001-01-25 2011-06-07 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US7045683B2 (en) * 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
MX281182B (es) * 2001-05-14 2010-11-22 Martek Biosciences Boulder Corp Produccion y uso de una fraccion rica en lipidos polares, que contienen acidos grasos altamente insaturados omega-3 y/u omega-6, procedentes de microbios, de semillas de plantas y de organismos marinos geneticamente modificados.
MXPA03010467A (es) * 2001-05-14 2004-12-06 Martek Biosciences Boulder Corp Produccion y uso de una fraccion polar rica en lipidos que contienen acido estearidonico y acido gama-linolenico proviniente de semillas y microbios.
ES2337564T3 (es) 2002-01-30 2010-04-27 Basf Plant Science Gmbh Metodo para elaborar acidos grasos poliinsaturados mediante un nuevo gen de elongasa.
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
WO2005024017A1 (en) * 2002-03-15 2005-03-17 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules associated with oil in plants
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
FR2848064B1 (fr) * 2002-12-06 2006-01-13 Bayer Cropscience Sa Plantes legumineuses transplastomiques fertiles
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
BR0317304A (pt) 2002-12-19 2005-11-08 Univ Bristol Processo para a produção de compostos, sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácidos, construção gênica, vetor, e, organismo
ATE517984T1 (de) 2003-02-27 2011-08-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
AU2004225483B2 (en) 2003-03-28 2009-07-23 Monsanto Technology, Llc Novel plant promoters for use in early seed development
EP1613746B1 (de) 2003-03-31 2013-03-06 University Of Bristol Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren
WO2004090123A2 (de) 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US9433228B2 (en) 2003-08-01 2016-09-06 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of multiple-unsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP1656449B1 (en) 2003-08-21 2009-05-06 Monsanto Technology LLC Fatty acid desaturases from primula
CA2450000A1 (en) * 2003-12-18 2005-06-18 Alberta Research Council Inc. Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil
EP1720988B1 (de) 2004-02-27 2011-10-12 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen
CN1930277B (zh) 2004-02-27 2011-02-02 巴斯福植物科学有限公司 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法
US20050220901A1 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 Huttenbauer Samuel Jr Methods of pharmaceutical separation from plants
CN1968688A (zh) 2004-04-16 2007-05-23 孟山都技术有限公司 脂肪酸去饱和酶在玉米中的表达
US7834250B2 (en) 2004-04-22 2010-11-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CN102559364B (zh) 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
US7138391B2 (en) * 2004-08-09 2006-11-21 Silverbrook Research Pty Ltd Hydrophilizable and hydrophilic cyanine dyes
US7456270B2 (en) * 2004-09-01 2008-11-25 Abbott Laboratories Δ6-desaturase genes and uses thereof
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
ATE552343T1 (de) 2005-04-19 2012-04-15 Basf Plant Science Gmbh Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen
AU2006237346B2 (en) 2005-04-20 2011-04-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
AU2006245701B2 (en) 2005-05-10 2011-04-28 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
ES2550623T3 (es) 2005-05-23 2015-11-11 Blue Horse Labs, Inc. Cártamo con ácido gamma linolénico elevado
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
EP1806398A1 (en) * 2006-01-04 2007-07-11 Monsanto S.A.S. Fad-2 mutants and high oleic plants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
ES2366297T3 (es) 2006-07-19 2012-01-13 Monsanto Technology, Llc Desaturasas de ácidos grasos de tetraselmis suecica.
AU2007287585B2 (en) 2006-08-24 2013-08-29 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
CA2661697A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
EP2182056B1 (de) 2006-10-06 2015-12-23 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen nicht-humanen Organismen
AU2008214568B2 (en) 2007-02-16 2013-04-18 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
US20090004715A1 (en) 2007-06-01 2009-01-01 Solazyme, Inc. Glycerol Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing
CA2695112A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongases and processes for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US20130323801A1 (en) * 2007-11-01 2013-12-05 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, Methods, and Kits for Polyunsaturated Fatty Acids from Microalgae
WO2009077478A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
AU2009242130B2 (en) 2008-04-30 2013-09-19 Rothamsted Research Ltd. Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
DE112009001585T5 (de) 2008-07-01 2012-02-23 Basf Plant Science Gmbh Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression
DE112009002048T5 (de) 2008-08-26 2012-01-26 Basf Plant Science Gmbh Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl
EP2358882B1 (en) 2008-11-18 2017-07-26 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
ES2714096T3 (es) 2008-11-28 2019-05-27 Corbion Biotech Inc Producción de aceites adaptados en microorganismos heterotróficos
CA2744930C (en) 2008-12-12 2018-03-20 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
MX2011010763A (es) 2009-04-17 2011-12-16 Basf Plant Science Co Gmbh Promotor de planta operable en endosperma y usos del mismo.
CA2756146C (en) 2009-04-22 2018-12-04 Basf Plant Science Company Gmbh Whole seed specific promoter
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
AU2010270309A1 (en) 2009-07-10 2012-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
DE112010005958T5 (de) 2009-12-03 2013-08-14 Basf Plant Science Company Gmbh Expressionskassetten für die Embryo-spezifische Expression in Pflanzen
CN102741415A (zh) 2010-02-02 2012-10-17 拜尔农科股份公司 使用hppd抑制剂作为选择剂的大豆转化
CA2801057C (en) 2010-05-28 2019-06-18 Solazyme, Inc. Tailored oils produced from recombinant heterotrophic microorganisms
US9388437B2 (en) 2010-06-25 2016-07-12 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
CA3024641A1 (en) 2010-11-03 2012-05-10 Corbion Biotech, Inc. Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods
MX351063B (es) 2011-02-02 2017-09-29 Terravia Holdings Inc Aceites adaptados producidos a partir de microorganismos oleaginosos recombinantes.
AU2013246661B2 (en) 2012-04-12 2018-12-20 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
ES2744868T3 (es) 2012-04-18 2020-02-26 Corbion Biotech Inc Aceites hechos a medida
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
US8946460B2 (en) 2012-06-15 2015-02-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Process for producing polyunsaturated fatty acids in an esterified form
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
EP2993993A2 (en) * 2013-04-26 2016-03-16 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
EP3052636A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 Solazyme, Inc. Tailored oils
SG11201604871VA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
KR102527795B1 (ko) 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질
ES2764273T3 (es) 2014-07-10 2020-06-02 Corbion Biotech Inc Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos
KR102054762B1 (ko) 2018-03-06 2020-01-22 대한민국(관리청: 특허청장, 승계청: 농촌진흥청장) 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 및 이의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4736866B1 (en) * 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
NZ221259A (en) * 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
ZA888155B (en) * 1987-11-04 1989-07-26 Merrell Dow Pharma Fluorinated arachidonic acid derivatives
BR9007159A (pt) * 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
ATE241007T1 (de) * 1990-03-16 2003-06-15 Calgene Llc Dnas, die für pflanzliche desaturasen kodieren und deren anwendungen

Also Published As

Publication number Publication date
HUT69781A (en) 1995-09-28
NZ244685A (en) 1994-06-27
BG61791B1 (bg) 1998-06-30
CN1174236A (zh) 1998-02-25
DE69233459T2 (de) 2005-12-15
BG98695A (bg) 1995-05-31
JPH07503605A (ja) 1995-04-20
US5689050A (en) 1997-11-18
EP0666918A1 (en) 1995-08-16
CZ81794A3 (en) 1995-09-13
CN1072722A (zh) 1993-06-02
BR9206613A (pt) 1995-04-11
JP3537434B2 (ja) 2004-06-14
CN1053469C (zh) 2000-06-14
AU667848B2 (en) 1996-04-18
CA2120629C (en) 2009-02-17
EP0666918B1 (en) 2004-12-15
EP0666918A4 (en) 1995-03-17
DE69233459D1 (de) 2005-01-20
ES2231767T3 (es) 2005-05-16
CN1121499C (zh) 2003-09-17
WO1993006712A1 (en) 1993-04-15
HU9401007D0 (en) 1994-08-29
US5552306A (en) 1996-09-03
US5663068A (en) 1997-09-02
RU2152996C2 (ru) 2000-07-20
UA43314C2 (uk) 2001-12-17
PH31293A (en) 1998-07-06
KR100316068B1 (ko) 2002-11-13
RO113256B1 (ro) 1998-05-29
IL103407A0 (en) 1993-03-15
HU217328B (hu) 1999-12-28
ATE284961T1 (de) 2005-01-15
IL103407A (en) 1999-09-22
DK0666918T3 (da) 2005-03-14
MX9205820A (es) 1993-04-01
AU2881292A (en) 1993-05-03
CA2120629A1 (en) 1993-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ285471B6 (cs) Způsob výroby gama linolenové kyseliny účinkem delta-6 Desaturázy
AU707061B2 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US6355861B1 (en) Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
US9701947B2 (en) Fatty acid desaturases from primula
US6683232B1 (en) Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
Zárate et al. Healthy omega-3 enhancement in Echium acanthocarpum transformed hairy roots by overexpression of a 6-desaturase gene from Primula vialli
US20070130654A1 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US20090077692A1 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20121013